CN109295050A - 血液微量cfDNA文库的双端标签特异性接头、试剂盒和建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种血液微量cfDNA文库的双端标签特异性接头、试剂盒和建库方法;其中,所述的双端标签特异性接头序列如SEQ ID NO.1~5所示。所述的引物组序列如SEQ ID NO.6~9所示。还包括一种基于随机序列构建cfDNA双端标签特异性基因组文库的构建方法,所述的建库方法操作简便,在初步PCR中无需换管与纯化,避免了建库过程中cfDNA的耗损,大大提高了文库的连接效率;简化了实验步骤,同时于接头序列中加入酶切位点及生物素标记位点,使得接头有效率大大提高,从而增强了建库的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学中生物技术领域。更具体涉及血液微量cfDNA双端标签特异性接头、试剂盒和基因组文库的制备方法,它适用于血液微量cfDNA 中超低频突变的检测。
背景技术
二代测序技术是目前高通量测序的研究中最常用的技术,在一代Sanger测序一次只能测一条DNA的基础上,二代测序实现了高通量测序,深度测序及重测序。cfDNA(cellfree DNA),即血液中循环的DNA,是身体的细胞、白血球和肿瘤细胞死亡后释放到血液中的片段DNA;对cfDNA高通量测序技术是液体活检的一种,它只需几毫升的静脉血液,即可对全身的cfDNA基因信息进行精确测定。基于得到的信息,可对许多疾病进行早诊断早治疗,尤其对于早期无法通过医学方法发现的肿瘤的诊断及治疗,具有重要的意义。这对于肿瘤早筛、用药和预后都具有重要意义。
但实现由cfDNA对肿瘤实现精准检测,尤其cfDNA中肿瘤超低频突变的检测,存在巨大的困难。首先血液中cfDNA含量极低,而且高度片段化,长度只有170bp作用,提取较为困难;同时由肿瘤细胞分泌的DNA片段只占cfDNA 的百分之一,因此检测cfDNA中关于肿瘤基因突变极为困难。而我们在建库与测序过程中,因为PCR扩增会产生一系列突变,因此使得精确检测到肿瘤基因突变的可能变得微乎其微。当前市面上出现了许多可用微量DNA建库的试剂盒,但需在连接接头前先进行DNA的扩增,无法确定原始突变;后续出现采用茎环结构的接头建库,虽可鉴定测序中出现的假阳性结果,但无法精确分析建库中 PCR时可能出现的碱基突变。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处,提供了一种血液微量cfDNA 文库的双端标签特异性接头、引物组和构建此种文库的方法。此构建cfDNA文库的方法cfDNA末端补平与加A尾一步完成,同时在连接和初步PCR时无需更换离心管,无需纯化,简化了建库的过程,减少了建库的时间,大大降低了在操作过程中cfDNA的丢失,同时合成接头时,在接头引物内加入了限制性核酸内切酶位点及生物素标记,大大提高了接头的有效合成率,提高了cfDNA的连接效率。
首先,本发明涉及的血液微量cfDNA文库的双端标签特异性Y型接头,所述接头序列由四种单链带有包含6、7、8、9个随机序列的引物DA2和一种互补单链引物DA1合成,DA2引物的5’端经磷酸化修饰;双端标签特异性接头 DA包括DA1、DA2-1、DA2-2、DA2-3、DA2-4;其序列如SEQ ID NO.1~5所示,为提高有效接头合成效率,在订购接头引物时,于接头引物中设置限制性核酸内切酶位点及生物素标记位点,接头引物纯化方式采用HPLC。
本发明另一方面涉及一种血液微量cfDNA文库的双端标签特异性接头的引物组Inner Primer包括Inner A、Inner B,其序列如SEQ ID NO.6-7所示。
本发明另一方面涉及一种基于随机序列构建cfDNA双端标签特异性基因组文库的试剂盒,其包括序列如SEQ ID NO.1~5所示的血液微量cfDNA文库的双端标签特异性接头。
进一步优选的情况下,所述的试剂盒,其还包括如SEQ ID NO.6~7所示的引物组和/或如SEQ ID NO.8~9所示的测序引物组,BC*是代表此引物中含有6 个特定碱基,见SEQID NO.9中6个碱基X,称为index,即在多个样本共同在测序仪上测序时,可依据每个样本中特定的index进行拆分,*为数字编号,每个编号对应一种特定碱基。
测序引物组如下:
本发明另一方面涉及一种血液微量cfDNA文库的双端标签特异性接头的使用方法,其包括下述步骤:如SEQ ID NO.1所述的DA1引物序列分别与如SEQ ID NO.2~5所示的四种DA2引物序列形成引物组;每组引物分别进行互补结合,条件为:95℃,5min;每分钟温度降低1℃至16℃;补平,获得平末端cfDNA。优选的情况下,所述PCR使用的DA1引物与DA2引物浓度为100μM;各取4.5μL 等量混匀,加入1μL 10×引物结合缓冲液,后在PCR仪器上进行引物的互补结合。其中,所述的10×结合缓冲液为100mM Tris-HCl,pH 7.5;10mM EDTA; 1MNaCl。
