JP7470216B2 - 遺伝子変異に対する区分性が向上したｄｎａ重合酵素変異体 - Google Patents

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Description

本発明は、ファミリーＡに属するＤＮＡ重合酵素変異体及びその利用に関し、プライマー３’末端の塩基が鋳型と相補的である場合には重合が円滑に起き、非相補的である場合には重合が抑制され、両方の場合の区別（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）がしやすくなるＤＮＡ重合酵素変異体、この変異体を用いたＰＣＲ方法、及びこの変異体を含むＰＣＲキットに関する。本発明は、単一塩基多型の分析（ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）及び体細胞突然変異の検出（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）などに有用である。
人間などの様々な生命体の形質、薬物代謝、免疫学的反応、遺伝病と癌のような疾患などに関与する遺伝的変異、すなわち、単一塩基多型、付加、欠失などの遺伝的変異を確認することは、治療の予測、治療方法の決定、治療予後及び再発の観察など、精密医療の具現において非常に重要である（Ａｕｔｏｎ，Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｚｈａｎｇ，Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｐｏｓｔｅ ２００１，Ｎａｋａｇａｗａ ａｎｄ Ｆｕｊｉｔａ ２０１８，Ｍａｒｔｉｎｃｏｒｅｎａ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ２０１５）。また、遺伝的変異の確認又は区別は、農食品分野において種の育種及び選別、原産地及び品種の判別などにも非常に有用である。
遺伝的変異は、生命体に天性的に存在したり又は成長過程中に環境的な又は内生的な原因によって発生し得る。人体などの遺伝的変異形態のうち最も一般的なものは単一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）である。以下、発明の説明では、様々な遺伝的変異の代表としてＳＮＰｓを挙げて説明する。
人間を含む生命体が持つＳＮＰｓの判別に用いられる方法のうち、最も普遍的で経済的で簡便な方法は、重合酵素を活用した遺伝子増幅技術、すなわち、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）技術であり、特に、ＰＣＲ過程において実時間で遺伝子変異量を測定できる定量的実時間ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ；「ｑＰＣＲ」又は「実時間ＰＣＲ」という。）が有用である。核酸の定性的及び定量的な検出手法である実時間ＰＣＲは、保健、農業、食品、環境などの様々な分野で応用されている。１９９０年の初めに開発された実時間ＰＣＲは、技術的限界点を改善し続けており、より正確で精密な手法として発展しつつある。
実時間ＰＣＲを用いた遺伝子判別キットの開発において、非特異的信号の発生、及び突然変異と野生型遺伝子配列との低い区分性は、実時間ＰＣＲの代表的な技術的限界とされている。
特に、癌、病原体検出などの診断技術として、実時間ＰＣＲ技術の開発のためには非特異的信号の制御が必須である。非特異的信号によって偽陽性が現れる場合には検査の信頼度が低下し、特に、極少量の検出が必要な非侵襲性又は最小侵襲性の液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）のような診断技術では、少量の標的変異を正確に診断するために、ＰＣＲ効率性及び特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を高める技術が必要である。ＰＣＲの効率性及び特異性を高めるために、ＰＣＲ溶液に添加する組成物を開発したり、特別なプローブ（ｐｒｏｂｅｓ）又はプライマー（ｐｒｉｍｅｒｓ）を考案したり、酵素を改良したりする方法が摸索されてきた。
ＰＣＲ溶液に添加する組成物には、主に、ＰＣＲの反応性を高める方法、プライマーダイマー（ｐｒｉｍｅｒ ｄｉｍｅｒｓ）の生成、又は使用するプライマーが非特異的標的に結合して生成される非特異的ＰＣＲ産物の生成、又は高いＧＣ比率及び特異高次構造の形成などによるＰＣＲ効率の減少を解消する用途の添加組成物が研究されてきた。このような組成物にはＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、べタイン（ｂｅｔａｉｎｅ）などがある。
そして、通称ＨｏｔＳｔａｒｔ ＰＣＲのために、低い温度で行われる反応を遮断し、高温でＰＣＲが行われるようにして非特異的増幅を防ぐ方法が多数報告されている。そのうち、ＨｏｔＳｔａｒｔ ＰＣＲ方法としては、ＤＮＡ重合酵素（ＤＮＡＰ）特異的単一クローン抗体を添加する方法［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９４）１６（６）：１１３４－１１３７］、ＤＮＡ重合酵素の活性を抑制する一本鎖オリゴヌクレオチドである通称アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を添加する方法［ＵＳ／００５６９３５０２Ａ（１９９７）（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｊａｙａｓｅｎａ １９９７）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１：１００－１１１（１９９７）（Ｌｉｎ ａｎｄ Ｊａｙａｓｅｎａ １９９７）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｎｏ．３：３０９－３１０（２００３）（Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏ ａｎｄ Ｎｏｍａ ２００３）］、又はＤＮＡ重合酵素と低い温度で結合能力を有し、ＤＮＡ重合酵素の活性を抑制するが、特定温度以上のＰＣＲ条件では二重螺旋を形成せず、ＤＮＡ重合酵素活性を抑制しない二本鎖ヌクレオチドを用いて非特異的ＤＮＡ合成を抑制する方法［Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６４（２）：２６８－２７８（１９９６）（Ｄａｎｇ ａｎｄ Ｊａｙａｓｅｎａ １９９６）；ＵＳ ８，０４３，８１６ Ｂ２（２０１１）（Ａｓｔａｔｋｅ，Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１１）］が知られている。
特別なプローブ及び／又はプライマーを用いてＰＣＲの効率性及び特異性を高める方法において特別なプローブとプライマーは、増幅された標的産物を特異的に検出するためのものであり、特異度の高いプローブを使用する方法が開発された。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ又はＳＹＴＯ９のようなＤＮＡ結合蛍光体を実時間ＰＣＲに使用すれば、増幅された産物全体が検出されるため、非特異的信号がしばじば発生する問題点がある。このような問題を解決するために標的配列特異的プローブ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅｓ）が開発され、このようなプローブには、ＴａｑＭａｎプローブ（ｄｕａｌ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｂｅ）［Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，７２７６－２８０（１９９１）（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ａｂｒａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９１）］と分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）［Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５，４６３－７１（２００１）（Ｍｈｌａｎｇａ ａｎｄ Ｍａｌｍｂｅｒｇ ２００１）］、スコルピオンプローブ（ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ）［Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，８０４－０７（１９９９）（Ｂａｎｅｒ，Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９８）］、ＬＵＸ（ｌｉｇｈｔ ｕｐｏｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）プライマー［Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０，ｅ３７（２００２）（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ，Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．２００２）］、アンプリフルオルプライマー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ ｐｒｉｍｅｒｓ）［ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２６，５５２－５８（１９９９）（Ｕｅｈａｒａ，Ｎａｒｄｏｎｅ ｅｔ ａｌ．１９９９）］などがある。
また、標的変異遺伝子を選択的に増幅するために、特異度の高いプライマー又は特殊オリゴヌクレオチドブロッカー（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｌｏｃｋｅｒ）を使用する方法などが開発された。特異度の高いプライマーを使用する方法には、３’末端の一つの塩基の違いによって区分されるＡＳ－ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）を中心に、３’末端に一つの変異配列の他に追加の人為的な変異配列を添加するＡＲＭＳ－ＰＣＲ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ＰＣＲ）のような方法［Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ．１８．３４９－３５２（２００４）（Ｊａｒｒｙ，Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７．２５０３－２５１６（１９８９）（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．１９８９）；Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７．８０４－８０７（１９９９）（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ，Ｔｈｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）；Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７１，２７８－２８２（２０１５）（Ｂｅｒｇａｌｌｏ，Ｇａｍｂａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１５）］があり、最近では、アニーリングの安全性を高めながらも鋳型とプライマー間のミスマッチ区別を保持するように２つの部分に分離されたプライマーを使用する方法であるＳｅｅＧｅｎｅ社のＤＰＯ（ｄｕａｌ－ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，４５５０－４５５６（２００４）（Ｓｈｅｒｒｉｌｌ，Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．２００４）；Ｂｉｏｍｏｌ．Ｄｅｔｅｃｔ．Ｑｕａｎｔｉｆ．１３－７（２０１４）（Ｒｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｔｕｉｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１４）；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９．３１５４－３１６２（２０１１）（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｂｅｎｉｐｒａｓｈａｄ ｅｔ ａｌ．２０１１）］とＳｗｉｆｔ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのｍｙＴプライマー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｗｉｆｔｂｉｏｓｃｉ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｍｙｔ－ｐｒｉｍｅｒｓ）が開発された。
非特異的な信号を抑制する又は対立遺伝子の区分性を高めるＰＣＲに容易に使用するためのＤＮＡ重合酵素の開発も多数なされている。ＰＣＲ技術には耐熱性ＤＮＡ重合酵素を用いることが一般である。
