KR20230159915A - 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 snp 마커 및 이의 용도 - Google Patents
상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 snp 마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 마커를 이용하면 다양한 참나무류 중에서 상수리나무 품종 '금수라1호'를 정확하게 판별할 수 있으므로, 본 발명의 SNP 마커는 상수리나무 품종 '금수라1호'의 품종 보호와 종자 관리체계 확립에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
우리나라에 분포하는 참나무속(Quercus sp.)은 낙엽성 참나무류인 상수리나무, 굴참나무, 졸참나무, 갈참나무, 떡갈나무, 신갈나무의 6가지 기본종과 이들의 변종 또는 잡종으로 보고된 정능참나무, 물참나무, 봉동참나무 등 약 31종이 보고되어 있다. 참나무는 상수리나무, 굴참나무, 졸참나무, 갈참나무, 떡갈나무 및 신갈나무 등 도토리가 열리는 나무를 통들어 부르는 말이다.
낙엽성 참나무류의 용도는 매우 다양한데, 열매인 도토리는 묵으로 만들어 먹고, 목재는 재질이 단단하고 치밀하여 예로부터 선박재, 농기구의 재료, 건축재, 합판재, 가구재로 널리 이용되었으며 표고버섯, 느타리버섯, 팽이버섯의 재배를 위한 골목으로도 많이 쓰이고 있다. 특히, 표고버섯 재배용 골목으로는 상수리나무가 으뜸이며, 오늘날에는 단풍이 아름다워 공원의 조경수로 쓰일 뿐만 아니라 지구온난화의 주범인 탄소를 저장하는 능력이 좋아 심으면 심을수록 가치가 높아지는 대표적인 나무이다.
상수리나무 대립종실 품종 육성을 위하여 1995년부터 전남 영암 등 9지역에서 종실이 크고, 종자가 많이 달리며, 병충해에 강하고 생장이 우수한 우량 개체 후보목을 선발한 후 2006년부터 종자 크기 등의 특성에 대한 차별성, 안정성 등을 검정하여 1개 클론(영암1호)을 대립·다수확성 우량품종으로 선정하였으며, 이를 품종명 '금수라1호'로 2011년에 품종보호권을 출원하였다. 그 후 2013∼2014년에 대조품종과의 비교분석을 통해 차별성이 인정되어 2014년 품종보호결정을 받았으며, 품종보호결정 이후 2016년부터 기술이전을 실시하여 접목으로 민간에 보급하고 있다.
대조품종(일반 상수리나무)과 상수리나무 품종 '금수라1호'의 종자의 특성을 비교해보면, 종자 모양은 대조품종이 광타원형인 것과 달리 '금수라1호'는 거의 원형에 가깝고, 종자 길이와 무게는 대조품종이 각각 20.9㎜와 4.1g인데 반해 '금수라1호'가 각각 22.8㎜와 6.7g이며, 한 나무 당 생산되는 열매의 양은 대조품종이 0.82kg/본인데 반해 '금수라1호'가 1.96kg/본으로 약 2.3배 더 많은 차이점들이 있다. 그러나 종자 번식, 접목 및 삽목을 했을 경우 종자결실까지 5~10년이 소요되며 일반 상수리나무의 잎과 수피 특성만으로 조기에 구별하기 어렵기 때문에 '금수라1호' 품종 및 이 품종을 모수로 사용한 종자를 구별할 수 있는 DNA 분자표지의 개발이 필요한 실정이다.
