KR102592643B1 - 농어와 점농어 종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 농어와 점농어를 판별하는 방법 - Google Patents
농어와 점농어 종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 농어와 점농어를 판별하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 농어와 점농어 종 판별을 위한 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 판별용 조성물, 이를 이용하여 농어와 점농어를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 판별 키트에 관한 것으로, 농어와 점농어 간의 미토콘드리아 DNA의 co1 유전자 영역을 이용하여 각각의 종에 대한 real-time PCR에 사용되는 특이적 프라이머 세트와 형광표지 프로브를 제작하여 종래기술보다 더욱 정확하고 간편하며 신속한 종 간 식별 마커를 제공한다.
Description
본 발명은 농어와 점농어 종 판별을 위한 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 판별용 조성물, 이를 이용하여 농어와 점농어를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 판별 키트에 관한 것이다.
농어(Lateolabrax japonicas)는 우리나라의 서해안과 남해안을 비롯한 중국, 대만 그리고 일본의 연안에 서식하며, 바다와 담수가 만나는 기수역에서도 서식하는 습성을 나타내는 어종으로서 산란기는 11월부터 4월 사이로 알려져 있다.
점농어(Lateobrax maculatus)는 우리나라를 비롯한 중국, 대만 그리고 일본에 서식한다. 특히, 우리나라에서는 서해안에 주로 분포하며, 남해안과 동해안 등지에서도 드물게 서식한다. 농어와 마찬가지로 일정 기간을 기수역에서 보내며, 농어에 비해 담수 적응력이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 또한, 해수와 담수에서 모두 산란이 가능하며, 10월부터 11월까지 산란한다.
우리나라에서는 농어와 점농어를 학술적으로 구분하여 사용하고 있으나, 정작 시장에서는 농어와 점농어를 구분하지 않고 모두 농어로 취급하여 유통하고 있다.
한편, 중국 연안의 환경적 요소와 양식 효율로 인하여 중국에서는 점농어를 양식하는 것으로 알려져 있으며, 중국으로부터 우리나라로 수입되는 양식산 농어는 모두 점농어로 알려져 있다. 이에 따라, 우리나라에서 유통되는 국내 양식산 농어의 대부분은 중국으로부터 종자를 수입하여 양식한 후, 유통되기에 양식산 농어는 점농어가 주를 이룬다.
우리나라는 ‘국산 수산물 및 원양산 수산물 원산지표시 대상’품목에서 농어류를 ‘해면어류’로 분류하여 소비자의 알권리 보장과 공정 거래를 유도하는 등 국가 정책을 통해 제도적으로 보호하고 있다. 일반적으로 시중에 유통되는 농어류는 농어, 점농어, 넙치농어(Lateolabrax latus) 등으로 알려져 있으나, 넙치농어는 희소한 고급어종으로 자연산만 시중에 간혹 유통되며, 형태적으로도 농어 및 점농어와 뚜렷한 차이를 나타낸다. 그러나 농어와 점농어는 등 측면에 나타나는 점의 유무와 척추골수의 차이로 이들을 동정하지만, 점농어 중에서 등 쪽 측면에 점이 나타나지 않는 개체들이 다수 존재하고, 척추 골수는 직접 해부해서 확인해야 하는 한계점이 존재하여 실제 수입, 검역 및 유통 과정에서 실효성이 낮은 문제가 있다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 유전자 염기서열 비교 분석을 이용한 분자계통수 및 유전적 거리 비교 등의 분자계통학적 분석법이 널리 이용되고 있다. 하지만 이러한 분석 방법은 계통분류학과 분자계통학 등의 전문적 지식이 요구되며, 신속하게 종 판별을 수행하기 힘든 문제점이 있어, 이를 해결하기 위하여 단일염기 다형성(Single-nucleotide polymorphism, SNP)을 이용한 특이적PCR band 검출법이 널리 이용되고 있다. 일반적으로 종 판별을 위해 사용되는 염기서열 분석 방법의 경우, 실험 및 분석 시간이 매우 오래 걸린다는 단점을 가지고 있으며, 일반 중합효소연쇄반응(PCR) 방법의 경우, 염기서열 차이가 적을 경우, 오류를 나타낼 수 있어, 특이 밴드 수준에서 차이가 나타나지 않을 가능성이 존재한다.
