KR100827551B1 - 담배녹반모자이크바이러스 진단용 특이 프라이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 담배녹반모자이크바이러스(Tobacco mild green mosaic virus, TMGMV)와 종 특이적으로 반응하는 저항성 연관 핵산단편에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물체의 담배녹반모자이크바이러스 저항성 형질과 연관 정도가 매우 높은 서열을 가지는 핵산, 상기 핵산의 일부 염기서열을 포함하는 프라이머 및 이들을 이용하여 담배녹반모자이크바이러스 저항성 식물체를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 분자 표지는 담배녹반모자이크바이러스를 식물체에 직접 접종하지 않고서도 신속하고 정확하게 담배녹반모자이크바이러스 저항성 식물체를 검출할 수 있으며, 나아가 담배녹반모자이크바이러스 저항성 식물체의 유전형을 결정할 수 있는 장점이 있으며, 항혈청을 이용한 진단방법보다 1,000배 이상 검출한계가 높다. 지금까지 알려진 담배녹반모자이크바이러스의 모든 계통에 대한 검출이 가능하고, 또한 다른 관련 바이러스와의 비특이적 반응이 없어 훨씬 정밀하게 담배녹반모자이크바이러스의 감염여부를 진단할 수 있다.

담배녹반모자이크바이러스, 저항성, 분자표지

Description

담배녹반모자이크바이러스 진단용 특이 프라이머{Specific primer for detection of Tobacco mild green mosaic virus}

도 1은 담배녹반모자이크바이러스 프라이머의 위치도

도 2는 프라이머 조합에 따른 담배녹반모자이크바이러스와의 RT-PCR 사진

(Lane 1: 조합 1, Lane 2: 조합 2, Lane 3: 조합 3, Lane 4: 조합 4)

본 발명은 담배녹반모자이크바이러스(Tobacco mild green mosaic virus, SMV)와 종 특이적으로 반응하는 저항성 연관 핵산단편에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물체의 담배녹반모자이크바이러스 저항성 형질과 연관 정도가 매우 높은 서열을 가지는 핵산, 상기 핵산의 일부 염기서열을 포함하는 프라이머 및 이들을 이용하여 담배녹반모자이크바이러스 저항성 식물체를 검출하는 방법을 제공한다.

대장균과 비슷한 막대형 모형을 띠고 있는 담배녹반모자이크바이러스 입자는 단일가닥의 RNA로 이루어져 있으며, 전체 게놈(genome) 크기는 6.355kb에 달한다. 담배녹반모자이크바이러스는 토바모(Tobamo) 그룹에 속하는 담배녹반모자이크바이러스로 서브게놈 mRNA(sub-genomic mRNA)를 가지고 있고 이런 단편적인 가닥이 기주에 작용하는 중요인자로 생각되어진다. 또한 약 85개정도의 다양한 RNA 단편들이 분리되어지고 있어 담배녹반모자이크바이러스의 진단 및 탐색에 많은 어려움을 야기하고 있다.

또한 담배녹반바이러스의 바이러스 단백질은 67-68%에 달하는 담배모자이크바이러스와 토마토모자이크바이러스와 아미노산 상동성을 가지고 있다. 이는 토바모(Tobamo) 그룹안에서 가장 가까운 연관성을 가지고 있어서 항혈청기법의 검출시 문제의 소지를 가지고 있다. 본 발명은 ELISA기기를 이용한 항혈청 반응으로 담배녹반모자이크바이러스를 탐색하고 진단하던 1986년대의 실험 기법(Wetter & Altschuh, J. Phytopath. 1987,Zrein, Burckard & Van Regenmortel, J. virol. Methods 1986.)보다 검출한계를 높였다. 본 발명에서 이용하는 바이러스 특이 염기서열을 포함하는 프라이머는 모든 바이러스가 싸고 있는 외피단백질(coat protein 또는 capsid protein)부분에서 고안하였다. 바이러스마다 외피단백질을 모두 가지고 있으며, 바이러스의 종 특이적으로 반응하는 저항성 연관 핵산단편에 관한 것으로 보이는 부분이다.

