CN117210437A - 两种基因编辑工具酶鉴定及其在核酸检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了两种新型向导RNA依赖型核酸内切酶Gs12‑2和Gs12‑14，通过实验鉴定发现，Gs12‑2的PAM识别序列为HVH（H=A/T/C，V=A/C/G），Gs12‑14的PAM识别序列为TTYV（Y=C/T，V=A/C/G），其优点在于，与已知LbCas12a相比，这两个核酸内切酶的靶标识别范围更广，能够高效特异切割基因组，并且还具有反式切割作用，即非特异性、单链DNase活性。本发明还建立了基于CRISPR/Gs12‑2和Gs12‑14系统介导的核酸可视化检测技术，在核酸检测领域应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及两种新鉴定的RNA引导的核酸内切酶Gs12-2和Gs12-14及其在核酸检测中的应用。
背景技术
传统的基因编辑工具主要包括锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活效应核酸酶(TALENs)和成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)。ZFN和TALEN是第一代和第二代基因编辑技术，两者都属于包含DNA识别结合域和DNA切割域的核酸酶。在这些技术中，DNA结合域是经过专门设计，可以靶向被DNA核酸酶域切割的特定DNA序列。然而，这些第一代和第二代基因编辑技术的广泛应用存在靶标识别率低、成本高、脱靶概率高和结构复杂等问题。这些缺点推动了第三代基因编辑技术的发展，即CRISPR/Cas9系统，它源自细菌中的适应性免疫系统。CRISPR基因编辑依赖于两个关键成分：CRISPR相关(Cas)蛋白和反式活性单向导RNA(sgRNA)。
随着对CRISPR相关蛋白的组成和发挥功能的形式进行更深入的研究，可将CRISPR/Cas系统分为两类：第1类Cas蛋白是多个亚基组成的多蛋白效应复合物，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第2类Cas蛋白是单个多结构域的效应蛋白，包括Ⅱ型的Cas9蛋白、Ⅴ型的Cas12蛋白和Ⅵ型的Cas13蛋白。相对而言，第二类系统相对更为简单、高效，并且操作方便。在2015年被发现的2类Ⅴ型效应蛋白Cas12a，其长度为1200-1500个氨基酸。Cas12a蛋白可以在crRNA(CRISPR RNA)的引导下与含有PAM序列(Protospacer-Adjacent Motif，前间隔区序列邻近基序，一段富含碱基T的序列)的靶标双链DNA结合并切割基因组DNA，该crRNA的长度仅为42-44个碱基。并且，CRISPR/Cas12a系统具有RNase和DNase活性，不需要额外的反式激活crRNA(tracrRNA)。2018年，Cas12a被发现能在crRNA的引导下特异性结合和切割目标双链DNA(dsDNA)，并在切割完成后仍保持活性，继续切割其他的非靶标单链DNA(ssDNA)，这种非特异性的切割活性被称为“附带切割”能力。科学家利用Cas12a的“附带切割”能力，与核酸扩增技术相结合，同时在系统中引入带有荧光基团和淬灭基团修饰的ssDNA报告基因，开发出了许多快速、简便、低成本的核酸检测平台。
CRISPR/Cas12a系统具有操作简单、价格低廉等优点，在核酸检测方面具有巨大的应用潜力，但特异性、PAM限制等缺陷使其应用受到限制。而这些均源自于Cas12a核酸酶的自身特性。因此，本领域仍然亟需寻找编辑活性高、PAM序列简单且基因组覆盖范围广、特异性高的新型CRISPR/Cas12a基因编辑系统。
发明内容
本发明首次挖掘并鉴定出两种Cas12a家族同源核酸内切酶Gs12-2和Gs12-14，还建立了基于Gs12-2和Gs12-14介导的核酸可视化检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
CRISPR/Cas12a系统中的同源核酸内切酶，包括以下蛋白：
I、SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的Gs12-2蛋白和SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的Gs12-14蛋白；
II、与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比，具有80％以上的序列相似性的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能；
