KR20040047338A - 고추마일드모틀바이러스 진단용 특이 프라이머 - Google Patents

고추마일드모틀바이러스 진단용 특이 프라이머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고추마일드모틀바이러스와 종 특이적으로 반응하는 핵산단편에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1, 4 내지 6으로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나의 핵산단편 또는 이들 핵산 단편의 특정 조합으로 구성되는 프라이머를 개시한다.
본 발명에 의하면 항혈청을 이용한 진단방법보다 1,000배 이상 검출한계가 높으며, 지금까지 알려진 고추마일드모틀바이러스의 모든 계통에 대한 검출이 가능하다. 또한 다른 관련 바이러스와의 비특이적 반응이 없어 훨씬 정밀하게 고추마일드모틀바이러스의 감염여부를 진단할 수 있다.

Description

고추마일드모틀바이러스 진단용 특이 프라이머{Specific Primers for Detection of Pepper mild mottle virus}
본 발명은 고추마일드모틀바이러스(Pepper mild mottle virus,PMMoV)와 종특이적으로 반응하는 핵산단편 및 그 조합에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 및 4 내지 6으로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나의 핵산단편 또는 이들 핵산 단편의 특정 조합으로 구성되는 프라이머에 관한 것이다.
고추마일드모틀바이러스는 전국적으로 널리 재배되고 있는 고추와 주요 수출작목으로 경제적 부가가치가 높은 단고추와 착색단고추 등에 흔히 발생하고 있다. 고추마일드모틀바이러스는 오염된 종자나 기계적인 접촉에 의해 쉽게 전염되어 경제적으로 큰 피해를 주고 있다. 최근에는 해외에서 채종된 종자의 도입이 계속적으로 증가하고 있어 고추마일드모틀바이러스의 도입 및 확산을 막기 위한 조기정밀진단기술의 개발이 요구되는 실정이다.
고추마일드모틀바이러스는 현재까지 몇 가지 계통이 알려져 있으며, 이들 간에는 상당한 변이가 존재한다. 현재까지 고추마일드모틀바이러스에 대한 진단 방법은 혈청학적 진단 방법만이 개시되어 있을 뿐이다. 하지만 동 방법으로는 계통간 변이가 존재하는 경우 검출능의 한계로 인해 검출에 실패할 가능성이 상당히 높은 실정이나 아직 이렇다할 대안은 제시되고 있지 못하다.
상기 종래 기술이 지니는 문제에 대한 해결방안을 제시하기 위해 안출된 본 발명의 목적은 계통간 변이에도 불구하고, 모든 고추마일드모틀바이러스 종에 걸쳐 광범위한 검출 스펙트럼을 가지는 핵산단편 내지는 프라이머를 제공함에 있다.
도 1은 고추마일드모틀바이러스 프라이머의 위치도
도 2는 프라이머 조합에 따른 고추마일드모틀바이러스와의 RT-PCR 사진
(Lane 1: 4/5, Lane 2: 3/5, Lane 3: 2/5, Lane 4: 1/5, Lane 5: 4/6, Lane 6: 3/6, Lane 7: 2/6, Lane 8: 1/6, Lane 9: 2/7, Lane 10: 1/7, Lane 11: 2/8, Lane 12: 1/8, Lane 13: 2/9, Lane 14: 1/9)
도 3은 1차 선발된 프라이머의 조합과 다른 유사 토바모바이러스와의 RT-PCR 사진
(Lane 1,6,11,16: PMMoV, Lane 2,7,12,17: ToMV, Lane 3,8,13,18: RMV, Lane 4,9,14,19: TMGMV, Lane 5,10,15,20: TMV)
상기 과제를 해결하기 위한 제 1관점에서의 본 발명은 고추마일드모틀바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 1 및 4 내지 6으로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 핵산단편을 포함한다.
또한 상기 제 1관점에 있어서의 핵산단편은 서열번호 1 및 4 내지 6으로 표시되는 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열을 포함한다.
또한 상기 제 1관점에 있어서의 핵산단편은 상기 핵산단편의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열을 포함한다.
상기에서 변형서열의 경우 실질적으로 고추마일드모틀바이러스의 게놈과 혼성화(hybridization)능을 유지하는 범위내에서 일부 염기의 결실, 삽입, 부가 및 치환된 서열을 의미한다.
또한 변형서열은 동일한 토바모바이러스(tobamovirus)에 속하며 유사한 기주범위를 가지는 토마토모자이크바이러스, 립그라스모자이크바이러스, 담배마일드그린모자이크바이러스, 및 담배모자이크바이러스 등의 게놈과 혼성화가 가능하지 않은 정도의 변형이어야 한다.
