CN108251542B - 一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法 - Google Patents

一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，是提取待检测的青蟹样品的核酸样品，然后用PCR引物对扩增核酸样品进行基因分型；其中拟穴青蟹中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1：锯缘青蟹中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2。本发明所建立的方法能够有效的鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹，其通过高分辨率熔融曲线HRM对待检测的青蟹进行分型，从而快速、准确鉴别青蟹种质，为青蟹的育苗养殖提供技术支持。

Description

一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法
技术领域
本发明属于分子标记辅助遗传育种技术领域，具体涉及一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法。
背景技术
青蟹属(Scylla)隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapode)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)。广泛分布于印度一西太平洋沿岸水域，包括东南亚、澳大利亚、日本、印度、南非等海域的红树林地区及河口内湾区，在我国主要分布于浙江、福建、台湾、广东、广西和海南沿岸水域。青蟹具有个体大、生长快、适应性强、肉味鲜美、营养丰富等特点，已成为世界性的经济养殖品种，但是随着捕捞强度的加大，海洋环境的污染，野生青蟹资源严重衰退，根据陈丕茂等人在2002-2004年各礁区拖网调查,蟹类资源密度为180.985kg·km-2,但经济蟹类所占比例仅为26.69％，且在以往调查中出现率较高且经济价值较高的锯缘青蟹未捕到，因此青蟹的人工养殖迫在眉睫。拟穴青蟹和锯缘青蟹是我们国家常见青蟹种类，由于不同青蟹在养殖生态学、繁殖学、营养学等生理生态方面有较大差异，不同种青蟹育苗要求不同，开展青蟹属种类的鉴定研究有助于青蟹养殖技术的发展。
发明内容
本发明提供一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，以及该方法所使用的分子标记；通过本发明的方法能够有效的鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹，从而弥补现有技术的不足。
本发明的用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，是提取待检测的青蟹样品的核酸样品，然后用PCR引物对扩增核酸样品进行基因分型；
其中拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1：
AATTAAAAAACTAATGATTATGCTACCTTTGCACGGTCAAAATACCGCGGCTATTTAACA-TTTTTGTCAGTGAGCAGGCTAGACTATA；
锯缘青蟹(Scylla_serrata)中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2：
AATTAAAAAACTAATGATTATGCTACCTTTGCACGGTCAAAATACCGCGGCTATTTAACACTTTTTGTCAGTGAGCAGGCTAGACTATA；
其中所使用的引物对，能够同时扩增上述核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的基因片段；
作为实施例的一种具体记载，所述的引物对的上游引物的序列如下：
5′-AATTAAAAAACTAATGATTATGCTACC-3′(SEQ ID NO:3)
下游引物的序列如下：
5′-TATAGTCTAGCCTGCTCACTGACA-3′(SEQ ID NO:4)；
上述的基因分析是使用高分辨率熔解曲线方法，其中反应程序如下：95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。
本发明所建立的方法能够有效的鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹，其通过高分辨率熔融曲线HRM对待检测的青蟹进行分型，从而快速、准确鉴别青蟹种质，为青蟹的育苗养殖提供技术支持。
附图说明
图1：拟穴青蟹和锯缘青蟹的外部形态图；
图2：SNP分子标记的拟穴青蟹和锯缘青蟹序列比对图；
图3：引物HRM扩增的标准化基准位移图；
图4：引物HRM扩增的熔解曲线峰图；
图5：鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的HRM图。
具体实施方式
传统上对于拟穴青蟹和锯缘青蟹都是通过形态学来进行鉴定，例如通过头胸甲螯足的外在形态特征来区别。例如拟穴青蟹头胸甲光滑,无小突起及白斑，螯及步足网格状斑纹较少，色较很淡。颜色因环境不同呈黄绿色或橄榄绿色；螯足腕节外缘内刺完全退化，微微凸起至接近光滑。而锯缘青蟹甲壳背面有白色斑点,螃蟹呈深绿色或绿褐色；螯及所有步足具明显的网状斑纹，颜色较深；螯足腕节外缘内、外刺较为尖锐(图1)。但上述的形态特征会在养殖或捕捞、运输的过程中造成损伤，导致通过形态特征无法进行鉴定。因此研究和保护青蟹种质的研究和鉴定技术，对我国青蟹产业可持续发展有着重要作用。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指单个核苷酸的变异导致的DNA序列多态性。SNP在动植物基因组中数量多，分布广，遗传稳定，通常是二等位性(个别位点有三等位、四等位)，故易于进行自动化分析。作为第3代分子标记的代表，SNP标记被广泛用于遗传图谱构建、性状关联分析、种群/个体鉴定、分子标记辅助育种等研究中。但通过SNP进行种群/个体鉴定的一个关键问题是发现相关的SNP位点，本发明正是在筛选获得了能够区别拟穴青蟹和锯缘青蟹的SNP位点后建立起来的。
所使用的高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的分子标记的筛选
在NCBI数据库中获得拟穴青蟹、锯缘青蟹的mtDNA序列，使用AlignX(a componentof Vector NTI Suite 7.1)软件进行序列比对，找出青蟹中的差异碱基区域；最终筛选得到的consensus序列，在consensus序列的13274-13362区间，以consensus序列为基准，设计引物，pcr扩增并测序验证，计数SNP出现位置为13334，共1个SNP位点。包含上述SNP位点的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1：
AATTAAAAAACTAATGATTATGCTACCTTTGCACGGTCAAAATACCGCGGCTATTTAACA-TTTTTGTCAGTGAGCAGGCTAGACTATA；
锯缘青蟹(Scylla_serrata)中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2：
AATTAAAAAACTAATGATTATGCTACCTTTGCACGGTCAAAATACCGCGGCTATTTAACACTTTTTGTCAGTGAGCAGGCTAGACTATA；
其序列的差异的序列比对如图2所示，包含该SNP位点的基因片段可以有效的将青蟹属的拟穴青蟹和锯缘青蟹进行区分。
从上述的片段设计能够扩增拟穴青蟹和锯缘青蟹片段的通用引物，引物设计应满足以下条件：目标扩增序列在50-150bp之间；为使熔解温度不同，序列之间存在GC碱基含量的差异；退火温度(Tm)应在50-60℃之间；正反引物之间应尽量避免错配、发夹结构和引物二聚体；引物由华大基因工程有限责任公司合成。随机选择5个所对应的青蟹DNA样本作为模板，使用琼脂糖凝胶电泳技术对引物进行初步筛选，选择能扩增出明亮、单一条带的引物组合进行HRM分析。最终确定的引物序列如下：
表1：HRM分析用的引物对信息
Figure BDA0001603946550000041
Figure BDA0001603946550000051
使用上述的引物进，使用
Figure BDA0001603946550000052
480饱和荧光染料HRM试剂盒，包含：10μL1×
Figure BDA0001603946550000053
480HRM Master Mix with
Figure BDA0001603946550000054
dye(Roche Diagnostics)，正反引物各10μmol，100ng DNA模板，1.6μL Mgcl2，补水至20μL。PCR反应和产物的熔解曲线分析同时在
Figure BDA0001603946550000055
480实时定量分析仪(Roche Diagnostics)上进行。反应程序如下：95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。扩增产物以4.4℃/s由72℃升至95℃5s，以2.2℃/s降至65℃1min，以0.11℃/s升至95摄氏度。以0.11℃/s冷却至40℃。反应结束后用roche
Figure BDA0001603946550000056
480软件自带的Tm Calling和Gene ScanningSoftware 1.5软件进行Tm值分析和基因分型。
使用引物获得的标准化基准位移图如图3所示，熔解曲线峰图如图4所示想，上述结果表明本发明所筛选获得的引物能有效的区分拟穴青蟹和锯缘青蟹。
实施例2利用SNP位点鉴别青蟹
所用拟穴青蟹和锯缘青蟹和紫螯青蟹分别采集自中国宁波市路林市场及中国三门县健康个体，根据林琪等研究的青蟹形态学特征进行形态学的鉴定。每个品种取30个个体，分别取游泳足肌肉组织，利用酚-氯仿法提取基因组DNA，将提取的DNA稀释至100ng/微升，并用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，保存于-20℃备用。
PCR反应在Roche Light Cycle 480仪器中进行。反应体系为20微升，包含10微升LC-HRM master Mix 10微升，正反引物各1.5微升，模板DNA1.2微升，grade H2O 3微升。反应程序为95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。扩增产物以4.4℃/s由72℃升至95℃5s，以2.2℃/s降至65℃1min，以0.11℃/s升至95摄氏度。以0.11℃/s冷却至40℃。反应结束后用roche LightCycler480软件对熔解曲线进行分析并记录Tm值。
使用
Figure BDA0001603946550000057
480饱和荧光染料HRM试剂盒，包含：10μL 1×
Figure BDA0001603946550000058
480HRM Master Mix with
Figure BDA0001603946550000059
dye(Roche Diagnostics)，正反引物各10μmol，100ng DNA模板，1.6μL Mgcl2，补水至20μL。PCR反应和产物的熔解曲线分析同时在
Figure BDA00016039465500000510
480实时定量分析仪(Roche Diagnostics)上进行。反应程序如下：95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。扩增产物以4.4℃/s由72℃升至95℃5s，以2.2℃/s降至65℃1min，以0.11℃/s升至95摄氏度。以0.11℃/s冷却至40℃。反应结束后用roche
Figure BDA0001603946550000061
480软件自带的Tm Calling和Gene ScanningSoftware 1.5软件进行Tm值分析和基因分型。对每种基因型曲线对应的PCR产物进行测序，对各种基因型的测序结果进行比对分析，观察彼此之间的碱基组成差异。
结果表明，60个样品DNA经普通PCR扩增测序后，基因型曲线与所属青蟹种分别对应。通过对不同变异类型的序列的扩增产物进行HRM分析，发现本发明所提供的分子标记和引物对可以有效的鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹三种青蟹(图5)。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattaaaaaa ctaatgatta tgctaccttt gcacggtcaa aataccgcgg ctatttaaca 60
tttttgtcag tgagcaggct agactata 88
<210> 2
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattaaaaaa ctaatgatta tgctaccttt gcacggtcaa aataccgcgg ctatttaaca 60
ctttttgtca gtgagcaggc tagactata 89
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aattaaaaaa ctaatgatta tgctacc 27
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tatagtctag cctgctcact gaca 24

Claims (2)

1.一种鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，其特征在于，所述的方法是提取待检测的青蟹样品的核酸样品，然后用PCR引物对扩增核酸样品进行基因分型；
其中拟穴青蟹中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1：锯缘青蟹中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2；
所述的基因分型是使用高分辨率熔解曲线方法进行基因分型；所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3；下游引物的序列为SEQ ID NO:4。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高分辨率熔解曲线方法，其扩增反应的程序如下：95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。
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Assignee: Taizhou Sangang Marine Aquaculture Professional Cooperative

Assignor: Ningbo University

Contract record no.: X2022330000474

Denomination of invention: A method for identifying Scylla serrata and Scylla serrata

Granted publication date: 20210511

License type: Common License

Record date: 20220830

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20180706

Assignee: Zhejiang Baisai Import and Export Trade Co.,Ltd.

Assignor: Ningbo University

Contract record no.: X2022980027211

Denomination of invention: A Method for Distinguishing Scylla serrata from Scylla serrata

Granted publication date: 20210511

License type: Common License

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