III、与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。
融合蛋白，包含上述核酸内切酶，以及与所述核酸内切酶的N端或C端连接的多肽。
多核苷酸，所述多核苷酸为编码上述核酸内切酶的多核苷酸，或编码上述融合蛋白的多核苷酸。含有所述多核苷酸的载体或宿主细胞。
一种可视化核酸检测试剂盒，包括上述核酸内切酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，以及与靶标核酸配对的向导RNA。
一种可视化检测伪狂犬病毒(PRV)核酸的试剂盒，包括上述Gs12-2蛋白或Gs12-14蛋白，单链DNA荧光-淬灭报告基因，以及与PRV核酸靶标配对的Gs12-2或Gs12-14蛋白向导RNA，所述的Gs12-2向导RNA序列为5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCCGGTGCUGGGCTCGUTGUG-3’，所述的Gs12-14蛋白向导RNA序列为5’-AAUUUCUACUUAGUGUAGAUUCCGGTGCUGGGCTCGUTGUG-3’(下划线序列为靶向区)。进一步地，还包括扩增PRV的RPA引物对，上游引物序列为5’-CGTGTACGTGCAGAACTCCATGCGCGTGCC-3’，下游引物序列为5’-CCCAGCTTAAAGTAGCGCCGGTGGTTGCCG-3’。
本发明的技术方案具有如下主要的有益效果：
1.本发明首次提供了一种结合宏基因组学与实验手段挖掘和鉴定到的新型Cas12a家族同源核酸内切酶Gs12-2和Gs12-14。
2.本发明发现PAM识别序列范围更广的核酸内切酶Gs12-2和Gs12-14，其优点在于可以在基因组中识别PAM为“HVH”或“TTYV”(V＝A/C/G、Y＝C/T、H＝A/T/C)的靶标DNA位点，极大拓展了基因编辑靶标覆盖范围。
3.本发明首次提供了CRISPR/Gs12-2和Gs12-14系统介导的核酸可视化检测技术。
附图说明
图1.利用宏基因组学方法预测的Cas12a家族同源核酸内切酶Gs12-2和Gs12-14系统进化树分析。A.Gs12-2和Gs12-14与已知Cas12a蛋白(AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a)同源性分析；B.Gs12-2和Gs12-14系统进化树分析。
图2.核酸内切酶Gs12-2和Gs12-14基因座、结构域及向导RNA的DR序列模式图。A.Gs12-2和Gs12-14基因座示意图；B.向导RNA的DR序列二级结构折叠与多序列比对。
图3.预测的Gs12-2和Gs12-14蛋白氨基酸序列与已知Cas12a蛋白(AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a)氨基酸序列保守性分析。
图4.凝胶电泳检测Gs12-2和Gs12-14切割双链DNA靶标活性。靶标为非洲猪瘟病毒ASFV p72基因扩增片段，识别的靶标位点PAM为“TTTV”。
图5.在细菌中利用PAM文库消减实验鉴定Gs12-2和Gs12-14识别PAM的特征。A.PAM文库消减实验示意图；B.Gs12-2和Gs12-14可识别的PAM。
图6.鉴定Gs12-2和Gs12-14切割双链DNA靶标的温度范围。靶标为猪伪狂犬病毒PRV gB基因扩增片段。A.Gs12-2体外切割双链靶标1h后凝胶电泳图；B.Gs12-14体外切割双链靶标1h后凝胶电泳图。
图7.鉴定Gs12-2和Gs12-14反式切割活性的酶切温度范围。靶标为ASFV p72基因。A.Gs12-2反式切割活性的酶切温度范围；B.Gs12-14反式切割活性的酶切温度范围。
图8.评估靶标中单个碱基错配对Gs12-2和Gs12-14反式切割活性的位置效应。靶标为猪PRV gB基因扩增片段，PC为阳性对照，PAM位点为GTTG，NC为阴性对照。A.靶点单碱基错配模式图；B、D.通过蓝光和荧光强度检测Gs12-2在单碱基错配时的不同反式切割活性。C、E.通过蓝光和荧光强度检测Gs12-14在单碱基错配时的不同反式切割活性。
图9.基于RPA-CRISPR/Gs12-2系统介导的猪伪狂犬病毒核酸可视化检测技术。A.利用qPCR明确PRV阳性或阴性样品；B.通过蓝光检测RPA-CRISPR/Gs12-2结果。
具体实施方式
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
Genie scissor(灵剪)核酸内切酶家族，其中Genie是精灵的意思，代表为细菌来源，scissor代表基因剪刀，表明其可能发挥的基因编辑功能。Genie scissor核酸内切酶对应的中文名称为“灵剪”核酸内切酶，Genie scissor基因编辑系统代表“灵剪”核酸内切酶介导的基因编辑系统，简称为“灵剪基因编辑”。
前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif，简称PAM)是一个短的DNA序列(通常为2-6碱基对长度)。传统观点认为，PAM是Cas核酸酶切割所必需的，通常在切割位点下游3-4个核苷酸。有许多不同Cas内切酶可以从不同的细菌中纯化，并且每种酶可能识别不同的PAM序列。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.基于宏基因组学方法挖掘新型Cas12家族同源核酸内切酶
基于发明人搭建的Cas12a家族同源核酸内切酶的生物信息学鉴定流程，对NCBInr(Non-Redundant Protein Sequence Database)非冗余蛋白库、全球微生物基因目录数据库(GMGC)等公共数据库中的海量宏基因组测序数据进行了细菌编码蛋白深度挖掘。大致分析流程为：针对目标数据库中所有的contig序列，使用minced软件搜寻与定位CRISPRarray，接着使用prodigal软件预测CRISPR array邻近表达的蛋白质，通过CD-hit软件对预测到的所有蛋白去冗余、并利用mega软件进行蛋白质聚类分析、利用hmmer软件进行CRISPR-Cas相似性蛋白鉴定与分类，最终获得两种新的未知细菌蛋白。
通过系统发育进化树分析，发现这两种新的细菌蛋白位于CRISPR-Cas12a系统进化不同分支上(图1)，推测它们可能为新的RNA引导型核酸内切酶。本发明对这类来自不同细菌中新发现的蛋白命名为Genie scissor(灵剪，Gs)核酸内切酶。为了方便后续研究，进一步基于细菌种属来源，发明人将这种新的未知细菌蛋白分别命名为Gs12-2和Gs12-14，其命名规则为：“核酸内切酶+数字编号”，Gs12-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，Gs12-14蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
接着，发明人利用本地化blast程序，对这种新发现的细菌蛋白与NCBI nr数据库进行序列相似性比对。结果发现，Gs12-2蛋白与已知核酸内切酶LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a的氨基酸序列保守性分别为34.96％、34.60％和30.88％，新的Gs12-14蛋白与已知核酸内切酶LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a的氨基酸序列保守性分别为44.17％、37.92％和32.17％(图1)。
进一步，发明人通过对这两种蛋白的基因座用CRISPRCasFinder软件进行分析。结果发现，Gs12-2和Gs12-14具有CRISPR array序列，包含多个重复和间隔序列，但是Gs12-14没有Cas4、Cas1和Cas2。通过使用hmmer软件与Pfam数据库中的结构域序列进行隐马尔可夫模型比对分析，分析得到了REC1domain(Alpha helical recognition lobe domain)，RuvCnuclease domain和NUC domain(Nuclease domain)，推测这两个新的细菌蛋白可能具有核酸切割活性；接着发明人对Gs12-2和Gs12-14的DR序列二级结构通过RNAfold web server在线网站进行预测与多序列比对，结果发现这两个新预测的细菌蛋白与已知Cas12a蛋白的DR二级结构类似，Gs12-2仅有一个碱基存在差异；Gs12-14 DR序列多一个碱基，并且有四个碱基存在差异(图2)。
最后发明人对Gs12-2和Gs12-14蛋白的RuvC和REC结构域分别与已知的LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a蛋白进行氨基酸多序列比对。如图3所示，发现Gs12-2和Gs12-14蛋白结构域与已知Cas12a蛋白的氨基酸序列相似性存在较大差别，因此亟需通过进一步实验确定它是否具有核酸定向切割活性。
实施例2.新型核酸酶Gs12-2和Gs12-14具有体外双链DNA切割活性
本实施例通过体外实验测试Gs12-2和Gs12-14蛋白对双链DNA的切割活性。利用与靶核酸配对的向导RNA引导Gs12-2和Gs12-14蛋白识别并结合在靶核酸上，从而激发Gs12-2和Gs12-14蛋白对靶核酸的切割活性，切割体系里的双链靶核酸。接着进行琼脂糖凝胶电泳观察目标条带大小变化来鉴定它的酶切活性。
本实施例中选择的靶标双链DNA(dsDNA)为非洲猪瘟P72基因，PAM为TTTA，其序列：
