CN111057796A - 检测辣椒轻斑驳病毒的pcr引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测辣椒轻斑驳病毒的PCR引物组，包括3条辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)基因组运动蛋白(MP)和外壳蛋白(CP)编码基因部分序列特异引物与2条辣椒内参基因Actin特异引物，其中3条辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)基因组MP和CP基因部分序列特异引物分别为PMMoV‑F1、PMMoV‑F470和PMMoV‑R991，2条辣椒内参基因Actin特异引物为PeActin‑F1和PeActin‑R1093。本发明在1.0％～1.5％琼脂糖中进行PCR扩增结果的检测，不需要使用昂贵的荧光定量PCR仪，具有快速、经济、稳定性强、准确度高和灵敏度的特点。

Description

检测辣椒轻斑驳病毒的PCR引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于作物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的PCR引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)为烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的(+)sRNA病毒，最早在美国发现，其后在德国、荷兰、英国、加拿大、澳大利亚等国均有报道。该病毒主要通过种子和汁液传播，介体不易传毒，带毒种子、感病植株和带毒土壤是重要的侵染源，在干燥的植物病残体上可存活25年。PMMoV感染辣椒植株后可引起叶片皱缩、斑驳和花叶症状，果实褪绿和斑驳、变小、畸形甚至局部坏死和脱落，给辣椒生产造成严重的危害。1994年，在我国新疆辣椒上首次发现该病毒的危害，随着各地种子的引入和种质资源的频繁交流，PMMoV不断蔓延，在海南省、陕西、山东、宁夏、河北、辽宁等地区均有该病毒危害的报道，而且在一些地区已经上升为优势病毒种类，成为温室和大棚辣椒的重要致病病原之一，因此在生产上要密切监测该病毒引起的危害情况，加强种子检疫和脱毒处理，及时控制该病毒的蔓延与扩散。
在PMMoV病的防控中，对其进行快速、准确的检测是很关键的一个环节。传统的病毒检测方法主要有生物学法、电镜法、血清学法以及分子生物学检测法(主要包括RT-PCR法以及核酸杂交法)。目前，PMMoV检测方法应用比较普遍的包括血清学检测法(主要是ELISA法)和RT-PCR法。ELISA法检测灵敏度及特异性不高，容易出现假阴性和假阳性的现象，且试剂盒的成本较高，不适于PMMoV快速、准确检测。而RT-PCR(Reverse transcription-PCR)法具有灵敏度高、快速、特异性较强等其它检测方法所不能比拟的优点。但目前的RT-PCR方法都只采用一对特异引物对PMMoV进行检测，致使无法排除假阴性，甚至还会出现假阳性，导致检测结果不够准确。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种准确检测辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的的PCR引物组，本发明对从不同地区辣椒发病植株上的PMMoV基因组运动蛋白(movement protein，MP)和外壳蛋白(coat protein，CP)编码基因进行测序，从保守区设计3条特异性引物组成2对引物组合，在提高PMMoV检测特异性的同时，可以起到排除假阳性扩增的作用，另外，再增加设计1对辣椒内参引物可以检测cDNA合成质量，可以起到排除假阴性扩增的作用，为研究辣椒PMMoV流行情况及脱毒辣椒种的病毒检测提供技术支撑。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种检测辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的PCR引物组，包括3条辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)基因组MP和CP基因(4952～5942bp区域)部分序列特异引物与2条辣椒内参基因Actin特异引物，其中3条辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)基因组MP和CP基因部分序列特异引物分别为PMMoV-F1、PMMoV-F470和PMMoV-R991，2条辣椒内参基因Actin特异引物为PeActin-F1和PeActin-R1093，具体如下：
PMMoV-F1：TCCGAGAAGTGCCGACA，如SEQ ID NO.1所示；
PMMoV-F470:GTTCAACGGGTCCTCCTTC，如SEQ ID NO.2所示；
PMMoV-R991：TCAATTTGTCTGCCGCTGAG，如SEQ ID NO.3所示；
PeActin-F1:GTGACAATGGAACAGGAATG，如SEQ ID NO.4所示；
PeActin-R1093:CACTTCCGGTGGACAATG，如SEQ ID NO.5所示。
包含上述引物组的试剂或试剂盒。
采用如上所述的引物组检测辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的PCR检测方法，包括以下操作步骤：
(1)取待测样品，提取其总RNA，反转录为cDNA；
(2)采用所述引物组，以待测样品cDNA为模板进行PCR反应，获得扩增产物；
(3)1.0％～1.5％琼脂糖电泳检测2～5μL扩增产物，若出现1093bp、991bp且出现522bp条带，则表示样品cDNA可用且含有PMMoV病毒；若仅出现1093bp条带，则表示样品cDNA可用，但未检测到PMMoV病毒；若不出现任何条带，则表示样品cDNA不可用。
优选地，所述PCR反应体系中引物反应方式为：
PMMoV基因组MP和CP基因部分序列的特异引物组合PMMoV-F1、PMMoV-F470、PMMoV-R991为组合检测PMMoV；内参引物组合：PeActin-F1、PeActin-R1093检测样品中cDNA质量；