프로브 또는 프라이머로 사용되는 경우 변형된 염기의 수는 혼성화능을 실질적으로 유지하는 한 특별한 한정을 요하지는 아니하나, 통상 변이의 결과 얻어진 핵산단편의 총 염기 개수가 10∼50개 정도가 바람직하다.
핵산단편이 프라이머로 사용되는 경우 변이의 위치는 혼성화를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지는 않지만 바람직하게는 중합효소연쇄반응의 단계 중 신장단계(elongation step)에 영향을 미치는 3'말단 부위는 배제되거나, 최소한도의 변이만이 허용되어야 할 것이다.
상기 핵산단편의 분자상에 결합하는 표식물(marker)은 방사선 물질 또는 비방사선 물질의 어느 것도 포함될 수 있다. 방사선 물질은 예를 들면, 인산에스테르 부분에 방사선 동위체를 포함하는 것일 수 있다. 비방사선 표식물의 예로는 로다민, 플로오로세인 및 이들 유도체 등의 형광물질 등일 수 있다. 또한 간접적인 표식물로서 비오틴, 햅텐 등이 도입될 수도 있다.
고상 담체(solis-phase carrier)와 결합가능한 부위는 예를 들면, 샌드위치혼성화 반응 등 핵산의 특이 단편을 고상 담체에 특이적으로 결합할 경우에 이용된다. 고상 담체는 중합효소 연쇄반응 생성물의 선택적인 검출을 더욱 효과적으로 수행할 수 있도록 하는 한 특별히 한정되지는 아니한다. 이들 고상 담체의 예로는 예로는 아가로스비드, 폴리아크릴비드, 라텍스, 마이크로타이터, 폴리스티렌볼 등의 고상담체에 프라이머 중에 도입된 결합부위를 포착가능하도록 프트렙토아비딘, 항체 등을 도입한 것 등이 있다.
상기 포식물 또는 고상담체와 결합가능한 부위는 프라이머로 사용되는 경우 중합연쇄반응시 신장에 방해를 주지 않기 위해 바람직하게는 5'말단부위에 도입된다.
본 발명의 핵산단편의 서열과는 상이하지만 상기와 같이 핵산단편에서 변형서열, 표식물, 고체상 담체 등을 사용하는 보다 구체적인 예가 특허공개 2001-0095120호에 개시되어 있다.
제 2관점에 의한 본 발명은 핵산단편의 조합으로서,
고추마일드모틀바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 1 또는 4 로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 핵산단편;
상기에서 선택된 어느 하나의 핵산단편과 조합되며, 고추마일드모틀바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 핵산단편의 조합으로 구성되는 프라이머를 포함한다.
상기 제 2관점에 의한 프라이머를 구성하는 핵산단편은 서열번호 1 및 4 내지 6으로 표시되는 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열을 포함한다.
또한 상기 제 2관점에 의한 프라이머를 구성하는 핵산단편은 상기 핵산단편의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열을 포함한다.
상기 본 발명의 제 2관점에서의 프라이머를 구성하는 핵산단편에서 변형서열, 표식물, 고체상 담체 등은 앞서 제 1측면에 의한 본 발명의 내용에서 설명한 바와 실질적으로 같으므로 여기서는 생략하기로 한다.
본 발명은 상기 개시된 핵산 단편 또는 핵산단편의 조합을 프라이머로 하고, 상기 프라이머를 미지의 바이러스의 게놈에 부가하여 중합효소연쇄반응에 의해 얻어진 산물로부터 고추마일드모틀바이러스를 검출하는 방법을 포함한다.
프라이머 신장반응은 예를 들면 유전자의 PCR증폭반응에 이용되는 효소, 반응조건 등에 대해서는 각종 수법들이 개시되어 있다. 본 발명에 기본이 되는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열은 각종 PCR법의 어느 것에 의하더라도 프라이머로서 충분한 길이 및 염기서열을 지니고 있다. 따라서, 각종 PCR의 어느 것을 적용하더라도 상기 설명한 바와 같은 부가적인 변형, 염기길이의 조정, 변이의 도입 등을 필요에 따라 실시하여 고추마일드모틀바이러스를 검출할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.
<실시예 1> 바이러스의 분리 및 유지
본 발명을 위해 사용된 바이러스의 분리 방법 및 유지는 다음과 같다.