ＤＮＡ重合酵素は、７種の以上の群（ｆａｍｉｌｙ）に区分されるが、ＰＣＲ技術に用いられる耐熱性重合酵素は、Ａ群に属するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素をはじめとする耐熱性細菌由来酵素群と、Ｂ群に属するＰｆｕ ＤＮＡ重合酵素をはじめとする古細菌由来酵素群から主に選択される。そのうち、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素をはじめとするＡ群のＤＮＡ重合酵素は、一般に、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有しており、この５’→３’ヌクレアーゼ活性には、エキソヌクレアーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性の両方もあり、このエンドヌクレアーゼ活性部分をフラップエンドヌクレアーゼ１（Ｆｌａｐ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １；ＦＥＮ１）とも呼ぶ。この活性は、加水分解プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ）の分解を用いた特異信号（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｇｎａｌ）の放出に非常に重要である。Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がないので、３’最終末端が、鋳型ＤＮＡと非相補的なプライマーを用いるＰＣＲに非常に適している。３’末端が非相補的であるＡＳ（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プライマー又はＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）プライマーの場合、プライマー３’塩基（ｂａｓｅ）のマッチ又はミスマッチによって突然変異と野生型又は２つの対立遺伝子の増幅効率が決定され、比較的良好な臨床的結果を導出する。しかし、しばしば、３’がミスマッチされたプライマーの場合も一部増幅されるため、多数の野生型に混入した突然変異の検出のための高感度診断において度々判別誤りが起きることがある。
分子診断のための実時間ＰＣＲには、配列番号１のアミノ酸配列を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素が広く用いられる。下記において特に言及がない限り、ＤＮＡ重合酵素のアミノ酸配列は配列番号１に従う。
配列番号１（野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素）
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE
Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ重合酵素Ｉが含まれるＡ群に属する耐熱性酵素である。Ｔａｑ重合酵素は、小さい断片である５’ヌクレアーゼドメイン（１－２８８ ａａ）と大きい断片である重合酵素ドメイン（２８９－８３２）（Ｓｔｏｆｆｅｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ又はＫｌｅｎＴａｑ）とに分けられ、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の重合酵素ドメインは手のひら（Ｐａｌｍ）サブドメイン、指（Ｆｉｎｇｅｒ）サブドメイン及び親指（Ｔｈｕｍｂ）サブドメインが人間の右手状の構造を形成してＤＮＡ二重螺旋構造とよく結合し得る（Ｏｌｌｉｓ，Ｂｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．１９８５）（Ｋｉｍ，Ｅｏｍ ｅｔ ａｌ．１９９５）（Ｅｏｍ，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９６）。
ＤＮＡ重合酵素Ｉに対する多数の決定構造研究を用いて、プライマー、プローブ、ＮＴＰ及びＭｇ＋＋などの結合部位と活性部位の位置を考慮した様々なアミノ酸残基に対する変異研究がなされた。主要探索領域としてモチーフＡ領域（６０５－６１７残基）（Ｐａｔｅｌ ａｎｄ Ｌｏｅｂ ２０００）（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．２０００）、Ｏ－螺旋領域（６５９－６７１残基）（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．２０００）、フィンガードメインのＰα－螺旋領域（７０４－７０７残基）（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，Ｔｚｅｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２００３）、ヌクレオチド結合ポケット領域（６１１－６１７残基）と立体ゲート（ｓｔｅｒｉｃ ｇａｔｅ）関連アミノ酸残基（６１５残基）及び手のひらドメイン（Ｐａｌｍ ｄｏｍａｉｎ）の三番目のβ－シート領域（５９７－６０９残基）（Ｏｎｇ，Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．２００６）、モチーフＣ領域（Ｓｔｒｅｒａｔｈ，Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）、そしてＰ’ドメイン領域（７０４－７１７残基）（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，Ｋｉｒｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．２００９）がある。
このような部位に対して、多数の研究により、酵素活性の増加した突然変異体（Ｉｇｎａｔｏｖ，Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．１９９８）、Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ ＰＣＲに利用可能な低温活性の弱い変異体（ｃｏｌｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔ）（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，Ｔｚｅｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２００３）（Ｗｕ，Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．２０１５）（Ｍｏｄｅｓｔｅ，Ｍａｗｂｙ ｅｔ ａｌ．２０１９）、逆転写ＰＣＲ、重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）ＰＣＲ、誤りがちなＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）などに利用可能なように、ｒＮＴＰ、疎水性塩基類似体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ）などの様々な基質に対する利用性が拡張された変異体（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．２０００）（Ｏｎｇ，Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．２００６））（Ｓｔｒｅｒａｔｈ，Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）（Ｌｏａｋｅｓ，Ｇａｌｌｅｇｏ ｅｔ ａｌ．２００９）（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｇｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）（Ｆａ，Ｒａｄｅｇｈｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．２００４）（Ｌｏａｋｅｓ，Ｇａｌｌｅｇｏ ｅｔ ａｌ．２００９）［ＵＳ ９２６７１３０Ｂ２（２０１６）（Ｍａｒｔｉｎ，Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１６）］ＵＳ２０１２／０２５８５０１ Ａ１（Ｂａｕｅｒ，Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２０１２）。延長（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）能力が改善された変異体（Ｙａｍａｇａｍｉ，Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１４）、血液、土壌などの様々な試料に含まれた成分によるＰＣＲ抑制に対して耐性を示す変異体（Ｋｅｒｍｅｋｃｈｉｅｖ，Ｋｉｒｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．２００９）などが開発された。
それらに加え、対立形質又は突然変異特異プライマーの３’末端配列の一致と不一致を区別する能力が増大された重合酵素が報告された［ＰＬｏｓ Ｏｎｅ．９（５）：ｅ９６６４０（２０１４）（Ｄｒｕｍ，Ｋｒａｎａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４）（Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｍａｒｘ ２０１９）；ＫＲ １０－２０１７－００８８３７３（２０１７）（イ・ビョンチョル２０１７）；ＵＳ ００３４８７９ Ａ１（２０１３）（Ｓｋｉｒａｇａｉｌａ，Ｔｕｂｅｌｅｖｉｃｉｕｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１３）；ＷＯ ０８２４４９ Ａ２（２０１５）（Ｍａｒｘ，ｄｒｕｍ ｅｔ ａｌ．２０１５）；ＵＳ９，２６７，１２０ Ｂ２（２０１６）（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６）；ＵＳ ８，７５９，０６１ Ｂ１（Ｍａｒｘ，Ｓｕｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ８（４）３９５－４０１（２００７）（Ｓｔｒｅｒａｔｈ，Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）。
これらの研究では、プライマーと鋳型、そして酵素内に入るヌクレオチドと構造的に結合すると推定されるアミノ酸残基を対象に集中的に変異を確保しようとし、驚くほどの成果が得られた。特に、Ｋ５０８Ｗ、Ｒ５３６Ｋ、Ｒ５８７Ｋ、Ｒ６６０Ｖの突然変異体（Ｄｒｕｍ，Ｋｒａｎａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４）とＭｕｔ＿ＡＤＬ変異体（変異部位Ｎ４８３Ｋ、Ｅ５０７Ｋ、Ｓ５１５Ｎ、Ｋ５４０Ｇ、Ａ５７０Ｅ、Ｄ５７８Ｇ、Ｖ５８６Ｇ、Ｉ６１４Ｍ）（Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ ａｎｄ Ｍａｒｘ ２０１９）などは、高い区分性を示したし、活性も比較的野生型Ｔａｑ重合酵素と比肩する程度であることから、商業的応用性を十分に備えていると評価される。
しかしながら、重合酵素に対する突然変異体開発が２０年以上行われているにもかかわらず、上のような研究を除けば、高い区分性を有する重合酵素の開発は成功せずにいる。効率的なライブラリー構築戦略（ＣＳＲ，ｓｐＣＳＲ，ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）と指向進化（ｄｉｒｅｃｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）のような非常に容易な変異体作製及び選別システムなどが開発されたが、阻害剤の添加を用いた高耐性酵素の選別又は非標準基質（ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）などを利用できる酵素の選別のような選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）又は選別システム（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の設定が、区分性の高い酵素の選別にはあまり有用でなかったためである。
したがって、正確な標的に基づく変異によって酵素を選別することが、区分性に優れた酵素選別可能性を高めるのに非常に重要である。したがって、区分性と関連した重合酵素の構造領域の発掘は、区分性に優れた酵素開発を担保できるであろう。
癌診断などのための臨床試料のうち、生体組織、血液、糞便、唾液などの検体内変異遺伝子の検出には、極少量の変異ＤＮＡの他にも多数の野生型ＤＮＡが混入していて突然変異ＤＮＡを特異的に検出することは非常に難しい。多数の野生型に混入して１％以下の極微量で存在する変異を検出できる特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を保障できなければならず、臨床的適用のためには高い堅固性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を有する必要がある。特に、野生型配列に対する低い偽陽性及び突然変異配列に対する高い特異度を示さなければならない。そのような理由で、癌診断などの高感度診断に適合するようにＰＣＲ効率性及び特異性を高めるためにＰＣＲ溶液添加組成物を開発したり、特別なプローブ及び／又はプライマーを考案したり、酵素を改良したりする方法が模索されてきた。
ＤＭＳＯ、べタインなどの増幅効率の増大のための試薬、ＤＮＡ重合酵素抑制用単一クローン抗体、室温のような低い温度でＤＮＡ重合酵素活性を抑制するオリゴ核酸、通称アプタマーの添加は、しばしばＤＮＡ増幅効率を増大させ、非特異的ＰＣＲ産物増幅やプライマーダイマー（ｄｉｍｅｒ）形成を抑制する。しかし、これらを添加したとき、対立遺伝子の区分性は増大させ難い。
また、特異的プライマーとプローブなどの使用により、特に単一塩基変異を区分することは技術的に容易でなく、普遍的な適用に限界があるだけでなく、特異的プライマーやプローブの設計に多い努力と費用がかかる。
今のところ、最も接近しやすく効率的な方法には、対立遺伝子の変異配列による３’ミスマッチの有無によって対立遺伝子を区分できるように、ＡＳプライマー又はＡＲＭＳプライマーを用いて対立遺伝子の区分性を向上させる方法がある。一つの塩基がミスマッチされるＡＳプライマーを使用する場合に、高いＰＣＲ効率に比べてしばしば対立遺伝子の区分性が低く、２つ以上の塩基がミスマッチされたＡＲＭＳプライマーの場合、ＡＳプライマー使用に比べて対立遺伝子の区分性は良くなるが、ＰＣＲ増幅効率が低くなるので、頻繁に検出限界（ＬＯＤ；ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）が低下する。
したがって、３’ミスマッチと３’マッチの区分性を高めた突然変異ＤＮＡ重合酵素を用いて突然変異配列の検出特異度を高めようとする研究が続いているが、多くの努力にもかかわらず、未ださほど成功的な変異体を確保できずにいる。また、選別された突然変異ＤＮＡ重合酵素は頻繁に酵素活性が低下し、これによって検出感度も低下し、商業的な利用が低調だった。
効率的に対立遺伝子又は突然変異配列を検出するために、重合酵素の活性が低下しない上にも、使用するプライマーの３’末端と鋳型ＤＮＡ間のマッチとミスマッチの区分性を高める酵素の開発が持続的に要求される。