初检引物组：辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)MP和CP基因部分序列的特异引物组合PMMoV-F1、PMMoV-R991以及内参引物PeActin-F1、PeActin-R1093为初检组合，同时检测样品PMMoV与cDNA合成质量；复检引物组：辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)MP和CP基因部分序列的特异引物组合PMMoV-F470、PMMoV-R991为复检引物组合，排除假阳性。
优选地，所述初检PCR反应体系和反应条件为：初检PCR反应体系20μL，为：2×TaqPCR Mix反应液10μL、cDNA模板1μL、PMMoV基因组MP和CP基因部分序列特异上、下游引物各0.5μL、内参基因Actin特异上、下引物各1.0μL，加ddH2O补至总体积20μL；
初检PCR反应条件：94℃预变性2min；30个循环参数为：94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃5min。
优选地，所述复检PCR反应体系和反应条件为：复检PCR反应体系20μL，为：2×TaqPCR Mix反应液10μL、cDNA模板1.0μL、PMMoV基因组MP和CP基因部分序列特异上、下游引物各1.0μL，加ddH2O补至总体积20μL；
复检PCR反应条件：94℃预变性2min；30个循环参数为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s；最后72℃5min。如上所述的引物组或含有该引物组的试剂盒在检测检测辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)中的应用。
利用辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)基因组MP和CP基因部分序列的特异引物可在阳性病样cDNA中扩增生成991bp、522bp特异性条带，利用1对辣椒内参引物可在cDNA合成质量合格的样品中扩增生成1093bp条带。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过3条辣椒轻斑驳病毒基因组MP和CP基因部分序列的特异引物设计，可同时检测病毒的3个特异性位点，避免假阳性的产生，1对辣椒内参引物的使用，可以检测样品cDNA合成质量，避免假阳性结果，整个检测过程可以在4h内完成；进一步的，本发明在1.0％～1.5％琼脂糖中进行PCR扩增结果的检测，不需要使用昂贵的荧光定量PCR仪，具有快速、经济、稳定性强、准确度高和灵敏度的特点。
附图说明
图1是本发明初检PCR扩增产物电泳图。
图2是本发明是复检PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
一种辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)基因组MP和CP基因(4952～5942bp区域))部分序列特异引物与2条辣椒内参基因Actin特异引物，其中，3条辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)基因组MP和CP基因部分序列特异引物分别为PMMoV-F1、PMMoV-F470和PMMoV-R991，2条辣椒内参基因Actin特异引物为PeActin-F1和PeActin-R1093，具体如下：
PMMoV-F1：TCCGAGAAGTGCCGACA，如SEQ ID NO.1所示；
PMMoV-F470:GTTCAACGGGTCCTCCTTC，如SEQ ID NO.2所示；
PMMoV-R991：TCAATTTGTCTGCCGCTGAG，如SEQ ID NO.3所示；
PeActin-F1:GTGACAATGGAACAGGAATG，如SEQ ID NO.4所示；
PeActin-R1093:CACTTCCGGTGGACAATG，如SEQ ID NO.5所示。
采用如上所述的引物组检测辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的PCR检测方法，包括以下操作步骤：
(1)取待测样品，提取其总RNA，反转录为cDNA；
(2)采用所述引物组，以待测样品cDNA为模板进行PCR反应，获得扩增产物；PCR反应体系中引物反应方式：
PMMoV基因组MP和CP基因部分序列的特异引物组合PMMoV-F1、PMMoV-F470、PMMoV-R991为组合检测PMMoV；内参引物组合：PeActin-F1、PeActin-R1093检测样品中cDNA质量；
初检引物组：辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)MP和CP基因部分序列的特异引物组合PMMoV-F1、PMMoV-R991以及内参引物PeActin-F1、PeActin-R1093为初检组合，同时检测样品PMMoV与cDNA合成质量；初检PCR反应体系和反应条件为：初检PCR反应体系20μL，为：2×Taq PCR Mix反应液10μL、cDNA模板1.0μL、PMMoV基因组MP和CP基因部分序列特异上、下游引物各0.5μL、内参基因Actin特异上、下引物各1.0μL，加ddH2O补至总体积20μL；初检PCR反应条件：94℃预变性2min；30个循环参数为：94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃5min；初检后所得扩增产物取2～5μL进行1.0％～1.5％琼脂糖电泳检测，若出现1093bp(见图1第3泳道)条带、991bp(见图1第4泳道)条带，则表示样品cDNA可用，且样品可能含有(PMMoV)病毒，但不能排除假阳性，需对初检后所得产物继续做PCR复检；
若初检后所得产物出现1093bp(见图1第3泳道)，未出现991bp，则说明cDNA可用，未检测到(PMMoV)病毒，对初检后所得产物不再继续做PCR复检；
若初检后所得产物未出现1093bp，则说明cDNA不可用，不再进行复检，需重新取待测样品，提取其总RNA，反转录为cDNA；
