WO2019166586A1 - Verfahren zur amplifikation einer nukleinsäure mit verbesserter spezifität - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure durch eine Nukleinsäurepolymerase über zwei Primer, die jeweils einen an die Zielsequenz und einen nicht daran bindenden Sequenzabschnitt aufweisen, wobei der zweite nicht als Matrize für die Polymerase dienen kann, und zwei Controller-Oligonukleotide, die jeweils mit den Primern und einem Teil des von ihnen synthetisierten Sequenzabschnitts komplementär sind und bei der Ablösung des synthetisierten Strangs von der Matrize dienen. Die Controller umfassen ebenfalls modifizierte Nukleotidbausteine, so dass sie nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen können.

Description

Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure mit verbesserter Spezifität
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren mit verbesserter Spezifität.
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität der folgenden Anmeldung: Europäische Patentanmeldungen EP18159155.3 vom 28.02.18; dieses und alle anderen hier erwähnten Patentdokumente sollen durch die Bezugnahme als in die vorliegende Beschreibung aufgenommen gelten (incorporation by reference).
Hintergrund
Die Synthese von Nukleinsäureketten nimmt heute eine zentrale Rolle in der Biotechnologie ein. Verfahren wie PCR haben sowohl die Forschungslandschaft als auch industrielle Applikationsfelder, wie Diagnostik und Lebensmittelindustrie, signifikant weiterentwickelt. Die Verbindung der PCR mit Technologien, wie Sequenzierung, Real-Time-Nachweis, Microarray- Technologie, Mikrofluidic-Managment etc. hat zur technologischen Entwicklung beigetragen und Nachteile der ursprünglichen PCR teilweise überwinden können. Es wurden auch weitere Amplifikations-Verfahren, wie isothermale Amplifikationstechniken entwickelt. Deren Einsatz wurde besonders für den Bereich von POCT ( point-of-care-testing ) vorgesehen. Trotz enormer Fortschritte auf diesem Gebiet nimmt die PCR die zentrale Rolle ein und bestimmt somit die einzelnen technologischen Barrieren ihrer Anwendung.
Während des Amplifikationsvorgangs findet bei der PCR keine Kontrolle der zwischen den Primern gelegenen amplifizierten Sequenzabschnitte statt. Die Primer-Bindung steht im Fokus von Optimierungen von PCR-Methoden. Zu Beginn der PCR und in ihrem Verlauf kommt es kontinuierlich zur Initiierung der Synthese von Hauptprodukten und Nebenprodukten, z.B. durch unspezifische Bindung oder Verlängerung der Primer. Bei ggf. erfolgenden Rücksynthesereaktionen wird der unspezifisch verlängerte Primer als Matrize abgelesen, was in der Regel zur Ausbildung einer vollständigen Primer-Bindungsstelle führt. Somit erfolgt eine Übertragung einer fehlerhaften Sequenzinformation von einem Synthese-Zyklus auf den nächsten, was in Summe nicht nur zur initialen Entstehung, sondern vor allem zur exponentiellen Vermehrung von Nebenprodukten führt.
Solche Nebenreaktionen können zur exponentiellen Vermehrung von Fragmenten führen, welche die Hauptreaktion (Amplifikation einer Zielsequenz) stören bzw. zu Interferenzen in nachfolgenden Schritten der Analyse führen. Solche Nebenprodukte umfassen typischerweise linke und rechte Primersequenzen, so dass ihre Amplifikation parallel zu der Hauptreaktion stattfinden kann. Anstatt einer Zielsequenz umfassen solche Nebenprodukte allerdings eine andere Nukleinsäure- Zielsequenz. Um die Synthese der Hauptprodukte zu optimieren und die Entstehung von Nebenprodukten zu minimieren, werden typischerweise Primer-Sequenzen optimiert und solche Reaktionsbedingungen gewählt, welche die Spezifität von Primer-Bindungen unterstützen. Wenn es dennoch zu Initiierung von Nebenprodukten gekommen ist, so können diese in der Regel parallel zu Hauptprodukten vervielfältigt werden, da während des Amplifikationsverfahren alle neugebildeten Stränge unabhängig von ihrer Zusammensetzung denaturiert werden. Während dieses Schrittes werden Primer-Bindungsstellen regeneriert, was die Voraussetzung für eine neue Synthese-Runde darstellt. In Verfahren wie PCR oder HDA oder SDA werden Mittel eingesetzt, welche keine sequenzabhängige Strang-Trennung bewirken (in der PCR wird eine Temperatur- Erhöhung eingesetzt, in der HDA eine Helicase und ATP, und in der SDA eine zu Strangverdrängung fähige Polymerase). Folglich werden sowohl in Hauptprodukten als auch in Nebenprodukten Primer-Bindungsstellen für erneute Bindungen und anschließende Synthesereaktion generiert. Nach einer einmaligen Initiierung können sowohl Hauptprodukte als auch Nebenprodukte parallel vervielfältig werden, wenn verwendete Primer entsprechende Primerbindungsstellen vorfinden.
Besonders anfällig für solche Nebenreaktionen sind Amplifikationsverfahren, welche unter teilweise schwer zu kontrollierenden Reaktionsbedingungen ablaufen müssen (z.B. point-of-care- testing) oder eine starke Präsenz von Nebenreaktionen-begünstigenden Faktoren aufweisen (z.B. Amplifikation von Sequenz-Fragmenten mit geringfügigen Sequenz-Abweichungen, wie beispielsweise Mutationen oder SNV, in Anwesenheit von hohen Mengen von Wildtyp-Sequenzen. Solche Analysen können beispielsweise in Forensik, Pränatal-Diagnostik oder beispielsweise bei ctDNA-Nachweis im Rahmen von Liquid-Biopsy Untersuchung von Bedeutung sein).
Vorrangig wird die Spezifität der PCR Amplifikation durch die Optimierung der Primer-Bindung an die Zielsequenzen erreicht. Dabei können beispielsweise zusätzliche Oligonukleotide verwendet werden, welche teilweise an den Primer binden und somit bei der Primer-Bindung an andere Nukleinsäureketten kompetitiv mitwirken können. Solche Sonden binden in der Regel an einen Sequenzabschnitt des Primers und lassen am Primer einen einzelsträngigen Sequenzabschnitt frei, mit dem der Primer an die Zielnukleinsäure binden und eine Synthesereaktion initiieren kann. Primer-Matrizen Mismatches können durch solche Oligonukleotide kompetitiv verdrängt werden, was die Spezifität der Initiierung verbessert. Solche zusätzlichen Oligonukleotide interagieren nicht mit der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette in Abschnitten zwischen den beiden Primern. Aufgrund eines molaren Überschusses der Primer kann es während einer Amplifikation dennoch zu unspezifischen Interaktionen von Primern mit Matrizen kommen, was zur Ausbildung einer voll funktionsfähigen Primer-Bindungsstelle als Folge der Synthese eines komplementären Stranges des Nebenproduktes führt. Das Vorliegen einer solchen vollständigen Primerbindungsstelle im Nebenprodukt führt zu einem Verlust der kompetitiven Wirkung von solchen zusätzlichen Oligonukleotiden auf die Primer-Bindung. Die Kontrolle der Spezifität der Bindung eines Primers an die Matrize durch solche Oligonukleotide macht somit nur die Initiierung einer Nebenreaktion unwahrscheinlicher, kann allerdings nach Entstehung eines Nebenproduktes seine exponentielle Amplifikation kaum beeinflussen.
Weiterhin werden üblicherweise markierte Oligonukleotid-Sonden im Rahmen von Detektions verfahren zur Verbesserung der Spezifität der Analyse zu einem spezifischen Nachweis von bestimmten Sequenzen eingesetzt. Diese Sonden beeinflussen im Wesentlichen die exponentielle Amplifikation nicht. Im Allgemeinen benötigen Sonden eine hinreichend hohe Konzentration von Nukleinsäureketten und entfalten ihre Wirkung deshalb im Endstadium einer Amplifikation, wenn genügend Produkt vorliegt (z.B. Taqman-Sonden oder Light-Cycler Sonden).
Im Allgemeinen kann eine Verbesserung der Spezifität der Synthese eines Amplifikations verfahrens mit reduzierter Entstehung und Co-Amplifikation von Nebenprodukten, welche sich von Zielsequenz unterscheiden, beispielsweise zu einer Verbesserung von diagnostischen Verfahren beitragen.
Basierend auf diesem Hintergrund ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren mit verbesserter Spezifität der Synthese von Zielnukleinsäureketten in einer exponentiellen Amplifikation bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel für die Umsetzung eines exponentiellen Amplifikationsverfahrens mit verbesserter Spezifität der Synthese zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, welche synthetisierte Sequenzabschnitte zwischen Primern überprüfen und die Effizienz einer Amplifikationsreaktion bzw. die Dauer einer Amplifikationsreaktion von Sequenzen in Abhängigkeit von ihrer Übereinstimmung mit einer Sequenz-Vorgabe beeinflussen können.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, welche eine Überprüfung der synthetisierten Sequenzen in Echtzeit ermöglichen und eine Kontrolle über die Verwendbarkeit der synthetisierten Sequenzen in weiteren Amplifikationszyklen ausüben (real time Controlling / on-line quality control).
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, welche ein exponentielles Amplifikationsverfahren für die Nukleinsäurekette mit einer Feedback-Funktion der Überprüfung von Inhalten von Nukleinsäureketten zur Verfügung stellt. Die Feedback-Funktion der Überprüfung soll dabei parallel zur exponentiellen Amplifikation erfolgen. Die einzelnen Amplifikations-Elemente bilden dabei einen Regel-Kreis.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sollen Nukleinsäureketten mit definierter Sequenz- Zusammensetzung synthetisiert bzw. amplifiziert werden können.
Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen und der folgenden Beschreibung aufgeführt. Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Amplifikation zur Verfügung gestellt.
In einer ersten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäurekette, bzw. einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz und / oder ihre komplementären Sequenzsegmente, die folgenden Schritte (Fig. 1 und 13):
Bereitstellung einer Start-Nukleinsäurekette, wobei die Start-Nukleinsäurekette
- einen 5'-Überhang umfasst (M2.1 .6), welcher im Wesentlichen für eine Polymerase unkopierbar ist
- einen Bereich umfasst, welcher komplementäre Sequenzsegmente zur Zielsequenz umfasst (M 2.1 .5 bis M 2.1 .1 )
- einen 3'-Bereich umfasst, welcher für Bindung und Verlängerung eines ersten Primer-Oligonukleotides (P1 .1 ) geeignet ist (M2.1 .1 )
Hybridisieren eines ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) an den 3'-terminalen Bereich einer Start-Nukleinsäurekette (M2.1 .1 ) und / oder eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (P2.1 E1 ), umfassend komplementäre Sequenzsegmente zu einer Zielsequenz, wobei das erste Primer-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst:
- einen ersten Bereich (P1 .1 .1 ), der sequenzspezifisch an den 3' terminalen Bereich der Start-Nukleinsäurekette (M2.1 .1 ) und / oder an den P2.1 -Ext (P2.1 E1 ) der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette binden kann,
- einen zweiten Bereich (P1 .1 .2) (Primer-Überhang), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder damit über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem ersten Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) gebunden werden kann und von einer für die Amplifikation verwendeten Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlichen unkopiert bleibt;
Hybridisieren eines zweiten Primer-Oligonukleotids (P2.1 ) an den 3'-terminalen Bereich (P1 .1 E1 ) des Komplementärstrangs der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst:
- einen ersten Bereich (P2.1 .1 ), der sequenzspezifisch an den 3'-terminalen Bereich des Komplementärstrangs (P1 .1 E1 ) binden kann,
- einen zweiten Bereich (P2.1 .2) (Überhang), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder damit über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem zweiten Controller-Oligonukleotid (C2.1 ) gebunden werden kann und von einer für die Amplifikation verwendeten Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlichen unkopiert bleibt;
Verlängerung (Extension) des ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) durch eine matrizenabhängige Polymerase unter Verwendung der Start-Nukleinsäurekette und / oder des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes (P2.1 -Ext) als Matrize unter Erhalt eines ersten Primer-Verlängerungsproduktes (P1 .1 -Ext), welches neben dem ersten Primer- Oligonukleotid einen von der Polymerase synthetisierten Bereich umfasst; das synthetisierte erste Primer-Verlängerungsprodukt umfasst die Zielsequenz bzw. ihre Anteile
Verlängerung (Extension) des zweiten Primer-Oligonukleotids (P2.1 ) durch eine matrizenabhängige Polymerase unter Verwendung des ersten Primer- Verlängerungsproduktes (P1 .1 -Ext) als Matrize unter Erhalt eines zweiten Primer- Verlängerungsproduktes (P2.1 -Ext), welches neben dem zweiten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst; das synthetisierte zweite Primer- Verlängerungsprodukt umfasst Sequenzsegmente komplementär zur Zielsequenz oder ihren Anteilen
Bindung eines ersten Controller-Oligonukleotids (C1 .1 ) an das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1 .1 -Ext) , wobei das erste Controller-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst (Fig. 13):
- einen ersten Bereich (C1 .1 .1 ), der an den zweiten Bereich (Überhang) des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 E6) binden kann,
- einen zweiten Bereich (C1 .1 .2), der zum ersten Bereich des zweiten Primer- Oligonukleotids (P1 .1 .1 ) komplementär ist, und
- einen dritten Bereich (C1 .1 .3), der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 E4) im Wesentlichen komplementär ist;
wobei das erste Controller-Oligonukleotid nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids dient, und das erste Controller-Oligonukleotid an komplementäre Sequenzsegmente des ersten Primer- Verlängerungsproduktes unter Verdrängung von komplementären Segmenten des anderen Stranges (Segmente P2.1 E1 und P2.1 E2) der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette bindet;
Bindung eines zweiten Controller-Oligonukleotids (C2.1 ) an das zweite Primer- Verlängerungsprodukt (P2.1 -Ext) und / oder an die Start-Nukleinsäurekette, wobei das zweite Controller-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst:
- einen ersten Bereich (C2.1 .1 ), der an den zweiten Bereich der zweiten Primer- Verlängerungsprodukts (P2.1 E6) und / oder an die Start-Nukleinsäurekette (M 2.1 .6) binden kann,
- einen zweiten Bereich (C2.1 .2), der zum ersten Bereich des zweiten Primer- Oligonukleotid (P2.1 .1 ) komplementär ist, und
- einen dritten Bereich (C2.1 .3), der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts (P2.1 E4) im Wesentlichen komplementär ist;
wobei das zweite Controller-Oligonukleotid nicht als Matrize für eine
Primerverlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids dient, und das zweite Controller-Oligonukleotid an das Primer-Verlängerungsprodukt unter Verdrängung von komplementären Segmenten des anderen Stranges (P1 .1 E1 und P1 .1 E2) der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette bindet;
wobei: der Doppelstrang umfassend P1 .1 -Ext und P2.1-Ext unter Reaktionsbedingungen unter Mitwirkung von C1 .1 und C2.1 voneinander getrennt werden kann
Und die synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte (P1 1 -Ext und P2.1 -Ext) gegenseitig als Matrizen dienen können, und
die Schritte wiederholt werden können, bis die gewünschte Menge der zu amplifizierenden Nukleinsäure synthetisiert wurde.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens werden die Schritte der Primer-Verlängerung weiterhin modifiziert und umfassen eine Verdrängung des jeweiligen Controller-Oligonukleotides aus der Bindung mit dem jeweiligen Primer-Verlängerungsprodukt unter Mitwirkung der
Polymerase.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird das Verfahren weiterhin modifiziert und umfasst: Fortführung der Reaktion unter Bedingungen, welche die Wiederholung von Schritten zulassen.