한편, 병 저항성 품종을 육종하기 위해서는 병 저항성 인자를 갖는 다른 품종으로부터 계속적인 역교배를 통하여 그 인자를 도입하여야 하며, 도입 단계마다 저항성 시험을 거쳐 선발하여야 하는데, 이러한 선발 단계에서 상기 병 저항성 인자와 밀접하게 연관되어 있는 분자 표지(molecular marker)를 이용한다면 매우 편리할 것이다. 예를 들면, 대한민국 특허출원 제2002-75493호에서는 오이모자이크바이러스와 종 특이적으로 반응하는 핵산단편의 특정 조합으로 구성되는 프라이머를 이용하여 오이모자이크바이러스의 감염여부를 진단하는 방법을 제공하고, 대한민국 특허출원 제2002-75495호에서는 수박모자이크바이러스2와 종 특이적으로 반응하는 핵산단편의 특정 조합으로 구성되는 프라이머를 이용하여 수박모자이크바이러스2의 감염여부를 진단하는 방법을 제공하고, 대한민국 특허출원 제2004-86321호에서는 식물 바이러스 중에서도 기주 범위가 가장 넓은 식물병원 바이러스로 알려진 쿠쿠모바이러스(Cucumovirus) 그룹에 속하는 CMV(cucumber mosaic virus)의 핵산의 일부 염기서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 CMV 저항성 식물체를 검출하는 방법을 제공한다.

앞서 말한 바와 같이 일반적으로 담배녹반모자이크바이러스의 계통 간에는 상당한 변이가 존재한다. 현재까지 담배녹반모자이크바이러스에 대한 진단 방법은 혈청학적 진단 방법만이 개시되어 있을 뿐이다. 하지만 동 방법으로는 계통간 변이가 존재하는 경우 검출능의 한계로 인해 검출에 실패할 가능성이 상당히 높은 실정이나 아직 이렇다 할 대안은 제시되고 있지 못하다. 담배녹반모자이크바이러스의 감염이 국내 보급된 담배녹반과 작물에 발생하여 심각한 피해를 야기할 수 있는데 이 병의 실질적인 방제를 위해서는 건전한 종자와 재배관리가 필수적이며, 담배녹반모자이크바이러스 병 발생시 조속한 방제대책을 강구해야 더 큰 피해를 막을 수 있다. 이를 위해서는 정밀하고 신속한 담배녹반모자이크바이러스의 진단이 절실히 필요하다.

본 발명은 이를 해결하기 위하여 지금까지 알려진 담배녹반모자이크바이러스(Tobacco mild green mosaic virus, TMGMV)의 모든 계통에 작용하는 특이 프라이머(Primer)를 개발하고자 하였다.

본 발명자들은 계통간 변이에도 불구하고, 모든 담배녹반모자이크바이러스 종에 걸쳐 광범위한 검출 스펙트럼을 가지는 핵산단편 내지는 프라이머를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 담배녹반모자이크바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 1~4로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1~4로 표시되는 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열임을 특징으로 하는 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산단편의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열임을 특징으로 하는 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1~4로 표시되는 염기서열 또는 프라이머를 포함하는 담배녹반모자이크바이러스 저항성 식물체 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1~4로 표시되는 염기서열 또는 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 담배녹반모자이크바이러스 저항성 식물체의 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1~4로 표시되는 선택된 핵산단편 및 조합을 프라이머로 하고, 상기 프라이머를 미지의 바이러스의 게놈에 부가하여 중합효소연쇄반응에 의해 얻어진 산물로부터 담배녹반모자이크바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 담배녹반모자이크바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 1~4로 표시되는 염기서열, 그의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택되는 프라이머를 포함한다.

본 발명은 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합인 서열임을 특징으로 하는 프라이머를 포함한다.

본 발명은 핵산단편의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열임을 특징으로 하는 프라이머를 포함한다.

본 발명은 염기서열 또는 프라이머를 포함하는 담배녹반모자이크바이러스 저항성 식물체 검출용 키트를 포함한다.

본 발명은 염기서열 또는 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 담배녹반모자이크바이러스 저항성 식물체의 검출 방법을 포함한다.

본 발명은 선택된 핵산단편 및 조합을 프라이머로 하고, 상기 프라이머를 미지의 바이러스의 게놈에 부가하여 중합효소연쇄반응에 의해 얻어진 산물로부터 담배녹반모자이크바이러스를 검출하는 방법을 포함한다.

변형서열의 경우 실질적으로 담배 녹반 모자이크 바이러스의 게놈과 혼성화(hybridization)능을 유지하는 범위내에서 일부 염기의 결실, 삽입, 부가 및 치환된 서열을 의미한다.

프로브 또는 프라이머로 사용되는 경우 변형된 염기의 수는 혼성화능을 실질적으로 유지하는 한 특별한 한정을 요하지는 아니하나, 통상 변이의 결과 얻어진 핵산단편의 총 염기 개수가 10∼50개 정도가 바람직하다.