(1) 실험대상 바이러스
고추마일드모틀바이러스 진단용 핵산단편 내지는 프라이머를 개발하기 위해 대상 바이러스인 고추마일드모틀바이러스와 대조 바이러스로 토바모바이러스 (tobamovirus)에 속하며 유사한 기주범위를 가지는 토마토모자이크바이러스(Tomato mosaic virus, ToMV), 립그라스모자이크바이러스(Ribgrass mosaic virus, RMV), 담배마일드그린모자이크바이러스(Tobacco mild green mosaic virus, TMGMV), 및 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus, TMV)가 이용되었다.
(2) 실험대상 바이러스의 분리
고추마일드모틀바이러스는 고추로부터, 토마토모자이크바이러스는 오토마토로부터, 립그라스모자이크바이러스는 배추로부터, 담배마일드그린모자이크바이러스와 담배모자이크바이러스는 담배로부터 각각 분리되었다.
상기 분리된 바이러스는 명아주 (Chenopodium amaranticolor)를 사용하여 식물바이러스 분리에서 일반적으로 사용되고 있는 국부병반분리법으로 순수분리한 다음, 박과식물에 접종하여 그대로 유지시킨 것이다.
<실시예 2> 프라이머의 설계
(1) 고추마일드모틀바이러스 분리주들의 유전정보 분석
고추마일드모틀바이러스의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위해 현재까지 알려진 고추마일드모틀바이러스 분리주들의 유전정보를 분석하였다. 염기서열 분석에 사용한 고추마일드모틀바이러스 분리주들을 하기 표 1에 나타내었다.
<표 1> 프라이머 설계에 이용한 고추마일드모틀바이러스 분리주
분리주명 분리기주 염기서열
PMMoV-I 고추 X72587 (Genbank)
PMMoV-J 고추 AB000709 (Genbank)
PMMoV-KP1 고추 농업과학기술원 식물병리과
PMMoV-S 고추 M81413 (Genbank)
프라이머 합성을 위한 염기서열 분석은 외피단백질 (coat protein, CP)과 이동단백질(movement protein, MP)을 포함하는 3' 말단영역 (3' untranslatedregion, 3'UTR)을 대상으로 하였다.
(2) 공통 염기서열의 탐색
상기 영역에서 모든 고추마일드모틀바이러스 계통들이 공통적으로 가지고 있는 염기서열 중에서 프라이머로서의 조건에 맞는 서열을 탐색하여 4개의 업 스트림 프라이머와 5개의 다운 스트림 프라이머를 하기 표 2와 같이 합성하였다. 합성과정은 화학합성법을 이용하였으며, DNA 자동합성기 모델 381A(퍼킨 엘머사)이 이용되었다.
<표 2> 고추마일드모틀바이러스 종 특이적 프라이머
프라이머 염기서열 (5'→3') 크기 위치
서열 1 GGACGACGTTAAGATTTC 18 MP
서열 2 TTCTTACCTGCTGTTATC 18 MP
서열 3 ACGTAAATTTCGCAATCAATCTAAG 25 MP
서열 4 ATTGGGCAGAACTCGGAGTCATCGG 25 MP
서열 5 GTCCACTCGCGCTCTCGAACAGAGC 25 CP
서열 6 GCTCCGAGAAGTGCCGACA 19 CP
서열 7 TTCTGCCCAATTCTAACCTT 20 MP
서열 8 CAGCTTCCCTTCCTTATTCA 20 MP
서열 9 ACCTACATACTTATTACTTCC 21 MP
상기 설계한 각 프라이머의 위치는 도 1에 나타내었다.
<실시예 3> 프라이머 선발
1. 본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리방법과 RT-PCR 조건은 다음과 같다.
(1) 총 RNA 분리
총 RNA는 구아니딘산-페놀 추출 방법을 이용하여 분리하였다. 감염식물체 50 ㎎에 변성완충액(4 M 구아니디니움티오시아네이트, 25 mM 소듐시트레이트, 0.5% sarcosyl, 100 mM 2-머켑토에탄올) 600 ㎕를 넣고 유발과 유봉을 이용하여 마쇄하였다.
여기에 2 M 소듐아세테이트 (pH 4.0) 60 ㎕를 첨가하고, 페놀:클로로포름:이소아밀알콜 (125:24:1) 600 ㎕를 첨가하여 혼합 후, 얼음에 15분간 정치시키고 10,000 g에서 20분간 원심분리시켰다.
