CN111575390A - 厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因及其引物和应用 - Google Patents

厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因及其引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因及其引物和应用，厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因为RPS23、CYTB5、EF‑1α和α‑Tubulin，RPS23基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，CYTB5基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，EF‑1α基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，α‑Tubulin基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；本发明从4个常用候选内参基因中筛选得到2个在不同发育阶段中表达相对最稳定的内参基因，以应用于厚壳贻贝不同发育阶段幼体的基因表达分析研究，从而为厚壳贻贝不同发育阶段幼体实验中功能基因表达的精确定量提供有力保证。

Description

厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因及其引物和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因及其引物和应用。
背景技术
厚壳贻贝(Mytilus coruscus)隶属软体动物门双壳纲贻贝目，是一种近海暖温性的底栖贝类，是我国继牡蛎、蛤和扇贝后的第四大海产贝类。贝类养殖不仅满足消费者对于鲜活、优质海产品的需求，同时对国家蓝色海洋可持续发展起着非常重要的作用。厚壳贻贝作为附着性贝类，幼体时期需要经历一个附着和变态的过程，也是其从浮游幼虫的生活方式转变为底栖生活方式的重要转变过程。幼体的变态过程主要由外界环境因子和内源性因子所控制，关于外界环境因子如海洋微生物被膜、海洋细菌被膜和人工诱导物等已有大量的研究报道。近年来，在分子水平阐明幼虫变态发育的调控机制受到科学家们的广泛关注。实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)是一种定量检测目的基因表达的技术，可以捕捉到PCR扩增反应中每个循环产物产生的荧光信号，完成定性以及定量分析。与传统的PCR技术相比，它具有高精确度、强特异性、快速检测和重复性好等优点。
内参基因是指在对某一个目的基因进行定量研究时，在不同实验条件下都能在待测样品中实现稳定表达的一类基因，其作用是校正目的基因的定量过程。这些内参基因一般都是管家基因，在细胞内可以稳定表达，从而有助于细胞各种功能的实现。在进行qRT-PCR过程中，待测样品可能会在反转录效率上存在差异，所以需要选择可以稳定表达的内参基因作为校正标准。
公开号为CN104073557A的专利中，筛选出的β-actin、GAPDH和RS18是Poly(I:C)应激实验中，牡蛎血细胞内表达最稳定的3个内参基因，因此可以同时使用做为荧光定量内参基因。此外，一些内参基因只在特定时期或处理条件下稳定表达。发育时期或处理条件不同，常用内参基因的表达就会产生巨大差异。因此，对于不同的实验条件和样本类型，需要不同的内参基因。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因，即筛选厚壳贻贝(Mytilus coruscus)不同生长发育阶段的荧光定量内参基因。基于荧光定量PCR中的绝对定量法在厚壳贻贝不同生长发育阶段相关实验中对其他功能基因进行定量分析所需的内参基因及其引物序列，从而筛选出稳定表达的内参基因，进一步大大提高qRT-PCR定量的准确性。
本发明的第二个目的是提供一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因的引物。
本发明的第三个目的是提供一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因和引物的应用。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因，荧光定量内参基因为RPS23、CYTB5、EF-1α和α-Tubulin，RPS23基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，CYTB5基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，EF-1α基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，α-Tubulin基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：