따라서, 본 발명자들은 Real-time PCR 방법을 사용하여 이종임에도 불구하고 형태적으로 매우 유사한 농어와 점농어 간 종 판별 방법을 발굴하고자 예의 노력하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 농어와 점농어 종 판별을 위한 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 판별용 조성물을 이용하여 신속하고 정확하게 농어와 점농어를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 판별용 조성물을 포함함으로써, 신속하고 정확하게 농어와 점농어를 판별하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 5의 프로브를 포함하는 점농어 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 6의 프로브를 포함하는 농어 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 5의 프로브; 및
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 6의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는, 농어와 점농어 판별을 위한 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 점농어로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 상기 점농어 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 점농어를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 농어로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 상기 농어 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 농어를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 농어 및 점농어로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 상기 농어와 점농어 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 농어와 점농어를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 점농어 판별용 조성물을 포함하는 점농어를 판별하기 위한 점농어 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 농어 판별용 조성물을 포함하는 농어를 판별하기 위한 농어 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 농어와 점농어 판별용 조성물을 포함하는 농어와 점농어를 판별하기 위한 농어와 점농어 판별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 농어와 점농어 종 판별을 위한 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 판별용 조성물, 이를 이용하여 농어와 점농어를 판별하는 방법 및 판별용 키트는 실제 수산물 유통 및 검역 현장에서 신속하고 정확하며 간편하게 이용될 수 있어 오동정 및 종의 둔갑으로 인한 산업적 및 학술적 피해를 최소화하는데 효과적이다.
도 1은 농어와 점농어의 프라이머 및 프로브의 위치를 나타낸 것으로 농어는 초록색, 점농어는 파란색을 나타낸다.
도 2는 농어와 점농어로부터 추출된 genomic DNA 샘플에 포함된 co1 유전자에 대한 PCR 증폭산물을 전기영동한 결과이다.
도 3a는 co1 유전자 서열이 없는 음성 대조군의 real-time PCR 결과 그래프이고, 도 3b는 점농어 유전자 샘플에 대한 real-time PCR 결과 그래프이며, 도 3c는 농어 유전자 샘플에 대한 real-time PCR 결과 그래프이다.
도 4a는 농어로부터 추출한 genomic DNA를 희석한 후 real-time PCR을 3회 반복하여 작성한 검량선(standard curve)을 나타낸 그래프이며, 도 4b는 점농어로부터 추출한 genomic DNA를 희석한 후 real-time PCR을 3회 반복하여 작성한 검량선을 나타낸 그래프이다.
도 2는 농어와 점농어로부터 추출된 genomic DNA 샘플에 포함된 co1 유전자에 대한 PCR 증폭산물을 전기영동한 결과이다.
도 3a는 co1 유전자 서열이 없는 음성 대조군의 real-time PCR 결과 그래프이고, 도 3b는 점농어 유전자 샘플에 대한 real-time PCR 결과 그래프이며, 도 3c는 농어 유전자 샘플에 대한 real-time PCR 결과 그래프이다.
도 4a는 농어로부터 추출한 genomic DNA를 희석한 후 real-time PCR을 3회 반복하여 작성한 검량선(standard curve)을 나타낸 그래프이며, 도 4b는 점농어로부터 추출한 genomic DNA를 희석한 후 real-time PCR을 3회 반복하여 작성한 검량선을 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 생물 시료에서 정제한 DNA에 대해 real-time PCR 수행 시 농어 또는 점농어에 특이적으로 작용하는 프라이머 세트 및 프로브를 발굴하여, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명에서 농어와 점농어 간의 종 특이적인 프라이머 및 프로브를 개발하기 위하여 농어와 점농어의 배지느러미 조직으로부터 genomic DNA를 추출한 후, 타겟이 되는 두 종의 미토콘드리아 DNA의 co1 유전자 염기서열 정보를 확보하고 증폭시켰다(도 1). 농어와 점농어의 co1 유전자의 PCR 농축 산물을 전기영동으로 확인한 후(도 2), 농어와 점농어의 co1 유전자 영역의 염기서열을 최종적으로 결정하였으며, 이 염기서열을 기반으로 농어와 점농어 간의 종 특이성을 나타낼 수 있는 프라이머 세트와 프로브를 제작하였다. Real-time PCR을 통해 제작된 프라이머 세트와 프로브의 검출 성능을 확인한 후(도 3), 희석된 genomic DNA를 사용하여 프라이머 세트와 프로브의 검출 한계를 확인하였다(도 4).
