CN108531614B - 一种基于高分辨率溶解曲线方法鉴别青蟹的分子标记 - Google Patents

一种基于高分辨率溶解曲线方法鉴别青蟹的分子标记 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于鉴别青蟹的分子标记，包括有用于检测榄绿青蟹的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，用于检测拟穴青蟹的基因片段，其其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；用于检测锯缘青蟹的基因片段，其其核苷酸序列为SEQ ID NO:3；用于检测紫螯青蟹的基因片段，其核苷酸序列为其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。本发明通过筛选到的分子标记，通过高分辨率熔融曲线HRM对青蟹进行分型，从而快速、准确鉴别青蟹种质，为青蟹育苗养殖提供技术支持。

Description

一种基于高分辨率溶解曲线方法鉴别青蟹的分子标记
技术领域
本发明属于分子辅助遗传育种技术领域，具体涉及一种基于高分辨率溶解曲线方法鉴别青蟹的分子标记。
背景技术
青蟹属(Scylla)隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapode)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)。广泛分布于印度一西太平洋沿岸水域，包括东南亚、澳大利亚、日本、印度、南非等海域的红树林地区及河口内湾区，在我国主要分布于浙江、福建、台湾、广东、广西和海南沿岸水域。青蟹具有个体大、生长快、适应性强、肉味鲜美、营养丰富等特点，已成为世界性的经济养殖品种，但是随着捕捞强度的加大，海洋环境的污染，野生青蟹资源严重衰退，根据陈丕茂等人在2002-2004年各礁区拖网调查,蟹类资源密度为180.985kg·km-2,但经济蟹类所占比例仅为26.69％，且在以往调查中出现率较高且经济价值较高的锯缘青蟹未捕到，因此青蟹的人工养殖迫在眉睫。由于不同青蟹在养殖生态学、繁殖学、营养学等生理生态方面有较大差异，不同种青蟹育苗要求不同，开展青蟹属种类的鉴定研究有助于青蟹养殖技术的发展。
因此研究和保护青蟹种质的研究和鉴定技术，对我国青蟹产业可持续发展有着重要作用。
发明内容
本发明提供一种用于鉴别青蟹的SNP分子标记，以及用于检测该分子标记的引物；通过检测该分子标记能够有效的区别青蟹的不同种，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种鉴别青蟹的SNP分子标记，所述的分子标记包括有用于检测榄绿青蟹(Scylla_olivacea)的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1用于检测拟穴青蟹(Scylla paramamosain)的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2
用于检测锯缘青蟹(Scylla_serrata)的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3；
用于检测紫螯青蟹(Scylla_tranquebarica)的基因片段，其核苷酸序列为其核苷酸序列为SEQ ID NO:4；
上述的分子标记在制备鉴别青蟹品种的制品中的应用；
本发明再一个方面提供一种鉴别青蟹品种的分子标记物；其中一种分子标记物为扩增引物对；
作为本发明实施例的一种具体记载，所述的引物对，其上游引物的序列为
AATTAACTAATGACATCATCTCATGG(SEQ ID NO:5)、
下游引物的序列为CGAGTTACATCTCGTCATCATTG(SEQ ID NO:6)；
本发明再一个方面提供一种基于高分辨率溶解曲线(HRM)鉴别青蟹的方法，是通过上述的引物对待检测的青蟹的核酸样品进行扩增，在对扩增产物测序后进行HRM分析来鉴别具体种。
所述的青蟹，为拟穴青蟹、锯缘青蟹、榄绿青蟹和紫螯青蟹。
本发明还提供用于HRM分析的试剂盒，所述的试剂盒包含有上述的引物对。
本发明筛选获得了能够有效鉴别拟穴青蟹、锯缘青蟹、榄绿青蟹和紫螯青蟹的基因片段，通过高分辨率熔融曲线HRM对青蟹进行分型，从而快速、准确鉴别青蟹种质，为青蟹育苗养殖提供技术支持。
附图说明
图1：4种青蟹序列比对图；
图2：引物扩增的标准化基准位移图；
图3：引物扩增的熔解曲线峰图；
图4：鉴别拟穴、锯缘、榄绿和紫螯四种青蟹图。
具体实施方式
根据林琪等的研究结果，东南沿海青蟹属由锯缘青蟹(Scylla serrata)、紫螯青蟹(Scylla tranquebarica)、拟穴青蟹(Scylla paramamosain)和榄绿青蟹(Scyllaolivacea)四种青蟹组成。对上述四种青蟹的形态学分类通常就是通过头胸甲和螯足的特征来区分，例如认为锯缘青蟹的甲壳背面有白色斑点,螃蟹呈深绿色或绿褐色；螯及所有步足具明显的网状斑纹，颜色较深；螯足腕节外缘内、外刺较为尖锐。但上述的形态特征很容易在捕捞养殖的过程中受到损伤，导致无法对其种属进行鉴定。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：鉴别青蟹的分子标记的筛选
在NCBI数据库中获得拟穴青蟹、锯缘青蟹、榄绿青蟹和紫螯青蟹的mtDNA序列，使用AlignX(a component of Vector NTI Suite 7.1)软件进行序列比对，找出四种青蟹中的差异碱基区域。
最终筛选得到的consensus序列总长17378bp，通过分析后，设计了46对引物，用四种青蟹各24份DNA模板进行HRM筛选，最终在consensus序列的4690-4892区间，以consensus序列为基准，设计引物，PCR扩增并测序验证，结果发现SNP出现位置为：4716，4719，4725，4728，4752，4764，4770，4779，4809，4818，4830，4831，4833，4834，4845，4860，4869，共17个SNP位点。
包含上述17个SNP位点的四种青蟹的核苷酸片段的序列分别如下：
用于检测Scylla_olivacea的基因片段，其核苷酸序列如下：
AATTAACTAATGACATCATCTCATGGTTTTCACCCCTACCACCTAGTCGACATAAGGCCTTGACCTCTAACTGGCTCAATCAGAGCTATAATACTAACTACAGGCTTAATTAAATGATTTCACCAATATAATATAAATCTTTTATTATTAAGATTTATCGCTATCCTCTTAACAATATATCAATGATGACGAGATGTAACTCG；
用于检测Scylla paramamosain的基因片段，其核苷酸序列如下：
AATTAACTAATGACATCATCTCATGGTTTTCATCCCTATCACTTAGTAGATATAAGGCCTTGACCTTTAACTGGCTCAATTAGAGCTATGATATTAACTACAGGTTTAATTAAATGATTCCACCAATATAATATAAATCTCCTATTATTAAGATTTATTGCTATTCTTTTAACAATATACCAATGATGACGAGATGTAACTCG；
用于检测Scylla_serrata的基因片段，其核苷酸序列如下：
AATTAACTAATGACATCATCTCATGGTTTTCACCCCTACCACCTAGTCGACATAAGGCCTTGACCTCTAACTGGCTCAATCAGAGCTATAATACTAACTACAGGCTTAATTAAATGATTTCACCAATATAATATAAATCTTTTATTATTAAGATTTATCGCTATCCTCTTAACAATGTATCAATGATGACGAGATGTAACTCG；
用于检测Scylla_tranquebarica的基因片段，其核苷酸序列如下：
AATTAACTAATGACATCATCTCATGGCTTTCATCCTTACCACTTAGTAGATATAAGGCCTTGGCCTTTAACTGGCTCAATCAGAGCTATAATATTAACTACAGGTTTAATTAAATGATTTCACCAATACAATATAAATCTTTTACTATTAAGATTCATTGCTATTCTTTTAACAATATACCAATGATGACGAGATGTAACTCG；