RPS23、CYTB5、EF-1α和α-Tubulin内参基因的特异性引物中RPS23基因的引物序列为：
RPS23-F：5’-TCACAGCCTTCGTCCCTAA-3’，
RPS23-R：5’-CCTTTGAACAGAGCCCAGA-3’。
CYTB5基因的引物序列为：
CYTB5-F：5’-CACTCAACTGACGCAAGAGAT-3’
CYTB5-R：5’-CAGCCAATGCCACACCAA-3’。
EF-1α基因的引物序列为：
EF-1α-F：5’-CACCACGAGTCTCTCCCTGA-3’
EF-1α-R：5’-GCTGTCACCACAGACCATTCC-3’。
α-Tubulin基因的引物序列为：
α-Tubulin-F：5’-TTGCAACCATCAAGACCAAG-3’
α-Tubulin-R：5’-TGCAGACGGCTCTCTGT-3’。
为达到上述第三个目的，本发明的解决方案是：
厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因在厚壳贻贝荧光定量中的应用。
RPS23基因的引物序列在厚壳贻贝荧光定量中的应用。
CYTB5基因的引物序列在厚壳贻贝荧光定量中的应用。
EF-1α基因的引物序列在厚壳贻贝荧光定量中的应用。
α-Tubulin基因的引物序列在厚壳贻贝荧光定量中的应用。
具体步骤为：
1.内参选择和引物设计：
根据本实验室厚壳贻贝转录组数据库，选择4个常用的管家基因作为候选内参基因，分别是RPS23、CYTB5、EF-1α和α-Tubulin。首先利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计这4个候选内参基因的引物。
2.内参基因PCR扩增
4个候选内参基因RPS23、CYTB5、EF-1α和α-Tubulin以厚壳贻贝不同发育阶段的cDNA为模板进行PCR扩增。经PCR扩增后，用1％的凝胶琼脂糖电泳检测其扩增产物的完整性。若出现单一且明亮的条带，证明扩增产物完整。再使用Nanodrop 2000紫外分光光度计对DNA浓度与纯度进行检测，测定A260/A280和A260/A230比值，最后送公司测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)，测序结果与转录组基因序列完全匹配。
3.割胶回收及产物纯化
使用验证后的引物重新进行PCR扩增，产物进行1％的凝胶琼脂糖电泳，然后在凝胶成像仪下切割目的条带，进行割胶回收。用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，将溶解的DNA按说明书纯化，然后将获得的纯化PCR产物作为标准品。最后使用Nanodrop 2000紫外分光光度计对DNA浓度与纯度进行检测，测定A260/A280和A260/A230比值，记录DNA浓度。
4.实时荧光定量PCR
利用RNAiso Plus试剂提取厚壳贻贝不同发育阶段的总RNA，根据试剂盒说明书去除基因组DNA，并进行反转录。转录后产物稀释100倍并冻存于-20℃冰箱中，用作qRT-PCR模板。将纯化后的标准品按照10倍比例稀释成7个梯度，获得7组不同浓度的cDNA，并将其作为模板进行qRT-PCR检测，得到候选基因的标准曲线。之后再用qRT-PCR检测4个候选基因在厚壳贻贝不同发育阶段中的表达。
5.数据分析
本实验利用geNorm、NormFinder、BestKeeper3个常用内参基因分析软件以及Ct值分析法对qRT-PCR产生的原始Ct值进行数据分析。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明从4个常用候选内参基因中筛选得到2个在厚壳贻贝不同发育阶段中表达相对最稳定的内参基因，以应用于厚壳贻贝不同发育阶段幼体的基因表达分析研究，选取稳定的内参基因是荧光定量qRT-PCR实验中重要的一环，能显著提高qRT-PCR所得数据的准确性，从而为厚壳贻贝不同发育阶段幼体实验中功能基因表达的精确定量提供有力保证。
附图说明
图1为本发明的RPS23的凝胶电泳结果示意图。
图2为本发明的CYTB5的凝胶电泳结果示意图。
图3为本发明的EF-1α和α-Tubulin的凝胶电泳结果示意图。
图4为本发明的geNorm法分析厚壳贻贝不同发育时期候选内参基因稳定性结果：(a)候选内参基因稳定值；(b)候选内参基因平均表达稳定性结果。
图5为本发明的NormFinder法分析厚壳贻贝不同发育时期候选内参基因稳定性结果。
图6为本发明的厚壳贻贝不同发育时期中CYTB5的Ct值分布。
图7为本发明的厚壳贻贝不同发育时期中RPS23的Ct值分布。
图8为本发明的厚壳贻贝不同发育时期中α-Tubulin的Ct值分布。
图9为本发明的厚壳贻贝不同发育时期中EF-1α的Ct值分布。
具体实施方式
本发明提供了一种厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因及其引物和应用。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例：