In einer Ausführungsform wird das Verfahren unter Bedingungen ausgeführt, welche keine Trennung von komplementären Strängen der zu amplifizierenden Nukleinsäure in Abwesenheit von einem Controller-Oligonukleotid zulassen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Amplifikation einer
Nukleinsäurekette eine Zielsequenz, wobei die Zielsequenz folgende Sequenzsegmente umfasst (in 5'-3'-Richtung): TS4.5, TS4.4, TS4.3, TS4.2, TS4.1 (Fig. 13).
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Bereitstellung einer Start- Nukleinsäurekette (M2.1 ), wobei der 5'-Überhang (M2.1 .6) nicht komplementär zur Zielsequenz ist und von der Polymerase nicht kopierbar ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Bereitstellung einer Start- Nukleinsäurekette (M2.1 ), wobei der 5'-Überhang (M2.1 .6) nicht komplementär zur Zielsequenz ist und von der Polymerase nicht kopierbar ist und an den ersten Bereich des zweiten Controller- Oligonukleotides binden kann.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Bereitstellung einer Start- Nukleinsäurekette (M2.1 ) , welche folgende Sequenzsegmente umfasst (in 5'-3'-Richtung):
M2.1 .6, M2.1 .5, M2.1 .4, M2.1 .3, M2.1 .2, M2.1 .1 , wobei M2.1 .6 nicht zur Zielsequenz
komplementär ist und M2.1 .5, M2.1 .4, M2.1 .3, M2.1 .2, M2.1 .1 im Wesentlichen komplementäre Sequenzen zur Zielsequenz umfassen. In einer weiteren Ausführungsform erfolgen die Schritte der Bindung des ersten Controllers und des zweiten Controllers an die Primer-Verlängerungsprodukte gleichzeitig bzw. parallel zueinander.
In einer weiteren Ausführungsform ist das erste Controller-Oligonukleotid nicht identisch zum zweiten Controller-Oligonukleotid.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst jedes Primer- Verlängerungsprodukt je ein Segment, welches nicht komplementär zum jeweiligen Controller ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst jedes Primer- Verlängerungsprodukt je ein Segment, welches nicht komplementär zum jeweiligen Controller ist, wobei bei gleichzeitiger Bindung von beiden Controllern an komplementäre Bereiche der jeweiligen Primer- Verlängerungsprodukte, beide Primer-Verlängerungsprodukte durch ihre nicht zum Controller komplementären Segmente einen Doppelstrang ausbilden können.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst jedes Primer- Verlängerungsprodukt je ein Segment, welches nicht komplementär zum jeweiligen Controller ist, wobei bei gleichzeitiger Bindung von beiden Controllern an komplementäre Bereiche der jeweiligen Primer- Verlängerungsprodukte, beide Primer-Verlängerungsprodukte durch ihre nicht zum Controller komplementäre Segmente einen Doppelstrang ausbilden können und diese Segmente P1 .1 E3 und P2.1 E3 umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erste Primer- Verlängerungsprodukt ein P1 .1 E3 Segment.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das zweite Primer-Verlängerungsprodukt ein P2.1 E3 Segment.
In einer weiteren Ausführungsform kann das P1 1 -Ext mit seinem P1 .1 E3 Segment an P2.1 E3 des P2.1-Ext komplementär binden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erste Primer- Verlängerungsprodukt ein P1 .1 E3 Segment und das zweite Primer-Verlängerungsprodukt ein P2.1 E3, welches eine Länge im Bereich von 0 bis 100 Nukleotiden umfasst, insbesondere von 0 bis 50 Nukleotiden,
insbesondere von 0 bis 30 Nukleotiden, insbesondere von 0 bis 15 Nukleotiden.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Verfahren bei Reaktionsbedingungen ausgeführt, welche Temperaturen zwischen 25°C und etwa 80°C umfassen, insbesondere zwischen 45°C und 75°C, insbesondere zwischen 50°C und 70°C.
In einer weiteren Ausführungsform kann das P1 1 -Ext mit seinem P1 .1 E3 Segment an P2.1 E3 des P2.1-Ext komplementär binden und einen Doppelstrang bilden, wobei die Längen der Segmente P1 .1 E3 und P2.1 E3 so gewählt sind, dass der Doppelstrang unter
Reaktionsbedingungen nicht stabil ist und zerfällt.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Verfahren isothermal durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform werden mindestens zwei verschiedene Temperaturen verwendet.
In einer Ausführungsform wird das Kopieren des Polynukleotid-Schwanzes im zweiten Primer- Bereich durch einen Stopp Bereich für die Polymerase bewirkt, der zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich angeordnet ist.
In einer Ausführungsform ist der dritte einzelsträngige Bereich des Controller-Oligonukleotids zum Segment des von der Polymerase synthetisierten Verlängerungsprodukts des jeweiligen Primer-Verlängerungsprodukts, welches unmittelbar an den ersten Primer-Bereich anschließt, im Wesentlichen komplementär, wobei:
In einer Ausführungsform ist der dritte einzelsträngige Bereich des Controller-Oligonukleotids zum 5'-Segment des Verlängerungsprodukts des jeweiligen Primer-Verlängerungsproduktes vollständig komplementär, wobei die Länge dieses komplementären Sequenzabschnittes folgende Bereiche umfasst: von mindestens 3 bis 70 Nukleotide, insbesondere von mindestens 5 bis 50 Nukleotide, insbesondere von 5 bis 40 Nukleotide, weiter insbesondere von 5 bis 30 Nukleotide, insbesondere von 5 bis 20 Nukleotide.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird das Verfahren weiterhin modifiziert und umfasst: gleichzeitige Amplifizierung des ersten und zweiten Primer-Verlängerungsproduktes in einer exponentiellen Reaktion unter Verwendung des ersten und zweiten Primer-Oligonukleotids und des ersten Controller-Oligonukleotides und des zweiten Controller-Oligonukleotides, wobei die gebildeten Primer-Verlängerungsprodukte als Matrizen für eine gegenseitige Synthese auftreten.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Bereitstellung einer Start- Nukleinsäurekette (M2.1 ) (Fig. 13 und 20) und folgende Schritte:
Bereitstellung einer Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz Hybridisieren eines zweiten Primer-Oligonukleotids (P2.1 ) an den 3'-terminalen Bereich (TS4.1 ) der Zielsequenz, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich (P2.1 .1 ), der (im Wesentlichen) sequenzspezifisch an den 3'-Bereich des Komplementärstrangs (TS4.1 und / oder P1 .1 E1 ) binden kann,
• einen zweiten Bereich (P2.1 .2) (Überhang), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder damit über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem zweiten Controller-Oligonukleotid (C2.1 ) gebunden werden kann und von einer für die Amplifikation verwendeten Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlichen unkopiert bleibt; Verlängerung (Extension) des zweiten Primer-Oligonukleotids (P2.1 ) durch eine matrizenabhängige Polymerase unter Verwendung der Zielsequenz als Matrize unter Erhalt einer Start-Nukleinsäurekette M2.1 (Fig. 13), welche neben dem zweiten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst, welcher zur Zielsequenz komplementäre Segmente umfasst;
T rennung der Stränge der Zielsequenz und der erhaltenen Start- Nukleinsäurekette voneinander, wobei die Start-Nukleinsäurekette in einzelsträngige Form überführt wird.
Wobei die Trennung durch eines der Verfahren erfolgen kann: Thermale Denaturierung, Alkalie-Denaturierung, enzymatische Strang-Trennung (z.B. Helicase), Degradation (z.B. RNase Abbau).
Der Begriff "im Wesentlichen komplementär" bedeutet im Sinne der Erfindung insbesondere, dass die zueinander komplementären Bereiche von Nukleinsäure nicht mehr als 5, 4, 3, 2, oder 1 Mismatches aufweisen.
Die oben genannten Schritte können in einem Ansatz oder in getrennten Ansätzen ausgeführt werden. Wenn die Vorgänge in einem Ansatz durchgeführt werden sollen, so können diese unter gleichen Bedingungen, z.B. isothermal, oder unter unterschiedlichen Bedingungen, z.B. beim Thermocycling, ausgeführt werden. Insbesondere sind Primer-Oligonukleotide und Controller- Oligonukleotid zu Beginn der Reaktion präsent. Eine sequenzielle Zugabe einzelner Reagenzien ist allerdings auch möglich.
Ebenfalls sind Kombinationen mit anderen Amplifikationsverfahren möglich, z.B. mit PCR, wobei die PCR beispielsweise erst über 1 bis 10 Zyklen durchgeführt wird und anschließend wird beispielsweise unter isothermalen Bedingungen weitergearbeitet.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass der dritte Bereich des ersten Controller-Oligonukleotids zu dem Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsproduktes im Wesentlichen komplementär ist, der sich unmittelbar an den Primer-Oligonukleotidanteil des ersten Primer-Verlängerungsproduktes anschließt.
Insbesondere wird dadurch die sequenzspezifische Verdrängung der zu amplifizierenden Nukleinsäure verbessert.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist der Teil des synthetisierten Bereiches, der im Wesentlichen komplementär zum dritten Bereich des ersten Controller-Nukleotids ist, eine Länge im Bereich von 5 Nukleotiden bis 50 Nukleotiden auf.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass der dritte Bereich des zweiten Controller-Oligonukleotids zu dem Teil des synthetisierten Bereiches des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes im Wesentlichen komplementär ist, der sich unmittelbar an den Primer-Oligonukleotidanteil des ersten Primer-Verlängerungsproduktes anschließt. Insbesondere wird dadurch die sequenzspezifische Verdrängung des Komplementärstranges oder des ersten Primer-Verlängerungsprodukts verbessert.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist der Teil des synthetisierten Bereiches, der im Wesentlichen komplementär zum dritten Bereich des zweiten Controller-Nukleotids ist, eine Länge im Bereich von 3 Nukleotide bis 70 Nukleotide auf, insbesondere 5 Nukleotide bis 50 Nukleotide, insbesondere 5 Nukleotide bis 50 Nukleotide, weiter insbesondere 5 Nukleotide bis 30 Nukleotide, weiter insbesondere 5 Nukleotide bis 20 Nukleotide.
In einer Ausführungsform ist der dritte einzelsträngige Bereich des ersten Controller-Oligo- Nukleotids zum 5'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes vollständig
komplementär, wobei die Länge dieses komplementären Sequenzabschnittes folgende Bereiche umfasst: von mindestens 3 bis 70 Nukleotide, insbesondere von mindestens 5 bis 50 Nukleotide, insbesondere von 5 bis 40 Nukleotide, von 5 bis 30 Nukleotide, oder insbesondere von 5 bis 20 Nukleotide.
In einer Ausführungsform ist der dritte einzelsträngige Bereich des zweiten Controller-Oligo- Nukleotids zum genannten 5'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes vollständig komplementär, wobei die Länge dieses komplementären Sequenzabschnittes folgende Bereiche umfasst: von mindestens 3 bis 70 Nukleotide, insbesondere von mindestens 5 bis 50 Nukleotide, insbesondere von 5 bis 40 Nukleotide, weiter insbesondere von 5 bis 30 Nukleotide, oder von 5 bis 20 Nukleotide.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Verfahren weiterhin folgenden Schritt umfasst: Hybridisierung einer Sonde an einen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure, des Komplementärstranges, des ersten Primer- Extensionsproduktes oder des zweiten Primer-Extensionsproduktes, wobei der Bereich nicht von dem ersten Controller-Oligonukleotid oder dem zweiten Controller-Oligonukleotid gebunden wird bzw. ihnen interagiert.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Verfahren weiterhin folgenden Schritt umfasst: Hybridisierung eines Blockierungs-Oligonukleotids an einen Bereich der zu amplifizierenden Nukleinsäure, des Komplementärstranges, des ersten Primer-Extensionsproduktes oder des zweiten Primer-Extensionsproduktes, wobei der Bereich nicht von dem ersten Controller-Oligonukleotid oder dem zweiten Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und die Hybridisierung des Block-Oligonukleotids eine Amplifikation der zu amplifizierenden Nukleinsäure, des Komplementärstranges, des ersten Primer- Extensionsproduktes oder des zweiten Primer-Extensionsproduktes verhindert.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das Verfahren im Wesentlichen isothermal durchgeführt wird. Der Begriff "im Wesentlichen isothermal" bedeutet im Sinne der vorliegenden Beschreibung insbesondere, dass die Reaktionstemperatur um nicht mehr als 10 °C innerhalb des Verfahrens geändert wird.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die zu amplifizierende Nukleinsäure eine Länge im Bereich von 30 Nukleotiden bis 200 Nukleotiden umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das erste Primer-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 60 Nukleotiden umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das zweite Primer-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 60 Nukleotiden umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das erste Controller-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 20 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das zweite Controller-Oligonukleotid eine Länge im Bereich von 20 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass der Bereich des Doppelstrangs umfassend das erste Primerverlängerungsprodukt und die zu amplifizierende Nukleinsäure, der nicht vom ersten Controller-Oligonukleotid oder dem zweiten Controller-Oligonukleotid gebunden wird, unter den gewählten Reaktionsbedingungen in die jeweiligen Einzelstränge dissoziiert.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass der Bereich des Doppelstrangs umfassend das zweite Primerverlängerungsprodukt und den Komplementärstrang, der nicht vom ersten Controller-Oligonukleotid oder vom zweiten
Controller-Oligonukleotid gebunden wird, unter den gewählten Reaktionsbedingungen in die jeweiligen Einzelstränge dissoziiert.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass der Bereich des Doppelstrangs umfassend das erste Primerverlängerungsprodukt und das zweite Primerverlängerungsprodukt, der nicht vom ersten Controller-Oligonukleotid oder dem zweiten Controller-Oligonukleotid gebunden wird, unter den gewählten Reaktionsbedingungen in die jeweiligen Einzelstränge dissoziiert.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die gewählten Reaktionsbedingungen eine Reaktionstemperatur im Bereich von 30 °C bis 75 °C umfassen. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das erste Primer-Oligonukleotid im zweiten Bereich eine Modifikation oder mehrere Modifikationen aufweist, insbesondere unmittelbar im Anschluss an den ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotids, welche die verwendete Polymerase am zweiten Bereich stoppen. Insbesondere wird dadurch nur der erste Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids als Matrize von einer Polymerase verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass das zweite Primer-Oligonukleotid im zweiten Bereich eine Modifikation oder mehrere Modifikationen aufweist, insbesondere unmittelbar im Anschluss an den ersten Bereich des zweiten Primer- Oligonukleotids, welche die verwendete Polymerase am zweiten Bereich stoppen. Insbesondere wird dadurch nur der erste Bereich des zweiten Primer-Oligonukleotids als Matrize von einer Polymerase verwendet.
