JP6804462B2 - 指数関数の底が2より大きい核酸増幅 - Google Patents
指数関数の底が2より大きい核酸増幅 Download PDFInfo
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Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2014年12月15日に出願した米国仮出願第62/092102号の優先権を主張するものである。
適用なし。
第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含む第一の外側プライマー;並びに
a'に隣接する、及びa'の5'側にある、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含む第一の内側プライマー
を含み、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに
第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではなく、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列c
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、核酸プライマーセット。
(a)試料を、
(i)第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含む第一の外側プライマー;並びに
a'に隣接する、及びa'の5'側にある第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含む第一の内側プライマー
を含み、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに
第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある、第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではない、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列c
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマー;並びに
(ii)第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマー
と接触させる工程であって、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で接触が行われる、接触させる工程;並びに
(b)5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して、鎖置換が生じる条件下で、存在する場合、標的核酸を増幅して、鋳型配列a'から第二のプライマーの結合部位へと伸長する配列を含むアンプリコンを産生する工程
を含む、方法。
第二の鋳型鎖配列e'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列eを含む第二の外側プライマー;並びに
第二の鋳型鎖配列f'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列fを含み、f'がe'に隣接する、及びe'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列fがその5'端で、
一本鎖プライマー配列fに隣接する、及び一本鎖プライマー配列fの5'側にあるプライマー配列e;並びに
第二の鎖鋳型配列e'に隣接する、及び第二の鎖鋳型配列e'の3'側にあり、第二の鎖鋳型配列h'に相補的ではない、プライマー配列eに隣接する、及びプライマー配列eの5'側にあるクランプ配列g
を含む二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する第二の内側プライマー
を含む、実施形態1、2、5、若しくは6に記載のプライマーセット、又は実施形態3から8に記載の方法。
第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列dを含む第一の外側プライマー;
第一の中間プライマーであって、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含み、a'がd'に隣接する、及びd'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列aがその5'端で、
一本鎖プライマー配列aに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
第一の鎖鋳型配列d'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列d'の3'側にある第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではなく、プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあるクランプ配列c1
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、中間プライマー;並びに、
第一の内側プライマーであって、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'がa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列a;
プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあり、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、内側プライマーを含む、核酸プライマーセット。
(a)試料を、
(i)第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列dを含む第一の外側プライマー;
第一の中間プライマーであって、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含み、a'がd'に隣接する、及びd'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列aがその5'端で、
一本鎖プライマー配列aに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
第一の鎖鋳型配列d'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列d'の3'側にある第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではなく、プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあるクランプ配列c1
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、中間プライマー;並びに、
第一の内側プライマーであって、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'がa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;
プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にある、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、内側プライマー
を含む、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマー、並びに