본 발명의 명세서에서 사용되는 용어의 정의는 하기에 기재된 것과 같다.
본 발명에 있어서,“프라이머(primer)”는 DNA 합성 시 시발점이 되는 DNA 짧은 가닥으로 DNA 중합효소가 합성을 시작할 수 있도록 3’-OH를 제공하는 것으로 의미할 수 있다. 표적핵산을 증폭하고자 할 때, 표적핵산만을 증폭할 수 있도록 시발점을 지정해주는 역할을 하며 따라서, 표적핵산에 따라 다양한 프라이머가 존재할 것이다. 프라이머 세트라고 함은 정방향 프라이머(Forward primer)와 역방향 프라이머(Reverse primer)를 포함하는 것을 의미한다. 중합효소연쇄반응 (PCR)시 이 프라이머를 시발점으로 하기 위하여 합성하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서,“중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)”이라는 용어는 최초의 주형 DNA를 반복과정(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 다량의 동일 DNA가 증폭되는 일련의 과정을 의미할 수 있다. 여기에는 (ⅰ) 증폭하고자하는 주형 DNA, (ⅱ) 복제의 시발점이 되는 프라이머, (ⅲ) DNA를 합성할 수 있는 효소인 DNA polymerase 그리고 (ⅳ) DNA의 재료가 되는 dNTPs 등이 필요하다.
본 발명에 있어서, “real time PCR”이라는 용어는 증폭되는 유전자의 정량적인 정보를 실시간으로 확인할 수 있는 PCR 기법으로 이해될 수 있다. 염기서열이 증폭되는 경우 형광물질이 방출되어 이를 측정하여 증폭된 염기서열의 정량적인 정보를 획득할 수 있다.
“프로브(probe)”는 표적 서열에 상보적인 서열, 즉 표적 부위 특이적 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)을 프로브의 말단에 부착시켜 real-time PCR을 수행할 수 있다.
본 발명은 점농어 판별을 위한 판별용 조성물로서, 점농어의 co1 유전자를 증폭하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 포함하는, 점농어 판별을 위한 점농어 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 점농어의 co1 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 적어도 선택되는 하나의 프로브를 포함하는 점농어 판별을 위한 점농어 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 농어의 co1 유전자를 증폭하는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는, 농어 판별을 위한 농어 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 농어의 co1 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 농어 판별을 위한 농어 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 점농어의 co1 유전자를 증폭하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트와 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 적어도 선택되는 하나의 프로브; 및 농어의 co1 유전자를 증폭하는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트와 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 농어 및 점농어 판별을 위한 농어와 점농어 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예의 점농어를 판별하는 방법은,
(i) 점농어로부터 genomic DNA을 추출하는 단계;
(ii) 상기 점농어 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예의 농어를 판별하는 방법은,
(i) 점농어로부터 genomic DNA을 추출하는 단계;
(ii) 상기 농어 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예의 농어와 점농어를 판별하는 방법은,
(i) 농어 및 점농어로부터 genomic DNA을 추출하는 단계;
(ii) 상기 농어와 점농어 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함한다.
상기 (i) 단계의 시료에서 DNA를 추출하는 것은 시료의 각 조직 혹은 다양한 가공물 등으로부터 다양한 방법에 의해 DNA를 추출할 수 있고, 이는 추출된 DNA를 분석하여 종을 판별하기 위한 것이므로, 상기 시료의 어느 부위에서 DNA를 추출하는지, 어떤 방법으로 추출하는지는 특별히 제한되지 않는다.
상기 (ii) 단계에서, 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 것은 검사표본을 늘리기 위한 것이므로, real-time PCR에 특별하게 한정되지 않고 공지인 여러 개량방법 중 하나일 수 있다.
