CN104073557B - 长牡蛎Poly(I:C)应激实验荧光定量的内参基因及其引物和应用 - Google Patents

长牡蛎Poly(I:C)应激实验荧光定量的内参基因及其引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明为长牡蛎Poly(I:C)应激实验荧光定量的内参基因及其引物和应用，涉及分子生物学领域，具体地说是长牡蛎聚肌苷酸聚胞苷酸应激实验荧光定量内参基因的筛选。本发明筛选出的β-actin、GAPDH和RS18是Poly(I:C)应激实验中，牡蛎血细胞内表达最稳定的3个内参基因。这3个内参基因在Poly(I:C)应激实验中，表达的稳定性优于候选的另外的七个内参基因(包括常用的28S？rRNA和Elongation？factor-1α)，因此可以同时使用做为荧光定量内参基因，能为长牡蛎Poly(I:C)应激实验中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持。

Description

长牡蛎Poly(I:C)应激实验荧光定量的内参基因及其引物和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说是长牡蛎聚肌苷酸聚胞苷酸(简称聚肌胞，Polyinosinic-polycytidylicacid，Poly(I:C))应激实验中进行功能基因表达分析的内参基因的筛选。
背景技术
长牡蛎(Crassostreagigas)，也称太平洋牡蛎(Pacificoyster)，属于瓣鳃纲(Bivalvia)，珍珠贝目(Pterioida)，牡蛎科，是冠轮动物(Lophotrochozoa)中软体动物门(Mollusca)内的重要分支。其肉质肥嫩，鲜美可口，营养丰富，具有很高的经济价值，是世界上重要的水产养殖对象。自然分布于日本、中国和韩国，为世界性广布种。太平洋牡蛎作为贝类的“模式种”，一直受到科学家们的广泛重视，尤其是近来长牡蛎基因组序列的破译引起更广泛的关注。
长牡蛎天然免疫系统一直是科学家们感兴趣的领域。牡蛎开放的循环系统，每天都要面对潮间带各种病原菌的挑战，而牡蛎却能应付自如，其体内必然存在完备精细的天然免疫系统。病原菌及相关病原分子应激实验是近年来研究免疫基因对病原菌或相关分子响应机制的重要手段，研究者通过对牡蛎成体进行病原菌或其类似物刺激，利用荧光实时定量PCR技术研究免疫基因随时间对病原菌或其类似物的响应。
Poly(I:C)是一种人工合成的双链RNA的类似物，由肌苷酸与胞苷酸多聚而成，是一种免疫增强剂。由于Poly(I:C)与一些病毒的双链RNA在结构上相似，它的钠盐可以用来模拟病毒感染，启动抗病毒的免疫反应。因此，Poly(I:C)经常被用做刺激源进行免疫学研究，以探索生物个体对病毒的响应机制。
荧光实时定量PCR(qRT-PCR)具有操作简单，成本较低，灵敏度高的优势，经常被用来研究目的基因的表达。一些对宿主对病原菌应激反应的研究，其转录水平的研究常常基于qRT-PCR实验。而相对荧光定量实验需要表达稳定的管家基因作为内参。管家基因是典型的组成性基因，在稳态或是病原应激的细胞中，管家基因都能相对较稳定表达。但是在不同的实验条件下，管家基因的表达量还是有差异的。因此确定稳定表达的管家内参基因对获得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要的。
发明内容
本发明的目的是筛选长牡蛎(Crassostreagigas)Poly(I:C)应激实验荧光定量的内参基因。即，基于荧光定量PCR中的相对定量法在长牡蛎Poly(I:C)应激实验中对免疫基因及其他功能基因进行定量分析所用的基因荧光定量内参基因及其引物。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
筛选出长牡蛎Poly(I:C)应激实验荧光定量的内参基因：长牡蛎Poly(I:C)应激实验中三个内参基因为β-actin,具有序列表SEQIDNo:1中碱基序列和GAPDH具有序列表SEQIDNo:2中碱基序列，RS18内参基因具有序列表SEQIDNo:3中碱基序列。
长牡蛎Poly(I:C)应激实验荧光定量的内参基因的应用，所述贝类基因β-actin，GAPDH与RS18在长牡蛎Poly(I:C)应激实验样品中稳定表达(即，表达量变化小)，能够在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因。
所述长牡蛎Poly(I:C)应激实验荧光定量的内参基因的应用，同时使用三个稳定表达的管家基因作为基因内参；三个基因内参的表达量Ct值为各基因在应激实验样品中的表达量Ct值的算术平均数；通过该三基因内参校正上样过程中的实验误差，能够提高实验的准确性。
