WO2021187554A1 - 耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体 - Google Patents

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WO2021187554A1
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nucleic acid
polypeptide
acid sequence
sequence
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裕之 松本
上森　隆司
白井　剛
石野　良純
園子 石野
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タカラバイオ株式会社
学校法人関西文理総合学園
国立大学法人九州大学
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    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Definitions

  • the present invention comprises a heat-resistant mismatched endonuclease variant that recognizes and cleaves a mismatched base pair in a double-stranded nucleic acid (hereinafter, may be simply referred to as a mismatch), and a composition containing the mismatched endonuclease variant. , And methods using mismatched endonuclease variants.
  • a method for analyzing these mutations in addition to directly analyzing the genome sequence, a method using an enzyme group that recognizes a mismatch has been performed.
  • One of them is an analysis method for detecting a mismatch formed by pairing mutant and wild-type DNA by binding a factor having a specific binding ability, and a typical example is Escherichia coli. Search for mutation sites using MutS, MutT, and MutL complexes can be mentioned (Patent Document 1).
  • a method using a mismatched endonuclease that specifically cleaves the mismatched site.
  • the presence or absence of mutation and its position are detected by analyzing a DNA fragment cleaved in the vicinity of the mismatch using a mismatched endonuclease.
  • a method using a CelI gene product derived from celery is known (Patent Document 2), and it is actually used for analysis of a mutant base.
  • this enzyme does not have heat resistance and cannot be directly used in methods involving high-temperature reaction processes such as the PCR method. Therefore, even when detecting a mutant base, four steps of amplification, mismatch formation, mismatch cleavage, and detection are required.
  • mismatched endonucleases are derived from Pyrococcus furiosus, Methanocaldococcus jannaschii, Thermococcus barophylus, and Thermococcus kodakarensis (Patent Document 3).
  • Patent Document 3 Other known mismatched endonucleases are derived from Pyrococcus furiosus, Methanocaldococcus jannaschii, Thermococcus barophylus, and Thermococcus kodakarensis.
  • these mismatched endonucleases recognize and cleave a plurality of mismatches in the recognition of mismatches (substrate specificity), and there is a problem in the substrate specificity.
  • the gene mutation to be detected may not match the substrate specificity of the mismatched endonuclease and cannot be analyzed as it is. In that case, there was no choice but to specifically detect the gene mutation by adding a properly designed nucleic acid called an inhibitory oligonucleotide to the reaction system (Patent Document 5).
  • Nucleic acid amplification technology is another biotechnology that has a great influence in addition to mutation analysis.
  • the polymerase chain reaction (PCR) method which is a typical technique in this nucleic acid amplification technique, is a technique for easily amplifying a desired nucleic acid fragment in vitro, and is used not only for research on genes but also for living organisms. It has become an indispensable experimental method in a wide range of fields such as science, medicine, and agriculture.
  • the PCR method is also applied to the detection of mutant genes and the analysis of DNA methylation.
  • the isothermal nucleic acid amplification method such as the LAMP method and the ICAN method does not require special equipment, it is used as a cheaper nucleic acid detection method.
  • the whole genome amplification method is an important technique for the analysis from a particularly rare sample.
  • Nucleic acid amplification technology is also used not only for amplifying DNA having a specific base sequence, but also for amplifying a mixture of DNA that holds a common base sequence region at both ends. Specific examples include the construction of a genomic library and a cDNA library. At that time, DNA molecules having a high content are preferentially amplified, which causes obstacles to analysis and screening of various types of DNA. May become.
  • Non-Patent Document 1 An SSH-PCR method that combines a PCR method and self-hybridization is also used (Non-Patent Document 2), but there is a risk that DNA having homology with DNA having a high content rate will also be removed.
  • the amplification of the DNA to be detected and the amplification of the DNA not to be detected may compete with each other. That is, it is a case where DNA other than the detection target is also amplified at the same time and it is difficult to detect the target DNA.
  • the DNA not to be detected is excessively excessive with respect to the DNA to be detected. If present, it is difficult to detect the DNA to be detected because of the false positive reaction caused by the DNA that is not the detection target.
  • Such problems include, for example, detection of a small number of mutant alleles in the presence of normal alleles (such as detection of circulating tumor DNA in blood), detection of a small number of methylated or unmethylated alleles in epigenetic assays, It can occur in performing such as detection of small amounts of fetal DNA sequences circulating in the mother's blood.
  • Non-Patent Document 3 a method called an enrichment PCR method or a restriction endonucleose-mediated Selective polymerase chain reaction (REMS PCR) method has been developed (Non-Patent Document 3).
  • This method uses a heat-resistant restriction enzyme, for example, a DNA having a mutant base sequence using a primer designed so that cleavage by this restriction enzyme occurs only when the template has a normal base sequence.
  • This is a method of selectively detecting only.
  • thermostable restriction enzyme having a recognition sequence suitable for selective detection by REMS PCR.
  • An object of the present invention is the use of a thermostable mismatched endonuclease variant having improved specificity for mismatches as compared to conventional mismatched endonucleases, a composition containing the mismatched endonuclease variant, and the mismatched endonuclease variant.
  • mismatched endonuclease mutant capable of specifically cleaving a GG mismatch
  • a mismatched endonuclease variant capable of specifically cleaving a TT mismatch.
  • the mismatched endonuclease is originally a homodimer
  • the creation of a mismatched endonuclease variant capable of specifically cleaving the GT / TG mismatch by connecting the monomers of the two variants with a linker. succeeded in.
  • the present invention was completed.
  • G guanine
  • Amino acid substitutions or mutations in the substituted or mutated amino acid sequence are retained; (4) A polypeptide having an amino acid sequence having 50% or more identity with respect to the substituted or mutated amino acid sequence according to the above (1) or (2), however, according to the above (1) or (2).
  • the amino acid substitution or mutation in the substituted or mutated amino acid sequence is retained, or (B) is a polypeptide selected from the group consisting of (5) to (8) below, and is a mismatched base in a double-stranded nucleic acid.
  • T thymine
  • a polypeptide containing an amino acid sequence substituted with an amino acid residue or a sulfur-containing amino acid residue A polypeptide containing an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acid residues are further mutated in the substituted amino acid sequence described in (5) above, except that the above mutations are substituted, deleted, inserted, and / Or an addition, the amino acid substitutions in the substituted amino acid sequence described in (5) above are retained; (7) A polypeptide containing an amino acid sequence having 50% or more homology to the substituted or mutated amino acid sequence according to the above (5) or (6), but according to the above (5) or (6).
  • the basic amino acid residue is lysine, arginine, or histidine
  • the acidic amino acid residue is aspartic acid or glutamic acid
  • the neutral (polar uncharged) amino acid is threonine, serine, asparagine, glutamine, Tyrosine, or cysteine
  • the sulfur-containing amino acid is cysteine or methionine
  • the hydrophobic (non-polar) amino acid is alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, tryptophan, phenylalanine, or methionine
  • the polypeptide described [3] The polypeptide according to [1] or [2], which comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 15 in the sequence listing.
  • [4] A nucleic acid encoding the polypeptide according to any one of [1] to [3].
  • [6] An expression vector containing the nucleic acid and expression regulatory sequence according to [4] or [5].
  • [7] A cell expressing a polypeptide having mismatched endonuclease activity transformed with the expression vector described in [6].
  • [8] A method for cleaving a double-stranded nucleic acid having a mismatch, which comprises a step of allowing the polypeptide according to any one of [1] to [3] to act on the double-stranded nucleic acid.
  • a method for suppressing the amplification of a nucleic acid containing a specific base sequence which comprises a step of performing a nucleic acid amplification reaction in the presence of the following (a) to (d): (A) Oligodeoxynucleotides designed to cause one or several mismatches when hybridized with a nucleic acid containing the specific base sequence or its complementary strand; (B) DNA polymerase; (C) At least a pair of oligonucleotide primers; and (d) the polypeptide according to any one of [1] to [3].
  • nucleic acid amplification reaction is a polymerase chain reaction (PCR) method or an isothermal nucleic acid amplification method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • [16] The method according to [15], wherein the single nucleotide polymorphism mutation is a single nucleotide polymorphism mutation that correlates with the therapeutic effect of canceration or a therapeutic agent for cancer, and [17] is selected from the following group. Dimer form polypeptide: (1) A homodimer having the polypeptide according to [1] (A) as a subunit, (2) A homodimer having the polypeptide described in [1] (B) as a subunit, and a heterodimer having the polypeptide described in (3) [1] (A) and [1] (B) as a subunit. Regarding.
  • thermostable mismatched endonuclease variant having high utility value in biotechnology, a composition containing the mismatched endonuclease variant, and a method using the mismatched endonuclease variant.
  • mismatch means a pair of bases different from the Watson-click base pair existing in the double-stranded nucleic acid, that is, G (guanine base) -C (cytosine base), A (adenine base) -T. Shows a base pairing of a combination other than the base pairing of (thymine base) or U (uracil base).
  • GG-specific means specificity for GG mismatch
  • TT-specific means specificity for TT mismatch
  • GT / TG-specific means GT or TT-. It is shown that each has specificity for G mismatch. In other words, it indicates that it does not recognize anything other than the mismatch.
  • the "polypeptide having a mismatched endonuclease activity" refers to a nuclease having an activity of cleaving a mismatched site in a double-stranded nucleic acid.
  • the mismatched endonuclease activity includes the activity of cleaving the phosphodiester bond adjacent to the nucleotide forming the mismatch, and the phosphate adjacent to the nucleotide 1 to 5 base pairs, preferably 1 to 3 base pairs away from the mismatch. Includes activity to cleave diester bonds.
  • the mismatched endonuclease preferably has an activity of specifically recognizing a specific mismatch and cleaving a double-stranded nucleic acid.
  • the heat-resistant mismatched endonuclease means a nuclease that exhibits an activity of cleaving a mismatched site in a double-stranded nucleic acid at a temperature of 50 ° C. or higher, and in the present invention, the heat-resistant mismatched endonuclease.
  • the use of nucleases is preferred.
  • the mismatched endonuclease in the present invention is an enzyme that forms a dimer and exhibits activity. It is known that when a monomer (monomer; also called a "subunit” indicating a component of a dimer) of the protein is expressed using Escherichia coli or the like as a host, it naturally associates to form a dimer (homodimer). Has been done. Further, in the present specification, "a polypeptide having an activity of cleaving a nucleic acid chain having guanine (G) forming a mismatched base pair in a double-stranded nucleic acid” and "a mismatched base pair in a double-stranded nucleic acid” are used. The "polypeptide having an activity of cleaving the forming nucleic acid chain having timine (T)” refers to each of the above-mentioned monomers.
  • Amino acids can be classified into hydrophilic (polar) and hydrophobic (non-polar) based on their chemical properties.
  • Hydrophilic (polar) amino acids include acidic amino acids, basic amino acids, neutral (polar uncharged) amino acids, tyrosine among amino acids having an aromatic ring, and cysteine among sulfur-containing amino acids.
  • Hydrophobic (non-polar) amino acids include amino acids having an aliphatic side chain, tryptophan and phenylalanine among amino acids having an aromatic ring, and methionine among sulfur-containing amino acids.
  • Acidic amino acids include aspartic acid (Asp, D) and glutamic acid (Glu, E).
  • Basic amino acids include lysine (Lys, K), arginine (Arg, R), and histidine (His, H).
  • Neutral (polarly uncharged) amino acids include threonine (Thr, T), serine (Ser, S), asparagine (Asn, N), glutamine (Gln, Q), tyrosine (Tyr, Y), and cysteine (Cys). , C) are included.
  • Amino acids with an aromatic ring include tyrosine (Tyr, Y), tryptophan (Trp, W), and phenylalanine (Phe, F).
  • Sulfur-containing amino acids include cysteine (Cys, C) and methionine (Met, M).
  • Amino acids with aliphatic side chains include alanine (Ala, A), glycine (Gly, G), valine (Val, V), leucine (Leu, L), isoleucine (Ile, I), and proline (Pro, P). ) Is included.
  • Proline is an imino acid having a cyclic side chain.
  • similar amino acids refer to amino acids having the same classification in the classification based on the chemical properties of the above amino acids. For example, lysine, arginine, and histidine are all similar amino acids because they are all classified as basic amino acids.
  • amino acid sequence homology means the similarity (homology or similarity) of the polypeptide sequence in consideration of the above-mentioned similar amino acids. Therefore, in the classification based on the chemical properties of the above amino acids, amino acids belonging to the same classification are considered to be "homologous".
  • amino acid sequence identity means the identity of a polypeptide sequence that does not consider that they are similar amino acids.
  • base sequence identity means the identity of the polynucleotide sequence.
  • a known program can be used to calculate the scores of the amino acid sequence homology, amino acid sequence identity, and base sequence identity.
  • the present invention is not limited in any way, for example, BLAST, BLAST, FASTA, SSEARCH, MPsrch and the like can be used.
  • the amino acid number (also referred to as amino acid position) used in the present invention is based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Therefore, the position of the amino acid specified by the amino acid number in the present specification is this when counted from the N-terminal of the homologous protein derived from another organism or the protein in which a mutation is introduced into the polypeptide of SEQ ID NO: 1. It may differ from the position indicated by the number.
  • the "position corresponding to (or corresponding to) the 47th position of the amino acid sequence of the wild-type mismatched end nuclease” is the wild-type amino acid sequence (sequence) using a known algorithm (BLASTp, CrystalOmega, etc.).
  • the amino acid residue considered to be at the same position as the amino acid residue at position 47 in the wild-type amino acid sequence can be identified. Point to.
  • the "target nucleic acid” or “target DNA” is a nucleic acid that is not cleaved by the mismatched endonuclease variant of the present invention. In other words, it is a nucleic acid to be amplified (template) in the amplification method of the present invention.
  • the "non-target nucleic acid” or “non-target DNA” is a nucleic acid that is cleaved by the mismatched endonuclease variant of the present invention. In other words, it is a nucleic acid that is not subject to amplification in the amplification method of the present invention because it is cleaved in the cleavage method of the present invention.
  • the "target nucleic acid” or “target DNA” and the "non-target nucleic acid” or “non-target DNA” are not particularly limited and may be any nucleic acid that is desired to be distinguished from each other.
  • a first aspect of the present invention relates to mismatched endonuclease variants, i.e., variants of mismatched endonucleases with altered substrate specificity.
  • the mismatched endonuclease variant contributes to substrate recognition / cleavage in a wild-type mismatched endonuclease derived from Pyrococcus furiosus (sometimes referred to as PfuNucS) or its homologue, or a variant having a mismatched endonuclease activity of PfuNucS. It is characterized in that the amino acid sequence of the site is changed.
  • the mismatched end nuclease variant of the present invention is not particularly limited to the present invention, but is a polypeptide derived from Pyrococcus furiosus PF_RS00065 (RefSeq ID: WP_11011124.1, SEQ ID NO: 1, former name: PF0012, former RefSeq ID: NP_577741).
  • polypeptide W77F (SEQ ID NO: 2) in which the tryptophan residue at position 77 of PF_RS00065 is replaced with phenylalanine
  • polypeptide MJ_RS01180 (RefSeq ID: NP_247194) derived from Methanocaldococcus jannaschii, which is a homologue of PF_RS00065.
  • MJ_0225 the polypeptide derived from Thermococcus barophylus TERMP_01877 (RefSeq ID: YP_004072075, SEQ ID NO: 4), and the polypeptide derived from the amino acid substitution KOD1 strain (JCM 12380T) of Thermococcus kodakarensis KOD1 strain (JCM 12380T).
  • the mismatched endonuclease variant of the present invention is preferably a thermostable enzyme.
  • a polypeptide that stably retains its activity even during a thermal cycle such as PCR is preferable, and is preferably 50 ° C. or higher, preferably 60 ° C. or higher, more preferably 70 ° C. or higher, and more preferably 70 ° C. or higher.
  • a polypeptide that does not inactivate at 90 ° C. or higher can be used in the method of the present invention.
  • the mismatched endonuclease variant of the present invention includes the polypeptides shown in (A) and / or (B) below.
  • a mismatched endonuclease variant consisting of the polypeptides shown in (A) and / or (B) below is exemplified.
  • Amino acid substitutions or mutations in the substituted or mutated amino acid sequence are retained; (4) A polypeptide containing an amino acid sequence having 50% or more identity with respect to the substituted or mutated amino acid sequence according to the above (1) or (2), but according to the above (1) or (2). Amino acid substitutions or mutations in the substituted or mutated amino acid sequence are retained.
  • a polypeptide containing an amino acid sequence substituted with an amino acid residue or a sulfur-containing amino acid residue A polypeptide containing an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acid residues are further mutated in the substituted amino acid sequence described in (5) above, except that the above mutations are substituted, deleted, inserted, and / Or an addition, the amino acid substitutions in the substituted amino acid sequence described in (5) above are retained; (7) A polypeptide containing an amino acid sequence having 50% or more homology to the substituted or mutated amino acid sequence according to the above (5) or (6), but according to the above (5) or (6).
  • Amino acid substitutions or mutations in the substituted or mutated amino acid sequence are retained; (8) A polypeptide containing an amino acid sequence having 50% or more identity with respect to the substituted or mutated amino acid sequence according to (5) or (6) above, except for the above (5) or (6). Amino acid substitutions or mutations in the substituted or mutated amino acid sequence are retained.
  • a polypeptide having a GG-specific mismatched endonuclease activity is provided.
  • the polypeptide having the GG-specific mismatched endonuclease activity include the polypeptide shown in (A) above.
  • serine at position 47 is a basic amino acid residue and position 76.
  • An example is a polypeptide comprising an amino acid sequence in which asparagine is replaced with an acidic amino acid residue, respectively.
  • a polypeptide containing an amino acid sequence in which leucine at position 123 is replaced with an amino acid residue having an aliphatic side chain is also GG-specific. It is exemplified as a polypeptide having a high mismatched endonuclease activity. More preferably, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a polypeptide in which serine at position 47 is replaced with lysine, arginine, or histidine and aspartic acid at position 76 is replaced with aspartic acid or glutamic acid is exemplified.
  • a polypeptide in which leucine at position 123 is replaced with alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, or proline in addition to the amino acid substitutions at positions 47 and 76 is exemplified.
  • a polypeptide having a TT-specific mismatched endonuclease activity is provided.
  • the polypeptide having the TT-specific mismatched endonuclease activity include the polypeptide shown in (B) above.
  • glutamine at position 78 is replaced with a basic amino acid residue and 123.
  • An amino acid sequence in which leucine at position is replaced with a neutral (polarly uncharged) amino acid residue or sulfur-containing amino acid residue, or leucine at position 125 is replaced with a hydrophobic amino acid residue or sulfur-containing amino acid residue.
  • Polypeptides containing are exemplified. More preferably, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, glutamine at position 78 is replaced with lysine, arginine, or histidine, and leucine at position 123 is replaced with threonine, serine, asparagine, glutamine, tyrosine, cysteine, or methionine. Or, a polypeptide comprising an amino acid sequence in which leucine at position 125 is replaced with alanine, glutamine, valine, isoleucine, proline, tryptophan, phenylalanine, cysteine or methionine is exemplified. More preferably, leucine at position 125 may be replaced with an amino acid having an aliphatic side chain other than leucine.
  • the polypeptide having the GG-specific mismatched endonuclease activity and the polypeptide having the TT-specific mismatched endonuclease activity may be in the form of a homodimer.
  • the above-mentioned polypeptide having GG-specific mismatched endonuclease activity expresses a monomer of the polypeptide using Escherichia coli or the like as a host, it naturally associates to form a dimer (homodimer). , Shows the activity. The same applies to the above-mentioned polypeptide having TT-specific mismatch endonuclease activity.
  • the present invention also provides a polypeptide having GT / TG-specific mismatched endonuclease activity.
  • the polypeptide having the GT / TG-specific mismatched endonuclease activity include the polypeptide shown in (A) above and a heterodimer protein containing the polypeptide shown in (B) above.
  • a heterodimer protein containing the above-mentioned polypeptide having a GG-specific mismatched endonuclease activity and a polypeptide having a TT-specific mismatched endonuclease activity is exemplified.
  • the heterodimer protein is a dimer of a polypeptide having the GG-specific mismatched endonuclease activity and a polypeptide having the TT-specific mismatched endonuclease activity, using, for example, Escherichia coli as a host. It can be produced by expressing it so as to form.
  • a polypeptide having GG-specific mismatched endonuclease activity and a polypeptide having TT-specific mismatched endonuclease activity are expressed separately, dissociated into monomers by an arbitrary method, and then mixed and reassociated. You may let me.
  • a polypeptide having a GG-specific mismatched endonuclease activity and a polypeptide having a TT-specific mismatched endonuclease activity are expressed as a single polypeptide via a linker.
  • a linker There is no limitation on the arrangement within the one polypeptide. It may be [polypeptide having GG-specific mismatched endonuclease activity]-[linker]-[polypeptide having TT-specific mismatched endonuclease activity] or [polypeptide having TT-specific mismatched endonuclease activity]. ]-[Linker]-[Polypeptide with GG-specific mismatched endonuclease activity].
  • the linker is preferably a peptide linker.
  • the amino acid sequence of the peptide linker and the number of residues (length) thereof are not limited, and any sequence and number of residues that do not inhibit heterodimerization and cleavage of the double-stranded nucleic acid are preferably used in the present invention. be able to.
  • the mismatched endonuclease mutant of the present invention has a substrate specificity (GG, TT, or GT / TG) of the mutant. Mutations in other amino acid positions may be included as long as the mismatch specificity) is not lost. Examples of other amino acid position mutations are not particularly limited, but are resistant to mutations and inhibitors that improve heat resistance as long as the substrate specificity of the mismatched endonuclease mutant of the present invention is maintained. Examples include mutations that improve and amino acid mutations that improve the properties of mismatched endonucleases.
  • the "mutation" may be any of an amino acid substitution mutation, an amino acid insertion mutation, an amino acid deletion mutation, or an amino acid addition.
  • the mismatched endonuclease variant of the present invention containing mutations in other amino acid positions is the amino acid substitution described in (A) (1) and (B) (5) above.
  • it may further contain an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acid residues are mutated.
  • the mismatched endonuclease variant of the present invention containing a mutation in another amino acid position is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 containing the amino acid substitutions described in (A) (1) and (B) (5) above, or It may contain an amino acid sequence having 50% or more homology with respect to the amino acid sequence in which 1 to 10 amino acid residues are further mutated in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 containing the amino acid substitution.
  • the 50% or more homology means, for example, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, or 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more. More preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more homology of amino acid sequences.
  • the mismatched endonuclease variant of the present invention containing a mutation in another amino acid position is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 containing the amino acid substitutions described in (A) (1) and (B) (5) above, or It may contain an amino acid sequence having 50% or more identity with respect to the amino acid sequence in which 1 to 10 amino acid residues are further mutated in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 containing the amino acid substitution.
  • the 50% or more identity means, for example, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, or 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more. More preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more amino acid sequence identity is included.
  • affinity tags include histidine (His) tag, Flag tag, HA tag, c-myc tag, glutathione S-transferase (GST) tag, and maltose binding protein (maltose binding) in which 4 to 8 His residues are consecutive.
  • Known examples include protein (MBP) tags and Strep (II) tags consisting of 8-residue amino acids (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys).
  • these tags can be linked to variants of the invention via a linker containing 1-15 amino acids.
  • polypeptides containing recognition sequences for such affinity tags, linkers, and / or proteases for cleavage of fusion polypeptides are also exemplified as mismatched endonuclease variants of the invention that contain mutations in other amino acid positions.
  • a mismatched endonuclease variant of the invention containing mutations in other amino acid positions can be an affinity tag, linker, within the range of 1-10 mutant amino acid residues, amino acid homology, or amino acid identity described above. , And / or the recognition sequence of the fusion polypeptide cleavage protease.
  • the mismatched endonuclease mutant of the present invention may contain an artificial amino acid (or also referred to as an unnatural amino acid).
  • artificial amino acids include tyrosine halide (chloro, bromo, iodo), tyrosine sulfate, azidotyrosine, acetyllysine, azidophenylalanine, fluorophenylalanine and the like.
  • the method for substituting a natural amino acid for an artificial amino acid is not particularly limited, and a known method can be used.
  • mismatched endonuclease variant of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a variant consisting of any of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 6 to 15.
  • mismatched endonuclease mutant of the present invention is suitably used in various uses described later, for example, in a method of excluding DNA containing a specific DNA sequence and amplifying and detecting other DNA.
  • the activity of the mismatched endonuclease can be measured using a double-stranded nucleic acid containing the mismatch as a substrate. Specifically, the activity is measured by reacting an excess amount of a double-stranded nucleic acid containing a mismatch with a mismatched endonuclease and measuring the amount of cleaved nucleic acid per unit time.
  • the cleaved double-stranded nucleic acid can be separated and quantified from the nucleic acid that has not been cleaved by electrophoresis or the like.
  • a double-stranded nucleic acid double-labeled with a fluorescent substance and a quenching substance is used so that an increase in fluorescence intensity can be detected only when the reaction solution is cleaved
  • the fluorescence intensity in the reaction solution can be measured at appropriate time intervals. By doing so, the activity can be easily measured. It is also possible to investigate the cleavage activity for a specific mismatch by changing the base of the mismatch in the double-stranded nucleic acid as a substrate.
  • nucleic acid encoding a mismatched endonuclease variant can be provided.
  • a nucleic acid encoding the above-mentioned mismatched endonuclease mutant of the present invention is provided.
  • the nucleic acid encoding the mismatched endonuclease variant of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids containing a base sequence encoding the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 6 to 15. More preferably, as the nucleic acid encoding the mismatched endonuclease variant of the present invention, a nucleic acid containing the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 21 to 30 is exemplified.
  • Table 1 shows the amino acid sequence of the polypeptide prepared in the examples of the present application and the nucleic acid sequence encoding the same as an example of the mismatched endonuclease variant of the present invention.
  • the nucleic acid encoding the mismatched endonuclease variant of the present invention is not particularly limited as long as it is composed of codons encoding a protein that can be expressed in the host used and has reverse transcriptase activity. Codon optimization may be performed to allow expression in the host or to increase expression. The codon optimization is preferably performed by a method commonly used in the art.
  • the expression vector of the present invention comprises a nucleic acid encoding the mismatched endonuclease variant of the invention and an expression regulatory sequence operably linked to the nucleic acid. include.
  • the expression vector used in the present invention is not particularly limited as long as it is an expression vector usually used in this field.
  • a vector capable of autonomous replication in a host cell or a vector capable of being integrated into a host chromosome can be used.
  • a vector compatible with the host may be used.
  • a plasmid vector for example, a plasmid vector, a phage vector, a viral vector, or the like
  • a plasmid vector a plasmid suitable for the host to be used, for example, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus spp., And a plasmid derived from yeast are well known to those skilled in the art, and many of them are commercially available. These known plasmids and variants thereof can be used in the present invention.
  • phage vector for example, ⁇ phage and the like
  • virus vector for example, an animal virus such as a retrovirus and a vaccinia virus, and an insect virus such as a baculovirus
  • many heterologous protein expression systems using yeast, insect cells, and mammalian cells as hosts have been constructed, and are already commercially available. These expression systems may be used in the production of the mismatched endonuclease variant of the present invention.
  • the promoter to be mounted on the expression vector of the present invention can be selected according to the host.
  • promoters derived from Escherichia coli such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter and phages and their variants are used. It can be used, but is not limited to the above.
  • an expression system for example, a pET expression system in which a phage-derived promoter and an RNA polymerase gene are combined may be used.
  • the expression vector of the present invention may further contain a nucleic acid encoding an affinity tag.
  • the nucleic acid encoding the affinity tag is inserted into the vector so that the fusion protein of the mismatched endonuclease variant of the invention and the affinity tag is expressed.
  • affinity tags include histidine (His) tag, glutathione S-transferase (GST) tag, maltose binding protein (MBP) tag, and 8-residue amino acid.
  • An example is a nucleic acid encoding a Strep (II) tag or the like consisting of (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys).
  • the tag may be added at any of the 5'end and / or 3'end side of the nucleic acid encoding the mismatched endonuclease mutant of the present invention, as long as it is appropriately added at a position that does not interfere with expression and tag function. good.
  • the tag is preferably a tag that can be cleaved at the purification stage of the expressed polypeptide or after purification.
  • such cleaving tags include, for example, fusion polypeptides such as Factor Xa, PreScision Protein, Thrombin, Enterokinase, and TEV Protease (Tobacco Etch Virus Protein).
  • fusion polypeptides such as Factor Xa, PreScision Protein, Thrombin, Enterokinase, and TEV Protease (Tobacco Etch Virus Protein).
  • tags containing nucleic acids encoding the recognition sequences of cleavage proteases include, for example, fusion polypeptides such as Factor Xa, PreScision Protein, Thrombin, Enterokinase, and TEV Protease (Tobacco Etch Virus Protein).
  • the expression vector of the present invention further contains one or more expression regulatory sequences.
  • the expression regulatory sequence is not particularly limited, and examples thereof include a promoter, a gene involved in the regulation of the promoter, a ribosome binding sequence, a polyadenylation signal, a transcription termination sequence (transcription terminator), an enhancer, and the like. Further, it may contain a gene encoding an origin of replication (origin), a marker used for selecting a transformant (drug resistance gene, a fluorescent marker, a luminescent marker), and a base sequence for enhancing translation efficiency.
  • the cells (hosts) transformed with the vector expressing the mismatched endonuclease variant of the present invention are particularly limited as long as they are hosts commonly used in the art. There is no. For example, bacteria (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, filamentous fungi, insect cells, eukaryotic cells, animal cells (mammalian cells including human cells, etc.) can be used.
  • bacteria Esscherichia coli, Bacillus subtilis, etc.
  • yeast filamentous fungi
  • insect cells eukaryotic cells
  • animal cells mammalian cells including human cells, etc.
  • prokaryotic cells for example, the genus Escherichia such as Escherichia coli (Escherichia coli), the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, the genus Pseudomonas putida, the genus Pseudomonas putida, etc. -Bacteria belonging to the genus Bacillus such as Rhizobium meliloti can be used as host cells.
  • Escherichia coli that can be used for producing heterologous proteins is well known to those skilled in the art, and many are commercially available (for example, Escherichia coli BL21T1R, Escherichia coli BL21, E.
  • Bacillus subtilis MI114 which is a bacterium of the genus Bacillus, B.I. Subtilis 207-21 and the like, which are Brevibacillus genus bacteria, and Brevibacillus choshinensis and the like are known as hosts for producing heterologous proteins. These host cells can be combined with a suitable expression vector and used to produce the mismatched endonuclease variants of the invention.
  • E. coli strain BL21 strain, E. coli strain E. coli. colli BL21T1R and BL21DE3 can be preferably used.
  • the method for introducing the expression vector into the host is not particularly limited as long as it can introduce nucleic acid into the host, and examples thereof include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, and a lithium acetate method. Can be used.
  • the method for introducing the expression vector into the insect cell is not particularly limited as long as DNA can be introduced into the insect cell, and for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method or the like can be used.
  • a phage vector or a viral vector can infect a host cell by a method corresponding to these vectors to obtain a transformant expressing the mismatched endonuclease variant of the present invention.
  • the above transformant can be cultured to obtain the mismatched endonuclease mutant of the present invention from the culture.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as they are suitable for the expression vector to be used, the host, and the like.
  • the present invention is not limited in any way, for example, when Escherichia coli BL21DE3 strain is transformed with a pET vector, the transformant is inoculated into LB medium and cultured with shaking at 37 ° C. When the OD of the culture solution reaches 0.2 to 0.8, IPTG is added to induce the expression of the target protein, for example, at 15 to 30 ° C. for 2 to 5 hours, preferably 25 ° C. for 4 to 5 hours. Incubate with shaking for hours.
  • a crushed product containing the variant of the present invention can be obtained by ultrasonic crushing treatment or lysis treatment with lysozyme. Since the crushed product contains a large amount of contaminants, the purification method used in this field, for example, ammonium sulfate precipitation method, anion exchange column, cation exchange column, gel filtration column, affinity chromatography column, dialysis, etc., may be appropriately combined. It is desirable to purify the variants of the invention.
  • the mutant to which the affinity tag has been added can be easily purified by using an affinity carrier according to the properties of the affinity tag. Further, depending on the type of host or expression vector used, in addition to IPTG, other necessary inducers such as L-arabinose may be added at an appropriate timing.
  • the method for producing a nucleic acid of the present invention is, for example, in a nucleic acid encoding a mismatched end nuclease that is a homologue of the polypeptide PF_RS00065 or a mutant polypeptide W77F thereof, or RS_00065.
  • the substitution of the codon corresponding to serine is preferably substituted with the codon corresponding to arginine or lysine.
  • substitution with the codon corresponding to arginine is particularly preferred. Codons can be substituted at amino acid residues at other positions as well.
  • mismatched endonuclease variants of the invention may be combined with mutations at other amino acid positions. Even in that case, it is possible to replace the codon in the same manner.
  • nucleic acids of SEQ ID NOs: 16 to 30 in the sequence listing are suitable.
  • the codon conversion may be carried out by a known method and is not particularly limited, but for example, mutagenesis by a known method such as site-specific mutagenesis using a mutagenesis primer, or a sequence (or sequence) after mutagenesis. It can be carried out by artificial synthesis of a nucleic acid having (a part of).