상기 (iii) 단계에서 증폭된 DNA 산물을 분석하는 것은, 약 924.578의 임계값에서 520nm 파장에서 나오는 형광값이 확인되면 농어, 약 147.714의 임계값에서 553nm 파장에서 나오는 형광값이 확인되면 점농어로 판별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예의 판별용 조성물을 포함하는 농어와 점농어를 판별하기 위한 농어 판별용 키트, 점농어 판별용 키트 또는 농어와 점농어 판별용 키트는, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예의 농어와 점농어를 판별하기 위한 농어 판별용 키트, 점농어 판별용 키트 또는 농어와 점농어 판별용 키트에 있어서, 상기 표지물질은, 상기 농어의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 상기 점농어의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 한쪽 말단, 예를 들어 5’말단에 표지될 수 있다.
본 발명의 일 실시예의 농어와 점농어를 판별하기 위한 농어 판별용 키트, 점농어 판별용 키트 또는 농어와 점농어 판별용 키트에 있어서, 상기 농어의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와 상기 점농어의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다. 이와 같이 상기 농어의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와 상기 점농어의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 검사 튜브에서 상기 농어와 점농어의 co1 유전자를 한번에 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예의 농어와 점농어를 판별하기 위한 농어 판별용 키트, 점농어 판별용 키트 또는 농어와 점농어 판별용 키트에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 상기 농어 및 점농어의 co1 유전자 증폭량을 산출할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5’말단은 FAM, HEX, JOE, TAMRA, Yakima Yellow, TET, NED, ROX, Quasar, CAL Flour 560, CAL Flour 610, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, 및 Biosearch Blue 등과 같은 형광물질로 표지될 수 있고, 프로브의 다른쪽 말단, 예를 들어 3’말단은 BHQ (BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 등), IABkFQ, DABCYL, TAMRA 및 ECLIPSE 등과 같은 소광물질로 표지될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
농어와 점농어의 배지느러미 조직으로부터 genomic DNA 추출
프라이머 및 프로브를 개발하기 위하여 사용된 농어와 점농어의 시료 정보는 표 1에 제시하였다. genomic DNA(gDNA)의 추출은 사용된 시료들의 배지느러미 부분을 약 1cm 정도 절단하여 통상적으로 알려진 페놀 추출법을 이용하여 추출하였고, 실험에 사용할 수 있도록 모든 gDNA를 희석하여 100ng/μL로 정량하였다.
실시예 2
농어와 점농어의 미토콘드리아 DNA의
co1
유전자 염기서열 증폭
농어와 점농어 간의 종 특이적 프라이머를 제작하기에 앞서, 두 종의 미토콘드리아 DNA의 co1 유전자 염기서열 정보를 확보하기 위하여, Ward et al. (2005)에서 사용된 co1 유전자의 universal primer (FishF1, 5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’; FishR1, 5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’)를 사용하여 일반 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 실험을 수행하였다.
PCR 반응은 20μL 용적의 AccuPower ® PCR Premix Kit(BIONEER Co., Daejeon, Republic of Korea)에 gDNA 100ng과 상기된 co1 유전자의 universal primer를 각각 10 pmole을 첨가하였으며, 95℃에서 30초의 초기 변성 반응을 유도한 후, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환 반응을 35회 실시하였고, 최종적으로 72℃에서 7분간 신장 반응을 수행하였다.
실시예 3
PCR 반응으로 얻은 증폭된 유전자의 염기서열 분석
증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 종 특이 밴드 유무를 확인하였다. 이후, co1 유전자 영역의 PCR 증폭 산물은 MG PCR Purification kit(Cancer Rop Co., Ltd, Seoul, Republic of Korea)로 정제한 후, 동일한 공통 primer를 이용하여 염기서열분석기 Applied BiosystemsTMABI3730XIDNAanalyzer(ThermoFisherScientificInc.,Waltham,MA,USA)을 통해 direct sequencing 방법으로 염기서열을 결정하였다.
염기서열 분석 결과, co1 유전자는 약 683bp 부근에서 모든 개체가 성공적으로 증폭되었다. 분석된 염기서열을 BioEdit 7.0.1의 ClustalW를 이용하여 다중염기서열정렬을 수행하였으며, 이를 통하여 농어와 점농어의 co1 유전자 영역의 염기서열을 최종적으로 결정하였다.