(ii)第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマー
と接触させる工程であって、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で接触が行われる、接触させる工程並びに
(b)5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して、鎖置換が生じる条件下で、存在する場合、標的核酸を増幅して、鋳型配列a'から第二のプライマーの結合部位へと伸長する配列を含むアンプリコンを産生する工程
を含む、方法。
第二の鋳型鎖配列h'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列hを含む第二の外側プライマー;
第二の鋳型鎖配列e'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列eを含み、e'がh'に隣接する、及びh'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列eがその5'端で、
一本鎖プライマー配列eに隣接する、及び一本鎖プライマー配列eの5'側にあるプライマー配列h;並びに
第二の鎖鋳型配列h'に隣接する、及び第二の鎖鋳型配列h'の3'側にある第二の鎖鋳型配列j'に相補的ではない、プライマー配列hに隣接する及びプライマー配列hの5'側にあるクランプ配列g1
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、第二の中間プライマー;並びに、
第一の鋳型鎖配列f'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列fを含み、f'がe'に隣接する及びe'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列fがその5'端で、
一本鎖プライマー配列fに隣接する、及び一本鎖プライマー配列fの5'側にあるプライマー配列e;
プライマー配列eに隣接する、及びプライマー配列eの5'側にあるプライマー配列h;並びに
プライマー配列hに隣接する、及びプライマー配列hの5'側にあり、クランプ配列c2が第一の鎖鋳型配列j'に相補的ではないクランプ配列g2
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する第二の内側プライマーを含む、実施形態18から26に記載のプライマーセット又は方法。
請求項及び明細書に使用する用語は、別段の指定がない限り以下に記載するように定義する。
t of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification、1995 (ワールドワイドウェブで入手可能:promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-); LCR Kit Instruction Manual、Cat. #200520、Rev. #050002、Stratagene社、2002; Barany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188〜93頁(1991); Bi及びSambrook、Nucl. Acids Res. 25:2924〜2951頁(1997); Zirviら、Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999); Deanら、Proc Natl Acad Sci USA 99:5261〜66頁(2002); Barany及びGelfand、Gene 109:1〜11頁(1991); Walkerら、Nucl. Acid Res. 20:1691〜96頁(1992); Polstraら、BMC Inf. Dis. 2:18- (2002); Lageら、Genome Res. 2003 Feb.;13(2):294〜307頁、並びにLandegrenら、Science 241:1077〜80頁(1988)、Demidov, V.、Expert Rev Mol Diagn. 2002 Nov.;2(6):542〜8頁、Cookら、J Microbiol Methods. 2003 May;53(2):165〜74頁、Schweitzerら、Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb.;12(1):21〜7頁、米国特許第5,830,711号、米国特許第6,027,889号、米国特許第5,686,243号、PCT出願WO0056927A3号、及びPCT出願WO9803673A1号において見出すことができる。
米国特許第8,252,558号及びHarrisら、BioTechniques 54:93〜97頁(2013年2月)は、「ポリメラーゼ連鎖置換反応」(PCDR)と名付けられたネステッドPCRの形態を教示する(両文書は、この記載に関して本明細書に参照により組み込まれる)。PCDRでは、外側プライマーから伸長が生じる場合、反応が鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いるため、内側プライマーから産生された伸長鎖を置換する。理論的に、これは各増幅サイクルにつき増幅産物の2倍より多い増加、及びしたがって従来のPCRを超える上昇した感受性及びスピードを可能にする。実際に、ネステッドプライマーから作製したすべてのアンプリコンは、外側プライマーのプライマーアニーリング部位をもはや含有しない。したがって、PCDRは、非常に多くのサイクルの各増幅サイクルにつき、増幅産物の2倍より多い増加を維持することができない。このため、PCDRは、標的核酸を検出するために必要な増幅サイクル数(例えば、約23〜約20)において、中程度の減少のみを提供する。対照的に、以下のTable 1(表1)は、継続的に1サイクルにつき4倍(4サイクル数)が、1サイクルにつき2倍する場合と同じ増幅量を得るのに必要なサイクル数を示す。サイクルにつき継続的な6倍の複製は、15サイクルで達成すると予想され、これは通常のPCRでは40サイクルを要すると予想される。
核酸を含有する試料は、生物源から得ることができ、当技術分野で公知の従来の方法を使用して調製できる。特に、本明細書に記載の方法で有用な核は、単細胞生物及び植物又は非ヒト動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、霊長類、及び他の非ヒト哺乳動物並びにヒト等の高等生物を含む、任意の供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、試料は、病原体に感染したことが疑われる、又は病原体に感染したことが公知の個体、がん等の疾患を有することが疑われる又は疾患を有することが公知の個体、又は妊娠中の個体から得ることができる。
核酸増幅によって検出できる任意の標的核酸は、本明細書に記載の方法を使用して検出することができる。典型的な実施形態では、少なくともいくつかのヌクレオチド配列情報が標的核酸として公知である。例えば、用いられる増幅反応がPCRである場合、十分な配列情報が通常、所与の標的核酸の各端について入手可能であり、好適な増幅プライマーの設計を可能にする。
核酸増幅に好適なプライマーは、好適な核酸ポリメラーゼの存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分長い。プライマーの正確な長さ及び組成は、例えば、アニーリング反応の温度、プライマーの供給源及び組成、並びにプローブが用いられる場合、プライマーアニーリング部位へのプローブアニーリング部位の近接、並びにプライマー:プローブ濃度の比を含む、多くの因子に依存する。例えば、標的核酸配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、約10〜約60の範囲でヌクレオチドを含有するが、より多い又はより少ないヌクレオチドを含有し得る。プライマーは、それらのそれぞれの鎖に選択的にアニールし、安定な二重鎖を形成するのに十分相補的であるべきである。
