CN115803434A

CN115803434A - 具有提高的对基因变异的辨别性的dna聚合酶变体

Info

Publication number: CN115803434A
Application number: CN202180039263.1A
Authority: CN
Inventors: 金载钟; 林時圭; 柳正铉; 李甫媄; 金瑟琪; 车善浩
Original assignee: Genotech Corp
Current assignee: Genotech Corp
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2023-03-14
Also published as: EP4159851A1; JP2023537559A; US20230304082A1; WO2021242041A1; JP7470216B2

Abstract

本发明涉及一种属于A家族的DNA聚合酶变体及其用途，并且本发明涉及一种DNA聚合酶变体，当引物3'末端的碱基与模板互补时，顺利聚合，当引物3'末端的碱基与模板不互补时，聚合被抑制，从而容易辨别这两种情况，而且本发明涉及一种利用所述变体的PCR方法及包含所述变体的PCR试剂盒。本发明对单核苷酸多态性分析(SNP基因分型)及体细胞突变检测等有用。

Description

具有提高的对基因变异的辨别性的DNA聚合酶变体

技术领域

本发明涉及一种属于A家族的DNA聚合酶变体及其用途，并且本发明涉及一种DNA聚合酶变体，当引物3'末端的碱基与模板互补时，顺利聚合，当引物3'末端的碱基与模板不互补时，聚合被抑制，从而容易辨别(discrimination)这两种情况，而且本发明涉及一种利用所述变体的PCR方法及包含所述变体的PCR试剂盒。本发明对单核苷酸多态性分析(SNP基因分型(genotyping))及体细胞突变检测(somatic mutation detection)等有用。

背景技术

识别参与人类等各种生物体的性状、药物代谢、免疫反应、遗传性疾病和癌症等疾病等的遗传变异，即单核苷酸多态性、添加、缺失等遗传变异对于实现精准医疗非常重要，如治疗的预测、治疗方法的确定、治疗的预后及复发的观察等(Auton,Brooks et al.2015,Zhang,Qin et al.2004,Poste 2001,Nakagawa and Fujita 2018,Martincorena andCampbell 2015)。此外，遗传变异的识别或辨别对于农业食品领域的育种及选种、原产地及品种的鉴定等也非常有用。

遗传变异可能固有地存在于生物体中或者在生长过程中因环境或内源性原因而发生。在人体等遗传变异形态中最常见的是单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)。在以下发明的说明中，作为各种遗传变异的代表，以SNPs为例进行说明。

在用于鉴定包括人类在内的生物体所具有的SNPs的方法中，最普遍、经济和简便的方法是利用聚合酶的基因扩增技术，即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，特别是在PCR过程中可以实时测量基因变异量的定量实时PCR(quantitativereal time PCR，“qPCR”或“实时PCR”)是有用的。实时PCR是一种核酸的定性和定量检测技术，已应用在卫生、农业、食品、环境等各种领域中。20世纪90年代初开发的实时PCR正在不断克服技术上的局限性，发展成为更准确、精密的技术。

在使用实时PCR的基因鉴定试剂盒的开发中，非特异性信号的产生以及对突变和野生型基因序列的低辨别性被认为是实时PCR的代表性技术局限性。

特别地，为了开发实时PCR技术作为癌症、病原体检测等诊断技术，必须对非特异性信号进行控制。由于非特异性信号而出现假阳性时，检测的可靠性降低，特别是在需要检测极少量的无创性或微创性液体活检(liquid biopsy)等诊断技术中，为了准确诊断少量的目标变异，需要提高PCR效率并提高特异性(specificity)的技术。为了提高PCR的效率和特异性，一直在寻找开发添加到PCR溶液中的组合物、设计特殊的探针(probes)或引物(primers)或者改良酶的方法。

对于添加到PCR溶液中的组合物，主要研究了提高PCR的反应性的方法、用于消除引物二聚体(primer dimers)的形成、使用的引物与非特异性靶标结合形成的非特异性PCR产物的形成或者通过高GC比例及特异性高次结构的形成等使PCR效率降低的添加组合物。这些组合物包括二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、甜菜碱(betaine)等。

并且，已报道有如下方法：为了所谓的热启动(HotStart)PCR，通过阻断在低温下进行的反应并在高温下进行PCR来防止非特异性扩增的方法。其中，已知的热启动PCR方法包括：添加DNA聚合酶(DNAP)特异性单克隆抗体的方法[Biotechniques(1994)16(6):1134-1137]，添加抑制DNA聚合酶活性的单链寡核苷酸即适配体(aptamer)的方法[US/005693502A(1997)(Gold and Jayasena 1997)；J.Mol.Biol.271:100-111(1997)(Lin andJayasena 1997)；Nucleic Acids Research Supplement No.3:309-310(2003)(Ikebukuroand Noma2003)]，或使用双链核苷酸抑制非特异性DNA合成的方法，其中，所述双链核苷酸具有在低温下与DNA聚合酶结合的能力，并且抑制DNA聚合酶的活性，但在特定温度以上的PCR条件下不形成双螺旋，因此不抑制DNA聚合酶活性[J.Mol Biol.264(2):268-278(1996)(Dang and Jayasena 1996)；US 8,043,816 B2(2011)(Astatke,Chatterjee etal.2011)]。

在使用特殊的探针和/或引物提高PCR的效率和特异性的方法中，特殊的探针和引物用于特异性地检测扩增的目标产物，已经开发了使用具有高特异性的探针的方法。在实时PCR中使用SYBR green I或SYTO9等DNA结合荧光团时会检测到整体扩增产物，因此存在经常产生非特异性信号的问题。为了解决这个问题，开发了目标序列特异性探针(targetsequence specific probes)，这种探针包括：TaqMan探针(双标记信号水解探针(duallabelled signaling hydrolysis probe))[P Natl Acad Sci USA88,7276-280(1991)(Holland,Abramson et al.1991)]，分子信标(molecular beacons)[Methods.25,463-71(2001)(Mhlanga and Malmberg 2001)]，蝎子探针(scorpion probes)[NatBiotechnol.17,804-07(1999)(Baner,Nilsson et al.1998)]，LUX(light uponextension)引物[Nucleic acids research.30,e37(2002)(Nazarenko,Lowe etal.2002)]，Amplifluor引物[BioTechniques.26,552-58(1999)(Uehara,Nardone etal.1999)]等。

此外，为了选择性地扩增目标变异基因，开发了使用具有高特异性的引物或特殊的寡核苷酸阻断剂(oligonucleotides blocker)的方法等。使用具有高特异性的引物的方法包括突变阻滞扩增系统PCR(amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR)等方法，所述ARMS-PCR中以通过3'末端的一个碱基的差异来辨别的等位基因特异性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)为核心，除了一个变异序列之外，将附加的人工变异序列添加到3'末端[Mol Cell Probes.18.349-352(2004)(Jarry,Masson et al.2004)；Nucleic Acids Res 17.2503-2516(1989)(Newton,Graham et al.1989)；NatBiotechnol.17.804-807(1999)(Whitcombe,Theaker et al.1999)；Cytokine 71,278-282(2015)(Bergallo,Gambarino et al.2015)]。近年来，开发了SeeGene公司的双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide，DPO)[J.Am.Chem.Soc.126,4550-4556(2004)(Sherrill,Marshall et al.2004)；Biomol.Detect.Quantif.1 3-7(2014)(Reddington,Tuite et al.2014)；J.Clin.Microbiol.49.3154-3162(2011)(Higgins,Beniprashad etal.2011)]和Swift Biosciences公司的myT引物(http://www.swiftbiosci.com/technology/myt-primers)，它们是使用分离成两个部分的引物以在提高退火稳定性的同时保持模板和引物之间的错配区别的方法。

并且，还开发了许多DNA聚合酶，以容易用于抑制非特异性信号或提高等位基因的辨别性的PCR。PCR技术中通常使用耐热性DNA聚合酶。

DNA聚合酶分为七种以上的家族(family)，但用于PCR技术的耐热性聚合酶主要选自包括属于A家族的Taq DNA聚合酶在内的源自耐热性细菌的酶组以及包括属于B家族的Pfu DNA聚合酶在内的源自古细菌的酶组。其中，包括Taq DNA聚合酶在内的A家族DNA聚合酶通常具有5'→3'核酸酶活性，并且该5'→3'核酸酶活性具有核酸外切酶活性和核酸内切酶活性，该核酸内切酶活性部分也称为Flap核酸内切酶1(Flap Endonuclease 1，FEN1)。该活性对于通过水解探针(例如TaqMan探针)的降解来释放特异性信号(specific signal)非常重要。Taq DNA聚合酶没有3'→5'核酸外切酶活性，因此非常适于使用3'末端与模板DNA不互补的引物的PCR。在3'末端不互补的等位基因特异性(allele specific，AS)引物或突变阻滞扩增系统(amplification refractory mutation system，ARMS)引物的情况下，根据引物3'碱基(base)的匹配或错配，确定突变和野生型或两个等位基因的扩增效率，得出较好的临床结果。然而，在某些情况下，在3'错配的引物的情况下也会发生部分扩增，因此在用于检测混杂在许多野生型中的突变的高灵敏度诊断中经常发生鉴定错误。

在用于分子诊断的实时PCR中广泛使用具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的Taq DNA聚合酶。除非下文另有说明，否则DNA聚合酶的氨基酸序列遵循SEQ ID NO：1。

SEQ ID NO：1(野生型Taq DNA聚合酶)

MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE

Taq DNA聚合酶是属于包括大肠杆菌DNA聚合酶I的A家族的耐热性酶。Taq聚合酶分为作为小片段的5'核酸酶结构域(1-288aa)和作为大片段的聚合酶结构域(289-832)(Stoffel片段或KlenTaq)，并且Taq DNA聚合酶的聚合酶结构域中，手掌(Palm)亚结构域、手指(Finger)亚结构域和拇指(Thumb)亚结构域形成人类右手状结构，从而可以很好地与DNA双螺旋结构结合(Ollis,Brick et al.1985)(Kim,Eom et al.1995)(Eom,Wang etal.1996)。

通过对DNA聚合酶I的许多晶体结构研究，对考虑到引物、探针、NTP和Mg++等结合位点和活性位点的位置的各种氨基酸残基进行了变异研究。主要的探索区域包括：基序A区域(605-617残基)(Patel and Loeb 2000)(Suzuki,Yoshida et al.2000)，O-螺旋区(659-671残基)(Suzuki,Yoshida et al.2000)，手指结构域的Pα-螺旋区(704-707残基)(Kermekchiev,Tzekov et al.2003)，核苷酸结合口袋区(611-617残基)和立体门(stericgate)相关氨基酸残基(615残基)以及手掌结构域的第三个β-片层区(597-609残基)(Ong,Loakes et al.2006)，基序C区域(Strerath,Gloeckner et al.2007)，以及P'结构域区域(704-717残基)(Kermekchiev,Kirilova et al.2009)。