Dies kann insbesondere durch Verwendung von Nukleotid-Modifikationen erreicht werden, welche zwar eine komplementäre Bindung mit dem ersten Bereich des jeweiligen Controller- Oligonukleotides eingehen können, nicht aber von der Polymerase als Matrize akzeptiert werden. Beispiele für solche Nukleotid-Modifikationen stellen Nukleotid-Verbindungen mit modifizierten Phosphat-Zucker-Rückgrad-Anteilen, z.B. 2'-0-Alkyl-RNA Modifikationen (z.B. 2'-OMe), LNA- Modifikationen oder Morpholino-Modifikationen dar. Im Allgemeinen hindert die Anwesenheit solcher Modifikationen in einem Strang eine DNA-abhängige Polymerase beim Ablesen eines solchen Stranges. Die Anzahl von solchen Modifikationen kann unterschiedlich groß sein, in der Regel können mehrere Modifikationen (zwischen 5 und 30) hinreichend sein, um eine
Polymerase beim Ablesen eines solchen Stranges zu hindern.
Dank der Verwendung solcher Modifikationen kommt es zu einer lokalen Hinderung der
Polymerase-Funktion, so dass bestimmte Segmente der verwendeten Strukturen nicht durch die Polymerase kopiert werden können und vorwiegend einzelsträngig bleiben. In dieser
einzelsträngigen Form können sie weitere Reaktionskomponenten binden und somit ihre
Funktion ausführen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Kit zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt oder einem der dazugehörigen Ausführungsformen oder Alternativen zur Verfügung gestellt. Das erfindungsgemäße Kit umfasst: ein erstes Primer-Oligonukleotid aufweisend folgende Bereiche:
• einen ersten Bereich, der sequenzspezifisch an den 3'-terminalen Bereich einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette binden kann,
• einen zweiten Bereich, der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder damit über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem ersten Controller-Oligonukleotid gebunden werden kann und von einer für die Amplifikation verwendeten Polymerase unter den gewählten
Reaktionsbedingungen im Wesentlichen unkopiert bleibt; • wobei das erste Primer-Oligonukleotid durch eine Polymerase zu einem ersten Primer-Verlängerungsprodukt verlängert werden kann, welches neben dem ersten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst; ein zweites Primer-Oligonukleotid aufweisend folgende Bereiche:
• einen ersten Bereich, der sequenzspezifisch an den 3'-terminalen Bereich des ersten Primer-Extensionsprodukts binden kann,
• einen zweiten Bereich, der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder über damit einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem zweiten Controller-Oligonukleotid gebunden werden kann und von einer für die Amplifikation verwendeten Polymerase unter den gewählten
Reaktionsbedingungen im Wesentlichen unkopiert bleibt;
• wobei das zweite Primer-Oligonukleotid durch eine Polymerase zu einem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt verlängert werden kann, welches neben dem zweiten Primer-Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst;
ein erstes Controller-Oligonukleotid aufweisend folgende Bereiche:
• einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich des ersten Primer- Verlängerungsproduktes binden kann,
• einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des zweiten Primer- Oligonukleotids im Wesentlichen komplementär ist, und
• einen dritten Bereich, der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Verlängerungsproduktes im Wesentlichen komplementär ist; wobei das erste Controller-Oligonukleotid nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids dient; und
ein zweites Controller-Oligonukleotid aufweisend folgende Bereiche:
• einen ersten Bereich, der an den zweiten Bereich des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes binden kann,
• einen zweiten Bereich, der zum ersten Bereich des zweiten Primer- Oligonukleotids im Wesentlichen komplementär ist, und
• einen dritten Bereich, der zumindest zu einem Teil des synthetisierten Bereiches des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes im Wesentlichen komplementär ist; wobei das zweite Controller-Oligonukleotid nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids dient,
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits umfasst das Kit weiterhin eine
Polymerase.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Kits gemäß dem obigen Aspekt zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt oder einem der dazugehörigen Ausführungsformen oder Alternativen zur Verfügung gestellt. Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung sollen in nicht beschränkender Weise durch die nachfolgenden Figuren und eine detaillierte Beschreibung ausgewählter Ausführungsformen erläutert werden.
Beschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt die Sequenzkomponenten einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Amplifikationsverfahrens.
Fig. 2 zeigt A: den schematischen Aufbau von Primer 1 .1 , Primer 2.1 , Controller 1 .1 und Controller 2.1 und B: die Interaktion zwischen Primer 1 .1 und Controller 1 .1 bzw. Primer 2.1 und Controller 2.1 .
Fig. 3 zeigt die Topographie der zu amplifizierenden Nukleinsäure (P.1 . Verlängerung und P2.1 Verlängerung):
Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung der Primer-Binding an die Primer- Verlängerungsprodukte; A: Primer 1 .1 binden an PBS P1 .1 des Primer-2.1
Verlängerungsproduktes; B: Primer 2.1 binden an PBS P2.1 des Primer-1 .1
Verlängerungsproduktes.
Fig. 5 zeigt eine schematische Darstellung der Controller-Bindung an die Primer- Verlängerungsprodukte.
Fig. 6 zeigt eine schematische Darstellung der Interaktion zwischen den Controllern (C1 .1/C1 .2) und den Primerverlängerungsprodukten (P1 1-Ext./P2.1-Ext.).
Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung der Interaktion der Controller C1 .1 und C2.1 und dem Komplex umfassend P1 1-Ext / P2.1-Ext sowie die Verwendung der Komplexe P1 1 -Ext /
C1 .1 und P2.1-Ext / C2.1 als Matrizen für eine Polymerasen-abhängige P1 .1 - und P2.1 - Verlängerung.
Fig. 8 zeigt eine schematische Darstellung der Amplifikation ausgehend von P1 1-Ext.
Fig. 9 zeigt eine schematische Darstellung der Erstellung einer Start-Nukleinsäurekette ausgehend von P1 .1 und ihre Verwendung in der Amplifikation.
Fig. 10 zeigt eine schematische Darstellung einer längeren doppelsträngigen Nukleinsäurekette (A); der Hybridisierung des Primers P.1 .1 an das 3'Ende eines Strangs der doppelsträngigen Nukleinsäurekette (B); des verlängerten Primers P1 1 -Ext (C); und der Verlängerung des Primers P2.1 , der an P1 1 -Ext. als Matrize hybridisiert ist (D).
Fig. 1 1 zeigt eine schematische Darstellung einer längeren doppelsträngigen Nukleinsäurekette (A); der Hybridisierung des Primers P2.1 an das 3'Ende eines Strangs der doppelsträngigen Nukleinsäurekette (B); des verlängerten Primers P2.1 -Ext (C); und der Verlängerung des Primers P1 .1 , der an P2.1 -Ext. als Matrize hybridisiert ist.
Fig. 12 zeigt schematisch die Synthese von P1 .1-Ext. unter Verdrängung des Controllers C2.1 . Fig. 13 zeigt schematisch die Synthese von P2.1-Ext. unter Verdrängung des Controllers C1 .1 .
Fig. 14 zeigt schematisch die Interaktion der Controller C1 .1 und C2.1 mit dem Komplex aus P1 .1 -Ext. und P2.1 -Ext.
Fig. 15 zeigt schematisch die Interaktion der Controller C1 .1 und C2.1 mit dem Komplex aus P1 .1 -Ext. und P2.1 -Ext.
Fig. 16 zeigt schematisch die Interaktion der Controller C1 .1 und C2.1 mit dem Komplex aus P1 .1 -Ext. und P2.1 -Ext.
Fig. 17 - 19 zeigen schematisch bestimmte Ausführungsformen von Topographie einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette
Fig. 20 zeigt eine schematische Darstellung der Erstellung einer Start-Nukleinsäurekette ausgehend von P2.1 und ihre Verwendung in der Amplifikation.
Fig. 21 - 30 zeigen Ergebnisse der Amplifikation (Beispiele)
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen und besondere Ausführungsformen:
Soweit nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann verstanden werden. Standardtechniken werden für molekularboiologische oder biochemische Verfahren verwandt (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die verwendeten Begriffe folgende Bedeutung:
Soweit die in der Beschreibung und im Sequenzprotokoll gezeigten Sequenzen von einander abweichen, gilt im Zweifel die in der Beschreibung gezeigte Sequenz.
Primer-Oligonukleotid:
Das Primer-Oligonukleotid umfasst einen ersten Primer-Bereich und einen zweiten Bereich.
In der vorliegenden Erfindung werden zwei Primer-Oligonukleotide verwendet, jedes für die Initiierung der Synthese eines spezifischen Primer-Verlängerungsproduktes. Zwar unterscheiden sich das erste und das zweite Primer-Oligonukleotid voneinander durch die
Sequenzzusammensetzung einzelner Bereiche, dennoch ist der grundsätzliche Aufbau von beiden Primer-Oligonukleotiden ähnlich.
Daher wird exemplarisch nur der Aufbau des ersten Primer-Oligonukleotides besprochen. Der Aufbau des zweiten Primers folgt im Wesentlichen den gleichen Überlegungen. Der erste Primer-Bereich ist in der Lage, an eine im Wesentlichen komplementäre Sequenz innerhalb der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder ihrer Äquivalente zu binden und eine Primer- Verlängerungsreaktion zu initiieren. Der zweite Bereich umfasst einen Polynukleotid-Schwanz, welcher in der Lage ist, ein Controller-Oligonukleotid zu binden und damit eine räumliche Nähe zwischen dem Controller-Oligonukleotid und den anderen Teilen des entsprechenden Primer- Verlängerungsproduktes zu bewirken, welche ausreichend ist, um eine Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid zu initiieren. Der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotids umfasst weiterhin mindestens eine Modifikation (eine Nukleotid-Modifikation oder eine nicht-Nukleotid- Modifikation), welche die Polymerase am Kopieren des Polynukleotid-Schwanzes hindert, indem die Fortführung der Polymerase-abhängigen Synthese gehemmt wird. Diese Modifikation ist beispielsweise am Übergang zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich des Primer- Oligonukleotids lokalisiert. Der erste Primer-Bereich des Primer-Oligonukleotids ist folglich durch eine Polymerase kopierbar, so dass eine komplementäre Sequenz zu diesem Bereich während der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes von der Polymerase erzeugt werden kann. Der Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des Primer-Oligonukleotids wird durch die Polymerase nicht kopiert.
Bestimmte Ausführungsformen des Primer-Oligonukleotids
In einer Ausführungsform wird dies durch die Modifikation im zweiten Bereich erreicht, welche die Polymerase vor dem Polynukleotid-Schwanz stoppt.
In einer weiteren Ausführungsform wird dies durch Nukleotid-Modifikationen im zweiten Bereich erreicht, wobei der gesamte Polynukleotid-Schwanz im Wesentlichen aus solchen Nukleotid- Modifikationen besteht und somit für die Polymerase unkopierbar ist.
In einer Ausführungsform ist ein jedes erstes Primer-Oligonukleotid spezifisch für je eine zu amplifizierende Nukleinsäure.
In einer Ausführungsform ist ein jedes erstes Primer-Oligonukleotid spezifisch für mindestens zwei der zu amplifizierenden Nukleinsäuren, welche jeweils im Wesentlichen unterschiedliche Sequenzen umfassen.
In einer Ausführungsform ist das erste Primer-Oligonukleotid mit einem charakteristischen Marker markiert, z.B. einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. TAMRA, Fluoreszein, Cy3, Cy5) oder einem Affinitätsmarker (z.B. Biotin, Digoxigenin) oder einem zusätzlichen Sequenzfragment, z.B. zur Bindung einer spezifischen Oligonukleotid-Sonde für die Detektion oder Immobilisierung oder zur Barcode-Markierung.
Primer- Verlängerungsprodukt:
Ein Primer-Verlängerungsprodukt (auch Primer-Extensionsprodukt genannt) entsteht durch enzymatische (Polymerase-abhängige) Verlängerung eines Primer-Oligonukleotides als Ergebnis einer matrizenabhängigen Synthese, welche durch eine Polymerase katalysiert wird. Ein Primer-Verlängerungsprodukt umfasst die Sequenz des Primer-Oligonukleotids in seinem 5'- Segment und die Sequenz des Verlängerungsproduktes (auch Extensions-Produkt genannt), welches durch eine Polymerase in matrizenabhängiger Form synthetisiert wurde. Das durch die Polymerase synthetisierte Verlängerungsprodukt ist komplementär zum Matrizenstrang, an welchem es synthetisiert wurde.
Ein spezifisches Primer-Verlängerungsprodukt (z.B. in Fig. 1 P.1 .1 -Ext oder P2.1 -Ext.) (Hauptprodukt der Amplifikation, auch die zu amplifizierende Nukleinsäurekette genannt, auch als Amplifikations-Fragment bezeichnet) umfasst Sequenzen der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette. Es ist ein Ergebnis einer spezifischen Synthese bzw. einer korrekten Ausführung einer beabsichtigten Primer-Verlängerungsreaktion bei welcher die spezifisch zu amplifizierende Nukleinsäurekette als Matrize dient.
Ein unspezifisches Primer-Verlängerungsprodukt (Nebenprodukt) umfasst beispielsweise Sequenzen, welche als Ergebnis einer unspezifischen bzw. inkorrekten bzw. nicht beabsichtigten Primer-Verlängerungsreaktion entstanden sind. Diese schließen beispielsweise Primer- Verlängerungsprodukte ein, welche als Folge eines falschen Initiierungs-Ereignisses (falsches Priming) oder als Folge anderer Nebenreaktionen, einschließlich Polymerase-abhängiger Sequenzveränderungen wie Basen-Substitution, Deletion etc., entstanden sind. Das Ausmaß an Sequenzabweichungen von unspezifischen Primer-Verlängerungsprodukten übersteigt im Allgemeinen die Fähigkeit von Controller-Oligonukleotiden, solche doppelsträngigen Nebenprodukte erfolgreich von ihren Matrizen zu verdrängen, so dass die Amplifikation von solchen Nebenprodukten langsamer verläuft oder vollständig ausbleibt. Das Ausmaß der Akzeptanz bzw. die Toleranzgrenze an Abweichungen ist abhängig beispielsweise von der Reaktionstemperatur und der Art und Weise der Sequenzabweichung. Beispiele für unspezifische Primer-Verlängerungsprodukte bilden Primer-Dimere oder Sequenzvarianten, welche nicht der zu amplifizierenden Nukleinsäure entsprechen, z.B. Sequenzen, welche keine Zielsequenz umfassen.