加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。Gs12-2蛋白的向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAGAGCAGACAUUAGUUUU UC；Gs12-14蛋白的向导RNA序列为：AAUUUCUACUUAGUGUAGAUUAGAGCAGACAUUAGUUUUUC(下划线区域为靶向区)。以PMD-18T-p72质粒为模板，p72-F:CTGTAACGCAGCACAGCTGA，p72-R:CCATGGTTTATCCCAGGAGT为引物进行PCR扩增得到P72双链DNA。其次，通过大肠杆菌密码子优化后合成编码Gs12-2和Gs12-14的DNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示，并分别在其C端加入NLS核定位信号。随后连接至pET-28a原核表达载体中，转化至大肠杆菌BL21菌株，鉴定阳性克隆后进行IPTG诱导表达，通过亲和层析纯化获得目的蛋白。体外切割反应采用如下体系：10×CutSmart Buffer 2μL，预测的Gs12-2、Gs12-14蛋白、增强型enAsCas12a或LbCas12a蛋白为500ng，crRNA为500ng，P72双链DNA扩增产物2μL。37℃分别孵育30min。反应完成后分别加入0.5μL蛋白酶K，55℃孵育10min终止反应。实验组添加向导RNA和靶标核酸，对照组不添加向导RNA。反应后通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，在UV照胶仪下进行成像观察相同反应时间相同反应温度下预测的新型核酸酶Gs12-2和Gs12-14实验组和对照组的目标条带区别，并通过Image J软件分析切割效率。
结果如图4所示，与不加向导RNA的对照组相比，实验组中的Gs12-2和Gs12-14蛋白在30min内就能够切割反应溶液里的双链DNA，存在1条或2条明显的切割条带，切割效率分别为Gs12-2:4.7％，Gs12-14:87.2％，enAsCas12a:47.9％，LbCas12a:11.2％由此可见，通过宏基因组学策略预测的细菌蛋白跟预期推测一样具有核酸靶向切割活性。
实施例3.鉴定Gs12-2和Gs12-14识别PAM的特征
通过在细菌上进行PAM文库消减实验，对同源性低且具有体外目标核酸切割活性的Gs12-2和Gs12-14蛋白所识别的PAM序列进行了鉴定。其中随机混合PAM载体库构建流程为：合成DNA oligo序列GGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGNNNNNNNGAGAAGTCATTTAATAAGGC CACTGTTAAAAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTT，其中N为随机脱氧核苷酸。以Oligo-F：GGCCAGTGAATTCGAGCTCGG和Oligo-R：AAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA为上下游引物经PCR扩增后，以同源重组的方式连入pUC19载体，转化大肠杆菌后提取质粒即可形成随机混合PAM载体库。Gs12-2蛋白的向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUGAGAAGUCAUUUAAUAAGGCCA CU；Gs12-14蛋白的向导RNA序列为AAUUUCUACUUAGUGUAGAUUGAGAAGUCAUUUAAUAAGGCCACU(下划线区域为靶向区)。
细菌PAM文库消减实验：将构建好的Gs12-2和Gs12-14蛋白分别与crRNA共表达的载体pACYC-Duet-1-Gs12-2-crRNA和pACYC-Duet-1-Gs12-14-crRNA转化至DE3(BL21)感受态中，制备稳定表达的细菌株。不含Gs12-2/14蛋白表达载体pACYC-Duet-1构建的稳转细菌株作为阴性对照。将100ng的PAM文库质粒分别电转至稳定表达的细菌株中，通过氨苄霉素和氯霉素双抗性的板子进行筛选，16h后将板子上的菌落刮下进行质粒提取。分别以100ng提取的质粒为模板，用文库测序引物Seq-F：5’-GGCCAGTGAATTCGAGCTCGG-3’和PAM-Seq-R：5’-CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACC-3’进行PCR扩增，产物回收后分别将实验组和对照组进行二代高通量测序，对测序结果通过Weblogo3.0分析展示。