通过对这些区域的许多研究，开发了具有增加的酶活性的突变体(Ignatov,Miroshnikov et al.1998)，可用于热启动PCR的低温活性较弱的变体(低温敏感变体(Coldsensitive variant))(Kermekchiev,Tzekov etal.2003)(Wu,Walsh et al.2015)(Modeste,Mawby et al.2019)，对rNTP、疏水性碱基类似物(hydrophobic baseanalogues)等各种底物的利用性扩展的变体(Suzuki,Yoshida et al.2000)(Ong,Loakeset al.2006)(Strerath,Gloeckner et al.2007)(Loakes,Gallego et al.2009)(Schultz,Gochi et al.2015)(Fa,Radeghieri et al.2004)(Loakes,Gallego etal.2009)[US 9267130B2(2016)(Martin,Simpson et al.2016)]US2012/0258501A1(Bauer,Myers et al.2012)以用于逆转录PCR、重亚硫酸盐(bisulfite)PCR、易错PCR(error prone PCR)等，具有增强的延伸(Elongation)能力的变体(Yamagami,Ishino etal.2014)，对于血液和土壤等各种样品中含有的成分对PCR的抑制表现出抗性的变体(Kermekchiev,Kirilova et al.2009)等。

此外，还报道了一种辨别等位基因或突变特异性引物的3'末端序列的匹配和错配的能力增强的聚合酶[PLos One.9(5):e96640(2014)(Drum,Kranaster et al.2014)(Raghunathan and Marx 2019)；KR10-2017-0088373(2017)(Lee,Byeongcheol 2017)；US0034879A1(2013)(Skiragaila,Tubeleviciute et al.2013)；WO 082449A2(2015)(Marx,drum et al.2015)；US 9,267,120 B2(2016)(Reichert,Bauer et al.2016)；US 8,759,061 B1(Marx,Summerer et al.2014)Chembiochem 8(4)395-401(2007)(Strerath,Gloeckner et al.2007)。

在这些研究中，试图将推测为与引物和模板以及进入酶中的核苷酸在结构上结合的氨基酸残基作为对象来集中确保变异，并获得了惊人的成果。特别地，K508W、R536K、R587K和R660V突变体(Drum,Kranaster et al.2014)和Mut_ADL变体(变异位点为N483K、E507K、S515N、K540G、A570E、D578G、V586G、I614M)(Raghunathan and Marx 2019)等表现出高辨别性，并且活性也与野生型Taq聚合酶相当，因此被评价为具有充分的商业应用性。

然而，尽管对聚合酶的突变体的开发已经进行了20多年，但除了如上所述的研究之外，具有高辨别性的聚合酶的开发并不成功。原因在于，虽然开发了有效的库构建策略(CSR、spCSR、噬菌体展示(phage display))和定向进化(direct evolution)等非常容易制备及筛选变体的系统等，但是诸如利用抑制剂的添加来筛选高耐受性酶或筛选可利用非标准底物(noncanonical substrates)等的酶的选择压力(selection pressure)或筛选系统(screening system)的设置对于筛选具有高辨别性的酶不是很有用。

因此，通过基于准确的靶标的变异来筛选酶对于增加筛选具有优异的辨别性的酶的可能性非常重要。因此，与辨别性相关的聚合酶的结构域的发现可以确保开发具有优异的辨别性的酶。

发明内容

要解决的技术问题

在用于诊断癌症等的临床样本中的生物组织、血液、粪便、唾液等样本中的变异基因的检测中，除了极少量的变异DNA之外，还混杂有许多野生型DNA，因此非常难以特异性地检测出突变DNA。需要确保特异性(specificity)，以检测出混杂在许多野生型中而以1％以下的极微量存在的变异，并且为了临床应用，需要具有高稳健性(robustness)。特别地，需要确保对野生型序列的低假阳性和对突变序列的高特异性。由于这些原因，为了提高PCR效率和特异性以适用于癌症诊断等高灵敏度诊断，人们一直在寻求开发添加到PCR溶液中的组合物，设计特殊的探针和/或引物，或者研究改良酶的方法。

DMSO、甜菜碱等用于提高扩增效率的试剂，用于抑制DNA聚合酶的单克隆抗体，在室温等低温下抑制DNA聚合酶活性的寡核酸，又名适配体的添加通常会提高DNA扩增效率，并且抑制非特异性PCR产物扩增或引物二聚体(dimer)的形成。然而，当添加这些后，难以提高对等位基因的辨别性。

此外，使用特异性引物和探针等来特别是辨别单核苷酸多态性在技术上并不容易，并且不仅在普遍应用方面存在局限性，而且在特异性引物或探针的设计方面需要大量的努力和成本。

迄今为止，最容易实现且最有效的方法是如下的方法：通过使用AS引物或ARMS引物，以通过等位基因的变异序列导致的3'错配的存在与否来辨别等位基因，以提高对等位基因的辨别性。在使用有一个碱基错配的AS引物的情况下，与高PCR效率相比，通常对等位基因的辨别性较低，在有两个以上的碱基错配的ARMS引物的情况下，与使用AS引物时相比，对等位基因的辨别性提高，但PCR扩增效率降低，因此频繁地导致检测限(limit ofdetection，LOD)降低。

因此，通过使用具有提高的对3'错配和3'匹配的辨别性的突变DNA聚合酶来提高突变序列的检测特异性的研究仍在继续，但尽管做出了许多努力，但迄今为止尚未获得成功的变体。此外，筛选得到的突变DNA聚合酶的酶活性频繁降低，由此检测灵敏度也降低，从而在商业方面的利用率较低。

为了有效地检测等位基因或突变序列，需要继续开发一种不会降低聚合酶活性并提高对所使用的引物3'末端和模板DNA之间的匹配和错配的辨别性的酶。

因此，本发明的目的在于，为了解决如上所述的问题并有效地检测SNPs等基因变异，提供一种具有优异的辨别性的DNA聚合酶。

此外，更具体地，本发明的目的在于，提供一种DNA聚合酶变体以提高对模板和引物3'末端之间的错配和匹配的辨别性，具体地，提供一种A家族的DNA聚合酶，更具体地，提供一种包含Taq DNA聚合酶的耐热性DNA聚合酶。

此外，本发明的目的在于，提供一种使用所述DNA聚合酶变体进行PCR的方法和PCR试剂盒。

技术方案

为了获得具有高辨别性的DNA聚合酶变体，本发明人在酶中设置变异目标区域，并针对该区域集中构建各种变体来进行研究，从而确保了优异的变体。

本发明中发明人旨在提供一种表现出惊人的水平的对基因变异的辨别性或对等位基因的辨别性的DNA聚合酶。

本发明中探索的一个区域是属于相当于拇指结构域(Thumb domain)的尖端(Tip)的Ha(487-496)和Hb(515-521)(Kim,Eom et al.1995)(Li,Korolev et al.1998)之间的环区(497-514)(以下称为环(loop)区)(图1)的部分。该环区中几乎没有带负电荷的氨基酸，而有许多带正电荷的氨基酸，因此表现出高pI值。此外，该区域与已知为具有高的对匹配和错配的辨别性的酶的T.sp.Z05 DNA聚合酶(Z05)(SEQ ID NO：2)的环区仅存在三个氨基酸(R501、L505和Q509)的差异。

SEQ ID NO：2(TZ05 DNA聚合酶)

MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFVVFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATLAKKAEREGYEVRILTADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLKPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENILKNLDRVKPESVRERIKAHLEDLKLSLELSRVRSDLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPAPLEEAPWPPPEGAFVGFVLSRPEPMWAELKALAACKEGRVHRAKDPLAGLKDLKEVRGLLAKDLAVLALREGLDLAPSDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAAHRALLAERLQQNLLERLKGEEKLLWLYQEVEKPLSRVLAHMEATGVRLDVAYLKALSLELAEEIRRLEEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELRLPALGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPGLVHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPIRTPLGQRIRRAFVAEAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGKDIHTQTASWMFGVSPEAVDPLMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPHLREMGARMLLQVHDELLLEAPQARAEEVAALAKEAMEKAYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKG

SEQ ID NO：7(野生型Taq DNA聚合酶的环区)

497-ELGLPAIGKTEKTGKRST-514

该环区(497-514残基或其相应的位置)可以选自DNA聚合酶的一部分，更具体地，可以选自构成A家族DNA聚合酶的氨基酸序列的一部分。

Taq DNA聚合酶的α-螺旋Ha和Hb区域是A家族聚合酶中一定程度上的序列保守区(80％以上)、序列保守区(90％以上)或高度序列保守区(95％以上)，并且两个螺旋之间存在环区(野生型Taq DNA聚合酶的497-514残基或其相应的位置)，并且可以选择该区域以实现本发明的目的。

如本发明的示例所示，本发明中探索的环区是与DNA结合相关的区域。

如本发明的示例所示，该环区与在DNA和DNA聚合酶结合的情况下DNA聚合酶不能降解的现象相关。

如本发明的示例所示，该环区与在高KCl浓度下，即在200mM以上的KCl浓度下DNA聚合酶不能降解相关。

如本发明的示例所示，Taq DNA聚合酶或其变体的降解被DNA抑制，因此可知环区是与DNA结合相关的区域，更具体地，环区是与引物结合相关的区域。

此外，如本发明的示例所示，根据研究聚合酶的结构的结果，预测环区是Taq DNA聚合酶和作为底物的引物的结合区。

此外，如本发明的一个实例所示，通过该区域的变异制备的Taq DNA聚合酶变体(例如，“K511A”变体)表现出提高的对3'匹配和3'错配的PCR辨别性，因此表示本发明中提出的环区是与引物结合相关的区域。

在本申请之前未报道过本发明中提出的野生型Taq DNA聚合酶的497-514残基或其相应的位置的环区是与引物结合相关的区域。

本发明人利用环区来实现本发明的目的，即实现提高DNA聚合酶的底物特异性或降低底物特异性的目的。

提高底物的特异性是指在模板和引物之间的结合中，根据引物的3'末端碱基与模板是匹配还是错配，加入3'匹配引物时，与加入3'错配引物时相比，更有效地进行PCR和/或降低聚合过程中的错误。

相反，降低底物特异性可以举例为除了正常底物dNTPs之外，rNTP、疏水性碱基类似物(hydrophobic base analogues)等假底物或改性底物的使用变得容易和/或聚合错误增加。