  • codon optimization may be performed to allow expression in the host used or to increase expression. The codon optimization can be performed by methods commonly used in the art.
  • codon substitutions for stabilizing and improving protein production in the host may be combined in the nucleic acid encoding the mismatched endonuclease mutant.
  • the method for producing nucleic acid of the present invention includes the above 2.
  • the nucleic acid described in the above can be applied.
  • the method for cleaving double-stranded nucleic acid of the present invention is to prepare a double-stranded nucleic acid having a mismatch in an appropriate buffer containing a divalent metal ion (for example, magnesium ion). , The above 1. It is carried out by allowing the mismatched endonuclease variant of the present invention described in the above to act.
  • a divalent metal ion for example, magnesium ion
  • a double-stranded nucleic acid having a mismatch in the method for cleaving a double-stranded nucleic acid of the present invention is double-stranded as long as there is a mismatch inside (between two base pairs that perform normal base pairing).
  • the nucleic acid is not limited to one in which one mismatch is present, and a plurality of mismatches may be present at intervals, or two or more consecutive mismatches may be present.
  • the mismatch in the method for cleaving the double-stranded nucleic acid of the present invention is preferably 1 to 8 consecutive mismatches existing inside the double-stranded nucleic acid, more preferably 1 to 4 consecutive mismatches, and even more preferably.
  • the plurality of mismatches when a plurality of mismatches are present in the double-stranded nucleic acid, the plurality of mismatches may be the same type of mismatch or may be different types of mismatches. You may.
  • oligodeoxynucleotides disclosed in International Publication No. 2014/142261 pamphlet and the like may be combined.
  • the oligodeoxynucleotide is an oligodeoxynucleotide designed to cause one or several mismatches when hybridized with a nucleic acid having a specific base sequence (for example, a gene mutation of interest). be.
  • a nucleic acid having a specific base sequence for example, a gene mutation of interest.
  • the chain length of the oligodeoxynucleotide can be appropriately determined so that the nucleic acid having the specific base sequence can hybridize with the oligodeoxynucleotide under the conditions of the reaction to be carried out. Further, it is desirable that the position where a mismatch occurs when hybridized with a nucleic acid having a specific base sequence is at least 3 nucleotides away from both the 5'end and 3'end of this oligodeoxynucleotide.
  • the inhibitory oligonucleotide disclosed in International Publication No. 2016/152812 pamphlet may be combined.
  • the inhibitory oligonucleotide means that at least one mismatch occurs when hybridized with the non-target nucleic acid, and the mismatch occurs when hybridized with the non-target nucleic acid when hybridized with the target nucleic acid. Is also an oligonucleotide that causes many mismatches.
  • the number of at least one mismatch that occurs when the inhibitory oligonucleotide is hybridized with the non-target nucleic acid is not particularly limited as long as the selective cleavage of the non-target nucleic acid occurs, and depends on the chain length of the inhibitory oligonucleotide. However, for example, 1 to 7, 1 to 5, or 1 to 3 can be mentioned.
  • the number of mismatches is expressed in% of the chain length of the inhibitory oligonucleotide, for example, in the range of 1 to 20%, 3 to 15%, or 4 to 8%. This aspect will be described as an example of a combination of a target nucleic acid and a non-target nucleic acid in which only one base in the base sequence is different.
  • a mismatch (hereinafter, may be referred to as the first mismatch) occurs between the target nucleic acid and the non-target nucleic acid with different bases, and another one is generated.
  • Another mismatch (hereinafter sometimes referred to as a second mismatch) occurs.
  • the first mismatched base is related to a base that differs between the target nucleic acid and the non-target nucleic acid, and it does not matter whether or not it is recognized or cleaved by a polypeptide having coexisting mismatched endonuclease activity. ..
  • the second mismatch is a mismatched base that is recognized and cleaved by a polypeptide having coexisting mismatch endonuclease activity.
  • a polypeptide having a mismatch endonuclease activity that recognizes and cleaves a guanine base-guanine base, a guanine base-thymine base, or a thymine base-thymine base
  • the mismatch selected from these is Inhibitory oligonucleotides are designed to form.
  • the inhibitory oligonucleotide when the inhibitory oligonucleotide is hybridized with a non-target nucleic acid, the above-mentioned second mismatch occurs, but the first mismatch does not occur.
  • an inhibitory oligonucleotide having the above properties it is possible to selectively cleave a non-target nucleic acid by a polypeptide having mismatched endonuclease activity.
  • the present invention is not limited to the use of inhibitory oligonucleotides capable of forming one or two mismatches as described above, but the inhibitory oligonucleotides that produce three or more mismatches to the extent that selective cleavage of the desired nucleic acid occurs. Nucleotides may be designed and used.
  • At least one mismatch occurring in the target nucleic acid and the non-target nucleic acid may be the second mismatch, and it does not matter whether the other mismatch is recognized / cleaved by the polypeptide having the mismatch endonuclease activity.
  • the three or more mismatches are recognized and cleaved by a polypeptide having a mismatched endonuclease activity.
  • oligonucleotides disclosed in International Publication No. 2014/142261 and the like or the inhibitory oligonucleotides disclosed in International Publication No. 2016/152812 pamphlets and the like that can be used in the method of the present invention are composed of DNA.
  • a part of which may be nucleotide analog or RNA. That is, a peptide having a structure that forms a double-stranded nucleic acid having at least one mismatch when hybridized with a non-target nucleic acid, and further recognized and cleaved by a polypeptide having a mismatch endonuclease activity in which the mismatch coexists. If so, there is no particular limitation.
  • double-stranded nucleic acids having a mismatch examples include PCR products, nucleic acids derived from biological samples such as genomic DNA and fragments thereof, and synthetic nucleic acids.
  • the double-stranded nucleic acid having a mismatch may be a mixture derived from a biological sample or a nucleic acid mixture produced by melting and reannealing a mixture of a nucleic acid derived from a biological sample and a synthetic nucleic acid.
  • mismatch is formed and the mismatched endonuclease is cleaved at this site.
  • the mismatched endonuclease of the present invention it is possible to perform mutation analysis simply by adding this mismatched endonuclease to the reaction solution of a nucleic acid amplification method such as the PCR method.
  • amplification effect cannot be obtained even if the number of cycles is increased by a certain number or more.
  • the main causes are the depletion of added primers or substrate dNTPs and the competition between the primers and the reactants for annealing.
  • the reactants are annealed with each other, and the template with mutation and the wild type If the templates of the above are mixed, the mutation sites will be mismatched due to the annealing of the reaction products amplified from these. Therefore, mutation analysis can be performed only by performing PCR in the coexistence of the mismatched endonuclease of the present invention with a larger number of cycles than usual. That is, the present invention describes the above 1.
  • a method for mutation analysis which comprises reacting a double-stranded nucleic acid with the mismatched endonuclease described in 1.
  • the method for cleaving double-stranded nucleic acid of the present invention can be carried out in the presence of an acidic polymer substance.
  • the coexistence of the acidic polymer substance has been confirmed to have the effect of controlling the mismatch recognition / cleavage activity of the polypeptide. This effect is more effective when the amount of nucleic acid in the sample is small.
  • the acidic polymer substance is preferably a polyanion. Further, an acidic polysaccharide having a sugar skeleton or an acidic polysaccharide having a linear carbon chain is preferable.
  • Acidic polymer substances include fucose sulfate-containing polysaccharides, dextran sulfate, carrageenan, heparin, ramnan sulfate, dermatan sulfate (chondroitin sulfate B), heparan sulfate, hyaluronic acid, alginic acid, pectin, polyglutamic acid, polyacrylic acid, polyvinyl sulfate, One or more selected from the group consisting of polystyrene sulfate and salts thereof, or nucleic acids different from the target nucleic acid and the non-target nucleic acid can be used.
  • the method for cleaving a double-stranded nucleic acid of the present invention may be further carried out in combination with a proliferating cell nuclear antigen (PCNA) or a variant thereof.
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • Double-stranded nucleic acid amplification method of the present invention The double-stranded nucleic acid cleavage method of the present invention can also be carried out in the process of nucleic acid amplification reaction.
  • a mismatched endonuclease to the nucleic acid amplification reaction solution, the double-stranded nucleic acid having a mismatch caused by the incorrect nucleotide uptake in the amplification process is cleaved.
  • amplification of a nucleic acid having a sequence different from that of the template nucleic acid before the start of the reaction is suppressed. In this way, nucleic acid amplification with a reduced error rate becomes possible.
  • a nucleic acid amplification method comprising a step of cleaving a double-stranded nucleic acid having a mismatch using the mismatched endonuclease variant of the present invention described in 1.
  • the step of cleaving the double-stranded nucleic acid having the mismatch may be performed at the same time as the nucleic acid amplification step.
  • a composition comprising the mismatched endonuclease described in 1 is also an aspect of the present invention.
  • a method for amplifying the nucleic acid contained therein is also one aspect of the present invention.
  • the above composition may further contain at least one selected from reaction buffers, divalent metal ions, deoxyribonucleotides, oligonucleotide probes, and intercalating dyes.
  • reaction buffers divalent metal ions, deoxyribonucleotides, oligonucleotide probes, and intercalating dyes.
  • the above composition may further contain a nucleic acid serving as a template for the nucleic acid amplification reaction.
  • the deoxyribonucleotide may contain a nucleotide analog.
  • the above-mentioned reaction buffer refers to a compound or mixture having an action of softening fluctuations in the hydrogen ion concentration (pH) of the reaction solution.
  • a mixed solution of a weak acid and its salt or a weak base and its salt has a strong buffering action, and is therefore widely used as a reaction buffer for the purpose of pH control.
  • the reaction buffer used in the present invention include Good's buffers such as Tris-HCl and HEPES-KOH, and phosphate buffers such as sodium phosphate buffer.
  • the divalent metal ion include magnesium ion, manganese ion, zinc ion, and cobalt ion.
  • Divalent metal ions can be supplied in the form of salts such as chlorides, sulfates, or acetates.
  • the method for amplifying the double-stranded nucleic acid of the present invention is not particularly limited to the present invention, but a method for amplifying DNA is exemplified.
  • Examples of the method for amplifying DNA include a polymerase chain reaction (PCR) method, an MDA (Multiple display amplification) method, and an isothermal nucleic acid amplification method such as the ICAN method and the LAMP method.
  • the concentration of the polypeptide having mismatched endonuclease activity in the above composition for nucleic acid amplification reaction is appropriately effective for cleavage of double-stranded nucleic acid having a concentration or mismatch that does not inhibit the amplification reaction of DNA in each reaction system.
  • the concentration may be tested and determined.
  • primers suitable for various nucleic acid amplification methods are selected. These may be DNA, RNA, or so-called chimeric primers in which a part of DNA is replaced with RNA as long as desired amplification occurs. Further, it may be a primer containing a known nucleic acid analog or a primer labeled with a fluorescent dye for the purpose of detection or the like.
  • a component for preventing carryover may be included.
  • it may contain dUTP or uracil N-glycosidase.
  • the double-stranded nucleic acid amplification method of the present invention can be carried out in the presence of the above-mentioned acidic polymer substance.
  • the effect of the acidic polymer substance is more effective when the amount of nucleic acid in the sample is small.
  • the acidic polymer substance those exemplified in the above-mentioned description of the method for selectively cleaving a non-target nucleic acid of the present invention can be preferably used.
  • the method of the present invention may be further carried out in combination with the above-mentioned Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) or a mutant thereof.
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • the method of suppressing the amplification of the nucleic acid of the present invention is described in 1. It is carried out by suppressing the amplification of a nucleic acid having a specific base sequence in a nucleic acid amplification reaction by utilizing the mismatched endonuclease variant of the present invention described in 1 and a properly designed oligodeoxynucleotide or inhibitory oligonucleotide.
  • oligodeoxynucleotides or inhibitory oligonucleotides designed to cause one or several mismatches when hybridized with a nucleic acid having the particular nucleotide sequence (b) DNA polymerase, (c).
  • a method of suppressing the amplification of a nucleic acid having a specific base sequence in the nucleic acid amplification reaction which comprises the step of carrying out the nucleic acid amplification reaction in the presence of at least a pair of primers and (d) a polypeptide having mismatched end-nuclease activity, is also possible. This is one aspect of the present invention.
  • the oligodeoxynucleotide or inhibitory oligonucleotide of (a) above is a single strand having a base sequence designed to cause one or several mismatches when hybridized with a nucleic acid having a specific base sequence.
  • the DNA is not particularly limited, and may be a so-called chimeric oligonucleotide in which a part of the DNA is replaced with RNA.
  • the 3'end of this oligonucleotide or inhibitory oligonucleotide is modified to suppress the extension reaction by DNA polymerase from the single-stranded DNA. May be good. For example, modifications such as amination are exemplified.
  • the oligonucleotide or inhibitory oligonucleotide can be obtained from deoxyribonuclease by phosphorothioation or other modification as long as the nucleic acid to which the oligonucleotide or inhibitory oligonucleotide binds undergoes cleavage of a polypeptide having mismatched endonuclease activity. May be protected from disconnection. Further, it may be labeled with a fluorescent dye, a quenching substance, or the like for the purpose of detection or the like.
  • the chain length of the oligonucleotide or suppressor oligonucleotide can be appropriately determined so that the nucleic acid having the specific base sequence can be hybridized with the oligonucleotide or suppressor oligonucleotide under the conditions of the reaction to be carried out. ..
  • the position where a mismatch occurs when hybridized with a nucleic acid having a specific base sequence may be at least 3 nucleotides away from both the 5'end and 3'end of this oligonucleotide or inhibitory oligonucleotide. desirable.
  • a mismatched endonuclease when the method of the present invention suppresses the amplification of a nucleic acid having a specific base sequence by a method such as the PCR method including a reaction at a high temperature, a mismatched endonuclease also having heat resistance is used. Is preferable.
  • the mismatched endonuclease described in 1 contains a thermostable enzyme that does not inactivate even in PCR, and is suitable for such applications.
  • the present invention further provides a composition for a nucleic acid amplification reaction containing the following (a) to (d): (A) Oligodeoxynucleotides or inhibitory oligonucleotides designed to cause one or several mismatches when hybridized with a nucleic acid having a specific base sequence or its complementary strand; (B) DNA polymerase; (C) At least a pair of oligonucleotide primers; and (d) 1.
  • A Oligodeoxynucleotides or inhibitory oligonucleotides designed to cause one or several mismatches when hybridized with a nucleic acid having a specific base sequence or its complementary strand
  • B DNA polymerase
  • C At least a pair of oligonucleotide primers
  • (d) 1.
  • the above composition may further contain at least one selected from reaction buffers, divalent metal ions, deoxyribonucleotides, oligonucleotide probes, and intercalating dyes.
  • the above composition may further contain a nucleic acid that serves as a template for a nucleic acid amplification reaction. Further, dUTP and uracil N-glycosidase may be contained.
  • the method of suppressing the amplification of a nucleic acid having a specific base sequence in the nucleic acid amplification reaction of the present invention can be carried out by any nucleic acid amplification method.
  • the present invention is not particularly limited, but is particularly suitable for a method of amplifying DNA.
  • the present invention can be carried out by the PCR method, the MDA method, the isothermal nucleic acid amplification method such as the ICAN method and the LAMP method, and the like.
  • the method of the present invention that suppresses the amplification of a nucleic acid having a specific base sequence in a nucleic acid amplification reaction can be carried out for any nucleic acid.
  • DNA is targeted for amplification
  • DNA present in an artificially prepared DNA mixture, an environment-derived sample, a biological-derived sample, or a DNA mixture prepared from the sample is exemplified.
  • biological samples include samples derived from mammals such as humans.
  • examples of the DNA mixture include a fragmented genomic DNA mixture, a cDNA mixture produced by a reverse transcription reaction from mRNA, and a mixture of a plurality of PCR products.
  • DNA having a specific base sequence in which amplification is suppressed examples include reverse transcriptase derived from rRNA that remains unseparated, and small molecule DNA produced by pairing of primers.
  • the concentration of the polypeptide having mismatched endonuclease activity in the method of the present invention is appropriately determined by testing a concentration that does not inhibit the amplification reaction of DNA in each reaction system or a concentration that is effective for cleavage of the double-stranded nucleic acid having a mismatch. do it.
  • the concentration of the oligonucleotide or the inhibitory oligonucleotide may be determined by optimizing the concentration used in consideration of the amount of the template and the amplification efficiency of the target DNA. For example, it can be carried out at a concentration of 0.1 to 10 times the concentration of the primer used in the amplification reaction.
  • the present invention provides a method for preferentially amplifying a target nucleic acid.