したがって、本発明の一態様は、上記のような問題点を解消し、ＳＮＰｓなどの遺伝子変異を効果的に検出するために、区分性の良いＤＮＡ重合酵素を提供することを目的とする。
また、本発明の一態様は、より具体的には、鋳型とプライマー３’間のミスマッチとマッチの区分性を高めることであり、これを達成するためのＤＮＡ重合酵素変異体を提供することであり、具体的には、ファミリーＡ系のＤＮＡ重合酵素を提供することであり、より具体的には、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を含む耐熱性ＤＮＡ重合酵素を提供することである。
また、本発明の一態様は、前記ＤＮＡ重合酵素変異体を用いてＰＣＲを行う方法及びＰＣＲキットを提供することである。
区分性の高いＤＮＡ重合酵素変異体を得るために、本発明者らは、酵素において変異標的領域を設定し、この部位に対して集中的に様々な変異体を作製して探索することによって優れた変異体を確保した。
本発明では、驚くべきレベルの遺伝子変異区分性又は対立遺伝子区分性を示すＤＮＡ重合酵素を提供しようとする。
本発明において、探索された一つの領域は、親指ドメイン（Ｔｈｕｍｂ ｄｏｍａｉｎ）の端部分（Ｔｉｐ）に該当するＨａ（４８７－４９６）及びＨｂ（５１５－５２１）（Ｋｉｍ，Ｅｏｍ ｅｔ ａｌ．１９９５）（Ｌｉ，Ｋｏｒｏｌｅｖ ｅｔ ａｌ．１９９８）間のループ領域（４９７～５１４）（以下、ループ（ｌｏｏｐ）領域という。）（図１）に属する部分である。このループ領域は、陰電荷で荷電されたアミノ酸はほとんどなく、陽電荷で荷電されたアミノ酸が多数あり、高いｐＩ値を示す。また、この領域は、マッチとミスマッチの区分性が高い酵素として知られたＴ．ｓｐ．Ｚ０５（配列番号２）ＤＮＡ重合酵素（Ｚ０５）のループ領域と単に３個のアミノ酸（Ｒ５０１、Ｌ５０５、Ｑ５０９）のみが相違する。
配列番号２（ＴＺ０５ＤＮＡ重合酵素）
MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFVVFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATLAKKAEREGYEVRILTADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLKPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENILKNLDRVKPESVRERIKAHLEDLKLSLELSRVRSDLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPAPLEEAPWPPPEGAFVGFVLSRPEPMWAELKALAACKEGRVHRAKDPLAGLKDLKEVRGLLAKDLAVLALREGLDLAPSDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAAHRALLAERLQQNLLERLKGEEKLLWLYQEVEKPLSRVLAHMEATGVRLDVAYLKALSLELAEEIRRLEEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELRLPALGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPGLVHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPIRTPLGQRIRRAFVAEAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGKDIHTQTASWMFGVSPEAVDPLMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPHLREMGARMLLQVHDELLLEAPQARAEEVAALAKEAMEKAYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKG
配列番号７（野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のループ領域）
497-ELGLPAIGKTEKTGKRST-514
このループ領域（４９７～５１４残基又はそれに相応する位置）は、ＤＮＡ重合酵素の一部分から選ばれてよく、より具体的には、、ＤＮＡ重合酵素ファミリーＡを構成しているアミノ酸配列の一部分から選ばれてよい。
Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のα－螺旋ＨａとＨｂ領域は、重合酵素ファミリーＡにおいて配列が、ある程度保存された領域（８０％以上）、保存された領域（９０％以上）、又は非常に保存された領域（９５％以上）であり、両螺旋間にループ領域（野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の４９７～５１４残基又はそれに相応する位置）があり、この領域は、本発明の目的を達成するために選択されてよい。
本発明において探索されたループ領域は、本発明の例示から提示するように、ＤＮＡ結合と関係している領域である。
このループ領域は、本発明の例示のように、ＤＮＡとＤＮＡ重合酵素とが結合した状態でＤＮＡ重合酵素が分解されない現象と関連がある。
このループ領域は、本発明の例示のように、高いＫＣｌ濃度、すなわち、ＫＣｌ濃度２００ｍＭ以上でＤＮＡ重合酵素が分解されないことと関連がある。
本発明の例示のように、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素又はその変異体の分解がＤＮＡによって抑制されるので、ループ領域がＤＮＡ結合、より具体的にはプライマー結合と関係している領域であることが分かる。
また、本発明の例示のように、ループ領域は、重合酵素構造研究の結果、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素と基質であるプライマーとの結合領域として予測される。
また、本発明の一例で具現されたように、この部位の変異によって製造されたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体（例えば、「Ｋ５１１Ａ」変異体）は、３’マッチと３’ミスマッチのＰＣＲ区分性を高めたことが見られ、本発明で提示したループ領域がプライマー結合と関連した領域であることを示す。
本発明で提示した野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の４９７－５１４残基又はそれに相応する位置のループ領域は、本出願の前に、プライマー結合と関係している領域として報告されたことがない。
本発明者らは、本発明の目的であるＤＮＡ重合酵素の基質特異性を高くしたり、基質特異性を低くしたりする目的を達成するためにループ領域を用いた。
基質の特異性を高くするということは、鋳型とプライマー間の結合においてプライマーの３’末端塩基が鋳型とマッチされるかミスマッチされるかによって、３’マッチプライマーを入れた場合に、３’ミスマッチプライマーを入れた場合に比べてＰＣＲがより効率的に進行され、及び／又は重合過程中の誤りが低くなることをいう。
逆に、基質特異性を低くすることには、正常な基質であるｄＮＴＰｓの他にｒＮＴＰ、疎水性塩基類似体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ）などの類似基質又は変形基質の使用が容易になること及び／又は重合誤りが多くなることを例示として挙げることができる。
本発明者らは、本発明の主要な目的であるプライマーの３’末端塩基が鋳型とマッチされる場合及びプライマーの３’末端塩基が鋳型とミスマッチされる場合にＰＣＲの区分性を高める変異体を選別するために、本発明においてループ領域を提供する。
本発明の説明、実施例及び特許請求の範囲でいう「区分性（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）」とは、標的遺伝子配列に存在する遺伝子変異又はＳＮＰｓなどの対立遺伝子変異を正常遺伝子と区分することを指し、具体的には、正常遺伝子又は変異遺伝子鋳型とプライマーの３’末端塩基がマッチされる場合とミスマッチされる場合に、実時間ＰＣＲにおいて標的遺伝子の増幅程度の相違のことを指す。増幅程度の相違は、ＰＣＲを行った後に電気泳動して確認するか、或いは実時間ＰＣＲで３’マッチとミスマッチ間のＣｔ（又は、Ｃｑ）値の差（ΔＣｔ＝３’ミスマッチのＣｔ値－３’マッチのＣｔ値）などによって確認できる。
本発明の一実施例では、ループ領域（野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の４９７－５１４残基又はそれに相応する部位）を構成しているアミノ酸から選ばれた一つ又はそれ以上のアミノ酸を元来のアミノ酸から他のアミノ酸に置換することによって本発明の目的を達成することができる。
本発明の一実施例では、このループ領域の多数の代表的なアミノ酸変異によって本発明の目的を達成できることを示す。
本発明の一実施例では、ループ領域（野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の４９７－５１４残基又はそれに相応する部位）に属する極性アミノ酸から選ばれたアミノ酸から他のアミノ酸への置換によって本発明の目的を達成できることを示す。前記極性アミノ酸は、具体的には、陽極性を示すアミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ又はR）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、又は陰極性を示すアミノ酸残基アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）から選ばれてよい。
より具体的には、本発明は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素においてＫ５０５、Ｅ５０７、Ｋ５０８、Ｋ５１１及びＲ５１２から選ばれるアミノ酸の置換によって本発明の目的を達成することができる。
また、ファミリーＡに属する他の耐熱性ＤＮＡ重合酵素においてもＴａｑ ＤＮＡ重合酵素のループ領域（配列番号７）に相応する領域を選択して区分性を向上させたＤＮＡ重合酵素変異体を生成することができる。具体的な一例を挙げると、Ｚ０５ ＤＮＡ重合酵素（配列番号２）の場合、前記Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のループ領域（４９７－５１４）に相応する領域としてループ領域（４９９－５１７）を選択して重合酵素変異体を生成することが可能である。
より具体的には、Ｚ０５ ＤＮＡ重合酵素（配列番号２）においてループ領域（４９９－５１７）に相応するアミノ酸部位、好ましくは、ループ領域に属し、荷電されたアミノ酸であるＲ５０１、Ｋ５０７、Ｋ５１０、Ｋ５１３及びＲ５１５から選ばれる一つ以上のアミノ酸を置換して変異体を生成でき、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のＥ５０７に相応するＺ０５ ＤＮＡ重合酵素のＱ５０９も置換の対象になってよい。
重合酵素の変異とは、重合酵素を構成している一連のアミノ酸配列のうち一つ以上のアミノ酸を選択して、元来配列に存在するアミノ酸の代わりに、他の自然的に生命体が利用するアミノ酸１９個（２０個から元来のものを除く）から選ばれる一つのアミノ酸への変換を意味するか、アミノ酸を化学的又は酵素的に変形（例えば、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、アミン化（ａｍｉｎａｔｉｏｎ）、アシル化（ａｃｙｌａｔｉｏｎ）、水酸化（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ）など）するか、又は欠失、追加を含むことであり、本発明では、元来のアミノ酸から他の自然の１９個のアミノ酸のいずれか一つに置換されることを指す。自然の２０個のアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）をいう。
本発明の目的をなすためのＤＮＡ重合酵素変異は、一般に、重合酵素を暗号化（ｃｏｄｉｎｇ）している遺伝子配列を変更することによって達成できる。変更するアミノ酸の三重コドン（ｔｒｉｐｌｅ ｃｏｄｏｎ）配列は本発明を制限しない。
また、本発明の目的をなすためのＤＮＡ重合酵素変異は、ＤＮＡ重合酵素を発現させる技術が本発明の範囲を制限しない。例えば、タンパク質発現及びクローニングベクターの種類、発現のためのプロモーターの種類、精製を容易にするためのタギング（Ｈｉｓタグなど）、遺伝子配列を宿主細胞に最適化すること、宿主細胞の種類（細菌、酵母、鳥類、無脊椎動物細胞（昆虫）、植物細胞、哺乳類細胞と体外翻訳システム（ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）など）のようなものにより、本発明の具体的な実施例と異なる例示であっても、それによって本発明の範囲が制限されることはない。
また、本発明の目的をなすためのＤＮＡ重合酵素変異体を得る方法が本発明を制限しない。例えば、クロマトグラフィーのための装置、緩衝液、樹脂種類、カラムの種類、沈殿方法、濾過方法などの具体的方法が本発明の例示と異なっても本発明を制限しない。
また、本発明の実施例で説明されるプライマーは、本発明を説明するものであるだけで、本発明の範囲を制限するものではない。
本発明において、ＰＣＲプライマーとしては、対立遺伝子特異的プライマー（Ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ；ＡＳプライマー）又はＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）プライマーを含む。
本発明において「３’ミスマッチ」とは、プライマーの３’末端と鋳型間のミスマッチをいい、プライマーの３’末端において７塩基又は５塩基のうち一つ以上の塩基が鋳型（又は、目的遺伝子）と相補的でないことを意味し、より具体的には、プライマー３’末端の最後の塩基が鋳型の塩基と非相補的である場合を含む。
本発明において「３’マッチ」とは、プライマーの３’末端と鋳型（又は、目的遺伝子）間の相補的マッチのことを指し、プライマーの３’末端の最後の塩基が鋳型の塩基と相補的である場合を含む。