本发明人在本发明中提供一种环区，所述环区用于筛选在引物的3'末端碱基与模板匹配时以及引物的3'末端碱基与模板不匹配时提高PCR的辨别性的变体，这是本发明的主要目的。

本发明的描述、实施方案和权利要求中的“辨别性(discrimination)”是指将目标基因序列中存在的基因变异或SNPs等等位基因变异与正常基因进行辨别，具体是指正常基因或变异基因模板与引物的3'末端碱基匹配时以及错配时的实时PCR中目标基因的扩增程度的差异。扩增程度的差异可以通过PCR之后进行电泳来确认，或者可以通过利用实时PCR的3'匹配与错配之间的Ct(或Cq)值之差(ΔCt＝3'错配的Ct值-3'匹配的Ct值)等来确认。

本发明的一个实施方案中，对于选自构成环区(野生型Taq DNA聚合酶的497-514残基或其相应的区域)的氨基酸中的一种以上的氨基酸，用其它氨基酸取代原氨基酸，从而可以实现本发明的目的。

本发明的一个实施方案中，表明可以通过该环区的许多代表性氨基酸变异来实现本发明的目的。

本发明的一个实施方案中，表明可以通过用其它氨基酸取代选自属于环区(野生型Taq DNA聚合酶的497-514残基或其相应的区域)的极性氨基酸中的氨基酸来实现本发明的目的。具体地，所述极性氨基酸可以选自带正电荷的氨基酸残基精氨酸(Arg或A)、组氨酸(His或H)、赖氨酸(Lys或K)、或者带负电荷的氨基酸残基天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)。

更具体地，本发明可以通过在Taq DNA聚合酶中选自K505、E507、K508、K511和R512中的氨基酸的取代来实现本发明的目的。

此外，在属于A家族的其它耐热性DNA聚合酶中也可以选择与Taq DNA聚合酶的环区(SEQ ID NO：7)相应的区域来产生具有提高的辨别性的DNA聚合酶变体。作为具体的一个实例，在Z05 DNA聚合酶(SEQ ID NO：2)的情况下，可以选择环区(499-517)作为与所述TaqDNA聚合酶的环区(497-514)相应的区域来产生聚合酶变体。

更具体地，在Z05 DNA聚合酶(SEQ ID NO：2)中，可以通过取代选自与环区(499-517)相应的氨基酸区域，优选为属于环区且作为带电氨基酸的R501、K507、K510、K513和R515中的一种以上的氨基酸来产生变体，并且与Taq DNA聚合酶的E507相应的Z05 DNA聚合酶的Q509也可以是取代的对象。

聚合酶的变异是指选择构成聚合酶的一系列氨基酸序列中的一种以上的氨基酸，将原序列中存在的氨基酸转变为选自其它生物体天然使用的19种氨基酸(在20种氨基酸中原氨基酸除外)中的一种氨基酸，或者对氨基酸进行化学或酶改性(例如糖基化(glycosylation)、胺化(amination)、酰化(acylation)、羟基化(hydroxylation)等)或者包含缺失和添加，在本发明中，聚合酶的变异是指原氨基酸被自然界中的其它19种氨基酸中的一种氨基酸取代。自然界中的20种氨基酸是指丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)、缬氨酸(Val或V)。

用于实现本发明的目的的DNA聚合酶变异通常可以通过改变编码(coding)聚合酶的基因序列来实现。改变的氨基酸的三联体密码子(triple codon)序列并不限制本发明。

此外，用于实现本发明的目的的DNA聚合酶变异中，表达DNA聚合酶的技术并不限制本发明的范围。例如，即使由于蛋白质表达和克隆载体的种类、用于表达的启动子的种类、便于纯化的标记(His标签等)、为宿主细胞优化基因序列、宿主细胞的种类(细菌、酵母、藻类、无脊椎动物细胞(昆虫)、植物细胞、哺乳动物细胞和体外翻译系统(in-vitrotranslation system)等)，使得该示例与本发明的具体实施方案不同，本发明的范围并不受限制。

此外，获得用于实现本发明的目的的DNA聚合酶变体的方法并不限制本发明。例如，用于层析的装置、缓冲液、树脂种类、柱的种类和沉淀方法、过滤方法等具体方法与本发明的示例不同并不限制本发明。

此外，本发明的实施方案中描述的引物仅用于说明本发明，并不限制本发明的范围。

在本发明中，PCR引物包括等位基因特异性引物(Allele specific primer，AS引物)或突变阻滞扩增系统(amplification refractory mutation system，ARMS)引物。

在本发明中，“3'错配”是指引物的3'末端与模板之间的错配，并且是指引物的3'末端的7个碱基或5个碱基中的一个以上的碱基与模板(或目标基因)不互补，更具体地，包括引物3'末端的最后一个碱基与模板的碱基不互补的情况。

在本发明中，“3'匹配”是指引物的3'末端与模板(或目标基因)之间的互补匹配，并且包括引物的3'末端的最后一个碱基与模板的碱基互补的情况。

本发明中的DNA聚合酶优选为属于A家族聚合酶(大肠杆菌(E.coli)Pol I类)的酶。该聚合酶可以选自耐热性细菌，优选可以选自源自耐热性真细菌(eubacteria)的DNA聚合酶，更优选可以选自源自栖热菌(Thermus)属、热袍菌(Thermotoga)属、热球菌(Thermococcus)属、奇异球菌(Deinococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属等的DNA聚合酶。此外，该DNA聚合酶可以应用于包含PCR的各种生物技术方法。

本发明的目的可以通过DNA聚合酶的环区或其相应的区域的变异来实现。

更具体地，本发明的目的可以通过Taq DNA聚合酶的环区(497-514残基)和A家族DNA聚合酶的相应的环区的变异来实现。

本发明的目的可以通过Taq DNA聚合酶的环区(497-514)或A家族DNA聚合酶的相应的环区的变异，通过一种以上的不带电荷的氨基酸(non-charged amino acid)的变异来实现。

本发明的目的可以通过Taq DNA聚合酶的环区(497-514)或A家族DNA聚合酶的相应的环区的变异，通过一种以上的带电(charged)氨基酸的变异来实现。

本发明的目的可以通过Taq DNA聚合酶的环区(497-514)或A家族DNA聚合酶的相应的环区的变异，通过一种以上的带正电荷的氨基酸(positive charged amino acid)的变异来实现。

本发明的目的可以通过取代Taq DNA聚合酶的505位置的K或属于A家族DNA聚合酶的相应的环区的氨基酸来实现。

本发明的目的可以通过取代Taq DNA聚合酶的507位置的E或属于A家族DNA聚合酶的相应的环区的氨基酸来实现。

本发明的目的可以通过取代Taq DNA聚合酶的508位置的R或属于A家族DNA聚合酶的相应的环区的氨基酸来实现。

本发明的目的可以通过取代Taq DNA聚合酶的511位置的K或属于A家族DNA聚合酶的相应的环区的氨基酸来实现。

本发明的目的可以通过取代Taq DNA聚合酶的512位置的R或属于A家族DNA聚合酶的相应的环区的氨基酸来实现。

作为本发明的一个实例，所测试的变异为G499R、K505G、K505I、K505L、K505M、K505F、E507G、E507K、E507Q、K508A、K508S、K508R、K511A、K511R、R512K、R512W等，优选为作为这些中的具有高变异辨别性的变体的、带正电荷的氨基酸被其它氨基酸取代的K505G、K505I、K505L、K505M、K505F、K508A、K508S、K508R、K511A、K511R、R512K或R512W变异Taq DNA聚合酶。

以下说明这些酶实现本发明的目的的原因。

观察本发明的环区内的变体的活性与结构的关系、引物与环区内氨基酸的静电结合(静电相互作用(electrostatic interaction))相关性，可以说明本发明的效果和独创性。

根据本发明的一个实例的变异区域是Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO：1)的环区(497-514；SEQ ID NO：7)或A家族DNA聚合酶的与其相应的环区。该环区是DNA结合区。本发明的一个实例中说明的由大肠杆菌(E.coli)的蛋白酶(OmpT)切割的区域是该环区，在该区域与DNA结合的状态下蛋白酶对该区域的切割受到抑制，因此在本发明中确认到该环区是DNA结合区。

令人惊讶的是，该环区存在于Ha(487-496)和Hb(515-521)之间(Kim,Eom etal.1995)(Li,Korolev et al.1998)(图1)，该区域相当于以往没有针对DNA聚合酶的改性进行集中探索的拇指结构域(Thumb domain)的尖端，并且预测该区域与引物的磷酸骨架结合。

本发明的一个实例中集中探索的区域是Taq DNA聚合酶的Ha(487-496)和Hb(515-521)之间的环区(497-514)。

如本发明人在发明的示例中所示，该区域是与DNA引物的结合相关的区域。

用于DNA聚合的引物的结合区被考虑为突变目标，以开发辨别3'匹配和3'错配的酶，这是本发明的主要目的。

本发明中对环区的集中探索为开发一种新型酶提供非常重要的途径，所述新型酶具有提高的对引物3'末端的碱基与模板DNA的匹配和错配之间的辨别性。

在本发明的一个实例中，作为变异目标的氨基酸残基可以优先选自Ha(487-496)和Hb(515-521)之间的环区(497-514)中带正电荷的氨基酸残基精氨酸(Arg或A)、组氨酸(His或H)、赖氨酸(Lys或K)、或者带负电荷的氨基酸残基天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)。

对于这些氨基酸残基，带电氨基酸残基在决定DNA聚合酶与DNA、特别是与引物之间的结合力方面起到非常重要的作用，因此它们的一种以上的变异改变DNA，特别是引物与酶的结合力，从而提高辨别性和/或提高PCR扩增活性和/或改变底物的特异性。

该环区内存在或新引入的带负电荷的氨基酸可以阻碍环与DNA引物磷酸骨架之间的结合，从而降低DNA聚合酶活性。

该环区内存在或新引入的带正电荷的氨基酸可以使环区与引物磷酸骨架容易结合，从而提高DNA聚合酶活性。

当用不带电荷的氨基酸取代该环区内存在的带正电荷的氨基酸时，可以保持高DNA聚合酶活性，并且可以制备具有优异的辨别性的酶。

有益效果

根据本发明，提供一种DNA聚合酶变体，通过包含Taq DNA聚合酶的A家族热稳定性DNA聚合酶的Ha和Hb结构域之间的环区的氨基酸变异，所述DNA聚合酶变体具有保持或提高的聚合酶活性，并且对根据模板和引物之间的碱基匹配或错配的辨别性得到提高。

