CN105385767A - 一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物及其鉴定方法 - Google Patents

一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物及其鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物及其鉴定方法，包括以下步骤：采集待鉴别的中华绒螯蟹的样本；从中华绒螯蟹腿部肌肉提取DNA；以提取出来的DNA为模板，用10对微卫星引物进行PCR扩增；对PCR产物进行电泳检测，然后进行银染；对银染结果进行数字化分析，用遗传软件测量个体之间的遗传距离，根据遗传距离绘制UPGMA聚类分析图，根据聚类分析结果区分不同家系的个体。本发明可以快速准确的对中华绒螯蟹的家系进行区分，有效防止近亲繁殖，在中华绒螯蟹家系选育和育种中有很大的应用价值。

Description

一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物及其鉴定方法
技术领域:
本发明涉及一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物及其鉴定方法，属于分子标记技术领域。
背景技术:
中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是我国重要的水产经济蟹类，在我国广泛分布于南北沿海和各地湖泊，尤其是长江水系。中华绒螯蟹味道鲜美并且含有大量的维生素A，对儿童的佝偻病和老年人的骨质疏松症有很大的益处。
随着养殖业的快速发展，集约化程度也随着提高，就会产生近亲繁殖和回交的现象，近几年中华绒螯蟹的品质出现了严重退化的现象。在养殖对比试验的过程中，常常将不同的家系放入同一池塘中养殖，最终也需要区分不同的中华绒螯蟹家系，因此建立一种中华绒螯蟹的家系判定方法具有极其重要的理论和生产意义。
发明内容:
本发明的目的是提供一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物及其鉴定方法，有助于快速准确的鉴别不同家系的中华绒螯蟹，有效防止近亲繁殖，在中华绒螯蟹的选育和遗传保护方面提供极大的理论依据。
本发明的技术方案如下：
一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物，该引物包括10对微卫星引物，具体如下：
编号 正向引物DNA序列(5’-3’) 反向引物DNA序列(3’-5’) 退火温度
1 GATAGACCGTAAATGAGACGGCTG GGACGGAGAAAACTAGAGACCACA 63℃
2 TAGGGGGTTTTAGGTGTGGTGATA ATTTATGTGGAGGGAATGGGAGAT 62℃
3 TTTCCCATCATCATGACAACAGTAAT CTCAGGATGGCGATGATGATAA 63℃
4 TATTTCATCATCACCATCACCACC CATCGAGGCTTTGTTTTGATGTTA 63℃
5 TTTCAACTTTTCTCCGGGTTGTTA CGGTGATCCTAATTACATTCTGGG 63℃
6 TATCAGAGAGGAAGAGGACGTTGG GAGGAGGAGGGCAGGTAAAGAG 63℃
7 ATAACAGATGCAAGTGGAGGTGGT TCTCCCCTCACAAGGACAAAACTA 63℃
8 CTCAAGGCACCAGGACACTTATCT CACCTCTCCTCTCTAAATCACCCA 63℃
9 TCCTCGTCATCCTCATCTCTTTTC TCGTGGCTGATTCTCCACTACATA 62℃
10 AGGGCCTGTGTCCTATGAGTGAT TTCCCTCTGATTATTTCGTTAGGGA 63℃
。
2.一种中华绒螯蟹不同家系的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)从待鉴别的中华绒螯蟹腿部肌肉提取DNA；
(2)以步骤(1)得到的DNA为模板，用权利要求1所述的10对引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物使用聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染；
(4)对步骤(3)的银染结果通过遗传分析软件进行分析，测量每个个体之间的遗传距离，根据遗传距离绘制UPGMA聚类分析图，根据聚类结果区分不同中华绒螯蟹家系的个体。
所述的中华绒螯蟹不同家系的鉴定方法，步骤(2)中PCR扩增的反应体系可以为15ul：10×PCRBuffer1.5ul，2.5mmol/LdNTP0.5ul，MgCl21.5ul，上下游引物各0.5ul，Taq酶0.2ul，DNA模板2ul，超纯水8.3ul。
所述的中华绒螯蟹不同家系的鉴定方法，步骤(2)中PCR扩增反应程序可以为：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存。
所述的中华绒螯蟹不同家系的鉴定方法，步骤(3)中PCR产物可以用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳和银染。
所述的中华绒螯蟹不同家系的鉴定方法，步骤(4)中所述的遗传分析软件可以为population软件。
本发明提供的鉴别中华绒螯蟹不同家系的分子标记方法所用的引物，具有高度多态性，进一步保证了鉴别中华绒螯蟹不同家系的鉴别结果的准确性与可靠性。
本发明提供的鉴别中华绒螯蟹不同家系的分子标记方法，可以将混杂的不同家系的中华绒螯蟹的个体区别开来，有助于防止近亲繁殖和选育。
附图说明
图1为实施例1中根据个体之间的遗传距离画出的UPGMA聚类分析图。
具体实施方式：
实施例1
(1)中华绒螯蟹的选取：
选取4个抱卵的中华绒螯蟹雌蟹，待其子代长大，每只雌蟹的后代组成一个家系，从第一个家系中选取21个个体，编号为1-21，从第二个家系中选取11个个体，编号为22-32，从第三个家系中选取18个个体，编号为33-50，从第四个家系中选取18个个体，编号为51-68。
(2)中华绒螯蟹亲本和子代DNA的提取：
1.从中华绒螯腿部取0.2g肌肉，放入1.5ml离心管中，加入470ulSET。肌肉要用研磨棒捣碎。
2.加入25ul20％SDS(终浓度为0.5％)，然后加入5ul20mg/ml蛋白酶K(终浓度200ug/ml)。
3.放入55摄氏度水浴锅水浴5小时看到溶液澄清。期间需要每一小时摇晃一下。
4.加入1uRNAse37摄氏度水浴一小时。
5.加入500毫升的饱和酚，上下颠倒半小时，颠倒过程中不能破坏DNA。
6.10000rpm离心10分钟。
7.用枪头吸出上清液，放入另一个干净的离心管，枪头的尖端要被减除，防止破坏DNA。同时不要吸到下层的浑浊液体。
8.重复5-7步骤。
9.加入酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，上下颠倒半小时，颠倒过程中不能破坏DNA。在离心机上10000rpm离心10分钟。用枪头吸出上清液，放入另一个干净的离心管，枪头的尖端要被减除，防止破坏DNA。同时不要吸到下层的浑浊液体。
10.加入氯仿：异戊醇(24:1)，上下颠倒半小时，颠倒过程中不能破坏DNA。在离心机上10000rpm离心10分钟。用枪头吸出上清液，放入另一个干净的离心管，枪头的尖端要被减除，防止破坏DNA。同时不要吸到下层的浑浊液体。
11.在上清液中加入1ml的预冷的无水乙醇，用力快速旋转，直至析出白色沉淀，或者在零下20摄氏度冰箱中过夜。
12.在离心机10000rpm旋转3分钟，弃上清液，剩下固体，加入1ml的70％的乙醇洗涤沉淀。
13.在离心机上10000rpm旋转三分钟，弃掉上清液，此时DNA沉淀与壁粘附不牢，容易随乙醇滑出。回收DNA用70％乙醇洗去DNA沉淀中的盐。
14.40-50摄氏度烘干，加入适量的超纯水。
(3)中华绒螯蟹PCR产物扩增反应和电泳检测
本实验所选用的10对微卫星引物及条件如表1所示，PCR反应体系为15ul：10×PCRBuffer1.5ul，2.5mmol/LdNTP0.5ul，MgCl21.5ul，上下游引物各0.5ul，Taq酶0.2ul，DNA模板2ul，超纯水8.3ul。反应程序为：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存。
PCR产物用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染后拍照。
表1中华绒螯蟹10对微卫星引物的基本信息
(4)遗传结构分析
将步骤(3)得到的10对微卫星清晰的电泳图像进行数字化处理，通过Cervus软件计算出这10个微卫星位点的有效等位基因数、杂合度和多态信息含量(表2)。
表2中华绒螯蟹10个微卫星位点的有效等位基因数、杂合度及多态信息含量
由表2可以看出每个位点的有效等位基因数介于3.5和5.7之间，大部分位点的观测杂合度在0.5附近，所有位点的多态信息含量均大于0.5，均表现为高度多态性。通过软件population软件分析计算每个个体之间的遗传距离，并构建UPGMA聚类分析图，结果如图1所示，四个中华绒螯蟹家系聚类成4个大的分支，同一个家系所有的个体聚类在同一个大的分支上，可以确定他们的亲缘关系，这与前提条件完全相同；不同家系的个体聚类在不同的分支上，说明它们亲缘关系较远，也和前提条件完全相同，鉴定结果准确率达到了100％。根据聚类图表现出的亲缘关系，可以区分4个家系，从而验证了这个方法的可靠性。我们得出结论，分布在不同大的分枝上的个体亲缘关系较远。所以我们可以用这10个微卫星位点和这个方法来区分不同的中华绒螯蟹家系。
序列表
<110>中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120>一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物及其鉴定方法
<130>1
<160>20
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gatagaccgtaaatgagacggctg24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ggacggagaaaactagagaccaca24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tagggggttttaggtgtggtgata24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atttatgtggagggaatgggagat24
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tttcccatcatcatgacaacagtaat26
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ctcaggatggcgatgatgataa22
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tatttcatcatcaccatcaccacc24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
catcgaggctttgttttgatgtta24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
tttcaacttttctccgggttgtta24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cggtgatcctaattacattctggg24
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
tatcagagaggaagaggacgttgg24
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
gaggaggagggcaggtaaagag22
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
ataacagatgcaagtggaggtggt24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tctcccctcacaaggacaaaacta24
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ctcaaggcaccaggacacttatct24
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
cacctctcctctctaaatcaccca24
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
tcctcgtcatcctcatctcttttc24
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tcgtggctgattctccactacata24
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
agggcctgtgtcctatgagtgat23
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
ttccctctgattatttcgttaggga25

Claims (6)

1.一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物，其特征在于，该引物包括10对微卫星引物，具体如下：
2.一种中华绒螯蟹不同家系的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待鉴别的中华绒螯蟹腿部肌肉提取DNA；
(2)以步骤(1)得到的DNA为模板，用权利要求1所述的10对引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物使用聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染；
(4)对步骤(3)的银染结果通过遗传分析软件进行分析，测量每个个体之间的遗传距离，根据遗传距离绘制UPGMA聚类分析图，根据聚类结果区分不同中华绒螯蟹家系的个体。
3.根据权利要求2所述的中华绒螯蟹不同家系的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增的反应体系为15ul：10×PCRBuffer1.5ul，2.5mmol/LdNTP0.5ul，MgCl21.5ul，上下游引物各0.5ul，Taq酶0.2ul，DNA模板2ul，超纯水8.3ul。
4.根据权利要求2所述的中华绒螯蟹不同家系的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增反应程序为：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存。
5.根据权利要求2所述的中华绒螯蟹不同家系的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中PCR产物用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳和银染。
6.根据权利要求2所述的中华绒螯蟹不同家系的鉴定方法，其特征在于，步骤(4)中所述的遗传分析软件为population软件。
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