1.内参选择和引物设计：
根据本实验室厚壳贻贝转录组数据库，选择4个常用的管家基因作为候选内参基因，分别是RPS23、CYTB5、EF-1α和α-Tubulin。首先利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计这4个候选内参基因的引物，标准为引物长度在18-23bp之间，Tm值在50-65℃之间，产物大小在100-200bp之间(表1)
表1 引物序列
Figure BDA0002551599510000041
2.内参基因PCR扩增及测序
4个候选内参基因CYTB5、RPS23、EF-1α和α-Tubulin以厚壳贻贝不同发育阶段的cDNA为模板进行PCR扩增。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。经PCR扩增后，用1％的凝胶琼脂糖电泳检测其扩增产物的完整性。确认为单一且明亮的条带(图1-图3)。再使用Nanodrop 2000紫外分光光度计对DNA浓度与纯度进行检测，测定A260/A280和A260/A230比值，之后送公司测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)，测序结果(表2)与基因序列完全匹配，则基因引物验证成功。
表2 测序结果
Figure BDA0002551599510000051
3.割胶回收及产物纯化
使用验证后的引物重新进行PCR扩增，产物进行1％的凝胶琼脂糖电泳，然后在凝胶成像仪下切割目的条带，进行割胶回收。具体操作步骤如下：凝胶成像仪下割下单一DNA条带，放入1.5mL离心管中，称重。按照每0.1g凝胶加入0.1mL Binding Buffer的比例，加入Binding Buffer溶解目的条带，55℃金属浴加热7min，期间每2-3min混匀一次，直至条带完全溶解。用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，将溶解的DNA上柱，离心机设定10000g转速离心1min。将离心出的液体倒掉，柱内加300μL的Binding Buffer，以16000g转速离心1min。继续将溶液倒出，柱内加700uL的Wash Buffer(用前加乙醇)，以16000g的转速离心1min(该步骤重复两次)。将洗脱后的DNA放到新的1.5mL离心管中，干燥5min，加入20μL的DNAase/RNaseFreewater，以16000g转速离心2min，然后获得纯化的PCR产物作为标准品。最后使用Nanodrop 2000紫外分光光度计对DNA浓度与纯度进行检测，测定A260/A280和A260/A230比值，记录DNA浓度。
4.实时荧光定量PCR
4.1.总RNA的提取
将厚壳贻贝5个发育阶段(担轮幼虫、D型幼虫、壳顶幼虫、眼点幼虫和稚贝)的样品加入1mL RNAiso Plus(TaKaRa，美国)后匀浆，室温静置5min，用离心机离心5min，转速为12000g，温度设定为4℃。离心后将上清液转移至新的1.5mL离心管中，加入200μL的氯仿，振荡混匀，室温静置5min，离心机设定12000g、4℃后，离心15min。离心后上清液继续转移至新的离心管中，加入500μL的异丙醇，室温静置10min，离心机设定12000g、4℃后，离心10min。接着用1mL的75％乙醇清洗沉淀，离心机设定7500g、4℃后离心5min，弃上清液并保留沉淀，再干燥，然后溶解于适量的DEPC水中。提取总RNA后，使用Nanodrop 2000紫外分光光度计检测RNA的浓度与纯度，测定A260/A280和A260/A230比值，选取A260/A280在1.9-2.1之间，A260/A230在1.8-2.0之间的RNA。接着用1％的琼脂糖凝胶检测所选RNA的完整性。若经过电泳后的RNA存在28S、18S和5.8S三条完整的条带，则证明该RNA完整，可以用于后续实验。检测合格的RNA分装后冻存于-80℃超低温冰箱。
4.2.cDNA的合成
分别取厚壳贻贝各发育时期的总RNA(1μg)，使用试剂盒A PrimeScriptTM RTreagent kit with gDNA Eraser(Takara，大连，中国)，去除残留的基因组DNA污染并进行反转录。参照说明书，第一步反应体系为10μL：2μL 5×gDNA Eraser Buffer，1μL gDNAEraser，500ng总RNA，RNase Free dH2O加至总体积为10μL，42℃反应2min。然后，将10μL混合物加入最终20μL反应体系中：10μL步骤一反应物，1μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，4μL5×PrimeScript Buffer，4μL RNase Free dH2O，37℃反应15min，然后在87℃下反应5s。转录后产物稀释100倍并冻存于-20℃冰箱中，用作qRT-PCR模板。
4.3.标准曲线的绘制及候选基因的qRT-PCR检测