如上所述的DNA聚合酶变体用于实时PCR，因此对单核苷酸多态性分析(SNP基因分型)和体细胞突变检测等有用。

此外，如上所述的DNA聚合酶变体可以用于PCR试剂盒以提高辨别性。

附图说明

图1中示出与引物结合的氨基酸集中存在的DNA聚合酶的区域。将水生栖热菌(T.aquaticus)、T.sp Z05、海栖热袍菌(T.maritima)、大肠杆菌(E.coli)、热坚芽孢杆菌(B.caldotenax)和嗜热嗜脂肪地芽孢杆菌(G.stearothermophilus)的DNA聚合酶区域中的Taq DNA聚合酶的环区(497-514残基)及其相邻区域进行了比较。

图2为Taq DNA聚合酶的SDS-PAGE照片。(A)是在大肠杆菌MV1184中表达的野生型Taq DNA聚合酶的降解结果。黑色箭头表示降解产生的蛋白条带。为了从DEAE柱层析纯化物中去除KCl，使用缓冲液A进行洗涤。S是野生型Taq DNA聚合酶标准产品。0，未进行过滤；1×，过滤一次；2×，过滤两次；S，标准Taq DNA聚合酶。(B)是对于在大肠杆菌MV1184中表达的包含E507K变异的Taq DNA聚合酶变体的DEAE柱层析纯化物，使用分别包含0mM、100mM、300mM、500mM的KCl的缓冲液A进行过滤的样品的SDS-PAGE照片。(C)是在大肠杆菌MV1184中表达的包含E507K变异的Taq DNA聚合酶变体的DEAE柱层析纯化物中，分别混合0μg、0.4μg、2.0μg、10μg、50μg的鲑鱼精DNA，或者混合在DEAE柱层析中洗脱Taq DNA聚合酶后的馏分的集合(BP)，然后使用缓冲液A进行过滤的样品的SDS-PAGE照片。M，蛋白质分子量标志物；C，未处理的试验组；BP，混合BP的样品。

图3是Taq DNA聚合酶降解产物的SDS-PAGE照片。1：未处理组，2：降解处理组。

图4是示出Taq DNA聚合酶切割位点(cleavage site)和OmpT识别位点(P)的示意图。

图5是示出Taq DNA聚合酶的环(loop)结构与DNA的紧密结构的示意图。Taq DNA聚合酶的拇指亚结构域(Thumb subdomain)中存在的α-螺旋Ha(487-496残基，灰色区域)、α-螺旋Hb(515-521残基，灰色区域)、α-螺旋I(527-552残基，灰色区域)和环(497-514残基，两个灰色区域之间)，不带电荷的氨基酸残基(灰色区域)，数字表示Taq DNA聚合酶中的氨基酸残基位置。

图6中示出使用K511A Taq DNA聚合酶变体和野生型Taq DNA聚合酶的实时PCR结果。使用BRAF-V600E和EGFR-T790M的正常DNA(w)和变异DNA(m)作为模板。数字表示使用正常DNA的实时PCR的Ct值减去使用变异DNA的实时PCR的Ct值的值。WT：使用野生型Taq DNA聚合酶的结果，K511A：使用K511A变异Taq DNA聚合酶的结果。

图7a和图7b是用于确认包含各区域的代表性变异的Taq DNA聚合酶变体的辨别性的实时PCR结果。BRAR-V600E和EGFR-T790M，是从表达各变异蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行粗纯化得到的样品，测试它们对变异的辨别性。WT：使用野生型Taq DNA聚合酶的结果，G499R、K505G、E507K、K508S、K511A和R512W分别是使用相应的Taq DNA聚合酶变体的结果。

图8中示出使用CS2-K511A和K511A Taq DNA聚合酶变体以及野生型Taq DNA聚合酶的实时PCR结果。使用EGFR-T790M的正常DNA(w)和变异DNA(m)作为模板。此时使用的正向引物为EGFR-ARMS-F。WT：野生型Taq DNA聚合酶，K511A：K511A变异Taq DNA聚合酶，CS2-K511A：CS2-K511A变异Taq DNA聚合酶。

最佳实施方式

本发明涉及一种DNA聚合酶变体，在与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有80％以上的同源性的DNA聚合酶或它们的Klenow片段(fragment)中Ha序列和Hb序列之间的环区的一种以上的氨基酸发生变异，并且与野生型DNA聚合酶相比，保持聚合活性，并具有提高的对等位基因或基因变异的辨别性。

此外，本发明涉及一种DNA聚合酶变体，其中，所述变异是氨基酸的取代、插入或缺失。

此外，本发明涉及一种DNA聚合酶变体，其中，所述环区是SEQ ID NO：1的497-514位置或其相应的位置。

此外，本发明涉及一种DNA聚合酶变体，其中，所述变异是选自SEQ ID NO：1的497、498、499、500、501、502、503、505、506、509、510、511、512、513、514或其相应的位置中的一个以上的位置处的氨基酸发生变异。

此外，本发明涉及一种DNA聚合酶变体，其中，除了所述位置的变异之外，还包含I707L和E708K中的一种以上的变异或其相应的位置处的一种以上的变异。

此外，本发明涉及一种DNA聚合酶变体，其中，所述具有80％以上的同源性的DNA聚合酶与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有90％以上、91％以上、92％以上、93％以上或94％以上的同源性，更优选具有95％以上、96％以上或97％以上的同源性。

此外，本发明涉及一种DNA聚合酶变体，其中，存在于所述SEQ ID NO：1的497、505、511和512位置或其相应的位置处的带电氨基酸中的一种以上发生变异。

此外，本发明涉及一种DNA聚合酶变体，其中，存在于所述SEQ ID NO：1的505、511和512位置或其相应的位置处的带正电荷的氨基酸中的一种以上发生变异。

此外，本发明涉及一种DNA聚合酶变体，其中，除了所述氨基酸变异位置之外，存在于SEQ ID NO：1的504、507、508、707、708位置或其相应的位置处的一种以上的氨基酸进一步发生变异。

此外，本发明涉及一种DNA聚合酶变体，所述DNA聚合酶变体包含选自G499R、K505G、K505I、K505L、K505M、K505F、E507A、E507G、E507S、E507R、E507Q、K508A、K508G、K508S、K511A、K511S、R512K、R512W或其相应的位置的相应变异中的一种以上的变异。

此外，本发明涉及一种DNA聚合酶变体，所述DNA聚合酶变体包含K511A、I707L和E708K三种氨基酸变异或其相应的位置处的变异。

此外，本发明涉及一种使用所述DNA聚合酶变体进行实时聚合酶链式反应的方法，其中，所述聚合酶链式反应对等位基因或基因变异的辨别性得到提高。

此外，本发明涉及一种聚合酶链式反应试剂盒，所述聚合酶链式反应试剂盒包含所述DNA聚合酶变体。

具体实施方式

下面通过列举实验例和实施例，对本发明进行具体说明。然而，本发明的范围并不限于以下实验例和实施例的记载范围，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。

<实验例1>定点诱变(Site directed mutagenesis)和Taq DNA聚合酶突变体的构建

为了蛋白质表达，使用载体pJR-Taq，所述载体pJR-Taq构建为使得Taq DNA聚合酶基因位于质粒pUC18中的lac启动子的下游。各变体是使用载体pJR-Taq作为模板并通过定点诱变进行构建。通过使用引物(SEQ ID NO：8-93)，如下所述对需要进行变异的氨基酸进行定点诱变来制得相应的Taq DNA聚合酶变体。使用Pfu DNA聚合酶(Enzynomics公司，韩国)进行PCR后，使用限制酶DpnI(Enzynomics公司，韩国)进行处理以去除未变异的模板DNA，并将变异的质粒转化到大肠杆菌DH5α中以获得变异质粒。通过碱基序列分析来确认所获得的质粒的目标序列区域的碱基序列变异。为了使载体中除Taq DNA聚合酶基因以外的其它区域的序列变异最小化，将获得的每个变异质粒用KpnI/BamHI进行切割以获得约1.3kb的片段，并且将pJR-Taq用KpnI/BamHI进行切割以与去除1.3kb的3.8kb片段连接，并转化到大肠杆菌DH5α中，从而构建用于表达每个变体的载体。

[表1]

<实验例2>用于表达Taq DNA聚合酶的培养

将用于表达Taq DNA聚合酶的载体引入到大肠杆菌MV1184(ompT⁺)或大肠杆菌DH5α(DE3)(ompT^-)中使用。为了表达TaqDNA聚合酶，将大肠杆菌在LB(1％胰蛋白胨(tryptone)、0.5％酵母提取物(yeast extract)、1％NaCl)培养基中在37℃下预培养8小时，并在2X YT培养基(1.6％胰蛋白胨、1.0％酵母提取物、0.5％NaCl)中接种1％的预培养液，并在37℃下进行主要培养。当培养液的O.D.600值达到0.4至0.6时，添加0.5mM IPTG并培养约4小时。将完成培养的培养液浸入冰水中进行冷却，然后进行离心分离(10000×g，10分钟，4℃)以回收菌体。将回收得到的菌体悬浮在培养液的1/10(v/v)的缓冲液A[50mMTris-Cl(pH 8.0)、1mM EDTA、1μM苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)]中后离心分离以进行回收，重复该方法两次以去除培养基成分，然后再次悬浮在培养液的1/20至1/40(v/v)的缓冲液A中来制备。

<实验例3>Taq DNA聚合酶的粗纯化样品的制备

从菌体悬浮液(实验例2)中将Taq DNA聚合酶进行粗纯化，所述菌体悬浮液是从100ml的培养液中获得的。对于菌体悬浮液，利用超声波破碎机(2mm的尖端(tip)，振幅(amplitude)为25％，9.9s/3s(开(on)/关(off))，5分钟)将菌体进行破碎，然后进行离心分离(10000×g、10分钟、4℃)以回收上清液。在上清液中添加RNase至50μg/ml，并在37℃下反应30分钟，然后在75℃下热处理20分钟，并进行离心分离(10000×g、10分钟、4℃)以回收上清液(4.0ml)，从而获得粗纯化样品。该样品用于蛋白质定量后的Taq DNA聚合酶活性比较实验。

<实验例4>Taq DNA聚合酶的高纯度纯化

从菌体悬浮液中将Taq DNA聚合酶以高纯度进行纯化，所述菌体悬浮液是从4.5L的培养液中获得的。利用超声波破碎机(13mm的尖端，振幅为90％，5.5s/9.9s(开(on)/关(off))，1小时)将菌体悬浮液(100ml)的菌体进行破碎，然后进行离心分离(10000×g、10分钟、4℃)以回收上清液。向其中添加硫酸链霉素(streptomycin sulfate)至5％，并搅拌30分钟后进行离心分离(10000×g、10分钟、4℃)以回收上清液。将该溶液在75℃下热处理20分钟，再次将样品进行离心分离(10000×g、10分钟、4℃)，将获得的上清液用0.45μm的针式过滤器(赛多利斯(Sartorius)公司)进行过滤。

