CN110607403A - 鱼类弹状病毒巢式pcr检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents
鱼类弹状病毒巢式pcr检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用,属于分子生物学技术领域。本发明以待测样品总RNA为模板,进行反转录反应,得到待测样品cDNA;以待测样品cDNA为模板进行第一轮PCR扩增反应;再以第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增反应;将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,将凝胶置于成像系统中观察是否出现阳性扩增条带,判定待测样品是否含有鱼类弹状病毒。本发明具有灵敏性高、特异性强的特点,能够快速、准确地检测出鱼类弹状病毒‑乌鳢水泡病毒。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用,属于分子生物学技术领域。
背景技术
PCR即聚合酶链式反应技术,一种类似于参照细胞内的DNA复制过程。该技术是以DNA为模板,加入PCR酶以及对应的特异性引物在PCR仪器中进行程序反应,复制扩增产生新的互补DNA片段。其过程由变性-退火-延伸三个步骤组成,经过多次循环,2-3小时内就可将DNA扩增放大上百万倍。因其扩增效率高、特异性强、灵敏性高等优点,在分子生物学研究领域得到了广泛的应用。
巢式PCR则是建立在普通PCR方法基础之上的一种改进型方案,与一般PCR技术有所区别的是,巢式PCR需要两对引物。内外两引物进行两次PCR扩增,第一轮扩增后,再用其扩增后的PCR产物为模板,用内引物进行第二轮扩增,得到灵敏性高,特异性更强的目的条带。
乌鳢水泡病毒(Snakehead fish vesicularvirus,SHVV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae),Perhabdovirus属。2014年从养殖池塘的患病杂交鳢体内分离出来,该病毒能够感染鳢科鱼类、鳜鱼、黄鳝等。近年来,该病毒对一些养殖区域造成了极大危害,在一些人工养殖的池塘内,感染初期病鱼体表无明显症状,摄食减弱,体质下降;严重时停止摄食、体色变黑、眼球突出、浮于池边、时而翻滚,不久便死亡,目前尚无有效治疗方法。对于该病毒的鉴定目前没有专门的文献和技术,一般都是用普通PCR检测,特异性、灵敏性较低,出现假阳性的几率较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷,提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用,具有灵敏性高、特异性强的特点,能够快速、准确地检测出鱼类弹状病毒-乌鳢水泡病毒。
为解决上述技术问题,本发明提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组,所述引物组包括两组引物对,其中一组引物对包括上游引物SHVV-1F和下游引物SHVV-1R,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;另外一组引物对包括上游引物SHVV-2F和下游引物SHVV-2R,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测的试剂盒,所述试剂盒包括上述的引物组。
进一步地,所述试剂盒还包括Premix Taq。
本发明还提供一种鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法,包括:
提取待测样品总RNA,以待测样品总RNA为模板,进行反转录反应,得到待测样品cDNA;
以待测样品cDNA为模板,利用权利要求1所述的上游引物SHVV-1F和下游引物SHVV-1R,进行第一轮PCR扩增反应;
以第一轮PCR扩增产物为模板,利用权利要求1所述的上游引物SHVV-2F和下游引物SHVV-2R,进行第二轮PCR扩增反应;
将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,将凝胶置于成像系统中观察是否出现阳性扩增条带,判定待测样品是否含有鱼类弹状病毒。
进一步地,所述第一轮PCR扩增反应体系包括:待测样品cDNA模板1μL、浓度为10μM的上游引物SHVV-1F 1μL、浓度为10μM的下游引物SHVV-1R 1μL、浓度为2x的Premix Taq10μL、ddH2O 7μL,总量20μL。
进一步地,所述第一轮PCR扩增反应程序为:95℃5min,95℃30s,56℃30s,72℃1min,30个循环;72℃5min延伸,12℃降温,4℃保存。
进一步地,所述第二轮PCR扩增反应体系包括:第一轮PCR扩增产物1μL、浓度为10μM的上游引物SHVV-2F 1μL、浓度为10μM的下游引物SHVV-2R 1μL、浓度为2x的Premix Taq10μL、ddH2O 7μL,总量20μL。
进一步地,所述第二轮PCR扩增反应程序为:95℃5min;95℃30s,56℃30s,72℃1min,30个循环,72℃5min延伸,12℃降温,4℃保存。
本发明还提供一种上述的引物组、试剂盒或检测方法在鱼类弹状病毒检测中的应用。
本发明所达到的有益效果:
本发明针对乌鳢水泡病毒保守基因序列,设计相关特异性引物,以及相适宜的PCR反应条件,建立一种乌鳢水泡病毒巢式PCR检测方法,具有快速、准确等特点。
巢式PCR较普通PCR而言,其特异性、灵敏性都得到大幅提高,减少了假阳性的几率。同时,它能更好地区分同源性较高,种属相近的病毒,运用于临床检测准确性更高,更可靠。
本发明建立的乌鳢水泡病毒巢式PCR检测方法,具有灵敏性高、特异性强等特点,能够快速、准确地检测出乌鳢水泡病毒。为乌鳢水泡病毒的临床诊断与预防提供了一项重要的技术手段,对实施乌鳢水泡病毒的鉴定、分离、流行病学调查等研究提供了技术方案。
附图说明
图1为巢式PCR检测结果:M:Marker DL2000;1:SHVV-1F、SHVV-1R一扩结果;2:SHVV-2F、SHVV-2R二扩结果。
图2为巢式PCR特异性检测结果:M:Marker DL2000;1:乌鳢水泡病毒;2:真鲷虹彩病毒;3:传染性脾肾坏死病毒;4:鲤春病毒血症病毒;5:ddH2O阴性对照。
图3为巢式PCR灵敏性检测结果:M:Marker DL2000;1-9:100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8病毒液稀释倍数。
图4为巢式PCR临床样品检测:M:Marker DL2000;1-16:样品1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16;17:ddH2O阴性对照。
图5为普通一次PCR扩增图,以cDNA为模板,所用引物为SHVV-2F、SHVV-2R。M:Marker DL2000;1:乌鳢水泡病毒。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1巢式PCR检测方法的建立
1、实验材料:患病鱼样本采自广东省顺德市杂交鳢养殖场,由实验室保存,-80℃。
实验试剂:TRIpure Reagent(北京艾德莱生物);异丙醇、三氯甲烷、75%乙醇(国药集团化学试剂厂);DEPC水(Biosharp公司产品);Premix Taq(TaKaRa Version 2.0plusdye)、反转录酶、DL2000DNA Marker(TaKaRa公司产品);DNA凝胶回收试剂盒(全式金公司生产);琼脂糖(Biowest Agarose);50×TAE缓冲液。
2、引物设计与合成
根据NCBI(National Center for Biotechnology)已发表乌鳢水泡病毒相关的基因序列,使用Clone Manager软件,根据乌鳢水泡病毒核衣壳蛋白基因的保守序列。利用引物设计软件(Primer primer),设计内外两对乌鳢水泡病毒的PCR引物(SHVV-1F、SHVV-1R;SHVV-2F、SHVV-2R),引物序列见表1。
表1:SHVV巢式PCR引物序列
2、RNA提取和cDNA合成
RNA提取:取待测样品鱼的肾脏组织,根据RNA提取说明书(Trizol法),提取待检测样品病毒RNA,提取的RNA很容易降解,需要立即进行反转录或者-20℃保存。
cDNA合成:根据RNA反转录说明书操作,取0.2ml无酶离心管,配置以下混合液(10μL):RNA模板×5μL、Oligo Dt Primer(50μM)×1μL、dNTP Mixture(10Mm each)×1μL、RNaseFree dH2O×3μL,在PCR仪中65℃恒温保持05:00min,迅速插入冰中冷却;以上步骤,可使反转录效率提升。上述反应物×10μL、RNase Free dH2O×4.5μL、Prime ScriptⅡRTase(200U/μL)×1μL、5×Prime ScriptⅡBuffer×4μL、RNase Inhibitor(40U/μL)×0.5μL,轻轻吹打摇匀。将离心管放入PCR仪,45℃,50:00min合成cDNA、95℃05:00min使酶失去活性,随后立即放入冰盒冷却03:00min,即为cDNA模板,-20℃保存备用。
3、巢式PCR体系的建立
巢式PCR需要两对引物通过两次扩增完成,反应物配置总量为20μL。
第一轮反应体系:步骤2的cDNA模板×1μL、SHVV-1F×1μL、SHVV-1R×1μL、PremixTaq×10μL、ddH2O×7μL。PCR反应程序:95℃5min,95℃30s,56℃30s,72℃1min,30循环;72℃5min延伸,12℃降温,4℃保存。
第二轮反应体系:第一轮PCR扩增产物×1μL、SHVV-2F×1μL、SHVV-2R×1μL、Premix Taq×10μL、ddH2O×7μL。PCR反应程序:95℃5min;95℃30s,56℃30s,72℃1min,30循环,72℃5min延伸,12℃降温,4℃保存。
4、电泳检测
配置1×TAE缓冲液和1.0%琼脂糖凝胶;点样5μL,DL2000Marker 5μL为参照,使用凝胶电泳仪120V电泳30min。结果显示:阳性条带清晰、明亮(见图1)。将条带胶回并做相关测序检测,扩增条带与目的基因序列一致。
实施例2巢式PCR方法的评价
1、特异性检测
分别取乌鳢水泡病毒(SHVV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的DNA或cDNA为检测模板,设置ddH2O为阴性对照,按照本发明建立的巢式PCR检测方法检测。结果显示SHVV呈阳性,扩增出了397bp单一目的条带,实验对照样品RSIV、ISKNV、SVCV以及ddH2O,均无任何条带,呈阴性(见图2)。
2、灵敏性检测
