JP2021141898A - 核酸増幅用試薬及び核酸増幅法 - Google Patents
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Abstract
Description
項1.終濃度が50mM以上のテトラメチルアンモニウム塩、及びテトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
項2.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼが、終濃度が50mM以上のテトラメチルアンモニウム塩存在下で阻害されないDNAポリメラーゼである項1に記載の核酸増幅用組成物。
項3.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼが配列番号10と90%以上の同一性があるDNAポリメラーゼである項1または2に記載の核酸増幅用組成物。
項4.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼがTth DNAポリメラーゼである項1または2に記載の核酸増幅用組成物。
項5.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼがZ05 DNAポリメラーゼである項1または2に記載の核酸増幅用組成物。
項6.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼが配列番号11の変異体である項1または2に記載の核酸増幅用組成物。
項7.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼが配列番号11の少なくともE507位、またはE742位が改変されたDNAポリメラーゼである項6に記載の核酸増幅用組成物。
項8.前記テトラメチルアンモニウム塩が、酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれた少なくとも1種の化合物である項1〜7のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項9.テトラメチルアンモニウム塩の終濃度が100〜210mMである項1〜8のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項10.少なくとも抗体、反応緩衝剤および金属イオンをさらに含む項1〜9のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項11.少なくとも逆転写酵素、抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む項1〜10のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項12.核酸増幅反応がPCRである項1〜11のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項13.核酸増幅反応がワンステップRT−PCRである項1〜12のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項14.テトラメチルアンモニウム塩及び、及び終濃度が50mM以上のテトラメチルアンモニウム耐性を有するDNAポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅法。
項15.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼが、50mMのテトラメチルアンモニウム塩存在下で阻害されないDNAポリメラーゼである項14に記載の核酸増幅法。
項16.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼが配列番号10と90%以上の同一性があるDNAポリメラーゼである項14または15に記載の核酸増幅法。
項17.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼがTth DNAポリメラーゼである請求項14〜16のいずれかに記載の核酸増幅法。
項18.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼがZ05 DNAポリメラーゼである項14〜17のいずれかに記載の核酸増幅法。
項19.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼが配列番号11の変異体である項14〜18のいずれかに記載の核酸増幅法。
項20.前記テトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼが配列番号11の少なくともE507位、またはE742位が改変されたDNAポリメラーゼである項14〜19のいずれかに記載の核酸増幅法。
項21.前記テトラメチルアンモニウム塩が、酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれた少なくとも1種の化合物である項14〜20のいずれかに記載の核酸増幅法。
項22.テトラメチルアンモニウム塩の終濃度が100〜210mMである項14〜21のいずれかに記載の核酸増幅法。
項23.少なくとも抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む項14〜22のいずれかに記載の核酸増幅法。
項24.少なくとも逆転写酵素、抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む項14〜23のいずれかに記載の核酸増幅法。
項25.核酸増幅反応がPCRである項14〜24のいずれかに記載の核酸増幅法。
項26.核酸増幅反応がワンステップRT−PCRである項14〜25のいずれかに記載の核酸増幅法。
DNAポリメラーゼのテトラメチルアンモニウム塩耐性評価
BlendTaq(東洋紡)添付の10×PCR Bufferを用い、1×PCR Buffer、0.2mM dNTPs、50ngヒトゲノム、β―アクチン1.3kbを増幅する15pmolの配列番号12及び13に記載のプライマーを含む50μlの反応液中に、耐性の有無を判定したい酵素を2.5Uになるよう添加する。酢酸テトラメチルアンモニウムを終濃度0、50、100、150、200mMになるように添加し、94℃、30秒の前反応の後、94℃、30秒→60℃、30秒→72℃、90秒を30サイクル繰り返すスケジュールでPCRを行う。増幅産物を電気泳動で確認し、酢酸テトラメチルアンモニウムを添加したものと酢酸テトラメチルアンモニウムを添加していないものを比較し、増幅量が変わらなければ、その濃度までテトラメチルアンモニウム塩に耐性があるということができる。
(1)RNAサンプル
RNAサンプルとして、エンテロウィルスRNA(Vircell)を使用した。1570コピーのエンテロウィルスRNAを鋳型として使用した。
(2)cDNA合成
エンテロウィルスRNAを鋳型としてcDNAを合成した。
ReverTra Ace(登録商標) qPCR RT Master Mix(東洋紡)の5×RT Master Mix 2μL、
RNA 5μL、
を含む反応液10μLを、以下の温度条件で反応した。
37℃ 10分
50℃ 5分
98℃ 5分
(3)PCR反応
酢酸テトラメチルアンモニウムを0から160mMまで添加したバッファーを調製し、(2)で取得したcDNAを添加してリアルタイムPCRを実施した。
rTth DNA Polymerase(東洋紡) 1unit、
抗Tth抗体 0.4μg、
10×Buffer(東洋紡 rTth DNA PolymeraseのBuffer) 2μL、
10mM dNTPs(東洋紡) 0.4μL、
10μM エンテロウィルスフォアードプライマー(配列番号1) 0.6μL、
10μM エンテロウィルスプローブ(配列番号2) 0.4μL、
10μM エンテロウィルスリバースプライマー(配列番号3) 0.6μL、
RNA 5μL、
酢酸テトラメチルアンモニウム 各条件の濃度、
を含む反応液20μLを、以下の温度サイクルで反応した。
95℃ 1分
95℃ 15秒−60℃ 45秒 45サイクル
その結果を図1に示す。図1Aは、リアルタイムPCRで求められた各コピー数におけるCt値をまとめたものである。図1Bは、リアルタイムPCRで得られた増幅曲線の図である。驚くべきことに酢酸テトラメチルアンモニウムを0から160mMまで添加するにしたがって、増幅曲線の立ち上がりが早くなっている(Ct値が小さくなる)。このことから、酢酸テトラメチルアンモニウムの濃度を上げることにより、PCR反応の増幅効率が向上することがわかる。
Z05 DNA Polymerase(ロシュ) 1unit、
抗Tth抗体 0.4μg、
10×Buffer(東洋紡 rTth DNA PolymeraseのBuffer) 2μL、
10mM dNTPs(東洋紡) 0.4μL、
10μM エンテロウィルスフォアードプライマー(配列番号1) 0.6μL、
10μM エンテロウィルスプローブ(配列番号2) 0.4μL、
10μM エンテロウィルスリバースプライマー(配列番号3) 0.6μL、
RNA 5μL、
酢酸テトラメチルアンモニウム 各条件の濃度、
を含む反応液20μLを、以下の温度サイクルで反応した。
95℃ 1分
95℃ 15秒−60℃ 45秒 45サイクル
(1)RNAサンプル
RNAサンプルとして、バクテリオファージMS2由来のRNA(ロシュ・ダイアグノスティックス(品番:10165948001))を使用した。MS2 RNAを1,000,000コピーから1コピーまで、1/10ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。酢酸テトラメチルアンモニウムを0から300mMまで添加したときの感度をリアルタイムRT−PCRにおいて比較した。
(2)RT−PCR反応
PCRの反応効率と感度の指標として、MS2 RNAを標的としたRT−PCRを行った。
ReverTra Ace(東洋紡) 1unit、
RNase inhibitor(東洋紡) 1unit、
rTth DNA Polymerase(東洋紡) 1unit、
抗Tth抗体 0.4μg、
10×Buffer(東洋紡 rTth DNA PolymeraseのBuffer) 2μL、
10mM dNTPs(東洋紡) 0.4μL、
10μM MS2フォアードプライマー(配列番号4) 0.6μL、
10μM MS2プローブ(配列番号5) 0.4μL、
10μM MS2リバースプライマー(配列番号6) 0.6μL、
RNA 5μL、
酢酸テトラメチルアンモニウム 各条件の濃度、
を含む反応液20μLを、以下の温度サイクルで反応した。
42℃ 10分
95℃ 5分
95℃ 15秒−60℃ 45秒 45サイクル
酢酸テトラメチルアンモニウム濃度は0から300mM(終濃度)までの条件を比較した。
その結果を図2、図3、図4に示す。図2及び図3は、リアルタイムRT−PCRで求められた各コピー数におけるCt値をまとめたものである。図4は、MS2RNAのコピー数の対数値をx軸に、Ct値をy軸にとり、グラフ化したものである。驚くべきことに、酢酸テトラメチルアンモニウムを0から100mMまで添加するにしたがって、増幅曲線の立ち上がりが早くなり(Ct値が小さくなる)、検出感度が向上している。また、酢酸テトラメチルアンモニウムの100から210mM程度で増幅曲線の立ち上がりが最も早く(Ct値が最小)、検出感度も最大となり、220mMを越えて添加すると、反応が阻害されて検出できないことがわかる。
120mM(終濃度)酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー及び120mM(終濃度)酢酸テトラメチルアンモニウムを含まないバッファーを調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムRT−PCRを実施した。
(1)RNAサンプル
RNAサンプルとして、ムンプスウィルスRNA(Vircell)を使用した。ムンプスウィルスRNAを6250コピーから24コピーまで、1/4ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
(2)RT−PCR反応
PCRの反応効率と感度の検討の指標として、ムンプスウィルスRNAを標的としたRT−PCRを行った。酢酸テトラメチルアンモニウム以外の組成を下記に示す。
ReverTra Ace(東洋紡) 1unit、
RNase inhibitor(東洋紡) 1unit、
rTth DNA Polymerase(東洋紡) 1unit、
抗Tth抗体 0.4μg、
10×Buffer(東洋紡 rTth DNA PolymeraseのBuffer) 2μL、
10mM dNTPs(東洋紡) 0.4μL、
10μM ムンプスウィルスフォアードプライマー(配列番号7) 0.6μL、
10μM ムンプスウィルスプローブ(配列番号8) 0.6μL、
10μM ムンプスウィルスリバースプライマー(配列番号9) 0.4μL、
RNA 5μL、
を含む反応液20μLを、以下の温度サイクルで反応した。
50℃ 10分
95℃ 1分
95℃ 15秒−60℃ 45秒 45サイクル
その結果を図5、図6に示す。図5は、120mM 酢酸テトラメチルアンモニウムを含まないバッファー、120mM 酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーでリアルタイムRT−PCRを実施し、縦軸にCt値、横軸にRNAの対数値を取りグラフ化した図である。図6は、調製した各々のバッファーでリアルタイムRT−PCRを実施した時の増幅曲線である。図Aは120mM 酢酸テトラメチルアンモニウムを含まないバッファー、図Bは120mM 酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーの図である。酢酸テトラメチルアンモニウムを含まないバッファーでは100コピー程度までの増幅が可能だったが、酢酸テトラメチルアンモニウムを添加すると、驚くべきことに、30コピー以下の検出が可能となった。
120mM(終濃度)酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーで、Tth DNAポリメラーゼ及びTaq DNAポリメラーゼでリアルタイムRT−PCRを実施した。
(1)RNAサンプル
RNAサンプルとして、ムンプスウィルスRNA(Vircell)を使用した。ムンプスウィルスRNAを6250コピーから24コピーまで、1/4ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
(2)RT−PCR反応
PCRの反応効率と感度の検討の指標として、ムンプスウィルスRNAを標的としたRT−PCRを行った。酢酸テトラメチルアンモニウム以外の組成を下記に示す。
ReverTra Ace(東洋紡) 1unit、
RNase inhibitor(東洋紡) 1unit、
rTth DNA Polymerase(東洋紡)またはrTaq DNA Polymerase(東洋紡) 1unit、
抗Taq抗体または抗Tth抗体 0.4μg、
10×Buffer(東洋紡 rTth DNA PolymeraseのBuffer) 2μL、
10mM dNTPs(東洋紡) 0.4μL、
10μM ムンプスウィルスフォアードプライマー(配列番号7) 0.6μL、
10μM ムンプスウィルスプローブ(配列番号8) 0.6μL、
10μM ムンプスウィルスリバースプライマー(配列番号9) 0.4μL、
0.3M カルニチン
4% トリメチレングリコール
RNA 5μL、
を含む反応液20μLを、以下の温度サイクルで反応した。
50℃ 10分
95℃ 1分
95℃ 15秒−60℃ 45秒 45サイクル
その結果を図7、図8に示す。図7は、縦軸にCt値、横軸にRNAの対数値を取りグラフ化した図である。図8のAはTth DNAポリメラーゼ、図8のBはTaq DNAポリメラーゼでリアルタイムRT−PCRを実施した時の増幅曲線である。驚くべきことに、酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーはTth DNAポリメラーゼとの組み合わせにより、検出感度が向上した。一方、Taq DNAポリメラーゼは阻害され、検出不可能であった。
120mM(終濃度)酢酸テトラメチルアンモニウム及び120mM(終濃度)酢酸テトラメチルアンモニウムの代わりに塩化テトラメチルアンモニウムを添加したバッファーをそれぞれ調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムRT−PCRを実施した。
(1)RNAサンプル
RNAサンプルとして、ムンプスウィルスRNA(Vircell)を使用した。ムンプスウィルスRNAを6250コピーから24コピーまで、1/4ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
(2)RT−PCR反応
PCRの反応効率と感度の検討の指標として、ムンプスウィルスRNAを標的としたRT−PCRを行った。酢酸テトラメチルアンモニウム又は塩化テトラメチルアンモニウム以外の組成を下記に示す。
ReverTra Ace(東洋紡) 1unit、
RNase inhibitor(東洋紡) 1unit、
rTth DNA Polymerase(東洋紡) 1unit、
抗Tth抗体 0.4μg、
10×Buffer(東洋紡 rTth DNA PolymeraseのBuffer) 2μL、
10mM dNTPs(東洋紡) 0.4μL、
10μM ムンプスウィルスフォアードプライマー(配列番号7) 0.6μL、
10μM ムンプスウィルスプローブ(配列番号8) 0.6μL、
10μM ムンプスウィルスリバースプライマー(配列番号9) 0.4μL、
0.3M カルニチン