为了Taq DNA聚合酶蛋白的析出，向滤液中添加硫酸铵至饱和度为65％，在4℃下经过1小时后，通过离心分离(10000×g、10分钟、4℃)回收沉淀物，并悬浮在10ml的缓冲液A中。将悬浮液置于透析膜(dialysis membrane，Spectra/Por，MWCO：12-14KDa)中，并在4L的缓冲液A中透析过夜以去除盐。将去除盐的溶液用0.45μm的针式过滤器(赛多利斯公司)进行过滤，并通过FPLC(AKTA，UPC-900)进行纯化。柱层析按照DEAE sephacel(30ml，XK26/20柱(column)中，GE医疗(GE healthcare))、SP琼脂糖凝胶(sepharose)(20ml，XK16/20柱中，GE医疗)、肝素琼脂糖凝胶(heparin sepharose)(10ml，HR16柱中，GE医疗)的顺序进行。此时，为了柱的平衡化，使用缓冲液A(DEAE sephacel和肝素琼脂糖凝胶柱)和缓冲液B[20mMHEPES(pH 6.9)、1mM EDTA、1μM PMSF](Q琼脂糖凝胶柱)，对于洗脱，使用含有1MKCl的缓冲液A和缓冲液B对蛋白质进行浓度梯度洗脱。在各柱的步骤中，回收包含Taq DNA聚合酶的洗脱馏分，并用VIVASPIN20(MW：50000)进行过滤工艺。该过滤工艺用于去除盐或者用于洗涤和浓缩以进行活性试验，将从各柱中回收的馏分用VIVASPIN20(MW：50000)进行浓缩，然后在下一步骤中用约15ml的缓冲液A或缓冲液B重复洗涤和过滤两次。

为了下一步骤的柱，用10～20ml的相同的缓冲液进行溶解后应用于下一个柱中，或者根据试验用适当的溶液进行溶解后进行试验。

使用SDS-PAGE(12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryl amide gelelectrophoresis))和Bradford检测试剂(assay reagent)(西格玛(Sigma)公司)，并使用牛血清白蛋白作为标准蛋白，对获得的各纯化步骤或最终纯化的Taq DNA聚合酶进行定量和比较。

将粗纯化或纯化的Taq DNA聚合酶与包含最终浓度为50mM Tris-Cl(pH 8.0)、0.5mM EDTA、1μM PMSF、4mM KCl、2mM MgCl₂、1mM DTT和50％甘油的储存缓冲液进行混合并在-70℃下储存，并用于试验。

<实验例5>Taq DNA聚合酶变体活性的比较

将量化的蛋白质量调整为恒定，并进行常规PCR(conventional PCR)方法之后进行电泳，以比较和测量Taq DNA聚合酶变体和野生型Taq DNA聚合酶的活性。使用λ噬菌体DNA(10pg，Bioneer公司)作为模板，并且使用分别为10pmol的λ(lambda)-F(5'-GGTGCTTTATGACTCTGCCGC)和λ-R(5'-AGCGCCCTTCCTGGTATGC)作为引物，在PCR缓冲液[10mMTris-Cl(pH 9.0)、1.5mM MgCl₂、40mM KCl、0.6M甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Methyl-α-D-glucopyranoside)、0.03％吐温20(tween 20)、3mM dNTP]中，在94℃(5分钟)下反应之后，在94℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(30秒)下重复反应30次，并在72℃(7分钟)下反应后终止，通过电泳确认DNA扩增产物(500bp)的形成。

<实验例6>用于确认辨别性的实时PCR

除非在以下实施例中另有说明，否则本发明的实施例中使用的PCR的组合物和条件如下。

对于用于PCR的模板DNA，合成各目标检测基因BRAF c.1799rc.A>T(p.V600E)(以下称为BRAF-V600E)的正常序列(SEQ ID NO：3)或突变序列(SEQ ID NO：4)和EGFR c.2369C>T(p.T790M)(以下称为EGFR-T790M)正常序列(SEQ ID NO：5)或突变序列(SEQ ID NO：6)的DNA，插入pTOP Blunt V2(Enzynomics公司，韩国)中并制备，并转化到大肠杆菌中，然后将培养并纯化的质粒DNA用限制酶进行切割并纯化，然后进行定量以成为2×10⁷拷贝(copy)/反应(reaction)并使用。

SEQ ID NO：3(BRAF V600正常(rc))

AAAATATTCGTTTTAAGGGTAAAGAAAAAAGTTAAAAAATCTATTTACATAAAAAATAAGAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAAATACTATAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCCAAAAATTTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAGATCTCATTTTCCTATCAGAGCAAGCATTATGAAGAGTTTAGGTAAGAGATCTAATTTCTATAATTCTGTAATATAATATTCTTTAAAACATAGTACTTCATCTTTCCTCTTAGAGTCAATAAGTATGTCTAAAACAATGATTAGTTCTATTTAGCCTATATA

SEQ ID NO：4(BRAF V600E突变(rc))

AAAATATTCGTTTTAAGGGTAAAGAAAAAAGTTAAAAAATCTATTTACATAAAAAATAAGAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAAATACTATAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCCAAAAATTTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAGATCTCATTTTCCTATCAGAGCAAGCATTATGAAGAGTTTAGGTAAGAGATCTAATTTCTATAATTCTGTAATATAATATTCTTTAAAACATAGTACTTCATCTTTCCTCTTAGAGTCAATAAGTATGTCTAAAACAATGATTAGTTCTATTTAGCCTATATA

SEQ ID NO：5(EGFR T790正常)

CACGCACACACATATCCCCATGGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAGCGCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATCTCCCCTCCCCGTATCTCCCTTCCCTGATTACCTTTGCGATCTGCACACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGCGTGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACACGTGGGGGTTGTCCACGCTGGCCATCACGTAGGCTTCCTGGAGGGAGGGAGAGGCACGTCAGTGTGGCTTCGCATGGTGGCCAGAAGGAGGGGCACATGGACCCCTTCCAGGTGAAGACGCATGAATGCGATCTTGAGTTTCAAAATACGTACTCATGGAGGAAAAGCTGTGCCTGCAAAAGACCTAGC

SEQ ID NO：6(EGFR T790M突变)

CACGCACACACATATCCCCATGGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAGCGCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATCTCCCCTCCCCGTATCTCCCTTCCCTGATTACCTTTGCGATCTGCACACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACACGTGGGGGTTGTCCACGCTGGCCATCACGTAGGCTTCCTGGAGGGAGGGAGAGGCACGTCAGTGTGGCTTCGCATGGTGGCCAGAAGGAGGGGCACATGGACCCCTTCCAGGTGAAGACGCATGAATGCGATCTTGAGTTTCAAAATACGTACTCATGGAGGAAAAGCTGTGCCTGCAAAAGACCTAGC

为了确认BRAF-V600E变异的辨别性，使用正向引物5'-GGGACCCACTCCATCGAGATTTCT-3'(BRAF-AS-F；SEQ ID NO：94)；反向引物5'-AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAG-3'(BRAF-R；SEQ ID NO：95)；信号探针5'-FAM-CTGTGAGGTCTTCATGAAG-BHQ1-3'(BRAF-P；SEQ ID NO：96)，为了确认EGFR-T790M变异的辨别性，使用正向引物5'-AGCCGAAGGGCATGAGCTGCA-3'(EGFR-AS-F；SEQ ID NO：97)或5'-AGCCGAAGGGCATGAGCTACA-3'(EGFR-ARMS-F；SEQ ID NO：98)；反向引物5'-AGTGTGGACAACCCCCACGTGTGC-3'(EGFR-R；SEQ ID NO：99)；信号探针5'-FAM-CGGTGGAGGTGAGGCAGATG-BHQ1-3'(EGFR-P；SEQ ID NO：100)。特别地，为了检测各目标检测基因BRAF-T790M和BRAF-V600E突变，正向引物是设计为最终3'末端碱基与变异基因匹配(matched)或正常基因与最终末端碱基错配(mismatched)的AS引物或ARMS引物。各引物使用量为10pmol/反应，探针使用量为20pmol/反应。

用于辨别BRAF-V600E的PCR是在95℃(5分钟)下进行之后，在95℃(30秒)、55℃(1分钟)下重复进行50次，用于辨别EGFR-T790M的PCR是在95℃(5分钟)下进行之后，在95℃(30秒)、55℃(40秒)下重复进行50次。

在进行PCR时，缓冲溶液包含10mM Tris、pH 9.0、1.5mM MgCl₂、1mM dNTPs、60mMKCl、10mM(NH₄)₂SO₄，并使用CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad公司，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州(CA)，美国)进行PCR。但是，根据实施方案，可以改变KCl的浓度，或者添加甜菜碱等，或者改变酶的种类(取决于野生型或Taq DNA聚合酶变体)或酶的量并使用。本发明的DNA聚合酶变体的匹配和错配的辨别性通过ΔCt来评价(ΔCt＝模板变体的Ct值-野生型模板的Ct值)。

<实施例1>根据大肠杆菌表达亲本菌株的Taq DNA聚合酶的降解

对于如所述<实验例2>所示培养和表达的Taq DNA聚合酶，在<实验例4>的DEAE柱层析纯化步骤中，使用缓冲液A并使用VIVASPIN20(MW：50000)，对Taq DNA聚合酶馏分进行过滤工艺。通过SDS-PAGE确认蛋白质。在此过程中，确认到在作为OmpT变异株的大肠杆菌BL21(DE3)(ompT^-)中表达的Taq DNA聚合酶没有发生降解，但在不是OmpT变异株的大肠杆菌MV1184(ompT⁺)中表达的野生型Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO：1)在纯化过程中部分降解(图2的A)。当进行相同的过程时，确认到特别是在大肠杆菌MV1184(ompT⁺)中表达的包含E507K变异的Taq DNA聚合酶的纯化过程中发生更多的降解(图2的B)。即，纯化过程中的TaqDNA聚合酶的降解根据表达亲本菌株表现出明显不同的模式，并且在包含E507K变异的TaqDNA聚合酶中发生更明确的降解现象。

<实施例2>通过高浓度KCl抑制Taq DNA聚合酶的降解

在<实验例4>的纯化过程中，在使用缓冲液A并使用VIVASPIN20(MW：50000)对通过DEAE柱层析获得的Taq DNA聚合酶进行过滤的洗涤过程中，该降解迅速发生。