실시예 4
농어와 점농어 간의 종 특이 프라이머 및 프로브 제작
확보된 co1 유전자의 양방향 염기서열 데이터는 FinchTV ver. 1.4(Geospiza Inc., Seattle, WA, USA; http:www.geospiza.com/finchtv)를 이용하여 trimming을 실시한 후, BioEdit ver.7.0.9 소프트웨어의 clustalW를 이용하여 다중염기서열정리를 수행하였다. 이후, DNA Sequence Polymirphism(DnaSP, ver. 5.10.01) 소프트웨어를 사용하여 두 종의 Haplotype을 분석하였다. 이를 통하여, 농어와 점농어 간의 염기서열에서 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 부위를 탐색한 후, 농어 약 131bp 및 점농어 약 107bp 부근에서 특이적 증폭 사이즈를 나타내도록 26~35 mer 크기의 종 판별 프라이머를 각각 제작하였다(도 1 및 표 2).
농어와 점농어에 대한 Real-time PCR용 프로브를 제작하기 위하여, 본 발명에서 개발된 각각의 종 판별 프라이머의 정방향과 역방향 프라이머가 포함되지 않는 안쪽 염기서열에서 최대한 종 간 특이성을 나타내는 부분을 탐색한 후 약 25bp의 크기를 나타내는 프로브를 종당 한 개씩 제작하였다(도 1 및 표 2).
실시예 5
농어와 점농어 간의 종 특이 프라이머 및 프로브 검출 성능 평가
개발된 농어와 점농어의 Real-time PCR 프라이머와 프로브 세트의 효과적인 대상종 식별 여부를 판단하기 위하여 일반 PCR 방법을 이용한 duplex PCR 실험을 선행하였다. gDNA 추출 방법은 상술한 방법을 동일하게 적용하였으며, co1 유전자 영역을 이용한 duplex PCR 반응은 20μL 용적의 AccuPower ® Gold Multiplex PCR Premix(BIONEER Co., Daejeon, Republic of Korea)에 gDNA 20ng/μL와 co1 유전자 종 특이적 프라이머를 각각 5 pmole/μL로 희석한 후 각각 0.5 μL씩 첨가하고, 나머지 볼륨은 Nuclease-free water(NFW)로 채워 총 볼륨을 20μL가 되도록 하였으며, 95℃에서 5분간 초기변성 및 30초간 변성 반응을 유도한 후, 68℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환 반응을 30회 실시하였고, 최종적으로 72℃에서 5분간 신장 반응을 수행하였다. 일반 PCR에 의한 duplex PCR 프라이머 효용성 여부는 EcoDyeTM Nucleic Acid Staining Solution(BIOFACT Co., Ltd., Daejeon, Republic of Korea)으로 염색된 1.5% agarose gel에 증폭 산물을 전기영동하여 농어(131bp)와 점농어(107bp)의 종 특이적 밴드 생성 여부를 확인하였다(표 3, 4 및 도 2).
Real-time PCR을 수행하기 위하여 iQ Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) 10 μL에 gDNA 100ng/μL와 duplex PCR 프라이머 및 프로브를 각각 5pmole/μL을 첨가하고, 나머지 볼륨은 NFW로 채워 총 볼륨이 20 μL가 되도록 혼합하였다. Real-time PCR 반응 조건은 95℃에서 3분간 초기변성 반응을 수행한 후, 95℃에서 10초간 변성 과정을 거치고 68℃에서 10초간 결합 및 신장 반응을 50회 반복 수행하였으며, 비주형대조군(non-template control, NTC)으로 농어와 점농어 gDNA 100 ng 및 NFW를 혼합하여 사용하였다.
농어와 점농어의 real-time PCR 증폭 반응 시 co1 유전자 종 특이적 프라이머 및 프로브에 대한 표적 유전자 서열이 없는 음성 대조군의 real-time PCR 결과, 특이적 결합에 의한 증폭 반응이 감지되지 않았다(도 3a).
농어와 점농어의 co1 유전자 종 특이적 프라이머 및 프로브 등 표적 유전자 서열에 대한 real-time PCR 증폭 반응 결과, 서열번호 5의 프로브 5’ 말단에 FAM으로 표지된 점농어의 특이적인 프로브는 924.578의 임계값(Threshold)에서 520nm파장에서 나오는 형광값으로 확인하였다(도 3b). 또한, 서열번호 6의 프로브 5’말단에 HEX으로 표지된 농어의 특이적인 프로브는 147.714의 임계값에서 553nm 파장에서 나오는 형광값으로 확인하였다(도 3c).
따라서, 본 발명에서 개발된 종 특이적 프라이머에 대한 프로브는 두 종간의 서로 다른 방출 파장을 갖는 표지물질인 FAM과 HEX를 사용하여 표 5와 표 6의 반응물 조성 및 반응 조건을 통해서 위양성 또는 위음성 결과가 도출되지 않고 농어와 점농어를 명확히 판별할 수 있었다(도 3b 및 3c).
실시예 6
농어와 점농어 간의 종 특이 프라이머 및 프로브 검출 한계 평가
제작된 농어와 점농어 간의 Real-time PCR 종 판별 마커의 검출 한계를 확인하기 위하여 두 종의 gDNA 100ng/μL의 농도를 10배씩 6번 희석한 후, 3회 반복하여 검량선(standard curve)을 작성하였다(도 4a 및 4b). 농어와 점농어로부터 직접 추출한 gDNA를 멸균된 3차 증류수로 100 ng/μL ~ 0.001 ng/μL 등 6개 구간으로 설정하여 희석한 후, 상기된 동일한 방법으로 real-time PCR을 수행하였다. 그 결과, 점농어의 경우에는 1 ng/μL의 농도까지 점농어의 co1 유전자 서열의 유효한 증폭이 가능하였고(도 4a), 농어의 경우에는 10 ng/μL의 농도까지 농어의 co1 유전자 서열의 유효한 증폭이 가능하였다(도 4b). 본 발명에서 Real-time PCR 종 특이적 프라이머와 프로브를 이용한 농어와 점농어의 종 판별 방법은 수입활동에 따른 검역 및 유통 과정에서 정량화된 데이터를 기반으로 농어와 점농어를 신속하고 정확하게 종 판별하여 부정 유통을 차단하고 투명성을 재고하여 소비자와 판매자를 모두 보호할 수 있는 방안을 마련할 수 있을 것으로 예상된다.
Claims (13)
- 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 5의 프로브를 포함하며,
상기 프라이머 세트는 점농어의 co1 유전자 내 291, 294, 303, 357, 360, 363, 370, 372 및 375 번째 단일염기다형성 부위의 염기를 식별하는 것을 특징으로 하는, 점농어 판별용 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 점농어 판별용 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용하는 종 특이적 판별용 조성물인 것을 특징으로 하는, 점농어 판별용 조성물.
- 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 6의 프로브를 포함하며,
상기 프라이머 세트는 농어의 co1 유전자 내 552, 564, 582, 648, 654, 666, 678 및 681 번째 단일염기다형성 부위의 염기를 식별하는 것을 특징으로 하는, 농어 판별용 조성물. - 제3항에 있어서, 상기 농어 판별용 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용하는 종 특이적 판별용 조성물인 것을 특징으로 하는, 농어 판별용 조성물.
- 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 5의 프로브,
여기서 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 점농어의 co1 유전자 내 291, 294, 303, 357, 360, 363, 370, 372 및 375 번째 단일염기다형성 부위의 염기를 식별함; 및
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 6의 프로브,
여기서 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 농어의 co1 유전자 내 552, 564, 582, 648, 654, 666, 678 및 681 번째 단일염기다형성 부위의 염기를 식별함;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 농어와 점농어 판별용 조성물. - 제5항에 있어서, 상기 서열번호 5의 프로브와 서열번호 6의 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 형광물질로 표지되는 것을 특징으로 하는, 농어와 점농어 판별용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 형광 물질은 FAM, HEX, JOE, TAMRA, Yakima Yellow, TET, NED, ROX, Quasar, CAL Flour 560, CAL Flour 610, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, 및 Biosearch Blue로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 농어와 점농어 판별용 조성물.
- (i) 점농어로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 점농어 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 점농어를 판별하는 방법.
- (i) 농어로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항의 농어 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 농어를 판별하는 방법.
- (i) 농어 및 점농어로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 제5항 내지 7항 중 어느 한 항의 농어와 점농어 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 농어와 점농어를 판별하는 방법.
- 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 점농어 판별용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 점농어를 판별하기 위한 점농어 판별용 키트.
- 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항의 농어 판별용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 농어를 판별하기 위한 농어 판별용 키트.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 농어와 점농어 판별용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 농어와 점농어를 판별하기 위한 농어와 점농어 판별용 키트.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |