CN116676291A - 核酸内切酶Genie scissor及其介导的基因编辑系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CRISPR/Cas系统中核酸内切酶Genie scissor及其介导的基因编辑系统。具体地，本发明提供了一种基于宏基因组学方法挖掘到的新型向导RNA依赖型核酸内切酶Genie scissor，特别是新发现来自氨基酸球菌科的AfGs12‑1蛋白和来自毛螺菌科家族成员TF01‑11的LtGs12‑1，其优点在于具有覆盖靶标位点范围更广的基因组编辑能力。本发明建立了基于LtGs12‑1或AfGs12‑1蛋白介导的核酸裸眼可视化检测与基因组定向编辑技术，在基因组定点修饰与核酸检测领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因组编辑技术领域，具体地涉及新鉴定的CRISPR/Cas系统的核酸内切酶Genie scissor，特别是LtGs12-1或AfGs12-1蛋白介导的核酸裸眼可视化检测、基因组编辑技术及其应用。
背景技术
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)成簇的规律间隔的短回文重复序列是广泛存在于大多数细菌和古菌中的原核生物的一种获得性免疫系统，用于抵抗存在于噬菌体或质粒的外源遗传元件的入侵。现广泛用于基因编辑，它通过向导RNA引导识别并结合到基因组上的特定靶标序列，进而切割DNA产生DSB(双链断裂)并刺激宿主产生NHEJ(生物非同源末端连接)和HDR(同源重组)两种修复机制，从而进行特定位点的基因编辑。
CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，PAM识别序列为“NGG”的活性较高的SpCas9核酸酶，最早被应用于真核生物的基因编辑，除此之外，还有V型PAM识别序列为“TTTN”Cas12a蛋白。与Cas9相比，Cas12a具有多个优势，如向导RNA较短，更容易被递送至细胞中；切割后产生粘性末端，更利于基因组精准识别编辑；切割位点与其识别位点距离较远，可实现连续多次编辑的目的。然而，目前已知的Cas12a蛋白，如AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a等，仍存在编辑效率较低，或者PAM序列复杂等缺陷。
因此，本领域仍然亟需寻找编辑活性高、PAM序列简单且基因组覆盖范围广、特异性高的新型CRISPR/Cas基因编辑系统。
发明内容
本发明首次开发了一种CRISPR/Cas系统的新型核酸内切酶Genie scissor及其介导的基因编辑系统，具体地，基于宏基因组学方法挖掘到新型向导RNA依赖型核酸内切酶Genie scissor，特别是来自毛螺菌科TF01-11的LtGs12-1蛋白具有覆盖靶标位点范围更广的基因组编辑能力，本发明还建立了基于LtGs12-1或AfGs12-1蛋白介导的核酸裸眼可视化检测与基因组定向编辑技术。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
CRISPR/Cas系统中的核酸内切酶，包括以下蛋白：
I、SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的AfGs12-1蛋白；
II、SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的LtGs12-1蛋白；
III、与SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列相比，具有80％以上的序列同一性的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能；
Ⅳ、与SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。
融合蛋白，包含上述核酸内切酶，以及与所述蛋白的N端或C端连接的多肽。
分离的多核苷酸，所述多核苷酸为编码上述核酸内切酶的多核苷酸序列，或所述融合蛋白的多核苷酸。含有所述多核苷酸的载体或宿主细胞。
上述核酸内切酶在基因编辑中的应用，包括包括原核生物基因组、真核生物基因组或体外基因的修饰基因、敲除基因、改变基因产物的表达、修复突变或插入多核苷酸。
一种CRISPR/Cas基因编辑系统，包括上述核酸内切酶或融合蛋白或多核苷酸或载体或宿主细胞。进一步地，还包括能够结合上述核酸内切酶的同向重复序列和能够靶向目标序列的引导序列。
一种可视化核酸检测试剂盒，包括上述的核酸内切酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导RNA。
本发明的技术方案具有如下主要的有益效果：
