CN113699214A - 基于基因捕获技术的测序方法 - Google Patents

基于基因捕获技术的测序方法 Download PDF

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CN113699214A CN202111251613.9A CN202111251613A CN113699214A CN 113699214 A CN113699214 A CN 113699214A CN 202111251613 A CN202111251613 A CN 202111251613A CN 113699214 A CN113699214 A CN 113699214A
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Abstract

本发明提供了一种基于基因捕获技术的测序方法,原理是使用重组酶复合物在37℃条件下协助3’端封闭的单链DNA探针高效特异性地杂交到双链目标DNA分子中,再利用单链DNA探针上带有的亲和标记对靶DNA进行特异性富集。这种方法既具有探针杂交捕获技术的长探针配对较强和探针设计要求低等优势,又具有CRISPR/dCas9系统操作简单、耗时短、DNA无需热变性、捕获效率高和成本低等优点,且探针不参与后续的扩增,提高鉴定准确性。因此相较于其他捕获技术,RATE‑seq具有操作简单、捕获效率高、耗时极短(30 min)、稳定性好和成本低等明显优势,非常适用于基因捕获和自动化应用。除此之外,RATE‑seq还能有效分离去除病理样本中的人类宿主DNA,提高病原微生物的检出率。

Description

基于基因捕获技术的测序方法
技术领域
本发明专利涉及一种基于基因捕获技术的测序方法,属于生物技术领域。
背景技术
二代和三代测序技术因具有通量大、信息全、操作简便等优势,成为基因诊断和治疗领域的核心技术。基因捕获一直是DNA和RNA高通量测序技术的一大难题。由于人的基因组信息庞大,大约包含30亿个碱基对,而真正编码基因的区域占比不到4%,外显子区域及转录调控元件区域占比低于1%。而致病突变绝大多数富集在外显子区域及转录调控元件区域上,因此这些区域的基因信息对疾病的诊断和治疗具有关键的作用。由于这些区域占比太少,利用全基因组测序技术进行序列信息验证和突变类型分析具有极低的效率和准确率。通常对于一个位点信息的判断需要成百乃至上万的测序覆盖深度,这意味着利用全基因测序进行基因信息的有效分析往往需要超过数百G的测序数据,这极大的增加了二代测序和三代测序在基因诊断上的成本和普及难度,也造成了大量的不必要浪费。因此,开发一种捕获靶位点基因序列的技术,是二代和三代测序技术在基因治疗领域普及和应用的关键。
目前已有的基因捕获技术主要分为两类。一类是探针杂交捕获技术,利用带修饰(如生物素)的长探针(40-120 nt)对基因组DNA进行杂交,并使用相应的亲和介质(如链霉亲和素磁珠)进行捕获。这种方法极其复杂,需要先将双链DNA进行预变性,再将变性成单链的DNA与探针进行杂交,杂交后的溶液进行真空干燥浓缩后,才能进行靶位点捕获。这种方法的优势是探针与靶DNA配对区域较长,结合能力强,且探针设计要求低。但也有明显的缺陷,如操作复杂、耗时长(约两天)、成本高、对仪器依赖性强、捕获效率较低、非特异性高、DNA损失大,极大地限制了捕获技术的应用。
近年来,随着基因编辑技术CRISPR/Cas系统的发展,各类Cas蛋白被开发出来应用于不同的领域。一种切割活性完全失活的dCas9成为体外基因捕获的重要工具。这种方法结合了CRISPR/Cas9基因编辑系统的高特异性,也利用了dCas9带有的解旋酶活性,因此可以在室温下利用带有特殊修饰的dCas9和sgRNA对靶位点进行捕获。这种捕获方法相较于传统的探针杂交捕获技术,具有成本低、耗时短(2h)、捕获效率高、操作简单、DNA无需热变性等优点,但是dCas9自身与DNA的非特异性结合和sgRNA的脱靶效应严重阻碍了捕获效率和特异性。此外,sgRNA的设计难度较大(依赖于PAM序列),与靶位点的配对长度较短(20 nt),严重阻碍了其在大规模基因捕获上的应用。且sgRNA和dCas9的稳定性较差也使得这种捕获方式难以大范围推广和普及。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于基因捕获技术的测序方法。
本发明采取的技术方案为:一种基于基因捕获技术的测序方法,其特征在于其步骤包括:
(1)获取样本的总DNA文库;
(2)针对待捕获的靶基因,设计并合成探针,所述探针与靶基因DNA严格互补配对,且设有便于与捕获介质结合的修饰,所述探针3’ 端采用双脱氧核糖核苷酸、生物素或者氨基修饰以封闭探针的3’ 端;