鉴定Gs12-2和Gs12-14蛋白识别的PAM序列特征：对起始载体库中含有的16,384种不同类型的PAM序列，分别统计它们在高通量测序中实验组和对照组中出现的次数高低，并用各自组所有PAM序列总数进行标准化。针对每条PAM消耗变化的计算方式为log2(对照组标准化值/实验组标准化值)，当该值大于3.5时，认为这条PAM被显著消耗。然后使用Weblogo3.0对显著消耗的PAM序列各位置碱基出现频率进行可视化展示。
结果如图5所示，发现两种松散型PAM序列的CRISPR/Cas12a基因编辑系统的Gs12-2和Gs12-14，分别可以在基因组中PAM为“HVH”和“TTYV”(V＝A/C/G、Y＝C/T、H＝A/T/C)的序列中切割靶标DNA。
实施例4.鉴定Gs12-2和Gs12-14体外切割双链DNA靶标的温度作用范围
本实施例通过体外实验测试Gs12-2和Gs12-14蛋白在不同温度梯度下对双链DNA的切割活性。利用与靶核酸配对的向导RNA引导Gs12-2和Gs12-14蛋白识别并结合在靶核酸上，从而激发Gs12-2和Gs12-14蛋白对靶核酸的切割活性，切割体系里的双链靶核酸。接着进行琼脂糖凝胶电泳观察目标条带大小变化来鉴定它的酶切活性。
本实施例中选择靶标双链DNA(dsDNA)为伪狂犬病毒gB基因，PAM为TTTG，其序列：
加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。Gs12-2蛋白的向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUGUAGGUGAACUGCAGGCGCG；Gs12-14蛋白的向导RNA序列为：AAUUUCUACUUAGUGUAGAUUGUAGGUGAACUGCAGGCGCG(下划线区域为靶向区)。以pUC57-PRV-gB质粒为模板，PRV-F:GAGGCCTCGGAGGCCATCGA，PRV-R:TACCGGCACATCTCGCGCC为引物进行PCR扩增得到PRV双链DNA。体外切割反应采用如下体系：10×CutSmart Buffer 2μL，预测的Gs12-2或Gs12-14蛋白为500ng，crRNA为500ng，PRV gB靶标扩增产物2μL。Gs12-2蛋白在25℃、37℃、42℃、50℃和60℃下分别孵育1h，Gs12-14蛋白在25℃、37℃、42℃、50℃和60℃下分别孵育1h。反应完成后分别加入0.5μL蛋白酶K，55℃孵育10min终止反应。实验组添加向导RNA和靶标核酸，对照组不添加向导RNA。反应后通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，在UV照胶仪下进行成像观察预测的新型蛋白酶Gs12-2和Gs12-14实验组和对照组的目标条带区别，并通过ImageJ软件分析切割效率。如图6所示，在25℃、37℃、42℃、50℃和60℃下，Gs12-2体外切割1h的切割效率分别为52.6％、51.2％、39.2％、44.1％和47.6％；Gs12-14体外切割20min的切割效率为34.1％、39.6％、45.3％、35.2％和26.1％。由此可见Gs12-2和Gs12-14蛋白在25-60℃范围内均具有较高体外切割活性。
实施例5.CRISPR/Gs12-2和CRISPR/Gs12-14系统可介导核酸现场可视化快速检测
进一步评估Gs12-2和Gs12-14蛋白是否具有反式切割(trans cleavage)活性。利用可以与靶核酸配对的向导RNA引导核酸内切酶Gs12-2和Gs12-14识别并结合在靶核酸上；随之激发其对任意单链核酸的“反式切割”活性，从而切割反应体系里的单链DNA荧光-淬灭报告基因(ssDNA-FQ)；进一步可以通过激发的荧光强度、背景噪音和肉眼颜色变化来判断候选细菌蛋白的反式切割功能。本实施例评估Gs12-2和Gs12-14反式切割活性作用温度范围中采用的靶标双链DNA(dsDNA)为伪狂犬病毒PRV gB基因扩增片段，序列如下：
加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。Gs12-2蛋白向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCCGGUGC AGGGCUCGAUGAG；Gs12-14蛋白向导RNA序列为：AAUUUCUACUUAGUGUAGAUUCCGGUGCAGGGCUCGA UGAG下划线序列为靶向区(下划线区域为靶向区)。荧光-淬灭报告基因为ROX-random-BHQ2(5’ROX/GTATCCAGTGCG/3’BHQ2)。采用以下反应体系：Gs12-2或Gs12-14蛋白500ng，向导RNA500ng，2μL 10×CutSmart Buffer，1μM单链DNA荧光-淬灭报告基因和2μL的PCR扩增靶标产物。阴性对照为不加靶标。分别在16℃、25℃、37℃、42℃、50℃和60℃反应15min，98℃反应2min灭活。通过在蓝光和紫外光下观察荧光强度和背景噪音，来判断体外上述预测蛋白的反式切割活性。结果如图7所示，Gs12-2和Gs12-14蛋白在37-50℃具有较高反式切割活性且Gs12-2在50℃时反式切割活性最高，Gs12-14在42℃时反式切割活性最高。