获得如<实验例2>或<实验例4>所示培养和纯化的包含E507K变异的Taq DNA聚合酶变体的DEAE sephacel层析纯化步骤的馏分。对于50μl(约4μg的蛋白质/μl)的该馏分样品，分为仅使用不含KCl的缓冲液A(0M KCl)以及缓冲液A中含有100mM、300mM、500mM KCl的缓冲液A，用VIVASPIN20(MW：50000，用量为50ml)进行过滤工艺，然后用含有与各过滤试验组相同浓度的KCl的缓冲液A分别进行溶解来获得。通过SDS-PAGE确认各试验组的溶解的Taq DNA聚合酶的结果，在0mM KCl的情况下，发生降解，新观察到约33KDa和约60KDa的蛋白质片段，并且原DNA聚合酶显著减少。然而，在使用包含100mM以上的KCl的缓冲液A进行过滤的情况下，与未处理组没有差异。由此可知，Taq DNA聚合酶降解受到高浓度KCl的抑制(图2的B)。

<实施例3>DNA抑制Taq DNA聚合酶的降解

如<实验例2>或<实验例4>所示获得包含E507K变异的Taq DNA聚合酶的DEAEsephacel层析纯化步骤的馏分。在约50μl(约4μg的蛋白质/μl)的该馏分样品中混合两倍体积(100μl)的在DEAE柱层析中洗脱Taq DNA聚合酶后获得的馏分(BP)，然后如<实验例4>所示进行过滤工艺。使用缓冲液A并使用VIVASPIN20(MW：50000)进行过滤工艺，然后将用250μl的缓冲液A进行溶解并回收的样品通过SDS-PAGE确认蛋白质的降解。结果，令人惊讶的是，在未混合BP的样品中发生Taq DNA聚合酶的降解，但在混合BP的样品中没有发生降解。对于此时使用的BP进行Bradford测定和SDS-PAGE分析的结果，该BP中几乎不含蛋白质，但含有大量核酸(约50ng/μl)。由此推测降解的抑制因子是如DNA等核酸，而不是未知蛋白质。

根据这些结果，将所述包含E507K变异的Taq DNA聚合酶变体的DEAE sephacel层析纯化步骤的50μl的馏分分别与0.4μg DNA、2.0μg DNA、10μg DNA或50μg DNA(鲑鱼精核酸(salmon sperm nucleic acid)，西格玛公司)进行混合以制备样品，对于该样品，使用缓冲液A进行与上述相同的过滤工艺。结果，在用2.0μg以上的DNA处理的试验组中，没有像BP处理组那样发生Taq DNA聚合酶的降解。这显然是核酸抑制蛋白酶对Taq DNA聚合酶的降解。即，这些结果表明Taq DNA聚合酶的降解区域与对结合DNA重要的区域或结合DNA的区域相关。

<实施例4>Taq DNA聚合酶的降解位点的确定

对于如<实验例2>或<实验例4>所示培养和纯化的包含E507K变异的Taq DNA聚合酶变体的DEAE柱层析步骤中获得的样品(纯度为96％以上)，使用缓冲液A进行<实验例4>的过滤工艺和洗涤，并用缓冲液A进行回收，以在高达10℃下完全降解(图3)。当通过SDS-PAGE确认降解产物时，大片段(large fragment)大小约为60KDa，小片段(small fragment)大小约为33KDa。

将两个片段电泳的SDS-PAGE凝胶进行切割以回收蛋白质片段，并分析氨基酸序列的结果，未确定明确的切割位点，但确认到60KDa片段为Taq聚合酶的N-末端片段，33KDa片段为C-末端片段，并且基于这些结果，对33KDa的N-末端序列进行分析，以确认更准确的切割位点。结果，确认到33KDa片段的N-末端序列是R-S-T-S…。相应的Taq DNA聚合酶上的序列是R512-S513-T514-S515，因此确定切割位点在K511和R512之间(图4)。

有趣的是，切割位点K511和R512由两个连续的带正电荷的氨基酸组成。这些连续的带正电荷的氨基酸是众所周知的大肠杆菌的膜蛋白酶OmpT优选的切割位点。据报道，当在OmpT的切割位点两侧的几个氨基酸残基(P6至P'6)中存在带负电荷的氨基酸时，OmpT对蛋白质的切割受到显著抑制(Hritonenko and Stathopoulos 2007,Schechter andBerger 2012)。

根据所述实施例1至实施例3，与野生型Taq DNA聚合酶相比，包含E507K变异的TaqDNA聚合酶变体更容易降解，这似乎是因为相当于OmpT识别位点P5位置的E507从带负电荷的氨基酸谷氨酸(glu，E)转变为带正电荷的氨基酸赖氨酸(lys，K)。即，这被解释为E507K变异Taq DNA聚合酶对OmpT的底物亲和力比野生型Taq DNA聚合酶大，因此相邻的连续的带正电荷的氨基酸残基K511和R512[P1(K)-P1'(R)]之间的肽键容易被OmpT蛋白酶切割(图4)。

<实施例2>中在高浓度的KCl下DNA聚合酶的降解受到抑制被推测为KCl对OmpT蛋白酶降解活性的抑制。

此外，在<实施例3>中DNA聚合酶的降解被DNA抑制(图3)，由此可以看出，OmpT蛋白酶识别(相互作用(interaction))或切割的DNA聚合酶位点是与DNA结合的区域。因此，可以明确地知道Taq DNA聚合酶切割位点(511和512)及其周围位点是与DNA结合的区域。

<实施例5>Taq DNA聚合酶的结构和降解区域

在<实施例4>中确认的作为发生降解的区域的K511-R512区域存在于相当于TaqDNA聚合酶的拇指结构域的尖端的具有小α-螺旋结构的Ha(487-496)和Hb(515-521)之间的环区(497-514)中(图1和图5)。

Ha和Hb是A家族DNA聚合酶之间具有高同源性(homology)的保守(conserved)区，与此相比，环区由相对低保守(less conserved)区组成，但非常有趣的是，该区域的特征在于几乎没有带负电荷的氨基酸，并且包含许多带正电荷的氨基酸。

预测Taq DNA聚合酶的拇指结构域中存在的Ha(487-496)和Hb(515-521)之间的环结构存在于引物区域附近(Kim,Eom et al.1995)，但在本发明之前该区域的重要性未被注意到。原因在于，该区域在形成晶体结构时表现出高度无序态(highly disorderedstate)，因此尚未明确地确定与包括引物在内的底物的结构相关性。

使用蛋白质数据库(PDB，https://www.rcsb.org/)中的Taq DNA聚合酶和DNA结合的晶体结构DB的3KTQ信息，并通过PyMOL(https://pymol.org/2/)程序，对环区的结构进行详细分析。结果，确认到该环结构围绕着引物的骨架(backbone)区域(图5)。这种结构很好地表现出DNA对Taq DNA聚合酶降解的抑制的相关性。

从这些结构特性和Taq DNA聚合酶的降解特性可以确认该环区与包括引物在内的DNA结合有密切的相关性。

Taq DNA聚合酶的与引物相互作用的环区可以成为开发提高PCR的效率或提高辨别性的酶变体的非常重要的区域。环区的氨基酸可以成为重要的改性(工程(engineering))目标区域，特别是该区域中存在的带电氨基酸可以被选作一次改性目标。环区的带正电荷的氨基酸可以与引物的磷酸骨架的负电荷发生静电结合(静电相互作用)，因此可以期待它们的变异改变Taq DNA聚合酶的活性，特别是改变聚合酶表现出辨别性的特性。

<实施例6>K511A变体及R512A变体的制备及活性的验证

根据<实施例5>的推理，欲确认是否可以通过将存在于环区中的几个氨基酸中的作为优选切割区域的带正电荷的氨基酸K511和R512进行改性来筛选与作为本发明的主要目的的辨别性相关的变异株。通过<实验例1>的定点诱变方法，将K511和R512转变为代表性的不带电荷的氨基酸丙氨酸(A)来制备K511A和R512A Taq DNA聚合酶变体。使该变体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，将各变异Taq DNA聚合酶进行粗纯化并通过PCR测量活性的结果，K511A变异株具有与野生型Taq DNA聚合酶相当的高活性，但R512A变异株没有表现出TaqDNA聚合酶活性。根据这些结果推测，R512位置的带正电荷的氨基酸精氨酸而不是K511位置在与引物的结合中起到非常重要的作用。

<实施例7>K511A变体对匹配和错配的辨别性的确认

将<实施例6>中构建的K511A Taq DNA聚合酶变体如<实验例2>和<实验例4>所示进行培养，并通过SDS-PAGE纯化至95％以上的纯度。如<实验例6>所示，对纯化得到的K511ATaq DNA聚合酶进行实时PCR。在进行的PCR条件下，与野生型Taq DNA聚合酶相比，K511ATaqDNA聚合酶表现出显著高的辨别性。以BRAF-V600E[A和T碱基辨别(模板DNA；SEQ ID NO：5、6)]和EGFR-790M[C和T碱基辨别(模板DNA；SEQ ID NO：3、4)]为对象，确认K511A变体的3'-错配辨别性。结果表明，在使用K511A Taq DNA聚合酶的实时PCR中表现出对匹配和错配的高辨别性(图6)。

<实施例8>在使用K511A Taq的PCR中的KCl和甜菜碱的影响

在如<实施例7>所示进行纯化的K511A Taq DNA聚合酶变体中，将KCl浓度从0逐渐增加到180mM，同时通过将K511A变体与野生型Taq DNA聚合酶的活性变化进行比较来确认(表3)。野生型Taq DNA聚合酶即使在高KCl浓度下也保持较高的活性，并且随着酶浓度的增加，存在对匹配和错配之间的辨别性提高的趋势。特别地，在K511A变体的情况下，在检测BRAF-V600E时，在KCl浓度高达约80mM为止保持活性，在检测EGFR-T790M时，在KCl浓度高达约100mM为止保持活性，在这两种情况下，酶变体的浓度越高，辨别性越高，酶变体的浓度越低，辨别性越低。此外，在添加甜菜碱(1.25M)的条件下，K511A变体的活性略有增强，并且KCl的浓度范围进一步扩大，在检测BRAF-V600E时，在约100mM以上的KCl浓度下也表现出高活性，在检测EGFR-T790M时，在约120mM以上的KCl浓度下也表现出高活性。

根据这些实施例的结果，用于通过使用K511A变体对匹配和错配之间的PCR的最佳辨别性的KCl和甜菜碱的适当的浓度范围可以根据目标模板和引物或PCR条件而不同。

[表2]

