CN110607403A - 鱼类弹状病毒巢式pcr检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

鱼类弹状病毒巢式pcr检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用，属于分子生物学技术领域。本发明以待测样品总RNA为模板，进行反转录反应，得到待测样品cDNA；以待测样品cDNA为模板进行第一轮PCR扩增反应；再以第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增反应；将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察是否出现阳性扩增条带，判定待测样品是否含有鱼类弹状病毒。本发明具有灵敏性高、特异性强的特点，能够快速、准确地检测出鱼类弹状病毒‑乌鳢水泡病毒。

Description

鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及 应用
技术领域
本发明涉及鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
PCR即聚合酶链式反应技术，一种类似于参照细胞内的DNA复制过程。该技术是以DNA为模板，加入PCR酶以及对应的特异性引物在PCR仪器中进行程序反应，复制扩增产生新的互补DNA片段。其过程由变性-退火-延伸三个步骤组成，经过多次循环，2-3小时内就可将DNA扩增放大上百万倍。因其扩增效率高、特异性强、灵敏性高等优点，在分子生物学研究领域得到了广泛的应用。
巢式PCR则是建立在普通PCR方法基础之上的一种改进型方案，与一般PCR技术有所区别的是，巢式PCR需要两对引物。内外两引物进行两次PCR扩增，第一轮扩增后，再用其扩增后的PCR产物为模板，用内引物进行第二轮扩增，得到灵敏性高，特异性更强的目的条带。
乌鳢水泡病毒(Snakehead fish vesicularvirus,SHVV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，Perhabdovirus属。2014年从养殖池塘的患病杂交鳢体内分离出来，该病毒能够感染鳢科鱼类、鳜鱼、黄鳝等。近年来，该病毒对一些养殖区域造成了极大危害，在一些人工养殖的池塘内，感染初期病鱼体表无明显症状，摄食减弱，体质下降；严重时停止摄食、体色变黑、眼球突出、浮于池边、时而翻滚，不久便死亡，目前尚无有效治疗方法。对于该病毒的鉴定目前没有专门的文献和技术，一般都是用普通PCR检测，特异性、灵敏性较低，出现假阳性的几率较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用，具有灵敏性高、特异性强的特点，能够快速、准确地检测出鱼类弹状病毒-乌鳢水泡病毒。
为解决上述技术问题，本发明提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组，所述引物组包括两组引物对，其中一组引物对包括上游引物SHVV-1F和下游引物SHVV-1R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；另外一组引物对包括上游引物SHVV-2F和下游引物SHVV-2R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。
进一步地，所述试剂盒还包括Premix Taq。
本发明还提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，包括：
提取待测样品总RNA，以待测样品总RNA为模板，进行反转录反应，得到待测样品cDNA；
以待测样品cDNA为模板，利用权利要求1所述的上游引物SHVV-1F和下游引物SHVV-1R，进行第一轮PCR扩增反应；
以第一轮PCR扩增产物为模板，利用权利要求1所述的上游引物SHVV-2F和下游引物SHVV-2R，进行第二轮PCR扩增反应；
将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察是否出现阳性扩增条带，判定待测样品是否含有鱼类弹状病毒。
进一步地，所述第一轮PCR扩增反应体系包括：待测样品cDNA模板1μL、浓度为10μM的上游引物SHVV-1F 1μL、浓度为10μM的下游引物SHVV-1R 1μL、浓度为2x的Premix Taq10μL、ddH2O 7μL，总量20μL。
进一步地，所述第一轮PCR扩增反应程序为：95℃5min，95℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min延伸，12℃降温，4℃保存。
进一步地，所述第二轮PCR扩增反应体系包括：第一轮PCR扩增产物1μL、浓度为10μM的上游引物SHVV-2F 1μL、浓度为10μM的下游引物SHVV-2R 1μL、浓度为2x的Premix Taq10μL、ddH2O 7μL，总量20μL。
进一步地，所述第二轮PCR扩增反应程序为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环，72℃5min延伸,12℃降温，4℃保存。
本发明还提供一种上述的引物组、试剂盒或检测方法在鱼类弹状病毒检测中的应用。
本发明所达到的有益效果：
本发明针对乌鳢水泡病毒保守基因序列，设计相关特异性引物，以及相适宜的PCR反应条件，建立一种乌鳢水泡病毒巢式PCR检测方法，具有快速、准确等特点。
巢式PCR较普通PCR而言，其特异性、灵敏性都得到大幅提高，减少了假阳性的几率。同时，它能更好地区分同源性较高，种属相近的病毒，运用于临床检测准确性更高，更可靠。
本发明建立的乌鳢水泡病毒巢式PCR检测方法，具有灵敏性高、特异性强等特点，能够快速、准确地检测出乌鳢水泡病毒。为乌鳢水泡病毒的临床诊断与预防提供了一项重要的技术手段，对实施乌鳢水泡病毒的鉴定、分离、流行病学调查等研究提供了技术方案。
附图说明
图1为巢式PCR检测结果：M:Marker DL2000；1:SHVV-1F、SHVV-1R一扩结果；2:SHVV-2F、SHVV-2R二扩结果。
图2为巢式PCR特异性检测结果：M:Marker DL2000；1：乌鳢水泡病毒；2：真鲷虹彩病毒；3：传染性脾肾坏死病毒；4：鲤春病毒血症病毒；5：ddH2O阴性对照。