实施例6.评估CRISPR/Gs12-2和CRISPR/Gs12-14系统的特异性
进一步鉴定CRISPR/Gs12-2和CRISPR/Gs12-14系统对靶标区域单碱基错配识别能力。本实施例中采用的靶标双链DNA(dsDNA)为猪伪狂犬病毒PRV的gB部分保守基因，序列如下：
加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。首先PCR扩增出含有从1-20位连续靶标位点突变的双链DNA模板，分别以Target-F至Target-p72-F-20C为上游引物，以Target-p72-R为下游引物进行扩增得到靶标双链基因。本发明使用的引物序列表如下：
Gs12-2蛋白向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCCGGTGCUGGGCTCGUTGUG，Gs12-14蛋白向导RNA序列为：AAUUUCUACUUAGUGUAGAUUCCGGTGCUGGGCTCGUTGUG(下划线区域为靶向区)。首先，原核表达纯化出Gs12-2和Gs12-14蛋白，体外转录出向导RNA和PCR扩增出PRV gB靶基因双链DNA。接着采用以下反应体系：Gs12-2或Gs12-14蛋白500ng，向导RNA500ng，2μL 10×CutSmart Buffer，1μM单链DNA荧光-淬灭报告基因(5’ROX/GTATCCAGTGCG/3’BHQ2)和2μL的PCR扩增靶标产物。阴性对照为不加靶标。37℃反应15min，98℃反应2min灭活。通过在蓝光下观察荧光强度和背景噪音，来判断体外上述预测蛋白的反式切割活性。结果如图8所示，与完全配对的阳性对照相比，存在单个碱基错配的位点能明显抑制Gs12-2和Gs12-14蛋白的核酸反式切割的活性。由此可见，Gs12-2和Gs12-14蛋白对靶标位点的单个碱基错配较为敏感，反过来讲即表明其对靶标位点识别特异性较高，更有助于今后用于精准识别单核苷酸序列多态性(SNP)或基因组碱基修饰等。
实施例7.利用RPA-CRISPR/Gs12-2技术可视化检测猪伪狂犬病毒
评估CRISPR/Gs12-2系统介导的核酸现场可视化检测技术的可靠性。针对PRV，建立RPA-CRISPR/Gs12-2检测技术。先收集PRV感染和未感染细胞的培养液作为模拟临床病毒感染样本，与定量PCR相比较，以此来评估新开发技术的检测准确性。其中采用伪狂犬病毒PRV gB基因扩增片段为阳性对照组，仅加灭菌水作为阴性对照。序列如下：
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加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。Gs12-2蛋白向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCCGGUGCAGGGCUCGAUGAG。扩增的RPA引物：上游引物：5’-CGTGTACGTGCAGAACTCCATGCGCGTGCC-3’，下游引物：5’-CCCAGCTTAAAGTAGCGCCGGTGGTTGCCG-3’。定量PCR引物：上游引物：GGCGTGTACGTGCAGAACTC，下游引物：ACCCGCTCCCCAGCTTAAAG。首先，原核表达纯化出Gs12-2蛋白，体外转录出向导RNA和PCR扩增出PRV gB靶基因双链DNA。然后体外培养PK15细胞，待细胞融合度达70％后，接种PRV病毒，在37℃恒温培养箱培养3天后收集病毒培养液。接着取30μL PRV病毒培养液分装入3个PCR管，每管10μL，分别加入10μL病毒核酸粗提液Quick Extract Solution，经过65℃加热5min，98℃加热5min后备用；取220μL灭菌水分装入11个PCR管中，每管20μL。将以上14个PCR管随机打乱并编号为1-14号。最后分别采用定量PCR和RPA-CRISPR/Gs12-2检测方法检测待检的16个样品。定量PCR反应体系：MonAmpTM chemoHs qPCR Mix 10μL，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，纯水9.2μL，待检样品1μL，引物浓度为10nM。反应程序：预变性：95℃、5min；扩增：95℃、5s，60℃、15s，40个循环；退火：40℃、30s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。RPA-CRISPR/Gs12-2反应体系：Gs12-2蛋白500ng，向导RNA 500ng，2μL 10×CutSmart Buffer，1μM单链DNA荧光-淬灭报告基因(5’ROX/GTATCCAGTGCG/3’BHQ2)和1μL的RPA扩增靶标产物。37℃反应15min，98℃反应2min灭活。RPA(TwistDX)反应体系：A buffer29.4μL，正向引物2μL，反向引物2μL，B buffer 2.5μL(浓度为280mM)，DEPC水40.1μL，混匀后分装到4个PCR管，每管19μL后，各加入1μL待检样品。42℃反应20min。通过分析定量PCR待检样品的CT值与阳性对照和阴性对照CT值，判断待检样品中病毒感染细胞培养液编号，然后在蓝光下观察RPARPA-CRISPR/Gs12-2检测结果的荧光强度和背景噪音。结果如图9所示，定量PCR检测方法判定3号、7号和12号样品为PRV感染的细胞培养液，RPA-CRISPR/Gs12-2检测方法检测结果与定量PCR一致。由此可见，RPA-CRISPR/Gs12-2技术检测准确性高，为今后PRV核酸可视化检测提供了新方法。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本领域的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (7)
1.CRISPR/Cas12a系统中的同源核酸内切酶，其特征在于，包括以下蛋白：
I、SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的Gs12-2蛋白和SEQ ID NO.2所示氨基酸序列Gs12-14蛋白；
II、与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比，具有80%以上的序列同一性的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能；
III、与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。
2.融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述蛋白和其他修饰部分。
3.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述核酸内切酶的多核苷酸，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸。
4.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸内切酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导RNA。
6.一种可视化检测伪狂犬病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的Gs12-2蛋白或Gs12-14蛋白，单链DNA荧光-淬灭报告基因，以及与PRV核酸靶标配对的Gs12-2或Gs12-14蛋白向导RNA，所述的Gs12-2向导RNA序列为5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUCCGGTGCUGGGCTCGUTGUG-3’，所述的Gs12-14蛋白向导RNA序列为5’-AAUUUCUACUUAGUGUAGAUCCGGTGCUGGGCTCGUTGUG-3’。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括伪狂犬病毒的重组酶聚合酶扩增引物对，上游引物序列为5’-CGTGTACGTGCAGAACTCCATGCGCGTGCC-3’，下游引物序列为5’-CCCAGCTTAAAGTAGCGCCGGTGGTTGCCG-3’。
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2023
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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| CN116676291B (zh) * | 2022-08-22 | 2024-02-27 | 华中农业大学 | 核酸内切酶Genie scissor及其介导的基因编辑系统 |
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