在上表中，Mt表示突变DNA模板，Wt表示野生型DNA模板。

<实施例9>环区带电氨基酸变体的构建及其活性

选择环区中的带电氨基酸G499、K505、E507、K508、K511、R512，制备被20种氨基酸中的几种代表性氨基酸[A、G、S、K(或R)、E]取代的多个变体，并对该变体的活性和变异辨别性进行测试。各变体的制备是通过使用用于制备各变体的引物组并根据<实验例1>来进行。

对于变体，根据<实验例2>将大肠杆菌BL21(DE3)作为亲本菌株进行培养，并根据<实验例3>进行粗纯化，对于该粗纯化的样品，根据<实验例5>进行活性试验。通过Bradford分析法对粗纯化的各Taq DNA聚合酶样品进行定量，并且从约600ng的蛋白质开始，稀释2倍(300ng)、4倍(150ng)、16倍(75ng)、32倍(37.5ng)，并进行PCR反应来进行评价(表3)。

结果，在将K505、K508、K511和R512带正电荷的氨基酸取代为带负电荷的氨基酸谷氨酸时，即K505E、K508E、K511E和R512E变体没有表现出DNA聚合酶活性。然而，在用相同的带正电荷的氨基酸取代时，聚合酶活性仍然非常高。

根据这些结果可以确认，带正电荷的氨基酸赖氨酸(K)和精氨酸(R)是对活性非常重要的区域。据推测，这种聚合酶活性的丧失是由于将带正电荷的氨基酸取代为带负电荷的氨基酸，导致环区和包括引物在内的DNA骨架的磷酸之间的结合减弱而出现的结果。与此相反，确认到将环区内唯一的带负电荷的氨基酸谷氨酸(E507)取代为赖氨酸(K)的变体的活性没有降低，或者活性反而增加。此外，在将不带电荷的氨基酸G499取代为带正电荷的氨基酸精氨酸(R)时，表现出高酶活性。

[表3]

*在1/8以上的稀释下具有活性时，标记为+++；在1/2以上且小于1/8的稀释下具有活性时，标记为++；仅在小于1/2的稀释下具有活性时，标记为+；在原液中未检测到活性时，标记为-。

**辨别性表示为ΔΔCt。ΔΔCt＝使用野生型(WT)Taq DNA聚合酶的ΔCt-使用Taq DNA聚合酶变体的ΔCt，其中，ΔCt＝突变体模板(mutant template)的Ct-野生型模板(wild type template)的Ct。试验中通过对BRAF-V600E的变异辨别性进行评价。ΔΔCt小于1时，标记为-；ΔΔCt为1以上至小于3时，标记为+；ΔΔCt为3以上至小于6时，标记为++；ΔΔCt为6以上时，标记为+++。未检测到时，标记为nd。

<实施例10>DNA聚合酶变体的实时PCR辨别性的比较

对于如<实施例8>所示进行粗纯化的各种Taq DNA聚合酶变体中的活性为++以上的Taq DNA聚合酶变体粗纯化样品，根据实验例6进行用于确认辨别性的实时PCR。将该结果示于表3的辨别性一栏中。辨别性是通过比较ΔΔCt(ΔΔCt＝野生型Taq的ΔCt-突变体Taq的ΔCt，ΔCt＝突变体模板的Ct-野生型模板的Ct)值来进行评价。

试验变体中具有较高的辨别性的变体(++)为K511R、R512K，表现出非常高的辨别性的变体(+++)为K505G、K505I、K505L、K505M、K505F、K508S、K508R、K511A、R512W(表3及图7a、图7b)。

在实施例8中，在用带负电荷的氨基酸取代时，变体(K505E、K508E、K511E、R512E)的活性显著降低，类似地，在去除带负电荷的氨基酸时(E507G、E507K、E507Q)，活性较高，但辨别性未大幅提高。有趣的是，在带正电荷的氨基酸K和R相互取代时，即K511R和R512K变体保持活性，并且辨别性也略微增加。确认到在各变体中表现出高辨别性的变体是被不带电荷的氨基酸取代的变体K505G、K505I、K505L、K505M、K505F、K508S、K511A、R512W等。

根据这些结果推测，本发明的作为集中变异区域的环区中的带负电荷的氨基酸的存在阻碍DNA骨架的磷酸与环区的结合，从而导致活性降低，并且判断环区的带正电荷的氨基酸的存在诱导蛋白质和引物的坚固结合，从而有助于保持稳定的活性。确认到在环区的带正电荷的氨基酸取代为不带电荷的氨基酸时，活性损失不大，并且提高辨别性。

<实施例11>在K511A变体中进一步引入变异的变体的辨别性的确认

根据<实施例6>的方法构建在K511A Taq DNA聚合酶变体中进一步引入了I707L和E708K变异的变异株CS2-K511A，所述I707L和E708K是被报道为在低温下活性受到抑制的突变体(低温敏感突变体(cold sensitive mutant))的区域。如<实验例2>和<实验例4>所示进行培养，并通过SDS-PAGE纯化至95％以上的纯度。如<实验例6>所示，对纯化得到的CS2-K511A Taq DNA聚合酶进行实时PCR。此时，正向引物使用EGFR-ARMS-F。在进行的PCR条件下，与野生型Taq DNA聚合酶相比，CS2-K511A Taq DNA聚合酶在实时PCR中表现出非常高的对匹配和错配之间的辨别性(表3和图8)。

工业实用性

本发明的具有提高的辨别性的DNA聚合酶变体在保持或提高聚合酶活性的同时，对根据模板和引物之间的碱基匹配或错配的辨别性得到提高，从而可以容易地确认互补位置或不互补变异位置的存在以及是否扩增，因此容易地检测出少量多种混合的样品中的等位基因，并且容易地检测出包含微量突变的样品中的突变基因，而且可以广泛用于农业、水产业、畜产品等的基因检测或医学领域的诊断等。

序列表自由文本

附有电子文件

本发明是在韩国农林畜产食品部的支援下完成的课题的结果(课题编号：1545019806，课题名称：基于FenDEL的用于品种检测产品的实时基因分析技术的开发)。

序列表

<110> 基诺泰科有限公司

<120> 具有提高的对基因变异的辨别性的DNA聚合酶变体

<130> 基诺泰科-DNA聚合酶变体-200529

<160> 100

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 832

<212> PRT

<213> 水生栖热菌

<400> 1

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 2

<211> 834

<212> PRT

<213> 栖热菌属细菌

<400> 2

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

50 55 60

Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln

85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg

130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220

Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro

290 295 300

Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp

305 310 315 320

Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg

325 330 335

Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly

340 345 350

Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp

355 360 365

Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro

370 375 380

Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp

385 390 395 400

Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln

405 410 415

Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr

420 425 430

Gln Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala

435 440 445

Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu

450 455 460

Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala

465 470 475 480

Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu

485 490 495

Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly

500 505 510

Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His

515 520 525

Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys

530 535 540

Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly

545 550 555 560

Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu

565 570 575

Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu

580 585 590

Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu

595 600 605

Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu

610 615 620

Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile

625 630 635 640

His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala Val

645 650 655

Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu

660 665 670

Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr

675 680 685

Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys

690 695 700

Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly

705 710 715 720

Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn

725 730 735

Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn

740 745 750

Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val

755 760 765

Lys Leu Phe Pro His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln

770 775 780

Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu

785 790 795 800

Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala

805 810 815

Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala

820 825 830

Lys Gly

<210> 3

<211> 501

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

aaaatattcg ttttaagggt aaagaaaaaa gttaaaaaat ctatttacat aaaaaataag 60

aacactgatt tttgtgaata ctgggaacta tgaaaatact atagttgaga ccttcaatga 120

ctttctagta actcagcagc atctcagggc caaaaattta atcagtggaa aaatagcctc 180

aattcttacc atccacaaaa tggatccaga caactgttca aactgatggg acccactcca 240

tcgagatttc actgtagcta gaccaaaatc acctattttt actgtgaggt cttcatgaag 300

aaatatatct gaggtgtagt aagtaaagga aaacagtaga tctcattttc ctatcagagc 360

aagcattatg aagagtttag gtaagagatc taatttctat aattctgtaa tataatattc 420

tttaaaacat agtacttcat ctttcctctt agagtcaata agtatgtcta aaacaatgat 480

tagttctatt tagcctatat a 501

<210> 4

<211> 501

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

aaaatattcg ttttaagggt aaagaaaaaa gttaaaaaat ctatttacat aaaaaataag 60

aacactgatt tttgtgaata ctgggaacta tgaaaatact atagttgaga ccttcaatga 120

ctttctagta actcagcagc atctcagggc caaaaattta atcagtggaa aaatagcctc 180

aattcttacc atccacaaaa tggatccaga caactgttca aactgatggg acccactcca 240

tcgagatttc tctgtagcta gaccaaaatc acctattttt actgtgaggt cttcatgaag 300

aaatatatct gaggtgtagt aagtaaagga aaacagtaga tctcattttc ctatcagagc 360

aagcattatg aagagtttag gtaagagatc taatttctat aattctgtaa tataatattc 420

tttaaaacat agtacttcat ctttcctctt agagtcaata agtatgtcta aaacaatgat 480

tagttctatt tagcctatat a 501

<210> 5

<211> 448

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

cacgcacaca catatcccca tggcaaactc ttgctatccc aggagcgcag accgcatgtg 60

aggatcctgg ctccttatct cccctccccg tatctccctt ccctgattac ctttgcgatc 120

tgcacacacc agttgagcag gtactgggag ccaatattgt ctttgtgttc ccggacatag 180

tccaggaggc agccgaaggg catgagctgc gtgatgagct gcacggtgga ggtgaggcag 240

atgcccagca ggcggcacac gtgggggttg tccacgctgg ccatcacgta ggcttcctgg 300

agggagggag aggcacgtca gtgtggcttc gcatggtggc cagaaggagg ggcacatgga 360

ccccttccag gtgaagacgc atgaatgcga tcttgagttt caaaatacgt actcatggag 420

gaaaagctgt gcctgcaaaa gacctagc 448

<210> 6

<211> 448

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

cacgcacaca catatcccca tggcaaactc ttgctatccc aggagcgcag accgcatgtg 60

aggatcctgg ctccttatct cccctccccg tatctccctt ccctgattac ctttgcgatc 120

tgcacacacc agttgagcag gtactgggag ccaatattgt ctttgtgttc ccggacatag 180

tccaggaggc agccgaaggg catgagctgc atgatgagct gcacggtgga ggtgaggcag 240

atgcccagca ggcggcacac gtgggggttg tccacgctgg ccatcacgta ggcttcctgg 300

agggagggag aggcacgtca gtgtggcttc gcatggtggc cagaaggagg ggcacatgga 360

ccccttccag gtgaagacgc atgaatgcga tcttgagttt caaaatacgt actcatggag 420

gaaaagctgt gcctgcaaaa gacctagc 448

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 水生栖热菌

<400> 7

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

1 5 10 15

Ser Thr

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

tttgacgagc taagacttcc cgccatcggc 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gccgatggcg ggaagtctta gctcgtcaaa 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