  • the method may further include the step of detecting the amplified target DNA.
  • this aspect of the present invention may be referred to as "a method for detecting a nucleic acid of the present invention".
  • a method for detecting a nucleic acid of the present invention for example, according to the detection method of the present invention in which DNA is a detection target, even when a non-detection target DNA (DNA having a specific base sequence) is present in a large excess with respect to the detection target DNA (target DNA).
  • a DNA using a DNA not to be detected as a template by an oligonucleotide or a suppressing oligodeoxynucleotide and a polypeptide having a mismatched end nuclease activity Since amplification is suppressed, it becomes possible to detect the DNA to be detected.
  • the method of suppressing the amplification of nucleic acid of the present invention can be carried out in the presence of the above-mentioned acidic polymer substance.
  • the effect of the acidic polymer substance is more effective when the amount of nucleic acid in the sample is small.
  • the acidic polymer substance those exemplified in the above-mentioned description of the method for selectively cleaving a non-target nucleic acid of the present invention can be preferably used.
  • the method of the present invention may be further carried out in combination with the above-mentioned Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) or a mutant thereof.
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • the nucleic acid detection method of the present invention is described in 8. above.
  • the present invention includes a step of suppressing the amplification of a non-target nucleic acid by the method for suppressing the amplification of the nucleic acid of the present invention, and a step of preferentially amplifying the target nucleic acid, and a step of detecting the amplified target nucleic acid.
  • the method for detecting a nucleic acid of the present invention makes it possible to distinguish between a wild type and a mutant type, for example, for a nucleic acid corresponding to a gene known to have a mutation.
  • the method of the present invention is useful for detecting circulating tumor DNA in blood and detecting a small amount of fetal DNA sequence contained in the blood of a mother.
  • mutations include microdeletion and point mutation.
  • the polymorphisms caused by point mutations are called single nucleotide polymorphisms (SNPs).
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the present invention is not particularly limited, but the above-mentioned small number of mutation allelic genes include single nucleotide polymorphism mutations used as tumor markers, single nucleotide polymorphism mutations that correlate with the therapeutic effect of drugs for treating cancer, and single nucleotide polymorphism mutations. Nuclei containing at least one single nucleotide polymorphism mutation selected from the group consisting of single nucleotide polymorphism mutations known to correlate with cell canceration are preferred. Some SNPs are frequently found in tumor cells, and some are known to have a correlation with the therapeutic effect of cancer therapeutic agents and carcinogenesis.
  • SNPs examples include K-ras gene, B-raf gene, and epidermal growth factor receptor (EGFR) gene SNPs.
  • Somatic mutations in the K-ras gene are frequently found in colorectal cancer, lung adenocarcinoma, thyroid cancer and the like.
  • Somatic mutations in the B-raf gene are frequently found in colorectal cancer, malignant melanoma, papillary thyroid cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, and the like.
  • somatic mutations in the EGFR gene are frequently found in various solid tumors.
  • the detection method of the present invention may be carried out using DNA obtained after treating a composition containing methylated DNA extracted from a biological sample with bisulfite as a material. According to the detection method of the present invention, detection of a small number of methylated alleles in the presence of a large excess of unmethylated alleles, or detection of a small number of unmethylated alleles in the presence of a large excess of methylated alleles. Detection can be performed.
  • a known hydrogen sulfite method used for detecting methylated DNA can be used.
  • the treatment converts unmethylated cytosine to uracil, but not methylated cytosine. Furthermore, when this bisulfite-treated reaction solution is amplified by the PCR method, uracil is converted to thymine and methylated cytosine becomes cytosine.
  • the detection of a small number of methylated allelic genes in the presence of a large excess of unmethylated allelic genes at a specific site, or the detection of a small number of unmethylated allelic genes in the presence of a large excess of methylated allelic genes It is nothing more than verifying the presence of cytosine in a large excess of thymine or the presence of thymine in a large excess of cytosine, respectively.
  • amplification from a large excess of thymine or cytosine-containing DNA can be suppressed, the presence of a small number of methylated alleles or unmethylated alleles can be easily verified.
  • the step of detecting the target nucleic acid in the detection method of the present invention electrophoresis, base sequence analysis, real-time PCR using a probe such as a cycling probe or a TaqMan probe can be used.
  • a probe such as a cycling probe or a TaqMan probe
  • general methods can be used as they are.
  • HRM High Resolution Melting
  • the nucleic acid detection method of the present invention can be carried out in the presence of the above-mentioned acidic polymer substance.
  • the effect of the acidic polymer substance is more effective when the amount of nucleic acid in the sample is small.
  • the acidic polymer substance those exemplified in the above-mentioned description of the method for selectively cleaving a non-target nucleic acid of the present invention can be preferably used.
  • the method of the present invention may be further carried out in combination with the above-mentioned Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) or a mutant thereof.
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • Escherichia coli BL21 DE3 strain (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed with the plasmid and cultured overnight at 37 ° C. on a 1.5% agarose LB plate containing ampicillin at a concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • Three single colonies were selected from this plate and inoculated into LB medium (hereinafter referred to as LB-AP medium) containing ampicillin at a concentration of 100 ⁇ g / ml, and cultured with shaking at 37 ° C. overnight.
  • 300 ⁇ l of the culture solution was inoculated into 6 ml of LB-AP medium, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. overnight.
  • IPTG having a final concentration of 1 mM was added to the culture broth, and induction culture was further carried out at 25 ° C. for 4 hours. After that, when the OD600 value reached 4, the cells were collected.
  • the cells obtained above were suspended in a solution containing 400 ⁇ l of 50 mM Tris HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 5% glycerol and 0.15% Triton X-100 (hereinafter referred to as Buffer S).
  • An operation was performed in which ultrasonic treatment for 30 seconds using an ultrasonic crusher (manufactured by Sonic & Materials) was repeated 3 times at 4 ° C. This operation made the suspension transparent.
  • the suspension after ultrasonic crushing was centrifuged at 11000 ⁇ g at 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was collected.
  • the crude extract thus obtained was subjected to Ni resin purification.
  • Ni resin purification was carried out as follows. That is, 50 ⁇ l of Ni-NTA Agarose (manufactured by Qiagen) was placed in a 1.5 ml tube, washed twice with 250 ⁇ l of sterile distilled water, and then Buffer A (50 mM Tris / HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 5% glycerol). And 5 mM imidazole) 250 ⁇ l were equilibrated twice. The equilibrated Ni-NTA agarose was suspended in 400 ⁇ l of a crude extract and allowed to stand for 30 minutes. Then, it was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 ° C.
  • Ni-NTA agarose was washed 3 times with 100 ⁇ l Buffer A. Then, the adsorbate was eluted from Ni-NTA agarose with 100 ⁇ l of Buffer B (50 mM Tris HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 5% glycerol and 300 mM imidazole). The obtained eluate was used as a mismatched endonuclease mutant solution in the tests described below.
  • Buffer B 50 mM Tris HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 5% glycerol and 300 mM imidazole
  • Nucleic acid Nucles-Template-T (SEQ ID NO: 31) and NucS-Template-G (SEQ ID NO: 31) are used as nucleic acids forming double-stranded DNA as a substrate.
  • Double-stranded DNA in which these Templates and Probes were combined was used as a substrate.
  • FAM was added to the 5'end of the two types of probe, and Eclipse (registered trademark) Dark Quencher was added to the 3'end, respectively.
  • the composition of the 10x buffer is 500 mM Tris-HCl (pH 9.2), 140 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 100 mM KCl, 25 mM MgCl 2 , and 0.1% BSA.
  • the composition of the enzyme dilution buffer is 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 0.1 mM DTT, 0.01% Gelatin, 0.5% Nonidet P-40, 0.5% Tween-20, And 0.09% BSA.
  • Example 1 Preparation of Mismatched Endonuclease Mutant (1) Mismatched Endonuclease Mutant S47K + N76D According to Experimental Method 1 (1-1), an artificial gene encoding a mutant protein in which the serine at position 47 in the polypeptide PF_RS00065 derived from Pyrococcus furiosus was replaced with lysine and the aspartic acid at position 76 was replaced with aspartic acid was prepared. , Mismatched endonuclease mutant solution was prepared. The amino acid sequence of the variant protein is shown in SEQ ID NO: 6, and the nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO: 21.
  • Mismatched endonuclease mutant Q78R + L123T According to Experimental Method 1 (1-1), an artificial gene encoding a mutant protein in which glutamine at position 78 in the polypeptide PF_RS00065 derived from Pyrococcus furiosus was replaced with arginine and leucine at position 123 was replaced with threonine was prepared. A mismatched endonuclease variant solution was prepared. The amino acid sequence of the variant protein is shown in SEQ ID NO: 10, and the nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO: 25.
  • Mismatched endonuclease mutant Q78R + L123C According to Experimental Method 1 (1), an artificial gene encoding a mutant protein in which glutamine at position 78 was replaced with arginine and leucine at position 123 was replaced with cysteine in the polypeptide PF_RS00065 derived from Pyrococcus furiosus was prepared, and a mismatched endo was prepared. A nuclease variant solution was prepared. The amino acid sequence of the variant protein is shown in SEQ ID NO: 12, and the nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO: 27.
  • Mismatched endonuclease mutant Q78R + L125V According to Experimental Method 1 (1-1), an artificial gene encoding a mutant protein in which glutamine at position 78 in the polypeptide PF_RS00065 derived from Pyrococcus furiosus was replaced with arginine and leucine at position 125 was replaced with valine was prepared. A mismatched endonuclease variant solution was prepared. The amino acid sequence of the variant protein is shown in SEQ ID NO: 13 and the nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO: 28.
  • Example 2 Substrate Specificity Evaluation Test of Mismatched Endonuclease Variants
  • GG-specific mismatched endonuclease variants and TT-specific mismatched endonuclease variants with altered substrate specificity were obtained from wild-type mismatched endonucleases.
  • Example 3 Substrate specificity evaluation test of heterodimer-type mismatched endonuclease variant
  • a substrate specificity evaluation test was conducted according to Experimental Method 1 (2). went.
  • the heterodimer-type mismatched endonuclease mutant changed the substrate specificity from the wild-type mismatched endonuclease, and was also different from the mismatched endonuclease mutant prepared in Examples 1 (1) to (9). It showed substrate specificity specific to GT / TG mismatch.
  • the present invention is useful in a wide range of fields such as genetic engineering, biology, medicine, and agriculture.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of mismatch endonuclease PF0012 from Pyrococcus furiosus SEQ ID NO: 2; Amino acid sequence of mismatch endonuclease PF0012 W77F variant SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of mismatch endonuclease TERMP_01877 from Thermococcus barophilus SEQ ID NO: 4: Amino acid sequence of mismatch endonuclease MJ_0225 from Methanocaldococcus jannaschii SEQ ID NO: 5: Amino acid sequence of mismatch endonuclease TKO NucS from Thermococcus kodakarensis SEQ ID NO: 6: Amino acid sequence of mismatch endonuclease variant S47K + N76D from PF0012 SEQ ID NO: 7: Amino acid sequence of mismatch endonuclease variant S47R + N76D + L123