Die Beurteilung einer hinreichenden Spezifität der Amplifikation hängt häufig mit der Aufgabenstellung zusammen. In vielen Amplifikationsverfahren kann ein gewisses Maß der Unspezifität der Amplifikationsreaktion toleriert werden, solange das gewünschte Ergebnis erreicht werden kann.
Bestimmte Ausführungsformen des Primer-Verlängerungsprodukts
In einer Ausführungsform stimmt die Sequenz der synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte mit der zu erwartenden Sequenz einer zu amplifizierenden Nukleinsäure komplett überein.
In einer anderen Ausführungsform können Abweichungen in der erhaltenen Sequenz von der theoretisch zu erwartenden Sequenz toleriert werden.
In einer Ausführungsform liegt das Ausmaß der Übereinstimmung der erhaltenen Sequenz infolge einer Amplifikation mit der Sequenz der theoretisch zu erwartenden zu amplifizierenden Nukleinsäure beispielsweise zwischen 90 % und 100 %, insbesondere liegt die Übereinstimmung bei über 95 %, insbesondere liegt die Übereinstimmung über 98 % (gemessen am Anteil der synthetisierten Basen).
Die Länge des Verlängerungsproduktes eines spezifischen Primer-Verlängerungsproduktes kann zwischen 10 und 300 Nukleotiden liegen, in manchen Ausführungsformen zwischen 10 und 180 Nukleotiden liegen, in manchen Ausführungsformen zwischen 20 und 120 Nukleotiden, oder zwischen 30 und 80 Nukleotiden.
In einer Ausführungsform beträgt der Anteil von zu amplifizierenden Nukleinsäureketten am Gesamtergebnis der Reaktion mehr als 1 %, insbesondere mehr als 10 %, insbesondere mehr als 30 % gemessen an der Gesamtmenge an neusynthetisierten Strängen.
Die zu amplifizierende Nukleinsäurekete
Die zu amplifizierende Nukleinsäurekette stellt eine Nukleinsäurekette dar, welche sequenzspezifisch oder zumindest vorwiegend sequenzspezifisch mit Hilfe der exponentiellen Amplifikation unter Einsatz von Primern und Controller-Oligonukleotid durch die Polymerase amplifiziert werden soll.
Die zu amplifizierende Nukleinsäurekette umfasst das erste spezifische und das zweite spezifische Primer-Verlängerungsprodukt.
Die zu amplifizierende Nukleinsäurekette umfasst eine Zielsequenz bzw. ist dieser komplementär.
Die Länge der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette kann zwischen 20 und 300 Nukleotiden liegen, insbesondere zwischen 30 und 200 Nukleotiden liegen, oder zwischen 40 und 150 Nukleotiden, oder zwischen 50 und 100 Nukleotiden.
Die zu amplifizierende Nukleinsäurekette kann eine oder mehrere Zielsequenzen oder ihre Äquivalente umfassen. Weiterhin kann eine zu amplifizierende Nukleinsäurekette die im Wesentlichen zu einer Zielsequenz komplementären Sequenzen umfassen, welche mit ähnlicher Effizienz wie eine Zielsequenz in einer Amplifikationsreaktion vermehrt werden und die Zielsequenz oder ihre Abschnitte umfassen. Zusätzlich zu einer Zielsequenz kann die zu amplifizierende Nukleinsäure weitere Sequenzsegmente einschließen, beispielsweise Primer- Sequenzen, Sequenzen mit Primer-Bindungsstellen und /oder Sequenzsegmente für die Bindung von Detektions-Sonden, und / oder Sequenzsegmente für die Sequenz-Kodierung von Strängen durch Barcode-Sequenzen und / oder Sequenzsegmente für die Bindung an eine feste Phase. Die Primer-Sequenzen oder ihre Sequenzanteile, sowie Primer-Bindungsstellen oder ihre Sequenzanteile können beispielsweise zu Sequenzabschnitten einer Zielsequenz gehören.
Damit die Amplifikation starten kann, muss zu Beginn der Reaktion eine Nukleinsäurekette (Start- Nukleinsäurekette) in das Reaktionsgemisch gegeben werden, welche als initiale Matrize für die Synthese der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette auftritt. Diese Nukleinsäurekette wird als Start-Nukleinsäurekette bezeichnet. Diese Start-Nukleinsäurekette gibt die Anordnung einzelner Sequenz-Elemente vor, welche für die Bildung / Synthese / exponentielle Amplifikation einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette von Bedeutung sind.
Diese Start-Nukleinsäurekette umfasst einen unkopierbaren 5'-Bereich (Überhang), welcher in einer bestimmten Ausführungsform mit dem zweiten Primer-Bereich eines Primers identisch ist.
Eine solche Start-Nukleinsäurekette (M1 .1 oder M2.1 ) kann beispielsweise vor der Amplifikation durch eine Primer-Verlängerungsreaktion unter Verwendung eines Nukleinsäurestranges, welcher eine Zielsequenz umfasst, und einem der beiden Amplifikations-Primer (des ersten Primer- Oligonukleotides, Fig. 9 und 10, oder des zweiten Primer-Oligonukleotides, Flg. 13 und 20) sowie einer geeigneten Polymerase und Substrate (dNTP) hergestellt werden. Nach Überführung einer solch hergestellten Start-Nukleinsäurekette in eine einzelsträngige Form (z.B. durch Hitzedenaturierung oder Alkali-Denaturierung oder enzymatischem Abbau von Zielsequenz, z.B. via RNasen) kann eine solche Start-Nukleinsäurekette als initiale Matrize zum Start der Reaktion gegeben werden.
In anfänglichen Stadien der Amplifikationsreaktion und in ihrem weiteren Verlauf binden die jeweiligen Primer an die entsprechenden Bindungsstellen in der Start-Nukleinsäurekette und initiieren die Synthese von spezifischen Primer-Verlängerungsprodukten. Solche spezifischen Primer-Verlängerungsprodukte akkumulieren im Verlauf der Amplifikation in exponentieller Art und Weise und übernehmen zunehmend die Rolle von Matrizen für die Synthese komplementärer Primer-Verlängerungsprodukte bei einer exponentiellen Amplifikation.
Durch die wiederholten matrizenabhängigen Synthese-Vorgänge im Rahmen einer exponentiellen Amplifikation wird somit die zu amplifizierende Nukleinsäurekette gebildet.
Gegen Ende einer Amplifikationsreaktion kann das Hauptprodukt der Reaktion (die zu amplifizierende Nukleinsäure) vorwiegend einzelsträngig sein oder vorwiegend einen komplementären Doppelstrang bilden. Dies kann beispielsweise durch die relative Konzentration von beiden Primern und entsprechende Reaktionsbedingungen bestimmt werden.
Äquivalente der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette umfassen Nukleinsäuren mit im Wesentlichen identischen Informationsgehalt. Beispielsweise haben komplementäre Stränge einer zu amplifizierenden Nukleinsäure identischen Informationsgehalt und können als äquivalent bezeichnet werden.
Bestimmte Ausführungsformen der zu amplifizierenden Nukleinsäure
In einer Ausführungsform umfasst eine zu amplifizierende Nukleinsäure eine Zielsequenz. In einer Ausführungsform entspricht die Zielsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure. In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Start-Nukleinsäurekette eine Zielsequenz. In einer Ausführungsform entspricht die Zielsequenz einer Start-Nukleinsäurekette.
In einer anderen Ausführungsform bildet die Zielsequenz (Fig. 18 und 19) einen Teil der Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette. Eine solche Zielsequenz kann von 3'-Seite und / oder von 5'-Seite von weiteren Sequenzen flankiert sein. Diese weiteren Sequenzen können beispielsweise Bindungsstellen für Primer oder ihre Anteile umfassen, und / oder Primer- Sequenzen oder ihre Anteile umfassen, und/ oder Bindungsstellen für Detektions-Sonden umfassen, und / oder Adaptor-Sequenzen für komplementäre Bindung an eine feste Phase (z.B. Im Rahmen von Microarrays, oder Bead-basierten Analysen) umfassen und / oder Barcoding- Sequenzen für eine digitale Signatur von Sequenzen umfassen.
In einer Ausführungsform entspricht die initiale Matrize (Start-Nukleinsäurekette), welche einer Amplifikationsreaktion zu Beginn zugeführt wird, bzw. welche in das Reaktionsgemisch gegeben wird, der Sequenz-Zusammensetzung der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette.
Zielsequenz
Eine Zielsequenz ist in einer Ausführungsform ein Segment einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette, welches als charakteristische Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure dienen kann. Diese Zielsequenz kann als Marker für die Anwesenheit oder Abwesenheit einer anderen Nukleinsäure dienen. Diese andere Nukleinsäure dient somit als Quelle der Zielsequenz und kann beispielsweise eine genomische DNA oder RNA oder Teile der genomischen DNA oder RNA (z.B. mRNA), oder Äquivalente der genomischen DNA oder RNA eines Organismus sein (z.B. cDNA, modifizierte RNA wie rRNA, tRNA, microRNA etc.), oder definierte Veränderungen der genomischen DNA oder RNA eines Organismus umfassen, beispielsweise Mutationen (z.B. Deletionen, Insertionen, Substitutionen, Additionen, Sequenzvermehrung, z.B. Repeat- Vermehrung im Rahmen von Mikrosatellit-Instabilität), Splice-Varianten, Rearrangement-varianten (z.B. T-Ze II- Rezeptor Varianten) usw. Die einzelnen Zielsequenzen können für ein phänotypisches Merkmal stehen, beispielsweise für Antibiotika-Resistenz oder prognostische Information haben und somit für diagnostische Assays / Tests von Interesse sein. Als Quelle / Ursprung einer Zielsequenz kann eine solche Nukleinsäure beispielsweise die Zielsequenz als Sequenz-Element ihres Stranges umfassen. Eine Zielsequenz kann somit als charakteristischer Marker für einen bestimmten Sequenzinhalt einer anderen Nukleinsäure dienen.
Die Zielsequenz kann einzelsträngig oderdoppelsträngig sein. Sie kann mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure im Wesentlichen identisch sein oder nur einen Teil der zu amplifizierenden Nukleinsäure darstellen.
Äquivalente der Zielsequenz umfassen Nukleinsäuren mit im Wesentlichen identischen Informationsgehalt. Beispielsweise haben komplementäre Stränge einer Zielsequenz identischen Informationsgehalt und können als äquivalent bezeichnet werden, RNA und DNA Varianten einer Sequenz sind ebenfalls Beispiele für äquivalenten Informationsgehalt.
Im Rahmen der Material-Vorbereitung vor der Amplifikations-Reaktion kann eine solche Zielsequenz aus ihrer ursprünglichen Sequenzumgebung isoliert werden und für die Amplifikationsreaktion vorbereitet werden. Start-Nukleinsäurekette (Fig. 9 und 10, 13 und 20)
Damit die Amplifikation starten kann, muss zu Beginn der Reaktion eine Nukleinsäurekette im Reaktionsgemisch anwesend sein, welche als initiale Matrize für die Synthese der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette auftritt. Diese Nukleinsäurekette wird als Start- Nukleinsäurekette bezeichnet. Diese Start-Nukleinsäurekette gibt die Anordnung einzelner Sequenz-Elemente vor, welche für die Bildung / Synthese / exponentielle Amplifikation einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette von Bedeutung sind.
Eine solche Start-Nukleinsäurekette kann einzelsträngig oder doppelsträngig zu Beginn der Reaktion vorliegen. Wenn die komplementären Stränge der Start-Nukleinsäurekette voneinander getrennt sind, können die Stränge unabhängig davon, ob die Nukleinsäure ursprünglich doppel- oder einzelsträngig vorlag, als Matrize für die Synthese von spezifischen komplementären Primer- Verlängerungsprodukten dienen.
Controller-Oligonukleotid
Das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 und C2.1 ) ist eine einzelsträngige Nukleinsäurekette, welche eine im Wesentlichen zu einem Teil eines Primer-Verlängerungsprodukts komplementäre Sequenz einschließt, welches im Rahmen der Amplifikation der zu amplifizierenden Nukleinsäure spezifisch generiert wird. Dadurch kann das Controller-Oligonukleotid an das erste Primer-Oligonukleotid und mindestens an das 5'-Segment des spezifischen Verlängerungsprodukts des ersten Primer- Oligonukleotid im Wesentlichen komplementär binden.
In der vorliegenden Erfindung werden mindestens zwei Controller-Oligonukeotide verwendet, wobei jedes an sein Primer-Verlängerungsprodukt sequenzspezifisch binden kann. Das erste Controller-Oligonukleotid interagiert spezifisch mit dem ersten Primer-Oligonukleotid und mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt. Das zweite Controller-Oligonukleotid interagiert spezifisch mit dem zweiten Primer-Oligonukleotid und mit dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt.
Zwar unterscheiden sich die beiden verwendeten Controller-Oligonukleotide voneinander, der prinzipielle Aufbau eines Controller-Oligonukleotides ist dennoch bei beiden verwendeten Controller-Oligonukleotiden gleich. Zur Vereinfachung der Darstellung wird daher das erste Controller-Oligonukleotid erklärt. Der Aufbau des zweiten Controller-Oligonukleotides kann entsprechend diesen Angaben angepasst werden.
Das erste Controller-Oligonukleotid kann an das erste Primer-Oligonukleotid und mindestens an das 5'-Segment des spezifischen Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotids im Wesentlichen komplementär binden.
Das Controller-Oligonukleotid umfasst in seinem inneren Sequenzsegment Nukleotid- Modifikationen, welche die Polymerase daran hindern, einen komplementären Strang unter Verwendung des Controller-Oligonukleotids als Matrize zu synthetisieren, wenn das erste Primer- Oligonukleotid an das Controller-Oligonukleotid komplementär gebunden ist. Das Controller-Oligonukleotid ist weiterhin in der Lage, unter den gewählten Reaktionsbedingungen das jeweilige zweite spezifische Primer-Verlängerungsprodukt vollständig oder teilweise aus der Bindung mit dem ersten spezifischen Primer-Verlängerungsprodukt via Strangverdrängung zu verdrängen. Dabei lagert sich das Controller-Oligonukleotid mit seinen komplementären Bereichen an das erste spezifische Primer-Verlängerungsprodukt an. Bei erfolgreicher Bindung zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem ersten spezifischen Primer-Verlängerungsprodukt führt dies zur Wiederherstellung eines einzelsträngigen Zustandes des 3 '-ständigen Segments des zweiten spezifischen Primer-Verlängerungsproduktes, welches für die Bindung des ersten Primer-Oligonukleotides geeignet ist, so dass eine neue Primer- Verlängerungsreaktion stattfinden kann. Während der Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes kann das Controller-Oligonukleotid aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt mittels Strangverdrängung beispielsweise durch die Polymerase und/oder durch das zweite Primer-Oligonukleotid getrennt werden.