핵산단편이 프라이머로 사용되는 경우 변이의 위치는 혼성화를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지는 않지만 바람직하게는 중합효소연쇄반응의 단계 중 신장단계(elongation step)에 영향을 미치는 3'말단 부위는 배제되거나, 최소한도의 변이만이 허용되어야 할 것이다.

본 발명의 핵산단편의 서열과는 상이하지만 상기와 같이 핵산단편에서 변형서열을 사용하는 보다 구체적인 예가 대한민국 등록특허 제0454434호에 개시되어 있다.

담배녹반모자이크바이러스 진단용 특이 프라이머를 설계하기 위하여 지금까지 알려진 모든 담배녹반모자이크바이러스의 전체 게놈 유전정보를 분석하였다. 또한 담배녹반모자이크바이러스의 여러 계통과 분리주들간의 유전정보를 참고하여 정렬하고 외피단백질(Capsid or Coat protein)을 포함하는 전체 염기서열 중에서 공통적으로 가지고 있는 프라이머로서의 조건을 충족하는 부분를 도출할 수 있었다(도1). 이 중 담배 모자이크 바이러스나 토마토모자이크바이러스와의 상동성이 일치하지 않는 바이러스 특이적으로 반응하는 연관 핵산단편에 관한 것에 일치하도록 탐색하여 설계하였다. 설계한 프라이머들은 담배녹반모자이크바이러스와의 RT-PCR을 통하여 진단에 효과적인 프라이머 조합을 최종적으로 선발하였다(도2).

본 발명에 따라 제공되는 담배녹반모자이크바이러스의 프라이머 설계, 프라이머 선발, RT-PCR에 의한 바이러스 진단을 아래에서 실시 예에 의해 설명하였다.

이하 본 발명이 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1> 프라이머의 설계

(1) 담배녹반모자이크바이러스 분리주들의 유전정보 분석

담배녹반모자이크바이러스의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위하여 지금까지 알려진 담배녹반모자이크바이러스 분리주들의 유전정보를 미국 NCBI 온라인 사이트를 이용한 모든 유전자 은행의 정보로 대체하여 이를 분석하였다.

(2) 공통 염기서열 및 기주 특이적 염기서열 탐색

담배녹반모자이크바이러스의 전체 게놈 분석 데이터를 분리주와 계통 별로 수집하여 이를 정렬하고, 공통적인 염기서열의 부분적 위치를 확인하였다.

담배 녹반 모자이크바이러스의 공통염기서열 탐색에 이용된 분리주들은 NCBI에 등재되어 있는 Genbank accession no.는 AF103783, AF103782, TMI429097, TMI429096, TMI429095, M34236, M34077, NC_001556, AB078435로 외피단백질 영역부분과 그 근처를 대상으로 하였다. 이 영역에서 모든 담배녹반모자이크바이러스 계통들이 공통적으로 가지고 있는 염기서열 중에서 프라이머로서의 조건에 맞는 서열을 탐색하여 표 1과 같은 프라이머를 합성하였다.

(3) 합성한 프라이머 개요

표 1에서 보면 종류는 정방향(forward)과 역방향(reverse) 프라이머로 분리하였으며, 탐색된 영역의 위치를 같이 나타내었다. 상세 합성한 프라이머 위치는 도 1에 나타내었다.

종류	프라이머	염기서열(5→3)	크기
forward	서열1	CCT TAT ACA ATC AAC TCT CCG A	22
forward	서열2	TGA GAT TTC CTG CAT CGG ATT T	22
reverse	서열3	TTT GGT ATC AGC CAC CCT GAA	21
reverse	서열4	TGC TTG ATT GAA CAT GCC AGT T	22

<담배녹반모자이크바이러스 종 특이적으로 설계한 프라이머>

<실시예 2> 프라이머 선발

합성한 프라이머는 RT-PCR 산물의 크기를 감안하여 정방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머를 한 쌍으로 4가지로 조합하였다. TMGMV는 우리나라 담배와 고추에서 발생이 확인되었으며, 프라이머의 RT-PCR 검정에 사용한 담배 녹반 모자이크바이러스 분리주 TMGMV는 고추에서 분리한 것으로써, 4조합은 TMGMV 분리주의 총 RNA와의 RT-PCR을 통하여 담배녹반모자이크바이러스 진단에 효과적인 조합을 선발하였다. 선발된 프라이머 조합과 RT-PCR 산물의 크기는 표 2와 같다.

조합번호	포워드프라이머 (forward primer)	리버스프라이머 (reverse primer)	반응 생성물사이즈 (product size (bp))
1	서열 1	서열 3	550
2	서열 1	서열 4	450
3	서열 2	서열 3	350
4	서열 2	서열 4	200

<담배녹반모자이크바이러스 진단용 프라이머 조합>

1. 본 발명을 위해 사용한 총(Total) RNA 분리방법과 RT-PCR 조건은 다음과 같다.

(1) 총 RNA 분리

총 RNA는 트리졸 용액(Tri-reagent; TR118, MRC co.) 추출 방법을 이용하여 분리하였다.

1) 감염식물체 100mg을 유발에 담아 액체질소를 넣어 유봉을 이용하여 잘게 마쇄

2) 마쇄된 식물체 조직을 온도를 떨어뜨린 용기에 담고 트리졸 용액 1ml를 넣고 볼텍싱(vortexing)으로 고루 섞음

3) 200ul 클로로포름(Chloroform) 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 15분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리

4) RNA를 함유하고 있는 수층을 채취하여 위 3)방법으로 맑은 수층을 수득

5) 수득한 수층의 80%정도 부피의 이소프로파놀(Isopropanol)을 혼합하여 실온에서 20분간 정치한 다음 4℃에서 13,000rpm으로 20분간 원심분리

6) 침전물의 이소프로파놀(Isopropanol) 액을 건조시켜 2ml의 70% 에탄올을 넣어 침전물을 흔들어 세척

7) 70% 에탄올에 부양되어있는 침전물을 4℃에서 13000rpm으로 15분 동안 원심분리

8) 침전물의 70% 에탄올 액을 건조시켜 100ul 증류수로 녹여서 냉동보관

(2) 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR)

RT-PCR은 아래의 조건으로 실시하였다.

1) 30ug 총 RNA에 역방향 프라이머(reverse primer)를 총 RNA량의 1/10ug을 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 12㎕로 만들어, 70℃에서 10분 반응한 후 ice에서 30분 정치

2) 역전사는 위 반응액에 5배 역전사완충액 (250 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl₂, 150 mM KCl, 5 mM dithiothreithol, pH 8.5) 4㎕, 10 mM dNTP 2㎕, RNA 분해효소 저해제(RNase inhibitor) 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 반응액을 20㎕로 만들어 37℃에서 5분 정도 반응

3) MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 2유니트(unit)을 넣고, 42℃에서 1시간 역전사 반응을 실시하고 70℃에서 10분간 처리한 다음 얼음(ice)으로 냉각

4) PCR은 역전사반응으로 합성해놓은 cDNA를 ½희석한 후 주형으로 1㎕사용

5) 10배 PCR 완충액 (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl₂, 500 mM KCl, pH 8.3) 2㎕, 정방향(forward) 프라이머 5pmole, 역방향(reverse) 프라이머 5pmole, 10mM dNTPs 0.4㎕, EF Taq 중합효소(polymerase) 1유니트(unit)를 넣고 증류수로 첨가하여 20㎕ 반응액으로 수행

6) PCR 조건은 94 ℃에서 1분간 변성시킨 후, 변성(Denature)는 94 ℃에서 30초, 결합(Annealing) 58 ℃에서 30초, 합성(Extension)은 72 ℃에서 30초를 35회 실시7) PCR 산물은 1% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석

상기한 바와 같이, 본 발명은 담배녹반모자이크바이러스 저항성 형질과 연관 정도가 매우 높은 유전자 염기서열을 갖는 분자 표지를 제공함으로써, 담배녹반모자이크바이러스를 식물체에 직접 접종하지 않고서도 신속하고 정확하게 담배녹반모자이크바이러스 저항성 식물체를 검출할 수 있으며, 나아가 담배녹반모자이크바이러스 저항성 식물체의 유전형을 결정할 수 있는 장점이 있으며, 항혈청을 이용한 진단방법보다 1,000배 이상 검출한계가 높으며, 지금까지 알려진 담배녹반모자이크바이러스의 모든 계통에 대한 검출이 가능하다. 또한 다른 관련 바이러스와의 비특이적 반응이 없어 훨씬 정밀하게 담배녹반모자이크바이러스의 감염여부를 진단할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

1. 담배녹반모자이크바이러스와 종 특이적으로 반응하는 서열번호 1~4로 표시되는 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로부터 조합에 의해 선택되는 프라이머 세트로서, 상기 조합은 정방향 프라이머가 서열번호 1 및 2로 이루어진 군에서 선택되고, 역방향 프라이머가 서열번호 3 및 4로 이루어진 군에서 선택되는 프라이머 세트.
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