(3)探针与重组酶复合物预结合;
(4)探针-重组酶复合物与样本的总DNA文库结合;
(5)利用可与探针特异性结合的捕获介质,将与探针结合的靶基因DNA文库从总DNA文库中分离出来,获得富集的靶基因;
(6)扩增获得的靶基因,测序。
需要声明的是,基于本领域技术人员的认知完全可以意识到,步骤(1)与步骤(2)、(3)之间并无操作顺序的先后要求,在步骤前标注(1)、(2)、(3)只是为了描述的方便,实际上,先进行步骤(2)、(3),再进行步骤(1)的方式,与进行步骤(1)、(2)、(3)的方式是等效的方式。因此,本领域技术人员应当认知到,先进行步骤(2)、(3),再进行步骤(1)的方式,与进行步骤(1)、(2)、(3)的方式均在本发明的保护范围内。
优选的,所述探针的长度为30-50 nt。
优选的,所述探针5’端采用生物素修饰或多聚脱氧腺苷酸修饰。
优选的,所述重组酶复合物包括UvsX重组酶和UvsY重组酶辅助蛋白,使用浓度在20-200 nM。
优选的,所述重组酶复合物还包括gp32单链DNA结合蛋白,使用浓度在10-50 nM。
优选的,所述探针的使用浓度10-100 nM,总DNA的投入量为0.1-100 ng/uL。
优选的,步骤(2)中使用预结合缓冲液,在室温下预结合5-30min,预结合缓冲液的配比为:10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷,10-300 mM醋酸钾、3-50 mM醋酸镁、0.3-3 mM 二硫苏糖醇、1-20 mM 三磷酸腺苷。
优选的,步骤(3)中的结合温度为30-50℃。
优选的,当探针上的修饰是生物素修饰时,捕获介质使用链霉亲和素磁珠;当探针上的修饰是多聚脱氧腺苷酸修饰时,捕获介质使用多聚脱氧胸苷酸磁珠。
优选的,步骤(4)具体为:将捕获介质与反应体系在室温下孵育10-60min,分离捕获介质并清洗,然后将吸附在捕获介质上的DNA洗脱,洗脱的方式为高温98℃洗脱、1-20 mM生物素竞争洗脱或者体积浓度5%-50%变性剂去离子甲酰胺洗脱。
优选的,使用清洗缓冲液对捕获介质进行清洗,所述清洗缓冲液包含10-100 mM三羟甲基氨基甲烷、10-2000 mM氯化钠、体积浓度0.1-3%的吐温20。
本发明的有益效果为:
本发明提供了一种基于重组酶的新型基因捕获技术,并命名为RATE-seq(Recombinase-Assistant Target Enrichment and Sequencing)。RATE-seq的原理是使用重组酶复合物在37℃条件下协助单链DNA探针高效特异性地杂交到双链目标DNA分子中,再利用单链DNA探针上带有的亲和标记对靶DNA进行特异性富集。这种方法既具有探针杂交捕获技术的长探针配对较强和探针设计要求低等优势,又具有CRISPR/dCas9系统操作简单、耗时短、DNA无需热变性、捕获效率高和成本低等优点。因此相较于其他捕获技术,RATE-seq具有操作简单、捕获效率高、耗时极短(30 min)、稳定性好和成本低等明显优势,非常适用于基因捕获和自动化应用。除此之外,RATE-seq还能有效分离去除病理样本中的人类宿主DNA,提高病原微生物的检出率。
本发明使用的探针为3’端修饰封闭的探针,探针结构简单,合成成本低,且探针不参与后续靶基因的扩增,可以保证捕获序列原始的信息,提高对捕获的靶分子序列鉴定的准确性。同时,封闭的探针也可以防止其自建库,阻止探针与接头产生非特异性结合,进一步提高测序结果的准确性。
附图说明
图1 RATE基因捕获技术流程和原理示意图。
图2 两种5.8S修饰探针在RATE基因捕获技术上的应用原理图。
图3 qPCR验证两种5.8S修饰探针在RATE基因捕获技术上的效率和特异性。
图4 二代高通量测序验证两种5.8S修饰探针在RATE基因捕获技术上的效率和特异性。
图5 qPCR验证两种3’端修饰探针在RATE捕获技术上的应用效果比较。
图6 qPCR验证5.8S修饰探针长度在RATE基因捕获技术上的效率和特异性。
图7 qPCR验证重组反应温度在RATE基因捕获技术上的效率和特异性。
图8 qPCR验证重组反应时间在RATE基因捕获技术上的效率和特异性。
图9 qPCR验证洗脱方式在RATE基因捕获技术上的效率和特异性。
图10 三种基因捕获技术的特点对比。
图11 二代测序验证三种基因捕获技术对5.8S基因的捕获效率和特异性。
图12 三种基因捕获技术捕获5.8S基因测序信号图。
图13 两种三代测序验证RATE基因技术对BRCA1基因的捕获效率和特异性。
图14利用RATE技术捕获BRCA1基因的两种三代测序信号图。
图15 人类高丰度Alu序列比对结果及探针位置。