β-actin的特异性引物为:
β-actin-F:5’-GTGCTACGTTGCCCTGGACTT-3’
β-actin-R:5’-TCGCTCGTTGCCAATGGTGAT-3’；
GAPDH的特异性引物为:
GAPDH-F:5’-TTCTCTTGCCCCTCTTGC-3’
GAPDH-R:5’-CGCCCAATCCTTGTTGCTT-3’；
RS18的特异性引物为:
RS18-F:5’-GCCATCAAGGGTATCGGTAGAC-3’
RS18-R:5’-CTGCCTGTTAAGGAACCAGTCAG-3’。
具体步骤为：
a.候选内参基因序列的获得：选取长牡蛎荧光定量PCR常用5个的内参基因Elongationfactor-1α,β-actin,18SrRNA,28SrRNA和Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)，以及在牡蛎幼虫发育过程中表达稳定的内参Ribosomalprotein18(RS18)和RibosomalproteinL7(RL7)，另外3个从牡蛎基因组中获得的人的管家基因的同源基因S-phasekinase-associatedprotein1(SKP1)，HeterogeneousnuclearribonucleoproteinQ(HNRQP)和Ubiquitin-conjugatingenzymeE2D2(UBCD1)共10个基因作为内参基因的候选基因。
b.引物设计：根据获得的候选基因序列设计该基因相应的特异引物(扩增产物单一，具体为溶解曲线峰单一，3％的琼脂糖胶检测条带单一)。
c.PCR模板的准备：收集样品后，用TRIzol(试剂，市购于LifeTechnologies公司)提取总RNA，用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)(试剂盒，市购于TaKaRa公司)按照说明书反转成双链cDNA。作为荧光定量PCR的模板。
d.荧光定量PCR反应：以反转的cDNA为模版，用内参基因相应的特异引物在ABI7500FASTreal-timePCR仪中进行扩增。获得各个基因的表达数据Ct值。
e.根据所得Ct值通过GeNormv3.4软件计算，筛选出表达最稳定的内参管家基因并确定最优内参基因数目。
本发明具有如下优点：
1.本发明首次从多达十种候选内参基因中筛选出Poly(I:C)应激实验中表达最稳定的内参基因，数据真实可靠。
2.筛选出的内参基因适用于长牡蛎Poly(I:C)应激实验中免疫相关基因或其他功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准确性。其应用较为普遍，操作相对简单，成本较低，灵敏度高，精确度高。
3.本研究筛选出的的三个内参基因是经过严格的内参筛选程序选出的，是长牡蛎在Poly(I:C)应激条件下表达最稳定的内参基因。
附图说明：
图1.GeNorm软件计算出的各内参管家基因表达稳定值；
图2.GeNorm通过成对变异系数(Vn/Vn+1)确定最适合的内参基因的数目。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。本发明所采用实验用品均来自市购，所用英文标记均为产品包装名称。
序列表(1)SEQIDNO:1的信息β-actin基因
序列特征长度：1423bp
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA
特性名称：β-actin
来源：长牡蛎
序列描述：牡蛎β-actin基因全长，基因编号AF026063
CCGAACTCAAACCATCACTTTCTTGTCTGGATATTAATCTTACAACTTCACAATGGGAGATGAAGATATTGCAGCTTTAGTCGTAGACAATGGATCCGGAATGTGCAAGGCCGGATTTGCCGGAGACGATGCTCCCAGAGCTGTGTTTCCCTCCATTGTCGGACGCCCCAGACATCAGGGTGTGATGGTTGGTATGGGACAGAAGGACAGCTATGTAGGAGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGTATCCTCACCCTCAAGTACCCCATTGAACACGGCATCGTCACCAACTGGGATGACATGGAGAAAATCTGGCATCATACCTTCTACAATGAACTCCGTGTGGCCCCAGAGGAACACCCCGTCCTCCTGACCGAGGCCCCACTCAACCCCAAGGCCAACAGAGAAAAGATGACACAGATCATGTTCGAGACCTTCAACTCTCCCGCCATGTACGTCGCCATCCAGGCCGTACTGTCCCTGTACGCTTCCGGTCGTACAACCGGTATCGTACTCGACTCCGGAGATGGTGTGTCTCACACAGTCCCCATCTACGAAGGTTACGCCCTTCCCCACGCCATCATGAGATTGGATCTCGCTGGACGTGATCTGACCGATTACCTCATGAAAATCCTCACAGAACGTGGATACTCTTTCACCACCACAGCCGAGAGAGAAATCGTCAGAGACATCAAGGAGAAACTGTGCTACGTTGCCCTGGACTTCGAACAAGAGATGACTACTGCTGCTTCATCCTCATCTCTAGAGAAGAGCTATGAACTTCCCGACGGTCAGGTCATCACCATTGGCAACGAGCGATTCAGGTGCCCAGAGGCCATGTTCCAGCCATCCTTCCTTGGAATGGAATCTTCCGGAATCCATGAAACATCATACAACAGTATCATGAAATGTGATGTCGATATCCGTAAAGACTTGTACGCTAATATTGTCCTGTCTGGAGGTACCACCATGTTCCCCGGCATTGCTGACCGTATGCAAAAGGAGGTCACCGCCCTCGCTCCCCCAACAATGAAGATTAAGGTCATTGCTCCACCTGAGAGGAAATACTCCGTCTGGATCGGTGGTTCCATCCTTGCTTCTCTCTCCACCTTCCAACAGATGTGGATCAGCAAACAGGAGTACGACGAATCTGGACCATCCATTGTCCACAGGAAATGCTTCTAAATAGACTCATTAGTTTTAATAAGATTCTTTTTCTGTAGTTTAAATTGTTTAGTAGTAGTTCTCATTACACACACGTGATGATTGAGTAAAGACCTTCTGGCCATCAAGTGGCTGTGATAGGAGTTTAATATAGATTGCATACCCCTTAGAAATATCTTAGATCAGACTAGTATGAAATATGATAAAGCTTTATTAACACTGTTTCGTTCTTGATTCTGAATAAAATGTTATCACATTGTT
序列表(2)SEQIDNO:2的信息GAPDH基因
序列特征长度：928bp
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA
特性名称：GAPDH
来源：长牡蛎
序列描述：牡蛎GAPDH部分基因序列，基因编号AJ544886
ACGGTTTCGGGCGGATCGGTCGTCTTGTCCTTAGGGCAGCCTTGGACAAAGGAGTTGATGTTGTTGCAGTCAATGATCCTTTCATTGACCTTGACTATATGGTTTACATGTTCAAATATGATTCAACTCACGGAGTTTTCAATGGGGAGATTAAAATTGATGGAGGAAAACTGGTGATCAATGGGAAGGCAATGTCCGTATATTGCGAACGGGATCCAGCCAACATTCCCTGGTCCAAGGATGGTGCTGAATACATTGTCGACTCTACAGGGTGCTTTACTACTCTTGACAAAGCAGGGTCTCATATGAAAGGAGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCCCCCTCAGCTGACGCACCCATGTTTGTTTGTGGTGTCAATGCAGAAAAGTACTCCAAAGACCAGAACATCGTCAGCAACGCATCCTGCACCACAAATTGTCTTGCCCCTCTTGCAAAAGTGATTCATGAGAAATTTGGAATTGTTGAAGGTTTGATGACAACAGTCCATGCGTACACAGCCACCCAGAAGGTTGTGGATGGCCCAAGCAACAAGGATTGGCGTGGTGGTAGAGGTGCAGCCCAAAACATCATCCCCTCCTCAACTGGAGCTGCCAAAGCTGTCGGAAAGGTTATCCCAGATTTGAACGGAAAATTGACCGGAATGGCTTTCCGCGTACCAGTTCCAGATGTTTCCGTTGTTGATTTAACCTGCAGAATCAATAAAGGGGCATCATACAATGATATTAAGGCAGCCATCAAGGCAGCCTCTGAGAATGAATTGAAAGGCATTTTGGGATACACAGAAGATGATGTTGTTTCCCAGGATTTCCGTGGAGACAAGCGAAGCAGCATTTTTGATGCAAAGGCTGGAATTGCCTTGAATGACAATTTTGTGAAGCTTGTGTCTTGGTACGACAATGAATACGG
列表(3)SEQIDNO:3的信息RS18基因
序列特征长度：459bp
