JP2021185835A - コロナウイルスのサブタイプの識別方法 - Google Patents

Abstract

【課題】コロナウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型とを識別する方法の提供。【解決手段】ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の２８，１４４番目の塩基を含む領域を識別用標的領域とし、ゲノムＲＮＡ中の前記識別用標的領域を包含する領域を増幅用標的領域とし、被験試料から抽出されたＲＮＡ又はそのｃＤＮＡを鋳型として、Ｌ型ウイルスの識別用標的領域のプラス鎖ゲノムＲＮＡ又は相補鎖ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡにハイブリダイズ可能な１本鎖核酸をＬ型結合性オリゴヌクレオチドプローブと、Ｓ型ウイルスの識別用標的領域のプラス鎖ゲノムＲＮＡ又は相補鎖ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡにハイブリダイズ可能な１本鎖核酸をＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブとの存在下で、増幅用標的領域を増幅する鋳型依存的核酸増幅反応を行い、増幅産物に基づいて、被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型とを識別する方法。【選択図】なし

Description

本発明は、コロナウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡの２８，１４４番目の塩基がウラシル（Ｕ）であるＬ型ウイルスと、当該塩基がシトシン（Ｃ）であるＳ型ウイルスとを識別する方法、及び当該方法に用いられるキットに関する。

２０１９年１２月に最初の感染が報告された後、世界的な感染拡大が問題となっている新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ−１９）は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２（Severe Acute Respiratory Syndrome CoronaVirus 2）を原因病原体とする感染症である。ごく最近、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＣ＿０４５５１２．２）の２８，１４４番目がウラシルであるＬ（ロイシン）型と、２８，１４４番目がシトシンであるＳ（セリン）型の２つの主要な型が報告されている（非特許文献１）。Ｌ型は感染の初期段階で一般的であったことから、Ｓ型と比較して感染力が強い可能性があるとして注目されている。

遺伝子の塩基配列が変化する遺伝子変異の多くは、わずか１〜数塩基が挿入、欠失、他の塩基への転換等がなされている。このため、遺伝子変異の検出は１〜数塩基の変異部位以外は同じ塩基配列からなる野生型核酸と変異型核酸を識別して検出する必要がある。

ＤＮＡやＲＮＡの１〜数塩基の変異を検出する方法としては、様々な技術が存在している。ＰＣＲ（polymerase chain reaction）を利用した変異検出方法としては、例えば、蛍光物質とクエンチャーによる修飾オリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＣＲ法が挙げられる。当該方法では、変異が入っていることが予想されるＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する反応を、変異が入っていることが予想される変異型ＤＮＡ領域にハイブリダイズし、蛍光物質とクエンチャーで修飾されたオリゴヌクレオチドプローブの存在下で行う。変異型ＤＮＡに対しては当該プローブがアニールし、ＰＣＲに使われるＤＮＡポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性によってプローブが切断され、蛍光物質とクエンチャーが乖離する結果、反応系に蛍光が生じる。野生型ＤＮＡの場合には、当該プローブがアニールしないため、蛍光は生じない。ただ、野生型と変異型のＤＮＡが混在するサンプルでは、定量的な評価をする場合には煩雑な操作が必要なため、ヘテロ変異の検出には使いにくい。

１〜数塩基の変異を検出する方法として、ＤＮＡ上の変異を含む領域を標的領域とし、当該標的領域にハイブリダイズ可能な１７〜２９塩基程度の短鎖ＲＮＡ（オリゴリボヌクレオチド、ＯＲＮ）の存在下で、当該標的領域を含む領域をＰＣＲ増幅するＯＲＮｉ−ＰＣＲ法が報告されている（特許文献１）。ＯＲＮｉ−ＰＣＲ法では、ＯＲＮがハイブリダイズするＤＮＡ領域のＰＣＲ増幅は特異的に阻害され、ＯＲＮがハイブリダイズしないＤＮＡのみがＰＣＲ増幅される。つまり、増幅産物が得られた場合には、鋳型としたＤＮＡは、目的の変異を有しておらず、増幅産物が得られなかった場合には、当該ＤＮＡは目的の変異を有していると識別できる。

特許第６６５３９３２号公報 国際公開第００／２８０８２号 国際公開第０２／１６６３９号 特公平７−１１４７１８号公報 特許第２６５０１５９号公報

Tang et al, National Science Review, 2020, DOI: 10.1093/nsr/nwaa036 Barany, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1991, vol.88, p.189-193. Sarrazin et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, vol.39, p.2850-2855. Dean et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, vol.99, p.5261-5266. Piepenburg et al., PLoS Biology, 2006, vol.4, e204. Nakaguchi et al., Journal of Clinical Microbiology, 2004, vol.42, p.4248-4292.

本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型を識別する方法や当該方法のためのキットを提供することを主たる目的とする。

本発明者は、鋭意研究した結果、ＯＲＮｉ−ＰＣＲ法を利用することによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型の一塩基の差異を、陽性シグナルとして検出できることを見出し、本発明を完成させた。