图16利用靶向Alu序列的RATE捕获技术对人类宿主DNA捕获去除效果。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。本实施例所使用的引物序列如表1所示,sgRNA库引物序列见附表。
表1 接头序列及修饰
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例1:生物素修饰探针和多聚腺苷酸修饰探针在RATE捕获技术上的应用效果比较。
在本实施例中,我们比较了生物素修饰探针和多聚腺苷酸修饰探针在RATE捕获技术上的捕获效果(原理见图1和图2),我们挑取的靶DNA位点为5.8S rRNA来源的双链DNA。具体实施方式如下:
1)RNA文库的构建:1 ug 293F RNA经翌圣生物的Hieff NGS® Ultima Dual-modeRNA Library Prep Kit for Illumina(Cat#12252)进行RNA建库后,使用RATE-seq流程进行捕获。
2)生物素修饰探针捕获
表2
组分 用量
Biotin-5.8S probe (SEQ ID NO: 6) 10-100 nM
UvsX重组酶 20-200 nM
UvsY重组酶辅助蛋白 20-200 nM
10×重组缓冲液 3 µL
总体积 20 µL
10×重组缓冲液包括100-1000 mM 三羟甲基氨基甲烷,100-3000 mM醋酸钾、30-500 mM醋酸镁、3-30 mM 二硫苏糖醇、10-200 mM 三磷酸腺苷等
室温静置 5min。
表3
组分 用量
上述反应体积 20 µL
gp32单链结合蛋白 10-50 nM
步骤(1)中构建好的文库 0.1-100 ng/uL
总体积 30 µL
35-45℃反应10 min。
反应结束后,加入10 ul 按照说明书清洗好的Dynabeads™ M-270 链霉亲和素磁珠,混匀后室温旋转孵育10 min。在磁分离架上分离磁珠和上清,磁珠使用清洗缓冲液(10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷,10-2000 mM氯化钠、0.1-3%吐温20)清洗3次后,加入20 ulddH2O,98℃ 5 min,取上清。将回收的DNA 进行定量和NGS测序分析,定量引物见表1,结果见图3和图4。
3)多聚脱氧腺苷酸修饰探针捕获
表4
组分 用量
polyA-5.8S probe 39 10-100 nM
UvsX重组酶 20-200 nM
UvsY重组酶辅助蛋白 20-200 nM
10×重组缓冲液 3 µL
总体积 20 µL
10×重组缓冲液包括100-1000 mM 三羟甲基氨基甲烷,100-3000 mM醋酸钾、30-500 mM醋酸镁、3-30 mM 二硫苏糖醇、10-200 mM 三磷酸腺苷等
室温静置 5min。
表5
组分 用量
上述反应体积 20 µL
gp32单链结合蛋白 10-50 nM
步骤(1)中构建好的文库 0.1-100 ng/uL
总体积 30 µL
30-45℃反应10 min。
反应结束后,加入10 ul 按照说明书清洗好的oligo(dT)23磁珠,混匀后室温旋转孵育10 min。在磁分离架上分离磁珠和上清,磁珠使用清洗缓冲液(10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷,10-2000 mM氯化钠、0.1-3%吐温20)清洗3次后,加入20 ul ddH2O,98℃ 5 min,取上清。将回收的DNA 进行定量和NGS测序分析,定量引物用表1,结果见图3和图4。
结果如图3和图4所示,RATE捕获技术可以有效捕获5.8S目的基因的片段,捕获效率可达到85%以上,对于非靶位点如28S和ACTB基因具有很低的捕获效率,这表明RATE技术在基因捕获上具有巨大的应用价值。其中,生物素修饰的探针在RATE捕获上具有更高的效率。
实施例2:不同3’端修饰探针在RATE捕获技术上的应用效果比较。
在本实施例中,我们比较了双脱氧核糖核苷酸修饰ddN(SEQ ID NO: 3)和氨基修饰NH2C6(SEQ ID NO: 2)两种3’端修饰探针SEQ ID NO:在RATE捕获技术上的捕获效果,选取的靶DNA位点为5.8S rRNA来源的双链DNA。具体实施方式与实施例1中的生物素修饰探针捕获流程相同。结果如图5所示,探针3’端包含ddN修饰和NH2C6修饰都具有很好的RATE捕获效率,其中ddN修饰的探针捕获效率更好。
实施例3:不同长度生物素修饰探针在RATE捕获技术上的应用效果比较。
在本实施例中,我们比较了不同长度(30-50 nt)的生物素修饰探针(SEQ ID NO:3-10)在RATE捕获技术上的捕获效果,选取的靶DNA位点为5.8S rRNA来源的双链DNA。具体实施方式如下:
1)RNA文库的构建:1 ug 293F RNA经翌圣生物的Hieff NGS® Ultima Dual-modeRNA Library Prep Kit for Illumina(Cat#12252)进行RNA建库后,使用RATE-seq流程进行捕获。
2)生物素修饰探针捕获
表6
组分 用量
Biotin-5.8S probe 30-50 10-100 nM
UvsX重组酶 20-200 nM
UvsY重组酶辅助蛋白 20-200 nM
10×重组缓冲液 3 µL
总体积 20 µL
10×重组缓冲液包括100-1000 mM 三羟甲基氨基甲烷,100-3000 mM醋酸钾、30-500 mM醋酸镁、3-30 mM 二硫苏糖醇、10-200 mM 三磷酸腺苷等
室温静置 5min。
表7
组分 用量
上述反应体积 20 µL
gp32单链结合蛋白 10-50 nM
步骤(1)中构建好的文库 0.1-100 ng/uL
总体积 30 µL
30-45℃反应10 min。
反应结束后,加入10 ul 按照说明书清洗好的Dynabeads™ M-270 链霉亲和素磁珠,混匀后室温旋转孵育10 min。在磁分离架上分离磁珠和上清,磁珠使用清洗缓冲液(10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷,10-2000 mM氯化钠、0.1-3%吐温20)清洗3次后,加入20 ulddH2O,98℃ 5 min,取上清。将回收的DNA 进行定量和NGS测序分析,定量引物用表1,结果见图6。
结果如图6所示,在36-45 nt长度的探针具有更高的捕获效率和捕获特异性。
实施例4:重组反应温度在RATE捕获技术上的应用效果比较。
在本实施例中,我们比较了不同重组反应温度(30-45℃)在RATE捕获技术上的捕获效果,具体实施方式与实施例3相同。结果如图7所示,重组反应在35-40℃时捕获效率最高。
实施例5:重组反应时间在RATE捕获技术上的应用效果比较。
在本实施例中,我们比较了不同重组反应时间(5-30 min)在RATE捕获技术上的捕获效果,具体实施方式与实施例3相同。结果如图8所示,重组反应时间为10-20 时具有更高的捕获效率和捕获特异性。
实施例6:磁珠洗脱条件在RATE捕获技术上的应用效果比较。
在本实施例中,我们比较了不同磁珠洗脱条件在RATE捕获技术上的捕获效果。具体实施方式如下:
1)RNA文库的构建:1 ug 293F RNA经翌圣生物的Hieff NGS® Ultima Dual-modeRNA Library Prep Kit for Illumina(Cat#12252)进行RNA建库后,使用RATE-seq流程进行捕获。
2)生物素修饰探针捕获
表8
组分 用量
Biotin-5.8S probe 45 10-100 nM
UvsX重组酶 20-200 nM
UvsY重组酶辅助蛋白 20-200 nM
10×重组缓冲液 3 µL
总体积 20 µL
10×重组缓冲液包括100-1000 mM 三羟甲基氨基甲烷,100-3000 mM醋酸钾、30-500 mM醋酸镁、3-30 mM 二硫苏糖醇、10-200 mM 三磷酸腺苷等。
室温静置 5min。
表9
组分 用量
上述反应体积 20 µL
gp32单链结合蛋白 10-50 nM
步骤(1)中构建好的文库 0.1-100 ng/uL
总体积 30 µL
37℃反应10 min。
反应结束后,加入10 ul 按照说明书清洗好的Dynabeads™ M-270 链霉亲和素磁珠,混匀后室温旋转孵育10 min。在磁分离架上分离磁珠和上清,磁珠使用清洗缓冲液(10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷,10-2000 mM氯化钠、0.1-3%吐温20)清洗3次。
高温洗脱:加入20 ul ddH2O,98℃ 5 min,取上清。
生物素竞争洗脱:加入20 ul含1-20 mM生物素的ddH2O,室温旋转孵育30 min,取上清。
变性剂洗脱:加入20 ul含5%-50%生物素的ddH2O,室温旋转孵育30 min,取上清。
将回收的DNA 进行定量分析,定量引物用表1。
结果如图9所示,高温洗脱时具有更高的捕获效率和捕获特异性。
实施例7:三种捕获方法的比较。
在本实施例中,我们比较了三种基因捕获方式对5.8S DNA的捕获效果。具体实施方式如下:
1)RNA文库的构建:1 ug 293F RNA经翌圣生物的Hieff NGS® Ultima Dual-modeRNA Library Prep Kit for Illumina(Cat#12252)进行RNA建库后,使用RATE-seq流程进行捕获。
2)RATE-seq
表10
组分 用量
