KR102296889B1 - 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별방법 - Google Patents

토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 SNP 마커를 토마토 작물에 적용하면, 토마토 점무늬병에 저항성을 나타내는 토마토 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 점무늬병 저항성 토마토 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 토마토 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별방법{Molecular marker for selecting Gray leaf spot resistant or susceptible tomato cultivar and selection method using the same molecular marker}
본 발명은 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별방법에 관한 것이다. 상세하게는, 토마토 점무늬병 (gray leaf spot) 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트, 프로브 및 마이크로어레이, 상기 프라이머 세트 또는 프로브; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 토마토 점무늬병 저항성 품종을 판별하기 위한 키트 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것이다.
토마토 점무늬병(Gray Leaf Spot, GLS)은 스템필리움 속(Stemphylium sp.), 상세하게는 스템필리움 솔라니(Stemphylium solani)에 의하여 발생하는 곰팡이 병의 하나이다. 토마토 점무늬병은 일반적으로 고온, 다습한 환경의 시설재배 포장에서 많이 발생하며 병원균이 감염된 후 5일 이내에 병 증상이 나타나게 된다 (Kim BS et.al., Plant. Pathol. J., 15:348-350, 1999). 회갈색 내지 암갈색의 작은 부정형 반점을 형성하게 되고 작은 반점으로 남아 있거나 심하게 감염될 경우 잎이 황색으로 변하며 마르고 떨어지게 된다. 유묘 상태뿐 아니라 성묘 단계에서도 심각한 피해를 주게 된다. 감염된 식물체의 경우 전염의 위험성으로 인하여 폐기하여야하므로 전체 생산량에 심각한 문제를 일으키게 된다.
토마토 점무늬병은 고온, 다습한 환경에서 주로 발생하므로 온실 재배 시 내부가 다습하지 않도록 환기를 자주 하며 균형 시비를 한다. 병든 잎이 발견되면 전염되기 전 제거하는 방법을 사용한다. 국내 종묘회사 내에서는 저항성 품종은 개발되어 있지 않으며 위와 같은 환경 조절로 병 방제를 하고 있는 것으로 확인되어진다.
점무늬병 저항성 유전자인 Sm은 야생종인 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium)인 계통으로부터 유래된 것으로 확인되어진다. GLS 저항성을 가지는 계통 선발을 위하여 2009년 미국에서 특정 제한효소를 사용하여 다형성을 판별하는 CAPS 마커인 CT55가 개발되어 있으나, 국내 자원에서는 다형성을 나타내지 않으므로 선발에 활용이 불가능하므로 국내 자원에 적합한 새로운 분자마커의 개발이 필요한 상황이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별용 분자마커를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 토마토 점무늬병 저항성 계통 및 이병성 계통의 유전체 염기서열 비교분석 및 다형성 확인을 통하여 신규 SNP 분자마커를 도출하고, 이를 토대로 SNP 분자마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브를 개발하여 저항성 계통 및 이병성 계통의 교배 집합 세대를 대상으로 토마토 점무늬병 저항성 여부를 용이하게 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
Kim BS et.al., Plant. Pathol. J., 15:348-350, 1999
본 발명의 목적은 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 프로브 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5로 표시되는 프로브를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 5의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 프로브 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 또는 상기 프로브; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 토마토 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트 또는 제3항의 프로브를 이용하여 혼성화 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 5로 이루어진 염기서열 또는 이의 상보적 염기서열을 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 따른 SNP 마커를 토마토 작물에 적용하면, 토마토 점무늬병에 저항성을 나타내는 토마토 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 점무늬병 저항성 토마토 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 토마토 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 토마토 점무늬병 감염 정도에 따른 인덱스(index) 구별을 나타낸 사진으로, 여기서, 0, 1은 저항성(R, Resistance)을, 2, 3은 중도저항성(IR, Intermediate Resistance)을, 4, 5는 이병성(S, Susceptible)으로 구별한다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 토마토 점무늬병 저항성 및 이병성 판별을 위한 토마토 염색체(chromosome) 11에서 SNP 마커의 위치를 보여주는 토마토 점무늬병 저항성 Sm 유전자 지도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 토마토 점무늬병에 대한 저항성 및 이병성이 확인된 계통의 염기서열을 분석하여 나타낸 도로, 여기서 SL2.50(Sol Genomics Network 제공 토마토 표준 염기서열), 5001 계통 및 5006 계통은 토마토 점무늬병 이병성(susceptible) 계통이며, 5003 계통 및 5010 계통은 토마토 점무늬병 저항성(resistance) 계통이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 토마토 점무늬병 저항성 계통(R) 및 이병성 계통(S)의 염기서열을 정렬하여 나타낸 도로, 여기서 단일염기다형성(SNP)을 노란색으로 표시하여 나타내었다. 도 4에 표시된 염기서열의 65번째 위치 염기가 토마토 점무늬병 이병성 계통(S)의 경우 A이고, 저항성 계통(R)의 경우 T이다. 또한, 토마토 점무늬병 저항성 계통(R) 및 이병성 계통(S) 판별을 위한 본 발명의 정방향 프라이머(F-primer) 및 역방향 프라이머(R-primer) 혼성화 부위 (파란색 박스)와 SNP 프로브(SNP probe) 혼성화 부위(녹색 박스)를 각각 표시하여 나타내었다.
도 5는 본 발명의 토마토 점무늬병 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 HRM (high resolution melting) 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, SS는 이병성을, RS는 중도저항성을, RR은 저항성을 나타낸다. 용융 온도(melting temperature)는 57℃인 경우 이병성(SS)으로, 용융 온도가 62℃인 경우 저항성(RR)으로 판별한다.
본 발명은 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별방법에 관한 것으로, 상세하게는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트, 프로브 및 마이크로어레이, 상기 프라이머 세트 또는 프로브; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 토마토 점무늬병 저항성 품종을 판별하기 위한 키트 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5로 표시되는 프로브를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "판별"은 토마토 품종 시료로부터, 본 발명의 프라이머 세트 또는 프로브에 의해 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판단하여 구별하는 것을 의미하며, '구별'과 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 FAM 또는 HEX이다. 표적 서열의 증폭시 대립유전자(allele) 특이적인 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머 세트"는 복수의 프라이머를 의미한다. 또한, 프라이머 세트는 프라이머를 수용하기 위한 컨테이너를 더 포함할 수 있다. 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 염기 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약과 4가지 뉴클레오사이트 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 헥산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 삽입물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트법, 포스포디 에스테르법, 디에틸포스모르아미다이트법 등을 이용하는 화학 합성법을 통하여 제조될 수 있다. 또한, 프라이머 염기서열은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.
일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판별하기 위한, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고, 프로브는 서열번호 5의 염기서열로 이루어질 수 있다 (표 2).
상기 프라이머 세트는 서열번호 6 내지 10의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있으며, 상기 서열번호 6 내지 10의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 간 구별을 위한 SNP(single nuclotide polymorphism) 부위를 포함한 것일 수 있다(도 4).
상기 'SNP'란 유전체 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5로 표시되는 프로브를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물은 SNP 위치 염기를 포함하는 상기 서열번호 6 내지 10의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화되어 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 6부터 서열번호 10까지 모두 65번째로, 65번째 위치 염기가 토마토 점무늬병 이병성 계통(S)의 경우 A이고, 저항성 계통(R)의 경우 T이다.
본 발명에 따른 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 5로 표시되는 프로브는, 이에 제한되지는 않으나, 상기 단일 SNP 염기, A 또는 T를 포함하는 10개 이상의 연속 염기, 15개 이상의 연속 염기, 또는 20개 이상의 연속 염기와 상보적으로 혼성화, 증폭됨에 의해 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판별할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 프라이머는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 프라이머 세트는 SNP 위치의 주변 서열로부터 제작하였으며, 이에 제한되지는 않으나, PCR로 증폭하고 전기영동을 통해 산물을 확인함으로써 품종을 식별하는 방법에 적용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 5의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 프로브 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 프로브는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 프로브는 SNP 위치를 포함하여 제작하였으며, 이에 제한되지는 않으나, SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 특이적 혼성화를 통해, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판별할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트 또는 상기 프로브; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼(buffer) 등을 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 토마토 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트 또는 제3항의 프로브를 이용하여 혼성화 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 토마토 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있으며, 그 방법은 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 분리된 토마토 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 토마토 시료에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시　32P 또는　35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별을 위한 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별을 위한 방법은 PCR 증폭 산물에 대하여 HRM 분석함으로써 토마토 점무늬병 저항성 여부를 판단하여 판별하였다. 본 발명에서 사용하는 HRM(high resolution melting) 분석은 한 개의 염기 서열 차이에 의하여 달라지는 용융 온도(melting temperature)를 구분해 줌으로써 염기서열 분석 없이 DNA 조각의 염기서열 차이를 보여줄 수 있는 분석방법으로서, 이러한 HRM 분석 결과는 두 DNA 샘플 간 용해 곡선(melting curve)에 있어 차이를 보여주었다.
상세하게는, 토마토 점무늬병 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 HRM 분석한 결과, 토마토 점무늬병 이병성 계통(SS)의 경우 용융 온도 57℃를 나타내었고, 토마토 점무늬병 저항성 계통(RR)의 경우 용융 온도 62℃를 나타내었다 (도 5).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 5로 이루어진 염기서열 또는 이의 상보적 염기서열을 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에서 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 마이크로어레이는 본 발명의 SNP 마커가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다. "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가 (microtiter) 플레이트, 막 (예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구 (비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링 (homopolymer tailing), 지방족기, NH2기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐 (hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 토마토 점무늬병 저항성 토마토(R) 및 이병성 토마토(S) 판별을 위한 마커 제조
토마토 점무늬병에 대한 저항성 및 이병성이 확인된 5003 계통 (저항성), 5010 계통 (저항성)과 5001 계통(이병성), 5006 계통(이병성) 간의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 확인하기 위해 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 염기서열 분석을 실시하였다.
점무늬병 저항성(R) 및 이병성(S)의 게놈 DNA에 Phusion　 High-Fidelity DNA Polymerase(NEB, MA, USA) 및 하기 표 1의 프라이머 SmD-F4, SmD-R4를 이용하여 저항성 유전자 및 이병성 유전자 부위를 증폭하였다.
점무늬병 저항성(R) 계통 및 이병성(S) 계통의 게놈 DNA 증폭용 프라이머 세트
프라이머 염기서열 서열번호 용도
SmD-F4(정방향) ATGTCATCAGCAAGGTTCTAAGACAAA 1 시퀀싱용(sequencing)
SmD-R4(역방향) CCACTCAGTGTTCTACAATGTATAATG 2 시퀀싱용(sequencing)
중합효소연쇄반응은 유전자 증폭기(TP3000, Takara, Japan)를 사용하여 95℃에서 5분 동안 변성시킨 다음 95℃에서 1분 동안 변성(denaturation), 55℃에서 30초 동안 증폭(annealing), 72℃에서 1분 동안 연장(extention)을 32 사이클을 실시한 후, 후기 연장(post-extention)을 72℃에서 5분 동안 실시하였다. 증폭된 DNA는 HIQ blue mango(Bio-D, Korea)가 첨가된 1% 아가로오스 겔(agrose gel)에 전기영동 후 확인하였다.
확인된 중합효소연쇄반응의 결과물은 Expin™ Gel SV(GeneAll, Korea)를 이용하여 아가로오스겔로부터 DNA를 분리하여 마크로젠(Macrogen, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하여 도 3과 같은 결과를 확인하였다.
점무늬병 저항성 토마토(R) 및 이병성 토마토(S)의 염기서열을 비교하여 도 4와 같이 단일염기다형성(SNP)을 확인하였고, 하기 표 2의 SmD-F5, SmD-R5, SmD-P1와 같은 분자마커를 제작하였다.
점무늬병 저항성 토마토(R) 및 이병성 토마토(S) 판별용 분자마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브
프라이머/프로브 염기서열 서열번호 용도
SmD-F5(정방향) AGTGACACTACACAATTGATATTTCAC 3 증폭용(amplify)
SmD-R5(역방향) GTAATGGCTTCTGGTGTGCATACATCT 4 증폭용(amplify)
SmD-P1 CATAAATGTGTCATTCGTGTTT 5 단일염기다형성 확인용 프로브 (SNP Probe)
실시예 2: 토마토 점무늬병 저항성 유전자(R) 및 이병성 유전자(S) 탐색을 위한 HybProbe (hybridization probe melting) 분석
제작된 분자마커는 LightCycler 96　(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)를 사용하여 HMR 분석을 수행하였다. 분석 조건은 95℃에서 10분 동안 변성시킨 다음, 95℃에서 20초 동안 변성(denaturation), 56℃에서 20초 동안 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 20초 동안 연장(extention)을 45 사이클을 실시하였고, 마지막으로 High Resolution Melting 단계에서 95℃에서 60초, 40℃에서 100초 및 85℃에서 1초로 PCR을 종결하였다.
도 5는 토마토 점무늬병 저항성(R) 및 이병성(S) 판별용 분자마커를 이용하여 HybProbe 분석을 실시한 결과를 나타낸 그래프이다. 결과와 같이 저항성 계통(line) [RR]과 이병성 계통(line) [SS]이 상이한 용융 피크(melting peak)를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 3: 교배조합을 통한 점무늬병 저항성(R) 및 이병성(S) 확인
개발된 분자마커의 유효성을 확인하기 위해 하기 표 3 및 표 4와 같은 교배조합 1(5001 계통(S) × 5003 계통(R))과 교배조합 2(5006 계통(S) × 5010 계통(R))를 작성하였으며, 상기 작성된 분석법을 이용하여 점무늬병 저항성(RR), 중도저항성(RS), 이병성(SS)을 분석하였다. 또한, 도 1을 바탕으로 하는 표현형 평가를 실시하였다. 분자마커 확인 결과 1(RR):2(RS):1(SS)에 가까운 비율을 확인할 수 있었으며, 표현형 평가 결과 역시 분자마커의 결과와 일치하는 것을 확인하였다.
교배조합 1(5001 계통(S) × 5003 계통(R))
교배조합 계통명 (Name) 유전형 (Genotype) 표현형 (Phenotype)*
CT01-01 RR R
CT01-02 RR R
CT01-03 RS IR
CT01-04 RS IR
CT01-05 RR R
CT01-06 RS IR
CT01-07 SS S
CT01-08 SS S
CT01-09 RS IR
CT01-10 RR R
CT01-11 RS IR
CT01-12 SS S
CT01-13 SS S
CT01-14 RR R
CT01-15 RR R
CT01-16 RR R
CT01-17 RS IR
CT01-18 RS IR
CT01-19 SS S
CT01-20 RR R
CT01-21 RS IR
CT01-22 RS IR
CT01-23 SS S
CT01-24 SS S
CT01-25 RS IR
CT01-26 RR R
CT01-27 RS IR
CT01-28 RS IR
CT01-29 RS IR
CT01-30 RS IR
CT01-31 RS IR
CT01-32 SS S
* 인덱스(index): 도 1 참조
교배조합 2(5006 계통(S) × 5010 계통(R))
교배조합 계통명 (Name) 유전형 (Genotype) 표현형 (Phenotype)*
CT02-01 RS IR
CT02-02 RS IR
CT02-03 RS IR
CT02-04 RS IR
CT02-05 RR R
CT02-06 SS S
CT02-07 SS S
CT02-08 RS IR
CT02-09 RS IR
CT02-10 RS IR
CT02-11 RS IR
CT02-12 RS IR
CT02-13 RS IR
CT02-14 SS S
CT02-15 RR R
CT02-16 RR R
CT02-17 RR R
CT02-18 SS S
CT02-19 RS IR
CT02-20 RS IR
CT02-21 RR R
CT02-22 RS IR
CT02-23 RR R
CT02-24 SS S
CT02-25 SS S
CT02-26 RS IR
CT02-27 RS IR
CT02-28 RR R
CT02-29 RS IR
CT02-30 SS S
CT02-31 SS S
CT02-32 SS S
* 인덱스(index): 도 1 참조
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Claims (4)

  1. 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5로 표시되는 프로브를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물로서,
    상기 조성물은 서열번호 6 내지 10 중의 어느 하나의 염기서열에서 65번째 염기가 A 또는 T인 것을 검출하는 것을 특징으로 하는 SNP 마커 조성물.
  2. 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 프라이머 세트로서,
    상기 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 서열번호 6 내지 10 중의 어느 하나의 염기서열에서 65번째 염기가 A 또는 T인 것을 검출하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  3. 서열번호 5의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별용 프로브 조성물로서,
    상기 프로브는 서열번호 6 내지 10 중의 어느 하나의 염기서열에서 65번째 염기가 A 또는 T인 것을 검출하는 것을 특징으로 하는 프로브용 조성물.
  4. a) 토마토 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트 또는 제3항의 프로브 조성물을 이용하여 혼성화 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 토마토 점무늬병 저항성 품종 또는 이병성 품종 판별방법.
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