Detaillierte Beschreibung bestimmter Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur exponentiellen Amplifikation von DNA, welche eine Sequenzkontrolle bzw. Sequenzüberprüfung während der Amplifikation über Teilsegmente des zu amplifizierenden Fragments mittels Controller-Oligonukleotide beinhaltet. Dadurch kann eine verbesserte Spezifität der exponentiellen Amplifikationsreaktion erreicht werden. Nur Sequenzen, welche mit den vordefinierten Controllersequenzen übereinstimmen, werden amplifiziert. Die Sequenzüberprüfung erfolgt nicht über die Gesamtlänge des zu amplifizierenden DNA- Fragmentes. Mittlere Abschnitte (Strang Segmente, welche mit keinem der Controller-Oligonukleotide interagieren) können in ihrer Sequenzzusammensetzung und Sequenzlänge variieren.
Damit wird eine Möglichkeit geschaffen, Sequenzabweichungen zu vervielfältigen, auch wenn diese nicht genau bekannt sind, z.B. SNV und InDels in Hotspots (wie KRAS Codon 12, EGFR Deletionen / Insertionen in Exon 19 und 21 ).
Das erfindungsgemäße Verfahren startet mit der Verlängerung zweier Primer. Unmittelbar nach der Synthese liegt das Amplifikations-Fragment in doppelsträngiger Form vor. Dieser Doppelstrang ist unter den Reaktionsbedingungen stabil und kann nicht spontan dissoziieren oder diese spontane Dissoziation erfolgt sehr langsam.
In doppelsträngiger Form des zu amplifizierenden Fragmentes liegen Primer-Bindungs- Sequenzsegmente ebenfalls in doppelsträngiger Form vor und sind somit für die Bindung von einzelsträngigen Primern nicht zugängig. Somit können Amplifikations-Fragmente mit Primerbindungsstellen in doppelsträngiger Form nicht als Matrizen für die spezifische Sequenzsynthese auftreten. Somit stellt die doppelsträngige Form eine inerte Form des Amplifikations-Fragments dar. Für eine spezifische exponentielle Amplifikation sollen die synthetisierten Sequenz-Fragmente in folgenden Synthese-Zyklen als Matrizen dienen. Als Voraussetzung dafür muss das synthetisierte Amplifikations-Fragment aus seiner doppelsträngigen Form zumindest teilweise in einzelsträngige Form überführt werden, wobei zumindest die Primer-Bindungsstellen in einzelsträngiger Form vorliegen müssen und damit in der Lage sein, Primer zu binden, welche eine Synthese initiieren können.
Eine Doppelstrang-Öffnung erfolgt unter Mitwirkung von zwei Controller-Oligonukleotiden, welche komplementäre Sequenzen zu endständigen Bereichen des zu amplifizierenden Fragmentes umfassen. Damit sind die Controller-Oligonukleotide in der Lage, eine Bindung mit einem Sequenzsegment des synthetisierten Stranges einzugehen und einen Doppelstrang zu bilden. Insbesondere werden dabei Primer-Bindungs-Stellen in einzelsträngige Form überführt und können somit neue Primer binden.
Die Voraussetzung für die Öffnung des Doppelstranges des zu amplifizierenden Fragmentes ist insbesondere eine Sequenzübereinstimmung mit den jeweiligen Controller-Sequenzen. Damit erfolgt nach jedem Synthese-Schritt eine Sequenz-Überprüfung von Segmenten des synthetisierten Fragmentes bevor das synthetisierte Fragment aus einer doppelsträngigen Form in eine einzelsträngige Form überführt wird. Die Sequenz-Überprüfung erfolgt über die Primer-Länge hinaus (ca. 5 - 50 Nukleotide des synthetisierten Abschnittes) und unterscheidet sich somit von üblichen Amplifikationsverfahren, wo nur die Primer-Sequenz für die sequenzspezifische Bindung verantwortlich ist.
Ein mittleres Sequenz-Segment (P1 .1 E3 und P2.1 E3 Fig. 10 und 13) des synthetisierten Fragmentes wird in einer Ausführungsform von Controllern nicht überprüft. Während beide Controller-Oligonukleotide mit synthetisierten Strängen einen Doppelstrang gebildet haben, verbleibt somit das mittlere Sequenzsegment des synthetisierten Stranges in doppelsträngiger Form. Die T rennung dieses doppelsträngigen Segmentes (Dissoziation der doppelsträngigen Form in einzelsträngige Form) kann beispielsweise durch die Wahl der Temperatur begünstig werden. Besonders bei sehr kurzen Längen (von weniger als 10 Nukleotiden) dieses Fragments erfolgt die Strangtrennung rasch unter Reaktionsbedingungen (z.B. 55°C oder 65°C).
Durch das Zusammenspiel der beiden Controller-Oligonukleotide und der temperaturabhängigen Trennung des mittleren Segmentes erfolgt eine dauerhafte Trennung des synthetisierten Doppelstranges in eine einzelsträngige Form. Dabei verbleiben die jeweiligen Controller- Oligonukleotide an komplementären Teilen des jeweiligen Stranges und bilden somit einen Doppelstrang. In einem anschließend erfolgenden Synthese-Schritt durch die Polymerase werden die Controller-Stränge durch die Polymerase während der Synthese eines komplementären Stranges verdrängt, so dass ein neuer synthetisierter Strang gebildet werden kann. Die verwendeten Polymerasen sind somit in der Lage, Controller-Oligonukleotide aus ihrer Bindung mit komplementären Segmenten des zu amplifizierenden Fragmentes zu verdrängen. Insbesondere erfolgt die Amplifikation als exponentielle Amplifikation, bei welcher neusynthetisierte Produkte beider Primer (Primer-Verlängerungsprodukte) als Matrizen für weitere Syntheseschritte auftreten. Dabei werden Primersequenzen zumindest teilweise kopiert, so dass komplementäre Primer-Bindungsstellen entstehen, welche unmittelbar nach ihrer Synthese als Sequenzsegmente eines Doppelstranges vorliegen.
Im Amplifikationsverfahren erfolgen Synthese-Schritte von beiden Strängen und Doppelstrang- Öffnungs-Schritten der neusynthetisierten Sequenzabschnitte in gegenseitiger Abwechslung. Eine hinreichende Doppelstrang-Trennung nach einer Synthese stellt eine wichtige Voraussetzung für die weitere Synthese dar. Insgesamt kann eine solche Abwechslung aus Synthese- und Doppelstrang-Trennungsschritten zu einer exponentiellen Amplifikation führen.
Im erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren erfolgt die Doppelstrang-Öffnung von Hauptprodukten der Amplifikation (Amplifikation von Zielsequenz umfassenden Nukleinsäureketten) unter anderem mittels eines Oligonukleotides, genannt Controller- Oligonukleotid. Das Controller-Oligonukleotid umfasst Sequenzsegmente, welche der Zielsequenz entsprechen.
Im Einzelnen wird die Strangtrennung erfindungsgemäß durch den Einsatz von Controller- Oligonukleotiden mit vordefinierten Sequenzen erreicht, welche insbesondere mittels einer sequenzabhängigen nukleinsäurevermittelten Strangverdrängung einen neusynthetisierten Doppelstrang bestehend aus beiden spezifischen Primer-Verlängerungsprodukten trennen. Die dabei entstehenden einzelsträngigen Segmente von Primer-Verlängerungsprodukten umfassen die Zielsequenz, sowie entsprechende Primer-Bindungsstellen, welche als Bindungsstellen für weitere Primer-Oligonukleotide dienen können, so dass eine exponentielle Amplifikation von zu amplifizierenden Nukleinsäureketten erreicht wird. Die Primer-Verlängerungsreaktionen und Strangverdrängungsreaktionen finden insbesondere im Ansatz gleichzeitig statt. Die Amplifikation erfolgt insbesondere unter Reaktionsbedingungen, welche eine spontane Trennung von beiden spezifischen synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten nicht zulassen.
Eine spezifische exponentielle Amplifikation einer Zielsequenz-umfassenden Nukleinsäurekette umfasst eine Wiederholung aus Synthese-Schritten und Doppelstrang-Öffnungs-Schritten (Aktivierungs-Schritten für Primer-Bindungsstellen) als zwingende Voraussetzung für die Vermehrung der Nukleinsäurekette.
Die Öffnung von synthetisierten Doppelsträngen wird als Reaktions-Schritt umgesetzt, welcher sequenzspezifisch durch das Controller-Oligonukleotid beeinflusst werden soll. Diese Öffnung kann vollständig erfolgen, bis hin zur Dissoziation von beiden komplementären Primer- Verlängerungsprodukten, oder auch partiell sein.
Das Controller-Oligonukleotid umfasst erfindungsgemäß Sequenzabschnitte, welche mit der Zielsequenz interagieren können und weitere Sequenzabschnitte, welche diese Interaktion herbeiführen, bzw. ermöglichen, bzw. begünstigen. Im Rahmen der Interaktion mit dem Controller- Oligonukleotid werden doppelsträngige Abschnitte der synthetisierten Primer- Verlängerungsprodukte via sequenzspezifischer Strangverdrängung in eine einzelsträngige Form überführt. Dieser Vorgang ist sequenzabhängig: erst wenn die Sequenz des synthetisieren Doppelstranges ein gewisses Maß an Komplementarität mit der entsprechenden Sequenz des Controller-Oligonukleotides aufweist, kommt es zu einer hinreichenden Doppelstrang-Öffnung, so dass die für die Fortführung der Synthese wesentlichen Sequenzabschnitte, wie z.B. Primer- Bindungsstellen, in einzelsträngige Form überführt werden, was einem "aktiven Zustand" entspricht. Das Controller-Oligonukleotid "aktiviert" somit spezifisch die neusynthetisierten Primer- Verlängerungsprodukte, welche die Zielsequenz umfassen, für weitere Synthese-Schritte.
Hingegen werden Sequenzabschnitte, welche keine Zielsequenz umfassen, nicht in einen einzelsträngigen Zustand überführt und verbleiben als Doppelstrang, was einem "inaktiven" Zustand entspricht. Die potenziellen Primerbindungsstellen sind in einem solchen Doppelstrang an der Interaktion mit neuen Primern benachteiligt bzw. vollständig gehindert, so dass weitere Synthese-Schritte an solchen "nicht aktivierten" Strängen im Allgemeinen nicht stattfinden. Diese fehlende oder verminderte Aktivierung (d.h. Überführung in einen einzelsträngigen Zustand) von synthetisierten Nukleinsäuresträngen nach einem Synthese-Schritt führt dazu, dass im darauffolgenden Synthese-Schritt nur eine verminderte Menge an Primern an einer Primer- Verlängerungsreaktion erfolgreich teilnehmen kann.
Aufgrund einer anzustrebenden exponentiellen Amplifikation von Hauptprodukten (einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette, welche Zielsequenzen umfasst) werden mehrere Synthese- Schritte und Aktivierungs-Schritte (Doppelstrang-Öffnungs-Schritte) zu einem Amplifikations- Verfahren zusammengefasst und so lange ausgeführt, bzw. so oft wiederholt, bis die gewünschte Menge der spezifischen Nukleinsäurekette bereitgestellt ist.
Die Reaktionsbedingungen (z.B. Temperatur) werden dabei derart gestaltet, dass eine spontane Trennung von komplementären Primer- Verlängerungsprodukten in Abwesenheit eines Controller- Oligonukleotids unwahrscheinlich oder signifikant verlangsamt ist.
Die anzustrebende Erhöhung der Spezifität einer Amplifikation resultiert somit aus der Sequenzabhängigkeit der Trennung von komplementären Primer- Verlängerungsprodukten, welche eine Zielsequenz umfassen: das Controller-Oligonukleotid ermöglicht bzw. begünstigt diese Doppelstrang-Trennung als Folge der Übereinstimmung seiner Sequenzabschnitte mit vorgegebenen Sequenzabschnitten der Primer-Verlängerungsprodukte. Diese Übereinstimmung wird nach jedem Synthese-Zyklus durch das Controller-Oligonukleotid überprüft. Die exponentielle Amplifikation resultiert als Folge aus erfolgreichen Wiederholungen aus Synthese-Vorgängen und sequenzspezifischen Strangverdrängungen durch das Controller-Oligonukleotid, d.h. "Aktivierungen" (Doppelstrang-Öffnungen / Doppelstrang-Trennungen / Strangverdrängungs- Vorgängen resultierend in einzelsträngiger Form von entsprechenden Primer-Bindungsstellen) von neusynthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten. Die Gestaltung von Controller-Oligonukleotid und den Reaktionsbedingungen führt dazu, dass die Interaktion des Controller-Oligonukleotids mit unspezifischen Primer-Verlängerungsprodukten anders abläuft. Aufgrund unzureichender Komplementarität zwischen Controller-Oligonukleotid und einem unspezifischen Primer-Verlängerungsprodukt kommt es nicht zu einer hinreichenden Doppelstrang-Trennung / Strangverdrängung von einem solchen unspezifischen Primer- Verlängerungsprodukt von seinem Matrizenstrang. Das unspezifische Produkt bleibt somit vorwiegend in einem "inaktiven", doppelsträngigen Zustand.
Der Einsatz von vordefiniertem Controller-Oligonukleotid ermöglicht somit eine sequenzabhängige Überprüfung der Inhalte von Primer-Verlängerungsprodukten zwischen einzelnen Synthese- Schritten während der exponentiellen Amplifikation und Herbeiführung einer Selektion bzw. einer Auswahl von Sequenzen für nachfolgende Synthese-Schritte. Dabei kann zwischen "aktiven", einzelsträngigen Zuständen von neusynthetisierten spezifischen Primer-Verlängerungsprodukten als Folge einer erfolgreichen Interaktion mit einem Controller-Oligonukleotid, und "inaktiven" doppelsträngigen Zuständen von neusynthetisierten unspezifischen Primer- Verlängerungsprodukten als Folge einer mangelhaften und / oder unzureichenden und /oder verminderten und / oder verlangsamten Interaktion mit einem Controller-Oligonukleotid unterschieden werden.
Für eine exponentielle Amplifikation ergeben sich daraus folgende Effekte:
Unter nicht-denaturierenden Bedingungen erfolgt die Trennung von spezifisch synthetisierten Strängen unter Mitwirkung von Controller-Oligonukleotid.
Eine exponentielle Amplifikation von Zielsequenz-umfassenden Nukleinsäureketten erfolgt sequenzkontrolliert (Hauptreaktion). Diese Sequenz-Kontrolle erfolgt nach jedem Synthese-Schritt und schließt Sequenzsegmente ein, welche zwischen Primern liegen und eine Zielsequenz umfassen. Die erfolgreiche Überprüfung des Ergebnisses der Synthese nach jedem Synthese- Schritt resultiert in der Trennung von beiden spezifischen Primer-Verlängerungsprodukten, was die Voraussetzung für weitere spezifische Synthese-Schritte darstellt.