1.本发明首次提供了一种基于宏基因组学方法挖掘到的新型CRISPR/Cas系统的核酸内切酶Genie scissor，特别是来自氨基酸球菌科的AfGs12-1蛋白和毛螺菌科家族成员TF01-11的LtGs12-1蛋白。
2.本发明发现LtGs12-1蛋白的靶标PAM基序为HHV，其中H代表T、A或C、V代表A、G或C，与已知Cas12a蛋白(PAM为TTTV)相比，其优点在于具有覆盖靶标位点范围更广的基因组编辑能力。
3.本发明首次鉴定了LtGs12-1或AfGs12-1蛋白均能够介导核酸裸眼可视化检测与基因组定向编辑。
附图说明
图1.利用宏基因组学方法挖掘新型CRISPR/Cas系统的向导RNA依赖型核酸内切酶Genie scissor与系统进化树分析。其中LtGs12-1来自Lachnospiraceae_bacterium_TF01-11细菌，LmGs12-1来自Lachnospiraceae_bacterium_MC2017细菌，AfGs12-1来自Acidaminococcaceae(family)细菌。
图2.三种新型核酸内切酶Genie scissor基因座、结构域及向导RNA的同向重复序列(DR)模式图。A.AfGs12-1核酸内切酶基因座示意图；B.LtGs12-1核酸内切酶基因座示意图；C.部分LmGs12-1核酸内切酶基因座示意图；D.向导RNA的DR序列二级结构折叠与多序列比对。
图3.三种预测的新型核酸内切酶Genie scissor(AfGs12-1,LtGs12-1,LmGs12-1)结构域与已知蛋白(AsCas12a，LbCas12a，FnCas12a)的结构域氨基酸序列保守性分析。
图4.通过体外酶切实验评估三种新型向导RNA依赖型核酸内切酶Genie scissor定向切割双链DNA靶标的活性。A.靶向切割FANCF基因目标扩增区实验模式图；B.酶切产物凝胶电泳图。
图5.利用PAM文库消减实验鉴定向导RNA依赖型LtGs12-1核酸内切酶的PAM基序特征。A.PAM文库消减实验流程示意图；B.LtGs12-1核酸内切酶识别靶标位点PAM基序特征，其识别的基序为HHV，其中H代表T、A或C、V代表A、G或C。
图6.新型向导RNA依赖型LtGs12-1与已知LbCas12a核酸内切酶靶标位点识别数量比较。A.生物信息学分析流程示意图，其中LtGs12-1识别的PAM位点为HHV，LbCas12a识别的PAM位点为TTTV，靶标碱基组成长度均为20nt；B.通过生物信息学手段评估两种核酸内切酶针对随机选择的10个人源基因靶标识别位点数量；C.评估随机选择的100个人源基因靶标识别位点数量；D.评估针对非洲猪瘟病毒基因组全长的靶标识别位点数量。
图7.基于CRISPR-LtGs12-1和CRISPR-AfGs12-1系统的核酸裸眼可视化检测技术。A.利用向导RNA依赖型核酸内切酶进行核酸裸眼可视化检测实验流程图；B.利用CRISPR-LtGs12-1或CRISPR-AfGs12-1技术裸眼可视化检测非洲猪瘟病毒。
图8.评估CRISPR-LtGs12-1技术介导的核酸裸眼可视化检测最适温度。A.采用蓝光仪检测反应温度对向导RNA依赖型LtGs12-1核酸内切酶检测非洲猪瘟病毒编码基因p72活性的影响；B.采用酶标仪定量检测反应温度对向导RNA依赖型LtGs12-1蛋白介导的目标核酸分子检测活性影响。
图9.评估CRISPR-LtGs12-1系统介导的目标核酸分子检测特异性。A.合成的靶标位点碱基错配序列特征；B.采用酶标仪定量检测向导RNA依赖型LtGs12-1核酸内切酶对非PAM区单碱基错配位点的识别能力。PC阳性对照，NC阴性对照。
图10.采用RNP方法递送CRISPR-LtGs12-1蛋白与向导RNA复合物定向切割细胞基因组的目标靶标DNA。A.RNP递送与T7EN1酶切示意图；B.T7EN1酶切电泳图，其中Control为阴性对照组。
图11.利用脂质体转染含核定位信号的LtGs12-1和向导RNA真核表达载体定向切割细胞基因组靶标DNA。A.CRISPR-LtGs12-1系统介导的细胞基因组靶标基因定向基因编辑实验流程图；B.通过T7EN1酶切与Sanger测序技术检测针对人DNMT1的基因组切割活性；C.通过T7EN1酶切反应检测LtGs12-1系统介导的针对人RUNX1的基因组切割活性。
具体实施方式
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
核酸内切酶Genie scissor
Genie scissor(灵剪)核酸内切酶家族，其中Genie是精灵的意思，代表为细菌来源，scissor代表基因剪刀，表明其可能发挥的基因编辑功能。Genie scissor核酸内切酶对应的中文名称为“灵剪”核酸内切酶，Genie scissor基因编辑系统代表“灵剪”核酸内切酶介导的基因编辑系统，简称为“灵剪基因编辑”。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.基于宏基因组学方法挖掘新型向导RNA依赖型核酸内切酶