図2は、2つのプライマーセットが、標的ヌクレオチド配列の一端の第一の鋳型鎖にどのようにアニールするかを示す。議論しやすくするため、このプライマーセットは「フォワード」プライマーセットであると考えることができる。外側プライマーは、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズする配列aを含む。図3は、2つのプライマーセットが、標的ヌクレオチド配列の反対の端の第二の鋳型鎖にどのようにアニールするかを示す。議論しやすくするため、このプライマーセットは「リバース」プライマーセットであると考えることができる。ここで、外側プライマーは、第一の鋳型鎖配列e'に特異的にハイブリダイズする配列eを含む。図4及び図5は、例示的な「フォワード」及び「リバース」の3つのプライマーセットを示す。図4では、フォワード外側プライマーは、第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズする配列dを含む。図5では、フォワード外側プライマーは、第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズする配列dを含む。一般に、好適な外側プライマーの設計の検討は、従来のネステッドPCRで使用するための外側プライマーの設計と異ならない。特に、いくつかの実施形態では、別のプライマー配列(例えば内側又は中間プライマー配列)と比較して「外側」である任意のプライマー配列のTmは、好ましくは、内側(又は中間)プライマー配列のTmより低い。したがって、例えば、PCRの下降温度ランプ中、内側プライマーは、外側プライマーの前にアニール及び伸長を開始することができ;そうでなければ、外側プライマーの早期伸長が内側プライマーの標的部位をブロックし、そのアニーリングを妨げる。より具体的には、図2に示す実施形態では、プライマー配列aはプライマー配列bのTmより低いTmを有する。同様に、図3に示す実施形態では、プライマー配列eは、プライマー配列fより低いTmを有する。いくつかの実施形態では、Tmの差は少なくとも約4℃であり、一般に約4〜約20℃の範囲である。いくつかの実施形態では、Tmの差は約4〜約15℃の範囲である。しかし、外側プライマーのTmは通常、効率的なPCRを維持するために十分高く、例えば、いくつかの実施形態では、外側プライマーのTmは少なくとも40℃である。Tmは、配列の長さ、GC含量を調節することによって、及び/又は配列中に安定化若しく
は不安定化塩基を含むことによって調節できる。
図2を参照して、フォワードの2つのプライマーセットの内側プライマーは、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'はa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、並びに一本鎖プライマー配列bはその5'端で、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する。この第一の鎖は:一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではない、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列cを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖形態(すなわち、c-a/c'-a')の結合した配列c-a(ハイフンは、この文脈において配列c及びaで構成される結合した核酸配列を示すために使用される)のTmは、二本鎖形態(すなわち、a-b/a'-b')の結合した配列a-bのTmより高い。これは、例えば、結合した配列c-aを結合した配列a-bよりも長く及び/若しくはよりGCリッチにすることにより、並びに/又は結合した配列c-aを結合した配列a-bよりも多くの安定化塩基を含むように設計することにより、容易に達成される(「より多く」の必要条件は、配列a-bがG-C塩基対及び/又は安定化塩基を含有しない状況を含む)。代わりに、又は更に、結合した配列a-bは、結合した配列c-aよりも多くの不安定化塩基を含むように設計することができる(「より多く」の必要条件は、配列c-aが不安定化塩基を含有しない状況を含む)。いくつかの実施形態では、a'-c'はその3'端で伸長をブロックされる。
いくつかの実施形態では、増幅の各サイクルで産生されるコピー数を更に増加するために、第三のプライマーが標的核酸配列の1端又は両端に用いられ得る。図4及び図5は、例示的な「フォワード」及び「リバース」の3つのプライマーセットを示す。3つのプライマーセットは、上述のように外側プライマー及び上述の内側プライマーと構造が基本的に同じ中間プライマーを含む。更なるプライマーは、中間プライマーの鋳型鎖5'にハイブリダイズするように設計された内側プライマーである。
本開示の方法は、増幅のためポリメラーゼを使用する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは5'から3'のエクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼである。ポリメラーゼは、第一のプライマーから伸長する鎖が第一のプライマーに関して「外側」である第二のプライマーから伸長する鎖を形成する重合によって置換され得るような条件下で使用される。好都合には、ポリメラーゼは、鋳型鎖に相補的な鎖を置換することができ、「鎖置換」と呼ばれる特性である。鎖置換は、鋳型分子につき標的配列の複数コピーの合成をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示の方法における使用のためのDNAポリメラーゼは、非常に加工性である。例示的なDNAポリメラーゼは、5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するTaq DNAポリメラーゼの変異体、例えば、Taq DNAポリメラーゼ(ABI社)のStoffel断片、SDポリメラーゼ(Bioron社)、USPN 5474920に記載の5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損する変異体Taq、Bcaポリメラーゼ(Takara社)、Pfx50ポリメラーゼ(Invitrogen社)、Tfu DNAポリメラーゼ(Qbiogene社)を含む。熱サイクリングが行われる場合(PCRのように)、DNAポリメラーゼは好ましくは熱安定性DNAポリメラーゼである。以下のTable 2(表2)は、5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を有さないが、熱安定性を伴う鎖置換活性を有するNew England Biolabs社から入手可能なポリメラーゼを列挙する。
上記のプライマーセットは、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で、試料核酸と接触させる。望ましい核酸増幅方法は、用いられる反応条件下で鎖置換可能な5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して行われる。この増幅は、増幅反応に用いられる全てのプライマーの配列を含むアンプリコンを産生する。プライマーセットは、好都合には、別々のオリゴヌクレオチドの形態で増幅混合物に添加することができる。例えば、2つのプライマーセットは、3つのオリゴヌクレオチド(内側プライマーがヘアピン構造を含まないと仮定して)からなることができ、3つのプライマーセットは5つのオリゴヌクレオチド(内側プライマーも中間プライマーも、ヘアピン構造を含まないと仮定して)からなることができる。
任意の好適な標識戦略を本明細書に記載の方法に用いることができる。反応を単一の増幅産物の存在に関して分析する場合、普遍的検出プローブを増幅混合物中で用いることができる。特定の実施形態では、リアルタイムPCR検出は普遍的qPCRプローブを使用して行うことができる。好適な普遍的qPCRプローブは、SYBR Green、Pico Green (Molecular Probes, Inc.社、Eugene、OR)、Eva Green (Biotinum社)、エチジウムブロマイド(Zhuら、1994、Anal. Chem. 66:1941〜48頁を参照)等の、二本鎖DNA色素を含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、自動化した試料の操作及び/又は分析プラットフォームを使用して検出される。いくつかの実施形態では、市販の自動化分析プラットフォームが利用される。例えば、いくつかの実施形態では、GeneXpert(登録商標)システム(Cepheid社、Sunnyvale、CA)が利用される。
本明細書に記載の方法を行うためのキットも予期する。そのようなキットは、これらの方法のいずれかを実行するのに有用な1つ又は複数の試薬を含む。キットは通常、1つ又は複数の別々の組成物として、又は任意選択により、試薬の適合性を可能にする混合として、試薬を保持する1つ又は複数の容器を有するパッケージを含む。キットは、緩衝液、希釈液、標準物質、及び/又は試料の処理、洗浄、若しくはアッセイの任意の他の工程の実施に有用な任意の他の材料等、使用者の観点から望ましい他の材料も含み得る。
プライマー/標的構造上の「クランプ」オリゴの効果の確認
「クランプ」オリゴの存在あり及びなしで、プライマーオリゴ(「プライマー」と呼ばれるが、本実験においてはそのように使用されない)及び相補的標的配列のTmを測定する実験を実施した。標的オリゴを5'蛍光タグ(フルオレセイン)によって合成し、プライマーを蛍光クエンチング部分に組込む(図6参照)。赤色は2'-O-メチル主鎖の存在を示す。試験したオリゴ配列を以下のTable 4(表4)に列挙する。図6の構造中に示す右回りの最も二重らせん領域のTmを、温度が上昇し、蛍光及びクエンチャーがこの二重らせん領域の融解によって分けられる結果生じる蛍光の増加に従って測定した。
外側(隣接)プライマーの伸展性
図7Aに図式的に示す外側(隣接)プライマーの伸展性を、Table 6(表6)に示す条件下でのPCR反応で試験した。
Claims (20)
- 試料中の標的核酸を増幅するための核酸プライマーセットであって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、プライマーセットが、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマーの形態である、又は第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも2つの第一のプライマーが、
第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含む第一の外側プライマー;並びに
a'に隣接する、及びa'の5'側にある、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含む第一の内側プライマー
を含み、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに
第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではなく、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列c
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結し、かつ、
二本鎖形態の結合した配列c-aのT m が、二本鎖形態の結合した配列a-bのT m より高い、
核酸プライマーセット。 - 第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマーを更に含む、請求項1に記載のプライマーセット。
- 試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、
(a)試料を、
(i)第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含む第一の外側プライマー;並びに
a'に隣接する、及びa'の5'側にある第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含む第一の内側プライマー
を含み、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに
第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある、第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではない、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列c
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマー;並びに
(ii)第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマー
と接触させる工程であって、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で接触が行われる、接触させる工程;並びに
(b)5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して、鎖置換が生じる条件下で、存在する場合、標的核酸を増幅して、鋳型配列a'から第二のプライマーの結合部位へと伸長する配列を含むアンプリコンを産生する工程
を含み、かつ、
二本鎖形態の結合した配列c-aのT m が、二本鎖形態の結合した配列a-bのT m より高い、
方法。 - DNAポリメラーゼが鎖置換活性を含む、請求項3に記載の方法。
- 結合した配列c-aが、結合した配列a-bよりもGCリッチであり、及び/又はより多くの安定化塩基を含有する、請求項1又は2に記載のプライマーセット。
- 前記増幅が、PCRの対数期中に3サイクル数までの速さで標的核酸を増幅する、請求項3に記載の方法。
- 前記増幅が、単一のフォワード及び単一のリバースプライマーのみを使用する検出に必要とされるよりも、12%〜42%少ない増幅サイクル内で、生体試料中の単一コピーの核酸の前記検出を可能にする、請求項3又は6に記載の方法。
- 第二のプライマーが、第二の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第二のプライマーの形態である、又は第二の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第二のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも2つの第二のプライマーが、
第二の鋳型鎖配列e'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列eを含む第二の外側プライマー;並びに
第二の鋳型鎖配列f'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列f
を含み、f'がe'に隣接する、及びe'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列fがその5'端で、
一本鎖プライマー配列fに隣接する、及び一本鎖プライマー配列fの5'側にあるプライマー配列e;並びに
第二の鎖鋳型配列e'に隣接する、及び第二の鎖鋳型配列e'の3'側にある第二の鎖鋳型配列h'に相補的ではなく、プライマー配列eに隣接する、及びプライマー配列eの5'側にあるクランプ配列g
を含む二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する第二の内側プライマー
を含み、かつ、
二本鎖形態の結合した配列g-eのT m が、二本鎖形態の結合した配列e-fのT m よりも高い、
請求項1、2、又は、5に記載のプライマーセット。 - 結合した配列g-eが、結合した配列e-fよりもGCリッチであり、及び/又はより多くの安定化塩基を含有する、請求項8に記載のプライマーセット。
- 前記増幅が、PCRの対数期中に6サイクル数までの速さで標的核酸を増幅する、請求項8又は9に記載のプライマーセット。
- 前記増幅が、単一のフォワード及び単一のリバースプライマーのみを使用する検出に必要とされるよりも、36%〜66%少ない増幅サイクル内で、生体試料中の単一コピーの核酸の前記検出を可能にする、請求項8から10のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- クランプ配列cが、増幅中にコピーされ得ない、請求項1、2、5、及び8から11のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- クランプ配列cが、2'-O-メチルRNAを含む、請求項12に記載のプライマーセット。
- クランプ配列c及びgが、増幅中にコピーされ得ない、請求項8から13のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- クランプ配列c及びgが、2'-O-メチルRNAを含む、請求項14に記載のプライマーセット。
- 第一の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、ヘアピン配列を含まない、請求項1、2、5、及び8から15のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 第一の内側プライマー及び第二の内側プライマーの二本鎖プライマー配列のいずれもがヘアピン配列を含まない、請求項8から16のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 第一の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、クランプ配列cが相補的な配列c'に連結するヘアピン配列を含む、及び/又は第二の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、存在する場合、クランプ配列gが相補的な配列g'に連結するヘアピン配列を含む、請求項1、2、5、及び8から15のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 試料中の標的核酸を増幅するための核酸プライマーセットであって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、プライマーセットが、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマーの形態である、又は前記第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも3つの第一のプライマーが、
第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列dを含む第一の外側プライマー;
第一の中間プライマーであって、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含み、a'がd'に隣接する、及びd'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列aがその5'端で、
一本鎖プライマー配列aに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
第一の鎖鋳型配列d'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列d'の3'側にある第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではなく、プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあるクランプ配列c1
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、中間プライマー;並びに、
第一の内側プライマーであって、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'がa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列a;
プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあり、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、内側プライマーを含み、かつ、
二本鎖形態の結合した配列c1-dのT m が、二本鎖形態の結合した配列d-aのT m より高く、二本鎖形態の結合した配列c2-d-aのT m が、二本鎖形態の結合した配列d-a-bのT m より高い、
核酸プライマーセット。 - 試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、
(a)試料を、
(i)第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列dを含む第一の外側プライマー;
第一の中間プライマーであって、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含み、a'がd'に隣接する、及びd'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列aがその5'端で、
一本鎖プライマー配列aに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
第一の鎖鋳型配列d'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列d'の3'側にある第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではなく、プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあるクランプ配列c1
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、中間プライマー;並びに、
第一の内側プライマーであって、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'がa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;
プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にある、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、内側プライマー
を含む、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマー、並びに
(ii)第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマー
と接触させる工程であって、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で接触が行われる、接触させる工程、並びに
(b)5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して、鎖置換が生じる条件下で、存在する場合、標的核酸を増幅して、鋳型配列a'から第二のプライマーの結合部位へと伸長する配列を含むアンプリコンを産生する工程
を含み、かつ、
二本鎖形態の結合した配列c1-dのT m が、二本鎖形態の結合した配列d-aのT m より高く、二本鎖形態の結合した配列c2-d-aのT m が、二本鎖形態の結合した配列d-a-bのT m より高い、
方法。
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