Biotin-5.8S probe 45 10-100 nM
UvsX重组酶 20-200 nM
UvsY重组酶辅助蛋白 20-200 nM
10×重组缓冲液 3 µL
总体积 20 µL
10×重组缓冲液包括100-1000 mM 三羟甲基氨基甲烷,100-3000 mM醋酸钾、30-500 mM醋酸镁、3-30 mM 二硫苏糖醇、10-200 mM 三磷酸腺苷等。
室温静置 5min。
表11
组分 用量
上述反应体积 20 µL
gp32单链结合蛋白 10-50 nM
步骤(1)中构建好的文库 0.1-100 ng/uL
总体积 30 µL
37℃反应10 min。
反应结束后,加入10 ul 按照说明书清洗好的Dynabeads™ M-270 链霉亲和素磁珠,混匀后室温旋转孵育10 min。在磁分离架上分离磁珠和上清,磁珠使用清洗缓冲液(10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷、10-2000 mM氯化钠、0.1-3%吐温20)清洗3次。加入20 ulddH2O,98℃ 5 min,取上清。
2)CATE-seq(CRISPR-Assistant Target Enrichment and Sequencing)
表12
组分 用量
Biotin-5.8S sgRNA 10-1000 nM
dCas9 20-200 nM
10×NEB Buffer 3.1 3 µL
总体积 20 µL
室温静置 10 min。
表13
组分 用量
上述反应体积 20 µL
步骤(1)中构建好的文库 0.1-100 ng/uL
总体积 30 µL
37℃反应60 min。
反应结束后,加入10 ul 按照说明书清洗好的Dynabeads™ M-270 链霉亲和素磁珠,混匀后室温旋转孵育10 min。在磁分离架上分离磁珠和上清,磁珠使用清洗缓冲液(10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷,10-2000 mM氯化钠、0.1-3%吐温20)清洗3次。加入20 ulddH2O,10 ul 2 mg/mL 蛋白酶K, 50℃ 15 min,取上清。
3)传统探针杂交捕获:使用Integrated DNA Technologies的xGen®Hybridization and Wash Kit(Cat#1080577)按照操作说明进行杂交捕获,探针使用biotin 5.8S hyProbe-1和2。
将回收的DNA 进行定量和NGS测序分析,定量引物用表1。
三种基因捕获方式的特别比较见图10,传统杂交捕获方法操作繁琐、耗时长、捕获效率和特异性低、DNA需要变性、成本高,基于CRISPR/dCas9的基因捕获技术CATE-seq虽然增强了捕获特异性和效率,降低了捕获成本,简化了操作流程和缩短了时长,但是捕获探针的设计依赖于sgRNA的PAM序列,且sgRNA与靶DNA配对片段较短,影响了捕获的效率和广泛适用性。基因重组酶的基因捕获技术RATE-seq很好地克服了以下这些缺点,具有操作简单、耗时极端、捕获效率和特异性高、配对强度高、DNA无需变性、对DNA序列依赖性小、成本低等特点,适用于广泛的基因捕获需求。在图11和图12中,我们比较了三种捕获方式对5.8S DNA的捕获效果,证明了RATE-seq在捕获效率和捕获特异性上的优势。
实施例8:RATE捕获技术在三代测序上的应用。
在本实施例中,我们验证了RATE基因捕获技术在三代测序上的应用,我们验证的靶标基因是BRCA1,使用的探针序列是SEQ ID NO: 14-17。具体实施方式如下:
提取293F 基因组DNA ,进行DNA片段化和末端修复。
表14
组分 用量
293F 基因组 DNA 1-10 µg
Smearase® Mix(Yeasen) 10 µL
总体积 60 µL
30℃度反应1 min,72℃反应5 min。
2)RATE捕获
表15
组分 用量
Biotin-BRCA1 probe 1-4 10-100 nM
UvsX重组酶 20-200 nM
UvsY重组酶辅助蛋白 20-200 nM
10×重组缓冲液 3 µL
总体积 20 µL
室温静置 5min。
表16
组分 用量
上述反应体积 20 µL
gp32单链结合蛋白 10-50 nM
总体积 30 µL
使用配制好的30 uL重组反应液悬浮步骤(2)中 的磁珠,37℃反应10 min。离心取上清。加入10 ul 按照说明书清洗好的Dynabeads™ M-270 链霉亲和素磁珠,混匀后室温旋转孵育10 min。在磁分离架上分离磁珠和上清,磁珠使用清洗缓冲液(10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷,10-2000 mM氯化钠、0.1-3%吐温20)清洗3次。加入20 ul ddH2O,98℃ 5 min,取上清。