本発明におけるＤＮＡ重合酵素は、好ましくは、重合酵素Ａ群（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉ系）に属する酵素である。この重合酵素は耐熱性細菌、好ましくは耐熱性真性細菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）由来のＤＮＡ重合酵素から選ばれてよく、より好ましくは、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種、テルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種などに由来のＤＮＡ重合酵素から選ばれてよい。また、このＤＮＡ重合酵素は、ＰＣＲを含む様々な生命工学的方法に適用可能である。
本発明の目的は、ＤＮＡ重合酵素のループ領域又はそれに相応する領域の変異によって達成できる。
より具体的には、本発明の目的は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のループ領域（４９７～５１４残基）と相応するファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素のループ領域変異によって達成できる。
本発明の目的は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のループ領域（４９７～５１４）又はそれに相応するファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素のループ領域変異により、一つ以上の非荷電アミノ酸（ｎｏｎ－ｃｈａｒｇｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）の変異によって達成できる。
本発明の目的は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のループ領域（４９７～５１４）又はそれに相応するファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素のループ領域変異により、一つ以上の荷電（ｃｈａｒｇｅｄ）アミノ酸の変異によって達成できる。
本発明の目的は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のループ領域（４９７～５１４）又はそれに相応するファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素のループ領域変異により、し一つ以上の陽電荷アミノ酸（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）の変異によって達成できる。
本発明の目的は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の５０５位置のＫ又はそれに相応するファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素のループ領域に属するアミノ酸を置換して達成できる。
本発明の目的は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の５０７位置のＥ又はそれに相応するファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素のループ領域に属するアミノ酸を置換して達成できる。
本発明の目的は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の５０８位置のＲ又はそれに相応するファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素のループ領域に属するアミノ酸を置換して達成できる。
本発明の目的は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の５１１位置のＫ又はそれに相応するファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素のループ領域に属するアミノ酸を置換して達成できる。
本発明の目的は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の５１２位置のＲ又はそれに相応するファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素のループ領域に属するアミノ酸を置換して達成できる。
本発明の一例として試験された変異は、Ｇ４９９Ｒ、Ｋ５０５Ｇ、Ｋ５０５Ｉ、Ｋ５０５Ｌ、Ｋ５０５Ｍ、Ｋ５０５Ｆ、Ｅ５０７Ｇ、Ｅ５０７Ｋ、Ｅ５０７Ｑ、Ｋ５０８Ａ、Ｋ５０８Ｓ、Ｋ５０８Ｒ、Ｋ５１１Ａ、Ｋ５１１Ｒ、Ｒ５１２Ｋ、Ｒ５１２Ｗなどであり、好ましくは、これらのうち、変異の区分性が高い変異株であって、陽電荷アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたＫ５０５Ｇ、Ｋ５０５Ｉ、Ｋ５０５Ｌ、Ｋ５０５Ｍ、Ｋ５０５Ｆ、Ｋ５０８Ａ、Ｋ５０８Ｓ、Ｋ５０８Ｒ、Ｋ５１１Ａ、Ｋ５１１Ｒ、Ｒ５１２Ｋ又はＲ５１２Ｗ変異Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素である。
このような酵素が発明の目的を達成した理由を説明すると、次の通りである。
本発明のループ領域内の変異体の活性と構造との関係、プライマーとループ領域内のアミノ酸との静電気的結合（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の連関性について説明すると、発明の効果及び独創性を説明できる。
本発明の一例による変異領域は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（配列番号１）のループ領域（４９７～５１４；配列番号７）又はそれに相応するファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素のループ領域である。このループ領域はＤＮＡ結合領域である。本発明の一例で説明したＥ．ｃｏｌｉのプロテアーゼ（ＯｍｐＴ）によって切断される領域がこのループ領域であり、この領域は、ＤＮＡが結合した状態でプロテアーゼによる切断が抑制されるので、このループ領域がＤＮＡ結合領域であることを本発明から確認した。
このループ領域は、驚くべきことに、ＤＮＡ重合酵素の変形のために既存には集中的な探索がなされなかった親指ドメイン（Ｔｈｕｍｂ ｄｏｍａｉｎ）の端部分（Ｔｉｐ）に該当するＨａ（４８７－４９６）とＨｂ（５１５－５２１）（Ｋｉｍ，Ｅｏｍ ｅｔ ａｌ．１９９５）（Ｌｉ，Ｋｏｒｏｌｅｖ ｅｔ ａｌ．１９９８）との間に存在し（図１）、この部位はプライマーのリン酸骨格と結合すると予測される。
本発明の一例から集中的な探索がなされた領域は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のＨａ（４８７－４９６）とＨｂ（５１５－５２１）との間のループ領域（４９７～５１４）である。
この領域は、本発明者らの発明の例示で説明しているように、ＤＮＡプライマーとの結合と関連がある領域である。
ＤＮＡ重合のためのプライマーの結合領域は、本発明の主要目的である３’マッチ及び３’ミスマッチを区分する酵素を開発するための突然変異対象として考慮された。
本発明においてループ領域の集中的な探索は、プライマー３’末端の塩基と鋳型ＤＮＡのマッチ及びミスマッチ間の区分性が増加した新しい酵素の開発に非常に重要な道を提供する。
本発明の一例において変異対象アミノ酸残基は、Ｈａ（４８７－４９６）とＨｂ（５１５－５２１）との間のループ領域（４９７～５１４）のうち、陽極性を示すアミノ酸残基であるアルギニン（Ａｒｇ又はＡ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、又は陰極性を示すアミノ酸残基であるアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）から優先的に選ばれてよい。
これらのアミノ酸残基は、荷電された残基がＤＮＡ、特にプライマーとＤＮＡ重合酵素との結合力を決定するうえで非常に役割を担い、したがって、それらの一つ以上の変異は、ＤＮＡ、特にプライマーの酵素との結合力を変化させることにより、区分性が増加する、及び／又はＰＣＲ増幅活性が高くなる、及び／又は基質の特異性が変化し得る。
このループ領域内に存在する又は新しく導入する陰電荷アミノ酸は、ループとＤＮＡプライマーリン酸骨格との結合を妨害してＤＮＡ重合酵素活性を減少させることがある。
このループ領域内に存在している又は新しく導入する陽電荷アミノ酸は、ループ領域とプライマーリン酸骨格との結合を容易にしてＤＮＡ重合酵素活性を向上させることができる。
このループ領域内に存在する陽電荷アミノ酸を非電荷アミノ酸に置換する場合に、ＤＮＡ重合酵素活性は高く保持されながら、区分性にも優れた酵素を作ることができる。
本発明によれば、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を含むファミリーＡ熱安定性ＤＮＡ重合酵素のＨａ及びＨｂドメイン間のループ領域のアミノ酸変異により、重合酵素活性は保持又は向上しながら、鋳型とプライマー間の塩基マッチ又はミスマッチによる区分性が向上したＤＮＡ重合酵素変異体が提供される。
このようなＤＮＡ重合酵素変異体は実時間ＰＣＲに用いられ、単一塩基多型の分析（ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）及び体細胞突然変異の検出（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）などに有用である。
また、このようなＤＮＡ重合酵素変異体をＰＣＲキットに使用して区分性を向上させることができる。
プライマーと結合するアミノ酸が集中しているＤＮＡ重合酵素の領域を示す。Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔ．ｓｐ Ｚ０５、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡ重合酵素領域のうち、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のループ領域（４９７～５１４残基）とその近隣領域を比較したものである。
Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である。（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４で発現した野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解結果である。赤色の矢印は、分解されて発生したタンパク質帯を示す。ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー精製物からＫＣｌを除去するために緩衝液Ａを用いて洗浄した。Ｓは、野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素標準製品である。０，濾過無し；１ｘ，１回濾過；２ｘ，２回濾過；Ｓ，標準Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素。（Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４で発現したＥ５０７Ｋ変異が含まれたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体のＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー精製品を、ＫＣｌがそれぞれ０、１００、３００、５００ｍＭ含まれた緩衝液Ａを用いて濾過した試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である。（Ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４で発現したＥ５０７Ｋ変異が含まれたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体のＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー精製品にサケ精子ＤＮＡをそれぞれ０、０．４、２．０、１０、５０ｕｇを混合するか、ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーにおいてＴａｑ ＤＮＡ重合酵素が溶離した後の分画の群れ（ＢＰ）を混合した後、緩衝液Ａを用いて濾過した試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である。Ｍ，タンパク質分子量マーカー；Ｃ，無処理試験区；ＢＰ，ＢＰを混合した試料。
Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素分解産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である。１：無処理区、２：分解処理区。
Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素切断位置（ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）及びＯｍｐＴ認識部位（Ｐ）を示す模式図である。
Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素のループ（ｌｏｏｐ）構造とＤＮＡとの密接構造を示す模式図である。Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の親指サブドメイン（Ｔｈｕｍｂ ｓｕｂｄｏｍａｉｎ）に存在するα－螺旋Ｈａ（４８７－４９６残基、青色の領域）、α－螺旋Ｈｂ（５１５－５２１残基、青色の領域）、α－螺旋Ｉ（５２７－５５２残基、紫朱色領域）とループ（４９７～５１４残基、２つの青色の領域の間、非電荷アミノ酸残基（緑色の領域））、数字はＴａｑ ＤＮＡ重合酵素のアミノ酸残基位置を示す。
Ｋ５１１Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体と野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用した実時間ＰＣＲ結果を示す。鋳型としては、ＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅ及びＥＧＦＲ－Ｔ７９０Ｍの正常ＤＮＡ（ｗ）と変異ＤＮＡ（ｍ）を使用した。数字は、正常ＤＮＡを使用した実時間ＰＣＲのＣｔ値から、変異ＤＮＡを使用した実時間ＰＣＲのＣｔ値を引いた値を意味する。ＷＴ：野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用した結果、Ｋ５１１Ａ：Ｋ５１１Ａ変異Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用した結果。
各部位の代表的な変異を含むＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体の区分性確認のための実時間ＰＣＲ結果である。各変異タンパク質が発現したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株から粗精製した試料を用いてＢＲＡＲ－Ｖ６００Ｅ及びＥＧＦＲ－Ｔ７９０Ｍの変異区分性を試験した。ＷＴ：野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を用いた結果、Ｇ４９９Ｒ、Ｋ５０５Ｇ、Ｅ５０７Ｋ、Ｋ５０８Ｓ、Ｋ５１１Ａ、Ｒ５１２Ｗはそれぞれ、該当Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体を使用した結果である。 各部位の代表的な変異を含むＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体の区分性確認のための実時間ＰＣＲ結果である。各変異タンパク質が発現したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株から粗精製した試料を用いてＢＲＡＲ－Ｖ６００Ｅ及びＥＧＦＲ－Ｔ７９０Ｍの変異区分性を試験した。ＷＴ：野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を用いた結果、Ｇ４９９Ｒ、Ｋ５０５Ｇ、Ｅ５０７Ｋ、Ｋ５０８Ｓ、Ｋ５１１Ａ、Ｒ５１２Ｗはそれぞれ、該当Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体を使用した結果である。
ＣＳ２－Ｋ５１１Ａ及びＫ５１１Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体と野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を用いた実時間ＰＣＲ結果を示す。鋳型としては、ＥＧＦＲ－Ｔ７９０Ｍの正常ＤＮＡ（ｗ）と変異ＤＮＡ（ｍ）を使用した。このとき、使用した前方プライマーはＥＧＦＲ－ＡＲＭＳ－Ｆである。ＷＴ：野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素、Ｋ５１１Ａ：Ｋ５１１Ａ変異Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素、ＣＳ２－Ｋ５１１Ａ：ＣＳ２－Ｋ５１１Ａ変異Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素。
本発明は、配列番号１で構成されたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素と８０％以上の相同性を有するＤＮＡ重合酵素又はそれらのクレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）においてＨａ及びＨｂ配列間のループ領域のアミノ酸が一つ以上変異され、野生型ＤＮＡ重合酵素と比較して、重合活性は保持され、対立遺伝子又は遺伝子変異区分性が向上したＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、前記変異がアミノ酸の置換、挿入又は欠失である、ＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、前記ループ領域が配列番号１の４９７～５１４の位置又はそれに相応する位置である、ＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、前記変異が配列番号１の４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０５、５０６、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４又はそれに相応する位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置のアミノ酸が変異された、ＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、前記位置の変異に加えて、Ｉ７０７Ｌ及びＥ７０８Ｋのうち一つ以上の変異又はそれに相応する位置の一つ以上の変異がさらに含まれた、ＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、前記８０％以上の相同性を有するＤＮＡ重合酵素が、配列番号１で構成されたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素と９０％以上、又は９１％以上、又は９２％以上、又は９３％以上、又は９４％以上の相同性、より好ましくは、９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上の相同性を有する、ＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、前記配列番号１の４９７、５０５、５１１及び５１２の位置又はそれに相応する位置に存在する荷電されたアミノ酸のうち一つ以上が変異された、ＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、前記配列番号１の５０５、５１１及び５１２の位置又はそれに相応する位置に存在する陽電荷で荷電されたアミノ酸のうち一つ以上が変異された、ＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、前記アミノ酸変異位置に加え、配列番号１の５０４、５０７、５０８、７０７、７０８の位置又はそれに相応する位置に存在する一つ以上のアミノ酸がさらに変異された、ＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、Ｇ４９９Ｒ、Ｋ５０５Ｇ、Ｋ５０５Ｉ、Ｋ５０５Ｌ、Ｋ５０５Ｍ、Ｋ５０５Ｆ、Ｅ５０７Ａ、Ｅ５０７Ｇ、Ｅ５０７Ｓ、Ｅ５０７Ｒ、Ｅ５０７Ｑ、Ｋ５０８Ａ、Ｋ５０８Ｇ、Ｋ５０８Ｓ、Ｋ５１１Ａ、Ｋ５１１Ｓ、Ｒ５１２Ｋ、Ｒ５１２Ｗ又はそれに相応する位置の相応変異から選ばれる一つ以上の変異が含まれたＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、Ｋ５１１Ａ、Ｉ７０７Ｌ及びＥ７０８Ｋの３つのアミノ酸の変異又はそれに相応する位置の変異を含むＤＮＡ重合酵素変異体に関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡ重合酵素変異体を用いて対立遺伝子又は遺伝子変異区分性が改善された実時間重合酵素連鎖反応を行う方法に関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡ重合酵素変異体が含まれた重合酵素連鎖反応キットに関する。
以下、実験例及び実施例を挙げて発明を具体的に説明する。ただし、本発明の範囲が以下の実験例及び実施例の記載範囲に限定されないことは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって明らかである。
＜実験例１＞位置指定突然変異（Ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）とＴａｑ ＤＮＡ重合酵素突然変異体の作製
タンパク質発現のために、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素遺伝子をプラスミドｐＵＣ１８内のｌａｃプロモーターの下流に位置するように構築したベクターｐＪＲ－Ｔａｑを使用した。各変異体はベクターｐＪＲ－Ｔａｑを鋳型として位置指定突然変異によって構築した。変異のためのアミノ酸にプライマー（配列番号８－９３）を用いて、下記のように位置指定突然変異によって該当するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体を作った。Ｐｆｕ ＤＮＡ重合酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）を用いてＰＣＲを行った後、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）を処理して、変異されていない鋳型ＤＮＡを除去し、変異されているプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換して変異プラスミドを確保した。確保したプラスミドの目的配列部位の塩基配列変異を塩基配列分析で確認した。ベクターにおいてＴａｑ ＤＮＡ重合酵素遺伝子以外の他の部位の配列変異を最小化するために、確保したそれぞれの変異プラスミドをＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩで切断して約１．３ｋｂの断片を得、ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩでｐＪＲ－Ｔａｑを切断して１．３ｋｂの除去された断片３．８ｋｂと連結してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、それぞれの変異体発現用ベクターを作製した。
Figure 0007470216000001
Figure 0007470216000002

Figure 0007470216000003
＜実験例２＞Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の発現のための培養
Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素発現のためのベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４（ｏｍｐＴ＋）又はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＤＥ３）（ｏｍｐＴ－）に導入して使用した。Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉをＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ）培地で３７℃で８時間前培養し、２Ｘ ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１．０％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）に前培養液１％を接種して３７℃で本培養を行った。培養液のＯ．Ｄ．６００値が０．４～０．６になった時に、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して約４時間培養した。培養の完了した培養液を氷水に浸して冷却した後に遠心分離（１０，０００ ｘ ｇ、１０分、４℃）し、菌体を回収した。回収された菌体は、培養液の１／１０（ｖ／ｖ）の緩衝液Ａ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）］で懸濁した後に遠心分離して回収する方法を２回反復して培地成分を除去した後、培養液の１／２０～１／４０（ｖ／ｖ）の緩衝液Ａに再懸濁して準備した。
＜実験例３＞Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の粗精製試料の製造
培養液１００ｍｌで確保された菌体懸濁液（実験例２）からＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を粗精製した。菌体懸濁液を超音波破砕機を用いて（２ｍｍチップ（ｔｉｐ）、振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）２５％、９．９ｓ／３ｓ（ｏｎ／ｏｆｆ）、５分）菌体を破砕した後、遠心分離（１０，０００ ｘ ｇ、１０分、４℃）して上澄液を回収した。上澄液にＲＮａｓｅを５０μｇ／ｍｌとなるように添加して３７℃で３０分間反応させ、７５℃で２０分間熱処理後に遠心分離（１００００ ｘ ｇ、１０分、４℃）して上澄液（４．０ｍｌ）を回収し、粗精製試料を確保した。この試料をタンパク質定量後にＴａｑ ＤＮＡ重合酵素活性比較実験に使用した。
＜実験例４＞Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の高純度精製
４．５Ｌ培養液で確保された菌体懸濁液からＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を高純度で精製した。超音波破砕機（１３ｍｍチップ、振幅９０％、５．５ｓ／９．９ｓ（ｏｎ／ｏｆｆ）、１時間）を用いて菌体懸濁液（１００ｍｌ）の菌体を破砕した後、遠心分離（１０，０００ ｘ ｇ、１０分、４℃）して上澄液を回収した。ここに５％となるようにストレプトマイシン硫酸塩（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）を添加して３０分間撹拌後に遠心分離（１０，０００ ｘ ｇ、１０分、４℃）し、上澄液を回収した。この液を７５℃で２０分間熱処理し、再び試料を遠心分離（１０，０００ ｘ ｇ、１０分、４℃）して得られた上澄液を、０．４５μｍ注射器フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濾過した。濾過溶液にＴａｑ ＤＮＡ重合酵素タンパク質析出のために飽和度６５％となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で１時間後に沈殿物を遠心分離（１０，０００ ｘ ｇ、１０分、４℃）によって回収して１０ｍｌの緩衝液Ａで懸濁した。懸濁液を透析膜（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ：１２－１４ＫＤａ）に入れ、４Ｌの緩衝液Ａで一晩透析して塩を除去した。脱塩された溶液を０．４５μｍ注射器フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濾過してＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ，ＵＰＣ－９００）で精製した。カラムクロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ ｓｅｐｈａｃｅｌ（ＸＫ２６／２０カラム中３０ｍｌ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＸＫ１６／２０カラム中２０ｍｌ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ｈｅｐａｒｉｎ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＨＲ１６カラム中１０ｍｌ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の順に進行した。このとき、カラムの平衡化のために、緩衝液Ａ（ＤＥＡＥ ｓｅｐｈａｃｅｌとｈｅｐａｒｉｎ ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム）と緩衝液Ｂ［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ６．９）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｕＭ ＰＭＳＦ］（Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム）を使用し、溶離は、１Ｍ ＫＣｌの入っているＡとＢ緩衝液を使用して濃度勾配によってタンパク質を溶離した。各カラム段階でＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の含まれた溶離分画を回収してＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＭＷ：５０，０００）で濾過工程を行った。この濾過工程は、脱塩又は活性試験のための洗浄及び濃縮のために行い、各カラムから回収した分画をＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＭＷ：５０，０００）で濃縮した後、次の段階の緩衝液Ａ又はＢ（約１５ｍｌ）で２回反復して洗浄、濾過した。
