CN111118126A - 一种基于高通量测序的mRNA检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于高通量测序的mRNA检测方法，包括如下步骤：1)提取样本总RNA并质控；2)根据总RNA质控情况进行总RNA打断和/或引物杂交；3)合成cDNA第一链；4)合成cDNA第二链；5)构建链特异性cDNA文库；6)第一次杂交和捕获；7)第二次杂交和捕获；8)捕获后文库扩增及纯化；9)高通量测序。本发明采用杂交捕获的方式，特异性富集链特异性cDNA序列，进行mRNA表达检测。本发明在极低起始量和低质量情况下仍能保证良好的检测性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于高通量测序平台开发的mRNA检测方法。
背景技术
已有大量研究表明，通过RNA测序的方法可以检测来自生物学样品中RNA分子标志物的相对表达频率。RNA测序也被称为全转录组鸟枪法测序，是基于NGS(Next-GenerationSequencing，第二代测序)的全转录组学研究方法。RNA测序需提取生物样品中的全部转录的RNA，然后反转录为cDNA后进行文库制备及高通量测序，在此基础上进行生物信息分析，进而可以对该生物样品的基因表达状况进行全局了解。一般提取到的总RNA中，核糖体RNA(rRNA)占比～90％，而基因表达的信息存储在信使RNA(mRNA)中。因此在进行建库测序之前，一般会先去除rRNA，富集mRNA后再进行建库流程。现有的mRNA测序技术，以基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获，以及基于rRNA去除的mRNA测序技术为主。
然而，出于多种情况，受限于样品量的原因，会出现RNA提取总量不高；同时由于样本保存原因，提取到的RNA通常降解比较严重等现象。现有mRNA测序技术应用有诸多不足之处。
基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术是先用带有oligo-poly(T)的磁珠捕获含poly(A)-尾巴的mRNA，然后进行文库制备流程。文库制备一般含多个步骤(RNA破碎、cDNA第一链合成、第二链合成、末端修复&加A、加接头、文库扩增)。对于严重降解的RNA样品，大量 mRNA分子的3’末端不含有poly(A)-尾巴，因此无法被磁珠捕获得到，从而失去这一部分 mRNA的数据信息。
基于rRNA去除的mRNA测序技术是先用特异性DNA探针结合rRNA，再用RNase H 降解有DNA探针结合的RNA，回收到的mRNA再进行文库制备。文库制备一般含多个步骤 (RNA破碎、cDNA第一链合成、第二链合成、末端修复&加A、加接头、文库扩增)。RNase H降解法去除rRNA时会对mRNA造成一定损伤，因此此方法对起始RNA需求量较高，一般要求不少于1μg。同时，去除rRNA时不能有效去除内含子的片段，测序数据中内含子的数据占总数据的～50％。
综上所述，目前常用的mRNA测序技术有各自的缺点，在样品检测应用中有所限制，因此，急需一种可以适用于低投入量，低质量RNA测序的全面的系统性解决方案。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种基于高通量测序的mRNA检测方法。可以适用于低投入量，低质量RNA的检测。
本发明的技术方案是，一种基于高通量测序的mRNA检测方法，包括如下步骤：
1)提取样本总RNA并质控：RNA总量不低于10ng(优选范围为大于100ng)，浓度不低于2ng/ul(优选范围为大于10ng/ul)，RNA的260/280吸光值在1.8-2.0之间，RIN值不低于1(优选范围为大于2)，DV200不低于20％(优选范围为大于30％)；
2)总RNA打断和/或引物杂交：其中，DV200大于等于30％的RNA样品，需要先打断，再进行引物杂交，对于DV200小于30％的RNA样品，不需要打断，直接进行引物杂交；所述的引物为随机引物，其长度范围为5-10bp；
3)合成第一链cDNA：在逆转录酶的作用下，以总RNA为模板，合成cDNA第一链；
4)合成第二链cDNA：在DNA聚合酶的作用下，以第一链cDNA为模板，合成含有dUTP的cDNA第二链；
5)构建链特异性cDNA文库：取纯化后的cDNA产物，加入末端修复缓冲液和末端修复酶混合物进行末端修复反应；反应完成后加入接头、连接缓冲液、增强子及无核酶水进行连接反应；反应完成后加入尿嘧啶特异性切除酶切除含有U碱基的cDNA第二链；产物纯化后，加入标签引物进行文库扩增反应，经纯化后得到链特异性的cDNA文库；
6)第一次杂交和捕获；取固定质量(优选为200ng)链特异性的cDNA文库，加入杂交缓冲液和全外显子探针进行第一次杂交和捕获；
7)第二次杂交和捕获；在第一次杂交和捕获的回收产物中加入杂交缓冲液和全外显子探针进行第二次杂交和捕获；
8)捕获后文库扩增及纯化；在第二次杂交和捕获的回收产物中加入扩增引物和扩增酶进行文库扩增，纯化回收产物；
9)高通量测序：对扩增后的文库定量质控后进行高通量测序。
本发明的mRNA检测方法，使用随机引物对总RNA进行反转录合成cDNA，能更有效的将样本中的RNA转化为cDNA，支持超低起始量建库，适用于总RNA提取量低，RNA降解严重的样本。然后采用全外显子探针捕获的靶向测序方法，特异性的捕获来源于mRNA的 cDNA片段，能更有效的降低测序数据中rRNA数据所占比例，提高测序数据的有效性。
与现有检测产品相比，本发明的主要有益效果有：
1、适用于高度降解的样本：该发明方法通过全外显子探针捕获来源于mRNA的cDNA片段，有效避免了对mRNA降解程度的限制，可适用于高度降解的FFPE样本。
2、适用于低起始量建库：起始总RNA需求量少，可满足10ng以上高度降解RNA的建库，有效解决了临床样本样本量少、总RNA得率较少的限制。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1实施例1样本质控情况
图2本发明流程与基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术相关性分析(检测基因数和rRNA 比例)。
图3实施例2样本质控情况
图4本发明流程对高度降解FFPE RNA样本不同低起始量的检测分析及重复性分析(检测基因数、rRNA比例和外显子区富集效率)。
表1本发明流程与基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术相关性分析(检测基因表达相关性)。
表2本发明流程对高度降解FFPE RNA样本不同低起始量的检测分析及重复性分析。(检测基因表达相关性)
具体实施方式
实施例1
为了说明本发明的mRNA检测方法与标准的RNA-Seq方法(基于poly(A)-尾巴的mRNA 捕获技术)检测性能的一致性，使用福尔马林固定石蜡包埋的组织中提取的高度降解RNA样本(20ng)基于本发明的mRNA检测方法建库，使用同一来源的新鲜组织中提取的较为完整的RNA样本(1ug)基于标准的RNA-Seq方法(基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术)建库，再将两者的数据分析结果进行比较。
将4例新鲜组织样本进行福尔马林固定后石蜡包埋。分别从包埋前新鲜组织和包埋后 FFPE组织中提取总RNA。使用标准的RNA-Seq方法(基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术) 对1ug包埋前新鲜组织中提取的总RNA进行建库。使用本发明的RNA检测方法，对20ng包埋后FFPE组织中提取的总RNA进行建库。对测序获得的数据进行分析比较。
具体实施方式
1、提取样本总RNA并质控：使用RNA提取试剂盒(QIAGEN,
FFPE Handbook,货号:73504)进行RNA提取，RNA产量应不低于10ng，浓度不低于2ng/μl，260/280吸光值在1.8～2.0之间，RIN值不低于1，DV200不低于20％。
以下步骤2至步骤4使用建库试剂盒(NEB,
UltraTMII Directional RNALibrary Prep Kit for Illumina,货号:E7760L)进行文库构建。
2、cDNA第一链合成：根据RNA样品的质控结果，进行以下处理：
1)对于DV200大于等于30％的RNA样品：
RNA打断和引物杂交：取检测合格的RNA样本5μl，加入4μl 5×第一链合成缓冲液(建库试剂盒成分：NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer(5×))和1μl随机引物(生工合成)，总体积10ul，置于PCR仪上，按照以下程序进行打断和引物杂交反应：94℃8min，4℃保持，热盖105℃；
cDNA第一链合成：已打断的RNA中加入8μl链特异试剂(建库试剂盒成分：NEBNextStrand Specific Reagent)和2μl第一链合成酶混合物(建库试剂盒成分：NEBNext FirstStrand Synthesis Enzyme Mix)，总体积20μl。置于PCR仪上，按照以下程序进行反应：25℃10min， 42℃30min，(60℃2min，42℃2min)进行5个循环，70℃15min，4℃保持，热盖温度不低于80℃。
2)对于DV200小于30％的RNA样品：
RNA引物杂交：取检测合格的RNA样本5μl，加入1μl随机引物(生工合成)，总体积6ul，置于PCR仪上，按以下程序进行引物杂交：65℃5min，4℃保温，热盖105℃。
cDNA第一链合成：已进行引物杂交的RNA中加入4ul 5×第一链合成缓冲液(建库试剂盒成分：NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer(5×))，8μl链特异试剂(建库试剂盒成分：NEBNext Strand Specific Reagent)和2μl第一链合成酶混合物(建库试剂盒成分： NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix)，总体积20μl，置于PCR仪上，按照以下程序进行反应：25℃10min，42℃30min，(60℃2min，42℃2min)进行5个循环，70℃15min， 4℃保持，热盖温度不低于80℃。
3、cDNA第二链合成：在第一链合成的产物中加入8μl 10×第二链合成缓冲液(建库试剂盒成分：NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer with dUTP(10×))，4μl第二链合成酶混合物(建库试剂盒成分：NEBNext Second Strand SynthesisEnzyme Mix)和48μl无核酶水，总体积80μl，置于PCR仪上，按照以下程序进行反应：16℃60min，4℃保持，热盖温度不高于40℃，或者不盖热盖；反应结束后，加入176μl纯化磁珠(Beckman Coulter,AMPure XP磁珠，货号:A63881)进行纯化，使用53μl 0.1×TE缓冲液进行洗脱，回收50μl产物。
4、链特异性cDNA文库制备：取纯化后的cDNA产物50μl，加入7μl末端修复缓冲液(建库试剂盒成分：NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer)和3μl末端修复酶混合物(建库试剂盒成分：NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix)，总体积60μl，按照以下程序进行反应： 20℃30min，65℃30min，4℃保持；反应结束后，在末端修复产物加入适量的接头(按照每 10ng cDNA加入5umol标签接头，接头参考Illumina标准序列合成)、30μl连接缓冲液(建库试剂盒成分：NEBNext Ultra II Ligation Master Mix)，1μl增强子(建库试剂盒成分：NEBNext Ligation Enhancer)，补无核酶水至总体积93.5μl，按照以下程序进行反应：20℃90min，4℃保持，不盖热盖；反应结束后，在连接产物中加入3μl尿嘧啶特异性切除酶(NEB,USER Enzyme，货号:M5508)，按照以下程序进行反应：37℃15min，4℃保温，热盖温度不低于 45℃；反应结束后，加入87μl纯化磁珠(Beckman Coulter,AMPure XP磁珠，货号:A63881) 进行纯化，使用23μl 0.1×TE缓冲液进行洗脱，回收21μl产物。
5、文库扩增：取上步产物21ul，加入25μl扩增反应液(KAPA,2×KAPA Hifi Readymix，货号:KK2806)、4μl 25uM的标签引物(引物参考Illumina标准序列合成，每一对引物上都有不一样的index标记，不同的样品使用不同的引物进行标记)，总体积50μl。按照以下程序进行文库扩增：
反应结束后，加入40μl纯化磁珠(Beckman Coulter,AMPure XP磁珠，货号:A63881) 进行纯化，使用30μl无核酸酶水进行洗脱，回收28μl产物。
6、文库质控：文库产量＞100ng，片段在300-500bp之间且无引物二聚体(170bp)为合格。
7、杂交捕获：使用全外显子探针(Illumina,Illumina Exome Panel,货号20020183)和捕获试剂盒(Illumina,TruSeq RNA Enrichment,货号:20020490)，经过两轮的杂交反应，捕获来源于mRNA的cDNA片段。
第一次杂交反应：取200ng质控合格的链特异性的cDNA文库，加入12.5μl杂交缓冲液和1.25μl全外显子探针，补无核酸酶水至总体积25ul，按照以下程序进行反应：
第一次磁珠捕获：取62.5μl链霉亲和素磁珠(Invitrogen,DynabeadsTMM-280Streptavidin,货号:11205D)于1.5ml离心管内，然后将杂交反应液全部转移到离心管中，1200rpm摇匀5min后置于室温孵育25min。快速离心后置于磁力架上2～5min至液体澄清，弃上清。
第一次洗涤操作：在上述1.5ml离心管中加入50μl洗涤缓冲液，盖紧，1800rpm摇匀4min后置于50℃金属浴20min。快速离心后置于磁力架上2～5min至液体澄清，弃上清。使用洗涤缓冲液重复清洗1次，共2次。
第一次洗脱操作：在上述1.5ml离心管中加入10μl 0.1N氢氧化钠溶液，1800rpm摇匀2min后室温孵育2min。快速离心后置于磁力架上2～5min至液体澄清，回收上清9μl。加入1.7μl洗脱缓冲液，1200rpm摇匀1min后快速离心。
第二次杂交反应：在上述回收样品(10.7ul)中加入12.5μl杂交缓冲液，1.25μl全外显子探针和0.55μl 0.1×TE缓冲液，总体积25μl，按照以下程序进行反应：
第二次磁珠捕获：取62.5μl链霉亲和素磁珠(Invitrogen,DynabeadsTMM-280Streptavidin,货号:11205D)于1.5ml离心管内，然后将杂交反应液全部转移到离心管中，1200rpm摇匀5min后置于室温孵育25min。快速离心后置于磁力架上2～5min至液体澄清，弃上清。
第二次洗涤操作：在上述1.5ml离心管中加入50μl洗涤缓冲液，盖紧，1800rpm摇匀4min后置于50℃金属浴20min。快速离心后置于磁力架上2～5min至液体澄清，弃上清。使用洗涤缓冲液重复清洗1次，共2次。
第二次洗脱操作：在上述1.5ml离心管中加入10μl 0.1N氢氧化钠溶液，1800rpm摇匀2min后室温孵育2min。快速离心后置于磁力架上2～5min至液体澄清，回收上清9μl。加入1μl洗脱缓冲液，1200rpm摇匀1min后快速离心。
8、捕获文库纯化及扩增：取第二次杂交捕获后的产物10ul，加入18ul纯化磁珠(Beckman Coulter,AMPure XP磁珠，货号:A63881)进行纯化，使用23μl 0.1×TE缓冲液进行洗脱，回收21μl产物。然后加入25μl扩增反应液(KAPA,2×KAPA Hifi Ready mix,货号:KK2806)、4μl引物(引物参考Illumina标准序列合成)，总体积50μl。按照以下程序进行文库扩增：
反应结束后，加入50μl纯化磁珠(Beckman Coulter,AMPure XP磁珠，货号:A63881) 进行纯化，使用30μl 0.1×TE缓冲液进行洗脱，回收28μl产物。
9、文库质控：浓度＞3ng/μl，片段在300-500bp之间为合格。
10、上机测序：使用Illumina高通量测序平台进行文库测序，测序读长为2×150bp。
11、数据质控：Q30＞80％，mapped ratio>60％，Exonic Rate＞60％，rRNA rate<5％。
12、数据分析：使用厦门艾德生物信息分析系统进行分析。
13、结果分析
样本总RNA质控结果如下图1所示，本实施例中，包埋后FFPE组织(图1A)中提取的总RNA存在较严重降解，包埋前新鲜组织(图1B)中提取的总RNA则较为完整。能够说明本发明的mRNA检测方法适用高度降解RNA样本。
本实施例中，使用标准的RNA-Seq方法(基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术)对1ug包埋前新鲜组织中提取的总RNA进行建库。使用本发明的RNA检测方法，对20ng包埋后 FFPE组织中提取的总RNA进行建库。两者检测性能比较的一致性能够体现本发明的mRNA 检测方法适用极低起始量且高度降解的RNA样本。
两者检测性能比较结果如图2和表1，其中PolyA(Fresh Frozen)代表使用标准的RNA-Seq 方法(基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术)对1ug包埋前新鲜组织中提取的总RNA进行建库所得到的数据，AmoyDx REMAP(FFPE)代表使用本发明的RNA检测方法，对20ng 包埋后FFPE组织中提取的总RNA进行建库所得到的数据。
结果显示，
使用本发明的RNA检测方法，对20ng高度降解RNA样本检出的总基因数与标准的RNA-Seq方法(基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术)对1ug新鲜组织中提取的完整性较好RNA样本检出的总基因数无显著差异(图2A)。
使用本发明的RNA检测方法，对20ng高度降解RNA样本检出的rRNA比例与标准的RNA-Seq方法(基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术)对1ug新鲜组织中提取的完整性较好RNA样本检出的rRNA比例无显著差异(图2B)，能够有效去除rRNA比例。
使用本发明的RNA检测方法，对20ng高度降解RNA样本检出的基因表达水平与标准的 RNA-Seq方法(基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术)对1ug新鲜组织中提取的完整性较好RNA样本检出的基因表达水平无显著差异(表1)，spearman相关系数都在0.85以上。
本实施例的分析结果说明在应用于极低起始量高度降解RNA样本时，本发明的RNA检测方法与标准的RNA-Seq方法(基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术)相比具有相同的检测性能。
实施例2
为了说明本发明的mRNA检测方法可用于极低起始量FFPE RNA样本的检测。从1例FFPE组织中提取总RNA，并进行质控，质控结果见图3。使用本发明的RNA检测方法，分别对10ng和20ng FFPE RNA进行建库，重复3次。对测序获得的数据进行分析比较。以体现本发明的mRNA检测方法适用极低起始量FFPE RNA样本检测的这一优点。
从提取样本总RNA并质控到数据分析的操作参照实施例1。
结果分析如下，
使用本发明的RNA检测方法，对10ng FFPE RNA样本检出的总基因数与20ng FFPERNA 样本检出的总基因数无显著差异(图4A)。
使用本发明的RNA检测方法，对10ng FFPE RNA样本检出的rRNA比例与20ng FFPERNA样本检出的rRNA比例无显著差异(图4B)，同样能够有效去除rRNA。
使用本发明的RNA检测方法，对10ng FFPE RNA样本检出数据中外显子区域的比例与 20ng FFPE RNA样本检出数据中外显子区域的比例无显著差异(图4C)，能够有效检测外显子区域数据。
使用本发明的RNA检测方法，对10ng FFPE RNA样本进行检测，重复之间检出的基因表达数据具有很好的一致性，spearman相关系数均大于0.94(表2)。对20ng FFPE RNA样本进行检测，重复之间检出的基因表达数据具有很好的一致性，spearman相关系数均大于0.97 (图4D，表2)。
使用本发明的RNA检测方法，对10ng FFPE RNA样本检出的基因表达数据与20ngFFPE RNA样本检出的基因表达数据具有很好的一致性，spearman相关系数均大于0.95(图4E，表2)。
实施例结果说明本发明的RNA检测方法可用于低至10ng起始量FFPE RNA样本的有效检测。
表1本发明流程与基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术相关性分析(检测基因表达相关性)
表2本发明流程对高度降解FFPE RNA样本不同低起始量的检测分析及重复性分析。(检测基因表达相关性)
Claims (11)
1.一种基于高通量测序的mRNA检测方法，包括如下步骤：
1)提取样本总RNA并质控：RNA总量不低于10ng，浓度不低于2ng/ul，RNA的260/280吸光值在1.8-2.0之间，RIN值不低于1，DV200不低于20％；
2)根据总RNA质控情况进行总RNA打断和/或引物杂交：其中，DV200大于等于30％的RNA样品，需要先打断，再进行引物杂交，对于DV200小于30％的RNA样品，不需要打断，直接进行引物杂交；所述的引物为随机引物，其长度范围为5-10bp；
3)合成第一链cDNA：在逆转录酶的作用下，以总RNA为模板，合成cDNA第一链；
4)合成第二链cDNA：在DNA聚合酶的作用下，以第一链cDNA为模板，合成含有dUTP的cDNA第二链；
5)构建链特异性cDNA文库：取纯化后的cDNA产物，加入末端修复缓冲液和末端修复酶混合物进行末端修复反应；反应完成后加入接头、连接缓冲液、增强子及无核酶水进行连接反应；反应完成后加入尿嘧啶特异性切除酶切除含有U碱基的cDNA第二链；产物纯化后，加入标签引物进行文库扩增反应，经纯化后得到链特异性的cDNA文库，对文库进行定量和质控，文库总量不低于200ng；
6)第一次杂交和捕获；取固定质量的链特异性的cDNA文库，加入杂交缓冲液和全外显子探针进行第一次杂交和捕获；
7)第二次杂交和捕获；在第一次杂交和捕获的回收产物中加入杂交缓冲液和全外显子探针进行第二次杂交和捕获；
8)捕获后文库扩增及纯化；在第二次杂交和捕获的回收产物中加入扩增引物和扩增酶进行文库扩增，纯化回收产物；
9)高通量测序：对扩增后的文库定量和质控后进行高通量测序。
2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤1)中所述样本为RNA降解较为严重的样本，包括福尔马林固定石蜡包埋FFPE的样本；并且需要对RNA进行质控，得到DV200质控值。
3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤2)中，根据DV200质控值分别进行样本处理，对于DV200大于等于30％的RNA样品，取RNA样本5ul，加入4ul 5×第一链合成缓冲液，1ul随机引物，总体积10ul，置于PCR仪上，按照以下程序进行打断和引物杂交反应：94℃ 8min，4℃保持，热盖温度105℃；对于DV200小于30％的RNA样品，取RNA样本5ul，加入1ul随机引物，总体积6ul，置于PCR仪上，按照以下程序进行引物杂交反应：65℃ 5min，4℃保持，热盖温度105℃。
4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤3)中，根据DV200质控值分别进行样本处理，对于DV200大于等于30％的RNA样品，取打断和引物杂交反应后的产物10ul，加入8μl链特异试剂和2μl第一链合成酶混合物，总体积20μl，置于PCR仪上，按照以下程序进行反应：25℃ 10min，42℃ 30min，(60℃ 2min，42℃ 2min)进行5个循环，70℃ 15min，4℃保持，热盖温度不低于80℃；对于DV200小于30％的RNA样品，取引物杂交反应后的产物6ul，加入4ul 5×第一链合成缓冲液，8μl链特异试剂和2μl第一链合成酶混合物，总体积20μl，置于PCR仪上，按照以下程序进行反应：25℃ 10min，42℃30min，(60℃ 2min，42℃ 2min)进行5个循环，70℃ 15min，4℃保持，热盖温度不低于80℃。
5.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤4)中，合成cDNA第二链时，在第一链合成的产物中加入8μl 10×第二链合成缓冲液，4μl第二链合成酶混合物和48μl无核酶水，总体积80μl；置于PCR仪上，按照以下程序进行反应：16℃60min，4℃保持，热盖温度不高于40℃，或者不盖热盖；反应结束后，加入176μl纯化磁珠进行纯化，使用53μl 0.1×TE缓冲液进行洗脱，回收50μl产物。
6.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤5)中，构建链特异性的cDNA文库步骤如下：取纯化后的cDNA产物50μl，加入7μl末端修复缓冲液和3μl末端修复酶混合物，总体积60μl，按照以下程序进行反应：20℃ 30min，65℃30min，4℃保持；反应结束后，在末端修复产物加入适量的接头(按照每10ng cDNA加入5umol标签接头)、30μl连接缓冲液，1μl增强子，补无核酶水至总体积93.5μl，按照以下程序进行反应：20℃ 90min，4℃保持，不盖热盖；反应结束后，在连接产物中加入3μl尿嘧啶特异性切除酶，按照以下程序进行反应：37℃ 15min，4℃保温，热盖温度不低于45℃；反应结束后，加入87μl纯化磁珠进行纯化，使用23μl 0.1×TE缓冲液进行洗脱，回收21μl产物；然后加入25μl扩增反应液、4μl 25uM的标签引物，总体积50μl。按照以下程序进行文库扩增：98℃ 45s，(98℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s)15个循环，72℃ 1min，4℃保持；反应结束后，加入40μl纯化磁珠进行纯化，使用30μl无核酸酶水进行洗脱，回收28μl产物。
7.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤5)中，所述的标签引物是指带独特index标记的引物，每一对引物上都有不一样的index标记，在文库扩增时，不同的样品使用不同的标签引物进行标记。
8.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤6)中，所述的固定质量为200ng。
9.根据权利要求8所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤6)中，第一次杂交和捕获的具体方法为：取200ng链特异性的cDNA文库，加入12.5μl杂交缓冲液和1.25μl全外显子探针，补无核酸酶水至总体积25ul，按照以下程序进行文库扩增：95℃10min，然后从94℃ 1min开始，经18个循环(每个循环温度降2℃，直至降至60℃，每个循环时间均为1min)，58℃ 90min；反应结束，使用链霉亲和素磁珠捕获杂交产物。
10.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤6)中，第一次杂交和捕获使用的探针是全外显子探针；步骤7)中，第二次杂交和捕获使用的探针是全外显子探针。
11.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤9)中，所述的高通量测序，采用包括Illumina高通量测序平台在内的测序平台。
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