本实验采用绝对定量方法测定相对mRNA表达。首先，采用梯度稀释法建立基因的标准曲线：根据纯化后的标准品浓度换算成DNA分子数，然后按照10倍梯度稀释，获得7组浓度分别为107、106、105、104、103、102、101个DNA分子标准品，然后将其作为模板，加入96孔板内，反应体系为10μL：5μL 2×FastStart Essential DNA Green Master(罗氏，瑞士)，上下游引物各0.3μL，1μLDNA，3.4μL ddH2O。使用实时荧光定量PCR仪(罗氏，
Figure BDA0002551599510000061
96，瑞士)进行qRT-PCR检测，得到候选基因的标准曲线。设置qRT-PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性10s，56℃复性15s，共45个循环，得到单一扩增产物。在每次qRT-PCR检测中，每个样本进行两次技术重复。之后再用qRT-PCR检测4个候选基因在厚壳贻贝不同发育阶段中的表达，模板为总RNA反转录得到的cDNA，反应体系为10μL：5μL 2×FastStartEssential DNA Green Master(罗氏，瑞士)，上下游引物各0.3μL，1μL cDNA，3.4μL ddH2O。反应程序：95℃预变性3min，95℃变性10s，56℃复性15s，共45个循环。
5.数据分析
本实验利用geNorm v3.5、NormFinder v20和BestKeeper v13常用内参基因分析软件以及Ct值分析法对qRT-PCR产生的原始Ct值进行基因表达稳定性分析。
5.1.geNorm分析
利用geNorm v3.5程序分别对CYTB5、RPS23、EF-1α、α-tubulin这4个内参基因在厚壳贻贝不同发育时期的表达量进行分析，结果如图4所示。结果显示，EF-1α基因的稳定性值M最小，在厚壳贻贝不同发育时期的表达最稳定。稳定性排序为：EF-1α>α-Tubulin>RPS23>CYTB5(图4a，4b)。
5.2.NormFinder分析
利用NormFinder v20程序对CYTB5、RPS23、EF-1α、α-Tubulin这4个候选内参基因在厚壳贻贝不同发育时期的表达量进行分析，结果如图5所示。结果显示，EF-1α的稳定性值(SV)最小，在厚壳贻贝不同发育时期表达最稳定，稳定性排序为：EF-1α>α-Tubulin>RPS23>CYTB5(图5)，与geNorm分析结果一致。
5.3.BestKeeper分析
如表3所示，用BestKeeper v13程序对CYTB5和RPS23、EF-1α、α-Tubulin这4个候选内参基因在厚壳贻贝不同发育时期的表达稳定性进行分析。结果显示，CYTB5的变异系数(CV)最小，在厚壳贻贝不同发育时期表达最稳定，稳定性排序为：CYTB5>α-Tubulin>EF-1α>RPS23(表3)。
表3 BestKeeper法分析厚壳贻贝不同发育时期候选内参基因稳定性结果
参数 CYTB5 RPS23 α-Tubulin EF-1α
最小值[CP] 24.88 23.91 20.12 19.34
最大值[CP] 34.00 38.75 30.67 28.80
标准差[±CP] 2.40 3.17 2.13 2.15
变异系数[％CP] 8.34 10.06 9.27 9.61
5.4.Ct值分析法
CYTB5、RPS23、α-Tubulin和EF-1α这4个内参基因在厚壳贻贝不同发育时期中的Ct值分布情况如图6至图9所示。这4个基因的Ct值分布在19.34到38.75之间。CYTB5的Ct值分布在24.88到34.00之间，RPS23的Ct值分布在23.91到38.75之间。EF-1α的Ct值分布在19.34到28.80之间，α-Tubulin的Ct值分布在20.12到30.67之间。由此计算出CYTB5的ΔCt值是9.12，RPS23的ΔCt值是14.84。EF-1α的ΔCt值是9.46，α-Tubulin的ΔCt值是10.55，因此，根据Ct值分析法可知，CYTB5在厚壳贻贝不同发育时期表达最稳定，稳定性排序为：CYTB5>EF-1α>α-Tubulin>RPS23。
5.5.综合分析
如表4所示，根据geNorm、NormFinder和BestKeeper3个软件以及Ct值分析法分析的结果，对4个候选内参基因表达稳定性进行综合排序。结果显示，EF-1α、α-Tubulin两个基因在厚壳贻贝不同发育时期表达最稳定，其次为CYTB5，最不稳定的是RPS23。
表4 厚壳贻贝不同发育时期中候选内参基因表达稳定性排名
geNorm NormFinder BestKeeper ΔCt法 综合排名
CYTB5 4 4 1 1 2
RPS23 3 3 4 4 3
EF-1α 1 2 3 2 1
α-Tubulin 2 1 2 3 1
综上可知，通过实时荧光定量PCR技术及3个内参基因分析软件(geNorm、NormFinder和BestKeeper)和Ct值分析法，结果表明EF-1α和α-Tubulin是厚壳贻贝不同发育时期的最适内参基因，表达的稳定性优于其他基因。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002551599510000091
Figure BDA0002551599510000101
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因及其引物和应用
<141> 2020-06-23
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 166
<212> DNA
<213> RPS23基因的碱基序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
tcacagcctt cgtccctaat gatggttgtc tgaactatgt tgaagaaaac gacgaagttt 60
tggtagcagg atttggtaga aaaggacatg ctgttggaga tattcccggt gtccgtttca 120
agatagtcaa agttgcaaat gtttccctct gggctctgtt caaagg 166
<210> 2
<211> 169
<212> DNA
<213> CYTB5基因的碱基序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
cactcaactg acgcaagaga tctaatgaaa gattacataa taggaacatt acatgaggac 60
gataggaaat ccataccaat aaaggaaaat acaacaataa acgcaccttc atcaagccag 120
gggagtgcct ggactggatg gctgattcca tttggtgtgg cattggctg 169
<210> 3
<211> 102
<212> DNA
<213> EF-1α基因的碱基序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
caccacgagt ctctccctga agccttacca ggagacaatg ttggtttcaa gtaagaacgt 60
ctctgtgaag gaattcgtag aggaatggtc tgtggtgaca gc 102
<210> 4
<211> 135
<212> DNA
<213> α-Tubulin基因的碱基序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
ttgcaaccat caagaccaag agaaccatcc agtttgtaga ttggtgtcca acaggattca 60
aggttggaat caactaccaa ccaccaactg ttgtaccagg aggtgatttg gctaaagtac 120
agagagccgt ctgca 135

Claims (7)

1.厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因，其特征在于：所述荧光定量内参基因为RPS23、CYTB5、EF-1α和α-Tubulin，RPS23基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，CYTB5基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，EF-1α基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，α-Tubulin基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种权利要求1所述RPS23、CYTB5、EF-1α和α-Tubulin内参基因的特异性引物，其特征在于：RPS23基因的引物序列为：
RPS23-F：5’-TCACAGCCTTCGTCCCTAA-3’，
RPS23-R：5’-CCTTTGAACAGAGCCCAGA-3’；
CYTB5基因的引物序列为：
CYTB5-F：5’-CACTCAACTGACGCAAGAGAT-3’
CYTB5-R：5’-CAGCCAATGCCACACCAA-3’；
EF-1α基因的引物序列为：
EF-1α-F：5’-CACCACGAGTCTCTCCCTGA-3’
EF-1α-R：5’-GCTGTCACCACAGACCATTCC-3’；
α-Tubulin基因的引物序列为：
α-Tubulin-F：5’-TTGCAACCATCAAGACCAAG-3’
α-Tubulin-R：5’-TGCAGACGGCTCTCTGT-3’。
3.权利要求1所述的厚壳贻贝不同发育阶段的荧光定量内参基因在厚壳贻贝荧光定量中的应用。
4.权利要求2所述的RPS23基因的引物序列在厚壳贻贝荧光定量中的应用。
5.权利要求2所述的CYTB5基因的引物序列在厚壳贻贝荧光定量中的应用。
6.权利要求2所述的EF-1α基因的引物序列在厚壳贻贝荧光定量中的应用。
7.权利要求2所述的α-Tubulin基因的引物序列在厚壳贻贝荧光定量中的应用。
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