cccgccatcg gcgctacgga gaagaccggc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

gccggtcttc tccgtagcgc cgatggcggg 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

cccgccatcg gcgaaacgga gaagaccggc 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gccggtcttc tccgtttcgc cgatggcggg 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

cccgccatcg gctctacgga gaagaccggc 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

gccggtcttc tccgtagagc cgatggcggg 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

cccgccatcg gcggtacgga gaagaccggc 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

gccggtcttc tccgtaccgc cgatggcggg 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

cccgccatcg gcagaacgga gaagaccggc 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

gccggtcttc tccgttctgc cgatggcggg 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

cccgccatcg gcttcacgga gaagaccggc 30

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

gccggtcttc tccgtgaagc cgatggcggg 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

cccgccatcg gcattacgga gaagaccggc 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

gccggtcttc tccgtaatgc cgatggcggg 30

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

cccgccatcg gccttacgga gaagaccggc 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

gccggtcttc tccgtaaggc cgatggcggg 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

cccgccatcg gcatgacgga gaagaccggc 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

gccggtcttc tccgtcatgc cgatggcggg 30

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

cccgccatcg gctggacgga gaagaccggc 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

gccggtcttc tccgtccagc cgatggcggg 30

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

atcggcaaga cggctaagac cggcaagcgc 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

gcgcttgccg gtcttagccg tcttgccgat 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

atcggcaaga cgaagaagac cggcaagcgc 30

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

gcgcttgccg gtcttcttcg tcttgccgat 30

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

atcggcaaga cgtctaagac cggcaagcgc 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gcgcttgccg gtcttagacg tcttgccgat 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

atcggcaaga cgggtaagac cggcaagcgc 30

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

gcgcttgccg gtcttacccg tcttgccgat 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

atcggcaaga cgcagaagac cggcaagcgc 30

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

gcgcttgccg gtcttctgcg tcttgccgat 30

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

gagaagaccg gcgctcgctc caccagcgcc 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

ggcgctggtg gagcgagcgc cggtcttctc 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

gagaagaccg gcagacgctc caccagcgcc 30

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

ggcgctggtg gagcgtctgc cggtcttctc 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

gagaagaccg gcgaacgctc caccagcgcc 30

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

ggcgctggtg gagcgttcgc cggtcttctc 30

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

gagaagaccg gctctcgctc caccagcgcc 30

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

ggcgctggtg gagcgagagc cggtcttctc 30

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

gagaagaccg gcggtcgctc caccagcgcc 30

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

ggcgctggtg gagcgaccgc cggtcttctc 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

gagaagaccg gcgttcgctc caccagcgcc 30

<210> 51

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

ggcgctggtg gagcgaacgc cggtcttctc 30

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

gagaagaccg gcattcgctc caccagcgcc 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

ggcgctggtg gagcgaatgc cggtcttctc 30

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

gagaagaccg gccttcgctc caccagcgcc 30

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

ggcgctggtg gagcgaaggc cggtcttctc 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

gagaagaccg gcatgcgctc caccagcgcc 30

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

ggcgctggtg gagcgcatgc cggtcttctc 30

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

gagaagaccg gcttccgctc caccagcgcc 30

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

ggcgctggtg gagcggaagc cggtcttctc 30

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

gagaagaccg gctatcgctc caccagcgcc 30

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 61

ggcgctggtg gagcgatagc cggtcttctc 30

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 62

gagaagaccg gctggcgctc caccagcgcc 30

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 63

ggcgctggtg gagcgccagc cggtcttctc 30

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 64

aagaccggca aggcctccac cagcgccgcc 30

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

ggcggcgctg gtggaggcct tgccggtctt 30

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 66

aagaccggca aggaatccac cagcgccgcc 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

ggcggcgctg gtggattcct tgccggtctt 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 68

aagaccggca agtcttccac cagcgccgcc 30

<210> 69

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 69

ggcggcgctg gtggaagact tgccggtctt 30

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

aagaccggca agggttccac cagcgccgcc 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 71

ggcggcgctg gtggaaccct tgccggtctt 30

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 72

aagaccggca agaagtccac cagcgccgcc 30

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 73

ggcggcgctg gtggacttct tgccggtctt 30

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 74

aagaccggca agttctccac cagcgccgcc 30

<210> 75

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 75

ggcggcgctg gtggagaact tgccggtctt 30

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 76

aagaccggca agatttccac cagcgccgcc 30

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 77

ggcggcgctg gtggaaatct tgccggtctt 30

<210> 78

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 78

aagaccggca agctttccac cagcgccgcc 30

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 79

ggcggcgctg gtggaaagct tgccggtctt 30

<210> 80

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 80

aagaccggca agatgtccac cagcgccgcc 30

<210> 81

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 81

ggcggcgctg gtggacatct tgccggtctt 30

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 82

aagaccggca aggtttccac cagcgccgcc 30

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 83

ggcggcgctg gtggaaacct tgccggtctt 30

<210> 84

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 84

aagaccggca agtggtccac cagcgccgcc 30

<210> 85

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 85

ggcggcgctg gtggaccact tgccggtctt 30

<210> 86

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 86

aagaccggca agtattccac cagcgccgcc 30

<210> 87

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 87

ggcggcgctg gtggaatact tgccggtctt 30

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 88

aagaccggca agcactccac cagcgccgcc 30

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 89

ggcggcgctg gtggagtgct tgccggtctt 30

<210> 90

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 90

gtgcgggcct ggcttgagaa gaccctggag 30

<210> 91

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 91

ctccagggtc ttctcaagcc aggcccgcac 30

<210> 92

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 92

cgggcctgga ttaagaagac cctggaggag 30

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 93

ctcctccagg gtcttcttaa tccaggcccg 30

<210> 94

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 94

gggacccact ccatcgagat ttct 24

<210> 95

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 95

aactcttcat aatgcttgct ctgatag 27

<210> 96

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 96

ctgtgaggtc ttcatgaag 19

<210> 97

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 97

agccgaaggg catgagctgc a 21

<210> 98

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 98

agccgaaggg catgagctac a 21

<210> 99

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 99

agtgtggaca acccccacgt gtgc 24

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 100

cggtggaggt gaggcagatg 20

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种DNA聚合酶变体，在与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有80％以上的同源性的DNA聚合酶或它们的Klenow片段中选自497、498、499、500、501、502、503、505、506、509、510、511、512、513、514位置或其相应的位置中的一个以上的位置处一种以上的氨基酸发生变异，并且与野生型DNA聚合酶相比，保持聚合活性，并具有提高的对等位基因或基因变异的辨别性。

2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述变异是氨基酸的取代、插入或缺失。

3.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述具有80％以上的同源性的DNA聚合酶与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有90％以上的同源性。

4.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述具有80％以上的同源性的DNA聚合酶与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有95％以上的同源性。

5.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，存在于497、505、511、512位置处以及在其相应的位置处的带电氨基酸中的一种以上发生变异。

6.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，存在于505、511和512位置处以及在其相应的位置处的带正电荷的氨基酸中的一种以上发生变异。

7.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，在504、507、508位置以及其相应的位置处的一种以上的氨基酸进一步发生变异。

8.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述DNA聚合酶变体包含G499R、K505G、K505I、K505L、K505M、K505F、E507A、E507G、E507S、E507R、E507Q、K508A、K508G、K508S、K511A、K511S、R512K、R512W以及在其相应的位置处的一种以上的变异。

9.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述DNA聚合酶变体进一步包含I707L、E708K以及在其相应的位置处的一种以上的变异。

10.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述DNA聚合酶变体包含K511A、I707L和E708K三种氨基酸变异或在其相应的位置处的三种氨基酸变异。

11.一种使用权利要求1至10中任一项所述的DNA聚合酶变体进行实时聚合酶链式反应的方法，其中，所述聚合酶链式反应对等位基因或基因变异的辨别性得到提高。

12.一种聚合酶链式反应试剂盒，其包含权利要求1至10中任一项所述的DNA聚合酶变体。

Claims

1.一种DNA聚合酶变体，在与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有80％以上的同源性的DNA聚合酶或它们的Klenow片段中Ha序列和Hb序列之间的环区的一种以上的氨基酸发生变异，并且与野生型DNA聚合酶相比，保持聚合活性，并具有提高的对等位基因或基因变异的辨别性。

2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述环区是SEQ ID NO：1的497-514位置或其相应的位置。

3.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述变异是氨基酸的取代、插入或缺失。

4.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述具有80％以上的同源性的DNA聚合酶与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有90％以上的同源性。

5.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述具有80％以上的同源性的DNA聚合酶与由SEQ ID NO：1组成的Taq DNA聚合酶具有95％以上的同源性。

6.根据权利要求1所述的DNA聚合酶变体，其中，所述变异发生在选自SEQ ID NO：1的497、498、499、500、501、502、503、505、506、509、510、511、512、513、514或在其相应的位置中的一个以上的位置处。

7.根据权利要求6所述的DNA聚合酶变体，其中，存在于497、505、511、512位置处或在其相应的位置处的带电氨基酸中的一种以上发生变异。

8.根据权利要求6所述的DNA聚合酶变体，其中，存在于505、511和512位置处或在其相应的位置处的带正电荷的氨基酸中的一种以上发生变异。

9.根据权利要求6所述的DNA聚合酶变体，其中，在504、507、508位置或其相应的位置处的一种以上的氨基酸进一步发生变异。

10.根据权利要求6所述的DNA聚合酶变体，其中，所述DNA聚合酶变体包含选自G499R、K505G、K505I、K505L、K505M、K505F、E507A、E507G、E507S、E507R、E507Q、K508A、K508G、K508S、K511A、K511S、R512K、R512W中的一种以上的变异或在其相应的位置处的一种以上的变异。

11.根据权利要求6所述的DNA聚合酶变体，其中，所述DNA聚合酶变体进一步包含I707L和E708K中的一种以上的变异或在其相应的位置处的一种以上的变异。

12.根据权利要求6所述的DNA聚合酶变体，其中，所述DNA聚合酶变体包含K511A、I707L和E708K三种氨基酸变异或在其相应的位置处的变异。

13.一种使用权利要求1至12中任一项所述的DNA聚合酶变体进行实时聚合酶链式反应的方法，其中，所述聚合酶链式反应对等位基因或基因变异的辨别性得到提高。

14.一种聚合酶链式反应试剂盒，其包含权利要求1至12中任一项所述的DNA聚合酶变体。