  • SEQ ID NO: 34 Synthetic oligonucleotide "NucS-Probe-G”. 5'-end is labeled with FAM and 3'-end is labeled with Eclipse.
  • SEQ ID NO: 35 Amino acid sequence of Linker
  • SEQ ID NO: 36 Nucleic acid sequence encoding Linker

Abstract

本発明により、ＧＧ特異的ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体、ＴＴ特異的ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体およびＧＴ／ＴＧ特異的ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体が提供される。また、当該変異体を用いたミスマッチ特異的切断反応、ミスマッチヌクレアーゼを利用した核酸増幅反応におけるエラーの除去方法、核酸増幅反応中に特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法、およびその抑制方法を利用した一塩基多型変異を有する核酸を検出する方法が提供される。

Description

耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体
　本発明は、二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対（以下、単にミスマッチと記載することもある）を認識して切断する耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体、当該ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を含む組成物、およびミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を用いた方法に関する。
　近年の生物工学技術の発展は著しく、特にゲノム解析法の進歩に伴った大規模ゲノム解析の結果、膨大なゲノム配列情報が蓄積されてきている。さらに前記情報と各種の生理機能解析とを合わせることで、機能的な遺伝子変異が数多く見出されてきた。これらの変異解析は、農作物の改良や有用微生物の分離、作製ばかりではなく、人の遺伝子診断などにも利用されるようになってきており、一般生活上にも大きな恩恵を与えている。
　これらの変異の解析法としては、ゲノム配列を直接解析する他に、ミスマッチを認識する酵素群を利用する方法が行われてきた。変異型と野生型のＤＮＡを対合させて形成されたミスマッチに対して、特異的結合能力のある因子を結合させて検出する解析方法がその一つであり、代表的な例としては大腸菌のＭｕｔＳ、ＭｕｔＴ、ＭｕｔＬ複合体を利用した変異部位の検索が挙げられる（特許文献１）。
　また、ミスマッチ部位を特異的に切断するミスマッチエンドヌクレアーゼを利用する方法も行われている。この場合は、ミスマッチエンドヌクレアーゼを利用し、ミスマッチ付近で切断されたＤＮＡ断片を解析することで、変異の有無やその位置を検出する。代表的な例としては、セロリ由来のＣｅｌＩ遺伝子産物を利用する方法が知られており（特許文献２）、実際に変異塩基の解析に利用されている。しかし、この酵素は耐熱性を持たず、ＰＣＲ法など高温の反応過程を含む手法には直接使用できない。このため、変異塩基の検出を行う際にも、増幅、ミスマッチ形成、ミスマッチ切断、検出の４ステップが必要となる。
　ミスマッチエンドヌクレアーゼは他に、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ由来、およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来が知られている（特許文献３および４）。しかしながら、これらミスマッチエンドヌクレアーゼは、ミスマッチの認識（基質特異性）において複数のミスマッチを認識して切断するものであり、その基質特異性に課題があった。
　また、検出したい遺伝子変異が、ミスマッチエンドヌクレアーゼの基質特異性と合致せず、そのままでは解析できない場合がある。その場合、適切に設計した抑制オリゴヌクレオチドと呼ばれる核酸を反応系に添加することにより、当該遺伝子変異を特異的に検出するしかなかった（特許文献５）。
　また、変異解析の他にも大きな影響を与えている生物工学的技術としては、核酸増幅技術が挙げられる。この核酸増幅技術の中で代表的な技術であるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）法は、試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等の幅広い分野において不可欠の実験手法となっている。ＰＣＲ法は、変異型遺伝子の検出や、ＤＮＡのメチル化の解析にも応用されている。また、ＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法などの等温核酸増幅法は特別な機器を必要としないことから、より安価な核酸検出法として使用されている。さらに近年になり行われるようになったゲノム全体の構造解析においては、特に希少な試料からの解析を行う上で、全ゲノム増幅法は重要な技術である。
　これらの核酸増幅法の問題点として、一定確率で間違った塩基の取り込みを起こすことがあげられる。ポリメラーゼの改良などを通して、この確率は低減されてきたものの、依然精密な解析の際には障害となっている。
　また、核酸増幅技術はある特定の塩基配列を有するＤＮＡの増幅のみならず、共通の塩基配列領域を両端に保持するＤＮＡの混合物を増幅する際にも用いられる。具体的な例としては、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーの構築などが挙げられるが、その際に含有率の高いＤＮＡ分子が優先的に増幅され、多様な種類のＤＮＡの解析やスクリーニングの障害となることがある。
　その問題を解決するため、自己ハイブリダイゼーションを利用した正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）により含有率の高いＤＮＡの比率の低減が行われている（非特許文献１）。またＰＣＲ法と自己ハイブリダイザーションを組み合わせたＳＳＨ－ＰＣＲ法も使用されている（非特許文献２）が、含有率の高いＤＮＡと相同性を持つＤＮＡも取り除かれる危険性も存在している。
　さらに、核酸増幅法によるＤＮＡの検出においては、検出対象のＤＮＡの増幅と、検出対象でないＤＮＡの増幅とが競合する場合がある。すなわち、検出対象以外のＤＮＡも同時に増幅され、対象のＤＮＡの検出が困難な場合である。サイクリングプローブやＴａｑＭａｎプローブ等のプローブを用いたリアルタイムＰＣＲによって検出対象のＤＮＡの増幅のみを検出して上記の問題を解消できることもあるが、検出対象でないＤＮＡが検出対象のＤＮＡに対して大過剰に存在する場合には、検出対象ではないＤＮＡに起因する偽陽性反応のため、検出対象のＤＮＡの検出は困難となる。
　このような問題は、例えば正常対立遺伝子の存在下における少数の変異対立遺伝子の検出（血中循環腫瘍ＤＮＡの検出等）、エピジェネティックアッセイでの少数のメチル化あるいは非メチル化対立遺伝子の検出、母親の血液中に循環する少量の胎児ＤＮＡ配列の検出等の実施において起こり得る。
　上記の問題を解決するために、ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ＰＣＲ法またはＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＥＭＳ　ＰＣＲ）法と呼ばれる方法が開発された（非特許文献３）。この方法は、耐熱性の制限酵素を利用し、例えば鋳型が正常型の塩基配列を持つ場合のみにこの制限酵素による切断が起こるように設計したプライマーを用いて、変異型の塩基配列を持つＤＮＡのみを選択的に検出する方法である。しかしながら、検出しようとするＤＮＡによっては、ＲＥＭＳ　ＰＣＲによる選択的検出に適した認識配列を持つ耐熱性の制限酵素が存在しない場合もある。
米国特許第５９２２５３９号明細書 国際公開第０１／０６２９７４号パンフレット 国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット 国際公開第２０１６／０３９３７７号パンフレット 国際公開第２０１６／１５２８１２号パンフレット
"Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ"、２００４年２月、第３２巻、３号、ｅ３７ "Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ"、２００９年、第４９６巻、２号、ｐ．２２３－２４３ "Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ"、１９９８年８月、第１５３巻、２号、ｐ．３７３－３７９
　本発明の目的は、従来のミスマッチエンドヌクレアーゼと比較してミスマッチに対する特異性が向上した耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体、当該ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を含む組成物、および当該ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の使用方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記の事情を鑑みて鋭意努力した結果、Ｇ－Ｇミスマッチを特異的に切断できるミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体およびＴ－Ｔミスマッチを特異的に切断できるミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の創製に成功した。また、ミスマッチエンドヌクレアーゼは本来ホモダイマーであるが、当該２種の変異体のモノマーをリンカーにて接続することにより、Ｇ－Ｔ／Ｔ－Ｇミスマッチを特異的に切断できるミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の創製に成功した。かくして、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、
［１］　下記（Ａ）または（Ｂ）で示されるポリペプチド：
（Ａ）下記（１）～（４）からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を形成しているグアニン（Ｇ）を有する核酸鎖を切断する活性を有するポリペプチド：
　（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
４７位のセリンが塩基性アミノ酸残基に、および
７６位のアスパラギンが酸性アミノ酸残基に
それぞれ置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
　（２）上記（１）記載の置換されたアミノ酸配列において、さらに１～１０個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記変異は、置換、欠失、挿入、および／または付加であり、上記（１）記載の置換されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は保持される；
　（３）上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される；
　（４）上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ただし、上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される、または
（Ｂ）下記（５）～（８）からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を形成しているチミン（Ｔ）を有する核酸鎖を切断する活性を有するポリペプチド：
　（５）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
７８位のグルタミンが塩基性アミノ酸残基に置換され、かつ
１２３位のロイシンが中性（極性無電荷）アミノ酸残基または含硫アミノ酸残基に置換されるか、あるいは１２５位のロイシンが疎水性アミノ酸残基または含硫アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
　（６）上記（５）記載の置換されたアミノ酸配列において、さらに１～１０個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記変異は、置換、欠失、挿入、および／または付加であり、上記（５）記載の置換されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は保持される；
　（７）上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される；
　（８）上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される、
［２］　塩基性アミノ酸残基が、リジン、アルギニン、またはヒスチジンであり、酸性アミノ酸残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、中性（極性無電荷）アミノ酸が、スレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、またはシステインであり、含硫アミノ酸が、システインまたはメチオニンであり、および疎水性（非極性）アミノ酸が、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、またはメチオニンである、［１］記載のポリペプチド、
［３］　配列表の配列番号６～１５より選択されるアミノ酸配列を含む、［１］または［２］記載のポリペプチド、
［４］　［１］～［３］いずれか１つに記載のポリペプチドをコードする核酸、
［５］　配列表の配列番号２１～３０より選択される塩基配列を含む、［４］記載の核酸、
［６］　［４］または［５］記載の核酸および発現調節配列を含む発現ベクター、
［７］　［６］記載の発現ベクターで形質転換された、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する細胞、
［８］　［１］～［３］のいずれか１つに記載のポリペプチドを二本鎖核酸に作用させる工程を包含する、ミスマッチを有する二本鎖核酸の切断方法、
［９］　下記（ａ）～（ｄ）を含む組成物：
　（ａ）［１］～［３］のいずれか１つに記載のポリペプチド；
　（ｂ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを含む、（ａ）のポリペプチドで切断される二本鎖核酸を生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に（ａ）のポリペプチドで切断されない二本鎖核酸を生じるオリゴヌクレオチド；
　（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；および
　（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、
［１０］　下記（１）および（２）の工程を含む核酸の増幅方法：
　（１）鋳型になる核酸分子と下記（ａ）～（ｄ）とを含む組成物を調製する工程；
　（ａ）［１］～［３］のいずれか１つに記載のポリペプチド；
　（ｂ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを含む、（ａ）のポリペプチドで切断される二本鎖核酸を生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に（ａ）のポリペプチドで切断されない二本鎖核酸を生じるオリゴヌクレオチド；
　（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；および
　（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド；ならびに
　（２）工程（１）により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程、
［１１］　核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、等温核酸増幅法、またはＭＤＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で実施される［１０］に記載の方法、
［１２］　下記（ａ）～（ｄ）の存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む、特定の塩基配列を含む核酸の増幅を抑制する方法：
　（ａ）前記特定の塩基配列を含む核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチド；
　（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；
　（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；および
　（ｄ）［１］～［３］のいずれか１つに記載のポリペプチド、
［１３］　核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、または等温核酸増幅法である、［１２］に記載の方法、
［１４］　標的ＤＮＡを優先的に増幅する方法であって、当該標的ＤＮＡと１個もしくは数個の塩基が異なる塩基配列のＤＮＡの増幅を［１２］または［１３］記載の方法で抑制することを特徴とする方法、
［１５］　野生型塩基配列のＤＮＡと、当該ＤＮＡに一塩基多型変異が生じたＤＮＡとを区別して増幅する目的に使用される［１４］に記載の方法、
［１６］　一塩基多型変異が、癌化、または癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異である、［１５］に記載の方法、および
［１７］　下記群から選択されるダイマー形態のポリペプチド：
（１）［１］（Ａ）記載のポリペプチドをサブユニットとして有するホモダイマー、
（２）［１］（Ｂ）記載のポリペプチドをサブユニットとして有するホモダイマー、および
（３）［１］（Ａ）および［１］（Ｂ）記載のポリペプチドをサブユニットとして有するヘテロダイマー、
に関する。
　本発明により、生物工学上利用価値の高い耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体、当該ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を含む組成物、およびミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を用いた方法が提供される。
　本発明において「ミスマッチ」とは、二本鎖核酸中に存在するワトソン－クリック塩基対とは異なる塩基の対合、すなわちＧ（グアニン塩基）－Ｃ（シトシン塩基）、Ａ（アデニン塩基）－Ｔ（チミン塩基）またはＵ（ウラシル塩基）の塩基対合以外の組み合わせの塩基対合を示す。
　本発明において「ＧＧ特異的」とはＧ－Ｇミスマッチに対する特異性を、「ＴＴ特異的」とはＴ－Ｔミスマッチに対する特異性を、「ＧＴ／ＴＧ特異的」とはＧ－ＴまたはＴ－Ｇミスマッチに対する特異性を有していることをそれぞれ示す。言い換えれば、該ミスマッチ以外は実質的に認識しないことを示す。
　本明細書において「ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド」(単にミスマッチエンドヌクレアーゼと記載することがある)とは、二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性を有するヌクレアーゼのことをいう。前記のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性は、ミスマッチを形成するヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合を切断する活性の他、ミスマッチから１～５塩基対、好ましくは１～３塩基対離れたヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合を切断する活性を包含する。本発明においてミスマッチエンドヌクレアーゼは、特定のミスマッチを特異的に認識して二本鎖核酸を切断する活性を有するものが好ましい。また、本明細書において耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼとは、５０℃以上の温度において二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性を示すヌクレアーゼのことをいい、本発明においては耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの使用が好ましい。
　本発明におけるミスマッチエンドヌクレアーゼは、二量体を形成して活性を示す酵素である。大腸菌などを宿主として該タンパク質の単量体（モノマー；ダイマーの構成要素を示す「サブユニット」ともいう）を発現させた場合、自然に会合し、二量体（ホモダイマー）を形成することが知られている。また、本明細書において「二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を形成しているグアニン（Ｇ）を有する核酸鎖を切断する活性を有するポリペプチド」および「二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を形成しているチミン（Ｔ）を有する核酸鎖を切断する活性を有するポリペプチド」とは、それぞれ前記モノマーのことをいう。
　アミノ酸は、その化学的性質に基づいて、親水性（極性）と疎水性（非極性）に分類することができる。
　親水性（極性）アミノ酸には、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、中性（極性無電荷）アミノ酸、芳香環を有するアミノ酸のうちチロシン、および含硫アミノ酸のうちシステインが含まれる。
　疎水性（非極性）アミノ酸には、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、芳香環を有するアミノ酸のうちトリプトファンおよびフェニルアラニン、および含硫アミノ酸のうちメチオニンが含まれる。
　酸性アミノ酸には、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）が含まれる。
　塩基性アミノ酸には、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）が含まれる。
　中性（極性無電荷）アミノ酸には、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）が含まれる。
　芳香環を有するアミノ酸には、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、およびフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）が含まれる。
　含硫アミノ酸には、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）およびメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）が含まれる。
　脂肪族側鎖を有するアミノ酸には、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、およびプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）が含まれる。なお、プロリンは側鎖が環状化したイミノ酸である。
　本発明において「類似したアミノ酸」とは、上記アミノ酸の化学的性質に基づいた分類において同じ分類になるアミノ酸同士のことをいう。例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンはすべて塩基性アミノ酸に分類されるため、互いに類似したアミノ酸である。
　本発明において「アミノ酸配列の相同性」とは、上記類似したアミノ酸であることを考慮したポリペプチド配列の類似性（homologyまたはsimilarity）を意味する。したがって、上記アミノ酸の化学的性質に基づいた分類において、同じ分類に属するアミノ酸同士は「相同性がある」とみなされる。
　本発明において「アミノ酸配列の同一性」とは、上記類似したアミノ酸であることを考慮しないポリペプチド配列の同一性（identity）を意味する。また、本発明において「塩基配列の同一性」とは、ポリヌクレオチド配列の同一性を意味する。
　上記アミノ酸配列の相同性、アミノ酸配列の同一性、および塩基配列の同一性のスコアを算出するには、公知のプログラムを使うことができる。本発明を何ら限定するものではないが、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ、ＦＡＳＴＡ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＭＰｓｒｃｈなどが使用できる。
　本発明において使用しているアミノ酸番号（またはアミノ酸位置ともいう）は、配列番号１のアミノ酸配列に基づく。そのため、本明細書におけるアミノ酸番号で特定したアミノ酸の位置は、他の生物由来の相同タンパク質や配列番号１のポリペプチドに変異が導入されたタンパク質において、そのタンパク質のＮ末端から数えた場合にこの番号で示される位置と異なることがある。言い換えると、本発明において「野生型ミスマッチエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列の４７位に相当する（または対応する）位置」とは、公知のアルゴリズム（ＢＬＡＳＴｐ、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａなど）を用いて、野生型アミノ酸配列（配列番号１）と、変異体アミノ酸配列や他の生物由来ミスマッチエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を比較およびアライメントすることにより、当該野生型アミノ酸配列において４７位のアミノ酸残基と同じ位置とみなされるアミノ酸残基を指す。
　本発明において「標的核酸」または「標的ＤＮＡ」とは、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体によって切断されない核酸である。言い換えれば、本発明の増幅方法において増幅の対象（鋳型）となる核酸である。一方、「非標的核酸」または「非標的ＤＮＡ」とは、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体によって切断される核酸である。言い換えれば、本発明の切断方法において切断されることにより、本発明の増幅方法において増幅の対象とならない核酸である。「標的核酸」または「標的ＤＮＡ」および「非標的核酸」または「非標的ＤＮＡ」は、特に限定されず、互いに区別されることが望まれるいずれの核酸であってもよい。
　以下、詳細に説明する。
１．本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体
　本発明の第一の態様は、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体、すなわち基質特異性が変化したミスマッチエンドヌクレアーゼの変異体に関するものである。当該ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来の野生型ミスマッチエンドヌクレアーゼ（ＰｆｕＮｕｃＳと記載することがある）またはそのホモログ、またはＰｆｕＮｕｃＳのミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する変異体において、基質の認識・切断に寄与する部位のアミノ酸配列が変化していることを特徴とする。
　本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、本発明を特に限定するものではないが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＷＰ＿０１１０１１１２４．１、配列番号１、旧名称：ＰＦ００１２、旧ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿５７７７４１）に、（ｉ）４７位のセリンの塩基性アミノ酸へのアミノ酸置換、および７６位のアスパラギンの酸性アミノ酸へのアミノ酸置換、または（ｉｉ）７８位のグルタミンの塩基性アミノ酸へのアミノ酸置換、および、１２３位のロイシンの中性（極性無電荷）アミノ酸または含硫アミノ酸へのアミノ酸置換あるいは１２５位のロイシンの疎水性アミノ酸または含硫アミノ酸へのアミノ酸置換を導入することにより、作製することができる。