本発明に係るコロナウイルスのサブタイプの識別方法、及びコロナウイルス識別用キットは、下記の通りである。
［１］ コロナウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡのうち、２８，１４４番目の塩基がウラシルであるＬ型ウイルスと、２８，１４４番目の塩基がシトシンであるＳ型ウイルスとを識別する方法であって、
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の２８，１４４番目の塩基を含む領域を、識別用標的領域とし、
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の前記識別用標的領域を包含する領域を、増幅用標的領域とし、
Ｌ型ウイルスの前記識別用標的領域におけるプラス鎖ゲノムＲＮＡ、又は前記識別用標的領域における相補鎖ゲノムＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡにハイブリダイズ可能な１本鎖核酸を、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブとし、
Ｓ型ウイルスの前記識別用標的領域におけるプラス鎖ゲノムＲＮＡ、又は前記識別用標的領域における相補鎖ゲノムＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡにハイブリダイズ可能な１本鎖核酸を、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブとし、
被験試料から抽出されたＲＮＡ又は当該ＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型として、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又はＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、前記増幅用標的領域を増幅する鋳型依存的核酸増幅反応を行い、前記増幅反応の増幅産物に基づいて、前記被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が、Ｓ型ウイルスとＬ型ウイルスのいずれであるかを識別する、
コロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［２］ 前記Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での前記鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量が、前記Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での前記鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量よりも多い場合に、前記被験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２はＳ型ウイルスであり、
前記Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での前記鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量が、前記Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での前記鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量よりも多い場合に、前記被験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２はＬ型ウイルスである、と識別する、前記［１］のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［３］ 前記識別用標的領域が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡのうち、２８，１２２番目〜２８，１４７番目の領域である、前記［１］又は［２］のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［４］ 前記Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及び前記Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブが、ＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドプローブである、前記［１］〜［３］のいずれかのコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［５］ 前記被験試料から抽出されたＲＮＡを鋳型として、逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型として鋳型依存的核酸増幅反応を行う、前記［１］〜［４］のいずれかのコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［６］ 前記鋳型依存的核酸増幅反応が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、ＭＤＡ法、及びＲＰＡ法からなる群より選択される一種以上である、前記［５］のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［７］ 前記鋳型依存的核酸増幅反応が、ＰＣＲ法である、前記［６］のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［８］ ＰＣＲ法が、変性ステップ、アニーリングステップ及び伸長ステップからなり、前記アニーリングステップ及び前記伸長ステップが、同じ温度で実施される、前記［７］のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［９］ 前記アニーリングステップ及び前記伸長ステップの温度が、５４〜５６℃である、前記［８］のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［１０］ 前記ＰＣＲ法を、配列番号３〜５のいずれかで表される塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号６で表される塩基配列を有するリバースプライマーとを用いて行う、前記［７］〜［９］のいずれかのコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［１１］ 前記増幅用標的領域の長さが、１８０〜７００塩基長である、前記［７］〜［１０］のいずれかのコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［１２］ 前記鋳型依存的核酸増幅反応が、ＮＡＳＢＡ法及びＴＲＣ法からなる群より選択される一種以上である、前記［１］〜［４］のいずれかのコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［１３］ 前記鋳型依存的核酸増幅反応の開始時点における、前記Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又は前記Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの濃度が、１０ｎＭ〜１０μＭである、前記［１］〜［１２］のいずれかのコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
［１４］ 前記［１］〜［１１］のいずれかのコロナウイルスのサブタイプの識別方法に用いられる、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及びＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブを含有し、
前記Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１で表される塩基配列を含み、
前記Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２で表される塩基配列を含む、
コロナウイルス識別用キット。
［１５］ さらに、配列番号３〜５のいずれかで表される塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号６で表される塩基配列を有するリバースプライマーとを含有する、前記［１４］のコロナウイルス識別用キット。
［１６］ さらに、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡと、配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡと、を含有する、前記［１４］又は［１５］のコロナウイルス識別用キット。

本発明に係るコロナウイルスのサブタイプの識別方法により、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型の一塩基の差異を陽性シグナルとして検出することができ、両者を高精度かつ簡便に識別することができる。
また、本発明に係るコロナウイルス識別用キットにより、より簡便に、前記コロナウイルスのサブタイプの識別方法を実施して、被験試料中に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がＬ型とＳ型のいずれであるかを識別することができる。

本発明に係るコロナウイルスのサブタイプの識別方法の原理のうち、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う態様の模式図である。 ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＯＲＦ８のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の遺伝子のＯＲＦ８（open reading frame 8）（配列番号８）を示した図である。 表２に記載のフォワードプライマー３種とリバースプライマー１種がハイブリダイズする領域付近の、ＳＡＲＳとＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡのアラインメント図である。 実施例１において、Ｌ型鋳型用ＤＮＡ又はＳ型鋳型用ＤＮＡを鋳型として、ＯＲＮ＿Ｌ、ＯＲＮ＿Ｓ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ１プライマー、及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーを用いてＯＲＮｉ−ＰＣＲを行い、得られた反応液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例２において、Ｌ型鋳型用ＤＮＡ又はＳ型鋳型用ＤＮＡを鋳型として、ＯＲＮ＿Ｌ、ＯＲＮ＿Ｓ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ２プライマー、及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーを用いてＯＲＮｉ−ＰＣＲを行い、得られた反応液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。 実施例３において、Ｌ型ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡから得られたｃＤＮＡを鋳型としてＯＲＮｉ−ＰＣＲを行い、得られた反応液をアガロース電気泳動して分離したバンドの染色像である。

本発明及び本願明細書において、「塩基配列が相同である」とは「塩基配列が同一である」を意味し、「塩基配列が相補である」とは「塩基配列が互いに相補的である」を意味する。

＜コロナウイルスのサブタイプの識別方法＞
本発明に係るコロナウイルスのサブタイプの識別方法（以下、「本発明に係る識別方法」ということがある。）は、被験試料中のコロナウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が、ゲノムＲＮＡの２８，１４４番目の塩基がウラシルであるＬ型ウイルスであるか、２８，１４４番目の塩基がシトシンであるＳ型ウイルスであるかを、識別する方法である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型ウイルスとＳ型ウイルスは、感染力は重症化のしやすさなどの点で相違する可能性がある。このため、本発明に係る識別方法により、被験動物から採取された被験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がＬ型とＳ型を識別することにより、当該型の特性に応じた適切な治療方法の選択が可能になる。例えば、Ｌ型はＳ型よりも感染力が高い可能性があるため、Ｌ型に感染していると判明した動物は、Ｓ型に感染していることが判明した動物よりも優先的に、隔離等の感染拡大防止措置をとったり、治療をすることが好ましい。

本発明に係る識別方法は、ＯＲＮｉ−ＰＣＲ法を利用した方法であって、被験試料から抽出されたＲＮＡ又は当該ＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の２８，１４４番目の塩基を含む領域を、Ｌ型又はＳ型のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の２８，１４４番目の塩基に結合する１本鎖核酸の存在下で、鋳型依存的核酸増幅反応により増幅し、増幅産物の有無や量に基づいて、Ｌ型かＳ型のいずれであるかを識別する。本発明に係る識別方法においては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の２８，１４４番目の塩基を含む領域を、識別用標的領域とし、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の識別用標的領域を包含する領域を、増幅用標的領域とする。また、Ｌ型ウイルスのゲノムＲＮＡ中の前記識別用標的領域におけるプラス鎖ゲノムＲＮＡ、又は前記識別用標的領域における相補鎖ゲノムＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡにハイブリダイズ可能な１本鎖核酸を、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブとする。Ｓ型ウイルスのゲノムＲＮＡ中の前記識別用標的領域におけるプラス鎖ゲノムＲＮＡ、又は前記識別用標的領域における相補鎖ゲノムＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡにハイブリダイズ可能な１本鎖核酸を、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブとする。