图3为巢式PCR灵敏性检测结果：M:Marker DL2000；1-9:100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8病毒液稀释倍数。
图4为巢式PCR临床样品检测：M:Marker DL2000；1-16:样品1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；17：ddH2O阴性对照。
图5为普通一次PCR扩增图，以cDNA为模板，所用引物为SHVV-2F、SHVV-2R。M:Marker DL2000；1：乌鳢水泡病毒。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1巢式PCR检测方法的建立
1、实验材料：患病鱼样本采自广东省顺德市杂交鳢养殖场，由实验室保存，-80℃。
实验试剂：TRIpure Reagent(北京艾德莱生物)；异丙醇、三氯甲烷、75％乙醇(国药集团化学试剂厂)；DEPC水(Biosharp公司产品)；Premix Taq(TaKaRa Version 2.0plusdye)、反转录酶、DL2000DNA Marker(TaKaRa公司产品)；DNA凝胶回收试剂盒(全式金公司生产)；琼脂糖(Biowest Agarose)；50×TAE缓冲液。
2、引物设计与合成
根据NCBI(National Center for Biotechnology)已发表乌鳢水泡病毒相关的基因序列，使用Clone Manager软件,根据乌鳢水泡病毒核衣壳蛋白基因的保守序列。利用引物设计软件(Primer primer)，设计内外两对乌鳢水泡病毒的PCR引物(SHVV-1F、SHVV-1R；SHVV-2F、SHVV-2R)，引物序列见表1。
表1：SHVV巢式PCR引物序列
2、RNA提取和cDNA合成
RNA提取：取待测样品鱼的肾脏组织，根据RNA提取说明书(Trizol法)，提取待检测样品病毒RNA，提取的RNA很容易降解，需要立即进行反转录或者－20℃保存。
cDNA合成：根据RNA反转录说明书操作，取0.2ml无酶离心管，配置以下混合液(10μL)：RNA模板×5μL、Oligo Dt Primer(50μM)×1μL、dNTP Mixture(10Mm each)×1μL、RNaseFree dH2O×3μL，在PCR仪中65℃恒温保持05:00min，迅速插入冰中冷却；以上步骤，可使反转录效率提升。上述反应物×10μL、RNase Free dH2O×4.5μL、Prime ScriptⅡRTase(200U/μL)×1μL、5×Prime ScriptⅡBuffer×4μL、RNase Inhibitor(40U/μL)×0.5μL，轻轻吹打摇匀。将离心管放入PCR仪，45℃，50:00min合成cDNA、95℃05:00min使酶失去活性，随后立即放入冰盒冷却03:00min，即为cDNA模板，-20℃保存备用。
3、巢式PCR体系的建立
巢式PCR需要两对引物通过两次扩增完成，反应物配置总量为20μL。
第一轮反应体系：步骤2的cDNA模板×1μL、SHVV-1F×1μL、SHVV-1R×1μL、PremixTaq×10μL、ddH2O×7μL。PCR反应程序：95℃5min，95℃30s，56℃30s，72℃1min，30循环；72℃5min延伸，12℃降温，4℃保存。
第二轮反应体系：第一轮PCR扩增产物×1μL、SHVV-2F×1μL、SHVV-2R×1μL、Premix Taq×10μL、ddH2O×7μL。PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min，30循环，72℃5min延伸,12℃降温，4℃保存。
4、电泳检测
配置1×TAE缓冲液和1.0％琼脂糖凝胶；点样5μL，DL2000Marker 5μL为参照，使用凝胶电泳仪120V电泳30min。结果显示：阳性条带清晰、明亮(见图1)。将条带胶回并做相关测序检测，扩增条带与目的基因序列一致。
实施例2巢式PCR方法的评价
1、特异性检测
分别取乌鳢水泡病毒(SHVV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的DNA或cDNA为检测模板，设置ddH2O为阴性对照，按照本发明建立的巢式PCR检测方法检测。结果显示SHVV呈阳性，扩增出了397bp单一目的条带，实验对照样品RSIV、ISKNV、SVCV以及ddH2O，均无任何条带，呈阴性(见图2)。
2、灵敏性检测
对1×104TCID50/mL的病毒液进行10倍倍比稀释(100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8)，按照本发明建立的检测方法提取RNA，合成cDNA。以此为PCR模板，以相应体系和程序，分别进行巢式PCR扩增。同时设置一组ddH2O为模板的阴性对照。结果显示，当检测样品病毒液稀释浓度为1×10-6以内，仍可观察到明亮的单一条带。当样品病毒液稀释浓度达到1×10-7以上，则无特异性条带(见图3)。表明本实验建立的巢式PCR方法对乌鳢水泡病毒最低检测浓度为1×0.01TCID50/mL。
实施例3临床样品检测
选择16个患病杂交鳢肾组织临床样品，设置ddH2O为阴性对照，按照本发明建立的巢式PCR检测方法检测。结果显示，13个样品扩增出了特异性条带，呈阳性；3个临床样品以及阴性对照ddH2O无条带，呈阴性(见图4)。将阳性条带胶回收测序，阳性样品基因序列与NCBI已发表乌鳢水泡病毒(SHVV)基因序列一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattctcatt tcttttatac ttt 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaaatacat atgaaagtgt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcattatga gatacagttt a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccgattggc ttacagtctg c 21