　さらには、ＰＦ＿ＲＳ０００６５の７７位のトリプトファン残基がフェニルアラニンに置換されてなるポリペプチドＷ７７Ｆ（配列番号２）、ＰＦ＿ＲＳ０００６５のホモログであるＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のポリペプチドＭＪ＿ＲＳ０１１８０（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿２４７１９４、配列番号３、旧名称：ＭＪ＿０２２５）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ由来のポリペプチドＴＥＲＭＰ＿０１８７７（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＹＰ＿００４０７２０７５、配列番号４）、およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ　ＫＯＤ１株（ＪＣＭ　１２３８０Ｔ）由来のポリペプチド（配列番号５）にも同様に、上記のアミノ酸置換（ｉ）または（ｉｉ）に対応する（相当する）変異を導入することにより、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を作製することができる。
　本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、好ましくは耐熱性酵素である。本発明を特に限定するものではないが、例えばＰＣＲのような熱サイクル中でも安定に活性を保持するポリペプチドが好ましく、５０℃以上、好ましくは６０℃以上、さらに好ましくは７０℃以上、より好ましくは９０℃以上でも失活しないポリペプチドが本発明の方法に使用できる。
　本発明を特に限定するものではないが、例えば、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）に示されるポリペプチドを含む。好適には、下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）に示されるポリペプチドからなるミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体が例示される。
　（Ａ）下記（１）～（４）からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を形成しているグアニン（Ｇ）を有する核酸鎖を特異的に切断する活性を有するポリペプチド：
　（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
４７位のセリンが塩基性アミノ酸残基に、および
７６位のアスパラギンが酸性アミノ酸残基に
それぞれ置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
　（２）上記（１）記載の置換されたアミノ酸配列において、さらに１～１０個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記変異は、置換、欠失、挿入、および／または付加であり、上記（１）記載の置換されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は保持される；
　（３）上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列にけるアミノ酸置換または変異は保持される；
　（４）上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される。
　（Ｂ）下記（５）～（８）からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を形成しているチミン（Ｔ）を有する核酸鎖を特異的に切断する活性を有するポリペプチド：
　（５）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
７８位のグルタミンが塩基性アミノ酸残基に置換され、かつ
１２３位のロイシンが中性（極性無電荷）アミノ酸残基または含硫アミノ酸残基に置換されるか、あるいは１２５位のロイシンが疎水性アミノ酸残基または含硫アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
　（６）上記（５）記載の置換されたアミノ酸配列において、さらに１～１０個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記変異は、置換、欠失、挿入、および／または付加であり、上記（５）記載の置換されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は保持される；
　（７）上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される；
　（８）上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される。
　本発明においては、ＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。該ＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとしては、上記（Ａ）に示されるポリペプチドが挙げられる。特に限定するものではないが、好ましくは、上記（Ａ）（１）に記載のような、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、４７位のセリンが塩基性アミノ酸残基に、および７６位のアスパラギンが酸性アミノ酸残基にそれぞれ置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが例示される。また、さらに、配列番号１の上記４７位および７６位のアミノ酸置換に加えて、１２３位のロイシンが脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドも、ＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとして例示される。さらに好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列において、４７位のセリンがリジン、アルギニン、またはヒスチジンに置換され、かつ７６位のアスパラギンがアスパラギン酸またはグルタミン酸に置換されたポリペプチドが例示される。また、さらに好ましくは、上記４７位および７６位のアミノ酸置換に加え、１２３位のロイシンがアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはプロリンに置換されたポリペプチドが例示される。
　さらに、本発明においては、ＴＴ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。該ＴＴ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとしては、上記（Ｂ）に示されるポリペプチドが挙げられる。特に限定するものではないが、好ましくは、上記（Ｂ）（５）に記載のような、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、７８位のグルタミンが塩基性アミノ酸残基に置換され、かつ１２３位のロイシンが中性（極性無電荷）アミノ酸残基または含硫アミノ酸残基に置換されるか、あるいは１２５位のロイシンが疎水性アミノ酸残基または含硫アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが例示される。さらに好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列において、７８位のグルタミンがリジン、アルギニン、またはヒスチジンに置換され、かつ、１２３位のロイシンがスレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システインまたはメチオニンに置換されるか、あるいは１２５位のロイシンがアラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、システインまたはメチオニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが例示される。さらに好ましくは、１２５位のロイシンは、ロイシン以外の脂肪族側鎖を有するアミノ酸に置換されていてもよい。
　上記ＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドおよび上記ＴＴ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、ホモダイマーの形態であってもよい。上記ＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、大腸菌などを宿主として該ポリペプチドの単量体（モノマー）を発現させた場合、自然に会合して二量体（ホモダイマー）を形成し、該活性を示す。上記ＴＴ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドも同様である。
　さらに、本発明においては、ＧＴ／ＴＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドも提供される。該ＧＴ／ＴＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとしては、上記（Ａ）に示されるポリペプチドおよび上記（Ｂ）に示されるポリペプチドを含むヘテロダイマータンパク質が挙げられる。特に限定するものではないが、好ましくは、上記ＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとＴＴ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを含むヘテロダイマータンパク質が例示される。該ヘテロダイマータンパク質は、例えば、大腸菌などを宿主として、上記ＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドおよび上記ＴＴ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが二量体（ヘテロダイマー）を形成するように発現させることにより、作製することができる。しかしながら、該ヘテロダイマータンパク質の作製方法に何ら限定は無い。ＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドおよびＴＴ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをそれぞれ別個に発現させ、任意の方法でモノマーへ解離させた後、両者を混合して再会合させてもよい。該ヘテロダイマータンパク質の好ましい作製方法においては、リンカーを介してＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドおよびＴＴ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを１本のポリペプチドとして発現させる。該１本のポリペプチド内における配置に何ら限定は無い。［ＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド］－［リンカー］－［ＴＴ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド］でもよいし、［ＴＴ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド］－［リンカー］－［ＧＧ特異的なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド］でもよい。該リンカーは、好ましくはペプチドリンカーである。該ペプチドリンカーのアミノ酸配列およびその残基数（長さ）に何ら限定は無く、ヘテロダイマー化および二本鎖核酸の切断を阻害しない配列および残基数であれば、本発明に好適に使用することができる。さらには、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとリンカーの間に、例えば、Ｆａｃｒｏｒ　Ｘａ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、エンテロキナーゼ（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｅｔｃｈ　Ｖｉｒｕｓ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの融合ポリペプチド切断用プロテアーゼの認識配列を有してもよい。
　また、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、上記（Ａ）（１）および（Ｂ）（５）に記載のアミノ酸置換に加え、当該変異体の基質特異性（ＧＧ、ＴＴ、またはＧＴ／ＴＧミスマッチ特異性）を失わない範囲で、他のアミノ酸位置の変異を含んでいてもよい。他のアミノ酸位置の変異の例としては、特に限定するものではないが、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の基質特異性を維持する範囲において、耐熱性を向上させる変異、阻害物質への耐性を向上させる変異、およびミスマッチエンドヌクレアーゼの特性を改善させるためのアミノ酸変異が挙げられる。ここで、「変異」は、アミノ酸置換変異、アミノ酸挿入変異、アミノ酸欠失変異、またはアミノ酸付加のいずれであってもよい。
　例えば、本発明を特に限定するものではないが、他のアミノ酸位置の変異を含む本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、上記（Ａ）（１）および（Ｂ）（５）に記載のアミノ酸置換に加えて、さらに１～１０個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。
　さらに例えば、他のアミノ酸位置の変異を含む本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、上記（Ａ）（１）および（Ｂ）（５）に記載のアミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列、または当該アミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列にさらに１～１０個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列に対して、５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。上記５０％以上の相同性とは、例えば、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上のアミノ酸配列の相同性を包含する。
　さらに例えば、他のアミノ酸位置の変異を含む本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、上記（Ａ）（１）および（Ｂ）（５）に記載のアミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列、または当該アミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列にさらに１～１０個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列に対して、５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。上記５０％以上の同一性とは、例えば、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上のアミノ酸配列の同一性を包含する。
　さらに、精製を容易にすることを目的として、Ｎ末端またはＣ末端にアフィニティタグを付加したミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体も本発明に包含される。アフィニティタグの例としては、Ｈｉｓ残基が４個～８個連続するヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、ｃ－ｍｙｃタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＢＰ）タグ、８残基のアミノ酸（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ）からなるＳｔｒｅｐ（ＩＩ）タグなどの公知のものが挙げられる。所望により、これらタグは１～１５個のアミノ酸を含むリンカーを介して本発明の変異体と連結することができる。さらには、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとリンカーの間に、例えば、Ｆａｃｒｏｒ　Ｘａ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、エンテロキナーゼ（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｅｔｃｈ　Ｖｉｒｕｓ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの融合ポリペプチド切断用プロテアーゼの認識配列を有してもよい。したがって、このようなアフィニティタグ、リンカー、および／または融合ポリペプチド切断用プロテアーゼの認識配列を含むポリペプチドも、他のアミノ酸位置の変異を含む本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体として例示される。例えば、他のアミノ酸位置の変異を含む本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、上記した１～１０個の変異アミノ酸残基数、アミノ酸相同性、またはアミノ酸同一性の範囲内で、アフィニティタグ、リンカー、および／または融合ポリペプチド切断用プロテアーゼの認識配列を含んでいてもよい。
　また、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、人工アミノ酸（または非天然アミノ酸ともいう）を含んでいてもよい。人工アミノ酸として、例えば、ハロゲン化チロシン（クロロ、ブロモ、ヨード）、硫酸チロシン、アジドチロシン、アセチルリジン、アジドフェニルアラニン、フルオロフェニルアラニンなどがある。天然アミノ酸から人工アミノ酸への置換方法に特に限定は無く、公知の方法を用いることができる。
　本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体として、特に限定するものではないが、配列番号６～１５記載のいずれかのアミノ酸配列からなる変異体が挙げられる。
　このような本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、後述する種々の用途、例えば特定のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡを排除しその他のＤＮＡを増幅、検出する方法において好適に使用される。
　ここで、ミスマッチエンドヌクレアーゼの活性は、ミスマッチを含有する二本鎖核酸を基質として測定することができる。具体的には、ミスマッチを含有する二本鎖核酸の過剰量とミスマッチエンドヌクレアーゼとを反応させ、単位時間当たりの切断核酸量を測定することで活性測定が実施される。切断された二本鎖核酸は、電気泳動などにより切断を受けなかった核酸と分離して定量することが可能である。切断を受けた場合にのみ蛍光強度の増加が検出できるように蛍光物質と消光物質とで二重に標識した二本鎖核酸を使用すれば、反応溶液中の蛍光強度を適当な時間ごとに測定することにより活性を簡便に測定することができる。また、基質となる二本鎖核酸の中のミスマッチの塩基を変えることで、特定のミスマッチに対する切断活性を調べることも可能である。
２．本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸
　本発明においては、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸を提供することができる。具体的には上記した本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸を提供する。
　本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸として、特に限定はされないが、配列番号６～１５のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸が例示される。さらに好適には、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸として、配列番号２１～３０のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸が例示される。
　本発明を何ら限定するものではないが、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の一例として、本願実施例において作製したポリペプチドのアミノ酸配列、およびそれをコードする核酸配列について、表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸は、使用する宿主（ｈｏｓｔ）において発現可能かつ逆転写酵素活性を有するタンパク質をコードするコドンで構成されたものであれば特に限定は無く、使用する宿主において発現可能にするためまたは発現量を増加させるためにコドンの最適化を行ってもよい。該コドン最適化は、本分野において通常使用されている方法によって行うことが好ましい。
３．本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸を含む発現ベクター
　本発明の発現ベクターは、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸、および該核酸と作動可能に連結された発現調節配列を含む。
　本発明に使用される発現ベクターとしては、本分野において通常使用されている発現ベクターであれば、特に限定は無い。宿主細胞において自立複製が可能なベクターや宿主染色体に組み込まれ得るベクターを使用することができる。宿主に適合するベクターを使用すればよい。
　本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸を挿入する発現ベクターとして、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、使用する宿主に適したプラスミド、例えば大腸菌由来のプラスミド、バチルス属細菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドが当業者に周知であり、また、市販されているものも多い。本発明には、これら公知のプラスミドやその改変体を使用することができる。ファージベクターとしては、例えば、λファージ等を使用することができ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを使用することができる。さらに、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞を宿主とする異種タンパク質発現系も数多く構築されており、また、すでに市販もされている。本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の製造には、これら発現系を使用してもよい。
　本発明の発現ベクターに搭載するプロモーターは宿主に応じて選択することができ、例えば大腸菌ではｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターやそれらの改変体を使用することができるが、前記のものに限定されるものではない。さらに、ファージ由来のプロモーターとＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み合わせた発現系（例えばｐＥＴ発現系等）を利用してもよい。
　発現させたポリペプチドの精製を容易にするために、本発明の発現ベクターは、アフィニティタグをコードする核酸をさらに含んでいてもよい。アフィニティタグをコードする核酸は、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体と当該アフィニティタグの融合タンパク質が発現されるようにベクターに挿入される。本発明を何ら限定するものではないが、アフィニティタグとしては、例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＢＰ）タグ、８残基のアミノ酸（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ）からなるＳｔｒｅｐ（ＩＩ）タグなどをコードする核酸が例示される。当該タグを付加する位置は、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸の５’末端および／または３’末端側のいずれでもよく、発現およびタグ機能の障害とならない位置に適宜付加すればよい。なお、該タグは、発現させたポリペプチドの精製段階もしくは精製後において切断できるタグが好ましい。本発明を何ら限定するものではないが、かかる切断できるタグとしては、例えば、Ｆａｃｒｏｒ　Ｘａ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、エンテロキナーゼ（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｅｔｃｈ　Ｖｉｒｕｓ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの融合ポリペプチド切断用プロテアーゼの認識配列をコードする核酸を含むタグが例示される。
　本発明の発現ベクターは、さらに１または複数の発現調節配列を含んでいる。当該発現調節配列は特に限定されるものではないが、プロモーターならびにプロモーターの制御に関わる遺伝子、リボソーム結合配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列（転写ターミネーター）、エンハンサー等が挙げられる。さらに複製起点（ｏｒｉｇｉｎ）や形質転換体の選別に用いられるマーカー（薬剤耐性遺伝子、蛍光マーカー、発光マーカー）をコードする遺伝子、翻訳効率を高めるための塩基配列を含んでいてもよい。
４．本発明の発現ベクターで形質転換された細胞
　本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を発現するベクターで形質転換する細胞（宿主）としては、本分野において通常使用されている宿主であれば、特に限定は無い。例えば細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、糸状菌、昆虫細胞、真核細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む哺乳動物細胞等）が使用できる。
　原核細胞を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ：大腸菌）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用することができる。異種タンパク質の製造に使用可能な大腸菌は当業者に周知であり、また、市販されているものも多い（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１Ｔ１Ｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１等）。また、バチルス属細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＩ１１４、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　２０７－２１等、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌であるもＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ等が異種タンパク質の製造用宿主として知られている。これらの宿主細胞を適切な発現ベクターと組み合わせ、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の製造に使用することができる。特に限定はされないが、大腸菌株のＢＬ２１系統である、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１Ｔ１ＲやＢＬ２１ＤＥ３が好適に使用できる。
　発現ベクターの宿主への導入方法としては、宿主に核酸を導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用することができる。昆虫細胞への発現ベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。ファージベクターやウイルスベクターは、これらベクターに応じた方法で宿主細胞への感染を実施し、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を発現する形質転換体を得ることができる。
　上記形質転換体を培養し、培養物から本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を取得することができる。培養条件は、使用する発現ベクター、宿主等に適した条件であれば特に限定はない。本発明を何ら限定するものではないが、例えば、ｐＥＴベクターにて大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株を形質転換した場合、形質転換体をＬＢ培地へ接種して３７℃にて振盪培養する。培養液のＯＤが０．２～０．８になった時点でＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導するために例えば１５～３０℃で２～５時間、好ましくは２５℃で４～５時間振盪培養する。その後、培養液を遠心分離し、得られた菌体を洗浄後、超音波破砕処理またはリゾチームによる溶菌処理によって本発明の変異体を含む破砕物を得ることができる。破砕物は夾雑物が多いため、本分野において使用されている精製方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、アフィニティクロマトカラム、透析等を適宜組み合わせるによって本発明の変異体の精製を行うことが望ましい。アフィニティタグが付加された変異体は、当該アフィニティタグの性質に応じたアフィニティ担体を使用して簡便に精製することが可能である。また、使用する宿主または発現ベクターの種類によっては、ＩＰＴＧに加え、Ｌ－アラビノースなど他に必要な誘導物質を適切なタイミングで添加してもよい。
５．本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸の製造方法
　本発明の核酸の製造方法は、ポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５またはその変異ポリペプチドＷ７７Ｆ、またはＲＳ＿０００６５のホモログであるミスマッチエンドヌクレアーゼをコードする核酸において、例えば、配列番号１のアミノ酸配列における４７位に相当する位置にあるセリンをコードするコドンを、塩基性アミノ酸をコードするコドンに置換する工程を含む。特に限定はされないが、上記セリンに対応するコドンの置換は、アルギニンまたはリジンに対応するコドンへの置換が好適である。さらには、アルギニンに対応するコドンへの置換が特に好適である。他の位置のアミノ酸残基においても、同様にコドンを置換することが可能である。
　上記１．で説明したとおり、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、他のアミノ酸位置の変異と組み合わせてもよい。その場合においても、同様にコドンを置換することが可能である。
　例えば、上記のコドン置換を導入されたミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸としては、配列表の配列番号１６～３０の核酸が好適である。
　前記コドン変換は、公知の方法によって行えばよく、特に限定するものではないが、例えば、変異導入プライマーを用いた部位特異的変異導入など公知の手法による変異導入、または変異後の配列（もしくは配列の一部）を有する核酸の人工合成によって行うことができる。さらに、使用する宿主において発現可能にするためまたは発現量を増加させるためにコドンの最適化を行ってもよい。該コドン最適化は、本分野において通常使用されている方法によって行うことができる。
　さらに、本発明の核酸の製造方法では、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸において、宿主内でタンパク質生産を安定・向上させるためのコドン置換を組み合わせてもよい。
　本発明の核酸の製造方法には、前記２．で説明した核酸が適用できる。
６．本発明の二本鎖核酸の切断方法
　本発明の二本鎖核酸の切断方法は、二価の金属イオン（例えば、マグネシウムイオン）を含む適切な緩衝液中で、ミスマッチを有する二本鎖核酸に、前記１．に記載の本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を作用させることで行われる。本発明の方法により、Ｇ－Ｇミスマッチ、Ｔ－Ｔミスマッチ、Ｇ－ＴミスマッチまたはＴ－Ｇミスマッチを含む二本鎖核酸を切断することができる。
　本発明の二本鎖核酸の切断方法におけるミスマッチを有する二本鎖核酸は、その内部（通常の塩基対合を行う２個の塩基対の間）にミスマッチが存在するものであれば二本鎖核酸中に１つのミスマッチが存在するものに限定されることはなく、ミスマッチが間隔をおいて複数個存在するものであってもよいし、２以上の連続するミスマッチが存在していてもよい。本発明の二本鎖核酸の切断方法におけるミスマッチとしては、好ましくは二本鎖核酸の内部に存在する１以上８以下の連続するミスマッチ、より好ましくは１以上４以下の連続するミスマッチ、さらにより好ましくは２つの連続するミスマッチまたは１つのミスマッチが例示される。本発明の二本鎖核酸の切断方法において、二本鎖核酸中に複数のミスマッチが存在する場合は、該複数のミスマッチは、同種のミスマッチであってもよいし、または異なる種類のミスマッチであってもよい。
　さらに、国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレットなどに開示されているオリゴデオキシヌクレオチドを組合わせてもよい。ここで、前記オリゴデオキシヌクレオチドは、特定の塩基配列（例えば、目的とする遺伝子変異）を有する核酸とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチドである。当該オリゴデオキシヌクレオチドの両末端を蛍光物質および消光物質で標識することにより、変異検出用プローブとして使用することができる。該オリゴデオキシヌクレオチドの鎖長は、実施される反応の条件の下で前記特定の塩基配列を有する核酸とこのオリゴデオキシヌクレオチドとがハイブリダイズできるように、適宜決定できる。また、特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際にミスマッチを生じる位置は、このオリゴデオキシヌクレオチドの５’末端、３’末端の両方から少なくとも３ヌクレオチド以上離れていることが望ましい。
　また、検出したい遺伝子変異が、ミスマッチエンドヌクレアーゼの基質特異性と合致せず、そのままでは解析できない場合、国際公開第２０１６／１５２８１２号パンフレットなどに開示されている抑制オリゴヌクレオチドを組合わせてもよい。ここで、抑制オリゴヌクレオチドとは、非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドである。抑制オリゴヌクレオチドを非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じる少なくとも１つのミスマッチの数は、非標的核酸の選択的切断が起こる範囲であれば特に限定されず、抑制オリゴヌクレオチドの鎖長にもよるが、例えば、１～７個、１～５個、又は１～３個などが挙げられる。また、上記ミスマッチの数を抑制オリゴヌクレオチドの鎖長に占める％で表現すると、例えば、１～２０％、３～１５％、又は４～８％の範囲である。本態様について、塩基配列中の１つの塩基のみが相違する標的核酸、非標的核酸の組合せを例として説明する。当該抑制オリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせると、標的核酸、非標的核酸の間で相違する塩基との間でミスマッチ（以降、第１のミスマッチと称することがある）を生じるとともに、もう一つの別のミスマッチ（以降、第２のミスマッチと称することがある）を生じる。
　前記第１のミスマッチの塩基は、標的核酸と非標的核酸の間で相違する塩基に関連するものであり、共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるか否かは問わない。
　一方、第２のミスマッチは、共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるミスマッチ塩基である。特に限定はされないが、例えば、グアニン塩基－グアニン塩基、グアニン塩基－チミン塩基、又はチミン塩基－チミン塩基を認識・切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの場合は、これらから選択されるミスマッチが形成されるように抑制オリゴヌクレオチドが設計される。
　また当該抑制オリゴヌクレオチドは、非標的核酸とハイブリダイズさせた際には、前記の第２のミスマッチを生じるが、第１のミスマッチは生じない。
　以上のような性質を備えた抑制オリゴヌクレオチドを設計して使用することにより、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによる非標的核酸の選択的な切断が可能となる。本発明は、前記のような１つもしくは２つのミスマッチを形成できる抑制オリゴヌクレオチドの使用に限定されるものではなく、所望の核酸の選択的切断が起こる範囲で、３以上のミスマッチを生じる抑制オリゴヌクレオチドを設計し、使用してもよい。この場合、標的核酸および非標的核酸において生じる少なくとも１つのミスマッチが前記第２のミスマッチであればよく、その他のミスマッチについて、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるか否かは問わない。好ましくは、前記３以上のミスマッチは、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるものである。
　本発明の方法で使用できる国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレットなどに開示されているオリゴデオキシヌクレオチドまたは国際公開第２０１６／１５２８１２号パンフレットなどに開示されている抑制オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡで構成されるが、その一部をヌクレオチドアナログやＲＮＡとしてもよい。即ち、非標的核酸とハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを有する二本鎖核酸を形成する構造を有し、さらに前記ミスマッチが共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって認識・切断されるものであれば特に限定はされない。
　本発明の方法により切断されるミスマッチを有する二本鎖核酸としては、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡやその断片などの生物試料由来の核酸、および合成核酸等が例示される。また、ミスマッチを有する二本鎖核酸は、生物試料由来の混合物または生物試料由来の核酸と合成核酸との混合物を融解、再アニーリングさせて生成された核酸混合物であってもよい。例えば、変異を有する核酸と野生型の核酸を混合し、融解、再アニーリングした場合、ミスマッチが形成され、この部位でミスマッチエンドヌクレアーゼの切断を受ける。こうして生じたミスマッチエンドヌクレアーゼによる切断後の核酸断片の大きさを観察することで、変異の有無、位置を検証できる。本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼを利用することにより、ＰＣＲ法などの核酸増幅法の反応液にこのミスマッチエンドヌクレアーゼを添加するだけで変異解析を行うことが可能である。ＰＣＲ法においては、そのサイクル数を一定数以上増加させても、増幅効果が得られなくなることが知られている。添加されているプライマーまたは基質となるｄＮＴＰｓの枯渇や、プライマーと反応産物のアニーリングの競合がその主な原因であるが、この時には反応産物同士のアニーリングが起こっており、変異を有する鋳型と野生型の鋳型が混在していれば、これらから増幅した反応産物同士のアニーリングにより変異部位にミスマッチが生じることになる。したがって、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼの共存下でのＰＣＲを通常よりも増加させたサイクル数で実施することだけで、変異解析が可能になる。すなわち、本発明は、前記１．に記載のミスマッチエンドヌクレアーゼを二本鎖核酸に作用させることを含む、変異解析方法を提供する。
　本発明の二本鎖核酸の切断方法は、酸性高分子物質存在下で実施することができる。当該酸性高分子物質は、それが共存することによって、当該ポリペプチドのミスマッチ認識・切断活性を制御する効果が確認されている。当該効果は、試料中の核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、ポリアニオンであるものが好ましい。また糖骨格を有する酸性多糖あるいは直鎖炭素鎖を有する酸性多糖が好ましい。酸性高分子物質としては、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ラムナン硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレン硫酸、およびそれらの塩、あるいは標的核酸及び非標的核酸とは異なる核酸からなる群より選択された１種以上を使用することができる。
　本発明の二本鎖核酸の切断方法は、さらに、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）又はその変異体を組み合わせて実施してもよい。
７．本発明の二本鎖核酸の増幅方法
　核酸増幅反応の過程でも、本発明の二本鎖核酸の切断方法を実施することができる。核酸増幅の反応液にミスマッチエンドヌクレアーゼを添加することで、増幅過程の誤ったヌクレオチドの取り込みで生じたミスマッチを有する二本鎖核酸が切断される。この結果、反応開始前の鋳型核酸とは異なる配列の核酸の増幅が抑制される。こうして、エラー率の低減した核酸増幅が可能になる。
　すなわち、本発明は、前記１．に記載の本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体を用いてミスマッチを有する二本鎖核酸を切断する工程を含む、核酸増幅方法を提供する。該ミスマッチを有する二本鎖核酸を切断する工程は、核酸増幅工程と同時に行われてもよい。さらに、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに（ｃ）前記１．に記載のミスマッチエンドヌクレアーゼを含む組成物も、本発明の一態様である。
　同様に、さらに上記の核酸増幅反応用の組成物と鋳型となる核酸分子を含む組成物を調製する工程、および得られたこの組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程を含む核酸の増幅方法も、本発明の一態様である。
　上記の組成物は、さらに反応緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、およびインターカレーティング色素から選択される少なくとも１種を含んでもよい。また、上記の組成物を核酸増幅反応に使用する場合、上記の組成物は、さらに核酸増幅反応の鋳型となる核酸を含んでいても良い。当該組成物において、デオキシリボヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログを含んでいてもよい。上記の反応緩衝剤とは、反応溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物または混合物のことをいう。一般に弱酸とその塩、あるいは弱塩基とその塩の混合溶液は強い緩衝作用を持つので、反応緩衝剤としてｐＨコントロールの目的で広く用いられている。本発明に使用される反応緩衝剤としては、例えばＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ等のグッドバッファーやリン酸ナトリウムバッファー等のリン酸バッファーが挙げられる。上記の２価の金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、およびコバルトイオンが挙げられる。２価の金属イオンは、塩化物、硫酸塩、または酢酸塩等の塩の形態で供給され得る。
　本発明の二本鎖核酸の増幅方法としては、本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡを増幅する方法が例示される。ＤＮＡを増幅する方法としては、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＭＤＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、およびＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法等の等温核酸増幅法が挙げられる。
　上記の核酸増幅反応用の組成物中のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの濃度は、適宜各々の反応系でＤＮＡの増幅反応を阻害しない濃度やミスマッチを有する二本鎖核酸の切断に有効な濃度を検定して決定すればよい。
　上記の核酸増幅反応用の組成物に使用される少なくとも１対のプライマーとしては、各種の核酸増幅法に適した２個以上のプライマーが選択される。これらは、所望の増幅が生じるものであればＤＮＡ、ＲＮＡのほか、ＤＮＡの一部がＲＮＡに置換されている所謂キメラプライマーであっても良い。また、公知の核酸アナログを含むプライマーや検出などを目的とした蛍光色素などにより標識されたプライマーであってもよい。
　さらに本発明の組成物の別態様としては、キャリーオーバー防止のためのコンポーネントを含んでいてもよい。例えば、ｄＵＴＰやウラシルＮ－グリコシダーゼを含んでいてもよい。
　本発明の二本鎖核酸の増幅方法は、前述の酸性高分子物質存在下で実施することができる。当該酸性高分子物質の効果は、サンプルの核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。本発明の方法は、さらに、前述の増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）又はその変異体を組み合わせて実施してもよい。
８．本発明の核酸の増幅を抑制する方法
　本発明の核酸の増幅を抑制する方法は、前記１．に記載の本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体および適切に設計されたオリゴデオキシヌクレオチドまたは抑制オリゴヌクレオチドを利用して、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制することで行われる。
　従って、（ａ）前記特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチドまたは抑制オリゴヌクレオチド、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）少なくとも一対のプライマー、および（ｄ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法も、本発明の一態様である。また、この方法を使用して標的核酸の塩基配列と１個もしくは数個の塩基が異なる特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制することによって、標的核酸を優先的に増幅する方法も、本発明の一態様である。
　上記の（ａ）のオリゴデオキシヌクレオチドまたは抑制オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計された塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡであれば特に限定はなく、ＤＮＡの一部がＲＮＡに置換されているいわゆるキメラオリゴデオキシヌクレオチドであっても良い。また、本発明を特に限定するものではないが、このオリゴデオキシヌクレオチドまたは抑制オリゴヌクレオチドの３’末端は、該一本鎖ＤＮＡからのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を抑制するための修飾を施されていてもよい。たとえば、アミノ化などの修飾が例示される。また、該オリゴデオキシヌクレオチドまたは抑制オリゴヌクレオチドは、当該オリゴデオキシヌクレオチドまたは抑制オリゴヌクレオチドが結合する核酸がミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの切断を受ける限りにおいて、ホスホロチオエート化やその他の修飾によりデオキシリボヌクレアーゼからの切断から保護されていてもよい。さらに、検出などを目的とした蛍光色素や消光物質などにより標識されていてもよい。
　上記オリゴデオキシヌクレオチドまたは抑制オリゴヌクレオチドの鎖長は、実施される反応の条件の下で前記特定の塩基配列を有する核酸とこのオリゴデオキシヌクレオチドまたは抑制オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズできるように、適宜決定できる。また、特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際にミスマッチを生じる位置は、このオリゴデオキシヌクレオチドまたは抑制オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端の両方から少なくとも３ヌクレオチド以上離れていることが望ましい。
　例えば、高温での反応を包含するＰＣＲ法のような方法で、本発明の方法により特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する場合には、ミスマッチエンドヌクレアーゼも耐熱性を有するものを使用することが好ましい。前記１．に記載のミスマッチエンドヌクレアーゼには、ＰＣＲにおいても失活しない耐熱性を有する酵素が包含されており、このような用途に好適である。
　したがって、本発明はさらに、下記（ａ）～（ｄ）を含む核酸増幅反応用組成物を提供する：
　（ａ）特定の塩基配列を有する核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチドまたは抑制オリゴヌクレオチド；
　（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；
　（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；および
　（ｄ）前記１．に記載の本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体。
　上記の組成物は、さらに反応緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、およびインターカレーティング色素から選択される少なくとも１種を含んでもよい。また、上記の組成物は、さらに核酸増幅反応の鋳型となる核酸を含んでいてもよい。さらに、ｄＵＴＰやウラシルＮ－グリコシダーゼを含んでいてもよい。
　本発明の核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法は、任意の核酸増幅法において実施することができる。本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡを増幅する方法に特に好適である。たとえばＰＣＲ法、ＭＤＡ法、およびＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法等の等温核酸増幅法等で本発明を実施することができる。
　本発明の、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法は、任意の核酸を対象として実施することができる。ＤＮＡを増幅対象とする場合には、人工的に作製されたＤＮＡ混合物、環境由来試料や生物由来の試料、またはその試料より調製されたＤＮＡ混合物中に存在するＤＮＡが例示される。本発明を特に限定するものではないが、生物由来の試料としては、ヒト等の哺乳類由来の試料が例示される。また、本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡ混合物としては、断片化されたゲノムＤＮＡ混合物、ｍＲＮＡより逆転写反応により生じたｃＤＮＡ混合物、複数のＰＣＲ産物の混合物などが例示される。増幅が抑制される特定の塩基配列を有するＤＮＡとしては、分離されずにのこるｒＲＮＡ由来の逆転写産物や、プライマー同士の対合により生じる低分子ＤＮＡなどが例示される。後に機能的スクリーニングを行う遺伝子ライブラリーを増幅する場合には、陽性を示す既知の遺伝子の配列を持つＤＮＡの増幅を抑制することで、より効率的に未知遺伝子を探索できるライブラリーの作製も可能になる。
　本発明の方法におけるミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの濃度は、適宜各々の反応系でＤＮＡの増幅反応を阻害しない濃度やミスマッチを有する二本鎖核酸の切断に有効な濃度を検定して決定すればよい。オリゴヌクレオチドまたは抑制オリゴデオキシヌクレオチドの濃度は、鋳型量や目的ＤＮＡの増幅効率を勘案して、使用濃度を最適化し、決定すればよい。例えば増幅反応に使用されるプライマーの濃度の０．１倍～１０倍の濃度で実施可能である。
　上記のとおり本発明により、標的核酸を優先的に増幅する方法が提供される。当該方法は、さらに増幅された標的ＤＮＡを検出する工程を含んでいても良い。本明細書においては、本発明のこの態様のことを「本発明の核酸の検出方法」と記載することがある。例えば、ＤＮＡを検出対象とする本発明の検出方法によれば、検出対象でないＤＮＡ（特定の塩基配列を有するＤＮＡ）が検出対象のＤＮＡ（標的ＤＮＡ）に対して大過剰に存在する場合においても、本発明の核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法におけるオリゴヌクレオチドまたは抑制オリゴデオキシヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとにより検出対象でないＤＮＡを鋳型としたＤＮＡの増幅が抑制されるため、検出対象のＤＮＡの検出を行うことが可能となる。
　本発明の核酸の増幅を抑制する方法は、前述の酸性高分子物質存在下で実施することができる。当該酸性高分子物質の効果は、サンプルの核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。本発明の方法は、さらに、前述の増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）又はその変異体を組み合わせて実施してもよい。
９．本発明の核酸の検出方法
　本発明の核酸の検出方法は、上記８．に記載される本発明の核酸の増幅を抑制する方法により非標的核酸の増幅を抑制し、標的核酸を優先的に増幅する工程、および増幅された標的核酸を検出する工程を含む。本発明の核酸の検出方法は、例えば変異の存在が知られている遺伝子に対応する核酸について、野生型と変異型とを区別して検出することを可能にする。特定の塩基配列を有する核酸（非標的核酸）として、野生型の塩基配列を含有するＤＮＡを設定して本発明の検出方法を実施することにより、大過剰の正常対立遺伝子（すなわち野生型の塩基配列を有するＤＮＡ）の存在下における少数の変異対立遺伝子の検出が可能となる。例えば血中循環腫瘍ＤＮＡの検出や母親の血液中に含有されている少量の胎児ＤＮＡ配列の検出に本発明の方法は有用である。当該変異としては、微小欠失および点突然変異が例示される。なお、点突然変異によって生じた多型は一塩基多型（ＳＮＰｓ）と呼ばれる。本明細書においては、ＳＮＰｓのうち変異型の塩基配列を有するＤＮＡのことを、一塩基多型変異を有するＤＮＡと記載することがある。
　本発明を特に限定するものではないが、前記の少数の変異対立遺伝子としては、腫瘍マーカーとして利用される一塩基多型変異、癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異、および細胞の癌化との相関が知られている一塩基多型変異からなる群より選択された少なくとも１つの一塩基多型変異を含む核酸が好ましい。ＳＮＰｓには、腫瘍細胞に高頻度で認められるものや、癌治療用薬剤による治療効果や発癌との相関が知られているものがある。このようなＳＮＰｓとしては、Ｋ－ｒａｓ遺伝子、Ｂ－ｒａｆ遺伝子、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子のＳＮＰｓが例示される。Ｋ－ｒａｓ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、肺腺癌、甲状腺癌等において高頻度で認められる。Ｂ－ｒａｆ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、悪性黒色腫、甲状腺乳頭癌、非小細胞肺癌、肺腺癌等において高頻度で認められる。また、ＥＧＦＲ遺伝子の体細胞変異は、様々な固形腫瘍において高頻度で認められる。ゲフィチニブやエルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤による癌の治療は、癌組織のＥＧＦＲ遺伝子が特定の一塩基多型変異を有する場合に有効である可能性が高いことが知られている。一方、癌組織のＫ－ｒａｓ遺伝子が一塩基多型変異を有する場合には、ＥＧＦＲ阻害剤への抵抗性を示す可能性が高いことが知られている。
　本発明の検出方法は、生物由来試料から抽出したメチル化ＤＮＡを含む組成物を亜硫酸水素塩処理した後に得られたＤＮＡを材料として実施してもよい。本発明の検出方法によれば、大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の検出、あるいは大過剰のメチル化対立遺伝子の存在下における少数の非メチル化対立遺伝子の検出を行うことができる。
　前記の亜硫酸水素塩による処理として、メチル化ＤＮＡの検出に用いられる公知の亜硫酸水素塩法（バイサルファイト法）が利用できる。当該処理により非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは変化しない。さらに、このバイサルファイト処理済みの反応液をＰＣＲ法で増幅すると、ウラシルはチミンに変換され、メチル化シトシンはシトシンとなる。つまり特定の部位での大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の検出、あるいは大過剰のメチル化対立遺伝子の存在下における少数の非メチル化対立遺伝子の検出は、それぞれ大過剰のチミンの中のシトシンの存在、または大過剰のシトシンの中のチミンの存在を検証することに他ならない。ここで大過剰に存在するチミンあるいはシトシンを含有するＤＮＡからの増幅を抑制できれば、少数のメチル化対立遺伝子あるいは非メチル化対立遺伝子の存在はたやすく検証することができる。