그런 다음, RNA를 함유하고 있는 수층을 채취하여 같은 양의 이소프로판올과 혼합한 다음 -20℃에서 30분간 정치시키고 10,000 g에서 20분간 원심분리시켰다. 형성된 침전물을 변성완충액 500 ㎕로 녹인 다음, 같은 양의 이소프로판올과 혼합하여 -20℃에서 30분간 정치시키고 10,000 g에서 10분간 원심분리시켰다.
그런 다음, 침전물을 75% 에탄올과 원심분리로 3회 세척하고, 100 ㎕ 증류수로 녹인 것을 냉동보관시켰다.
(2) 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR)
RT-PCR은 아래의 조건으로 실시하였다.
역전사는 5배의 역전사완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl2, 150 mM KCl, 5 mM 디티오스레이톨, pH 8.5) 4 ㎕, AMV 역전사효소 2.5 U, 10 mM dNTP 2 ㎕, RNase 억제제 10 U, 다운스트림 프라이머 25 pmole, 및 총 RNA 1 ㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20 ㎕로 만든 후, 42℃에서 30분간 역전사 반응을 실시하고 95℃에서 2분간 처리한 다음 4℃로 냉각시켰다.
PCR은 상기 역전사 반응액 20 ㎕에 10배의 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, pH 8.3) 8 ㎕, 업스트림 프라이머 25 pmole, Taq DNA 중합효소 2.5 U를 넣고 증류수를 첨가하여 100 ㎕ 반응액으로 조성하였다.
PCR은 반응액을 95℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 45초, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분 간 총 40회 실시하였다. PCR 산물은 1.2% 아가로오즈젤에서 분석하였다.
2. 합성한 프라이머는 RT-PCR 산물의 크기를 감안하여 업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머를 한 쌍으로 14가지로 조합하였다. 상기 14가지 조합은 고추마일드모틀바이러스에 감염된 작물에서 분리한 총 RNA와 RT-PCR을 실시하여 고추마일드모틀바이러스 진단에 보다 효과적인 조합을 1차 선발하였다. 여기서 선발된 프라이머 조합은 서열 4/5, 서열 1/5, 서열 4/6, 및 서열 1/9 이다(도 2참조).
1차 선발된 프라이머 조합은 같은 토바모바이러스(tobamovirus)에 속하며 유사한 기주범위를 가지는 토마토모자이크바이러스, 립그라스모자이크바이러스, 담배마일드그린모자이크바이러스, 및 담배모자이크바이러스와도 RT-PCR을 수행하여(도 3 참조) 비특이적 반응을 일으키지 않는 프라이머 조합 중 보다 우수한 특성을 가지는 3개의 조합을 최종적으로 선발하였다.
최종적으로 선발된 프라이머 조합과 PCR 산물의 크기는 표 3과 같다.
<표 3> 최종 선발된 고추마일드모틀바이러스 진단용 프라이머 조합
조합번호 포워드 프라이머 리버스 프라이머 반응생성물 사이즈(bp)
1 서열번호 4 서열번호 5 501
4 서열번호 1 서열번호 5 1210
5 서열번호 4 서열번호 6 310
본 발명에 의하면 항혈청을 이용한 진단방법보다 1,000배 이상 검출한계가 높으며, 지금까지 알려진 고추마일드모틀바이러스의 모든 계통에 대한 검출이 가능하다. 또한 다른 관련 바이러스와의 비특이적 반응이 없어 훨씬 정밀하게 고추마일드모틀바이러스의 감염여부를 진단할 수 있다.

Claims (7)

  1. 고추마일드모틀바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 1 및 4 내지 6으로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 프라이머
  2. 제 1항에 있어서,
    서열번호 1 및 4 내지 6으로 표시되는 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열임을 특징으로 하는 프라이머
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산단편의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열임을 특징으로 하는 프라이머
  4. 고추마일드모틀바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 1 또는 4 로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 핵산단편;
    상기에서 선택된 어느 하나의 핵산단편과 조합되며, 고추마일드모틀바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 핵산단편의 조합으로 구성되는 프라이머
  5. 제 4항에 있어서,
    서열번호 1 및 4 내지 6으로 표시되는 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열임을 특징으로 하는 프라이머
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 핵산단편의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열임을 특징으로 하는 프라이머
  7. 제 1항 내지 제 6항에서 선택된 핵산단편 및 조합을 프라이머로 하고, 상기 프라이머를 미지의 바이러스의 게놈에 부가하여 중합효소연쇄반응에 의해 얻어진 산물로부터 고추마일드모틀바이러스를 검출하는 방법
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