复检引物组：辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)MP和CP基因部分序列的特异引物组合PMMoV-F470、PMMoV-R991为复检引物组合，排除假阳性；复检PCR反应体系20μL，为：2×TaqPCR Mix反应液10μL、cDNA模板1.0μL、PMMoV基因组MP和CP基因部分序列特异上、下游引物各1.0μL，加ddH2O补至总体积20μL；复检PCR反应条件：94℃预变性2min；30个循环参数为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s；最后72℃5min；
(3)取复检后所得扩增产物2～5μL进行1.0％～1.5％琼脂糖电泳检测，若出现522bp阳性条带(见图2第3泳道)，则表示可以排除假阳性，样品确实含有(PMMoV)病毒。
图1中1、2、3、4泳道分别是DNA Marker2000、阴性对照、内参基因Actin、内参基因Actin(1093bp)和PMMoV基因组序列片段(991bp)；图2中1、2、3泳道分别是DNA Marker1000、阴性对照、PMMoV基因组序列片段(522bp)。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 检测辣椒轻斑驳病毒的PCR引物组、试剂盒及其应用
<130> 吉昌
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgagaagt gccgaca 17
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttcaacggg tcctccttc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaatttgtc tgccgctgag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgacaatgg aacaggaatg 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cacttccggt ggacaatg 18

Claims (7)

1.一种检测辣椒轻斑驳病毒的PCR引物组，其特征在于，包括3条辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)基因组包含运动蛋白(MP)和外壳蛋白(CP)编码基因序列特异引物与2条辣椒内参基因Actin特异引物，其中3条辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)MP和CP基因序部分列特异引物分别为PMMoV-F1、PMMoV-F470和PMMoV-R991，2条辣椒内参基因Actin特异引物为PeActin-F1和PeActin-R1093，具体如下：
PMMoV-F1：TCCGAGAAGTGCCGACA，如SEQ ID NO.1所示；
PMMoV-F470:GTTCAACGGGTCCTCCTTC，如SEQ ID NO.2所示；
PMMoV-R991：TCAATTTGTCTGCCGCTGAG，如SEQ ID NO.3所示；
PeActin-F1:GTGACAATGGAACAGGAATG，如SEQ ID NO.4所示；
PeActin-R1093:CACTTCCGGTGGACAATG，如SEQ ID NO.5所示。
2.一种包含如权利要求1所述引物组的试剂或试剂盒。
3.一种采用如权利要求1所述的引物组检测辣椒轻斑驳病毒的PCR检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)取待测样品，提取其总RNA，反转录为cDNA；
(2)采用所述引物组，以待测样品cDNA为模板进行PCR反应，获得扩增产物；
(3)1.0％～1.5％琼脂糖电泳检测2～5μL扩增产物，若出现1093bp、991bp且出现522bp条带，则表示样品cDNA可用且含有PMMoV病毒；若仅出现1093bp条带，则表示样品cDNA可用，但未检测到PMMoV病毒；若不出现任何条带，则表示样品cDNA不可用。
4.根据权利要求3所述的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系中引物反应方式为：
PMMoV基因组MP和CP基因部分序列的特异引物组合PMMoV-F1、PMMoV-F470、PMMoV-R991为组合检测PMMoV；内参引物组合：PeActin-F1、PeActin-R1093检测样品中cDNA质量；
初检引物组：辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)MP和CP基因部分序列的特异引物组合PMMoV-F1、PMMoV-R991以及内参引物PeActin-F1、PeActin-R1093为初检组合，同时检测样品PMMoV与cDNA合成质量；复检引物组：辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)MP和CP基因部分序列的特异引物组合PMMoV-F470、PMMoV-R991为复检引物组合，排除假阳性。
5.根据权利要求4所述的PCR检测方法，其特征在于，所述初检PCR反应体系和反应条件为：初检PCR反应体系20μL，为：2×Taq PCR Mix反应液10μL、cDNA模板1.0μL、PMMoV MP和CP基因部分序列特异上、下游引物各0.5μL、内参基因Actin特异上、下引物各1.0μL，加ddH2O补至总体积20μL；
初检PCR反应条件：94℃预变性2min；30个循环参数为：94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃5min。
6.根据权利要求4所述的PCR检测方法，其特征在于，所述复检PCR反应体系和反应条件为：复检PCR反应体系20μL，为：2×Taq PCR Mix反应液10μL、cDNA模板1.0μL、PMMoV MP和CP基因部分序列特异上、下游引物各1.0μL，加ddH2O补至总体积20μL；
复检PCR反应条件：94℃预变性2min；30个循环参数为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s；最后72℃5min。
7.根据权利要求1所述的引物组或含有该引物组的试剂盒在检测检测辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)中的应用。
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