Claims (9)

1. 鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组，其特征是，所述引物组包括两组引物对，其中一组引物对包括上游引物SHVV-1F 和下游引物SHVV-1R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；另外一组引物对包括上游引物SHVV-2F 和下游引物SHVV-2R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
2.鱼类弹状病毒巢式PCR检测的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Premix Taq。
4.鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，其特征是，包括：
提取待测样品总RNA，以待测样品总RNA为模板，进行反转录反应，得到待测样品cDNA；
以待测样品cDNA为模板，利用权利要求1所述的上游引物SHVV-1F 和下游引物SHVV-1R，进行第一轮PCR扩增反应；
以第一轮PCR扩增产物为模板，利用权利要求1所述的上游引物SHVV-2F 和下游引物SHVV-2R，进行第二轮PCR扩增反应；
将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶置于成像系统中观察是否出现阳性扩增条带，判定待测样品是否含有鱼类弹状病毒。
5.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，其特征是，所述第一轮PCR扩增反应体系包括：待测样品cDNA模板1μL、浓度为10 μM的上游引物SHVV-1F 1μL、浓度为10μM的下游引物SHVV-1R 1μL、浓度为2x的Premix Taq 10μL、ddH2O 7μL，总量20μL。
6.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，其特征是，所述第一轮PCR扩增反应程序为：95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 5 min延伸，12℃降温，4℃保存。
7.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，其特征是，所述第二轮PCR扩增反应体系包括：第一轮PCR扩增产物 1μL、浓度为10 μM的上游引物SHVV-2F 1μL、浓度为10 μM的下游引物SHVV-2R 1μL、浓度为2x的Premix Taq 10μL、ddH2O 7μL，总量20μL。
8.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法，其特征是，所述第二轮PCR扩增反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 5 min延伸 , 12℃降温，4℃保存。
9.根据权利要求1所述的引物组、权利要求2或3所述的试剂盒或权利要求4-8中任一所述的检测方法在鱼类弹状病毒检测中的应用。
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