図１に、本発明に係る識別方法のうちの一態様を模式的に示す。当該態様では、被験試料から抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブとして、表１に記載の塩基配列からなるオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ＿Ｌ）１を用い、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブとして、表１に記載の塩基配列からなるオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ＿Ｓ）２を用いる。表１の塩基配列中、大文字の箇所がＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の２８，１４４番目の塩基に相当する。

図２に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の遺伝子のＯＲＦ８（open reading frame 8）のｃＤＮＡ（配列番号９）を示す。図２中、２８，１４４番目の塩基を、白黒反転文字で示し、四角で囲った部分が識別用標的領域（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡの２８，１２２番目〜２８，１４７番目の領域）である。表１に記載のＯＲＮは、図２中の識別用標的領域と相同な塩基配列からなるオリゴリボヌクレオチドである。

図１の左側は、ＯＲＮ＿Ｌ１の存在下でＰＣＲを行った場合の模式図である。鋳型のｃＤＮＡが、Ｓ型ウイルスのゲノムＲＮＡの逆転写反応物であるＤＮＡ鎖３ｃとその相補鎖であるＤＮＡ鎖３ｇとからなる２本鎖ＤＮＡの場合には、ＯＲＮ＿Ｌ１は、鋳型のＤＮＡ鎖３ｇに対してミスマッチを有しているため両者の結合が弱く、よってプライマー４からのＤＮＡ鎖伸長反応が阻害されず、ＤＮＡ増幅が生じ、増幅産物が得られる。一方で、鋳型のｃＤＮＡが、Ｌ型ウイルスのゲノムＲＮＡの逆転写反応物であるＤＮＡ鎖３ｔとその相補鎖であるＤＮＡ鎖３ａとからなる２本鎖ＤＮＡの場合には、ＯＲＮ＿Ｌ１はＤＮＡ鎖３ａとミスマッチなくハイブリダイズする。ＤＮＡ鎖３ａを鋳型としたプライマー４からのＤＮＡ鎖伸長反応は、ＯＲＮ＿Ｌ１により阻害されるため、ＤＮＡ増幅は起こらず、増幅産物は得られない。

図１の右側は、ＯＲＮ＿Ｓ２の存在下でＰＣＲを行った場合の模式図である。鋳型のｃＤＮＡが、Ｓ型ウイルスのゲノムＲＮＡの逆転写反応物であるＤＮＡ鎖３ｃとその相補鎖であるＤＮＡ鎖３ｇとからなる２本鎖ＤＮＡの場合には、Ｓ型ＯＲＮ２は、ＤＮＡ鎖３ｇとミスマッチなくハイブリダイズする。ＤＮＡ鎖３ｇを鋳型としたプライマー４からのＤＮＡ鎖伸長反応は、ＯＲＮ＿Ｓ２により阻害されるため、ＤＮＡ増幅は起こらず、増幅産物は得られない。一方で、鋳型のｃＤＮＡが、Ｌ型ウイルスのゲノムＲＮＡの逆転写反応物であるＤＮＡ鎖３ｔとその相補鎖であるＤＮＡ鎖３ａとからなる２本鎖ＤＮＡの場合には、ＯＲＮ＿Ｓ２は、鋳型のＤＮＡ鎖３ａに対してミスマッチを有しているため両者の結合が弱く、よってプライマー４からのＤＮＡ鎖伸長反応が阻害されず、ＤＮＡ増幅が生じ、増幅産物が得られる。

本発明に係る識別方法において、識別用標的領域は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の２８，１４４番目の塩基を含む領域であり、オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする領域である。Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブは、鋳型依存的核酸増幅反応の核酸鎖伸長反応時に、Ｌ型ゲノムＲＮＡの識別用標的領域（２８，１４４番目の塩基がウラシルである領域：Ｌ型識別用標的領域）と相補的な塩基配列からなるＲＮＡ又はＤＮＡと、選択的にハイブリダイズする。Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブは、鋳型依存的核酸増幅反応の核酸鎖伸長反応時に、Ｓ型ゲノムＲＮＡの識別用標的領域（２８，１４４番目の塩基がシトシンである領域：Ｓ型識別用標的領域）と相補的な塩基配列からなるＲＮＡ又はＤＮＡと、選択的にハイブリダイズする。

本発明に係る識別方法において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の識別用標的領域は、２８，１４４番目の塩基を含む領域であれば特に限定されるものではない。例えば、識別用標的領域は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の、２８，１４４番目の塩基を含む１０塩基以上の領域であることが好ましく、１５塩基以上の領域であることがより好ましく、２０塩基以上の領域であることがさらに好ましく、２０〜３５塩基の領域がよりさらに好ましい。

本発明に係る識別方法において、識別用標的領域は、鋳型依存的核酸増幅反応の核酸鎖伸長反応時に、Ｌ型識別用標的領域と同一の塩基配列からなるＲＮＡが、Ｌ型ゲノムＲＮＡと相補的な塩基配列からなるＲＮＡ又はＤＮＡとは結合するが、Ｓ型ゲノムＲＮＡと相補的な塩基配列からなるＲＮＡ又はＤＮＡとは結合しないように、逆に、Ｓ型識別用標的領域と同一の塩基配列からなるＲＮＡが、Ｓ型ゲノムＲＮＡと相補的な塩基配列からなるＲＮＡ又はＤＮＡとは結合するが、Ｌ型ゲノムＲＮＡと相補的な塩基配列からなるＲＮＡ又はＤＮＡとは結合しないように、設計される。当該設計は、鋳型依存的核酸増幅反応の核酸鎖伸長反応の反応温度や反応液の塩濃度、鋳型依存的核酸増幅反応の種類等を考慮して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡの塩基配列に基づいて常法により設計される。当該設計は、一般的なプロープ設計に用いられる各種のソフトウェアを用いて行うこともできる。

Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及びＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡと、それぞれの識別用標的領域においてハイブリダイズできる限り、プローブを構成するヌクレオチドは、特に限定されるものではない。当該核酸としては、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡやＤＮＡと同様にオリゴヌクレオチドを構成可能な人工核酸等が挙げられる。修飾ＲＮＡ及び修飾ＤＮＡとしては、ヌクレオチドの糖、塩基、及びリン酸塩のいずれが修飾されたものであってもよい。Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ等は、これらのヌクレオチドのうち、１種類のみからなるものであってもよく、２種類以上を組み合わせて構成されたものであってもよい。

塩基が修飾されたヌクレオチドとしては、例えば、５位修飾ウリジン又はシチジン（例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、５−メチルオキシウリジン等）；８位修飾アデノシン又はグアノシン（例えば、８−ブロモグノシン等） ； デアザヌクレオチド（例えば７−デアザ-アデノシン等）；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド（例えば、Ｎ６−メチルアデノシン等） 等が挙げられる。また、糖が修飾されたヌクレオチドとしては、例えば、リボヌクレオチドの２'−ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン原子、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、又はＣＮ（ここで、Ｒは炭素数１〜６のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を示す）等によって置換された２'位糖修飾、５'末端がモノリン酸化された５'末端リン酸化修飾が挙げられる。リン酸塩が修飾されたヌクレオチドとしては、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。

Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及びＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドプローブであることが好ましく、１本鎖ＲＮＡ（オリゴリボヌクレオチドプローブ）であることがより好ましい。Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及びＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブが、ＲＮＡとその他のヌクレオチドのキメラである場合、その他のヌクレオチドは、全塩基長の５０％以下であることが好ましく、４０％以下であることがより好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、２０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることがさらに好ましく、５％以下であることがさらに好ましい。

Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及びＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブは、その５'末端及び／又は３'末端が修飾されていてもよい。例えば、５'末端及び／又は３'末端が、デオキシ化、リン酸化、アミノ化、ビオチン化、チオール化、コレステロール化、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）化、クエンチャー（ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−３など）、蛍光色素（ＤＮＰ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、６−ＦＡＭなど）などで修飾された一本鎖核酸を用いることができる。

Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及びＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブは、識別用標的塩基配列とハイブリダイズする領域を有していればよく、当該領域以外の領域を有していてもよい。

Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及びＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブは、公知の方法で人工的に化学合成することにより作製することができる。また、これらのオリゴヌクレオチドプローブは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡを鋳型として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法により作製することができる。

本発明に係る識別方法では、被験試料から抽出されたＲＮＡを鋳型として、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又はＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、識別用標的領域を含む領域を増幅する鋳型依存的核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物に基づいて、被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が、Ｓ型ウイルスとＬ型ウイルスのいずれであるかを識別する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中、鋳型依存的核酸増幅反応において増幅する対象の領域を、増幅用標的領域という。増幅用標的領域は、識別用標的領域を含む領域であれば特に限定されるものではなく、鋳型依存的核酸増幅反応の種類や、増幅産物の検出方法等を考慮して適宜決定することができる。

本発明に係る識別方法において、鋳型依存的核酸増幅反応は、核酸合成酵素が鋳型核酸に基づいて相補鎖の合成を繰り返すことにより、目的領域の核酸鎖を増幅させる反応である。本発明において用いられる鋳型依存的核酸増幅反応は、ＤＮＡを鋳型とする反応であってもよく、ＲＮＡを鋳型とする反応であってもよい。本発明において行なわれる鋳型依存的核酸増幅反応が、ＲＮＡを鋳型とする反応の場合、被験試料から抽出されたＲＮＡを鋳型として、直接鋳型依存的核酸増幅反応を行うことができる。一方で、本発明において行なわれる鋳型依存的核酸増幅反応が、ＤＮＡを鋳型とする反応の場合、被験試料から抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型として鋳型依存的核酸増幅反応を行うことができる。逆転写反応は、逆転写酵素を用いて常法により行うことができる。

ＤＮＡを鋳型とする鋳型依存的核酸増幅反応としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法（Loop-mediated isothermal Amplification：特許文献２）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids：特許文献３）、ＬＣＲ法（Ligase Chain Reaction：非特許文献２）、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification：特許文献４）、ＴＭＡ法（Transcription Mediated Amplification：非と特許文献３）、ＭＤＡ法 (Multiple Displacement Amplification：非特許文献４)、 及びＲＰＡ（Recombinase Polymerase Amplification：非特許文献５）法からなる群より選択される１種以上を用いることができる。これらの鋳型依存的核酸増幅反応は、反応液にＬ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又はＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブを含有させる以外は、常法により行うことができる。

ＲＮＡを鋳型とする鋳型依存的核酸増幅反応としては、例えば、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification：特許文献５）、及びＴＲＣ法（Transcription-Reverse Transcription-Concerted method：非特許文献６）からなる群より選択される１種以上を用いることができる。これらの鋳型依存的核酸増幅反応は、反応液にＬ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又はＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブを含有させる以外は、常法により行うことができる。

ＤＮＡを鋳型とする鋳型依存的核酸増幅反応を行う場合、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又はＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブは、被験試料から抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応により得られたｃＤＮＡのうち、識別用標的領域と相補的な塩基配列からなる領域とハイブリダイズする。ＲＮＡを鋳型とする鋳型依存的核酸増幅反応を行う場合、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又はＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブは、被験試料から抽出されたＲＮＡのうち、識別用標的領域と相補的な塩基配列からなる領域とハイブリダイズする。

鋳型依存的核酸増幅反応において用いるプライマーは、それぞれの核酸増幅方法に応じて、適切なプライマーを用いることができる。それぞれの核酸増幅方法に適切なプライマーは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡの配列情報に基づき、公知技術を用いて設計することができ、公知の方法で製造することができる。また、鋳型依存的核酸増幅反応の反応条件は、それぞれの核酸増幅方法の原理に則った特異的増幅産物が生成される限り特に限定されず、公知技術に基づいて適宜設定することができる。

鋳型依存的核酸増幅反応において用いるプライマーは、目的のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡ中の増幅用標的領域を特異的に増幅できるように設計される。具体的には、プライマーは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡに特異的な塩基配列であり、他の生物やウイルスのゲノム等において同一又は類似の塩基配列が見られないような領域を標的として設計されることが好ましい。特に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の近縁種であるＳＡＲＳのゲノムＲＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＣ＿００４７１８．３）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡと類似しているため、本発明に係る識別方法において、鋳型依存的核酸増幅反応で使用されるプライマーとしては、ＳＡＲＳのゲノムＲＮＡとは相違する塩基配列とハイブリダイズするように設計されることが好ましい。このようなプライマーは、通常公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）を利用して、一般的にＰＣＲのプライマーを設計する際に使用されているソフトウェアを利用して設計できる。

鋳型依存的核酸増幅反応に用いる核酸合成酵素は特に限定されず、上記に例示したそれぞれの核酸増幅方法に適したＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮＡポリメラーゼを適宜選択して用いることができる。鋳型依存的核酸増幅反応にＤＮＡポリメラーゼを用いる場合、用いるＤＮＡポリメラーゼは特に限定されず、上記に例示したそれぞれの核酸増幅方法に適したＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。例えば、ｐｏｌＩ型、α型、非ｐｏｌＩ非α型、又は混合型ＤＮＡポリメラーゼ（複数のＤＮＡポリメラーゼの混合物）などを挙げることができる。なかでも、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。α型ＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’エクソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼである。α型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製） などが市販されており、これらを好適に用いることができる。α型ＤＮＡポリメラーゼを用いる鋳型依存的核酸増幅反応としては、ＰＣＲが好ましい。

