CN105602946A - 一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法 - Google Patents
一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105602946A CN105602946A CN201510751050.8A CN201510751050A CN105602946A CN 105602946 A CN105602946 A CN 105602946A CN 201510751050 A CN201510751050 A CN 201510751050A CN 105602946 A CN105602946 A CN 105602946A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- procambius clarkii
- dna
- familys
- program
- degrees celsius
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公布了一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，包括以下步骤：人工建立半同胞家系；从克氏原螯虾尾部肌肉提取DNA；用筛选出来的10对微卫星引物对提取的DNA进行PCR扩增；对PCR产物进行电泳，然后进行银染；对银染结果进行数字化分析，用遗传软件测量个体之间的遗传距离，根据遗传距离绘制UPGMA聚类分析图，根据聚类分析结果区分不同家系的个体。本发明可以快速准确的对克氏原螯虾的家系进行区分，有效防止近亲繁殖，在克氏原螯虾家系选育中有很大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，属于分子标记技术领域。
背景技术
克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，在民间俗称小龙虾，也叫淡水小龙虾或者红螯虾，属于十足目、鳌虾科、原螯虾属，是生活于淡水中一种像龙虾的背上长有坚硬的外壳的动物，生存能力非常顽强，原产于南美洲和墨西哥北部，现在克氏原螯虾已成为我国重要的淡水经济养殖动物，在野外主要分布在小河、湖泊和小沟渠内。
亲子鉴定技术是指在医学上或者在生产中利用原理和技术进行区分父子之间是否有争议和亲缘关系远近的判定。亲子鉴定在水产动物的科学研究和生产中应用越来越广泛，如斑节对虾、大菱鲆、太平洋牡蛎、大西洋鲑。但是目前还没有鉴定克氏原鳌虾亲子关系的有效方法。传统的亲子关系鉴别方法是家系之间分开饲养或者在眼柄上做上标记，这两种方法不但费钱费力而且在眼柄上做标记会直接影响到克氏原鳌虾的生长。正因为没有快速有效的鉴别克氏原鳌虾亲子关系的方法，随着养殖业的快速发展，集约化程度也随着提高，就会产生近亲繁殖和回交的现象，近几年克氏原鳌虾的品质出现了严重退化的现象，因此建立一种克氏原鳌虾的亲子关系判定方法具有极其重要的理论和生产意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，有助于快速准确的鉴别不同家系的克氏原螯虾，有效防止近亲繁殖，在克氏原螯虾的选育和遗传保护方面提供极大的理论依据。
技术方案:
一种鉴别克氏原螯虾不同家系所用的扩增引物，该引物包括10对特异的微卫星引物，具体序列表如下：
| 正向引物DNA序列(5’-3’) | 反向引物DNA序列(3’-5’) | 退火温度 |
| CTCCCCATGCACTCTGGCTCTGT | TGGCGAATTTTGCCTGTTTCTGTC | 66℃ |
| CTCTCCACCAGTCATTTCTT | AAGCTTACAATAAATATAGATAGAC | 52℃ |
| TATATCAGTCAATCTGTCCAG | TCAGTAAGTAGATTGATAGAAGG | 54℃ |
| CCTCCCACCAGGGTTATCTATTCA | GTGGGTGTGGCGCTCTTGTT | 63℃ |
| TATGCACCTTTACCTGAAT | TGTTGGTGTGGTCATCA | 60℃ |
| CTCGGAATGTCCACCTGAGA | TCATTATGGATTTTGTCAATCTAT | 54℃ |
| GTCGGGAACCTATTTACAGTGTAT | AAGAGCGAAGAAAGAGATAAAGAT | 57℃ |
| AATCTTAAGATCATGAAAAAGGTA | TTTAAGGAACGTATAAGAAAAGAC | 57℃ |
| CTCGGCGAGTTTACTGAAAT | AGAAGAAAGGGATATAAGGTAAAG | 60℃ |
| GAAAGTCATGGGTGTAGGTGTAAC | TTTTTGGGCTATGTGACGAG | 60℃ |
。
一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，包括以下步骤：
(1)从待测的克氏原螯虾个体尾部肌肉中提取DNA；
(2)以步骤(1)得到的DNA为模板，分别用权利要求1所述的10对引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物使用聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染；
(4)对步骤(3)的银染结果通过遗传分析软件进行分析，测量每个个体之间的遗传距离，根据遗传距离绘制UPGMA聚类分析图，根据聚类结果区分不同氏原螯虾家系的个体。
所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，步骤(2)中PCR扩增的反应体系可以为15ul：Mg离子1.5ul、buffer1.5ul、4xdNTP0.5ul、一对引物各0.5ul、Taq酶0.2ul、DNA2ul、超纯水8.3ul。
所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，步骤(2)中PCR扩增反应程序可以为：第一个程序为95摄氏度预变性2分钟，第二个程序循环35次，程序为95摄氏度变性30秒，退火温度30秒，72摄氏度延伸1分钟，第三个程序为72摄氏度延伸10分钟，第四个程序为4摄氏度保存。
所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，步骤(3)中PCR产物可以用12％的聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染。
所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，步骤(4)中所述的遗传分析软件可以为population软件。
有益效果：
运用本技术，可以有效地将混杂的不同家系的克氏原螯虾的个体区别开来，有助于防止近亲繁殖和选育。
附图说明
图1为实施例1中根据个体之间的遗传距离画出的UPGMA聚类分析图。
具体实施方式：
实施例1
(1)克氏原螯虾的繁育
从江苏省无锡市水产市场随机选取三只抱卵的雌虾，分别为一号虾，二号虾，三号虾，人工建立三个家系：从一号虾子代中取14个仔虾，从二号虾子代中取14个仔虾，从三号虾子代中取15个仔虾，形成三个半同胞家系，共46个个体，1为一号虾，2到15为一号虾的子代，16为二号虾，17到30为二号虾的子代，31为三号虾，32到46为三号虾的子代。
(2)克氏原螯虾亲本和仔虾DNA的提取：
1.从克丝原螯虾尾部肌肉取0.2g肌肉，放入1.5ml离心管中，加入470ulSET。肌肉要用研磨棒捣碎。
2.加入25ul20％SDS(终浓度为0.5％)，然后加入5ul20mg/ml蛋白酶K(终浓度200ug/ml)。
3.放入55摄氏度水浴锅水浴5小时看到溶液澄清。期间需要每一小时摇晃一下。
4.加入1uRNAse37摄氏度水浴一小时。
5.加入500毫升的饱和酚，上下颠倒半小时，颠倒过程中不能破坏DNA。
6.10000rpm离心10分钟。
7.用枪头吸出上清液，放入另一个干净的离心管，枪头的尖端要被减除，防止破坏DNA。同时不要吸到下层的浑浊液体。
8.重复5-7步骤。
9.加入酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，上下颠倒半小时，颠倒过程中不能破坏DNA。在离心机上10000rpm离心10分钟。用枪头吸出上清液，放入另一个干净的离心管，枪头的尖端要被减除，防止破坏DNA。同时不要吸到下层的浑浊液体。
10.加入氯仿：异戊醇(24:1)，上下颠倒半小时，颠倒过程中不能破坏DNA。在离心机上10000rpm离心10分钟。用枪头吸出上清液，放入另一个干净的离心管，枪头的尖端要被减除，防止破坏DNA。同时不要吸到下层的浑浊液体。
11.在上清液中加入1ml的预冷的无水乙醇，用力快速旋转，直至析出白色沉淀，或者在零下20摄氏度冰箱中过夜。
12.在离心机10000rpm旋转3分钟，弃上清液，剩下固体，加入1ml的70％的乙醇洗涤沉淀。
13.在离心机上10000rpm旋转三分钟，弃掉上清液，此时DNA沉淀与壁粘附不牢，容易随乙醇滑出。回收DNA用70％乙醇洗去DNA沉淀中的盐。
14.40-50摄氏度烘干，加入适量的超纯水。
(3)克氏原螯虾PCR产物扩增反应和电泳检测
本实验所选用的10对微卫星引物及条件如表1所示，分别对以上得到的DNA进行PCR反应，其中PCR反应体系为15ul：Mg离子1.5ul、buffer缓冲液1.5ul、4×dNTP0.5ul、一对引物各0.5ul、Taq酶0.2ul、DNA2ul、超纯水8.3ul。反应程序为：第一个程序为95摄氏度预变性2分钟，第二个程序循环35次，程序为95摄氏度变性30秒，退火温度30秒，72摄氏度延伸1分钟，第三个程序为72摄氏度延伸10分钟，第四个程序为4摄氏度保存。
PCR产物用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染后拍照。
表1克氏原螯虾10对微卫星引物的基本信息
Tab.1Thebasicinformationoftheselected10primerpairsofProcambrusclarkii
(4)遗传结构分析
将步骤(3)得到的10对微卫星清晰的电泳图像进行数字化处理，通过软件population软件分析计算每个个体之间的遗传距离，并构建UPGMA聚类分析图，结果如图1所示，三个半同胞家系聚类成3个大的分支，同一个家系的亲本和子代聚类在同一个大的分支上，可以确定他们的亲子关系，这与前提条件完全相同。不同家系的亲本和子代聚类在不同的分支上，说明它们不具有亲子关系，也和前提条件完全相同。根据聚类图表现出的亲子关系，可以区分3个家系，从而验证了这个方法的真是可靠性。
序列表
<110>中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120>一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法
<130>1
<160>20
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ctccccatgcactctggctctgt23
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tggcgaattttgcctgtttctgtc24
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ctctccaccagtcatttctt20
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
aagcttacaataaatatagatagac25
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tatatcagtcaatctgtccag21
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tcagtaagtagattgatagaagg23
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
cctcccaccagggttatctattca24
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gtgggtgtggcgctcttgtt20
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
tatgcacctttacctgaat19
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
tgttggtgtggtcatca17
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ctcggaatgtccacctgaga20
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tcattatggattttgtcaatctat24
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gtcgggaacctatttacagtgtat24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
aagagcgaagaaagagataaagat24
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
aatcttaagatcatgaaaaaggta24
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
tttaaggaacgtataagaaaagac24
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
ctcggcgagtttactgaaat20
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
agaagaaagggatataaggtaaag24
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
gaaagtcatgggtgtaggtgtaac24
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tttttgggctatgtgacgag20
Claims (6)
1.一种鉴别克氏原螯虾不同家系所用的扩增引物，其特征在于，该引物包括10对特异的微卫星引物，具体序列表如下：
。
2.一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从待测的克氏原螯虾个体尾部肌肉中提取DNA；
（2）以步骤（1）得到的DNA为模板，分别用权利要求1所述的10对引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
（3）对步骤（2）得到的扩增产物使用聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染；
（4）对步骤（3）的银染结果通过遗传分析软件进行分析，测量每个个体之间的遗传距离，根据遗传距离绘制UPGMA聚类分析图，根据聚类结果区分不同氏原螯虾家系的个体。
3.根据权利要求2所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，其特征在于，步骤（2）中PCR扩增的反应体系为15ul：Mg离子1.5ul、buffer1.5ul、4xdNTP0.5ul、一对引物各0.5ul、Taq酶0.2ul、DNA2ul、超纯水8.3ul。
4.根据权利要求2所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，其特征在于，步骤（2）中PCR扩增反应程序为：第一个程序为95摄氏度预变性2分钟，第二个程序循环35次，程序为95摄氏度变性30秒，退火温度30秒，72摄氏度延伸1分钟，第三个程序为72摄氏度延伸10分钟，第四个程序为4摄氏度保存。
5.根据权利要求2所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，其特征在于，步骤（3）中PCR产物用12%的聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染。
6.根据权利要求2所述的鉴别克氏原螯虾不同家系的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的遗传分析软件为population软件。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510751050.8A CN105602946A (zh) | 2015-11-06 | 2015-11-06 | 一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510751050.8A CN105602946A (zh) | 2015-11-06 | 2015-11-06 | 一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105602946A true CN105602946A (zh) | 2016-05-25 |
Family
ID=55983291
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510751050.8A Pending CN105602946A (zh) | 2015-11-06 | 2015-11-06 | 一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105602946A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108179200A (zh) * | 2018-03-06 | 2018-06-19 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用 |
| CN108522383A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-09-14 | 海南归耘田农业科技有限公司 | 一种保持克氏原螯虾优良性状的育种方法 |
| CN109355363A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-02-19 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法 |
| CN111793701A (zh) * | 2019-09-05 | 2020-10-20 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种用于克氏原螯虾亲子鉴定的双重pcr微卫星引物及应用 |
| CN112021226A (zh) * | 2020-09-22 | 2020-12-04 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种适用于低产卵量淡水经济螯虾的种虾扩繁方法 |
| CN112210612A (zh) * | 2020-11-07 | 2021-01-12 | 华中农业大学 | 一种区分克氏原螯虾特定地理群体的ssr分子标记及其应用 |
-
2015
- 2015-11-06 CN CN201510751050.8A patent/CN105602946A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NATALIA M. BELFIORE ET AL.: "Variable microsatellite loci in red swamp crayfish, Procambarus clarkii, and their characterization in other crayfish taxa", 《MOLECULAR ECOLOGY》 * |
| 王长忠 等: "长江下游地区4个克氏原螯虾群体的遗传多样性分析", 《生物多样性》 * |
| 胡亚成: "微卫星标记应用于克氏原螯虾的半同胞家系分析和亲子鉴定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108179200A (zh) * | 2018-03-06 | 2018-06-19 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用 |
| CN108179200B (zh) * | 2018-03-06 | 2021-08-17 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用 |
| CN108522383A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-09-14 | 海南归耘田农业科技有限公司 | 一种保持克氏原螯虾优良性状的育种方法 |
| CN109355363A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-02-19 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法 |
| CN109355363B (zh) * | 2018-10-26 | 2021-05-18 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法 |
| CN111793701A (zh) * | 2019-09-05 | 2020-10-20 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种用于克氏原螯虾亲子鉴定的双重pcr微卫星引物及应用 |
| CN111793701B (zh) * | 2019-09-05 | 2023-04-25 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种用于克氏原螯虾亲子鉴定的双重pcr微卫星引物及应用 |
| CN112021226A (zh) * | 2020-09-22 | 2020-12-04 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种适用于低产卵量淡水经济螯虾的种虾扩繁方法 |
| CN112021226B (zh) * | 2020-09-22 | 2021-09-03 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种适用于低产卵量淡水经济螯虾的种虾扩繁方法 |
| CN112210612A (zh) * | 2020-11-07 | 2021-01-12 | 华中农业大学 | 一种区分克氏原螯虾特定地理群体的ssr分子标记及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105602946A (zh) | 一种鉴别克氏原螯虾不同家系的方法 | |
| CN102134593B (zh) | 半滑舌鳎性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用 | |
| CN104357553A (zh) | 一种黄颡鱼微卫星家系鉴定方法 | |
| CN103555847B (zh) | 一种罗非鱼亲子鉴定的方法 | |
| CN107022608B (zh) | Snp标记及其应用 | |
| CN105385767A (zh) | 一种鉴定中华绒螯蟹不同家系所用的引物及其鉴定方法 | |
| CN104152451B (zh) | 一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法 | |
| CN102912017B (zh) | 一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢的方法 | |
| CN103898217B (zh) | 一种草鱼鳃部寄生鳃片指环虫的特异性扩增引物对及其应用 | |
| CN107365872B (zh) | 鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法 | |
| CN102876809B (zh) | 一种草鱼呼肠孤病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN101984057B (zh) | 一种尼罗罗非鱼性别差异性分子标记及其应用 | |
| CN105755116B (zh) | 与中华绒螯蟹性早熟与否相连锁的微卫星标记的引物及其应用 | |
| CN103966316B (zh) | 一种二倍体泥鳅微卫星家系鉴定方法及其应用 | |
| CN115679004A (zh) | 鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和杂交种的引物、方法和试剂盒 | |
| Guan et al. | Comparative analysis of the morphology, karyotypes and biochemical composition of muscle in Siniperca chuatsi, Siniperca scherzeri and the F1 hybrid (S. chuatsi♀× S. scherzeri♂) | |
| CN109468391A (zh) | 应用于青鱼亲缘关系鉴定的双重pcr方法 | |
| CN112280871B (zh) | 一种珠星三块鱼特异性dna分子标记及其应用 | |
| CN104304096A (zh) | 一种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系的选育方法 | |
| CN108782458A (zh) | 一种改良泰深鸽的培育方法 | |
| CN105734144A (zh) | 一种大西洋鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用 | |
| Cheng et al. | White spot syndrome virus epizootic in cultured P acific white shrimp L itopenaeus vannamei (Boone) in T aiwan | |
| CN110592239A (zh) | 基于Cyt b基因鉴别犬牙南极鱼的引物和探针以及方法 | |
| CN111926088A (zh) | 一种检测图丽鱼种群的引物组、试剂盒和方法 | |
| CN105603097A (zh) | 用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160525 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |