CN107841565A - 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法 - Google Patents

鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107841565A
CN107841565A CN201711174930.9A CN201711174930A CN107841565A CN 107841565 A CN107841565 A CN 107841565A CN 201711174930 A CN201711174930 A CN 201711174930A CN 107841565 A CN107841565 A CN 107841565A
Authority
CN
China
Prior art keywords
eriocheir sinensis
labeled primers
molecular specificity
specificity labeled
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711174930.9A
Other languages
English (en)
Inventor
崔海月
耿小燕
张继敏
蒋寿佳
游欣欣
王敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhenjiang Huada Detection Co Ltd
Original Assignee
Zhenjiang Huada Detection Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhenjiang Huada Detection Co Ltd filed Critical Zhenjiang Huada Detection Co Ltd
Priority to CN201711174930.9A priority Critical patent/CN107841565A/zh
Publication of CN107841565A publication Critical patent/CN107841565A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种鉴别中华绒螯蟹的分子特异性引物及方法。用于鉴别中华绒螯蟹的分子特异性引物的上游引物PXF：如SEQ ID NO.1所示：下游引物PXR：如SEQ ID NO.2所示。本发明利用分子特异性标记引物PXF/PXR，通过常规PCR方法对中华绒螯蟹进行快速的分子鉴定，方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短，半日即可完成，是形态特征辨别中华绒螯蟹的有效辅助。

Description

鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异引物对中华绒螯蟹标本快速鉴别的方法。
背景技术
中华绒螯蟹(学名：Eriocheir sinensis)栖于淡水湖泊河流。每年6至7月间新生幼蟹溯河进入淡水后，栖于江河、湖荡的岸边。喜掘穴而居，或隐藏在石砾、水草丛中。掘穴时主要靠1对螯足，步足只起辅助作用。以水生植物、底栖动物、有机碎屑及动物尸体为食。取食时靠螯足捕捉，然后将食物送至口边。营养条件好时，当年幼蟹体重可达50至70克，最大可达150克，且性腺成熟，可与2龄蟹一起参加生殖洄游。如放养密度大或生长慢，则2龄时性腺也难以成熟，不能参加生殖洄游。目前，对中华绒螯蟹的物种识别仅局限于形态学鉴定，而且专业鉴定人员很少。由于长江上游水坝修筑导致产卵地遭到破坏；加之外来物种的入侵及水体污染导致中华绒螯蟹的生存环境遭受严重破坏，所以中华绒螯蟹的种群数量日益下降。因此，对中华绒螯蟹地方特有种进行有效鉴定以及物种保护已经刻不容缓。
DNA条形码技术(DNA barcoding)是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。DNA条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。DNA条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。DNA条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用DNA条形码技术，可以很好的对中华绒螯蟹进行快速、有效的鉴定。
物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些稀有物种和具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。
发明内容
本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种用于鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及其应用。
本发明的另一目的在于提供一种快速鉴别中华绒螯蟹的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种用于鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物，该引物的核苷酸序列如下：
上游引物PXF:5’-ACTTGGTGGTTTAAACTTAACCC-3’；
下游引物PXR:5’-ATTGAATTAGTATAGAAAGGGAG-3’。
该对分子特异性引物是采用普通PCR技术，经过对中华绒螯蟹标本的核糖体ITS区序列的克隆序列，然后通过NCBI的序列比对设计的，上述引物具有极高的专一性，用此对引物进行PCR扩增，可以获得200bp左右的特异性片段。
本发明还涉及上述的分子特异性标记引物(PXF/PXR)在鉴别中华绒螯蟹中的应用。
本发明还涉及上述的分子特异性标记引物在制备用于鉴别中华绒螯蟹的试剂盒中的应用。
一种用于鉴别中华绒螯蟹的试剂盒，该试剂盒中包含上述的分子特异性标记引物。该试剂盒中还包含PCR常用试剂。
一种快速鉴别中华绒螯蟹的方法，以待测样本的基因组DNA为模板，以上述的分子特异性标记引物(PXF/PXR)作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为中华绒螯蟹。所述的DNA目的条带为200±10bp的DNA目的条带。
上述PCR扩增的反应程序为：94℃变性5min；94℃、30s，48℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃延伸10min。
上述方法中扩增的选择、基因组DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。
需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于中华绒螯蟹的形态学特征初步的判断，再将判断为中华绒螯蟹的标本运用本发明方法鉴别。
对本发明所述快速鉴别中华绒螯蟹方法进行验证的具体步骤如下：
(1)从浸泡标本中剪取中华绒螯蟹的部分肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。
(2)生物公司试剂盒方法提取样品中的基因组DNA，于-20℃保存备用。
(3)以步骤(2)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物(PXF/PXR)作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR反应体系(总体积为25μL)组成为：
PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃、30s，48℃、30s，72℃、1min)；72℃条件下延伸10min。
取2μL PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示，检出大小约为200±10bp的条带，可初步判定待测样本为中华绒螯蟹。
本发明的有益效果主要体现在：
本发明的分子特异性标记引物(PXF/PXR)可对中华绒螯蟹进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、灵敏度高，是形态特征辨别中华绒螯蟹的有效辅助手段。
附图说明
图1是采用本发明的核酸分子特异性标记引物对中华绒螯蟹进行PCR扩增的电泳图。
其中，M：DNA标准分子量标；1,2为空白；3,4为目的片段；5,6为阴性对照。
具体实施方式
本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别中华绒螯蟹，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
(1)待测中华绒螯蟹基因组DNA的提取
取中华绒螯蟹组织样品，剪碎后使用基因组DNA提取试剂盒进行提取，利用1.5％琼脂糖胶对所得DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，于-20℃冰箱存放备用。
(2)设计合成特异性PCR扩增引物
设计合成基于中华绒螯蟹的特异性引物，上游引物PXF：5’-ACTTGGTGGTTTAAACTTAACCC-3’和下游引物PXR：5’-ATTGAATTAGTATAGAAAGGGAG-3’，由技术人员设计，并由引物设计公司合成。
(3)分子特异性标记引物(PXF/PXR)的PCR扩增
PCR反应体系25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPS 0.5μL，Taq(5U/μl)0.2μL，MgCl21.5μL，PXF引物(10μM)1μL，PXR引物(10μM)1μL，DNA模板(约10ng/μl)1μL，ddH2O17.3μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环(94℃、30s，48℃、30s，72℃、1min)；72℃条件下延伸10min。
(4)电泳检测：
取2μL PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120V，200mA，25min)，genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示。
M：DNA标准分子量标；1,2为空白；3,4为目的片段；5,6为阴性对照。由图1可见，扩增出分子量约为200bp左右的特异性DNA条带。。
实施例2：
用实施例1的方法进行中华绒螯蟹、日本绒螯蟹、梭子蟹三种蟹类检测，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，在实验人员未知物种名称的情况下开展实验，结果表明仅仅有一种蟹可扩增出分子量约为200bp左右的特异性DNA条带，另两种蟹类样本不能扩增出，检测结果与取样人记录信息完全一致。可表明本发明的核酸分子引物具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别中华绒螯蟹。
实施例3：
从蟹类组织样本中选取2组肌肉组织样，保存在95％酒精中。选取的肌肉组织分属两组不同品种的蟹类，其中一组为中华绒螯蟹(5个样品)，另一组为其他品种(5个样品)，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，实验操作人员在不清楚2组样本品种归属的情况下进行实验。采用与实施例1相同的实验方法进行实验，PCR产物测序结果显示其中一组的5个样品能够扩增出200bp左右的特异性DNA条带为中华绒螯蟹的组织样本，另一组的5个样品为非中华绒螯蟹的组织样本，实验结果同取样人记录信息完全一致。
上述实施例为本发明的较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 镇江华大检测有限公司
<120> 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acttggtggt ttaaacttaa ccc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attgaattag tatagaaagg gag 23

Claims (9)

1.用于鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物，其特征在于：该引物的核苷酸序列如下：
上游引物PXF:5’-ACTTGGTGGTTTAAACTTAACCC-3’；
下游引物PXR:5’-ATTGAATTAGTATAGAAAGGGAG-3’。
2.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在鉴别中华绒螯蟹中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的分子特异性标记引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为中华绒螯蟹。
4.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在制备用于鉴别中华绒螯蟹的试剂盒中的应用。
5.一种用于鉴别中华绒螯蟹的试剂盒，其特征在于该试剂盒中包含权利要求1所述的分子特异性标记引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒中还包含PCR常用试剂。
7.一种快速鉴别中华绒螯蟹的方法，其特征在于：以待测样本的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的分子特异性标记引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现DNA目的条带，则待测样本为中华绒螯蟹。
8.根据权利要求4所述的鉴别中华绒螯蟹的方法，其特征在于：所述的DNA目的条带为200±10bp的DNA目的条带。
9.根据权利要求4所述的鉴别中华绒螯蟹的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：94℃变性5min；94℃、30s，48℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃延伸10min。
CN201711174930.9A 2017-11-22 2017-11-22 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法 Pending CN107841565A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711174930.9A CN107841565A (zh) 2017-11-22 2017-11-22 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711174930.9A CN107841565A (zh) 2017-11-22 2017-11-22 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107841565A true CN107841565A (zh) 2018-03-27

Family

ID=61679076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711174930.9A Pending CN107841565A (zh) 2017-11-22 2017-11-22 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107841565A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531614A (zh) * 2018-04-23 2018-09-14 宁波大学 一种基于高分辨率溶解曲线方法鉴别青蟹的分子标记
CN114438222A (zh) * 2022-01-24 2022-05-06 宁波大学 一种中华绒螯蟹的性别鉴定特异性dna序列及性别鉴定方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1511960A (zh) * 2002-12-27 2004-07-14 李思发 中华绒螯蟹种质检测和鉴定技术
CN101481735A (zh) * 2009-01-07 2009-07-15 淮海工学院 一组基于三疣梭子蟹its基因的微卫星引物
CN105385767A (zh) * 2015-12-17 2016-03-09 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物及其鉴定方法
CN105755116A (zh) * 2016-01-31 2016-07-13 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 与中华绒螯蟹性早熟与否相连锁的微卫星标记的引物及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1511960A (zh) * 2002-12-27 2004-07-14 李思发 中华绒螯蟹种质检测和鉴定技术
CN101481735A (zh) * 2009-01-07 2009-07-15 淮海工学院 一组基于三疣梭子蟹its基因的微卫星引物
CN105385767A (zh) * 2015-12-17 2016-03-09 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物及其鉴定方法
CN105755116A (zh) * 2016-01-31 2016-07-13 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 与中华绒螯蟹性早熟与否相连锁的微卫星标记的引物及其应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531614A (zh) * 2018-04-23 2018-09-14 宁波大学 一种基于高分辨率溶解曲线方法鉴别青蟹的分子标记
CN108531614B (zh) * 2018-04-23 2021-07-27 宁波大学 一种基于高分辨率溶解曲线方法鉴别青蟹的分子标记
CN114438222A (zh) * 2022-01-24 2022-05-06 宁波大学 一种中华绒螯蟹的性别鉴定特异性dna序列及性别鉴定方法
CN114438222B (zh) * 2022-01-24 2023-04-25 宁波大学 一种中华绒螯蟹的性别鉴定特异性dna序列及性别鉴定方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Okumuş et al. Fish population genetics and molecular markers: II-molecular markers and their applications in fisheries and aquaculture
CN104357553B (zh) 一种黄颡鱼微卫星家系鉴定方法
CN106048065B (zh) 中华鲟环境dna检测pcr扩增引物及其检测方法和应用
CN107828899A (zh) 鉴别中华鲟的分子特异性标记引物及方法
Xing et al. A review of environmental DNA field and laboratory protocols applied in fish ecology and environmental health
CN114686597A (zh) 一种银龙鱼性别鉴定snp分子标记及其应用
CN107058603A (zh) 一种鲶鱼dna条形码标准检测序列及其应用
CN107354219B (zh) 一种鉴定企鹅性别的方法及试剂盒
Hou et al. Formalin-fixed fish larvae could be effectively identified by DNA barcodes: A case study on thousands of specimens in South China Sea
CN107841565A (zh) 鉴别中华绒螯蟹的分子特异性标记引物及方法
CN108531619B (zh) 用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物及应用
CN102382878B (zh) 一种鉴别建鲤不同家系的分子标记方法
Hsu et al. Use of microsatellite DNA and amplified fragment length polymorphism for cherry salmon (Oncorhynchus masou) complex identification
CN104450881A (zh) 基于DNA Barcoding 的6种常见鱼类鉴别试剂盒
Ritchie et al. Comparative virulence of Infectious salmon anaemia virus isolates in Atlantic salmon, Salmo salar L.
CN104450697B (zh) 一种与牡蛎抗病毒特性相关的snp标记及其应用
Senfeld et al. Taxonomic status of the extinct Canary Islands Oystercatcher Haematopus meadewaldoi
CN104630335A (zh) 一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法
CN107841563A (zh) 鉴别鲶鱼的分子特异性标记引物及方法
CN102864240A (zh) 一种鱼卵分类分子鉴定方法
CN110551826B (zh) 鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法
CN102586451B (zh) 一种建鲤配组繁殖的方法
CN106916884A (zh) 一种尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记ssr450及其应用
CN106636319A (zh) 快速鉴别东白眉长臂猿和北白颊长臂猿的分子生物学方法
CN110205389A (zh) 缢蛏抗副溶血弧菌相关SNPs分子标记及其扩增引物和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180327

RJ01 Rejection of invention patent application after publication