核酸増幅反応の反応液は、目的の反応が進行する組成の反応液であれば特に限定されないが、通常、鋳型核酸、プライマー（プライマーセット）、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ）、核酸合成酵素の基質となるヌクレオチドが含まれる。これら以外に、反応液には、緩衝剤、塩類等が添加され、必要に応じて、酵素の保護剤、Ｔｍ値の調整剤、界面活性剤等が添加される。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用する核酸合成酵素に応じて至適pH付近に調整される。塩類は、酵素の活性維持や核酸のＴｍ値調整のために適宜添加され、具体的には、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、（ＮＨ_４）_２ ＳＯ_４等が用いられる。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が使用される。さらに、Ｔｍ値の調整剤には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルグリシン）等が使用される。界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ等が使用される。反応液の具体的な組成は、公知技術に基づいて適宜設定することができる。反応液の具体的な組成は、実際に使用する鋳型、プライマー、核酸合成酵素、一本鎖核酸の具体的な組み合わせに応じて予備検討を行い、適宜設定することが好ましい。

鋳型依存的核酸増幅反応の反応液へのＬ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又はＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの添加量は、Ｌ型とＳ型の一塩基の差異を認識して、鋳型核酸にハイブリダイズすることによって増幅反応を阻害する効果が奏される量であれば、特に限定されるものではなく、使用する鋳型依存的核酸増幅反応における具体的条件ごとに予備検討を行い、適宜設定することができる。具体的には、例えば、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又はＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの鋳型依存的核酸増幅反応の開始時点における反応液の濃度が、１０μＭ以下が好ましく、２μＭ以下がより好ましい。当該濃度の下限は特に限定されないが、１０ｎＭ以上が好ましく、５０ｎＭ以上がより好ましく、１００ｎＭ以上がさらに好ましく、５００ｎＭ以上がよりさらに好ましい。

鋳型依存的核酸増幅反応により得られた増幅産物は、ＰＣＲ等の核酸増幅反応の増幅産物の検出に一般的に使用されている各種の方法により検出することができる。当該検出方法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動で分画したバンドをエチジウムブロマイド等により染色する方法、インターカレーター法、融解曲線分析法、ＴａｑＭａｎプローブ等を用いた蛍光検出法が挙げられる。インターカレンター法は、サイバーグリーン等の蛍光性インターカレーターが、生成された二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発することを利用した方法であり、増幅産物の増加とともに蛍光強度が増大する。反応溶液に励起光を照射して蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量をモニタリングすることができる。また、標識物質で修飾したプライマーを用いた場合には、当該標識物質を指標として検出することができる。蛍光物質で標識されたプライマーを使用した場合には、カラムクロマトグラフィー等により核酸増幅反応後の反応液から未反応のプライマーを除いた後、蛍光強度を測定することにより、増幅産物を検出できる。ＴａｑＭａｎプローブ等を用いた蛍光検出法は、蛍光物質（プローブの５'側）とクエンチャー（プローブの３'側）で修飾されたオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応液に加えることにより、プローブ標的領域の核酸増幅に応じて、ＰＣＲに使われるＤＮＡポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性によってプローブが切断され、蛍光物質とクエンチャーが乖離する結果、反応系に生じる蛍光を検出できる。

本発明に係る識別方法においては、型依存的核酸増幅反応により得られた増幅産物に基づいて、被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が、Ｓ型ウイルスとＬ型ウイルスのいずれであるかを識別する。Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下で鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物が得られ、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での鋳型依存的核酸増幅反応では増幅産物が確認できなかった場合には、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブによって増幅阻害が生じていることから、被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２はＳ型ウイルスであると識別できる。逆に、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下では鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物が得られ、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での鋳型依存的核酸増幅反応では増幅産物が確認できなかった場合には、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブによって増幅阻害が生じていることから、被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２はＬ型ウイルスであると識別できる。

Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブによる増幅阻害効果が弱い場合には、被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２がＳ型ウイルスであった場合でも、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下で鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物が得られるだけではなく、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下でも鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物が検出される場合がある。Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブによる増幅阻害効果が弱い場合も同様である。Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブを含有させた反応液と、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブを含有させた反応液の両方で増幅産物が得られた場合には、両反応の増幅産物量を比較する。

Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下で鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量が、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下で鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量よりも多い場合には、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブによって増幅阻害が生じていることから、被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２はＳ型ウイルスであると識別できる。例えば、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での相対増幅産物量を１とした場合の、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での相対増幅産物量が、好ましくは１．２５倍以上である場合、より好ましくは１．５倍以上である場合、さらに好ましくは１．７５倍以上である場合、よりさらに好ましくは２倍以上である場合に、被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２はＳ型ウイルスであると識別できる。

逆に、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下で鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量が、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下で鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量よりも多い場合には、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブによって増幅阻害が生じていることから、被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２はＬ型ウイルスであると識別できる。例えば、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での相対増幅産物量を１とした場合の、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での相対増幅産物量が、好ましくは１．２５倍以上である場合、より好ましくは１．５倍以上である場合、さらに好ましくは１．７５倍以上である場合、よりさらに好ましくは２倍以上である場合に、被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２はＬ型ウイルスであると識別できる。

本発明に係る識別方法における鋳型依存的核酸増幅反応としては、汎用されており、増幅産物の検出も比較的簡単であることから、ＰＣＲ法であることが好ましい。ＰＣＲ法は、一般的には、変性ステップ、アニーリングステップ及び伸長ステップからなるサイクルを繰り返すことで増幅産物を得る。アニーリング温度は、使用するポリメラーゼの至適温度や識別用標的領域のＴｍ値を考慮して設定することが好ましい。Ｔｍ値は、最近接塩基対法、ＧＣ％法等の公知の計算方法に基づいて算出することができる。例えば、以下の計算式で算出することができる。なお、式中、ａ、ｕ、ｇ、ｃは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃそれぞれの塩基の数を示す。

Ｔｍ（℃）＝ （ａ＋ｕ）×２＋（ｇ＋ｃ）×４

アニーリング温度は、例えば上記計算式で算出される識別用標的領域のＴｍ値に対して、［Ｔｍ値−２５℃］〜［Ｔｍ値℃］の範囲内であることが好ましく、［Ｔｍ値−２０℃］〜［Ｔｍ値−５℃］の範囲内であることがより好ましい。

本発明に係る識別方法において、鋳型依存的核酸増幅反応としてＰＣＲを行う場合、一般的な３ステップ法（変性→アニーリング→伸長のサイクル）で行ってもよいが、アニーリングステップと伸長ステップを同じ温度で行う２ステップ法（変性→アニーリング／伸長のサイクル）で行うことが好ましい。アニーリング温度では、鋳型核酸中の識別用標的領域と相補的な領域とハイブリダイズするが、伸長温度では当該領域とハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドプローブを用いた場合、当該オリゴヌクレオチドプローブによる伸長反応の阻害が不十分となり、偽陽性が生じる場合がある。２ステップ法を行うことにより、この様な偽陽性の問題を回避できる。

例えば、表１に記載のＯＲＮ＿Ｌ又はＯＲＮ＿Ｓを添加し、被験試料から抽出されたＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型として、２ステップＰＣＲを行う場合には、ＯＲＮ＿Ｌ及びＯＲＮ＿ＳのＴｍ値と使用するポリメラーゼの至適温度から、アニーリングステップと伸長ステップの温度は、５０〜７５℃が好ましく、５０〜６０℃がより好ましく、５４〜５６℃がさらに好ましい。また、核酸伸長反応が比較的安定であること、かつ増幅産物の検出も比較的容易である点から、増幅産物の大きさ（塩基長）が、５０〜１０００、好ましくは１００〜８００、より好ましくは１８０〜７００となるように、フォワードプライマーとリバースプライマーは設計されることが好ましい。

より具体的には、アニーリングステップと伸長ステップを５０〜６０℃で行う場合、２ステップＰＣＲで使用するプライマーは、表２に記載のセットを用いることが好ましい。表中の増幅産物は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡから得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合に得られる増幅産物の長さである。

本発明に係る識別方法において、鋳型依存的核酸増幅反応としてＰＣＲを行う場合、定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等） を行ってもよい。これらの定量的ＰＣＲを行う場合には、反応終了時点には、増幅産物の相対量が得られる。

本発明及び本願明細書において、「被験試料」とは、核酸が含まれている試料であって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の存在の有無やその型の識別に供試されるものである。本発明に係る識別方法に供される被験試料としては、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が存在している可能性があるものであれば、特に限定されるものではなく、動物の組織や細胞の抽出液（ライセート）、培養細胞の細胞抽出液、土壌等の自然界から採取された試料やその粗精製物等を用いることができる。中でも、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の感染が疑われる動物から採取された試料であることが好ましい。

被験試料が動物から採取された試料である場合、動物としては、ヒトであってもよく、家畜、養殖魚、愛玩動物、実験動物のようにヒトに飼育されている動物であってもよく、野生動物であってもよい。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ロバ、ヒツジ、サル、クジラ等の哺乳類；ニワトリ、インコ、ハト、カラス、カモ、ハクチョウ、インコ、カナリア、オウム、カモメ、ツバメ等の鳥類；ヘビ、ワニ、トカゲ等の爬虫類；カエル、イモリ、サンショウウオ等の両生類；ゼブラフィッシュ、メダカ、フナ、キンギョ、コイ、マグロ、ハマチ、タイ、イワシ等の魚類；エビ、カニ等の甲殻類等が挙げられる。サルとしては、具体的には、チンパンジー、オランウータン、ニホンザル、ゴリラ、ボノボ、テナガザル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセットメガネザル、クモザル、オマキザル等の非ヒト霊長類が挙げられる。

被験試料が動物から採取された試料である場合、当該被検試料は、血液、血清、血漿、リンパ液、鼻咽頭ぬぐい液、唾液、涙液、喀痰、腹腔液、骨髄液、尿等が挙げられる。これらの試料の動物からの採取は、常法により行うことができる。被験試料からのＲＮＡの抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。また、市販のＲＮＡ抽出用キットを用いることもできる。

＜コロナウイルス識別用キット＞
本発明に係る識別方法に用いられる試薬等をキット化することにより、当該方法をより簡便に行うことができる。本発明に係る識別方法のうち、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及びＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブを有する含むことが好ましい。中でも、ＯＲＮ＿Ｌのように、配列番号１で表される塩基配列を含むＬ型結合性オリゴヌクレオチドプローブと、ＯＲＮ＿Ｓのように、配列番号２で表される塩基配列を含むＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブを含むキットがより好ましい。

当該キットには、核酸増幅反応に用いるプライマーを更に含むことが好ましい。キットが有するプライマーとしては、表に記載の物が挙げられる。当該キットには、さらに、逆転写反応や核酸増幅反応に使用する、逆転写酵素、ポリメラーゼ、反応液を調製するための濃縮バッファー、ｄＮＴＰ等を含ませることもできる。

当該キットには、核酸増幅反応のコントロールとなる、人工的に設計されたＤＮＡやＲＮＡを鋳型として含ませることもできる。これらの鋳型として用いられる人工核酸は、被験試料から抽出されたＲＮＡ又はそのｃＤＮＡに混合した内部コントロールとしても使用できるように、当該人工核酸を鋳型として得られる増幅産物の塩基長が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡを鋳型とした場合に得られる増幅産物の塩基長と異なるように設計されていることが好ましい。

例えば、表２のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ１プライマーとＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーのセット、又はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ２プライマーとＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーのセットを用い、表１に記載のＯＲＮ＿Ｌ又はＯＲＮ＿Ｓをオリゴヌクレオチドプローブとして用いて２ステップＰＣＲを行う場合には、Ｌ型用の人工合成ＤＮＡ（配列番号７）とＳ型用の人工合成ＤＮＡ（配列番号８）を、鋳型コントロールとしてキットに含ませることができる。これらの人工合成ＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物の大きさは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡを鋳型とした場合とは異なる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ１プライマーとＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーのセットを用いた場合、人工合成ＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物は３００ｂｐであり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ２プライマーとＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーのセットを用いた場合、人工合成ＤＮＡを鋳型とした場合の増幅産物は２５０ｂｐである。

本発明に係るコロナウイルス識別用キットには、さらに、当該キットを用いて本発明に係る識別方法を行うためのプロトコールが記載された書面を含むことも好ましい。当該プロトコールは、当該キットを収容した容器の表面に記載されていてもよい。

次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。

［実施例１］
ＯＲＮｉ−ＰＣＲ法を利用してＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型を識別するために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡの塩基配列情報を検討し、識別用標的領域を設計した。ＰＣＲは、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いる２ステップＰＣＲを行った。

＜識別用標的領域の設計とＬ型／Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの合成＞
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、Ｔｍ値が５５〜７５℃程度となり、１塩基のみのミスマッチの識別が可能となるよう、２８，１４４番目の塩基が領域の末端付近、例えば、両末端から５塩基以内になるように、識別用標的領域を設計した。この結果、図２の四角で囲われた領域（Ｌ型のＴｍ値：７４℃、Ｓ型のＴｍ値：７６℃）を、識別用標的領域として決定した。

設計された識別用標的領域の塩基配列と同一の塩基配列からなるＲＮＡ（リボオリゴヌクレオチド）を、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及びＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブとした（表１）。両者は、塩基配列に基づいて、化学合成されたもの（ＦＡＳＭＡＣ社製）を用いた。

＜プライマーの設計と合成＞
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、増幅産物の大きさが１５０〜８００ｂｐ、伸長反応時の温度が５５℃でプライマーとして機能し得るフォワードプライマーとリバースプライマーを設計した。この際、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の近縁種である他のコロナウイルスのゲノムＲＮＡの非特異的な増幅が抑制されるように、これらのコロナウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列との相同性が低い領域を選択してプライマーを設計した。検討した７種のコロナウイルスのゲノムＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は以下の通りである：ＨＣｏＶ−２２９Ｅ（ＮＣ＿００２６４５．１）、ＨＫＵ１（ＮＣ＿００６５７７．２）、ＮＬ６３（ＮＣ＿００５８３１．２）、ＯＣ４３（ＮＣ＿００６２１３．１）、ＭＡＲＳ（ＮＣ＿０１９８４３．３）、ＳＡＲＳ（ＮＣ＿００４７１８．３）、及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２（ＮＣ＿０４５５１２．２）。

７種のコロナウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列を比較したところ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の２８，１４４番目の塩基付近の領域は、ＳＡＲＳとＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２では比較的保存されていたものの、その他のコロナウイルスでは保存されていなかった。そこで、ＳＡＲＳとＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡを比較したところ、両者の相同性が低い領域を選択して、表２に記載のフォワードプライマー３種とリバースプライマー１種を設計した。各プライマーがハイブリダイズする領域付近について、ＳＡＲＳとＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡのアラインメント図を図３に示す。図３（Ａ）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ１プライマー付近であり、図３（Ｂ）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ２プライマー付近であり、図３（Ｃ）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ３プライマー付近であり、図３（Ｄ）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマー付近である。図中、四角で囲われた領域が、各プライマーが設計された領域である。各プライマーは、塩基配列に基づいて、化学合成されたもの（ユーロフィンジェノミクス社製）を用いた。

＜ＯＲＮｉ−ＰＣＲ＞
ＯＲＮ＿Ｌ、ＯＲＮ＿Ｓ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ１プライマー、及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーを用いてＯＲＮｉ−ＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づいてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型を識別できるか調べた。表３に記載のＬ型鋳型用人工ＤＮＡ又はＳ型鋳型用人工ＤＮＡに対して、ＣＵＧＡ ７ｇＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行い、得られたＲＮＡを鋳型として逆転写酵素（ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ、ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型（Ｌ型鋳型用ＤＮＡ、Ｓ型鋳型用ＤＮＡ）として用いた。

０．００４ｐｇのＬ型鋳型用ＤＮＡ又はＳ型鋳型用ＤＮＡ、０．３μＭのＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ１プライマー及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマー、並びに１μＭのＯＲＮ＿Ｌ又はＯＲＮ＿Ｓ、並びにポリメラーゼを含む反応用濃縮液（ＴＯＹＯＢＯ社製）を混合して、１０μＬの反応液を調製した。各反応液に対してＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃、２分間の変性ステップ、次いで、９８℃、１０秒間、５５℃、５０秒間を１サイクルとし、これを２８サイクル行うアニーリング／変性ステップ、からなる温度条件で行った。得られた増幅産物は、２％のアガロースゲルを用いて電気泳動し、分離したバンドをエチジウムブロマイド染色した。

アガロース電気泳動して分離したバンドの染色像を図４に示す。図４（Ａ）はＯＲＮ＿Ｌ存在下でのＰＣＲの増幅産物の結果であり、図４（Ｂ）はＯＲＮ＿Ｓ存在下でのＰＣＲの増幅産物の結果である。ＯＲＮ＿ＬとＯＲＮ＿Ｓのいずれも含まない反応液では、Ｌ型鋳型用ＤＮＡとＳ型鋳型用ＤＮＡのいずれであっても、目的の大きさ（３００ｂｐ）の増幅産物のバンドが確認された。一方で、ＯＲＮ＿Ｌを含む反応液では、Ｓ型鋳型用ＤＮＡを鋳型とした場合には増幅産物のバンドが確認されたが、Ｌ型鋳型用ＤＮＡを鋳型とした場合には増幅産物のバンドは確認されなかった（図４（Ａ））。ＯＲＮ＿Ｓを含む反応液では、Ｌ型鋳型用ＤＮＡを鋳型とした場合には増幅産物のバンドが確認されたが、Ｓ型鋳型用ＤＮＡを鋳型とした場合には増幅産物のバンドは確認されなかった（図４（Ｂ））。これらの結果から、本実験で使用したプライマーセットとＯＲＮ＿Ｌ及びＯＲＮ＿Ｓを用いることにより、増幅産物の有無によってＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型を識別できることが確認された。

［実施例２］
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ１プライマーに代えて、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ２プライマーを用いた以外は、実施例１と同様にして、ＯＲＮｉ−ＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づいてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型を識別できるか調べた。

アガロース電気泳動して分離したバンドの染色像を図５に示す。図５（Ａ）はＯＲＮ＿Ｌ存在下でのＰＣＲの増幅産物の結果であり、図５（Ｂ）はＯＲＮ＿Ｓ存在下でのＰＣＲの増幅産物の結果である。ＯＲＮ＿ＬとＯＲＮ＿Ｓのいずれも含まない反応液では、Ｌ型鋳型用ＤＮＡとＳ型鋳型用ＤＮＡのいずれであっても、目的の大きさ（２５０ｂｐ）の増幅産物のバンドが確認された。一方で、ＯＲＮ＿Ｌを含む反応液では、Ｓ型鋳型用ＤＮＡを鋳型とした場合には、ＯＲＮ＿Ｌを含まない反応液と同程度の染色強度の増幅産物のバンドが確認されたが、Ｌ型鋳型用ＤＮＡを鋳型とした場合には、ＯＲＮ＿Ｌを含まない反応液よりもかなり染色強度の弱いバンドしか確認されなかった（図５（Ａ））。一方で、ＯＲＮ＿Ｓを含む反応液では、Ｌ型鋳型用ＤＮＡを鋳型とした場合には増幅産物のバンドが確認されたが、Ｓ型鋳型用ＤＮＡを鋳型とした場合には増幅産物のバンドは確認されなかった（図５（Ｂ））。これらの結果から、実施例１と同様に、本実験で使用したプライマーセットとＯＲＮ＿Ｌ及びＯＲＮ＿Ｓを用いることにより、増幅産物の有無によってＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型を識別できることが確認された。

［実施例３］
Ｌ型のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡの全長を鋳型とし、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ１プライマー及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーのセット、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ２プライマー及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーのセット、又はＳＡＲＳ−ＣｏＶ−３＿Ｆ１プライマー及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーのセットを用いた以外は、実施例１と同様にして、ＯＲＮｉ−ＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づいてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型を識別できるか調べた。

Ｌ型のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を鋳型として、逆転写酵素（ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ、ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。逆転写反応は、逆転写酵素の製造元が推奨するプロトコールに従って行った。

得られたｃＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様にしてＯＲＮｉ−ＰＣＲを行い、得られた増幅産物を電気泳動し、分離したバンドをエチジウムブロマイド染色した。アガロース電気泳動して分離したバンドの染色像を図６に示す。図６（Ａ）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ１プライマー及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーのセットを用いた反応液の増幅産物の結果、図６（Ｂ）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｆ２プライマー及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーのセットを用いた反応液の増幅産物の結果、図６（Ｃ）は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−３＿Ｆ１プライマー及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２＿Ｒプライマーのセットを用いた反応液の増幅産物の結果である。

いずれのプライマーセットを用いた場合でも、ＯＲＮ＿Ｓを含む反応液では、ＯＲＮ＿ＬとＯＲＮ＿Ｓのいずれも含まない反応液と同程度の染色強度の増幅産物のバンドが確認されたが、ＯＲＮ＿Ｌを含む反応液では、ＯＲＮ＿Ｌを含まない反応液よりもかなり染色強度の弱いバンドしか確認されなかった（図６（Ａ）〜（Ｃ））。これらの結果から、Ｌ型のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡに由来するｃＤＮＡを鋳型とした場合には、ＯＲＮ＿Ｓは特に増幅阻害を生じさせないが、ＯＲＮ＿Ｌによって増幅阻害が生じることから、得られた増幅産物に基づいてＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＬ型とＳ型を識別できることが明らかである。

１…ＯＲＮ＿Ｌ、２…ＯＲＮ＿Ｓ、３ｃ、３ｇ、３ｔ、３ａ…ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡから得られたｃＤＮＡ、４…プライマー。

Claims (16)

1. コロナウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡのうち、２８，１４４番目の塩基がウラシルであるＬ型ウイルスと、２８，１４４番目の塩基がシトシンであるＳ型ウイルスとを識別する方法であって、
   ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の２８，１４４番目の塩基を含む領域を、識別用標的領域とし、
   ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡ中の前記識別用標的領域を包含する領域を、増幅用標的領域とし、
   Ｌ型ウイルスの前記識別用標的領域におけるプラス鎖ゲノムＲＮＡ、又は前記識別用標的領域における相補鎖ゲノムＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡにハイブリダイズ可能な１本鎖核酸を、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブとし、
   Ｓ型ウイルスの前記識別用標的領域におけるプラス鎖ゲノムＲＮＡ、又は前記識別用標的領域における相補鎖ゲノムＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡにハイブリダイズ可能な１本鎖核酸を、Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブとし、
   被験試料から抽出されたＲＮＡ又は当該ＲＮＡから逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型として、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又はＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下で、前記増幅用標的領域を増幅する鋳型依存的核酸増幅反応を行い、前記増幅反応の増幅産物に基づいて、前記被験試料に含まれているＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２が、Ｓ型ウイルスとＬ型ウイルスのいずれであるかを識別する、
   コロナウイルスのサブタイプの識別方法。
2. 前記Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での前記鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量が、前記Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での前記鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量よりも多い場合に、前記被験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２はＳ型ウイルスであり、
   前記Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での前記鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量が、前記Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの存在下での前記鋳型依存的核酸増幅反応の増幅産物量よりも多い場合に、前記被験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２はＬ型ウイルスである、と識別する、請求項１に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
3. 前記識別用標的領域が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のゲノムＲＮＡのうち、２８，１２２番目〜２８，１４７番目の領域である、請求項１又は２に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
4. 前記Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及び前記Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブが、ＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドプローブである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
5. 前記被験試料から抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型として鋳型依存的核酸増幅反応を行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
6. 前記鋳型依存的核酸増幅反応が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、ＭＤＡ法、及びＲＰＡ法からなる群より選択される一種以上である、請求項５に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
7. 前記鋳型依存的核酸増幅反応が、ＰＣＲ法である、請求項６に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
8. ＰＣＲ法が、変性ステップ、アニーリングステップ及び伸長ステップからなり、前記アニーリングステップ及び前記伸長ステップが、同じ温度で実施される、請求項７に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
9. 前記アニーリングステップ及び前記伸長ステップの温度が、５４〜５６℃である、請求項８に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
10. 前記ＰＣＲ法を、配列番号３〜５のいずれかで表される塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号６で表される塩基配列を有するリバースプライマーとを用いて行う、請求項７〜９のいずれか一項に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
11. 前記増幅用標的領域の長さが、１８０〜７００塩基長である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
12. 前記鋳型依存的核酸増幅反応が、ＮＡＳＢＡ法及びＴＲＣ法からなる群より選択される一種以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
13. 前記鋳型依存的核酸増幅反応の開始時点における、前記Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ又は前記Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブの濃度が、１０ｎＭ〜１０μＭである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法。
14. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のコロナウイルスのサブタイプの識別方法に用いられる、Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブ及びＳ型結合性オリゴヌクレオチドプローブを含有し、
    前記Ｌ型結合性オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１で表される塩基配列を含み、
    前記Ｓ型結合性オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２で表される塩基配列を含む、
    コロナウイルス識別用キット。
15. さらに、配列番号３〜５のいずれかで表される塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号６で表される塩基配列を有するリバースプライマーとを含有する、請求項１４に記載のコロナウイルス識別用キット。
16. さらに、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡと、配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡと、を含有する、請求項１４又は１５に記載のコロナウイルス識別用キット。

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