CN105734144A - 一种大西洋鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用 - Google Patents

一种大西洋鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105734144A
CN105734144A CN201610197144.XA CN201610197144A CN105734144A CN 105734144 A CN105734144 A CN 105734144A CN 201610197144 A CN201610197144 A CN 201610197144A CN 105734144 A CN105734144 A CN 105734144A
Authority
CN
China
Prior art keywords
species
morrhua
real
atlantic ocean
detection system
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610197144.XA
Other languages
English (en)
Inventor
蒋丹
尹祺
李莉
于珂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201610197144.XA priority Critical patent/CN105734144A/zh
Publication of CN105734144A publication Critical patent/CN105734144A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系及应用。引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。采用大西洋鳕鱼特异性检测引物进行实时荧光PCR扩增大西洋鳕鱼的Co Ⅰ基因，实时荧光PCR扩增后会产生一条特异性扩增曲线，从而将大西洋鳕鱼成分进行特异性鉴定。本发明特异性引物设计合理，用于大西洋鳕鱼的物种检测，特异性好，检测灵敏度高，即经过荧光PCR分析，即可将大西洋鳕鱼成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。

Description

一种大西洋鳕鱼实时荧光PCR特异性检测体系及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系及应用。
背景技术
大西洋鳕鱼(学名：Gadusmorhua)为鳕形目鳕科鱼类的一种。原产于从北欧至加拿大及美国东部的北大西洋寒冷水域，栖息范围广泛，从沿海至大陆棚，以及许多开阔海域。大西洋鳕鱼是全世界年捕捞量最大的鱼类之一，为高经济价值的食用鱼，作为商业鱼种，其主要出口国是加拿大、冰岛、挪威及俄罗斯，日本产地主要在北海道。
大西洋鳕鱼无背鳍硬棘，有40-55枚背鳍软条；33-45枚臀鳍软条；51-55枚椎骨。上颌隆突，下颌具显著触须。侧线在胸鳍处弯曲，背前区的距离不到总体长的1/3，体高为体长的1/5。体色多变，背侧及体上部的色彩由褐色渐变为绿色或灰色，腹部淡化呈灰白色，腹膜银色。通过形态学特征进行判断是对大西洋鳕鱼识别的传统方法，但是这些形态学特征的可塑性强，受环境影响大，具有人为的主观倾向性，且存在丰富的近缘物种，近缘种间的形态差异细微，所以传统的形态学特征识别方法存在识别困难与识别错误的问题。
采用DNA技术鉴定动物物种是物种识别方法中最为热门也是发展最快的分子技术，快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是种群遗传学和进化遗传学的理想研究对象。目前，鱼类物种的分子检测主要集中CoⅠ基因，大西洋鳕鱼与其它近源物种的CoⅠ基因序列相似度在90％左右，序列之间存在着一定的差异。实时荧光PCR是DNA技术鉴定中快捷高效的技术之一，指在DNA扩增反应中，通过荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，研究利用实时荧光PCR对大西洋鳕鱼进行物种识别及在大西洋鳕鱼的物种保护及系统发育研究等领域均具有重大意义。
发明内容
本发明提供一种大西洋鳕鱼物种特异性检测体系及该特异性检测体系的应用方法。本发明可以检测出来自动物样品的微量DNA，完全区分大西洋鳕鱼的基因与其它鱼类基因，检测灵敏度高，方法快速，易操作。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测引物和检测体系，其中所述的引物序列是：
上游引物SEQIDNO.1：5’-AATCTTAATACTTCTTTCTTTGAC-3’；
下游引物SEQIDNO.2：5’-CTCAGACTATACCCATATACC-3’；
进一步地，所述大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系还包括由其他试剂所组成的反应体系如下表1：
表1大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系
其中，PremixExTaq购自于大连宝生物工程有限公司(商品货号：RR820)
进一步地，所述大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表2：
表2大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数
对所述的大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，利用GreenI与双链DNA非特异性结合的特性，监测每一PCR反应的荧光强度，以检测反应体系中的DNA扩增产物。