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA
特性名称：RS18
来源：长牡蛎
序列描述：牡蛎RS18基因序列，基因编号CGI_10008101
ATGGCTTTGATACTGCCAGAGAAGTTTCAGCACATTCTTCGTATCCTCAACACAAATATTGATGGACGAAGGAAAATTATGTTCGCTATGACTGCCATCAAGGGTATCGGTAGACGATATGCTAATGTTGTCTGCAAGAAAGCTGATGTAGATATCACAAAAAGGGCAGGGGAACTCTCAGAAGAAGAGATTGACAAAATTGTCACAATTATGCAGAACCCTCGTCAGTACAAGATTCCTGACTGGTTCCTTAACAGGCAGAAAGACATTAAGGATGGTAAATTCAGCCAGGTCATGTCCAACACACTGGACAACAAACTCCGTGAGGATCTGGAGCGACTAAAGAAGATCCGAGCACACAGAGGTCTCCGTCACTACTGGGGTCTAAGAGTGAGAGGACAGCACACAAAGACCACAGGAAGAAGAGGAAGAACTGTCGGTGTGGCCAAGAAGAAGTAA
实施例1
候选内参基因的选择：我们选取长牡蛎常用5个的内参基因：Elongationfactor-1α,β-actin,18SrRNA,28SrRNA和GAPDH，以及在牡蛎幼虫发育过程中表达稳定的内参基因RS18和RL7，还有另外3个从牡蛎基因组中获得的人的管家基因的同源基因SKP1，HNRP和UBCD1共10个基因作为内参基因的候选基因。所选取的内参基因序列(见表1)
定量实验所用实验材料：实验用成体健康长牡蛎(平均壳高90mm)购于青岛胶南。实验前暂养于充气的过滤海水中，水温维持在18℃±1℃。Poly(I:C)应激实验：120只长牡蛎均分为两组，每组60只。实验组60只每只注射100μlPoly(I:C)(1.0mg.mL-1inPBS)，对照组60只每只注射100μlPBS。在注射后0h，3h，6h，12h，24h，48h，72h，实验组与对照组每组分别随机抽取6只牡蛎，用无菌注射器抽取血淋巴后，800g离心10min收集血细胞，重悬于TRIzol试剂中备RNA提取用。
RNA提取方法用TRIzol按照说明书的步骤提取血细胞总RNA。
实施例2
经过荧光定量PCR评估候选内参基因表达稳定性：根据候选基因序列设计出特异的引物对(见表1)，在Poly(I:C)应激样品中进行荧光定量PCR，获得每个候选基因在各个应激时间点的表达数据即Ct值(thresholdcycle，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)。根据Ct值，用内参筛选常用的GeNorm软件计算出每个候选基因的稳定值，稳定值越小，代表基因表达越稳定。另外，GeNorm软件通过成对变异系数Vn/Vn+1的分析可以确定最适合管家基因的数目。Vandesompele等建议把0.15设置为成对变异系数的阈值，高于0.15就需要再添加额外的管家基因(一般认为选取3个内参基因对获取准确的定量数据已经足够)。GeNorm的具体算法及原理参见文献【VandesompeleJ,DePreterK,PattynF,PoppeB,VanRoyN,DePaepeA,SpelemanF(2002)Accuratenormalizationofreal-timequantitativeRT-PCRdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes.GenomeBiol3(7):research0034.1-0034.11】。选出适合的内参基因，组合后作为基因定量的内参。其具体实施方案如下：
1、实验材料：实验用成体健康牡蛎(平均壳高90mm)购于青岛胶南。实验前暂养于充气的过滤海水中，水温维持在18℃±1℃。Poly(I:C)应激实验：120只牡蛎均分为两组，每组60只，实验组60只每只注射100μlPoly(I:C)(1.0mg.mL-1inPBS)，对照组60只每只注射100μlPBS。在注射后0h，3h，6h，12h，24h，48h，72h，实验组与对照组每组分别随机抽取6只牡蛎，用无菌注射器抽取血淋巴后，800g离心10min收集血细胞，重悬于TRIzol试剂中备RNA提取用。
2、RNA提取：用TRIzol按照说明书的步骤提取总RNA。
3、第一链cDNA的合成：用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)(试剂盒，市购于TaKaRa公司)按照说明书将步骤2获得的总RNA反转成cDNA，作为荧光定量PCR模板。