进一步优选的情况下,所述补平的步骤包括:用Klenow exo-(克烈诺片段,Klenow Fragment,3’-5’exo-;以下用Klenow exo-代替。)对上述经过PCR进行互补结合所得的结合引物进行末端补平,条件为37℃,1小时;4℃暂存;沉淀补平的片段;随后用限制性核酸内切酶HpyCH4III(5U/μL)处理补平片段16-18 小时;随后,用链霉亲和素磁珠进行筛选。优选的情况下,使用酒精沉淀法对补平片段进行沉淀,用无核酸水溶解。
进一步优选的情况下,所述用链霉亲和素磁珠进行筛选的步骤包括:
(a)取50μL DynabeadsTMMyOneTMStreptavidin C1磁珠充分振荡混匀,放置磁力架上3min,弃上清。
(b)用200μL 1×binding&washing buffer清洗磁珠三次。
(c)用200μL 1×binding&washing buffer吹匀磁珠,加入带有biotin-dT的核酸混匀,室温下轻柔旋转结合15min(<20bp 10min;1kb 15min)。
(d)在磁力架上放置3min,上清保留。
(e)用200μL 1×binding&washing buffer清洗磁珠3次。
(f)用100μL ddH2O洗脱磁珠,在磁力架上放置3min,上清保留。
(g)之后用100μL ddH2O吹匀磁珠,75℃5min,在磁力架上放置3min,上清保留。
(h)用酒精沉淀法,沉淀出接头,稀释为浓度200ng/μL。
其中,连接的步骤中cfDNA起始量与接头工作液的比例为10-30ng:0.5-1μL;具体优选的情况下,当补平的步骤中DNA起始量小于10ng,接头工作液可加 0.5μL;当起始量DNA为10-30ng,接头工作液可加1μL。
本发明另一方面涉及一种基于双端标签特异性的微量cfDNA基因组文库制备方法,其特征在于:包括如下步骤,所有步骤在一管内完成,无需更换离心管与纯化:
(1)一步完成cfDNA末端补平及加A尾,得到3’端带A尾修饰的产物;
(2)将步骤(1)得到的3’端带A尾修饰的产物与带T尾的接头连接,得到连接产物;
(3)用内引物对步骤(2)得到的连接产物进行初步扩增,得到初级cfDNA 文库;纯化;其中,优选的纯化方法是磁珠纯化方法,除去接头及剩余引物;
(4)用序列如SEQ ID NO.8~9所示的测序引物扩增步骤(3)得到的初级 cfDNA文库并用磁珠进行筛选,得到cfDNA测序文库。
进一步优选的情况下,上述步骤(1)中在cfDNA末端补平及加A尾中,所用酶为TaqDNA聚合酶(Taq DNApolymerase)和T4DNA聚合酶(T4DNA polymerase),缓冲液为5×末端修复缓冲液。其中,所述的5×末端修复缓冲液成分为:250mMNaCl,50nM MgCl2,250mM Tris-HCl,50mM DTT,5mM ATP, 5mM dNTP,pH 7.5。
进一步优选的情况下,本发明接头序列经限制性核酸内切酶HpyCH4III处理出T尾后,用带有链霉亲和素的磁珠除去小片段及未能有效处理的接头,以便于和连有A尾的cfDNA片段结合。在cfDNA与接头连接时,所用酶为T4DNA ligase,所用缓冲液为连接反应缓冲液(ligation buffer);其中,所述的ligation buffer 的成分为15nM MgCl2,70mMTris-HCl,15mM DTT,1.5mM ATP,40%(W/V) 的PEG-8000,pH7.5。
本发明由于特异的缓冲液环境,cfDNA建库的步骤在一管内完成,无需换管与纯化,简化了实验步骤,节省了时间,降低了建库过程中的cfDNA损耗。
进一步优选的情况下,本发明在上述步骤(3)文库的初步扩增中,采用两步法反应条件,PCR扩增为14-18个循环,其反应条件为:
进一步优选的情况下,本发明在上述步骤(4)在添加测序引物时的二次PCR 扩增为4-6个循环,其反应条件为:
采用上述技术方案后,与当前技术相比,本发明具有以下有益的效果:
1.操作简单;本发明在末端补平、添加A尾、接头连接、初步PCR在一管内完成,无需复杂换管,无需纯化,减少材料耗损及时间,上手较简单。
2.性价比高;本发明采用NEB公司的常规试剂进行建库,这种自建文库的流程,使得每次建库成本极大的降低。
3.精确分辨突变:此方法在微量DNA的建库中采用先接头连接再扩增的方式,且接头带有随机标签序列,可在后续分析中轻松识别由测序及PCR过程中引入的假阳性结果,精确的分析cfDNA超低频突变。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明:
图1:本发明的cfDNA文库建库流程示意图。A为实验流程及时间图,B为文库序列信息,两侧信息相对应。箭头代表实验流程的方向。N代表碱基A、T、C、G,“……”代表省略的碱基。a代表内引物inner A和b代表内引物innerB, A和B代表测序引物MUP及BC*,圆圈代表磷酸化修饰位点,引物DA1和DA2 经过后续处理形成的Y型接头。
图2:A为实施例中cfDNA文库的安捷伦2100核酸分析仪片段质量检测结果。纵轴(Fluorescence)表示峰值的大小,横轴Size(bp)表示片段大小范围,两侧峰LM与UM为参照峰,中间峰处于370bp为样本片段检测峰。B图为文库电泳图,左右两侧条带为指示条带,中间两条条带为构建好的文库。
图3:是实施例中illumina X10测序仪下机数据质量FastQC评估结果。上侧图纵值代表Q值大小,横轴代表数据长度。Q20为临界点,为代表单个碱基测序质量正确率99%。下侧图纵轴代表每个碱基所占百分比,横轴代表数据长度,每种碱基所占频率为25%。
图4:是实施例中接头及内引物的序列信息。
具体实施方式
为了对本发明的具体实施步骤做进一步的详细阐述,将通过以下两个实施例来说明:
这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围,任何对本流程采用相似的策略而仅仅对内容进行部分修改也在本专利的保护范围。
实施例1
本发明提供了一种cfDNA建库试剂盒产品,在试剂盒中包括有:
用于连接cfDNA的双端标签特异性接头DA1及DA2,所述接头DA2的单链引物有5’磷酸化、生物素标记及限制性内切酶位点;
用于初步扩增的内引物inner A和inner B与添加测序接头的引物BC*与 MUP;
用于cfDNA末端修复的5×末端修复缓冲液;
用于cfDNA与接头连接的ligation buffer。
其中所述双端标签特异性接头由如下方法制得:
(1)将DA1引物分别与一种DA2引物各4.5μL等量混合,加入1μL 10×引物结合缓冲液,反应条件为95℃,5min,然后以1℃/min的降温速度至16℃,得到互补部分结合的初步连接接头。反应体系如下:
引物RA1 4.5μL
引物RA2 4.5μL
10×引物结合缓冲液 1μL
所述10×引物结合缓冲液的成分包括如下试剂:
Tris-HCl pH 7.5 100mM
NaCl 1M
EDTA 10mM
(2)将4管试剂分别用Klenow exo-进行末端补平。其反应体系如下:
(3)对末端补平的接头用酒精沉淀法纯化。其操作步骤如下:
A.将末端补平的接头转移至1.5ml离心管,加入2.5倍体积(50μL)的无核酸水,颠倒混匀,于4℃离心,30min。
B.弃上清,加入500μL无水乙醇,轻轻震荡,将沉淀震起(不要震碎),于4℃离心,15min。
C.弃上清,将离心管竖直放于室温下晾干。
D.加入15μL无核酸水,混匀。
(4)将4管末端补平的接头混匀,用限制性核酸内切酶处理末端补平的接头。反应体系如下:
(5)将限制性核酸内切酶处理好的接头,用链霉亲和素处理,除去未切出 T尾的接头及切断的段片段,处理步骤如下:
(a)取50μL DynabeadsTMMyOneTMStreptavidin C1磁珠充分振荡混匀,放置磁力架上3min,弃上清。
(b)用200μL 1×binding&washing buffer清洗磁珠三次。
(c)用200μL 1×binding&washing buffer吹匀磁珠,加入带有biotin-dT的核酸混匀,室温下轻柔旋转结合15min(<20bp 10min;1kb 15min)。
(d)在磁力架上放置3min,上清保留。
(e)用200μL 1×binding&washing buffer清洗磁珠3次。
(f)用100μL ddH2O洗脱磁珠,在磁力架上放置3min,上清保留。
(g)之后用100μL ddH2O吹匀磁珠,75℃5min,在磁力架上放置3min,上清保留。
(h)用酒精沉淀法,沉淀出接头。
(6)将重悬的接头引物稀释成终浓度为200ng/μL,每管20μL分装,于-20℃保存。
实施例2
关于宫颈癌血液微量cfDNA双端标签特异性文库制备方法,包括如下步骤:
(1)对cfDNA进行末端修复,获得末端加A尾的cfDNA,步骤如下:
(a)根据QIAGEN公司提供的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)试剂盒的使用说明书,使用此试剂盒对血浆中的游离的cfDNA进行提取;
(b)向PCR管中加入如下成分(5×End-repair buffer成分为250mM NaCl, 50nMMgCl2,0.5mM dNTP,250mM Tris-HCl,50mM DTT,5mM ATP, pH7.5;End-repair enzyme成分为T4DNApolymerase与Taq DNA polymerase混合所得。):
使用PCR仪,37℃反应30min,注意不要热盖,于4℃保存。
(2)取出末端加A尾的cfDNA离心管,与已合成的带有随机序列标签的接头混合均匀,进行连接反应,ligation buffer成分如下(15nM MgCl2,70mM Tris-HCl,15mM DTT,1.5mM ATP,40%(W/V)的PEG-8000,pH7.5):
放于PCR仪上,23℃反应30min,注意不要热盖,于4℃保存。
(3)将连接好接头的cfDNA进行初步PCR反应,其反应体系如下:
接头连接的cfDNA 20μL
inner primer(a与b混合液) 2μL
NEB 2×Master Mix 22μL
使用PCR仪,反应条件为:
(4)将PCR产物取出,快速离心5秒,进行磁珠纯化。其步骤为:
(a)将AMPure XP beads提前30分钟从2-8℃中取出,静置使其温度平衡至室温。
(b)颠倒或涡旋振荡使AMPure XP beads充分混匀,吸取35.2μL(0.8×) 加到初步PCR扩增产物中,用移液枪吹打10次以上彻底混匀。
(c)室温孵育5min,此时PCR管要远离磁力架。
(d)将PCR管放于磁力架上静置5min,等到溶液澄清后,保持样品始终处于磁力架上,小心移除上清。
(e)保持样本位于磁力架上,加入200μL新鲜配置的80%乙醇对磁珠进行漂洗(注意不要破坏磁珠),室温孵育30s,移除上清。
(f)重复步骤(e)。
(g)保持样本于磁力架中,开盖空气干燥5min。
(h)将样本从磁力架上取出,加入16.5μL无核酸水,用移液枪吹匀,室温静置2min。
(i)放于磁力架静置5min,待溶液澄清后,小心吸取15μL上清至一个新的PCR管内。
(5)将磁珠纯化好的DNA进行二次PCR扩增,添加测序引物。其反应体系如下:
使用PCR仪,其反应条件为
(6)将PCR产物取出,快速离心5秒,进行磁珠筛选。其步骤为:
(a)将AMPure XP beads提前30分钟从2-8℃中取出,静置使其温度平衡至室温。
(b)将PCR反应产物体积补足到100μL。
(c)颠倒或涡旋振荡使AMPure XP beads充分混匀,吸取51μL加到PCR 扩增产物中,用移液枪吹打10次以上彻底混匀。
(d)室温孵育5min,此时PCR管要远离磁力架。
(e)将PCR管放于磁力架上静置5min,等到溶液澄清后,保持样品始终处于磁力架上,小心把上清吸入新PCR管中。
(f)于上清中加入24μL AMPure XP beads,用移液枪吹打10次以上彻底混匀。
(g)室温孵育5min,此时PCR管要远离磁力架。
(h)将PCR管放于磁力架上静置5min,等到溶液澄清后,保持样品始终处于磁力架上,小心移除上清。
(i)保持样本位于磁力架上,加入200μL新鲜配置的80%乙醇对磁珠进行漂洗(注意不要破坏磁珠),室温孵育30s,移除上清。
(j)重复步骤(i)。
(k)保持样本于磁力架中,开盖空气干燥5min。
(l)将样本从磁力架上取出,加入16.5μL无核酸水,用移液枪吹匀,室温静置2min。
(m)放于磁力架静置5min,待溶液澄清后,小心吸取15μL上清至一个新的PCR管内。
(6)用Qubit3.0对文库进行浓度检测。随后对其进行质检和上机测序或进行捕获。
本发明文库制备结果表明此方法能够成功制备血浆微量cfDNA标签特异性的基因组文库,并进行后续的测序或者目标序列的捕获。此方法在初步PCR之前无需换管,无需纯化,大大降低了cfDNA的损耗;且此法实验过程简单(如图1所示),时间较短,可在3小时以内完成一次完整的文库构建。
以上所述,仅是本发明的优选实施方式,并非对本发明的技术范围作出任何的限制,故对于本技术领域的普通技术人员来说,可依据本发明的技术实施作出改进,但这些改进也应视为本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 血液微量cfDNA文库的双端标签特异性接头、试剂盒和建库方法
<120> 刘强
<130> 2015
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> DA1引物
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> DA2-1引物
<400> 2
tcttctacag tcannnnnna gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 53
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> DA2-2引物
<400> 3
tcttctacag tcannnnnnn agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcac 54
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> DA2-3引物
<400> 4
tcttctacag tcannnnnnn nagatcggaa gagcacacgt ctgaactcca gtcac 55
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> DA2-4引物
<400> 5
tcttctacag tcannnnnnn nnagatcgga agagcacacg tctgaactcc agtcac 56
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 内引物序列inner A
<400> 6
acactctttc cctacacgac gc 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 内引物序列inner B
<400> 7
agacgtgtgc tcttccgatc t 21
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> MUP序列
<400> 8
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 9
<211> 64
<212> DNA
<213> BC序列
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agatxxxxxx gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 64
Claims (10)
1.一种血液微量cfDNA文库的双端标签特异性接头,其特征在于:所述双端标签特异性接头序列如SEQ ID NO.1~5所示。
2.如权利要求1所述的血液微量cfDNA文库的双端标签特异性接头的引物组,其特征在于:序列如SEQ ID NO.6~7所示。
3.一种基于随机序列构建cfDNA双端标签特异性基因组文库的试剂盒,其特征在于:包括如权利要求1所述的血液微量cfDNA文库的双端标签特异性接头。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于:还包括如权利要求2所述的引物组和/或如SEQ ID NO.8~9所示的测序引物组。
5.一种血液微量cfDNA文库的双端标签特异性接头的使用方法,其特征在于:包括下述步骤:如SEQ ID NO.1所述的DA1引物序列分别与如SEQ ID NO.2~5所示的四种DA2引物序列形成引物组;每组引物分别进行互补结合,条件为:95℃,5min;每分钟温度降低1℃至16℃;补平。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述补平的步骤包括:用克烈诺片段对权利要求5所述方法制得的结合引物进行末端补平,条件为37℃,1小时;4℃暂存;沉淀补平的片段;随后用限制性核酸内切酶HpyCH4III处理补平片段;再用链霉亲和素磁珠进行筛选。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述引物浓度为100μM、每组引物各取4.5μL等量混匀,加入1μL 10×引物结合缓冲液;所述10×引物结合缓冲液的终浓度为100mMTris-HCl,pH 7.5,10mM EDTA,1M NaCl。
8.基于双端标签特异性的微量cfDNA基因组文库制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)一步完成cfDNA末端补平及加A尾,得到3’端带A尾修饰的产物;
(2)将步骤(1)得到的3’端带A尾修饰的产物与带T尾的接头连接,得到连接产物;
(3)用内引物对步骤(2)得到的连接产物进行初步扩增,得到初级cfDNA文库;纯化;其中,优选的纯化方法是磁珠纯化方法,除去接头及剩余引物;
(4)用SEQ ID NO.8~9所示的测序引物扩增步骤(3)得到的初级cfDNA文库并纯化,得到cfDNA测序文库。
9.根据权利要求8所述的基于双端标签特异性的微量cfDNA基因组文库制备方法,其特征在于:所述步骤(3)的初步PCR扩增的反应条件为:
10.根据权利要求8所述的基于双端标签特异性的微量cfDNA基因组文库制备方法,其特征在于:所述步骤(4)的PCR扩增的反应条件为:
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