Während der Amplifikation kann eine initiale Entstehung / Generierung von unspezifischen Primer- Verlängerungsprodukten nicht prinzipiell ausgeschlossen werden (Nebenprodukte). Aufgrund einer Matrizenabhängigkeit liegen solche unspezifischen Primer-Verlängerungsprodukte unmittelbar nach ihrer Synthese in der Regel in doppelsträngiger Form vor. Die Interaktion mit dem Controller-Oligonukleotid bleibt allerdings entweder vollständig aus oder ist eingeschränkt, so dass es nicht zu einer Strangtrennung kommt oder die Strangtrennung verlangsamt gegenüber der Hauptreaktion ist. Die Übertragung einer fehlerhaften Sequenzinformation von einem Synthese- Zyklus auf den nächsten findet somit nicht statt.
Durch die Wahl der Reaktions-Bedingungen und die Gestaltung von Controller-Oligonukleotid ist es somit möglich, einen gezielten Einfluss auf die Effizienz der Regenerierung von korrekten Nukleinsäureketten-Matrizen zwischen einzelnen Synthese-Schritten im Rahmen eines Amplifikationsverfahrens auszuüben. Im Allgemeinen, je höher das Maß der Übereinstimmung der synthetisierten Sequenz mit der vorgegebenen Sequenz des Controller-Oligonukleotids ist, umso erfolgreicher ist die Trennung der synthetisierten Produkte, umso erfolgreicher ist die Regenerierung von korrekten Matrizen von einem Synthese-Schritt zum nächsten. Umgekehrt führt eine Sequenz-Abweichung bei Nebenprodukten zu einer insuffizienten Regenerierung von Matrizensträngen und somit zu einer Verlangsamung der Synthese-Initiierung bzw. zur Reduzierung der Ausbeute in jedem nachfolgenden Zyklus. Die gesamte exponentielle Amplifikation von Nebenprodukten verläuft entweder langsamer oder findet gar nicht statt und / oder bleibt auf einem nicht detektierbaren Niveau.
Unter Reaktionsbedingungen, welche einen Doppelstrang nicht denaturieren, führt die Verwendung der sequenzabhängigen nukleinsäurevermittelten Strangverdrängung zur sequenzspezifischen Trennung der beiden Primer- Verlängerungsprodukte während der Amplifikationsreaktion im beschriebenen Verfahren: eine hinreichende Komplementarität zwischen neusynthetisierten Verlängerungsfragmenten der Primer-Oligonukleotide mit der zu Beginn einer Amplifikation vorgegebenen Sequenz eines Controller-Oligonukleotids stellt eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Strangverdrängung dar und kann somit Einfluss auf die Effizienz der Strangtrennung eines Doppelstranges (bestehend aus dem ersten und dem zweiten Primer- Verlängerungsprodukt) haben. Bei geringfügigen Abweichungen kommt es zu einer Verlangsamung der Strangverdrängung und somit auch zur Verlangsamung der Strangtrennung. Diese kann sich in einer Verlangsamung der Gesamtreaktion auswirken. Mit steigender Differenz in der Sequenz der neusynthetisierten Verlängerungsprodukte und der zu Beginn der Reaktion vorgegebenen Sequenz des Controller-Oligonukleotids kommt es zu einer immer höheren Hinderung der Strangverdrängung, welche im Endeffekt keine ausreichende Trennung von beiden Primer-Verlängerungsprodukten mehr leisten kann. Die beiden neu synthetisierten Stränge können nicht mehr ausreichend voneinander getrennt werden, so dass ihre Bindungsstellen für Primer- Oligonukleotide nicht mehr zugängig sind. Das führt im Allgemeinen zum Abbruch einer Amplifikation von Sequenzen mit Sequenzabweichungen.
Die Ausführung eines Amplifikationsverfahrens unter Verwendung von nur einem Controller- Oligonukleotid wurde in der PCT Anmeldung PCT/EP2017/07101 1 und der europäischen Anmeldung 16185624.0 bereits beschrieben. Zwar werden in der vorliegenden Anmeldung zwei verschiedene Controller-Oligonukleotide verwendet, dennoch sind Mechanismen einer sequenzabhängigen Strang-Verdrängung durch einen Controller sehr ähnlich. Zu Details der Ausführung einer Amplifikation mit nur einem Controller wird der Fachmann an diese Anmeldung verwiesen.
Nachfolgend sind einige vorteilhafte Ausführungsformen für Reaktionsbedingungen und einzelne Komponenten der Amplifikations-Reaktion genannt. Dabei wird vor allem der Aufbau eines Primers (am Beispiel eines ersten Primers), sowie der Aufbau eines zu diesem Primer korrespondierenden Controller-Oligonukleotids erläutert. Ausführungsformen für Polymerasen:
Das die Nukleinsäure-Synthese induzierende Agens kann eine Enzyme einschließende Verbindung oder ein System sein, das so wirkt, dass dadurch die Synthese der Primer- Verlängerungsprodukte bewirkt wird.
Geeignete Enzyme für die Amplifikation für diesen Zweck umfassen z.B. DNA-Polymerasen wie Bst Polymerase und ihre Modifikationen, Vent Polymerase und andere - insbesondere hitzestabile - DNA-Polymerasen, die den Einbau der Nukleotide in der korrekten Weise ermöglichen, wodurch die Primer-Verlängerungsprodukte gebildet werden, die zu jedem synthetisierten Nukleinsäurestrang komplementär sind. Im Allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert und schreitet dann in 5'- Richtung entlang des Matrizenstranges fort, bis die Synthese beendet ist oder unterbrochen wird.
In bestimmten Ausführungsformen werden matrizenabhängige DNA-Polymerasen in der ersten Amplifikation verwendet, welche zur Strangverdrängung fähig sind. Dazu zählen beispielsweise das große Fragment der Bst Polymerase oder ihre Modifikationen (z.B. Bst 2.0 DNA Polymerase), Klenow Fragment, Vent exo minus Polymerase, Deepvent exo minus DNA Polymerase, großes Fragment der Bsu DNA Polymerase, großes Fragment der Bsm DNA Polymerase.
In einer Ausführungsform werden Polymerasen eingesetzt, welche keine 5'-3'-Exonuklease- Aktivität aufweisen, bzw. keine 5'-3'-FEN-Aktivität aufweisen.
Die Desoxyribonukleosid-Triphosphate (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP und TTP (oder dUTP, oder dUTP/TTP-Gemisch) werden in adäquaten Mengen zum Synthesegemisch gegeben. In einer Ausführungsform können zusätzlich zu dNTPs mindestens eine weitere Art von dNTP-Analoga zum Synthesegemisch zugegeben werden. Diese dNTP-Analoga umfassen in einer Ausführungsform beispielsweise eine charakteristische Markierung (z.B. Biotin oder Fluoreszenzfarbstoff), so dass wenn in einen Nukleinsäurestrang eingebaut, auch diese Markierung in den Nukleinsäurestrang integriert ist. In einer anderen Ausführungsform umfassen diese dNTP-Analoga mindestens eine Modifikation des Zucker-Phosphat-Anteils des Nukleotids, z.B. alpha-Phosphorothioat-2'-Desoxyribonukleosid-Triphosphate (oder andere Modifikationen, welche einem Nukleinsäurestrang eine Nuklease-Resistenz verleihen), 2',3'-Dideoxy- Ribonukleosid-Triphosphate, Azyklo-Nukleosid-Triphosphate (oder andere zur Termination einer Synthese führende Modifikationen). In einer weiteren Ausführungsform umfassen diese dNTP- Analoga mindestens eine Modifikation einer Nukleobase, z.B. Iso-Cytosine, Iso-Guanosine (oder auch andere Modifikationen der Nukleobasen des erweiterten genetischen Alphabets), 2-Amino- Adenosine, 2-Thiouridine, Inosine, 7-deazy-adenosine, 7-deaza-guanosine, 5-Me-Cytosine, 5- Propyl-Uridine, 5-Propyl-Cytosine (oder auch andere Modifikationen von Nukleobasen, welche gegenüber natürlichen Nukleobasen durch eine Polymerase eingebaut werden können und zur Änderung der Strang-Stabilität führen). In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein dNTP- Analog sowohl eine Modifikation der Nukleobase als auch eine Modifikation des Zucker-Phosphat- Anteils. In einer weiteren Ausführungsform wird statt mindestens eines natürlichen dNTP- Substrates mindestens eine weitere Art von dNTP-Analoga zum Synthesegemisch zugegeben.
Strangverdrängung (Strand Displacement):
Hiermit wird ein Vorgang bezeichnet, welcher durch Einwirkung eines geeigneten Mittels zu einer vollständigen oder partiellen Trennung eines ersten Doppelstranges (bestehend beispielsweise aus A1 und B1 -Strang) führt, und zur gleichzeitigen / parallelen Ausbildung eines neuen zweiten Doppelstranges, wobei mindestens einer der Stränge (A1 oder B1 ) an der Ausbildung dieses neuen zweiten Stranges beteiligt sind. Man kann hier zwei Formen der Strangverdrängung unterschieden.
In einer ersten Form der Strangverdrängung kann die Ausbildung eines neuen zweiten Doppelstranges unter Verwendung eines bereits existierenden komplementären Stranges erfolgen, welcher zu Beginn der Reaktion im Allgemeinen in einzelsträngiger Form vorliegt. Dabei wirkt das Mittel der Strangverdrängung (beispielsweise ein vorgebildeter einzelsträngiger Strang C1 , welcher eine komplementäre Sequenz zum Strang A1 aufweist, auf den ersten bereits ausgebildeten Doppelstrang (A1 und B1 ) und geht mit dem Strang A1 eine komplementäre Bindung ein, wodurch der Strang B1 aus der Bindung mit dem Strang A1 verdrängt wird. Falls die Verdrängung des B1 vollständig abläuft, so ist das Ergebnis der C1 -Wirkung ein neuer Doppelstrang (A1 :C1 ) und ein einzelsträngiger Strang B1 . Falls die Verdrängung von B1 unvollständig abläuft, so hängt das Ergebnis von mehreren Faktoren ab. Beispielsweise kann ein Komplex aus partiell doppelsträngigen A1 :B1 und A1 :C1 als Zwischenprodukt vorliegen.
In einer zweiten Form der Strangverdrängung kann die Ausbildung eines neuen zweiten Doppelstranges unter einer gleichzeitig ablaufenden enzymatischen Synthese des komplementären Stranges erfolgen, wobei ein Strang des ersten vorgebildeten Doppelstranges als Matrize für die Synthese durch die Polymerase auftritt. Dabei wirkt das Mittel der Strangverdrängung (beispielsweise eine Polymerase mit einer Strangverdrängungs-Fähigkeit), auf den ersten bereits vorgebildeten Doppelstrang (A1 und B1 ) und synthetisiert einen zu Strang A1 komplementären neuen Strang D1 , wobei gleichzeitig der Strang B1 aus der Bindung mit dem Strang A1 verdrängt wird.
Unter dem Begriff „nukleinsäurevermittelte Strang-Verdrängung" wird eine Summe / Reihe von Zwischenschritten zusammengefasst, welche untereinander im Gleichgewicht stehen können, und im Ergebnis zur vorübergehenden oder dauerhaften Öffnung einer ersten vorgeformten Duplex (bestehend aus komplementären Strängen A1 und B1 ) und Ausbildung einer neuen zweiten Duplex (bestehend aus komplementären Strängen A1 und C1 ) führen, wobei A1 und C1 zueinander komplementär sind.
Es ist bekannt, dass eine wesentliche strukturelle Voraussetzung für die Initiierung einer Strangverdrängung die Herbeiführung einer räumlichen Nähe zwischen einem Duplex-Ende (vorgeformter erster Duplex aus A1 und B1 ) und einem einzelsträngigen Strang (C1 ) ist, welcher die Strangverdrängung initiiert (wobei A1 und C1 einen komplementären Strang bilden können). Eine solche räumliche Nähe kann insbesondere mittels eines einzelsträngigen Überhanges (in der Literatur sind Beispiele mit kurzen Überhängen bekannt, im Englischen genannt "Toehold", siehe Literatur oben) herbeigeführt werden, welcher den einzelsträngigen Strang (C1 ) vorübergehend oder dauerhaft komplementär bindet, und somit komplementäre Seqmente des Stranges C1 und A1 in hinreichende Nähe bringt, so dass eine erfolgreiche Strangverdrängung des Stranges B1 initiiert werden kann. Die Effizienz der Initiierung der nukleinsäurevermittelten Strang-Verdrängung ist im Allgemeinen um so höher, je näher die komplementären Segmente des Stranges A1 und C1 zueinander positioniert werden.
Eine weitere wesentliche strukturelle Voraussetzung für die effiziente Fortführung einer nukleinsäurevermittelten Strangverdrängung in inneren Segmenten liegt in hoher Komplementarität zwischen Strängen (z.B. zwischen A1 und C1 ), welche einen neuen Doppelstrang ausbilden müssen. So können beispielsweise einzelne Nukleotid-Mutationen (in C1 ) zur Unterbrechung einer Strangverdrängung (beschrieben z.B. für Branch-Migration) führen.
Die vorliegende Erfindung macht Gebrauch von der Fähigkeit komplementärer Nukleinsäuren zu einer sequenzabhängigen nukleinsäurevermittelten Strangverdrängung.
Besondere Ausführungsformen der Erfindung werden in den Figuren und Beispielen näher erläutert.
Ausführungsformen für Reaktionsbedingungen:
Reaktionsbedingungen für die erste Amplifikation
Reaktionsbedingungen umfassen unter anderem Puffer-Bedingungen, Temperatur-Bedingungen, Zeitdauer der Reaktion und Konzentrationen von jeweiligen Reaktionskomponenten.
Im Verlauf der Reaktion akkumuliert die Menge der spezifischen produzierten zu amplifizierenden Nukleinsäure in einer exponentiellen Weise. Die Reaktion umfassend die Synthese der Verlängerungsprodukte kann zur Produktion der gewünschten Menge der spezifischen Nukleinsäuresequenz so lange wie nötig durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird insbesondere kontinuierlich durchgeführt. In einer Ausführungsform läuft die Amplifikations- Reaktion bei gleicher Reaktionstemperatur ab, wobei die Temperatur insbesondere zwischen 50°C und 70°C liegt. In einer anderen Ausführungsform kann die Reaktions-Temperatur auch variabel gesteuert werden, so dass einzelne Schritte der Amplifikation bei jeweils unterschiedlichen Temperaturen verlaufen.
Die für die exponentielle Amplifikation benötigten Reagenzien sind insbesondere bereits zu Beginn einer Reaktion im gleichen Ansatz vorhanden. In einer anderen Ausführungsform können Reagenzien auch in späteren Stadien des Verfahrens zugegeben werden. In bestimmten Ausführungsformen werden keine Helicasen oder Recombinasen in der Reaktionsmischung zur Trennung der neu synthetisieren Doppelstränge der zu amplifizierenden Nukleinsäure verwendet.
In bestimmten Ausführungsformen beinhaltet die Reaktionsmischung keine biochemischen Energie-spendenden Verbindungen wie ATP.
Die Menge der zu Beginn der Reaktion vorliegenden zu amplifizierenden Nukleinsäure kann zwischen wenigen Kopien und mehreren Milliarden Kopien in einem Ansatz vorliegen. Bei diagnostischen Einsätzen kann die Menge der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette unbekannt sein.