4% トリメチレングリコール
RNA 5μL、
を含む反応液20μLを、以下の温度サイクルで反応した。
50℃ 10分
95℃ 1分
95℃ 15秒−60℃ 45秒 45サイクル
その結果を図9、図10に示す。図9は縦軸にCt値、横軸にRNAの対数値を取りグラフ化した図である。図10のAは酢酸テトラメチルアンモニウム、Bは塩化テトラメチルアンモニウムでリアルタイムRT−PCRを実施した時の増幅曲線である。驚くべきことに、塩化テトラメチルアンモニウムを使用した場合も酢酸テトラメチルアンモニウムと同様に検出感度が向上した。
Taq変異体の作製
Thermus aquaticus由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号14)を含有するプラスミド、pTaq E507K、pTaq E507R、pTaq E742K、pTaq E742Rを作製した。
Tth変異体の作製
Thermus thermophilus由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号26)を含有するプラスミド、pTth Q509K、pTth Q509R、pTth E744K、pTth E744Rを作製した。
耐熱性DNAポリメラーゼの作製
実施例6、7で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mlのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを、500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mlのアンピシリンを含有する3mlのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ製)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリJM109(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mlの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、耐熱性DNAポリメラーゼを得た。
A液: 40mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)、16mM 塩化マグネシウム、15mM ジチオスレイトール、100μg/ml BSA
B液: 1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C液: 1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D液: 20% トリクロロ酢酸(2mM ピロリン酸ナトリウム)
E液: 1mg/ml 仔牛胸腺DNA
A液25μl、B液5μl、C液5μl及び滅菌水10μlをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液5μlを加えて75℃で10分間反応する。その後冷却し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を、液体シンチレーションカウンター(パッカード製Tri−Carb2810 TR)を用いて計測し、鋳型DNAへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の1単位はこの条件下で30分当り10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
DNAポリメラーゼのテトラメチルアンモニウム塩耐性評価
上記のテトラメチルアンモニウム塩耐性評価方法で、実施例7で得られた改変型Taq DNAポリメラーゼ、及び野生型Taq DNAポリメラーゼ(東洋紡)、Tth DNAポリメラーゼ(東洋紡)、Z05 DNAポリメラーゼ(Roche)を評価した。
120mM(終濃度)酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファーで、Taq DNAポリメラーゼ及び改変型Taq DNAポリメラーゼ(Taq E507K、Taq E507R)で血液を鋳型にリアルタイムPCRを実施した。
(1)鋳型
鋳型として、血液1μlを使用した。
(2)PCR反応
酢酸テトラメチルアンモニウム以外の組成を、下記に示す。
Taq DNA Polymerase(東洋紡)または改変型Taq DNA Polymerase 1unit、
抗Taq抗体 0.4μg、
10×Buffer(東洋紡 rTth DNA PolymeraseのBuffer) 2μL、
10mM dNTPs(東洋紡) 0.4μL、
10μM プライマー(配列番号23) 0.6μL、
10μM プローブ(配列番号24) 0.6μL、
10μM プライマー(配列番号25) 0.4μL、
0.3M カルニチン
4% トリメチレングリコール
血液 1μL、
を含む反応液20μLを、以下の温度サイクルで反応した。
95℃ 1分
95℃ 15秒−60℃ 60秒 40サイクル
その結果を図12に示す。図12はそれぞれの酵素で行った増幅曲線を示す。Taq DNAポリメラーゼでは増幅が見られないものの、改変型Taq DNAポリメラーゼ(E507K、E742K)では立ち上がりが見られ、血液から直接、精製を経ることなく増幅できることが示された。E507R、E742Rでも同様の結果が得られた。テトラメチルアンモニウム塩の効果でPCRの効率が向上し、血液の阻害を受けることなくPCRが成功したと考えられる。
Claims (1)
- 反応液中終濃度が50mM以上となるように調整されたテトラメチルアンモニウム塩、及びテトラメチルアンモニウム耐性DNAポリメラーゼを含み、精製を経ていない生体試料から直接核酸増幅するために用いられる核酸増幅用組成物。
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