对1×104TCID50/mL的病毒液进行10倍倍比稀释(100,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8),按照本发明建立的检测方法提取RNA,合成cDNA。以此为PCR模板,以相应体系和程序,分别进行巢式PCR扩增。同时设置一组ddH2O为模板的阴性对照。结果显示,当检测样品病毒液稀释浓度为1×10-6以内,仍可观察到明亮的单一条带。当样品病毒液稀释浓度达到1×10-7以上,则无特异性条带(见图3)。表明本实验建立的巢式PCR方法对乌鳢水泡病毒最低检测浓度为1×0.01TCID50/mL。
实施例3临床样品检测
选择16个患病杂交鳢肾组织临床样品,设置ddH2O为阴性对照,按照本发明建立的巢式PCR检测方法检测。结果显示,13个样品扩增出了特异性条带,呈阳性;3个临床样品以及阴性对照ddH2O无条带,呈阴性(见图4)。将阳性条带胶回收测序,阳性样品基因序列与NCBI已发表乌鳢水泡病毒(SHVV)基因序列一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变形,这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组、试剂盒、检测方法及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattctcatt tcttttatac ttt 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaaatacat atgaaagtgt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcattatga gatacagttt a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccgattggc ttacagtctg c 21
Claims (9)
1. 鱼类弹状病毒巢式PCR检测的引物组,其特征是,所述引物组包括两组引物对,其中一组引物对包括上游引物SHVV-1F 和下游引物SHVV-1R,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;另外一组引物对包括上游引物SHVV-2F 和下游引物SHVV-2R,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
2.鱼类弹状病毒巢式PCR检测的试剂盒,其特征是,所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括Premix Taq。
4.鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法,其特征是,包括:
提取待测样品总RNA,以待测样品总RNA为模板,进行反转录反应,得到待测样品cDNA;
以待测样品cDNA为模板,利用权利要求1所述的上游引物SHVV-1F 和下游引物SHVV-1R,进行第一轮PCR扩增反应;
以第一轮PCR扩增产物为模板,利用权利要求1所述的上游引物SHVV-2F 和下游引物SHVV-2R,进行第二轮PCR扩增反应;
将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,将凝胶置于成像系统中观察是否出现阳性扩增条带,判定待测样品是否含有鱼类弹状病毒。
5.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法,其特征是,所述第一轮PCR扩增反应体系包括:待测样品cDNA模板1μL、浓度为10 μM的上游引物SHVV-1F 1μL、浓度为10μM的下游引物SHVV-1R 1μL、浓度为2x的Premix Taq 10μL、ddH2O 7μL,总量20μL。
6.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法,其特征是,所述第一轮PCR扩增反应程序为:95℃ 5 min,95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min,30个循环;72℃ 5 min延伸,12℃降温,4℃保存。
7.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法,其特征是,所述第二轮PCR扩增反应体系包括:第一轮PCR扩增产物 1μL、浓度为10 μM的上游引物SHVV-2F 1μL、浓度为10 μM的下游引物SHVV-2R 1μL、浓度为2x的Premix Taq 10μL、ddH2O 7μL,总量20μL。
8.根据权利要求4所述的鱼类弹状病毒巢式PCR检测方法,其特征是,所述第二轮PCR扩增反应程序为:95℃ 5 min;95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min,30个循环,72℃ 5 min延伸 , 12℃降温,4℃保存。
9.根据权利要求1所述的引物组、权利要求2或3所述的试剂盒或权利要求4-8中任一所述的检测方法在鱼类弹状病毒检测中的应用。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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