분자표지는 DNA 염기서열의 차이를 대상으로 모든 조직에서 탐지할 수 있으며, 환경적인 영향과 유전자 간의 다면 발현에 의한 영향을 받지 않는다는 장점을 가지고 있다. 현재 주요 작물에 대한 게놈 유전자 지도 작성이 활발하게 진행되고 있고, 분자표지는 육종의 선발 과정에 실제로 활용되고 있다. 식물의 육종 연구에 이용할 수 있는 분자표지가 다양하게 개발되어 왔으며 개발된 분자표지를 대량으로 검증하고 판별할 수 있는 기술과 실험 기자재도 매우 빠르게 개발되고 있다. 시간이 많이 소요되는 기술보다는 PCR을 이용한 RAPD(Random Amplified polymorphic DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism), SSR(Simple Sequence Repeat) 및 SNP(Single nucleotide polymorphism) 분석 등 다양한 분자표지 기술이 폭넓게 이용되고 있다. SNP는 개체 간의 DNA에 나타나는 하나의 염기 차이로, 매우 다양한 종의 게놈 전반에 걸쳐서 존재한다. 식물체 게놈에 나타나는 빈번한 SNP는 유전자형 분석(genotyping), 유전자지도 작성(mapping), 분자표지 도움 육종(marker assisted breeding) 및 유전자지도 기반 클로닝(map-based cloning) 등을 가능하게 하며, 이러한 기술을 이용하여 품종 판별 기술개발에 이용되기도 한다.
한편, 한국등록특허 제1457944호에 '감의 품종 판별용 스카 마커 조성물 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2315086호에 '오이 품종 판별용 SNP 마커 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 일반 상수리나무의 엽록체 게놈 서열(NCBI GenBank Accession No. NC_039429.1)과 상수리나무 품종 '금수라1호'의 엽록체 게놈 서열을 비교하여 '금수라1호'에 특이적인 SNP(single nucleotide polymorphism) 3개를 발굴하였다. 상기 SNP 마커를 이용하여 상수리나무 품종 '금수라1호' 시료와 참나무류 4수종(일반 상수리나무, 신갈나무, 굴참나무, 졸참나무) 시료를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 SNP 마커가 다양한 참나무류로부터 상수리나무 품종 '금수라1호'를 정확하게 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 15의 염기서열 중 176번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 16의 염기서열 중 170번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 17의 염기서열 중 172번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열변호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트와 프로브를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 CAPS 프라이머 세트 조성물 또는 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 참나무류 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 CAPS 프라이머 세트 또는 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호'를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 SNP 마커를 이용하면 다양한 참나무류 중에서 상수리나무 품종 '금수라1호'를 정확하게 판별할 수 있으므로, 본 발명의 SNP 마커는 상수리나무 품종 '금수라1호'의 품종 보호와 종자 관리체계 확립에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 CAPS 프라이머 세트(표 2)를 이용하여 참나무류 4수종(일반 상수리나무, 신갈나무, 굴참나무 및 졸참나무)과 상수리나무 품종 '금수라1호'를 대상으로 PCR을 수행한 결과이다. NC: 음성대조군.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브 조합(표 3)을 이용하여 참나무류 4수종(일반 상수리나무, 신갈나무, 굴참나무 및 졸참나무)과 상수리나무 품종 '금수라1호'를 대상으로 PCR을 수행한 결과이다. NC: 음성대조군.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브 조합(표 3)을 이용하여 참나무류 4수종(일반 상수리나무, 신갈나무, 굴참나무 및 졸참나무)과 상수리나무 품종 '금수라1호'를 대상으로 PCR을 수행한 결과이다. NC: 음성대조군.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 15의 염기서열 중 176번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 16의 염기서열 중 170번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 17의 염기서열 중 172번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 상수리나무 품종 '금수라1호'는 2011년 1월 17일자로 품종보호출원된 상수리나무 품종이다(품종보호 출원번호: 2011-01).
본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 15의 염기서열은 상수리나무 품종 '금수라1호'의 atpH~atpI 유전자간 부위의 일부 서열이고, 서열번호 16의 염기서열은 상수리나무 품종 '금수라1호'의 rpoC1 유전자 서열 일부이며, 서열번호 17의 염기서열은 상수리나무 품종 '금수라1호'의 rps11~rpl36 유전자간 부위의 일부 서열이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명의 SNP 마커를 상수리나무 품종 '금수라1호'의 판별에 사용할 수 있는 것은, 서열번호 15로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 176번째가 C 또는 T로, 서열번호 16으로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 170번째가 A 또는 G로, 서열번호 17로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 172번째가 G 또는 A로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 상기 SNP 위치 염기에 있어서, 서열번호 15의 염기서열 중 176번째에서 T 염기이거나, 서열번호 16의 염기서열 중 170번째에서 G 염기이거나, 서열번호 17의 염기서열 중 172번째에서 A 염기일 경우 상수리나무 품종 '금수라1호'로 판별할 수 있다(표 1 참고).