次の段階のカラムのために１０～２０ｍｌの同一緩衝液で溶解して次のカラムに適用するか、試験によって適切な溶液で溶解して試験した。
得られた各精製段階又は最終精製されたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動）とＢｒａｄｆｏｒｄ分析試薬（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質として定量、比較した。
粗精製又は精製されたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素は、最終濃度５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ ８．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭ ＰＭＳＦ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロールを含む貯蔵緩衝液と混合して－７０℃に保管しながら試験に使用した。
＜実験例５＞変異体Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素活性比較
定量したタンパク質量を一定に合わせて一般ＰＣＲ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ）方法を行った後に電気泳動し、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体と野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の活性を比較測定した。ラムダファージＤＮＡ（１０ｐｇ，バイオニア）を鋳型として用い、各１０ｐｍｏｌのラムダ－Ｆ（５’－ＧＧＴＧＣＴＴＴＡＴＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＣ）とラムダ－Ｒ（５’－ＡＧＣＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＡＴＧＣ）をプライマーとして用い、ＰＣＲ緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ ９．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ ＫＣｌ、０．６Ｍメチル－α－Ｄ－グルコピラノシド、０．０３％ ｔｗｅｅｎ ２０、３ｍＭ ｄＮＴＰ］で９４℃（５分）後に、９４℃（３０秒）－５５℃（３０秒）－７２℃（３０秒）を３０回繰り返し反応させ、７２℃（７分）反応後に終了し、ＤＮＡ増幅産物（５００ｂｐ）の生成を電気泳動で確認した。
＜実験例６＞区分性確認のための実時間ＰＣＲ
下記の実施例に特に言及がない限り、本発明の実施例に用いたＰＣＲの組成物及び条件は次の通りである。
ＰＣＲに使用した鋳型ＤＮＡは、各目的検出遺伝子ＢＲＡＦ ｃ．１７９９ ｒｃ．Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｖ６００Ｅ）（以下、ＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅ）の正常（配列番号３）又は突然変異配列（配列番号４）及びＥＧＦＲ ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔ７９０Ｍ）（以下、ＢＲＡＦ－Ｔ７９０Ｍ）正常（配列番号５）又は突然変異配列（配列番号６）のＤＮＡを合成してｐＴＯＰ Ｂｌｕｎｔ Ｖ２（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）に挿入、作製して大腸菌に形質転換した後、培養して精製されたプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断、精製後に定量して２×１０７ｃｏｐｙ／ｒｅａｃｔｉｏｎになるようにして使用した。
配列番号３（ＢＲＡＦ Ｖ６００正常（ｒｃ））
AAAATATTCGTTTTAAGGGTAAAGAAAAAAGTTAAAAAATCTATTTACATAAAAAATAAGAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAAATACTATAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCCAAAAATTTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAGATCTCATTTTCCTATCAGAGCAAGCATTATGAAGAGTTTAGGTAAGAGATCTAATTTCTATAATTCTGTAATATAATATTCTTTAAAACATAGTACTTCATCTTTCCTCTTAGAGTCAATAAGTATGTCTAAAACAATGATTAGTTCTATTTAGCCTATATA
配列番号４（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異（ｒｃ））
AAAATATTCGTTTTAAGGGTAAAGAAAAAAGTTAAAAAATCTATTTACATAAAAAATAAGAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAAATACTATAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCCAAAAATTTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAGATCTCATTTTCCTATCAGAGCAAGCATTATGAAGAGTTTAGGTAAGAGATCTAATTTCTATAATTCTGTAATATAATATTCTTTAAAACATAGTACTTCATCTTTCCTCTTAGAGTCAATAAGTATGTCTAAAACAATGATTAGTTCTATTTAGCCTATATA
配列番号５（ＥＧＦＲ Ｔ７９０正常）
CACGCACACACATATCCCCATGGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAGCGCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATCTCCCCTCCCCGTATCTCCCTTCCCTGATTACCTTTGCGATCTGCACACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGCGTGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACACGTGGGGGTTGTCCACGCTGGCCATCACGTAGGCTTCCTGGAGGGAGGGAGAGGCACGTCAGTGTGGCTTCGCATGGTGGCCAGAAGGAGGGGCACATGGACCCCTTCCAGGTGAAGACGCATGAATGCGATCTTGAGTTTCAAAATACGTACTCATGGAGGAAAAGCTGTGCCTGCAAAAGACCTAGC
配列番号６（ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異）
CACGCACACACATATCCCCATGGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAGCGCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATCTCCCCTCCCCGTATCTCCCTTCCCTGATTACCTTTGCGATCTGCACACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACACGTGGGGGTTGTCCACGCTGGCCATCACGTAGGCTTCCTGGAGGGAGGGAGAGGCACGTCAGTGTGGCTTCGCATGGTGGCCAGAAGGAGGGGCACATGGACCCCTTCCAGGTGAAGACGCATGAATGCGATCTTGAGTTTCAAAATACGTACTCATGGAGGAAAAGCTGTGCCTGCAAAAGACCTAGC
ＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅ変異の区分性を確認するために、前方プライマー５’－ＧＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴ－３’（ＢＲＡＦ－ＡＳ－Ｆ；配列番号９４）；後方プライマー５’－ＡＡＣＴＣＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＡＧ－３’（ＢＲＡＦ－Ｒ；配列番号９５）；シグナルプローブ５’－ＦＡＭ－ＣＴＧＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧ－ＢＨＱ１－３’（ＢＲＡＦ－Ｐ；配列番号９６）を使用し、ＥＧＦＲ－Ｔ７９０Ｍ変異区分性を確認するためには、前方プライマー５’－ＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡ－３’（ＥＧＦＲ－ＡＳ－Ｆ；配列番号９７）又は５’－ＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡ－３’（ＥＧＦＲ－ＡＲＭＳ－Ｆ；配列番号９８）；後方プライマー５’－ＡＧＴＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＣ－３’（ＥＧＦＲ－Ｒ；配列番号９９）；シグナルプローブ５’－ＦＡＭ－ＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＡＴＧ－ＢＨＱ１－３’（ＥＧＦＲ－Ｐ；配列番号１００）を使用した。特に、前方プライマーは、各目的検出遺伝子ＢＲＡＦ－Ｔ７９０ＭとＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅ突然変異の検出のために、最終３’末端塩基が変異遺伝子とマッチされる（ｍａｔｃｈｅｄ）か又は正常遺伝子と最終末端塩基がミスマッチされる（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）ように設計されたＡＳプライマー或いはＡＲＭＳプライマーである。各プライマーは、１０ｐｍｏｌ／ｒｅａｃｔｉｏｎ、プローブは２０ｐｍｏｌ／ｒｅａｃｔｉｏｎを使用した。
ＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅの区分のためのＰＣＲは、９５℃（５分）後に、９５℃（３０秒）－５５℃（１分）で５０回反復して行い、ＥＧＦＲ－Ｔ７９０Ｍの区分のためのＰＣＲは、９５℃（５分）後に、９５℃（３０秒）－５５℃（４０秒）で５０回反復して行った。
ＰＣＲの際に緩衝溶液は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ９．０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、６０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４）となるようにしてＣＦＸ９６実時間ＰＣＲ探知システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲを行う。ただし、実施例によってＫＣｌの濃度を異ならせたり、べタインなどを添加したり、酵素の種類（野生型か又は変異体Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素かによって）又は酵素の量を異ならせたりして使用する。発明されたＤＮＡ重合酵素変異体のマッチとミスマッチの区分性は、ΔＣｔ（ΔＣｔ＝変異体鋳型のＣｔ値－野生型鋳型のＣｔ値）で評価する。
＜実施例１＞大腸菌発現親菌株によるＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解
前記＜実験例２＞のように培養及び発現させたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を、＜実験例４＞のＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー精製段階でＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の分画を緩衝溶液ＡとしてＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＭＷ：５０，０００）を用いて濾過工程を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質を確認した。この過程中に、ＯｍｐＴ変異株であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｏｍｐＴ－）で発現したＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解が起きなかったが、ＯｍｐＴ変異株でないＥ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４（ｏｍｐＴ＋）で発現した野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（配列番号１）が精製中に一部分解されることを確認した（図２のＡ）。同過程を行う際に、特に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４（ｏｍｐＴ＋）で発現したＥ５０７Ｋ変異が含まれたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の精製過程中に、より多い分解が起きることを確認した（図２のＢ）。すなわち、精製過程におけるＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解は、発現親菌株によって明確に異なる様態を示しており、Ｅ５０７Ｋ変異が含まれたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素においてより明確に分解現象が起きた。
＜実施例２＞高い濃度のＫＣｌによるＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解抑制
このような分解は、＜実験例４＞の精製過程中にＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーから得たＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を、緩衝液Ａを用いてＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＭＷ：５０，０００）で濾過する洗浄過程中に急激に起きた。
＜実験例２＞又は＜実験例４＞のように培養、精製されたＥ５０７Ｋ変異が含まれたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体のＤＥＡＥ ｓｅｐｈａｃｅｌクロマトグラフィー精製段階の分画を確保した。この分画試料５０μｌ（約４μｇタンパク質／μｌ）を、ＫＣｌのない緩衝液Ａのみを使用するもの（０Ｍ ＫＣｌ）と、緩衝液Ａに１００、３００、５００ｍＭのＫＣｌが含有された緩衝液Ａを使用するものとに分けてＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＭＷ：５０，０００、５０ｍｌ容量）で濾過工程を行った後、各濾過試験区と同じ濃度のＫＣｌが含有された緩衝液Ａでそれぞれ溶解して得た。各試験区の溶解Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果、０ｍＭ ＫＣｌにおいて分解されて約３３ＫＤａと約６０ＫＤａのタンパク質断片が新しく観察され、元来のＤＮＡ重合酵素は非常に減少した。しかし、１００ｍＭ以上のＫＣｌが含まれた緩衝液Ａを使用した濾過においては無処理区と相違がなかった。このことから、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素分解が高濃度ＫＣｌによって抑制されることが分かった（図２のＢ）。
＜実施例３＞ＤＮＡによるＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解抑制
＜実験例２＞又は＜実験例４＞のようにＥ５０７Ｋ変異が含まれたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素のＤＥＡＥ ｓｅｐｈａｃｅｌクロマトグラフィー精製段階の分画を確保した。この分画試料約５０μｌ（約４μｇタンパク質／μｌ）に、ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーでＴａｑ ＤＮＡ重合酵素が溶離した後に得た分画（ＢＰ）を２倍体積（１００μｌ）で混合した後、＜実験例４＞のように濾過工程を行った。緩衝液ＡとしてＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＭＷ：５０，０００）を用いて濾過工程を行った後、緩衝液Ａ ２５０ｕｌで溶かして回収した試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の分解を確認した。その結果、驚くべきことに、ＢＰを混合していない試料はＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解が起きたが、ＢＰを混合した試料は分解が起きなかった。この時に使用したＢＰは、Ｂｒａｄｆｏｒｄ測定及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果、タンパク質がほとんど含まれていなかったが、核酸（～５０ｎｇ／μｌ）が多量含まれていた。このことから、分解の抑制因子は未知のタンパク質であるというよりは、ＤＮＡのような核酸であると推定される。
このような結果により、前記Ｅ５０７Ｋ変異が含まれたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体のＤＥＡＥ ｓｅｐｈａｃｅｌクロマトグラフィー精製段階の分画５０ｕｌに、各０．４、２．０、１０．又は５０μｇ ＤＮＡ（ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ，Ｓｉｇｍａ）を混合して準備した試料に対して、前記と同じ濾過工程を緩衝液Ａで行った。その結果、２．０μｇ以上のＤＮＡを処理した試験区では、ＢＰ処理区と同様にＴａｑ ＤＮＡ重合酵素が分解されなかった。これは、明確に、核酸がタンパク質分解酵素によるＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解を抑制することである。すなわち、このような結果は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解部位がＤＮＡとの結合に重要な部位又はＤＮＡと結合する部位と関連していることを意味する。
＜実施例４＞Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解位置の決定
＜実験例２＞又は＜実験例４＞のように培養、精製されたＥ５０７Ｋ変異が含まれたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体のＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー段階で得た試料（純度９６％以上）を、緩衝液Ａで＜実験例４＞のように濾過及び洗浄し、緩衝液Ａで回収し、～１０℃で完全に分解が起こるようにした（図３）。分解された産物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したとき、大きい切片（ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は約６０ＫＤａ、小さい切片（ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は約３３ＫＤａのサイズであった。
２つの切片が電気泳動されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを切ってタンパク質切片を回収してアミノ酸配列を分析した結果、明確な切断の位置は特定できなかったが、６０ＫＤａ断片がＴａｑ重合酵素のＮ－末端断片として、３３ＫＤａ断片がＣ－末端断片として確認されたし、これに基づいてより正確な切断位置を確認するために、３３ＫＤａのＮ－末端配列を分析した。その結果、３３ＫＤａ断片のＮ末端配列がＲ－Ｓ－Ｔ－Ｓ…であることを確認した。これに相応するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素上の配列は、Ｒ５１２－Ｓ５１３－Ｔ５１４－Ｓ５１５であり、これによって切断部位がＫ５１１とＲ５１２との間として決定された（図４）。
興味深いことに、切断位置であるＫ５１１とＲ５１２は、連続する２つの陽電荷アミノ酸で構成されている。このような連続する陽電荷アミノ酸は、大腸菌の膜性プロテアーゼであるＯｍｐＴが選好する切断部位としてよく知られている。ＯｍｐＴの切断部位の両側にある数個のアミノ酸残基（Ｐ６～Ｐ’６）に陰電荷アミノ酸が存在する場合に、ＯｍｐＴによるタンパク質切断が顕著に抑制されることが報告されている（Ｈｒｉｔｏｎｅｎｋｏ ａｎｄ Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｓ ２００７，Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ ２０１２）。
前記実施例１～３によれば、野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素に比べて、Ｅ５０７Ｋ変異が含まれたＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体がよりよく分解されるが、これは、ＯｍｐＴ認識部位Ｐ５位置に該当するＥ５０７が、陰電荷アミノ酸であるグルタミン酸（ｇｌｕ，Ｅ）から陽電荷アミノ酸であるリジン（ｌｙｓ，Ｋ）に変わったためと考えられ。すなわち、Ｅ５０７Ｋ変異Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素が野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素に比べてＯｍｐＴに対する基質親和力が大きくなり、隣接した連続する陽電荷アミノ酸残基であるＫ５１１とＲ５１２［Ｐ１（Ｋ）－Ｐ１’（Ｒ）］のペプチド結合がＯｍｐＴプロテアーゼによって容易に切断されたものと説明される（図４）。
＜実施例２＞において、高い濃度のＫＣｌにおいてＤＮＡ重合酵素の分解抑制は、ＫＣｌによるＯｍｐＴプロテアーゼ分解活性の阻害と推定される。
また、＜実施例３＞において、ＤＮＡによってＤＮＡ重合酵素の分解が抑制された（図３）が、このことから、ＯｍｐＴプロテアーゼが認識（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）又は切断するＤＮＡ重合酵素部位は、ＤＮＡと結合する領域であることが分かる。したがって、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素切断部位（５１１及び５１２）及びその周辺部位は、ＤＮＡと結合する領域であることが明らかに分かる。
＜実施例５＞Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の構造と分解部位
＜実施例４＞で確認した、分解が起きる部位であるＫ５１１－Ｒ５１２部位は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の親指ドメイン（Ｔｈｕｍｂ ｄｏｍａｉｎ）の端部分に該当する小さいα－螺旋構造を有するＨａ（４８７－４９６）とＨｂ（５１５－５２１）との間のループ領域（４９７～５１４）内に存在する（図１及び図５）。
Ｈａ及びＨｂは、ファミリーＡ ＤＮＡ重合酵素間に高い類似性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有する保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）領域であり、これに比べて、ループ領域は、相対的に低く保存された（ｌｅｓｓ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）領域で構成されているが、非常に興味深いことに、この領域には陰電荷アミノ酸がほとんどなく、陽電荷アミノ酸が多数含まれている特徴がある。
Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の親指ドメインに存在するＨａ（４８７－４９６）とＨｂ（５１５－５２１）との間のループ構造は、プライマー領域の近くに存在すると予測したが（Ｋｉｍ，Ｅｏｍ ｅｔ ａｌ．１９９５）、この領域の重要性は、この発明の前には注目されていなかった。その理由は、この領域が結晶構造形成時に高い非定型性（ｈｉｇｈｌｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｓｔａｔｅ）を示し、プライマーをはじめとする基質との構造的連関性を明確に突き止めなかったためである。
ループ部位の構造を、タンパク質データベース（ＰＤＢ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／）にあるＴａｑ ＤＮＡ重合酵素とＤＮＡの結合の結晶構造ＤＢである３ＫＴＱ情報を用いて、ＰｙＭＯＬ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／２／）プログラムで鋭意調べてみた。その結果、このループ構造がプライマーの骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）部位を取り囲んでいることを確認した（図５）。このような構造は、ＤＮＡによるＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解抑制の関連性をよく示しているものである。
このような構造的特性とＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の分解特性からして、このループ領域がプライマーをはじめとするＤＮＡ結合と密接な連関性があることを確認することができる。
プライマーと相互作用するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素のループ部位は、ＰＣＲの効率性を高めたり区分性を増大したりする酵素変異体の開発に非常に重要な部位になり得る。ループ領域のアミノ酸は、重要な変形（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）対象領域になり得、特に、この領域に存在する荷電されたアミノ酸が一次的な変形対象として選択されてよい。ループ領域の陽電荷アミノ酸は、プライマーのリン酸骨格の陰電荷と静電気的結合（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）が可能なので、それらの変異はＴａｑ ＤＮＡ重合酵素の活性変化、特に、区分性を示す重合酵素の特性の変化を期待することができる。