进一步地，所述大西洋鳕鱼物种进行实时荧光PCR特异性检测方法为：采用大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系扩增大西洋鳕鱼的CoⅠ基因，以PremixExTaqDNA聚合酶进行PCR反应，利用GreenI与双链DNA结合后发出荧光的特性，检测反应体系中的GreenI与DNA结合后发出的荧光，达到检测PCR产物扩增量目的。通过设计大西洋鳕鱼物种特异性引物，从而引发特异性扩增，通过荧光信号的收集处理，获得特异性扩增曲线。
本发明特异性引物设计合理，用于大西洋鳕鱼物种检测，特异性好，检测灵敏度高。采用本方法检测大西洋鳕鱼动物成分结果显示，采用大西洋鳕鱼物种特异性检测引物进行实时荧光PCR扩增大西洋鳕鱼的CoⅠ基因，会产生一条特异性扩增曲线，即经过实时荧光PCR分析，即可将大西洋鳕鱼成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
附图说明
图1.相似序列的物种分布情况，其中，方框内的物种为大西洋鳕鱼所在的位置；
图2.引物的特异性分析，如图所示只有Gadusmorhua的物种能和所设计的引物完全互补结合，没有检验到完全匹配的其它物种，证明引物的特异性较好；
图3.引物PCR扩增的电泳检测结果图，图中：M、DL2000marker；1、大西洋鳕鱼2、大西洋鳕鱼3、太平洋鳕鱼4、黑线鳕5、蓝鳕鱼6、阿拉斯加鳕鱼7、空白对照。
图4.大西洋鳕鱼实时荧光PCR的溶解曲线检测结果图，图中：1、大西洋鳕鱼2、大西洋鳕鱼3、太平洋鳕鱼4、黑线鳕5、蓝鳕鱼6、阿拉斯加鳕鱼7、空白对照。
图5.大西洋鳕鱼与其他鳕形目海洋鱼类的实时荧光PCR特异性检测结果图，图中：1、大西洋鳕2、绿青鳕3、太平洋鳕鱼4、北太平洋无须鳕5、黑线鳕6、蓝鳕鱼7、黑鳕8、阿拉斯加鳕鱼9、空白对照。
图6.灵敏度分析结果图，图中：1、25ng/μL扩增结果；2、5ng/μL扩增结果；3、1ng/μL扩增结果；4、0.2ng/μL扩增结果；5、0.04ng/μL扩增结果；6、0.01ng/μL扩增结果；7、空白对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。本发明下述具体实施例中所涉及的实验方法如无特殊说明，均为实验室常规方法，所用的试剂或药品，如无特殊说明，均由常规方法制备或者可由商业途径获得，其中所用空白对照为水。
实施例1荧光PCR特异性检测引物序列的设计
1.大西洋鳕鱼相近物种CoⅠ基因的分析
登录NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gN程序在nr数据库中进行相似性序列的搜索，返回的相似序列的物种分布情况如图1所示，并将所有序列以Gadusmorhua及CoⅠ为关键词在nr数据库中进行搜索，将搜索结果的序列下载存盘后，进行Blast列下载存盘。图1为相似序列的物种分布情况，其中，方框内的物种为大西洋鳕鱼所在的位置。
2.大西洋鳕鱼物种特异性检测引物的设计
将下载的序列进行序列的相似性分析和序列性分析，在序列的差异处设计特异性引物。
3.大西洋鳕鱼物种特异性检测引物的特异性分析
将设计好的引物在NCBI中，利用primerblast程序选择nr数据库，进行引物的特异性分析，如图2结果所示：在返回的结果中，只有Gadusmorhua的物种能和所设计的引物完全互补结合，没有检验到完全匹配的其它物种，证明引物的特异性较好。
4.大西洋鳕鱼物种特异性检测引物合成
在宝生物公司合成大西洋鳕鱼物种特异性检测引物1对，其序列为：
上游引物SEQIDNO.1：5’-AATCTTAATACTTCTTTCTTTGAC-3’；
下游引物SEQIDNO.2：5’-CTCAGACTATACCCATATACC-3’；
5.大西洋鳕鱼DNA的提取
采用DNA提取试剂盒(购于宝生物公司)提取大西洋鳕鱼(购自于大连国富水产食品有限公司)模板DNA，用微量分光光度计检测提取大西洋鳕鱼模板DNA的浓度为100ng左右。
6.大西洋鳕鱼CoⅠ基因的克隆及测序验证
琼脂糖凝胶电泳检测：以合成的特异性引物PCR扩增大西洋鳕鱼的CoⅠ基因后，以2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示(如图3所示)，经琼脂糖凝胶电泳检测后会分别产生187bp的特异性电泳条带，电泳效果最好，PCR扩增效率最高。
片段的切胶回收：采用宝生物公司的DNA片段回收试剂盒将目的条带回收及纯化，操作过程按试剂盒附带的说明书进行。
回收片段的连接、克隆及测序：回收片段与克隆载体pMD-19T连接，转化，经菌液PCR检测，阳性菌株送上海生物工程有限公司进行序列测定，确定所克隆的目的片段的序列信息。
序列验证：测序结果采用NCBI的BlastN程序通过序列比对进行验证，验证结果显示，所克隆的片段为大西洋鳕鱼的CoⅠ基因片段。
实施例2实时荧光PCR特异性检测体系的应用
大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，即利用所述大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系扩增大西洋鳕鱼的CoⅠ基因，对大西洋鳕鱼物种进行实时荧光PCR特异性检测，具体步骤如下：
表3大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系
大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表4：
表4大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数