　本発明の検出方法における標的核酸を検出する工程には、電気泳動、塩基配列解析、サイクリングプローブやＴａｑＭａｎプローブ等のプローブを用いたリアルタイムＰＣＲを利用することができる。これらの検定方法は一般的な手法をそのまま用いることが可能である。特にＨＲＭ（Ｈｉｇｈ　Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｍｅｌｔｉｎｇ）解析法を用いた場合、目的ＤＮＡの増幅と検出を１段階で行うことができ、迅速かつ簡便な目的ＤＮＡの検証が可能になる。
　本発明の核酸の検出方法は、前述の酸性高分子物質存在下で実施することができる。当該酸性高分子物質の効果は、サンプルの核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。本発明の方法は、さらに、前述の増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）又はその変異体を組み合わせて実施してもよい。
　以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実験方法１
（１－１）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の作製
　Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿Ｒ０００６５（ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＷＰ＿０１１０１１１２４．１、配列番号１）をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１６に示した。本明細書では、その塩基配列をもとに特定の部位に変異を導入した人工遺伝子を常法により作製した。得られた人工遺伝子は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオＵＳＡ社製）を用いて、プラスミドｐＥＴ６ｘＨＮ－Ｃ（タカラバイオＵＳＡ社製）に導入した。得られたプラスミドは、Ｃ末端側にヒスチジンタグが付加されたミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする塩基配列を有している。
　次に、当該プラスミドで大腸菌ＢＬ２１　ＤＥ３株（タカラバイオ社製）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含む１．５％アガロースＬＢプレート上にて、３７℃で終夜培養を行った。このプレートから３つのシングルコロニーを選択して１００μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地（以下ＬＢ－ＡＰ培地と称する）に植菌し、３７℃で終夜振とう培養を行った。さらに前記培養液３００μｌをＬＢ－ＡＰ培地６ｍｌに接種し、３７℃で終夜振とう培養した。ＯＤ６００値が０．６になった時に、培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えてさらに２５℃で４時間誘導培養を行った。その後ＯＤ６００値が４になった時に菌体を採取した。
　上記で得られた菌体を４００μｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％グリセロールおよび０．１５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む溶液（以下、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓと称する）に懸濁し、４℃で超音波破砕装置（Ｓｏｎｉｃ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）を使用した３０秒間の超音波処理を３回繰り返す操作を実施した。この操作により懸濁液は透明となった。超音波破砕後の懸濁液を４℃で１１０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収した。こうして得た粗抽出液をＮｉ樹脂精製に供した。
　Ｎｉ樹脂精製は、以下のようにして行った。即ち、５０μｌのＮｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）を１．５ｍｌのチューブに入れ、２５０μｌの滅菌蒸留水で２回洗浄したのちＢｕｆｆｅｒ　Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　ｐＨ７．５、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％グリセロールおよび５ｍＭ　イミダゾール）２５０μｌで２回平衡化した。平衡化したＮｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅを粗抽出液４００μｌに懸濁し、３０分間静置させた。その後、４℃で１２０００回転１０分間遠心した。上清を除去した後のＮｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅを１００μｌのＢｕｆｆｅｒ　Ａで３回洗浄した。その後、１００μｌのＢｕｆｆｅｒ　Ｂ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　ｐＨ７．５、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％グリセロールおよび３００ｍＭ　イミダゾール）でＮｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅから吸着物を溶出させた。得られた溶出液をミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液として、後述の試験に使用した。
（１－２）ヘテロダイマー型ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の作製
　上記１－１にて作製した変異体をコードする遺伝子を基に、ヘテロダイマー型ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする遺伝子を作製した。ＧＧ特異的ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする遺伝子およびＴＴ特異的ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体をコードする遺伝子について、リンカー（配列番号３５）を介してそれらを直列に接続した人工遺伝子を１－１と同様の方法により作製した。
（２）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の基質特異性評価試験
（２－１）核酸
　基質となる二本鎖ＤＮＡを形成する核酸として、ＮｕｃＳ－Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｔ（配列番号３１）およびＮｕｃＳ－Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｇ（配列番号３２）、ならびにＮｕｃＳ－Ｐｒｏｂｅ－Ｔ（配列番号３３）およびＮｕｃＳ－Ｐｒｏｂｅ－Ｇ（配列番号３４）を公知の方法にて化学合成した。これらＴｅｍｐｌａｔｅとＰｒｏｂｅを組合わせた二本鎖ＤＮＡを基質として使用した。２種のＰｒｏｂｅの５’末端にはＦＡＭ、３’末端にはＥｃｌｉｐｓｅ（登録商標）　Ｄａｒｋ　Ｑｕｅｎｃｈｅｒをそれぞれ付加した。
（２－２）切断特異性
　２．５μｌの１０ｘ緩衝液、１μｌの２５μＭ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ、１．５μｌの５μＭ　Ｐｒｏｂｅ、５μｌのミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液、および１５μｌの滅菌水を混合し、合計２５μｌとした。サーマルサイクラーにて、５５℃、６０秒を１サイクルとし、それを６０サイクル行った。または、サーマルサイクラーにて、５５℃、１５秒を１サイクルとし、それを６０サイクル行った。ここで、１０ｘ緩衝液の組成は、５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ９．２）、１４０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ　ＫＣｌ、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、および０．１％　ＢＳＡである。酵素希釈用緩衝液の組成は、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＤＴＴ、０．０１％　Ｇｅｌａｔｉｎ、０．５％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０、０．５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．０９％　ＢＳＡである。
実施例１　ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の作製
（１）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体　Ｓ４７Ｋ＋Ｎ７６Ｄ
　実験方法１（１－１）にしたがって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５における４７位のセリンをリジンへ、および７６位のアスパラギンをアスパラギン酸へそれぞれ置換した変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を作製し、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液を調製した。当該変異体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に、および核酸配列を配列番号２１に示した。
（２）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体　Ｓ４７Ｒ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｌ１２３Ａ
　実験方法１（１－１）にしたがって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５における４７位のセリンをアルギニンへ、７６位のアスパラギンをアスパラギン酸へ、および１２３位のロイシンをアラニンへそれぞれ置換した変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を作製し、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液を調製した。当該変異体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に、および核酸配列を配列番号２２に示した。
（３）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体　Ｓ４７Ｒ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｌ１２３Ｇ
　実験方法１（１－１）にしたがって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５における４７位のセリンをアルギニンへ、７６位のアスパラギンをアスパラギン酸へ、および１２３位のロイシンをグリシンへそれぞれ置換した変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を作製し、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液を調製した。当該変異体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に、および核酸配列を配列番号２３に示した。
（４）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体　Ｑ７８Ｒ＋Ｌ１２３Ｓ
　実験方法１（１－１）にしたがって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５における７８位のグルタミンをアルギニンへ、および１２３位のロイシンをセリンへそれぞれ置換した変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を作製し、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液を調製した。当該変異体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号９に、および核酸配列を配列番号２４に示した。
（５）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体　Ｑ７８Ｒ＋Ｌ１２３Ｔ
　実験方法１（１－１）にしたがって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５における７８位のグルタミンをアルギニンへ、および１２３位のロイシンをスレオニンへそれぞれ置換した変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を作製し、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液を調製した。当該変異体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に、および核酸配列を配列番号２５に示した。
（６）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体　Ｑ７８Ｒ＋Ｌ１２３Ｍ
　実験方法１（１－１）にしたがって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５における７８位のグルタミンをアルギニンへ、および１２３位のロイシンをメチオニンへそれぞれ置換した変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を作製し、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液を調製した。当該変異体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１に、および核酸配列を配列番号２６に示した。
（７）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体　Ｑ７８Ｒ＋Ｌ１２３Ｃ
　実験方法１（１）にしたがって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５における７８位のグルタミンをアルギニンへ、および１２３位のロイシンをシステインへそれぞれ置換した変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を作製し、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液を調製した。当該変異体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２に、および核酸配列を配列番号２７に示した。
（８）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体　Ｑ７８Ｒ＋Ｌ１２５Ｖ
　実験方法１（１－１）にしたがって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５における７８位のグルタミンをアルギニンへ、および１２５位のロイシンをバリンへそれぞれ置換した変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を作製し、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液を調製した。当該変異体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に、および核酸配列を配列番号２８に示した。
（９）ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体　Ｑ７８Ｒ＋Ｌ１２５Ａ
　実験方法１（１－１）にしたがって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ＿ＲＳ０００６５における７８位のグルタミンをアルギニンへ、および１２５位のロイシンをアラニンへそれぞれ置換した変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を作製し、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液を調製した。当該変異体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に、および核酸配列を配列番号２９に示した。
（１０）ヘテロダイマー型ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体
　実験方法１（１－２）に従って、変異体１（Ｓ４７Ｒ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｌ１２３Ａ；配列番号７）および変異体２（Ｑ７８Ｒ＋Ｌ１２３Ｍ；配列番号１１）を、リンカー（配列番号３５）を介して１本のポリペプチドとして発現する人工遺伝子を作製し、ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体溶液を調製した。当該変異体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に、および核酸配列を配列番号３０に示した。
実施例２　ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の基質特異性評価試験
　実施例１（１）～（９）にて作製したミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体、および野生型ミスマッチエンドヌクレアーゼ（ＰｆｕＮｕｃＳ）およびそのＷ７７Ｆ変異体について、実験方法１（２）に従って基質特異性評価試験を行った。その結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示したように、野生型ミスマッチエンドヌクレアーゼから基質特異性が変化した、ＧＧ特異的ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体およびＴＴ特異的ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体が得られた。
実施例３　ヘテロダイマー型ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体の基質特異性評価試験
　実施例１（１０）にて作製したヘテロダイマー型ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体について、実験方法１（２）に従って基質特異性評価試験を行った。
　その結果、ヘテロダイマー型ミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体は、野生型ミスマッチエンドヌクレアーゼから基質特異性が変化した、さらには実施例１（１）～（９）にて作製したミスマッチエンドヌクレアーゼ変異体とも異なる、ＧＴ／ＴＧミスマッチに特異的な基質特異性を示した。
　本発明は、遺伝子工学、生物学、医学、農業等幅広い分野において有用である。
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SEQ ID NO: 35: Amino acid sequence of Linker
SEQ ID NO: 36: Nucleic acid sequence encoding Linker

Claims (17)

  1. 　下記（Ａ）または（Ｂ）で示されるポリペプチド：
    （Ａ）下記（１）～（４）からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を形成しているグアニン（Ｇ）を有する核酸鎖を切断する活性を有するポリペプチド：
    　（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
    ４７位のセリンが塩基性アミノ酸残基に、および
    ７６位のアスパラギンが酸性アミノ酸残基に
    それぞれ置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    　（２）上記（１）記載の置換されたアミノ酸配列において、さらに１～１０個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記変異は、置換、欠失、挿入、および／または付加であり、上記（１）記載の置換されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は保持される、；
    　（３）上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される；および
    　（４）上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記（１）または（２）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される、または
    （Ｂ）下記（５）～（８）からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を形成しているチミン（Ｔ）を有する核酸鎖を切断する活性を有するポリペプチド：
    　（５）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、
    ７８位のグルタミンが塩基性アミノ酸残基に置換され、かつ
    １２３位のロイシンが中性（極性無電荷）アミノ酸残基または含硫アミノ酸残基に置換されるか、あるいは１２５位のロイシンが疎水性アミノ酸残基または含硫アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    　（６）上記（５）記載の置換されたアミノ酸配列において、さらに１～１０個のアミノ酸残基が変異されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記変異は、置換、欠失、挿入、および／または付加であり、上記（５）記載の置換されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は保持される；
    　（７）上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ただし、上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される；
    　（８）上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ただし、上記（５）または（６）記載の置換または変異されたアミノ酸配列におけるアミノ酸置換または変異は保持される。
  2. 　塩基性アミノ酸残基が、リジン、アルギニン、またはヒスチジンであり、
    酸性アミノ酸残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
    中性（極性無電荷）アミノ酸が、スレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、またはシステインであり、
    含硫アミノ酸が、システインまたはメチオニンであり、
    および
    疎水性（非極性）アミノ酸が、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、またはメチオニンである、
    請求項１記載のポリペプチド。
  3. 　配列番号６～１５より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載のポリペプチド。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  5. 　配列番号２１～３０より選択される塩基配列を含む、請求項４記載の核酸。
  6. 　請求項４または５記載の核酸および発現調節配列を含む発現ベクター。
  7. 　請求項６記載の発現ベクターで形質転換された、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する細胞。
  8. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドを二本鎖核酸に作用させる工程を包含する、ミスマッチを有する二本鎖核酸の切断方法。
  9. 　下記（ａ）～（ｄ）を含む組成物：
    　（ａ）請求項１～３のいずれか１項記載のポリペプチド；
    　（ｂ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを含む、（ａ）のポリペプチドで切断される二本鎖核酸を生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に（ａ）のポリペプチドで切断されない二本鎖核酸を生じるオリゴヌクレオチド；
    　（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；および
    　（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド。
  10. 　下記（１）および（２）の工程を含む核酸の増幅方法：
    　（１）鋳型になる核酸分子と下記（ａ）～（ｄ）とを含む組成物を調製する工程；
    　（ａ）請求項１～３のいずれか１項記載のポリペプチド；
    　（ｂ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを含む、（ａ）のポリペプチドで切断される二本鎖核酸を生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に（ａ）のポリペプチドで切断されない二本鎖核酸を生じるオリゴヌクレオチド；
    　（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；および
    　（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド；ならびに
    　（２）工程（１）により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程。
  11. 　核酸増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、等温核酸増幅法、またはＭＤＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で実施される請求項１０に記載の方法。
  12. 　下記（ａ）～（ｄ）の存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む、特定の塩基配列を含む核酸の増幅を抑制する方法：
    　（ａ）前記特定の塩基配列を含む核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシヌクレオチド；
    　（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；
    　（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；および
    　（ｄ）請求項１～３のいずれか１項記載のポリペプチド。
  13. 　核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、または等温核酸増幅法である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　標的ＤＮＡを優先的に増幅する方法であって、当該標的ＤＮＡと１個もしくは数個の塩基が異なる塩基配列のＤＮＡの増幅を請求項１２または１３記載の方法で抑制することを特徴とする方法。
  15. 　野生型塩基配列のＤＮＡと、当該ＤＮＡに一塩基多型変異が生じたＤＮＡとを区別して増幅する目的に使用される請求項１４に記載の方法。
  16. 　一塩基多型変異が、癌化、または癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　下記群から選択されるダイマー形態のポリペプチド：
    （１）請求項１（Ａ）記載のポリペプチドをサブユニットとして有するホモダイマー、
    （２）請求項１（Ｂ）記載のポリペプチドをサブユニットとして有するホモダイマー、および
    （３）請求項１（Ａ）および請求項１（Ｂ）記載のポリペプチドをサブユニットとして有するヘテロダイマー。
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