1)去除基因组DNA反应。按如下成分于冰上配制反应混合液，
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl
gDNA Eraser 1.0μl
Total RNA ≤1ug
RNase Free dH2O up to10μl
42℃反应，2min，然后放置于4℃。
2)反转录反应。按如下成分于冰上配制20μl的反应体系：
试剂 使用量
步骤1的反应液 10.0μl
PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1.0μl
RT Primer Mix 1.0μl
5×PrimeScript Buffer2(for Real Time) 4.0μl
RNase Free dH2O 4.0μl
37℃反应15min，85℃，5sec(失活酶)，4℃保存cDNA。需长期保存时，放于-20℃。
4、引物设计：根据所选内参基因序列用PrimerPremier5软件设计出相应的特异性引物。设计好后交由上海桑尼公司合成。
表1本发明所用的内参基因名称，缩写，基因ID和引物序列
5、PCR反应：在ABI7500FASTreal-timePCR仪(荧光定量PCR仪，市购于ABI公司)中进行。每个PCR反应做3个重复。反应结束后获得每个候选基因在不同时间点的Ct值。按如下成分于冰上配制20μl的PCR反应体系：
试剂 使用量
2×SYBR Green PCR Mix(Takara) 10.0μl
10mM正向引物 0.4μl
10mM反向引物 0.4μl
ROX Reference Dye II 0.4μl
cDNA(步骤3获得) 2.0μl
ddH2O up to20μl
PCR扩增程序为：①95℃预变性2min；②95℃，3sec，③60℃，30sec，②③步循环40次；仪器自动制作溶解曲线。通过观察ABI7500FASTreal-timePCR仪在PCR反应后生成的溶解曲线为单一峰判定所用引物无非特异扩增；用2μl的PCR产物在3％的琼脂糖胶中150V电泳25min，观察到条带单一，从而进一步确定所用引物的特异扩增。
6、根据步骤5中获得的Ct值(见表2)，用内参筛选常用的GeNorm软件计算选出稳定值最小的两个管家基因(β-actin和GAPDH)，但是成对变异系数分析显示两个内参基因不足以作为研究基因表达的内参，需要再添加额外的内参基因RS18。因此将这三个内参基因组合后作为Poly(I:C)应激实验功能基因表达分析的基因定量内参。
7、长牡蛎基因β-actin，GAPDH和RS18在长牡蛎Poly(I:C)应激实验不同时间点取样样品中稳定表达(即表达量变化小)，能够在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因。同时使用三个稳定表达的内参基因作为内参；三个基因内参的表达量Ct值为β-actin，GAPDH和RS18基因在长牡蛎Poly(I:C)应激实验不同时间点的表达量Ct值的算术平均数，通过以上基因内参校正实验误差，能够提高实验的准确性。
表2Poly(I:C)刺激后不同时间点的内参基因定量CT值

Claims (2)

1.长牡蛎Poly(I:C)应激实验荧光定量内参基因，其特征在于：内参基因为β-actin、GAPDH和RS18；其中内参基因β-actin如序列表SEQIDNo:1中碱基序列所示，内参基因GAPDH如序列表SEQIDNo:2中碱基序列所示，内参基因RS18如序列表SEQIDNo:3中碱基序列所示。
2.一种权利要求1所述的长牡蛎Poly(I:C)应激实验荧光定量内参基因的应用，其特征在于：所述长牡蛎基因β-actin，GAPDH和RS18在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因。
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Validation of housekeeping genes as internal controls for studying gene expression during Pacific oyster (Crassostrea gigas) development by quantitative real-time PCR;Yishuai Du等;《Fish & Shellfish Immunology》;20130126;第34卷;第939-945页 *

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CN104073557A (zh) 2014-10-01

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