본 발명은 상기 서열번호 15, 16 및 17의 염기서열에서 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.
본 발명은 또한, 서열번호 15의 염기서열 중 176번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism); 서열번호 16의 염기서열 중 170번째 염기에 위치한 SNP; 또는 서열번호 17의 염기서열 중 172번째 염기에 위치한 SNP;를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리 L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 CAPS 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 15의 염기서열 중 176번째 염기에 위치한 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있고, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 16의 염기서열 중 170번째 염기에 위치한 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있으며, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 17의 염기서열 중 172번째 염기에 위치한 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있다.
본 발명의 CAPS 프라이머 세트 조성물은 상기 각 SNP에 따라 증폭산물의 서열이 제한효소 자리를 갖는 것과 가지지 않는 것으로 나뉘도록 설계되었다. 예를 들어, 본 발명의 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트의 경우, 일반 상수리나무의 SNP 염기 C와 상수리나무 품종 '금수라1호'의 SNP 염기 T에 따라 해당 프라이머 세트에 의한 일반 상수리나무의 증폭산물 서열은 제한효소 HinfI에 의해 절단될 수 있는 제한효소 자리를 갖게 되지만, 상수리나무 품종 '금수라1호'의 증폭산물 서열은 제한효소 자리를 가지지 못하게 된다. 따라서, 해당 프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리하면 일반 상수리나무의 증폭산물은 제한효소에 의해 절단되고, 상수리나무 품종 '금수라1호'의 증폭산물은 절단되지 않기 때문에 각 산물들을 전기영동하여 밴드의 크기를 확인함으로써 SNP 염기 타입을 분석할 수 있다. 본 발명의 CAPS 프라이머 세트의 염기서열 정보와 PCR 증폭산물의 절단을 위한 제한효소에 대한 정보는 표 2에 기재된 바와 같다.
본 발명에 따른 상기 프라이머 세트는 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)용 프라이머 세트일 수 있다. CAPS는 제한 증폭 다형성 시퀀스라고도 하며, 개체간 다형성 PCR 산물에 대한 제한효소 처리로 생성된 다형성 단편을 의미한다. 사전에 개체 간에 염기서열의 차이가 있다는 것을 알고 있는 유전자 또는 염기서열 단편을 목적으로 해서 검출이 이루어지며, 종의 게놈 중에서 해당 유전자 또는 염기서열 단편만을 PCR법에 의해 선별하여 증폭한다. 증폭된 유전자 또는 염기서열 단편의 길이는 개체 간의 차이가 없으나, 유전자 또는 염기서열 단편 내부의 염기서열은 다르기 때문에 그 서열의 차이를 인식하는 제한효소를 선발해서 처리한다. 제한효소로 절단되는 DNA를 보유하는 개체와 절단되지 않는 DNA를 가지는 개체와의 차이를 구별할 수 있으며 절단된 산물의 차이로 전기영동법에 의해 쉽게 검출된다.
본 발명의 CAPS 프라이머 세트 조성물은 바람직하게는 상기 3개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 3개의 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 3개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 상수리나무 품종 '금수라1호'를 더욱 효율적으로 판별할 수 있다.
본 발명의 CAPS 프라이머 세트 조성물을 이용하면 참나무류인 상수리나무(Quercus acutissima)와 이의 신품종 '금수라1호', 신갈나무(Quercus mongolica), 굴참나무(Quercus variabilis) 및 졸참나무(Quercus serrata) 중에서 상수리나무 품종 '금수라1호'만을 특이적으로 구별할 수 있다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 서열번호 1, 3 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2, 4 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트와 프로브를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 마커 조성물은 서열번호 16의 염기서열 중 170번째 염기에 위치한 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머 세트와 상기 SNP 위치 염기를 포함하고 있는 서열번호 9 및 10의 프로브; 또는 서열번호 17의 염기서열 중 172번째 염기에 위치한 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머 세트와 상기 SNP 위치 염기를 포함하고 있는 서열번호 13 및 14의 프로브로 이루어져 있다.