其序列的差异的序列比对如图1所示，上述的片段可以有效的将青蟹属的拟穴青蟹、锯缘青蟹、榄绿青蟹和紫螯青蟹四种青蟹进行区分。
从上述的片段设计能够扩增上述四个片段的通用引物，引物设计应满足以下条件：目标扩增序列在50-150bp之间；为使熔解温度不同，序列之间存在GC碱基含量的差异；退火温度(Tm)应在50-60℃之间；正反引物之间应尽量避免错配、发夹结构和引物二聚体；引物由华大基因工程有限责任公司合成。随机选择5个所对应的青蟹DNA样本作为模板，使用琼脂糖凝胶电泳技术对引物进行初步筛选，选择能扩增出明亮、单一条带的引物组合进行HRM分析。最终确定的引物序列如下：
Figure BDA0001637726480000046
使用上述的引物进，使用
Figure BDA0001637726480000041
480饱和荧光染料HRM试剂盒，包含：10μL1×
Figure BDA0001637726480000042
480 HRM Master Mix with
Figure BDA0001637726480000043
dye(Roche Diagnostics)，正反引物各10μmol，100ng DNA模板，1.6μL Mgcl2，补水至20μL。PCR反应和产物的熔解曲线分析同时在
Figure BDA0001637726480000044
480实时定量分析仪(Roche Diagnostics)上进行。反应程序如下：95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。扩增产物以4.4℃/s由72℃升至95℃5s，以2.2℃/s降至65℃1min，以0.11℃/s升至95摄氏度。以0.11℃/s冷却至40℃。反应结束后用roche
Figure BDA0001637726480000045
480软件自带的Tm Calling和Gene ScanningSoftware 1.5软件进行Tm值分析和基因分型。
使用引物获得的标准化基准位移图如图2所示，熔解曲线峰图如图3所示想，显示本发明所筛选获得的引物能有效的区分四种青蟹。
实施例2利用SNP位点鉴别青蟹
根据林琪等研究的青蟹形态学特征，所用拟穴青蟹、锯缘青蟹、榄绿青蟹和紫螯青蟹于2016年10月分别采集自中国宁波市路林市场及中国三门县健康个体若干，每个品种取24个个体，分别取游泳足肌肉组织，利用酚-氯仿法提取基因组DNA，将提取的DNA稀释至100ng/微升，并用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，保存于-20℃备用。
对每个品种的青蟹选30个个体进行分析，PCR反应在Roche Light Cycle 480仪器中进行。反应体系为20微升，包含10微升LC-HRM master Mix 10微升，正反引物各1.5微升，模板DNA1.2微升，grade H2O 3微升。反应程序为95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。扩增产物以4.4℃/s由72℃升至95℃5s，以2.2℃/s降至65℃1min，以0.11℃/s升至95摄氏度。以0.11℃/s冷却至40℃。反应结束后用roche LightCycler480软件对熔解曲线进行分析并记录Tm值。
使用
Figure BDA0001637726480000051
480饱和荧光染料HRM试剂盒，包含：10μL 1×
Figure BDA0001637726480000052
480HRM Master Mix with
Figure BDA0001637726480000053
dye(Roche Diagnostics)，正反引物各10μmol，100ng DNA模板，1.6μL Mgcl2，补水至20μL。PCR反应和产物的熔解曲线分析同时在
Figure BDA0001637726480000054
480实时定量分析仪(Roche Diagnostics)上进行。反应程序如下：95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。扩增产物以4.4℃/s由72℃升至95℃5s，以2.2℃/s降至65℃1min，以0.11℃/s升至95摄氏度。以0.11℃/s冷却至40℃。反应结束后用roche
Figure BDA0001637726480000055
480软件自带的Tm Calling和Gene ScanningSoftware 1.5软件进行Tm值分析和基因分型。对每种基因型曲线对应的PCR产物进行测序，对各种基因型的测序结果进行比对分析，观察彼此之间的碱基组成差异。
通过对不同变异类型的序列的扩增产物进行HRM分析，发现本发明所提供的分子标记和引物对可以有效的鉴别拟穴、锯缘、榄绿和紫螯四种青蟹(图4)；检测结果表明96个样品DNA经普通PCR扩增测序后，基因型曲线与所属青蟹种一一对应。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种基于高分辨率溶解曲线方法鉴别青蟹的分子标记
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattaactaa tgacatcatc tcatggtttt cacccctacc acctagtcga cataaggcct 60
tgacctctaa ctggctcaat cagagctata atactaacta caggcttaat taaatgattt 120
caccaatata atataaatct tttattatta agatttatcg ctatcctctt aacaatatat 180
caatgatgac gagatgtaac tcg 203
<210> 2
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattaactaa tgacatcatc tcatggtttt catccctatc acttagtaga tataaggcct 60
tgacctttaa ctggctcaat tagagctatg atattaacta caggtttaat taaatgattc 120
caccaatata atataaatct cctattatta agatttattg ctattctttt aacaatatac 180
caatgatgac gagatgtaac tcg 203
<210> 3
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aattaactaa tgacatcatc tcatggtttt cacccctacc acctagtcga cataaggcct 60
tgacctctaa ctggctcaat cagagctata atactaacta caggcttaat taaatgattt 120
caccaatata atataaatct tttattatta agatttatcg ctatcctctt aacaatgtat 180
caatgatgac gagatgtaac tcg 203
<210> 4
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattaactaa tgacatcatc tcatggcttt catccttacc acttagtaga tataaggcct 60
tggcctttaa ctggctcaat cagagctata atattaacta caggtttaat taaatgattt 120
caccaataca atataaatct tttactatta agattcattg ctattctttt aacaatatac 180
caatgatgac gagatgtaac tcg 203
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattaactaa tgacatcatc tcatgg 26
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgagttacat ctcgtcatca ttg 23

Claims (1)

1.一种基于高分辨率溶解曲线鉴别青蟹的方法，其特征在于，所述的方法是通过引物对待检测的青蟹的核酸样品进行扩增，在对扩增产物测序后进行HRM分析来鉴别具体种；所述的青蟹为拟穴青蟹、锯缘青蟹、榄绿青蟹和紫螯青蟹；
所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:5；下游引物的序列为SEQ ID NO:6；
其中检测榄绿青蟹的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
用于检测拟穴青蟹的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
用于检测锯缘青蟹的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3;
用于检测紫螯青蟹的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792809A (zh) * 2010-04-06 2010-08-04 中国水产科学研究院东海水产研究所 一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的pcr方法
CN104046683B (zh) * 2013-03-13 2015-06-10 中国科学院海洋研究所 一种用于鉴别贝类两种近缘物种或鉴定其杂交后代的方法
CN107841565A (zh) * 2017-11-22 2018-03-27 镇江华大检测有限公司 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792809A (zh) * 2010-04-06 2010-08-04 中国水产科学研究院东海水产研究所 一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的pcr方法
CN104046683B (zh) * 2013-03-13 2015-06-10 中国科学院海洋研究所 一种用于鉴别贝类两种近缘物种或鉴定其杂交后代的方法
CN107841565A (zh) * 2017-11-22 2018-03-27 镇江华大检测有限公司 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法

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