基于发明人搭建的新型向导RNA依赖型核酸内切酶的生物信息学鉴定流程，对全球微生物基因目录数据库(GMGC，Global Microbial Gene Catalog，https://gmgc.embl.de/)中的海量宏基因组测序数据进行了细菌编码蛋白深度挖掘。大致分析流程为：针对目标数据库中所有的contig序列，使用minced软件搜寻与定位CRISPR array，接着使用prodigal软件预测CRISPR array邻近表达的蛋白质，通过CD-hit软件对预测到的所有蛋白去冗余、并利用mega软件进行蛋白质聚类分析、利用hmmer软件进行CRISPR-Cas相似性蛋白鉴定与分类，最终获得3种新的未知细菌蛋白，发现它们分别来自氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae family)、毛螺菌科家族成员TF01-11(Lachnospiraceae bacteriumTF01-11)和毛螺菌科家族成员MC2017(Lachnospiraceae bacterium MC2017)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2、3所示，其核酸序列如SEQ ID NO：4、5、6所示。
通过系统发育进化树分析，发现这三种新的细菌蛋白分别位于不同CRISPR-Cas12a系统进化分支上(图1)，推测它们可能为新的RNA引导型核酸内切酶。本发明对这类来自不同细菌中新发现的蛋白命名为Genie scissor(灵剪)核酸内切酶。为了方便后续研究，进一步基于细菌种属来源，发明人将这3种新的未知细菌蛋白分别命名为AfGs12-1、LtGs12-1和LmGs12-1，其命名规则为：“细菌来源+核酸内切酶+数字编号”。
接着，发明人利用本地化blast程序，对这3种新发现的细菌蛋白与NCBI nr数据库进行序列相似性比对。结果发现，新的AfGs12-1蛋白与已知核酸内切酶LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a的氨基酸序列保守性分别为33.88％、34.38％和99.31％(图1)，接着再与NCBInr数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，发现其与已知类型Cas12a蛋白相似性最高为99.31％。与之相比，新发现的LtGs12-1与已报道LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a的氨基酸序列保守性分别为32.07％、31.41％和33.43％(图1)；当与NCBI nr数据库比对后，发现其与已知的其它类型Cas12a蛋白相似性最高仅为36.60％。另外，新发现的LmGs12-1与已报道LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a的氨基酸序列保守性分别为23.24％、22.80％和23.28％(图1)；进一步通过NCBI nr数据库比对，发现其与已知的其它类型Cas12a蛋白序列相似性最高仅为30.52％。由此可见，新发现的3种细菌蛋白，除了AfGs12-1与已知Cas12a的氨基酸序列相似性最高外，LtGs12-1和LmGs12-1与已知Cas12a的氨基酸序列相似性均低于37％。
进一步，发明人通过对这三种蛋白的基因座用CRISPRCasFinder软件进行分析。结果发现，其中AfGs12-1和LtGs12-1都具有CRISPR array序列，包含多个重复和间隔序列，以及Cas4、Cas1和Cas2蛋白。通过使用hmmer软件与Pfam数据库中的结构域序列进行隐马尔可夫模型比对分析，分析得到了REC1 domain(Alpha helical recognition lobe domain)，RuvC nuclease domain和NUC domain(Nuclease domain)，推测这两个新的细菌蛋白可能具有核酸切割活性；然而发现LmGs12-1蛋白的NUC结构域不完整，不确定其是否具有核酸切割活性(图2A、B、C)。接着发明人分别对AfGs12-1和LtGs12-1的同向重复序列(DR)二级结构通过RNAfold web server(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)在线网站进行预测与多序列比对，结果发现这两个新预测的细菌蛋白与已知Cas12a蛋白的DR二级结构类似，但存在一个碱基差异(图2D)。其中，AfGs12-1蛋白采用的向导RNA其DR序列为AAUUUCUACUCUUGUAGAU，而LtGs12-1蛋白采用的向导RNA其DR序列为AAUUUCUACUAUUGUAGAU。设计和构建sgRNA表达载体时，仅需将新发现蛋白的DR序列加上特异针对靶标基因的20个碱基组合即可(图2D)。
最后发明人对AfGs12-1和LtGs12-1的RuvC和Nuc结构域分别与已知的LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a蛋白进行氨基酸多序列比对。如图3所示，发现AfGs12-1与已知的AsCas12a蛋白结构域氨基酸序列高度一致，然而LtGs12-1和LmGs12-1蛋白的结构域与已知Cas12a蛋白的氨基酸序列相似性存在较大差别，因此亟需通过进一步实验确定它们是否具有核酸定向切割活性。
实施例2.向导RNA依赖型LtGs12-1和AfGs12-1核酸内切酶具有体外核酸切割活性
本实施例通过体外实验测试AfGs12-1、LtGs12-1和LmGs12-1蛋白对双链DNA的切割活性。利用与靶核酸配对的向导RNA引导Genie scissor蛋白识别并结合在靶核酸上，从而激发Genie scissor蛋白对靶核酸的切割活性，切割体系里的双链靶核酸。接着进行琼脂糖凝胶电泳观察目标条带大小变化来鉴定它们的酶切活性。
本实施例中选择靶标核酸为人FANCF基因，PAM为TTTG，其序列：
加粗部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUGUCGGCAUGGCCCCAUUCGC(下划线区域为靶向区)；先以HEK293T细胞基因组为模板(100ng)，以FANCF-F(GCCCTACATCTGCTCTCCCTCC)和FANCF-R(GGGCCGGGAAAGAGTTGCTG)为引物进行PCR扩增得到FANCF双链DNA。其次，通过大肠杆菌密码子优化后合成编码AfGs12-1、LtGs12-1和LmGs12-1蛋白的DNA序列，并分别在其C端加入NLS核定位信号，它们的DNA序列如SEQ ID NO：7、8、9所示。随后连接至pET-28a原核表达载体中，分别转化至大肠杆菌BL21菌株，鉴定阳性克隆后进行IPTG诱导表达，通过亲和层析纯化获得目的蛋白。体外切割反应采用如下体系：10×r2.1 NEBuffer2μL，预测的Geniescissor-NLS-tagged蛋白为500ng，向导RNA为500ng，FANCF靶标基因为100ng。37℃孵育30min。实验组添加向导RNA和靶标核酸，对照组不添加向导RNA。反应后通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，在UV照胶仪下进行成像观察3种预测的新型蛋白酶实验组和对照组的目标条带区别，并通过Image J软件分析切割效率(图4A)。
结果如图4B所示，与不加向导RNA的对照组相比，实验组中的AfGs12-1和LtGs12-1蛋白均能够切割反应溶液里的双链DNA，存在2条明显的切割条带，且切割效率分别为31.04％和32.51％。与此不同的是，LmGs12-1蛋白并不能切割双链DNA。由此可见，通过宏基因组学策略预测的3种细菌蛋白并不是跟预期推测一样均具有核酸切割活性。随后重点针对AfGs12-1和LtGs12-1核酸内切酶继续开展后续研究。
实施例3.CRISPR-LtGs12-1蛋白能特异识别PAM基序为HHV的靶标位点
通过PAM文库消减实验，对同源性低且具有体外目标核酸切割活性的LtGs12蛋白所识别的PAM序列进行了鉴定。其中随机混合PAM载体库构建流程为：合成DNA oligo序列GGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGNNNNNNNGAGAAGTCATTTAATAAGGCCACTGTTAAAAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTT，其中N为随机脱氧核苷酸。以Oligo-F：GGCCAGTGAATTCGAGCTCGG和Oligo-R：AAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA为上下游引物经PCR扩增后，以同源重组的方式连入pUC19载体，转化大肠杆菌后提取质粒即可形成随机混合PAM载体库。采用的向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUGAGAAGUCAUUUAAUAAGGCCACU(下划线区域为靶向识别序列)。
PAM文库消减实验：取Nde I酶切得到的线性化PAM文库质粒200ng，原核表达纯化的LtGs12-1蛋白1μg，体外转录PAM鉴定向导RNA 500ng，10×r2.1NEBuffer 2μL，DEPC水补齐至20μL。不加向导RNA的作为消减实验的对照组，分别在37℃孵育1h。用文库测序引物Seq-F：GGCCAGTGAATTCGAGCTCGG和PAM-Seq-R：CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACC进行PCR扩增，产物回收后分别将实验组和对照组进行二代高通量测序，对测序结果通过Weblogo3.0分析展示(图5A)。
鉴定LtGs12-1蛋白识别的PAM序列特征：对起始载体库中含有的16384种不同类型的PAM序列，分别统计它们在高通量测序中实验组和对照组中出现的次数高低，并用各自组所有PAM序列总数进行标准化。针对每条PAM消耗变化的计算方式为log2(对照组标准化值/实验组标准化值)，当该值大于3.5时，认为这条PAM被显著消耗。然后使用Weblogo3.0对显著消耗的PAM序列各位置碱基出现频率进行可视化展示。结果如图5B所示，发现LtGs12-1蛋白识别PAM序列为HHV(H＝T，A或C；V＝A，G或C)，这与已报道的Cas12a蛋白特异识别PAM为“TTTV”碱基组成序列存在较大差异。
进一步评估了LtGs12-1与已知LbCas12a蛋白靶标识别数量的差别。发明人通过生物信息学手段进行了深入比较研究(图6A)。其大致策略为：针对随机选择的10个人源基因、100个人源基因以及非洲猪瘟病毒基因组全长，通过CRISPR-offinder软件(www.biootools.com)分别设计符合LtGs12-1与LbCas12a蛋白识别要求的sgRNA，结果如图6B、C、D所示，发现这两个蛋白的靶标位点识别的数量存在较大差别，相对而言，新鉴定的LtGs12-1蛋白靶标位点识别的数量更为广泛。总之，与已知LbCas12a蛋白相比，新鉴定的LtGs12-1蛋白可实现更大基因组范围内的靶标位点定向编辑。
实施例4.CRISPR-LtGs12-1和AfGs12-1蛋白均可介导核酸现场可视化快速检测
进一步评估AfGs12-1和LtGs12-1蛋白是否具有反式切割(trans cleavage)活性。利用可以与靶核酸配对的向导RNA引导核酸内切酶Genie scissor识别并结合在靶核酸上；随之激发其对任意单链核酸的“反式切割”活性，从而切割反应体系里的单链DNA荧光-淬灭报告基因(ssDNA-FQ)；进一步可以通过激发的荧光强度、背景噪音和肉眼颜色变化来判断候选细菌蛋白的反式切割功能(图7A)。
本实施案例中采用的靶标双链DNA(dsDNA)为非洲猪瘟病毒ASFV的p72部分保守基因，序列如下：
加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。靶标单链DNA(ssDNA)为一段和向导RNA反向互补的引物，序列为：GAAAAACTAATGTCTGCTCTATCTACAACAGTAGAAAT。向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAGAGCAGACAUUAGUUUUUC(下划线区域为靶向区)。单链DNA荧光-淬灭报告基因序列为ROX-N12-BHQ2(5’ROX/GTATCCAGTGCG/3’BHQ2)。首先原核表达纯化出四种蛋白(AfGs12-1、LtGs12-1、LbCas12a和enAsCas2a)，体外转录出向导RNA和PCR扩增出p72靶基因双链DNA。接着采用以下反应体系：AfGs12-1、LtGs12-1或Cas12a蛋白500ng，向导RNA 500ng，2μL 10×r2.1 NEBuffer，20μM单链DNA荧光-淬灭报告基因(ROX-N12-BHQ2)和3μL的PCR扩增靶标产物/单链互补引物。阴性对照为不加靶标。37℃反应15min，98℃反应2min灭活。在自然光和蓝光下观察颜色变化，荧光强度和背景噪音，来判断体外上述四种蛋白的反式切割活性。
结果如图7B所示，从切割前后反应溶液颜色与荧光变化来看，新发现的LtGs12-1和AfGs12-1蛋白与已知的LbCas12a蛋白核酸反式切割活性基本一致；与增强型enAsCas12a相比，新鉴定的两个蛋白切割后，荧光背景噪音相对更低。由此可见，新发现的两个细菌蛋白均具有较高的反式切割活性，且具有相对较低的背景荧光信号，表明它们非常适合用于现场可视化核酸检测实验。由此成功建立了基于LtGs12-1或AfGs12-1系统介导的非洲猪瘟病毒核酸检测新技术。
接着评估了LtGs12-1系统介导的核酸检测技术最适酶切反应温度。采用上述的靶标作为核酸检测的位点进行以下体系反应：LtGs12-1蛋白500ng，向导RNA 500ng，2μL 10×r2.1 NEBuffer，1μM单链DNA荧光-淬灭报告基因(ROX-N12-BHQ2)和3μL的PCR扩增靶标产物。分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃以及65℃反应15min，98℃灭活2min。通过在蓝光下观察与酶标仪上精确判读荧光强度和背景噪音等。结果如图8所示，LtGs12-1蛋白酶切最适反应温度为30℃-50℃，且在37℃-45℃范围内相对最佳。
实施例5.评估CRISPR-LtGs12-1蛋白的特异性
进一步鉴定了CRISPR-LtGs12-1系统对非PAM区域单碱基错配识别能力。本实施案例中采用的靶标双链DNA(dsDNA)为非洲猪瘟病毒ASFV的p72部分保守基因，序列如下：
加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。首先PCR扩增出含有从1-24位连续靶标位点突变的双链DNA模板，分别以Target-F至Target-p72-F-20G引物为上游，以Target-p72-R引物为下游进行扩增得到靶标双链基因(图9A)。本发明使用的引物序列表如下：
其中向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAGAGCAGACAUUAGUUUUUC(下划线区域为靶向区)。单链DNA荧光-淬灭报告基因序列为ROX-N12-BHQ2(5’ROX/GTATCCAGTGCG/3’BHQ2)；首先原核表达纯化出LtGs12-1蛋白，体外转录向导RNA，PCR分别扩增p72单碱基突变的靶基因DNA。接着采用以下反应体系：LtGs12-1蛋白1μg，向导RNA 500ng，2μL 10×r2.1NEBuffer，1μM单链DNA荧光-淬灭报告基因(ROX-N12-BHQ2)和3μL的不同碱基突变的PCR扩增靶标产物。通过在蓝光下观察以及在酶标仪精确判读荧光强度和背景噪音等，来判断LtGs12-1蛋白的单碱基错配识别能力，并以此评估其识别特异性。
结果如图9B所示，与完全配对的阳性对照相比，存在单个碱基错配的位点能明显抑制LtGs12-1蛋白的核酸切割活性。由此可见，LtGs12-1蛋白对靶标位点的单个碱基错配较为敏感，反过来讲即表明其对靶标位点识别特异性较高，更有助于今后用于精准识别单核苷酸序列多态性(SNP)或基因组碱基修饰等。
实施例6.CRISPR-LtGs12-1可介导基因组高效定向编辑
对LtGs12-1蛋白切割细胞基因组的定向编辑能力进行了评估。本实施例首先通过LipofectamineTMCRISPRMAXTM将新发现的AfGs12-1和LtGs12-1与已知enAsCas12a和LbCas12a蛋白分别与向导RNA进行孵育。接着将各自形成的核糖核蛋白复合体RNP转染至人源HEK 293T细胞中，利用与靶核酸配对的向导RNA引导AfGs12-1、LtGs12-1或Cas12a蛋白识别并结合在靶核酸上，从而激发基因组切割活性。最后收集细胞和提取基因组DNA，并通过T7EN1酶切检测。
本实施例中选择靶标核酸为人FANCF基因，PAM为TTTG，其序列：
加粗部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUGUCGGCAUGGCCCCAUUCGC(下划线区域为靶向区)；在HEK 293T细胞融合度至70-80％进行铺板，12孔板中接种细胞数为8×104细胞/孔。铺板6-8h进行转染，预测的Genie scissor或Cas12a-NLS-tagged蛋白加入1.25μg和625ng向导RNA孵育后，与50μLopti-MEM以及2.6μL Cas9 plusTM reagent混匀；50μL opti-MEM中加入3μL的CRISPRTMreagent进行混匀。稀释好的CRISPRTM reagent与稀释后RNP混合均匀，室温孵育10min。孵育好的混合液加入铺有细胞的培养基中进行转染。37℃培养72h后，弃去培养基，用100μL PBS进行细胞重悬提取细胞的基因组。对转染阳性细胞的靶位点进行PCR扩增。通过T7EN1酶处理反应和琼脂糖凝胶电泳观察条带的变化来判断预测蛋白有无在体内基因编辑活性，同时通过Image J来粗略计算编辑效率(图10A)。阴性对照的模板为不转染RNP的正常培养HEK293T细胞基因组。结果如图10B所示，与不加RNP转染的阴性对照相比，实验组中的enAsCas12a、LbCas12a、AfGs12-1和LtGs12-1蛋白，通过T7EN1酶切反应和电泳检测，发现这四种蛋白均具有明显的细胞基因组编辑活性，它们的切割效率(Indel)分别为39.56％、30.11％、28.06％和30.08％，由此可见，新发现的AfGs12-1和LtGs12-1可用于细胞基因组定向或特异编辑。
进一步，本实施例通过将新发现LtGs12-1蛋白进行真核细胞密码子优化，并在其蛋白质的N与C端分别加入SV40 NLS和NLS核定位信号，序列如SEQ ID NO：10所示，将合成的序列构建至Lenti-puro慢病毒载体中，同时与向导RNA真核表达载体通过脂质体共转染至HEK 293T细胞中，利用与靶核酸配对的向导RNA引导LtGs12-1蛋白识别并切割靶标核酸分子，通过T7EN1酶切和琼脂糖凝胶电泳，以及Sanger测序检测其是否具有细胞基因组定向编辑活性(图11A)。
选择靶标核酸分别为人DNMT1基因，PAM为TTTC，其序列为：
加粗部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUA(下划线区域为靶向区)；以及人RUNX1基因，PAM为TTTC，其序列：