3) 文库构建。回收后的DNA按照说明书要求构建Pacbio和Nanopore DNA测序文库,并在相应的平台上进行测序和分析。
结果如图13和图14所示,RATE基因捕获技术能够有效捕获BRCA1基因的DNA序列,并应用于三代测序PacBio-seq和Nanopore-seq。这说明我们开发的RATE-seq是一种可以与二代测序和三代测序搭配的简便基因捕获技术。
实施例9:靶向Alu序列的RATE捕获技术在宿主基因组分离上的应用。
Alu序列是在人类基因组上的高度重复序列,具有50-100万个拷贝。这些重复序列分散在基因组上,平均距离约只有3kb。因此,Alu序列是人类宿主基因捕获分离的重要靶点。丰度较高的人类Alu序列比对结果和探针位置见图15。在本实施例中,我们利用RATE基因捕获技术对含细菌、真菌、病毒DNA等病原的模拟标准品样本中对人类宿主基因组DNA进行捕获去除。具体实施方式如下:
1)DNA标准品混合物的制备。使用翌圣生物的MolPure® Cell/Tissue DNA Kit(Cat# 18700)提取293F细胞的基因组DNA。使用翌圣生物的MolPure® Bacterial DNA Kit(Cat# 18806)提取大肠杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的基因组DNA。使用翌圣生物的MolPure®Fungal DNA Kit(Cat# 18812)提取毕赤酵母和串珠状赤霉菌的基因组DNA。支原体基因组DNA标准品购买自Minerva Biolabs,HBV DNA标准品购买自ZeptoMetrix(Cat# P0060),T7噬菌体DNA标准品购买自Applichem(Cat# A5197)。使用Qubit测定标准品浓度。将以上DNA按照下表的比例进行混合:
表17
组分 用量
人类293F gDNA 10 µg
大肠杆菌DNA 100 ng
嗜热脂肪芽孢杆菌DNA 10 ng
毕赤酵母DNA 100 ng
串珠状赤霉菌DNA 10 ng
T7噬菌体DNA 1 ng
支原体基因组DNA 0.1 ng
HBV DNA 标准品 0.01 ng
补加DEPC水至 100 µL
Qubit测定DNA标准品浓度,并用DEPC水稀释成100 ng/µL的DNA标准品。
2)RATE捕获
表18
组分 用量
Biotin-Alu probe 1和2 10-100 nM
UvsX重组酶 20-200 nM
UvsY重组酶辅助蛋白 20-200 nM
10×重组缓冲液 3 µL
总体积 20 µL
室温静置 5min。
表19
组分 用量
上述反应体积 20 µL
gp32单链结合蛋白 10-50 nM
DNA标准品 1-100 ng
总体积 30 µL
37℃反应10 min。离心取上清。加入10 ul 按照说明书清洗好的Dynabeads™ M-270 链霉亲和素磁珠,混匀后室温旋转孵育10 min。在磁分离架上分离磁珠和上清。上清保留备用。磁珠使用清洗缓冲液(10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷,10-2000 mM氯化钠、0.1-3%吐温20)清洗3次。加入20 ul ddH2O,98℃ 5 min,取上清。
3)DNA测序:将捕获上清和捕获磁珠上回收的DNA使用翌圣生物的Hieff NGS®OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina(Cat# 12203)进行DNA文库构建,并在Illumina NovaSeq 6000平台进行测序。将测序结果分别比对到人类、大肠杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、酵母、串珠状赤霉菌、T7噬菌体、支原体和HBV DNA上,计算测序结果中各病原微生物DNA的占比,结果见图16。
测序结果如图16所示,利用靶向Alu序列的人类宿主DNA捕获去除方式可以有效捕获分离病原标准品中的人类宿主DNA序列,提高病原微生物检测的灵敏度和准确性。
综上,我们开发了一种基于重组酶的新型基因捕获技术,并命名为RATE-seq(Recombinase-Assistant Target Enrichment and Sequencing)。RATE-seq的原理是使用重组酶复合物在37℃条件下协助单链DNA探针高效特异性地杂交到双链目标DNA分子中,再利用单链DNA探针上带有的亲和标记对靶DNA进行特异性富集。这种方法既具有探针杂交捕获技术的长探针配对较强和探针设计要求低等优势,又具有CRISPR/dCas9系统操作简单、耗时短、DNA无需热变性、捕获效率高和成本低等优点。因此相较于其他捕获技术,RATE-seq具有操作简单、捕获效率高、耗时极短(30 min)、稳定性好和成本低等明显优势,非常适用于基因捕获和自动化应用。除此之外,RATE-seq还能有效分离去除病理样本中的人类宿主DNA,提高病原微生物的检出率。
序列表
<110> 翌圣生物科技(上海)股份有限公司
<120> 基于基因捕获技术的测序方法
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac tcggctcgtg cgtcgatgaa gaacgcagct 60
agctgcgag 69
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
tgcgtcgatg aagaacgcag ctagctgcga g 31
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
tgcgtcgatg aagaacgcag ctagctgcga g 31
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
tcgtgcgtcg atgaagaacg cagctagctg cgag 34
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 5
ggctcgtgcg tcgatgaaga acgcagctag ctgcgag 37
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 6
ctcggctcgt gcgtcgatga agaacgcagc tagctgcgag 40
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 7
tcactcggct cgtgcgtcga tgaagaacgc agctagctgc gag 43
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 8
ggatcactcg gctcgtgcgt cgatgaagaa cgcagctagc tgcgag 46
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 9
ggtggatcac tcggctcgtg cgtcgatgaa gaacgcagct agctgcgag 49
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 10
gcggtggatc actcggctcg tgcgtcgatg aagaacgcag ctagctgcga g 51
<210> 11
<211> 100
<212> RNA
<213> Artifical sequence
<400> 11
guagccccgg gaggaacccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 12
ctcttagcgg tggatcactc ggctcgtgcg tcgatgaaga acgcagctag ctgcgagaat 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 13
gacgctcaga caggcgtagc cccgggagga acccggggcc gcaagtgcgt tcgaagtgtc 60
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 14
gagacggagt ctctctctgt cacctaggct ggagcgtag 39
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 15
ccacctgcct cggcctcctg gagtactggg attacaggcg tgag 44
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 16
gggcaggcca ggcacagtgg ctcaagcctg taactgcagc ac 42
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 17
gctctcatag agctcatatt ctagtgtggt agacagttga tac 43
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 18
gtggctcacg cctgtaatcc cagcatttgg gaggccgagg 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 19
gatcgagacc atccyggcta amamggtgaa accccgtctc 40
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 20
ctcttagcgg tggatcactc g 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 21
gcaagtgcgt tcgaagtgtc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 22
cctagtgggc cacttttggt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 23
ggctagttga ttcggcaggt 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 24
ccttccagca gatgtggatc a 21
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 25
ttctgcgcaa gttaggtttt gtc 23

Claims (11)

1.一种基于基因捕获技术的测序方法,其特征在于其步骤包括:
(1)获取样本的总DNA文库;
(2)针对待捕获的靶基因,设计并合成探针,所述探针与靶基因DNA严格互补配对,且设有便于与捕获介质结合的修饰,所述探针3’ 端采用双脱氧核糖核苷酸、生物素或者氨基修饰;
(3)探针与重组酶复合物预结合;
(4)探针-重组酶复合物与样本的总DNA文库结合;
(5)利用可与探针特异性结合的捕获介质,将与探针结合的靶基因DNA文库从总DNA文库中分离出来,获得富集的靶基因;
(6)扩增获得的靶基因,测序。
2.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法,其特征在于:所述探针的长度为30-50 nt。
3.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法,其特征为:所述探针5’端采用生物素修饰或多聚脱氧腺苷酸修饰。
4.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法,其特征为:所述重组酶复合物包括UvsX重组酶和UvsY重组酶辅助蛋白,使用浓度在20-200 nM。
5.根据权利要求4所述的基于基因捕获技术的测序方法,其特征为:所述重组酶复合物还包括gp32单链DNA结合蛋白,使用浓度在10-50 nM。
6.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法,其特征为:所述探针的使用浓度10-100 nM,总DNA的投入量为0.1-100 ng/uL。
7.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法,其特征为:步骤(2)中使用预结合缓冲液,在室温下预结合5-30min,预结合缓冲液的配比为:10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷,10-300 mM醋酸钾、3-50 mM醋酸镁、0.3-3 mM 二硫苏糖醇、1-20 mM 三磷酸腺苷。
8.根据权利要求1所述的基于基因捕获技术的测序方法,其特征为:步骤(3)中的结合温度为30-50℃。
9.根据权利要求3所述的基于基因捕获技术的测序方法,其特征为:当探针上的修饰是生物素修饰时,捕获介质使用链霉亲和素磁珠;当探针上的修饰是多聚脱氧腺苷酸修饰时,捕获介质使用多聚脱氧胸苷酸磁珠。
10.根据权利要求9所述的基于基因捕获技术的测序方法,其特征为:步骤(4)具体为:将捕获介质与反应体系在室温下孵育10-60min,分离捕获介质并清洗,然后将吸附在捕获介质上的DNA洗脱,洗脱的方式为高温98℃洗脱、1-20 mM生物素竞争洗脱或者体积浓度5%-50%变性剂去离子甲酰胺洗脱。
11.根据权利要求10所述的基于基因捕获技术的测序方法,其特征为:使用清洗缓冲液对捕获介质进行清洗,所述清洗缓冲液包含10-100 mM 三羟甲基氨基甲烷、10-2000 mM氯化钠、体积浓度0.1-3%的吐温20。
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