KR102586202B1 - 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 판별을 위한 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 판별용 조성물, 이를 이용하여 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 판별 키트에 관한 것으로, 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 간의 미토콘드리아 DNA의 co1 유전자 영역을 이용하여 각각의 종에 대한 real-time PCR에 사용되는 특이적 프라이머 세트와 형광표지 프로브를 제작하여 종래기술보다 더욱 정확하고 간편하며 신속한 종 간 식별 마커를 제공한다.
Description
본 발명은 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 종 판별을 위한 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 판별용 조성물, 이를 이용하여 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하는 방법 및 이를 포함하는 판별 키트에 관한 것이다.
가리비과(Pectinidae) 이매패류는 전 세계적으로 엄청난 소비량을 가진 수산 품목으로 널리 알려져 있다. 일본은 세계 최대의 가리비 어업 생산국으로 알려져 있다. 그 중에서도 일본 훗카이도 지방과 우리나라 동해안 북부지방에 서식하는 큰가리비(Mizuhopecten yessoensis)는 참가리비로도 불리며 크기가 크고 단맛이 강하며 식감이 쫄깃하고 부드러운 수산물로써 상업적 중요성이 큰 수산품목이다. 우리나라에서 생산되는 큰가리비의 수출량은 2018년 1.3 톤 규모를 기록하였으며, 이듬해인 2019년에는 53.3톤 규모를 기록하여 약 41배의 폭발적인 수출 성장력을 보여주었다. 또한 큰가리비의 수입량은 2017년에 약 5,245 톤을 기록하였고, 2021년에는 약 10,771 톤을 기록하여 약 48.7%의 수입 증가량을 나타내어, 국내 가리비 소비량이 매년 증가하고 있는 추세에 있는 것으로 나타났다.
대서양해만가리비(Argopecten irradians)는 1982년 미국에서 중국으로 도입된 종으로서 우리나라에서는 경상남도 통영시와 고성군 일대에서 양식이 활발하게 이루어지고 있으며, 성장기간이 4~5개월로 다른 가리비류보다 짧아 경쟁력이 있다.
비단가리비(Chlamys farreri nipponensis)는 우리나라의 서해, 남해 및 동해안 남부에서 주로 양식되고 있으며, 수온에 예민하고 성장기간이 2년으로 길어 생산량이 적은 편이지만 육질은 연하고 담백하여 구이, 찜, 탕에 어울려 인기가 많은 이매패류로 알려져 있다.
우리나라 정부는 해산물 시장의 세계화와 국제 수산물 무역의 증가로 인하여 ‘국산 수산물 및 원양산 수산물 원산지 표시 대상 품목’을 법제화하고 가리비과 이매패류를 가리비류로 분류하여 식품 안전을 보장하고 부정 유통 방지를 위하여 엄격한 정책과 규정을 시행하고 있다. 가리비과 이매패류를 가공한 제품은 대부분 패각이 제거된 상태로 상품화되기 때문에 종판별에 어려움이 있다. 또한, FAO(2011)에 따르면 수입 제품의 의도적이거나 잘못된 표기는 공급과 수요에 따라 더 높은 가격을 매기거나 제품 교체를 위하여 위법 행위로 이어진 경우도 알려져 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 유전자 염기서열 비교 분석을 이용한 분자계통수 및 유전적 거리 비교 등의 분자계통학적 분석법이 널리 이용되고 있으나, 형태분류학과 분자계통학 등의 전문적 지식이 요구되어 신속하게 종 판별을 수행하기 힘든 문제점이 있다.
분자계통학적 기법을 이용하여 종을 식별하는 유전자 마커 개발 기술은 핵 DNA보다 세포에 더 풍부하고, 감수분열을 비롯한 유전자 재조합 과정에 참여하지 않으며, 모계유전을 하는 일반적 특성을 가진 미토콘드리아 DNA를 기반으로 널리 개발되고 있다. 이에 대한 종 식별 유전자 마커 기술은 염기서열 상에서 종간 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs) 부위를 탐색한 후, 종 특이 프라이머와 프로브를 제작하기 때문에, 제한효소 간편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 및 증폭 단편 길이 다형성(amplified fragment length polymorphism, AFLP) 그리고 무작위 증폭 다형성 DNA(Random amplification of polymorphic DNA, RAPD) 등 종래의 방법보다 시간적, 안정성, 편리성에 대하여 뛰어난 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명자들은 Real-time PCR 방법을 사용하여 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 간 종 판별 방법을 발굴하고자 예의 노력하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 종 판별을 위한 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 판별용 조성물을 이용하여 신속하고 간편하게 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 판별용 조성물을 포함함으로써, 신속하고 정확하게 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 7의 프로브를 포함하는 큰가리비 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 8의 프로브를 포함하는 대서양해만가리비 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 9의 프로브를 포함하는 비단가리비 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 7의 프로브;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 8의 프로브; 및
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 9의 프로브를 포함하는 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 큰가리비로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 상기 큰가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 큰가리비를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 대서양해만가리비로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 상기 대서양해만가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 대서양해만가리비를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 비단가리비로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 상기 비단가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 비단가리비를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 상기 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 큰가리비 판별용 조성물을 포함하는 큰가리비를 판별하기 위한 큰가리비 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 대서양해만가리비 판별용 조성물을 포함하는 대서양해만가리비를 판별하기 위한 대서양해만가리비 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 비단가리비 판별용 조성물을 포함하는 비단가리비를 판별하기 위한 비단가리비 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 조성물을 포함하는 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비를 판별하기 위한 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 종 판별을 위한 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 판별용 조성물, 이를 이용하여 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비를 판별하는 방법 및 판별용 키트는 실제 수산물 유통 및 검역 현장에서 신속하고 정확하며 간편하게 이용될 수 있어 오동정 및 종의 둔갑으로 인한 산업적 및 학술적 피해를 최소화하는데 효과적이다.
도 1은 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비의 프라이머 및 프로브의 위치를 나타낸 것으로 큰가리비는 노란색, 대서양해만가리비는 초록색, 비단가리비는 파란색을 나타낸다.
도 2는 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비로부터 추출된 genomic DNA 샘플에 포함된 co1 유전자에 대한 PCR 중폭산물을 전기영동한 결과이다.
도 3a 내지 3c는 co1 유전자 서열이 없는 음성 대조군의 real-time PCR 결과 그래프이고, 도 3d는 큰가리비 유전자 샘플에 대한 real-time PCR 결과 그래프이며, 도 3e는 대서양해만가리비 유전자 샘플에 대한 real-time PCR 결과 그래프이고, 도 3f는 비단가리비 유전자 샘플에 대한 real-time PCR 결과 그래프이다.
도 4a 내지 4c는 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비로부터 추출한 genomic DNA를 희석한 후 real-time PCR을 3회 반복하여 작성한 검량선(standard curve)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비로부터 추출된 genomic DNA 샘플에 포함된 co1 유전자에 대한 PCR 중폭산물을 전기영동한 결과이다.
도 3a 내지 3c는 co1 유전자 서열이 없는 음성 대조군의 real-time PCR 결과 그래프이고, 도 3d는 큰가리비 유전자 샘플에 대한 real-time PCR 결과 그래프이며, 도 3e는 대서양해만가리비 유전자 샘플에 대한 real-time PCR 결과 그래프이고, 도 3f는 비단가리비 유전자 샘플에 대한 real-time PCR 결과 그래프이다.
도 4a 내지 4c는 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비로부터 추출한 genomic DNA를 희석한 후 real-time PCR을 3회 반복하여 작성한 검량선(standard curve)을 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 생물 시료에서 정제한 DNA에 대해 real-time PCR 수행 시 큰가리비, 대서양해만가리비 또는 비단가리비에 특이적으로 작용하는 프라이머 세트 및 프로브를 발굴하여, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명에서 큰가리비, 대서양해만가리비 또는 비단가리비 간의 종 특이적인 프라이머 및 프로브를 개발하기 위하여 큰가리비, 대서양해만가리비 또는 비단가리비의 패각에 붙어있는 관자로부터 genomic DNA를 추출한 후, 타겟이 되는 세 종의 미토콘드리아 DNA의 co1 유전자 염기서열 정보를 확보하고 증폭시켰다(도 1). 큰가리비, 대서양해만가리비 또는 비단가리비의 co1 유전자의 PCR 농축 산물을 전기영동으로 확인하였으며(도 2), 이 염기서열을 기반으로 큰가리비, 대서양해만가리비 또는 비단가리비 간의 종 특이성을 나타낼 수 있는 프라이머 세트와 프로브를 제작하였다. Real-time PCR을 통해 제작된 프라이머 세트와 프로브의 검출 성능을 확인한 후(도 3), 희석된 genomic DNA를 사용하여 프라이머 세트와 프로브의 검출 한계를 확인하였다(도 4).
본 발명의 명세서에서 사용되는 용어의 정의는 하기에 기재된 것과 같다.
본 발명에 있어서,“프라이머(primer)”는 DNA 합성 시 시발점이 되는 DNA 짧은 가닥으로 DNA 중합효소가 합성을 시작할 수 있도록 3’-OH를 제공하는 것으로 의미할 수 있다. 표적핵산을 증폭하고자 할 때, 표적핵산만을 증폭할 수 있도록 시발점을 지정해주는 역할을 하며 따라서, 표적핵산에 따라 다양한 프라이머가 존재할 것이다. 프라이머 세트라고 함은 정방향 프라이머(Forward primer)와 역방향 프라이머(Reverse primer)를 포함하는 것을 의미한다. 중합효소연쇄반응 (PCR)시 이 프라이머를 시발점으로 하기 위하여 합성하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서,“중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)”이라는 용어는 최초의 주형 DNA를 반복과정(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 다량의 동일 DNA가 증폭되는 일련의 과정을 의미할 수 있다. 여기에는 (ⅰ) 증폭하고자하는 주형 DNA, (ⅱ) 복제의 시발점이 되는 프라이머, (ⅲ) DNA를 합성할 수 있는 효소인 DNA polymerase 그리고 (ⅳ) DNA의 재료가 되는 dNTPs 등이 필요하다.
본 발명에 있어서, “real time PCR”이라는 용어는 증폭되는 유전자의 정량적인 정보를 실시간으로 확인할 수 있는 PCR 기법으로 이해될 수 있다. 염기서열이 증폭되는 경우 형광물질이 방출되어 이를 측정하여 증폭된 염기서열의 정량적인 정보를 획득할 수 있다.
“프로브(probe)”는 표적 서열에 상보적인 서열, 즉 표적 부위 특이적 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)을 프로브의 말단에 부착시켜 real-time PCR을 수행할 수 있다.
본 발명은 큰가리비 판별을 위한 판별용 조성물로서, 큰가리비의 co1 유전자를 증폭하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 포함하는, 큰가리비 판별을 위한 큰가리비 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 큰가리비의 co1 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 적어도 선택되는 하나의 프로브를 포함하는 큰가리비 판별을 위한 큰가리비 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대서양해만가리비의 co1 유전자를 증폭하는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함하는, 대서양해만가리비 판별을 위한 대서양해만가리비 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대서양해만가리비의 co1 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 대서양해만가리비 판별을 위한 대서양해만가리비 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 비단가리비의 co1 유전자를 증폭하는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 포함하는, 비단가리비 판별을 위한 비단가리비 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 비단가리비의 co1 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 비단가리비 판별을 위한 비단가리비 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 큰가리비의 co1 유전자를 증폭하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트와 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 적어도 선택되는 하나의 프로브:
대서양해만가리비의 co1 유전자를 증폭하는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트와 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브; 및
비단가리비의 co1 유전자를 증폭하는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트와 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 판별을 위한 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예의 큰가리비를 판별하는 방법은,
(i) 큰가리비로부터 genomic DNA을 추출하는 단계;
(ii) 상기 큰가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예의 대서양해만가리비를 판별하는 방법은
(i) 대서양해만가리비로부터 genomic DNA을 추출하는 단계;
(ii) 상기 대서양해만가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예의 비단가리비를 판별하는 방법은
(i) 비단가리비로부터 genomic DNA을 추출하는 단계;
(ii) 상기 비단가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예의 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하는 방법은
(i) 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 로부터 genomic DNA을 추출하는 단계;
(ii) 상기 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함한다.
상기 (i) 단계의 시료에서 DNA를 추출하는 것은 시료의 각 조직 혹은 다양한 가공물 등으로부터 다양한 방법에 의해 DNA를 추출할 수 있고, 이는 추출된 DNA를 분석하여 종을 판별하기 위한 것이므로, 상기 시료의 어느 부위에서 DNA를 추출하는지, 어떤 방법으로 추출하는지는 특별히 제한되지 않는다.
상기 (ii) 단계에서, 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 것은 검사표본을 늘리기 위한 것이므로, real-time PCR에 특별하게 한정되지 않고 공지인 여러 개량방법 중 하나일 수 있다.
상기 (iii) 단계에서 증폭된 DNA 산물을 분석하는 것은, 608nm 파장에서 나오는 형광값(relative fluorescence unit, RFU)에 대한 17.23~19.02의 CT(cyclethreshold)값을 가지면 큰가리비, 520nm 파장에서 나오는 형광값에 대한 16.79~22.18의 CT값을 가지면 대서양해만가리비, 553nm 파장에서 나오는 형광값에 대한 18.56~20.90의 CT값을 가지면 비단가리비로 판별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예의 판별용 조성물을 포함하는 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하기 위한 큰가리비 판별용 키트, 대서양해만가리비 판별용 키트, 비단가리비 판별용 키트 또는 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 판별용 키트는, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예의 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하기 위한 큰가리비 판별용 키트, 대서양해만가리비 판별용 키트, 비단가리비 판별용 키트 또는 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 판별용 키트에 있어서, 상기 표지물질은, 상기 큰가리비의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단, 상기 대서양해만가리비의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 한쪽 말단, 및 상기 비단가리비의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 한쪽 말단, 예를 들어 5’말단에 표지될 수 있다.
본 발명의 일 실시예의 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하기 위한 큰가리비 판별용 키트, 대서양해만가리비 판별용 키트, 비단가리비 판별용 키트 또는 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 판별용 키트에 있어서, 상기 큰가리비의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브, 상기 대서양해만가리비의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브 및 상기 비단가리비의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다. 이와 같이 상기 큰가리비의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브, 상기 대서양해만가리비의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브 및 상기 비단가리비의 co1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 검사 튜브에서 상기 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비의 co1 유전자를 한번에 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예의 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하기 위한 큰가리비 판별용 키트, 대서양해만가리비 판별용 키트, 비단가리비 판별용 키트 또는 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 판별용 키트에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 상기 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비의 co1 유전자 증폭량을 산출할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5’말단은 ROX, FAM, HEX, JOE, TAMRA, Yakima Yellow, TET, NED, Quasar, CAL Flour 560, CAL Flour 610, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, 및 Biosearch Blue 등과 같은 형광물질로 표지될 수 있고, 프로브의 다른쪽 말단, 예를 들어 3’말단은 BHQ (BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 등), IABkFQ, DABCYL, TAMRA 및 ECLIPSE 등과 같은 소광물질로 표지될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종의 관자 조직으로부터 genomic DNA 추출
프라이머 및 프로브를 개발하기 위하여 사용된 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비의 시료 정보는 표 1에 제시하였다. Genomic DNA(gDNA)의 추출은 사용된 시료들은 패각에 붙어있는 관자 부분을 약 1cm 정도 절단하여 통상적으로 알려진 페놀 추출법을 이용하여 추출하고, 실험에 사용할 수 있도록 모든 gDNA를 희석하여 100ng/μL로 정량하였다.
실시예 2
큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종 간의 종 특이 프라이머 및 프로브 제작
본 연구에서는 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종 간의 종 특이적 프라이머 및 프로브를 제작하기 위하여 미국국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에 등록된 해당 3종에 대한 미토콘드리아 전체 염기서열을 확보하였다. 따라서, 큰가리비(FJ595959.1), 대서양해만가리비(DQ665851.1, KT161262.1) 및 비단가리비(FJ595957.1, EF473269.1) 등의 참조 염기서열을 선정하였다. 확보된 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비의 미토콘드리아 전체 DNA 서열 유전자 영역 중에서 co1 유전자 염기서열을 선택하였으며, 염기서열의 다중정렬에는 BioEdit ver 7.0.9 소프트웨어의 clustalW를 이용하여 다중염기서열정리를 수행하였다. 이를 통하여, 큰가리비, 대성양가리비 및 비단가리비 간의 co1 유전자 염기서열 내에서 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 부위를 탐색한 후, 큰가리비 약 182 bp, 대서양해만가리비 약 203 bp 및 비단가리비 약 94 bp 부근에서 특이적 증폭사이즈를 나타내도록 23~23 mer 크기의 종 판별 프라이머를 각각 제작하였다(도 1 및 표 2).
큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종에 대한 Real-time PCR용 프로브를 제작하기 위하여, 본 발명에서 개발된 각각의 종 판별 프라이머의 정방향과 역방향 프라이머가 포함되지 않는 안쪽 염기서열에서 최대한 종 간 특이성으ㄹ 나타내는 부분을 탐색한 후 약 26~34 mer 크기를 나타내는 프로브를 종당 한 개씩 총 3개의 Taqman 프로브를 제작하였다(도 1 및 표 2).
실시예 3
큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종 간의 종 특이 프라이머 및 프로브 검출 성능 평가
개발된 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종 간의 Real-time PCR 프라이머와 프로브 세트의 효과적인 대상종 식별 여부를 판단하기 위하여 일반 PCR 방법을 이용한 multiplex PCR 실험을 선행하였다. gDNA 추출 방법은 상술한 방법을 동일하게 적용하였으며, co1 유전자 영역을 이용한 multiplex PCR 반응은 20μL 용적의 AccuPower ® Gold Multiplex PCR Premix(BIONEER Co., Daejeon, Republic of Korea)에 50ng/μL의 gDNA 2μL와 5 pmole/μL로 희석한 co1 유전자의 종 특이적 프라이머를 각각 0.5 μL씩 첨가하고, 나머지 볼륨은 Nuclease-free water(NFW)로 채워 총 볼륨을 20μL가 되도록 하였다. 이후, DNA Engine Dyad® Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 95℃에서 5분간 초기변성 및 30초간 변성 반응을 유도한 후, 65℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환 반응을 30회 실시하였고, 최종적으로 72℃에서 5분간 신장 반응을 수행하였다(표 3a 및 3b). 일반 PCR에 의한 multiplex PCR 프라이머 효용성 여부의 경우, 고해상도의 특이밴드 위치를 탐색하기 위하여 전자동 모세관 전기영동 장치(Fragment Analyzer; Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 이용하여 전기영동을 수행한 후, PROsize ver. 3.0.1.6 (Agilent Technologies Inc., Waldbronn, Germany)을 이용하여 최종적으로 큰가리비 약 182bp, 대서양해만가리비 약 203 bp 및 비단가리비 약 94 bp 부근에서 종 특이밴드 생성 여부를 확인하였다(도 2).
Real-time PCR을 수행하기 위하여 iQ Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) 10 μL에 50ng/μL의 gDNA 2 μL와 상기된 multiplex PCR 프라이머 및 프로브를 각각 0.5 μL(5pmole/μL)을 첨가하고, 나머지 볼륨은 NFW로 채워 총 볼륨이 20 μL가 되도록 혼합하였다(표 5). Real-time PCR 반응 조건은 95℃에서 3분간 초기변성 반응을 수행한 후, 95℃에서 10초간 변성 과정을 거치고 65℃에서 10초간 결합 및 신장 반응을 50회 반복 수행하였으며, 비주형대조군(non-template control, NTC)으로 NFW를 사용하였다(표 6).
큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종 간의 real-time PCR 증폭 반응 시 co1 유전자 종 특이적 프라이머 및 프로브에 대한 표적 유전자 서열이 없는 음성 대조군의 real-time PCR 결과, 특이적 결합에 의한 증폭 반응이 감지되지 않았다(도 3a 내지 도 3c).
큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종 간의 co1 유전자 종 특이적 프라이머 및 프로브 등 표적 유전자 서열에 대한 real-time PCR 증폭 반응 결과, 서열번호 7의 프로브 5’말단에 ROX로 표지된 큰가리비의 특이적인 프로브는 608nm 파장에서 나오는 형광값(relative fluorescence units, RFU)에 대한 17.23~19.02의 cycle threshold (CT)값을 확인하였으며(도 4a) 서열번호 8의 프로브 5’말단에 FAM으로 표지된 대서양해만가리비의 특이적인 프로브는 520nm 파장에서 나오는 형광값에 대한 16.79~22.18의 CT값을 확인하였다(도 4b). 또한, 서열번호 9의 프로브 5’말단에 HEX로 표지된 비단가리비의 특이적인 프로브는 553nm 파장에서 나오는 형광값에 대한 18.56~20.90의 CT값을 확인하였다(도 4c).
따라서, 본 발명에서 개발된 종 특이적 프라이머에 대한 프로브는 세 종간의 서로 다른 방출 파장을 갖는 표지물질인 ROX, FAM 및 HEX를 사용하여 표4a와 표4b의 반응물 조성 및 반응 조건을 통해서 위양성 또는 위음성 결과가 도출되지 않고 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종을 명확히 판별할 수 있었다.
실시예 4
큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종 간의 종 특이 프라이머 및 프로브 검출 한계 평가
제작된 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종에 대한 Real-time PCR 종 판별 마커의 검출 한계를 확인하기 위하여 3종의 gDNA 100ng/μL의 농도를 10배씩 6번 희석한 후, 3회 반복하여 검량선(standard curve)을 작성하였다(도 4). 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종으로부터 직접 추출한 gDNA를 멸균된 3차 증류수로 최대 100ng/μL부터 최소 0.001 ng/μL까지 6개 구간을 설정하여 희석한 후, 상기된 동일한 방법으로 real-time PCR을 수행하였다. 그 결과, 큰가리비의 경우에는 최대 100ng/μL부터 최소 0.01 ng/μL의 농도 구간까지 큰가리비의 co1 유전자 서열의 유효한 증폭이 가능하였고(도 5a), 대서양해만가리비의 경우에도 최대 100ng/μL부터 최소 0.01 ng/μL의 농도까지 대서양해만가리비의 co1 유전자 서열의 유효한 증폭이 가능하였다(도 5b). 또한, 비단가리비의 경우에는 최대 100ng/μL부터 최소 0.1 ng/μL의 농도까지 비단가리비 co1 유전자 서열의 유효한 증폭이 가능하였다(도 5c).
본 발명에서 Real-time PCR 종 특이적 프라이머와 프로브를 이용한 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종 간의 종 판별 방법은 수입 활동에 따른 검역 및 유통 과정에서 정량화된 데이터를 기반으로 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 3종을 신속하고 정확하게 종 판별하여 부정 유통을 차단하고 투명성을 재고하여 소비자와 판매자를 모두 보호할 수 있는 방안을 마련할 수 있을 것으로 예상된다.
Claims (17)
- 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 7의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 프라이머 세트는 co1 유전자 내 1402번째, 1404번째, 1408번째, 1410번째, 1411번째, 1412번째, 1413번째, 1416번째, 1419번째, 1420번째, 1421번째, 1422번째, 1425번째, 1428번째, 1431번째, 1432번째, 1548번째, 1549번째, 1550번째, 1551, 1554번째, 1555번째, 1557번째, 1558번째, 1560번째, 1562번째, 1566번째, 1555번째, 1567번째, 1568번째, 1569번째, 1570번째 및 1571번째 단일염기다형성 부위의 염기를 식별하는,
큰가리비 판별용 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 큰가리비 판별용 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용하는 종 특이적 판별용 조성물인 것을 특징으로 하며,
상기 프라이머 세트는 co1 유전자 내 1402번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1404번째 염기인 단일염기다형성 T, A 또는 G를 식별하며, 1408번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 A를 식별하며, 1410번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 1411번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1412번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 1413번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1416번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하며, 1419번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 1420번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1421번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 G를 식별하며, 1422번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 1425번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하며, 1428번째 염기인 단일염기다형성 C, A 또는 T를 식별하며, 1431번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1432번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1548번째 염기인 단일염기다형성 C, A 또는 T를 식별하며, 1549번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 A를 식별하며, 1550번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 1551번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 1554번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하며, 1555번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 1557번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 1558번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 1560번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 1562번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 1566번째 염기인 단일염기다형성 G, T 또는 A를 식별하며, 1555번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 1567번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 1568번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 C를 식별하며, 1569번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1570번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1571번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하는,
큰가리비 판별용 조성물. - 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 8의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 프라이머 세트는 co1 유전자 내 138번째, 147번째, 154번째, 156번째, 159번째, 160번째, 313번째, 315번째, 316번째, 318번째, 322번째, 323번째, 327번째, 330번째, 333번째, 334번째, 336번째, 339번째 및 340번째 단일염기다형성 부위의 염기를 식별하는,
대서양해만가리비 판별용 조성물. - 제3항에 있어서, 상기 대서양해만가리비 판별용 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용하는 종 특이적 판별용 조성물인 것을 특징으로 하며,
상기 프라이머 세트는 co1 유전자 내 138번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 147번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 154번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 156번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 159번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 160번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 313번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 G를 식별하며, 315번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 G를 식별하며, 316번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 C를 식별하며, 318번째 염기인 단일염기다형성 C, G 또는 T를 식별하며, 322번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 323번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 327번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 330번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 333번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 334번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 336번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하며, 339번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 340번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하는,
대서양해만가리비 판별용 조성물. - 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 9의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 프라이머 세트는 co1 유전자 내 375번째, 378번째, 381번째, 384번째, 387번째, 396번째, 397번째, 398번째, 399번째, 402번째, 441번째, 444번째, 445번째, 447번째, 450번째, 451번째, 453번째, 456번째, 457번째, 460번째, 462번째 및 466번째 단일염기다형성 부위의 염기를 식별하는,
비단가리비 판별용 조성물. - 제5항에 있어서, 상기 비단가리비 판별용 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용하는 종 특이적 판별용 조성물인 것을 특징으로 하며,
상기 프라이머 세트는 co1 유전자 내 375번째 염기인 단일염기다형성 T, G 또는 A를 식별하며, 378번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 G를 식별하며, 381번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 384번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 387번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 396번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 397번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 398번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 399번째 염기인 단일염기다형성 G, A 또는 T를 식별하며, 402번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 441번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하며, 444번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 445번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 447번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 450번째 염기인 단일염기다형성 G , T 또는 A를 식별하며, 451번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 453번째 염기인 단일염기다형성 A, T 또는 G를 식별하며, 456번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 457번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 460번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 462번째 염기인 단일염기다형성 C, G 또는 T를 식별하며, 466번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하는,
비단가리비 판별용 조성물. - 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 7의 프로브;
서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 8의 프로브; 및
서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 9의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머세트(A)는 co1 유전자 내 1402번째, 1404번째, 1408번째, 1410번째, 1411번째, 1412번째, 1413번째, 1416번째, 1419번째, 1420번째, 1421번째, 1422번째, 1425번째, 1428번째, 1431번째, 1432번째, 1548번째, 1549번째, 1550번째, 1551, 1554번째, 1555번째, 1557번째, 1558번째, 1560번째, 1562번째, 1566번째, 1555번째, 1567번째, 1568번째, 1569번째, 1570번째 및 1571번째 단일염기다형성 부위의 염기를 식별하고,
상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트(B)는 co1 유전자 내 138번째, 147번째, 154번째, 156번째, 159번째, 160번째, 313번째, 315번째, 316번째, 318번째, 322번째, 323번째, 327번째, 330번째, 333번째, 334번째, 336번째, 339번째 및 340번째 단일염기다형성 부위의 염기를 식별하고,
상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트(C)는 co1 유전자 내 375번째, 378번째, 381번째, 384번째, 387번째, 396번째, 397번째, 398번째, 399번째, 402번째, 441번째, 444번째, 445번째, 447번째, 450번째, 451번째, 453번째, 456번째, 457번째, 460번째, 462번째 및 466번째 단일염기다형성 부위의 염기를 식별하는,
큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 조성물. - 제7항에 있어서, 상기 서열번호 7의 프로브, 서열번호 8의 프로브 및 서열번호 9의 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 형광물질로 표지되는 것을 특징으로 하며,
상기 프라이머세트(A)는 co1 유전자 내 1402번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1404번째 염기인 단일염기다형성 T, A 또는 G를 식별하며, 1408번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 A를 식별하며, 1410번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 1411번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1412번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 1413번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1416번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하며, 1419번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 1420번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1421번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 G를 식별하며, 1422번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 1425번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하며, 1428번째 염기인 단일염기다형성 C, A 또는 T를 식별하며, 1431번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1432번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1548번째 염기인 단일염기다형성 C, A 또는 T를 식별하며, 1549번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 A를 식별하며, 1550번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 1551번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 1554번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하며, 1555번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 1557번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 1558번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 1560번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 1562번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 1566번째 염기인 단일염기다형성 G, T 또는 A를 식별하며, 1555번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 1567번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 1568번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 C를 식별하며, 1569번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1570번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 1571번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하고,
상기 프라이머세트(B)는 co1 유전자 내 138번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 147번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 154번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 156번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 159번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 160번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 313번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 G를 식별하며, 315번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 G를 식별하며, 316번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 C를 식별하며, 318번째 염기인 단일염기다형성 C, G 또는 T를 식별하며, 322번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 323번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 327번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 330번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 333번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 334번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 336번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하며, 339번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 340번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하고,
상기 프라이머세트(C)는 co1 유전자 내 375번째 염기인 단일염기다형성 T, G 또는 A를 식별하며, 378번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 G를 식별하며, 381번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 384번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 T를 식별하며, 387번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 396번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 397번째 염기인 단일염기다형성 C 또는 T를 식별하며, 398번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 399번째 염기인 단일염기다형성 G, A 또는 T를 식별하며, 402번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 441번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하며, 444번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 445번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 447번째 염기인 단일염기다형성 A 또는 G를 식별하며, 450번째 염기인 단일염기다형성 G, T 또는 A를 식별하며, 451번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 453번째 염기인 단일염기다형성 A, T 또는 G를 식별하며, 456번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 457번째 염기인 단일염기다형성 T 또는 C를 식별하며, 460번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 T를 식별하며, 462번째 염기인 단일염기다형성 C, G 또는 T를 식별하며, 466번째 염기인 단일염기다형성 G 또는 A를 식별하는,
큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 조성물. - 제8항에 있어서, 상기 형광 물질은 ROX, FAM, HEX, JOE, TAMRA, Yakima Yellow, TET, NED, Quasar, CAL Flour 560, CAL Flour 610, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, 및 Biosearch Blue로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 조성물.
- (i) 큰가리비로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 큰가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 큰가리비를 판별하는 방법.
- (i) 대서양해만가리비로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항의 대서양해만가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대서양해만가리비를 판별하는 방법.
- (i) 비단가리비로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항의 비단가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비단가리비를 판별하는 방법.
- (i) 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 로부터 genomic DNA을 추출하는 단계; (ii) 제7항 내지 제9항중 어느 한 항의 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 조성물을 이용하여 상기 추출한 genomic DNA를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비를 판별하는 방법.
- 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 큰가리비 판별용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 큰가리비를 판별하기 위한 큰가리비 판별용 키트.
- 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항의 대서양해만가리비 판별용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대서양해만가리비를 판별하기 위한 대서양해만가리비 판별용 키트.
- 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항의 비단가리비 판별용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비단가리비를 판별하기 위한 비단가리비 판별용 키트.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비를 판별하기 위한 큰가리비, 대서양해만가리비, 및 비단가리비 판별용 키트.
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| KR1020230045218A KR102586202B1 (ko) | 2022-12-01 | 2023-04-06 | 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비 종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 큰가리비, 대서양해만가리비 및 비단가리비를 판별하는 방법 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117327809A (zh) * | 2023-12-01 | 2024-01-02 | 中国海洋大学 | 海湾扇贝积累类胡萝卜素相关分子标记及其应用 |
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| CN112176074A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-01-05 | 辽宁省海洋水产科学研究院 | 一种检测虾夷扇贝的实时荧光pcr引物探针及方法 |
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| CN117327809B (zh) * | 2023-12-01 | 2024-03-22 | 中国海洋大学 | 海湾扇贝积累类胡萝卜素相关分子标记及其应用 |
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