采用大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测组合物进行实时荧光PCR扩增大西洋鳕鱼的CoⅠ基因时，以PremixExTaqDNA聚合酶进行PCR反应，利用GreenI与双链DNA结合后发出荧光，检测反应体系中的GreenI与DNA结合后发出的荧光，通过设计大西洋鳕鱼物种特异性引物，从而引发特异性扩增，通过荧光信号的收集处理，获得特异性扩增曲线，如图4及图5所示，证明了所设计引物进行PCR扩增的有效性及特异性的结果。
实施例3特异性检测
利用所述大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系进行大西洋鳕鱼的物种成分实时荧光PCR特异性检测大西洋鳕鱼等鳕形目样品，采用DNA提取试剂盒提取各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA的浓度为50ng/μL，分别按照上述步骤4中所述反应体系及反应参数进行PCR扩增，产生的30个循环以下的特异性扩增曲线即为大西洋鳕鱼，其他样品在30个循环以后出现扩增曲线或没有扩增曲线，此方法可以准确的对大西洋鳕鱼的成分进行鉴定，具有很好的特异性，如图5所示。
实施例4灵敏度检测
采用DNA提取试剂盒提取阳性样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA梯度稀释，制备成25ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.04ng/μL、0.01ng/μL6个浓度梯度样品，分别按照上述步骤3中所述反应体系及反应参数进行实时荧光PCR扩增，以确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图6所示，所产生特异性扩增曲线即为大西洋鳕鱼，当DNA浓度≥0.04ng/μL时均可以特异扩增，即该标准方法的检测灵敏度为0.04ng/μL。此方法可以准确的对大西洋鳕鱼的成分进行鉴定，具有很好的灵敏度。
以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测引物，其特征在于：引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。
2.一种大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于：包括如权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的一种大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系，包括下述试剂：
4.根据权利要求2所述的一种大西洋鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于：所述检测体系的反应参数为：变性，95℃,30s；扩增，95℃,5s；60℃,30s，40个循环。
5.利用权利要求2所述检测体系对大西洋鳕鱼物种进行实时荧光PCR特异性检测。
CN201610197144.XA 2016-03-31 2016-03-31 一种大西洋鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用 Pending CN105734144A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610197144.XA CN105734144A (zh) 2016-03-31 2016-03-31 一种大西洋鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610197144.XA CN105734144A (zh) 2016-03-31 2016-03-31 一种大西洋鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105734144A true CN105734144A (zh) 2016-07-06

Family

ID=56253193

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610197144.XA Pending CN105734144A (zh) 2016-03-31 2016-03-31 一种大西洋鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105734144A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112322759A (zh) * 2020-12-10 2021-02-05 镇江华大检测有限公司 一种基于高通量测序鉴定三种鳕鱼的检测方法
CN112760386A (zh) * 2021-01-29 2021-05-07 南京工业大学 鉴定大西洋鳕鱼、狭鳕和黑线鳕的引物组、试剂盒和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2858631A1 (fr) * 2004-09-24 2005-02-11 Centre Nat Rech Scient Procede de detection et d'identification de la presence de matieres biologiques provenant de poissons, et oligonucleotides pour sa mise en oeuvre