加粗部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。向导RNA序列分别为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCUGAUGG UCCAUGUCUGUUA；AAUUUCUACUAUUGUAGAUUGCUCCGAAGGUAAAAGAAAU(下划线区域为靶向区)。
在HEK 293T细胞融合度至70-80％进行铺板，12孔板中接种细胞数为8×104细胞/孔。铺板6-8h进行转染，向200μl Jetprime Buffer依次加入预测1μg的LtGs12-1真核表达载体或已知的enAsCas12a真核表达载体，1μg向导RNA表达载体和10μL Jetprime regent吹打混匀，室温孵育10min。孵育好的混合液加入铺有细胞的培养基中进行转染。37℃培养72h后，弃去培养基，用100μL PBS进行细胞重悬提取细胞的基因组。对转染阳性细胞的靶位点进行PCR扩增编辑附近的序列。通过T7EN1酶切反应和琼脂糖凝胶电泳观察目标条带变化，同时回收PCR产物连接进T载体进行Sanger测序。阴性对照的模板为不转染的正常培养HEK293细胞基因组。结果如图11B所示，LtGs12-1系统对DNMT1的基因组编辑活性为23.64％，Sanger测序结果显示在含有PAM的靶标识别区存在Indel突变(11B)。图11C所示中，LtGs12-1系统同样能特特异切割RUNX1基因，且其对细胞的基因组切割活性与增强型enAsCas12a接近。由此可见，发现新鉴定的LtGs12-1蛋白具有较高的细胞基因组切割编辑，表明该系统非常适合用于基因组定向编辑。
Claims (10)
1.CRISPR/Cas系统中的核酸内切酶，其特征在于，包括以下蛋白：
I、SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的AfGs12-1蛋白；
II、SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的LtGs12-1蛋白；
III、与SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列相比，具有80％以上的序列同一性的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能；
Ⅳ、与SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。
2.融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述蛋白和其他修饰部分。
3.分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述核酸内切酶的多核苷酸序列，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸。
4.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所的多核苷酸。
5.宿主细胞，其特征在于，所述宿主包含权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4所述的载体。
6.权利要求1所述的核酸内切酶，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的宿主细胞在基因编辑中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的基因编辑包括原核生物基因组、真核生物基因组或体外基因的修饰基因、敲除基因、改变基因产物的表达、修复突变或插入多核苷酸。
8.一种CRISPR/Cas基因编辑系统，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸内切酶，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要5所述的宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的CRISPR/Cas基因编辑系统，其特征在于，还包括能够结合权利要求1所述的核酸内切酶的同向重复序列和能够靶向目标序列的引导序列。
10.一种可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要1所述的核酸内切酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导RNA。
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