본 발명의 마커 조성물에 있어서, 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 7, 8, 11 및 12의 서열 내의 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 7의 프라이머(21개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 7, 8, 11 및 12의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프로브는 각각 일반 상수리나무에 해당하는 SNP 위치 염기(A)와 상수리나무 품종 '금수라1호'에 해당하는 SNP 위치 염기(G)를 포함하고, 상기 서열번호 13 및 14의 프로브는 각각 일반 상수리나무에 해당하는 SNP 위치 염기(G)와 상수리나무 품종 '금수라1호'에 해당하는 SNP 위치 염기(A)를 포함하여 제작된 것이다.
상기 서열번호 9, 10, 13 및 14의 염기서열로 이루어진 프로브는 5' 말단에 형광염료가 표지되고, 3' 말단에는 소광제(quencher)가 표지되며, 5' 말단과 3' 말단 사이의 내부에 ZEN 소광제가 추가로 표지된 ZEN™ Dual quenched Probes이다. 구체적으로, 5' 말단에 FAM 또는 SUN의 형광물질이 표지되고, 5' 말단으로부터 9번째와 10번째 염기 사이에 ZEN 소광제가 삽입되고, 3' 말단에 3IABkFQ(Iowa Black® FQ) 소광제가 표지된 것으로, 내부에 삽입된 ZEN 소광제는 5' 말단에 표지된 형광물질과 소광제 사이의 거리를 단축시키고, 3' 말단에 표지된 소광제와 함께 소광 효과를 극대화하여 배경(background)을 최대한 낮추고 시그널(signal)을 증가시키는 효과가 있다.
본 발명에서, 용어 "프로브"는 RNA 및 DNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 변이 염기서열(SNP)의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중연쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 CAPS 프라이머 세트 조성물 또는 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 상수리나무 품종 '금수라1호', CAPS 프라이머 세트 조성물 및 마커 조성물은 전술한 것과 같다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 CAPS 프라이머 세트 조성물을 포함할 경우 제한효소를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 제한효소는 바람직하게는 HinfI, HaeIII 및 Sau96I로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 키트에는 제한효소 HinfI를 추가로 포함할 수 있고, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 키트에는 제한효소 HaeIII를 추가로 포함할 수 있으며, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 키트에는 제한효소 Sau96I를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
참나무류 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 CAPS 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는, 상수리나무 품종 금수라1호'를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 상수리나무 품종 '금수라1호' 및 CAPS 프라이머 세트 조성물은 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 참나무류는 상수리나무(Quercus acutissima), 상수리나무 품종 '금수라1호', 신갈나무(Quercus mongolica), 굴참나무(Quercus variabilis) 및 졸참나무(Quercus serrata)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 참나무류 시료는 참나무류 식물체의 잎, 줄기, 종자, 수피 또는 뿌리 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 참나무류 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명에서 용어, "제한효소"는 DNA의 특정한 염기서열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 특수한 효소를 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 선택되어진 프라이머 세트를 기반으로 PCR을 수행한 후 프라이머와 조합인 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하였다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 제한효소는 바람직하게는 HinfI, HaeIII 또는 Sau96I일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 상수리나무 품종 '금수라1호'를 판별하는 방법에 있어서, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭산물이 HinfI 처리에 의해 절단되면 참나무류 4수종(일반 상수리나무, 신갈나무, 굴참나무 및 졸참나무)로 판별될 수 있고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭산물이 HinfI 처리에 의해 절단되지 않으면 상수리나무 품종 '금수라1호'로 판별될 수 있다. 또한, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭산물이 HaeIII 처리에 의해 절단되면 상수리나무 품종 '금수라1호'로 판별될 수 있고, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭산물이 HaeIII 처리에 의해 절단되지 않으면 참나무류 4수종으로 판별될 수 있다. 또한, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭산물이 Sau96I 처리에 의해 절단되면 참나무류 4수종으로 판별될 수 있고, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭산물이 Sau96I 처리에 의해 절단되지 않으면 상수리나무 품종 '금수라1호'로 판별될 수 있다(도 1 참고).
본 발명은 또한,
참나무류 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호'를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 상수리나무 품종 '금수라1호' 및 마커 조성물은 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 참나무류는 상수리나무(Quercus acutissima), 상수리나무 품종 '금수라1호', 신갈나무(Quercus mongolica), 굴참나무(Quercus variabilis) 및 졸참나무(Quercus serrata)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 상수리나무 품종 '금수라1호'를 판별하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 마커 조성물을 이용한 상수리나무 품종 '금수라1호'의 판별은 실시간(real-time) PCR을 통해 수행될 수 있으며, 상기 실시간 PCR(Real-time PCR)은 각 PCR을 지수함수적으로 증가하는 범위 내에서 비교하기 위해 매 시기의 PCR 진행 상황을 실시간으로 모니터링하는 방법이다. 본 발명에 따른 방법은, 다른 종류의 형광물질이 결합된 2개의 프로브를 이용함으로써 형광물질의 패턴 분석을 통해 결과를 쉽게 분석할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. DNA 추출 및 염기서열 분석
상수리나무 품종 '금수라1호'의 잎을 채취하고 DNeasy® Plant Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 추출하였다. 상기 추출된 게놈 DNA를 대상으로 Illumina 시퀀싱 방식을 통해 페어드 엔드(paired-end)로 생산된 짧은 리드(short-read)를 20 Gb 생산하였으며, NOVOPlasty(ver. 4.3.) 프로그램을 이용하여 '금수라1호'의 엽록체 유전체를 조립하였다. 그 다음, CLC genomics workbench(ver. 22)를 이용하여 일반 상수리나무의 엽록체 게놈 서열(NCBI GenBank Accession No. NC_039429.1)과 본 발명에서 조립된 '금수라1호'의 엽록체 게놈 서열을 비교하였다.
2. SNP 마커 개발
일반 상수리나무와 상수리나무 품종 '금수라1호'의 엽록체 게놈 서열을 비교하여, '금수라1호'에 특이적인 SNP 3개를 발굴하였다(표 1).
3. SNP 기반 CAPS 프라이머 세트 및 프로브 제작
상기 표 1에 개시된 SNP 마커에 기반하여 3개의 CAPS 프라이머 세트와 2개의 프라이머 세트 및 프로브 조합을 디자인하였다. CAPS 프라이머 세트는 상기 표 1에서 No.1 내지 3의 SNP에 기반하여 제작하였고(표 2), 프라이머 세트 및 프로브 조합은 상기 표 1에서 형광 프로브 설계가 가능한 No.2 및 3의 SNP에 기반하여 제작하였다(표 3).
3. PCR 및 전기영동
본 발명의 CAPS 프라이머 세트의 검증을 위해, 상수리나무 품종 '금수라1호'를 포함한 참나무류 4수종(신갈나무, 상수리나무, 굴참나무 및 졸참나무의 수형목 클론)의 총 42본의 게놈 DNA와, CAPS 프라이머 세트(표 2) 및 TaKaRa EX-taq®를 이용하여 PCR을 수행하였다. 참나무류 4수종의 시료는 국립산림품종관리센터 채종원으로부터 제공받았다. PCR 과정은 전변성 94℃ 5분; 변성(denaturation) 94℃ 30초, 결합(annealing) 57℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 30초의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다. 그 다음, 각 프라이머 세트의 증폭산물 5 ㎕에 제한효소, 제한효소 버퍼 및 증류수가 혼합된 총 10 ㎕의 반응액을 37℃에서 16시간 동안 반응하였다. 상기 제한효소가 처리된 반응액 10 ㎕를 1.5~2.5% 아가로스겔에서 100V로 1시간 동안 전기영동한 후, 겔을 촬영하여 제한효소가 처리된 증폭산물의 크기를 확인하였다.
또한, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브 조합(마커 조성물)의 검증을 위해, 상수리나무 품종 '금수라1호'를 포함한 참나무류 4수종(신갈나무, 상수리나무, 굴참나무 및 졸참나무의 수형목 클론)의 총 44본의 게놈 DNA와, 프라이머 세트 및 프로브(표 3) 및 PrimeTime® Gene Expression Master Mix(Integrated DNA Technologies, 미국)를 이용하여 Real-time PCR을 수행하였다. Real-time PCR(Bio-rad사, CFX96) 기기를 이용하여 95℃에서 3분 동안 변성시킨 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 60초 조건에서 40반복으로 형광(FAM, SUN)을 측정하였고, CFX96의 [Allelic discrimination] 프로그램을 이용하여 참나무류 4수종과 상수리나무 품종 '금수라1호'를 판별하였다
실시예 2. 본 발명의 SNP 마커를 이용한 상수리나무 품종 '금수라1호'의 판별
본 발명의 CAPS 프라이머 세트(표 2)를 이용하여 참나무류 4수종(일반 상수리나무, 신갈나무, 굴참나무 및 졸참나무)과 상수리나무 품종 '금수라1호'의 DNA 시료를 주형으로 PCR을 수행하였다.
그 결과, 프라이머 세트 C1 및 C3의 경우 참나무류 4수종의 증폭산물은 제한효소 처리에 의해 절단되었고, 상수리나무 품종 '금수라1호'의 증폭산물은 제한효소 인식 자리가 존재하지 않아 절단되지 않았다. 또한, 프라이머 세트 C2의 경우 참나무류 4수종의 증폭산물은 제한효소 인식 자리가 존재하지 않아 절단되지 않았고, 상수리나무 품종 '금수라1호'의 증폭산물은 제한효소 처리에 의해 절단되었다(도 1).
또한, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브(표 3)를 이용하여 참나무류 4수종과 상수리나무 품종 '금수라1호'의 DNA 시료를 주형으로 PCR을 수행한 결과, 2개의 프라이머 세트 및 프로브 조합(T1 및 T2) 모두 참나무류 4수종으로부터 상수리나무 품종 '금수라1호'를 정확하게 판별할 수 있음을 확인하였다(도 2).
상기 결과를 통해, 본 발명의 SNP 분자마커와 이에 기반한 프라이머 세트 또는 프로브는 다양한 참나무류 중에서 상수리나무 품종 '금수라1호'만을 특이적으로 판별할 수 있음을 알 수 있었다.
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tcagaacggc ttcgatattt 20
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ggaattccta tctaaattaa cagtaataga gccgcagccg cttagatatt acatatataa 240
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atatcttaca ttcaatcgga ttatagaatc attcttcgaa acattcaca 349
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<213> Quercus acutissima
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tcagtgtcat agaattactt agcataaata ccataggtta ggtaccatat gagcaggtcc 120
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ttcgaatgta tgtacaaaga atttcttttt ttatacttct tactattaag tagtgctcat 240
aaatctcatg ataagtaccc aaagattcat agtgaacttc gataggagct tctcttgaag 300
caataacgcg ttggtctagt tgccaccgga gccataaagt actatctaaa ttgattcttt 360
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tccatttcat gccaaaacgg atcttttccg ctttttttta tttgtatatt gagtccctta 180
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tatcttacat ttaatcggat tatagaatca ttcttcgaaa cattcaca 348
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<212> DNA
<213> Quercus acutissima
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<213> Quercus acutissima
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gggagtctct tttattttat aaagattatc cttgtctttg tttatgtctc gggttggaac 240
aaattactat aattcgtccc cgtctacgga tcagtctaca tttttcacaa attttacgaa 300
tggaggccct tattttcata 320
Claims (9)
- 서열번호 15의 염기서열 중 176번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 16의 염기서열 중 170번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 17의 염기서열 중 172번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 SNP 마커 조성물.
- 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 프라이머 세트 조성물.
- 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열변호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트와 프로브를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 마커 조성물.
- 제2항의 CAPS 프라이머 세트 조성물 또는 제3항의 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호' 판별용 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 키트는 제한효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제6항에 있어서, 상기 제한효소는 HinfI, HaeIII 및 Sau96I로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
- 참나무류 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 CAPS 프라이머 세트 또는 제3항의 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 상수리나무 품종 '금수라1호'를 판별하는 방법. - 제8항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 분석은 제한효소 절단, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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