CN102559920A (zh) * 2012-02-29 2012-07-11 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 鳕鱼成分的实时荧光pcr检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2858631A1 (fr) * 2004-09-24 2005-02-11 Centre Nat Rech Scient Procede de detection et d'identification de la presence de matieres biologiques provenant de poissons, et oligonucleotides pour sa mise en oeuvre
CN102559920A (zh) * 2012-02-29 2012-07-11 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 鳕鱼成分的实时荧光pcr检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEATRIZ HERRERO等: "Authentication of Atlantic Cod (Gadus morhua) Using Real Time PCR", 《JOURNAL OF AGRICULTURE AND FOOD CHEMISTRY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112322759A (zh) * 2020-12-10 2021-02-05 镇江华大检测有限公司 一种基于高通量测序鉴定三种鳕鱼的检测方法
CN112760386A (zh) * 2021-01-29 2021-05-07 南京工业大学 鉴定大西洋鳕鱼、狭鳕和黑线鳕的引物组、试剂盒和方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102134593B (zh) 半滑舌鳎性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用
Silva et al. DNA-based techniques for seafood species authentication
CN103937802A (zh) 日照海蝉的dna条形码标准基因序列以及基于该基因序列的物种鉴定方法
CN104498604A (zh) 一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别引物和鉴别方法
CN112226518B (zh) 一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的分子标记c69483及其应用
Chen et al. Differentiation of fish species in Taiwan Strait by PCR-RFLP and lab-on-a-chip system
CN111471756A (zh) 用于鲟鱼性别鉴定的特异性dna片段ssm1及应用
CN111254202A (zh) 一种检测大西洋三文鱼的引物组、试剂盒和检测方法
CN113481306B (zh) 一种使用实时荧光pcr手段快速检测13种龙利鱼源性成分的方法
CN105483227A (zh) 一种华鲮dna条形码标准检测基因及其应用
CN105734144A (zh) 一种大西洋鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用
CN112226497B (zh) 一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的分子标记c98284及其应用
CN103555847A (zh) 一种罗非鱼亲子鉴定的方法
CN110042168B (zh) 用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的引物对、试剂盒及方法
CN109355363B (zh) 一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法
Herrero et al. Authentication of swordfish (Xiphias gladius) by RT–PCR and FINS methodologies
CN105734143A (zh) 一种欧鳇实时荧光pcr特异性检测体系及应用
CN102134604B (zh) 鉴别中华乌塘鳢种群的单核苷酸多态性标记和鉴别方法
Faria-Pereira et al. Molecular assessment of Gymnotus spp.(Gymnotiformes: Gymnotidae) fishing used as live baitfish in the Tietê River, Brazil
CN104073557B (zh) 长牡蛎Poly(I:C)应激实验荧光定量的内参基因及其引物和应用
CN105838788A (zh) 一种蓝鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用
CN110564869A (zh) 基于16S rRNA基因鉴别裸盖鱼的引物和探针以及方法
CN104962660A (zh) 一种杂色蛤物种实时荧光pcr特异性检测体系及应用
Li et al. Combining DNA mini-barcoding and species-specific primers PCR technology for identification of heosemys grandis
CN102134600B (zh) 一种朱鹮性别鉴定的pcr方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160706