CN108570507B - 一种用于鉴别三种青蟹的snp分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鉴别榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹的SNP分子标记，所述的分子标记在榄绿青蟹中的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、在拟穴青蟹中的核苷酸序列为SEQ ID NO:2、在锯缘青蟹中的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。本发明提供一种鉴别榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，所述的方法是通过待检测的青蟹样品中是否存在上述所提及的SNP分子标记来判断样品的种属。本发明获得了能够有效鉴别榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹的SNP分子标记；在上述分子标记中设计引物，通过高分辨率熔融曲线HRM对青蟹进行分型，从而快速、准确鉴别青蟹种质，为青蟹的育苗养殖提供技术支持。

Description

一种用于鉴别三种青蟹的SNP分子标记

技术领域

本发明属于分子辅助遗传育种技术领域，具体涉及一种用于鉴别三种青蟹的SNP分子标记。

背景技术

青蟹属(Scylla)隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapode)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)。广泛分布于印度一西太平洋沿岸水域，包括东南亚、澳大利亚、日本、印度、南非等海域的红树林地区及河口内湾区，在我国主要分布于浙江、福建、台湾、广东、广西和海南沿岸水域。青蟹具有个体大、生长快、适应性强、肉味鲜美、营养丰富等特点，已成为世界性的经济养殖品种，但是随着捕捞强度的加大，海洋环境的污染，野生青蟹资源严重衰退，根据陈丕茂等人在2002-2004年各礁区拖网调查,蟹类资源密度为180.985kg·km^-2,但经济蟹类所占比例仅为26.69％，且在以往调查中出现率较高且经济价值较高的锯缘青蟹未捕到，因此青蟹的人工养殖迫在眉睫。榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹是我们国家常见青蟹种类，由于不同青蟹在养殖生态学、繁殖学、营养学等生理生态方面有较大差异，不同种青蟹育苗要求不同，开展青蟹属种类的鉴定研究有助于青蟹养殖技术的发展。

传统上对于榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹都是通过形态学来进行鉴定，例如通过头胸甲螯足的外在形态特征来区别。例如榄绿青蟹的螯足呈橙红色，螯足及步足上无或有少量网格状斑纹；螯足腕节外缘内刺完全退化，微微凸起至接近光滑。而拟穴青蟹头胸甲光滑,无小突起及白斑，螯及步足网格状斑纹较少，色较很淡。颜色因环境不同呈黄绿色或橄榄绿色；螯足腕节外缘内刺完全退化，微微凸起至接近光滑。而锯缘青蟹甲壳背面有白色斑点,螃蟹呈深绿色或绿褐色；螯及所有步足具明显的网状斑纹，颜色较深；螯足腕节外缘内、外刺较为尖锐(图1)。但上述的形态特征会在养殖或捕捞、运输的过程中造成损伤，导致通过形态特征无法进行鉴定。因此研究和保护青蟹种质的研究和鉴定技术，对我国青蟹产业可持续发展有着重要作用。

发明内容

本发明提供一种用于鉴别三种青蟹的SNP分子标记，以及用于检测该分子标记的引物；通过检测该分子标记能够有效的区别青蟹的榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹三个品种，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种鉴别榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹的SNP分子标记，所述的分子标记在榄绿青蟹(Scylla_olivacea)中的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、在拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中的核苷酸序列为SEQ ID NO:2、

在锯缘青蟹(Scylla_serrata)中的核苷酸序列为SEQ ID NO:3；

本发明提供一种鉴别榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，所述的方法是通过待检测的青蟹样品中是否存在上述所提及的SNP分子标记来判断样品的种属；

所述的方法，是基于高分辨率溶解曲线(HRM)方法来鉴别青蟹；

其中所使用的引物对，其上游引物的序列如下：

5-′AAAAATTACCTAATAATGATGGTATAC-3′(SEQ ID NO:4)

下游引物的序列如下：

5-′TATTTAAAGTTATGTACTTGAAATTTG-3′(SEQ ID NO:5)；

本发明还提供用于HRM分析的试剂盒，所述的试剂盒包含有上述的引物对。

本发明获得了能够有效鉴别榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹的SNP分子标记；在上述分子标记中设计引物，通过高分辨率熔融曲线HRM对青蟹进行分型，从而快速、准确鉴别青蟹种质，为青蟹的育苗养殖提供技术支持。

附图说明

图1：榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹的外部形态图；

图2：SNP分子标记的榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹序列比对图；

图3：引物HRM扩增的标准化基准位移图；

图4：引物HRM扩增的熔解曲线峰图；

图5：鉴别榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹三种青蟹图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：鉴别青蟹的分子标记的筛选

在NCBI数据库中获得拟穴青蟹、锯缘青蟹、榄绿青蟹和紫螯青蟹的mtDNA序列，使用AlignX(a component of Vector NTI Suite 7.1)软件进行序列比对，找出四种青蟹中的差异碱基区域。最终筛选得到的consensus序列总长17378bp，通过分析后在consensus序列的14460-14605区间，以consensus序列为基准，对榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹的三种青蟹进行序列比较，计数SNP出现位置为：14492，14494，14495，14496，14497，14504，14516，14534，14576，共9个SNP位点。

包含上述9个SNP位点的榄绿青蟹(Scylla_olivacea)中的核苷酸序列为SEQ IDNO:1：

AAAAATTACCTAATAATGATGGTATACATACTACAACAAGCTTAAGTAAGATTCTTCGTGGTGTATCGATTCAAAAACAGGTTCCTCTGACAAGACTAAATCACCGCCAAATTCTTCAAATTTCAAGTACATAACTTTAAATA；

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)的核苷酸序列为SEQ ID NO:2

AAAAATTACCTAATAATGATGGTATACATACTACTCTACAAGCCTAAGTAAGATTTTTCGTGGTGTATCGATTTAAAAACAGGTTCCTCTGACAAGACTAAATCACCGCCAAATTATTCAAATTTCAAGTACATAACTTTAAATA

在锯缘青蟹(Scylla_serrata)中的核苷酸序列为SEQ ID NO:3；

AAAAATTACCTAATAATGATGGTATACATACTGCCTTTACAAGCTTAAGTAAGATTCTTCGTGGTGTATCGATTCAAAAACAGGTTCCTCTGACAAGACTAAATCACCGCCAAATTCTTCAAATTTCAAGTACATAACTTTAAATA；

其序列的差异的序列比对如图2所示，与锯缘青蟹相比，榄绿青蟹与拟穴青蟹在上述片段分别存在3个和1个碱基的缺失，同时存在2个和7个位点的碱基差异。上述的片段可以有效的将青蟹属的榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹的三种青蟹进行区分。

从上述的片段设计能够扩增上述三个片段的通用引物，引物设计应满足以下条件：目标扩增序列在50-150bp之间；为使熔解温度不同，序列之间存在GC碱基含量的差异；退火温度(Tm)应在50-60℃之间；正反引物之间应尽量避免错配、发夹结构和引物二聚体；引物由华大基因工程有限责任公司合成。随机选择5个所对应的青蟹DNA样本作为模板，使用琼脂糖凝胶电泳技术对引物进行初步筛选，选择能扩增出明亮、单一条带的引物组合进行HRM分析。最终确定的引物序列如下：

表1：HRM分析用的引物对信息

使用上述的引物进，使用

480饱和荧光染料HRM试剂盒，包含：10μL1×

480HRM Master Mix with

dye(Roche Diagnostics)，正反引物各10μmol，100ng DNA模板，1.6μL Mgcl₂，补水至20μL。PCR反应和产物的熔解曲线分析同时在

480实时定量分析仪(Roche Diagnostics)上进行。反应程序如下：95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。扩增产物以4.4℃/s由72℃升至95℃5s，以2.2℃/s降至65℃1min，以0.11℃/s升至95摄氏度。以0.11℃/s冷却至40℃。反应结束后用roche

480软件自带的Tm Calling和Gene ScanningSoftware 1.5软件进行Tm值分析和基因分型。

使用引物获得的标准化基准位移图如图3所示，熔解曲线峰图如图4所示想，上述结果表明本发明所筛选获得的引物能有效的区分榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹。

实施例2利用SNP位点鉴别青蟹

根据林琪等研究的青蟹形态学特征，所用榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹和紫螯青蟹分别采集自中国宁波市路林市场及中国三门县健康个体，每个品种取30个个体，分别取游泳足肌肉组织，利用酚-氯仿法提取基因组DNA，将提取的DNA稀释至100ng/微升，并用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，保存于-20℃备用。

对每个品种的青蟹选30个个体进行分析，PCR反应在Roche Light Cycle 480仪器中进行。反应体系为20微升，包含10微升LC-HRM master Mix 10微升，正反引物各1.5微升，模板DNA1.2微升，grade H₂O 3微升。反应程序为95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。扩增产物以4.4℃/s由72℃升至95℃5s，以2.2℃/s降至65℃1min，以0.11℃/s升至95摄氏度。以0.11℃/s冷却至40℃。反应结束后用roche LightCycler480软件对熔解曲线进行分析并记录Tm值。

使用

480饱和荧光染料HRM试剂盒，包含：10μL 1×

480HRM Master Mix with

dye(Roche Diagnostics)，正反引物各10μmol，100ng DNA模板，1.6μL Mgcl₂，补水至20μL。PCR反应和产物的熔解曲线分析同时在

480实时定量分析仪(Roche Diagnostics)上进行。反应程序如下：95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。扩增产物以4.4℃/s由72℃升至95℃5s，以2.2℃/s降至65℃1min，以0.11℃/s升至95摄氏度。以0.11℃/s冷却至40℃。反应结束后用roche

480软件自带的Tm Calling和Gene ScanningSoftware 1.5软件进行Tm值分析和基因分型。对每种基因型曲线对应的PCR产物进行测序，对各种基因型的测序结果进行比对分析，观察彼此之间的碱基组成差异。

结果表明，90个样品DNA经普通PCR扩增测序后，基因型曲线与所属青蟹种分别对应。通过对不同变异类型的序列的扩增产物进行HRM分析，发现本发明所提供的分子标记和引物对可以有效的鉴别榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹三种青蟹(图5)。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 一种用于鉴别三种青蟹的SNP分子标记

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaattacc taataatgat ggtatacata ctacaacaag cttaagtaag attcttcgtg 60

gtgtatcgat tcaaaaacag gttcctctga caagactaaa tcaccgccaa attcttcaaa 120

tttcaagtac ataactttaa ata 143

<210> 2

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaaattacc taataatgat ggtatacata ctactctaca agcctaagta agatttttcg 60

tggtgtatcg atttaaaaac aggttcctct gacaagacta aatcaccgcc aaattattca 120

aatttcaagt acataacttt aaata 145

<210> 3

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaattacc taataatgat ggtatacata ctgcctttac aagcttaagt aagattcttc 60

gtggtgtatc gattcaaaaa caggttcctc tgacaagact aaatcaccgc caaattcttc 120

aaatttcaag tacataactt taaata 146

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaaattacc taataatgat ggtatac 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatttaaagt tatgtacttg aaatttg 27

Claims (2)

1.一种鉴别榄绿青蟹、拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，其特征在于，所述的方法是基于高分辨率溶解曲线方法来鉴别青蟹样品；所述的高分辨率溶解曲线方法，其引物对的上游引物的序列为SEQ ID NO:4,下游引物的序列为SEQ ID NO:5。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法检测的榄绿青蟹的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、拟穴青蟹中的核苷酸序列为SEQ ID NO:2、锯缘青蟹中的核苷酸序列为SEQID NO:3。

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