＜実施例６＞Ｋ５１１Ａ変異体及びＲ５１２Ａ変異体の作製及び活性検証
＜実施例５＞の推論によって、ループ領域内に存在する様々なアミノ酸のうち、優先切断領域である陽電荷アミノ酸であるＫ５１１とＲ５１２を変形して、本発明の主要目的である区分性と関連した変異株の選別が可能であることを確認しようとした。Ｋ５１１とＲ５１２を、＜実験例１＞の部位指示突然変異方法により、代表的な非電荷アミノ酸であるアラニン（Ａ）に変更し、Ｋ５１１Ａ及びＲ５１２Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体を作製した。この変異体をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、各変異Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を粗精製してＰＣＲで活性を測定した結果、Ｋ５１１Ａ変異株は、野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素に比肩できるような高い活性を有していたが、Ｒ５１２Ａ変異株は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の活性が見られなかった。この結果から、Ｋ５１１に比べてＲ５１２位置の陽電荷アミノ酸であるアルギニンがプライマーとの結合に非常に重要な役割を担っていると推定された。
＜実施例７＞Ｋ５１１Ａ変異体のマッチとミスマッチ区分性確認
＜実施例６＞で作製したＫ５１１Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体を＜実験例２＞及び＜実験例４＞のように培養し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで９５％以上の純度で精製した。精製されたＫ５１１Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素に対して＜実験例６＞のように実時間ＰＣＲを行った。行われたＰＣＲ条件においてＫ５１１Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素は、野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素に比べて顕著に高い区分性を示した。ＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅ［ＡとＴの塩基区分（鋳型ＤＮＡ；配列番号５、６）］、ＥＧＦＲ－T７９０Ｍ［ＣとＴの塩基区分（鋳型ＤＮＡ；配列番号３、４）］を対象にＫ５１１Ａ変異体の３’－ミスマッチ区分性を確認した。その結果、Ｋ５１１Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を用いた実時間ＰＣＲにおいてマッチとミスマッチ間に高い区分性を示した（図６）。
＜実施例８＞Ｋ５１１Ａ Ｔａｑを用いたＰＣＲにおいてＫＣｌとべタインの影響
＜実施例７＞のように精製したＫ５１１Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体に、ＫＣｌ濃度を０から１８０ｍＭまで次第に上げながら、Ｋ５１１Ａ変異体の活性変化を野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素と比較しながら確認した（表３）。野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の場合、高いＫＣｌ濃度においても比較的高い活性を保持し、酵素濃度の増加によってマッチとミスマッチの区分性（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）が増大する傾向があった。特に、Ｋ５１１Ａ変異体の場合、ＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅの検出時にＫＣｌ濃度約８０ｍＭまで、ＥＧＦＲ－Ｔ７９０Ｍの検出時にＫＣｌ濃度約１００ｍＭまで活性が保持されたし、両方の場合とも、酵素変異体の濃度が高いほど区分性が大きくなり、低いほど区分性が低くなった。また、べタイン（１．２５Ｍ）が添加された条件では、Ｋ５１１Ａ変異体の活性が少しさらに強くなり、ＫＣｌの濃度範囲がさらに拡張され、ＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅの検出時にＫＣｌ約１００ｍＭ以上、ＥＧＦＲ－Ｔ７９０Ｍの検出時にＫＣｌ約１２０ｍＭ以上でも高い活性を示した。
このような実施例の結果から、Ｋ５１１Ａ変異体を用いたマッチとミスマッチＰＣＲの最適の区分性のための適切なＫＣｌ及びべタインの濃度範囲は、標的鋳型とプライマー又はＰＣＲ条件によって変わってよい。
Figure 0007470216000004
上の表で、Ｍｔは突然変異ＤＮＡ鋳型、Ｗｔは野生型ＤＮＡ鋳型を意味する。
＜実施例９＞ループ領域荷電されたアミノ酸変異体作製及びその活性
ループ領域のうち、荷電されたアミノ酸であるＧ４９９、Ｋ５０５、Ｅ５０７、Ｋ５０８、Ｋ５１１、Ｒ５１２を選択し、２０個のアミノ酸のうち代表的なアミノ酸のいくつかの種類［Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｋ（又はＲ）、Ｅ］で置換した多数の変異体を作って活性と変異区分性を試験した。各変異体の作製は、各変異体作製用のプライマーセットを用いて＜実験例１＞によって行った。
変異体は、＜実験例２＞によってＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を親菌株として培養し、＜実験例３＞によって粗精製したし、この粗精製試料に対して＜実験例５＞によって活性を試験した。粗精製した各Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素試料をＢｒａｄｆｏｒｄ分析法で定量し、約６００ｎｇのタンパク質から始まって２倍（３００ｎｇ）、４倍（１５０ｎｇ）、１６倍（７５ｎｇ）、３２倍（３７．５ｎｇ）に希釈してＰＣＲ反応を行って評価した（表３）。
その結果、Ｋ５０５、Ｋ５０８、Ｋ５１１、Ｒ５１２の陽電荷アミノ酸を陰電荷アミノ酸であるグルタミン酸に変えたとき、すなわち、Ｋ５０５Ｅ、Ｋ５０８Ｅ、Ｋ５１１Ｅ及びＲ５１２Ｅ変異体の場合、ＤＮＡ重合酵素活性を示さなかった。しかし、同一の陽電荷アミノ酸に置換した場合、重合酵素活性が相変らず非常に高かった。
このような結果から、陽電荷アミノ酸であるリジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）が活性に非常に重要な領域であることが確認できた。このような重合酵素活性の消失は、陽電荷アミノ酸が陰電荷アミノ酸に変わることにより、ループ部位とプライマーをはじめとするＤＮＡ骨格のリン酸間の結合が弱化して現れた結果と推定される。これと反対に、ループ部位内の唯一の陰電荷アミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ５０７）がリジン（Ｋ）に変更された変異体は、活性の減少がないか、むしろ活性が高くなることが確認された。また、非電荷アミノ酸であるＧ４９９を、陽電荷アミノ酸であるアルギニン（Ｒ）で置換した場合には高い酵素活性を示した。
Figure 0007470216000005
＊１／８以上希釈において活性がある場合に、＋＋＋；１／２以上１／８未満希釈において活性がある場合、＋＋；１／２未満でのみ活性がある場合、＋；原液において活性が検出されない場合、－と表示した。
＊＊区分性は、ΔΔＣｔで示した。ΔΔＣｔ＝野生型（ＷＴ）Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用したΔＣｔ（ΔＣｔ＝変異体鋳型のＣｔ－野生型鋳型のＣｔ）－Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体を使用したΔＣｔ。試験は、ＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅの変異区分性で評価する。ΔΔＣｔが１未満の場合に－；１以上～３未満の場合に＋；３以上～６未満の場合に＋＋；６以上の場合に＋＋＋と表示した。測定されていない場合にはｎｄと表示した。
＜実施例１０＞ＤＮＡ重合酵素変異体の実時間ＰＣＲ区分性比較
＜実施例８＞のように粗精製された様々なＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体のうち、活性が＋＋以上であるＴａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体粗精製試料に対して、実験例６によって区分性確認のための実時間ＰＣＲを行った。その結果を表３の区分性に表示した。区分性は、ΔΔＣｔ（ΔΔＣｔ＝野生型ＴａｑのΔＣｔ－変異体ＴａｑのΔＣｔ、ΔＣｔ＝変異体鋳型のＣｔ－野生型鋳型のＣｔ）値を比較して評価した。
試験変異体のうち、比較的高い区分性がある変異体（＋＋）はＫ５１１Ｒ、Ｒ５１２Ｋであり、非常に高い区分性を示す変異体（＋＋＋）はＫ５０５Ｇ、Ｋ５０５Ｉ、Ｋ５０５Ｌ、Ｋ５０５Ｍ、Ｋ５０５Ｆ、Ｋ５０８Ｓ、Ｋ５０８Ｒ、Ｋ５１１Ａ、Ｒ５１２Ｗであった（表３、図７Ａ及び図７Ｂ）。
実施例9において陰電荷アミノ酸への置換時に変異体（Ｋ５０５Ｅ、Ｋ５０８Ｅ、Ｋ５１１Ｅ、Ｒ５１２Ｅ）の活性が顕著に減少したし、これと類似に、陰電荷アミノ酸の除去時（Ｅ５０７Ｇ、Ｅ５０７Ｋ、Ｅ５０７Ｑ）に活性は比較的高いが、区分性はあまり高くなっていなかった。興味深いことに、陽電荷アミノ酸であるＫとＲを相互に置換する場合、すなわち、Ｋ５１１Ｒ及びＲ５１２Ｋ変異体は、活性が保持されたし、区分性も少し増加した。各変異体の中でも高い区分性を示す変異体は、非荷電アミノ酸に置換された変異体であるＫ５０５Ｇ、Ｋ５０５Ｉ、Ｋ５０５Ｌ、Ｋ５０５Ｍ、Ｋ５０５Ｆ、Ｋ５０８Ｓ、Ｋ５１１Ａ、Ｒ５１２Ｗなどと確認された。
このような結果からすれば、本発明の集中変異領域であるループ領域の陰電荷アミノ酸の存在は、ＤＮＡ骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）のリン酸とループ領域との結合を妨害して活性の減少を招くものと推論され、ループ領域の陽電荷アミノ酸の存在は、タンパク質とプライマーとの堅固な結合を誘導し、安定した活性の保持を助けるものと判断される。ループ領域の陽電荷アミノ酸を非電荷アミノ酸に置換する場合に、活性の消失は大きくなく、区分性を高めることが確認される。
＜実施例１１＞Ｋ５１１Ａ変異体への追加変異導入変異体の区分性確認
Ｋ５１１Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素変異体にさらに、低温で活性が抑制される突然変異体（ｃｏｌｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ）として報告された部位であるＩ７０７Ｌ及びＥ７０８Ｋ変異を導入した変異株ＣＳ２－Ｋ５１１Ａを、＜実施例６＞の方法によって作製した。＜実験例２＞及び＜実験例４＞のように培養し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで９５％以上の純度に精製した。精製されたＣＳ２－Ｋ５１１Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素に対して、＜実験例６＞と同様に実時間ＰＣＲを行った。ただし、このとき、前方プライマーは、ＥＧＦＲ－ＡＲＭＳ－Ｆを使用した。行われたＰＣＲ条件でＣＳ２－Ｋ５１１Ａ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素は、野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素に比べて実時間ＰＣＲにおいてマッチとミスマッチ間に非常に高い区分性を示した（表３及び図８）。
本発明の区分性が向上したＤＮＡ重合酵素変異体は、重合酵素活性は保持又は向上しながら、鋳型とプライマー間の塩基マッチ又はミスマッチによる区分性が向上するので、相補的位置又は非相補的変異位置の存在及び増幅の有無を容易に確認でき、よって、少量多品種が混合された試料中の対立遺伝子の検出が容易となり、微量の突然変異を含む試料中の突然変異遺伝子の検出が容易であり、農産物、水産物、畜産物などの遺伝子検査や医学分野の診断などに幅広く利用可能である。
［配列目録フリーテキスト］
電子ファイルとして添付。
本発明は、大韓民国農林畜産食品部の支援下で行った課題の結果であることを明らかにする（課題固有番号：１５４５０１９８０６、課題名：ＦｅｎＤＥＬベース品種検査製品用実時間遺伝子分析技術開発）。

Claims (5)

  1. 配列番号１のアミノ酸配列を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの変異体であって、
    前記変異体は、前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するとともに、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、
    前記変異体は、Ｋ５１１Ａ、Ｋ５１１Ｒ、およびＲ５１２Ｋから選択されるアミノ酸の置換を含み、ここで、アミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされ、前記Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと比較して対立遺伝子又は遺伝子変異区分性が向上した、変異体。
  2. 前記変異体は、Ｉ７０７Ｌ及びＥ７０８Ｋから選択されるアミノ酸の置換をさらに含む、請求項１に記載の変異体。
  3. Ｋ５１１Ａ、Ｉ７０７Ｌ及びＥ７０８Ｋの３つのアミノ酸の置換を含む、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の変異体を用いて対立遺伝子又は遺伝子変異区分性が改善されたリアルタイムＰＣＲ（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）を行う方法。
  5. 請求項１～３のいずれか一項に記載の変異体が含まれたリアルタイムＰＣＲ（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）キット。
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