In der Reaktion können auch weitere, nicht zu amplifizierende Nukleinsäuren vorliegen. Diese Nukleinsäuren können von natürlicher DNA oder RNA oder ihren Äquivalenten abstammen. In einer Ausführungsform liegen Kontroll-Sequenzen im gleichen Ansatz vor, welche parallel zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure ebenfalls amplifiziert werden sollen.
In bestimmten Ausführungsformen wird ein molarer Überschuss von ungefähr 103: 1 bis ungefähr 1015: 1 (Verhältnis Primer:Matrize) der eingesetzten Primer und des Controller-Oligonukleotides zu der Reaktionsmischung gegeben, welche Matrizen-Stränge für die Synthese der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette umfasst.
Es kann die Menge der Zielnukleinsäuren nicht bekannt sein, wenn das erfindungsgemäße Verfahren in diagnostischen Anwendungen benutzt wird, so dass die relative Menge des Primers und des Controller-Oligonukleotides bezüglich des komplementären Stranges nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. Die Menge des zugefügten Primers wird im Allgemeinen im molaren Überschuss bezüglich der Menge des komplementären Stranges (Matrize) vorhanden sein, wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch von komplizierten langkettigen Nukleinsäuresträngen enthalten ist. Ein großer molarer Überschuss verbessert die Effizienz des Verfahrens.
Die verwendeten Konzentrationen von Primer-1 , Primer-2 und Controller-Oligonukleotiden liegen beispielsweise in Bereichen zwischen 0,01 pmol/l und 100 pmol/l, insbesondere zwischen 0,1 pmol/l und 100 pmol/l, oder zwischen 0,1 pmol/l und 50 pmol/l, insbesondere zwischen 0,1 pmol/l und 20 pmol/l. Die hohe Konzentration von Komponenten kann die Geschwindigkeit der Amplifikation erhöhen. Die jeweiligen Konzentrationen einzelner Komponenten können unabhängig voneinander variiert werden, um das gewünschte Reaktionsergebnis zu erzielen.
Die Konzentration von Polymerase liegt in Bereichen zwischen 0,001 pmol/l und 50 pmol/l, insbesondere zwischen 0,01 pmol/l und 20 pmol/l, insbesondere zwischen 0,1 pmol/l und 10 pmol/l.
Die Konzentration von einzelnen dNTP-Substraten liegt in Bereichen zwischen 10 pmol/l und 10 mmol/l, insbesondere zwischen 50 pmol/l und 2 mmol/l, insbesondere zwischen 100 pmol/l und 1 mmol/l. Die Konzentration von dNTP kann die Konzentration von divalenten Metal-Kationen beeinflußen. Gegebenenfalls wird diese entsprechend angepasst. Als divalente Metal-Kationen werden beispielsweise Mg2+ verwendet. Als entsprechendes Anion können beispielsweise CI, Acetat, Sulfat, Glutamat etc. verwendet werden.
Die Konzentration an divalenten Metal-Kationen wird beispielsweise an den für jeweilige Polymerase optimalen Bereich angepasst und umfasst Bereiche zwischen 0,1 mmol/l und 50 mmol/l, insbesondere zwischen 0,5 mmol/l und 20 mmol/l, insbesondere zwischen 1 mmol/l und 15 mmol/l.
Die enzymatische Synthese erfolgt im Allgemeinen in einer gepufferten wässrigen Lösung. Als Puffer-Lösungen können gelöste konventionelle Puffer-Substanzen, wie Tris-HCI, Tris-Acetat, Kalium-Glutamat, HEPES-Puffer, und/oder Natrium-Glutamat in gängigen Konzentrationen verwendet werden. Der pH-Wert dieser Lösungen liegt üblicherweise zwischen 7 und 9,5, insbesondere etwa bei 8 bis 8,5. Die Puffer-Bedingungen können beispielsweise nach Empfehlung des Herstellers der verwendeten Polymerase angepasst werden.
Weitere Substanzen, wie sogenannte Tm-Depressoren (z.B. DMSO, Betaine, TPAC) etc. können zum Puffer zugegeben werden. Solche Substanzen verringern die Schmelztemperatur („Tm- Depressoren“) von Doppelsträngen und können somit einen positiven Einfluss auf die Öffnung von Doppelsträngen haben. Auch Polymerase-stabilisierende Komponenten, wie Tween 20 oder Triton 100 können in üblichen Mengen zum Puffer zugegeben werden. EDTA oder EGTA kann zur Komplexierung von Schwermetallen in konventionellen Mengen zugegeben werden. Polymerase stabilisierende Substanzen, wie Trehalose oder PEG 6000 können ebenfalls zum Reaktionsgemisch zugegeben werden.
Insbesondere enthält die Reaktionsmischung keine Inhibitoren der Strangverdrängungsreaktion und keine Inhibitoren einer Polymerasen-abhängigen Primer-Verlängerung.
In einer Ausführungsform enthält die Reaktionsmischung DNA-bindende Farbstoffe, insbesondere interkalierenden Farbstoffe, wie z.B. EvaGreen oder SybrGreen. Solche Farbstoffe können ggf. die Detektion der Neubildung von Nukleinsäureketten ermöglichen.
Die Reaktionsmischung kann weiterhin Proteine bzw. andere Substanzen enthalten, welche beispielsweise aus einem Original-Material stammen und welche die Amplifikation insbesondere nicht beeinflussen.
Ausführungsformen von Reaktionsbedingungen
Die Temperatur hat einen wesentlichen Einfluss auf die Stabilität der Doppelstränge.
In einer Ausführungsform werden während der Amplifikationsreaktion keine Temperaturbedingungen verwendet, welche im Wesentlichen zur Trennung von Doppelsträngen der zu amplifizierenden Nukleinsäure in Abwesenheit von Controller-Oligonukleotid führen. Damit soll sichergestellt werden, dass die Doppelstrang-Trennung von zu amplifizierenden Nukleinsäureketten von der Anwesenheit des Controller-Oligonukleotides im gesamten Verlauf der Amplifikation abhängig ist. Bei einer Temperatur etwa in Höhe von der gemessenen Schmelztemperatur (Tm) der zu amplifizierenden Nukleinsäure kommt es zu einer spontanen Trennung von beiden Strängen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, so dass der Einfluss des Controller-Oligonukleotids auf die Trennung von synthetisierten Strängen und somit auf die Sequenzspezifität der Amplifikation minimal bis begrenzt ist.
Bei einer exponentiellen Amplifikation, welche weniger sequenzspezifisch (d.h. wenig Controller- Oligonukleotid-abhängig) ablaufen muss, kann die Reaktionstemperatur beispielsweise um die Schmelztemperatur (d.h. Tm plus / minus 3° bis 5°C) der zu amplifizierenden Nukleinsäure liegen. Bei einer solchen Temperatur können Sequenzunterschiede zwischen Controller-Oligonukleotid und dem synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukt im Rahmen einer Strangverdrängungsreaktion im Allgemeinen gut toleriert werden.
Auch im Temperatur-Bereich von ca. (Tm minus 3° C) bis ca. (Tm minus 10°C) kann es immer noch zu einer spontanen Strangtrennung von synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukten kommen, obwohl mit geringerer Effizienz. Der Einfluss von dem Controller-Oligonukleotid auf die Sequenzspezifität der zu amplifizierenden Nukleinsäure ist höher als bei Temperaturbedingungen um die Schmelztemperatur (Tm) der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette.
Zwar findet die Strangtrennung mit sinkender Reaktionstemperatur im Wesentlichen dank der Interaktion des neusynthetisierten Doppelstranges mit dem Controller-Oligonukleotid statt, Allerdings können Duplexe aus Primern bei der Verlängerungstemperatur unter den genannten Bedingungen auch spontan zerfallen, d.h. ohne sequenzabhängige Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid. Beispielsweise liegt die Reaktionstemperatur bei einer vermindert sequenzspezifischen Amplifikation in Bereichen zwischen ca. (Tm minus 3°C) und ca. (Tm minus 10°C), insbesondere zwischen ca. (Tm minus 5°C) und ca. (Tm minus 10°C). Bei einer solchen Temperatur werden Sequenzunterschiede zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukt im Rahmen einer Strangverdrängungsreaktion schlechter toleriert.
Eine hohe Sequenzspezifität der Amplifikation des Verfahrens wird vor allem dann erreicht, wenn die neu synthetisierten Stränge der zu amplifizierenden Nukleinsäure unter Reaktionsbedingungen nicht spontan in Einzelstränge dissoziieren können. In einem solchen Fall spielt die sequenzspezifische Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid für eine sequenzspezifische Strangtrennung eine entscheidende Rolle und ist für die Sequenzspezifität der Amplifikationsreaktion maßgeblich verantwortlich. Dies kann im Allgemeinen erreicht werden, wenn die Reaktionstemperatur deutlich unter der Schmelztemperatur von beiden Strängen der zu amplifizierenden Nukleinsäure liegt und keine weiteren Komponenten für eine Strangtrennung verwendet werden, beispielsweise keine Helicasen oder Recombinasen. Beispielsweise liegt die Reaktionstemperatur bei einer sequenzspezifischen Amplifikation in Bereichen zwischen ca. (Tm minus 10°C) und ca. (Tm minus 50°C), insbesondere zwischen ca. (Tm minus 15°C) und ca. (Tm minus 40°C), insbesondere zwischen ca. (Tm minus 15°C) und ca. (Tm minus 30°C). In einer Ausführungsform der Amplifikation wird die maximale Reaktions-Temperatur im Verlauf der gesamten Amplifikationsreaktion nicht über die Schmelztemperatur der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette erhöht.
In einer weiteren Ausführungsform der Amplifikation kann die Reaktionstemperatur über die Schmelztemperatur der zu amplifizierenden Nukleinsäurketten mindestens einmal erhöht werden. Die Erhöhung der Temperatur kann beispielsweise zu Beginn der Amplifikationsreaktion erfolgen und zur Denaturierung von Doppelsträngen einer genomischen DNA führen. Dabei muss beachtet werden, dass während eines solchen Schrittes die Abhängigkeit der Doppelstrang-Trennung von der Wirkung des Controller-Oligonukleotides aufgehoben ist oder zumindest signifikant reduziert ist.
Die Reaktionstemperaturen der einzelnen Schritte der Amplifikationsreaktion können im Bereich von ca. 15°C bis ca. 85°C, insbesondere im Bereich von ca. 15°C bis ca. 75°C, insbesondere im Bereich von ca. 25°C bis ca. 70°C liegen.
Im Allgemeinen kann die Reaktionstemperatur für jeden einzelnen Reaktionsschritt optimal eingestellt werden, so dass für jeden Reaktionsschritt eine solche Temperatur herbeigeführt wird. Die Amplifikationsreaktion umfasst somit eine sich wiederholende Änderung von Temperaturen, welche zyklisch wiederholt werden. In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden Reaktionsbedingungen für mehrere Reaktionsschritte vereinheitlicht, so dass die Anzahl von Temperatur-Schritten geringer ist als die Anzahl von Reaktionsschritten. In einer solchen Ausführungsform der Erfindung erfolgt mindestens einer der Schritte der Amplifikation bei einer Reaktionstemperatur, welche sich von der Reaktionstemperatur anderer Schritte der Amplifikation unterscheidet. Die Reaktion verläuft somit nicht isothermal, sondern die Reaktionstemperatur wird zyklisch geändert.
Es werden beispielsweise während der Amplifikation mindestens zwei Temperatur-Bereiche verwendet, welche abwechselnd herbeigeführt werden (zyklische Änderung von Temperaturen zwischen einzelnen Temperatur-Bereichen). In einer Ausführungsform umfasst der untere Temperatur-Bereich beispielsweise Temperaturen zwischen 25°C und 60°C, insbesondere zwischen 35°C und 60°C, insbesondere zwischen 50°C und 60°C und der obere Temperatur- Bereich umfasst beispielsweise Temperaturen zwischen 60°C und 75°C, insbesondere zwischen 60°C und 70°C.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der untere Temperatur-Bereich beispielsweise Temperaturen zwischen 15°C und 50°C, insbesondere zwischen 25°C und 50°C, insbesondere zwischen 30°C und 50°C und der obere Temperatur-Bereich umfasst beispielsweise Temperaturen zwischen 50°C und 75°C, insbesondere zwischen 50°C und 65°C.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der untere Temperatur-Bereich beispielsweise Temperaturen zwischen 15°C und 40°C, insbesondere zwischen 25°C und 40°C, insbesondere zwischen 30°C und 40°C und der obere Temperatur-Bereich umfasst beispielsweise Temperaturen zwischen 40°C und 75°C, insbesondere zwischen 40°C und 65°C.
Die Temperatur kann im jeweiligen Bereich konstant gehalten werden oder als Temperatur- Gradient (abfallend oder aufsteigend) geändert werden.
Weitere Erläuterungen zu Temperatur-Einstellungen werden in folgenden Abschnitten bei Ausführungsformen im Einzelnen angeführt.
Jede herbeigeführte Temperatur kann eine gewisse Zeit aufrechterhalten werden, so dass dabei ein Inkubations-Schritt resultiert. Das Reaktionsgemisch kann somit während einer Amplifikation bei einer ausgewählten Temperatur eine gewisse Zeit inkubiert werden. Diese Zeit kann unterschiedlich lange für den jeweiligen Inkubations-Schritt sein und kann sich an den Fortschritt der jeweiligen Reaktion bei gegebener Temperatur richten (z.B. Primer-Verlängerung oder Strangverdrängung usw.). Die Zeit eines Inkubationsschrittes kann folgende Bereiche umfassen: zwischen 0,1 sec und 10.000 sec, insbesondere zwischen 0,1 sec und 1000 sec, insbesondere zwischen 1 sec und 300 sec, insbesondere zwischen 1 sec und 100 sec.
Durch eine solche Temperatur-Änderung können einzelne Reaktionsschritte insbesondere bei einer ausgewählten Temperatur ausgeführt werden. Dadurch können Ausbeuten von einem jeweiligen Reaktionsschritt verbessert werden. Innerhalb eines Synthese-Zyklus kann eine Temperatur-Änderung bzw. ein Temperatur-Wechsel zwischen einzelnen Temperatur-Bereichen ggf. mehrmals herbeigeführt werden. Ein Synthese-Zyklus kann somit mindestens einen Temperatur-Wechsel umfassen. Ein solcher Temperatur-Wechsel kann beispielsweise in einem PCR-Gerät / Thermocycler routinemäßig als zeitliches Programm ausgeführt werden.
Eine Ausführungsform betrifft ein Amplifikationsverfahren, bei welchem mindestens einer der Schritte, welche die Strangverdrängung umfassen, und mindestens einer der Schritte, welche die Primer-Verlängerungsreaktionen umfassen, gleichzeitig bzw. parallel stattfinden und unter gleichen Reaktionsbedingungen erfolgen. In einer solchen Ausführungsform kann beispielsweise eine Primer-Verlängerungsreaktion von mindestens einem Primer-Oligonukleotid (z.B. vom ersten Primer-Oligonukleotid) insbesondere bei Temperaturbedingungen im unteren Temperatur-Bereich erfolgen. Hingegen erfolgt die Strangverdrängung unter Mitwirkung von Controller-Oligonukleotid und die eine weitere Primer-Verlängerungsreaktion (z.B. vom zweiten Primer-Oligonukleotid) insbesondere im Reaktionsschritt im oberen Temperatur-Bereich.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Amplifikationsverfahren, bei welchem mindestens einer der Schritte, welche die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid umfassen und mindestens einer der Schritte, welche die Primer-Verlängerungsreaktion umfassen, bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt. In einer solchen Ausführungsform können beispielsweise Primer-Verlängerungsreaktionen von mindestens einem Primer-Oligonukleotid (z.B. vom ersten Primer-Oligonukleotid und / oder von zweiten Primer-Oligonukleotid) insbesondere bei Temperaturbedingungen im unteren Temperatur-Bereich erfolgen. Hingegen erfolgt die Strangverdrängung unter Mitwirkung von Controller-Oligonukleotid insbesondere im Reaktionsschritt im oberen Temperatur-Bereich.
In einerweiteren Ausführungsform verlaufen sämtliche Schritte einer Amplifikations-Reaktion unter gleichen Reaktionsbedingungen.
In einer solchen Ausführungsform kann das Amplifikationsverfahren unter isothermalen Bedingungen durchgeführt werden, d.h. dass keine Temperaturänderungen für die Ausführung des Verfahrens erforderlich sind. In einer solchen Ausführungsform der Erfindung erfolgt die gesamte Amplifikationsreaktion unter konstanter Temperatur, d.h. die Reaktion ist isothermal. Die Zeit einer solchen Reaktion umfasst beispielsweise folgende Bereiche: zwischen 100 sec und 30.000 sec, insbesondere zwischen 100 sec und 10.000 sec, insbesondere zwischen 100 sec und 1000 sec.
Im Abschnitt „Beispiele“ wird gezeigt, dass es möglich ist, Strukturen einzelner Reaktionskomponenten und entsprechende Reaktionsschritte dermaßen aneinander abzustimmen, dass eine isothermale Reaktion möglich ist.
Die Summe aller Verfahrens-Schritte, welche zu einer Verdoppelung der Menge einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette führt, kann als Synthese-Zyklus bezeichnet werden. Ein solcher Zyklus kann entsprechend isothermal ablaufen oder auch durch Änderungen der Temperatur in seinem Verlauf gekennzeichnet sein. Die Temperatur-Änderungen können sich von Zyklus zu Zyklus wiederholen und identisch gestaltet werden.
Besonders vorteilhaft sind Amplifikationsverfahren, bei welchen die maximal erreichbare Temperatur eine Strang-Trennung unter Mitwirkung von Controller-Oligonukleotid nur dann im Wesentlichen zulässt, wenn mehr als 5 Nukleotide des dritten Bereichs des Controller- Oligonukleotides eine komplementäre Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt eingehen können, insbesondere wenn mehr als 10, insbesondere wenn mehr als 20 Nukleotide des Controller-Oligonukleotides mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt eine Bindung eingehen. Im Allgemeinen gilt, je länger die erforderliche Bindung zwischen Controller- Oligonukleotid und dem komplementären Strang des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, bevor die synthetisierten Stränge unter Reaktionsbedingungen dissoziieren, desto spezifischer ist die Amplifikations-Reaktion. Im Einzelnen, kann durch Verlängerung bzw. Verkürzung des dritten Abschnittes des Controller-Oligonukleotides das gewünschte Maß an Spezifität ermittelt werden.
Ein Verfahrensschritt kann bei seiner Wiederholung bei konstanter Temperatur erfolgen über die Gesamt-Dauer des Verfahrens oder auch bei unterschiedlichen Temperaturen.
Einzelne Verfahrensschritte können jeweils hintereinander durch Zugabe von einzelnen Komponenten ausgeführt werden. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform liegen sämtliche für die Ausführung einer Amplifikation notwendigen Reaktions-Komponenten zu Beginn einer Amplifikation in einem Reaktionsgemisch vor.
Der Start einer Amplifikations-Reaktion kann durch Zugabe einer Komponente erfolgen, z.B. durch Zugabe einer Nukleinsäurekette umfassend eine Zielsequenz (z.B. eine Start-Nukleinsäurekette), oder einer Polymerase oder divalenten Metal-Ionen, oder auch durch Herbeiführung von Reaktions-Bedingungen, welche für die Amplifikation notwendig sind, z.B. die Einstellung einer erforderlichen Reaktionstemperatur für einen oder mehrere Verfahrensschritte.
Die Amplifikation kann so lange ausgeführt werden, bis die gewünschte Menge an zu amplifizierender Nukleinsäure erreicht ist. In einer anderen Ausführungsform wird die Amplifikationsreaktion über eine Zeit ausgeführt, welche bei Vorliegen einer zu amplifizierenden Nukleinsäure ausgereicht hätte, um eine ausreichende Menge zu erhalten. In einer anderen Ausführungsform wird die Amplifikationsreaktion über eine hinreichende Anzahl von Synthese- Zyklen (Verdoppelungszeiten) ausgeführt, welche bei Vorliegen einer zu amplifizierenden Nukleinsäure ausgereicht hätte, um eine ausreichende Menge zu erhalten.
Die Reaktion kann durch verschiedene Eingriffe gestoppt werden. Beispielsweise durch Änderung der Temperatur (z.B. Abkühlen oder Erhitzen, wobei beispielsweise die Polymerase in ihrer Funktion gestört wird) oder durch Zugabe einer Substanz, welche eine Polymerase-Reaktion stoppt, z.B. EDTA oder Formamid.
Im Anschluss an die Amplifikation kann die amplifizierte Nukleinsäurekette für weitere Analysen verwendet werden. Dabei können synthetisierte Nukleinsäureketten durch verschiedene Detektionsverfahren analysiert werden. Beispielsweise können fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid-Sonden verwendet werden oder Sequenzierungsverfahren (Sanger-Sequenzierung oder Next-Generation Sequenzierung), fest-Phasen-Analysen wie Microarray oder Bead-Array- Analysen usw. Die synthetisierte Nukleinsäurekette kann als Substrat / Matrize in weiteren Primer- Verlängerungsreaktionen verwendet werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird der Fortschritt der Synthese-Reaktion während der Reaktion überwacht. Das kann beispielsweise durch Einsatz von interkalierenden Farbstoffen erfolgen, z.B. Sybrgreen oder Evagreen, oder unter Einsatz von markierten Primern (z.B. Lux- Primer oder Scorpion-Primer) oder unter Einsatz von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid- Sonden.
Die Detektion der Veränderung der Fluoreszenz während der Amplifikation wird in einem Detektions-Schritt des Verfahrens umgesetzt. Dabei kann die Temperatur und die Dauer dieses Schrittes an die jeweiligen Erfordernisse einer Oligonukleotid-Sonde angepasst werden. Die Temperaturen des Detektions-Schrittes umfassen beispielsweise Bereiche zwischen 20°C und 75°C, insbesondere zwischen 40 und 70°C, insbesondere zwischen 55 und 70°C.
Während des Detektionsschrittes erfolgt die Beleuchtung der Reaktion mit Licht einer Wellenlänge, welche in der Lage ist, ein verwendetes Fluorophor des Detektions-Systems (ein Donor oder ein Fluoreszenzreporter) anzuregen. Die Signal-Erfassung erfolgt in der Regel parallel zur Anregung, wobei das spezifische Fluoreszenzsignal detektiert wird und seine Intensität quantifiziert wird.
Der Aufbau eines Primer-Oligonukleotides, welches mit dem korrespondierenden Controller- Oligonukleotid spezifisch binden kann, wird am Beispiel des ersten Primer-Oligonukleotides erläutert. Der Aufbau des zweiten Primer-Oligonukleotides folgt gleichen Regeln. Ebenfalls wird das Paar umfassend das erste Primer-Oligonukleotid und das erste Controller-Oligonukleotid exemplarisch zur Erläuterung von Interaktionen zwischen diesen und weiteren Komponenten verwendet.
Die Primer-Struktur für das erste und das zweite Primeroligonukleotid wird am Beispiel des ersten Primer-Oligonukleotid detailiert dargestellt. Der Aufbau des zweiten Primer-Oligonukleotides ist dem Aufbau des ersten ähnlich; Unterschiede zwischen dem ersten und dem zweiten Primer können je nach Ausführungsform beispielsweise in konkreten Zusammensetzungen der Sequenzen, verwendeten Längen der jeweiligen Bereiche, sowie Nukleotid-Modifikationen liegen.
Das erste Primer-Oligonukleotid (Primer-1 ) ist eine Nukleinsäurekette, welche mindestens folgende Bereiche einschließt:
• Einen ersten Primer-Bereich im 3'-Segment des ersten Primer-Oligonukleotides, der an einen Strang einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann
• Einen zweiten Bereich, gekoppelt direkt oder via einen Linker an das 5'-Ende des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides, welcher einen Polynukleotid- Schwanz umfasst, welcher zur Bindung eines Controller-Oligonukleotids und Unterstützung der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid geeignet ist, wobei der Polynukleotid-Schwanz unter Reaktionsbedingungen im Wesentlichen einzelsträngig bleibt, d.h. keine stabile Hairpin-Struktur oder ds-Strukturen ausbildet, und insbesondere nicht von der Polymerase kopiert wird.
Die Gesamtlänge des ersten Primer-Oligonukleotides liegt zwischen 10 und 80, insbesondere zwischen 15 und 50, insbesondere zwischen 20 und 30 Nukleotiden oder ihren Äquivalenten (z.B. Nukleotid-Modifikationen). Die Struktur des ersten Primer-Oligonukleotids ist dermaßen angepasst, dass es unter gewählten Reaktionsbedingungen eine reversible Bindung an das Controller-Oligonukleotid eingehen kann. Weiterhin ist die Struktur des ersten Primer- Oligonukleotides an seine Primer-Funktion angepasst. Weiterhin ist die Struktur so angepasst, dass eine Strangverdrängung mittels Controller-Oligonukleotid ausgeführt werden kann. Insgesamt sind Strukturen des ersten und des zweiten Bereichs aneinander angepasst, so dass eine exponentielle Amplifikation ausgeführt werden kann.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind der erste und der zweite Bereich des Primers in einer konventionellen 5'-3' Anordnung gekoppelt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Kopplung von beiden Abschnitten über eine 5'-5'-Bindung, so dass der zweite Bereich eine umgekehrte Richtung hat als der erste Bereich.
Die Kopplung von Bereichen zwischen einander/untereinander erfolgt insbesondere kovalent. In einer Ausführungsform ist die Kopplung zwischen dem ersten und zweiten Bereich eine für DNA konventionelle 5'-3'-Phosphodiester-Kopplung. In einer weiteren Ausführungsform ist es eine 5'- 5'-Phosphodiester-Kopplung. In einer weiteren Ausführungsform ist es eine 5'-3'-Phosphodiester- Kopplung, wobei zwischen benachbarten endständigen Nukleotiden bzw. Nukleotid-Modifikationen der beiden Bereiche mindestens ein Linker (z.B. ein C3, C6, C12 oder ein HEG-Linker oder eine abasische Modifikation) positioniert ist.
Einzelne Bereiche können unterschiedliche Nukleotid-Modifikationen einschließen. Dabei können individuelle Elemente von Nukleotiden modifiziert sein: Nukleobase und Rückgrat (Zucker-Anteil und / oder Phosphat-Anteil). Weiterhin können Modifikationen verwendet werden, welchen mindestens eine Komponente der Standard-Nukleotid-Bausteine fehlt oder modifiziert ist, z.B. PNA.
In einerweiteren Ausführungsform umfasst ein zweiter Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides weitere Sequenzen, die nicht an das Controller-Oligonukleotid binden. Diese Sequenzen können zu anderen Zwecken verwendet werden, z.B. zur Bindung an die feste Phase. Diese Sequenzen sind insbesondere am 5'-Ende des Polynukleotid-Schwanzes lokalisiert.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein erstes Primer-Oligonukleotid eine charakteristische Markierung umfassen. Beispiele für eine solche Markierung stellen Farbstoffe dar (z.B. FAM, TAMRA, Cy3, Alexa 488 etc.) oder Biotin bzw. andere Gruppen, die spezifisch gebunden werden können, z.B. Digoxigenin.
Der erste Primer-Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides
Die Sequenz-Länge liegt zwischen ca. 3-30 Nukleotiden, insbesondere zwischen 5 und 20 Nukleotiden, wobei die Sequenz vorwiegend komplementär zum 3'-Segment eines Stranges der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette ist. Im Einzelnen, muss dieser Primer-Bereich in der Lage sein, an das komplementäre 3'-Segment eines zweiten Primer-Verlängerungsproduktes spezifisch zu binden. Dieser erste Bereich soll bei der Rücksynthese kopiert werden können und dient auch als Matrize für den 2. Strang. Die Nukleotid-Bausteine sind insbesondere untereinander via übliche 5'-3' Phosphodieser-Bindung oder Phosphothioester-Bindung verknüpft.
Der erste Primer-Bereich schließt insbesondere Nukleotid-Monomere ein, welche die Funktion der Polymerase nicht oder nur unwesentlich beeinflussen, dazu gehören beispielsweise:
• natürliche Nukleotide (dA, dT, dC, dG etc.) oder deren Modifikationen ohne veränderte Basen-Paarung
• Modifizierte Nukleotide, 2-Amino-dA, 2-thio-dT oder andere Nukleotid-Modifikationen mit abweichender Basen-Paarung.
In einer Ausführungsform ist das 3'-OH-Ende dieses Bereichs insbesondere frei von Modifikationen und hat eine funktionsfähige 3'-OH Gruppe, welche von der Polymerase erkannt werden kann. Der erste Primer-Bereich dient als Initiator der Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes in der Amplifikation. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der erste Bereich mindestens eine Phosphorothioat-Verbindung, so dass kein Abbau des 3'-Endes des Primers durch die 3'-Exonuclease Aktivität von Polymerasen erfolgen kann.
Die Sequenz des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids und die Sequenz des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotides sind insbesondere einander komplementär.
In einer Ausführungsform kann der erste Primer-Bereich oder sein 3'-Segment an Sequenzsegmente einer Zielsequenz binden.
Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides
Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides ist insbesondere eine Nukleinsäuresequenz, welche mindestens einen Polynukleotid-Schwanz umfasst, welcher insbesondere während der Synthesereaktion von der Polymerase unkopiert bleibt und welcher zur Bindung mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides fähig ist. Das Segment des zweiten Bereichs, welches überwiegend diese Bindung mit dem Controller-Oligonukleotid eingeht, kann als Polynukleotid-Schwanz bezeichnet werden.
Weiterhin muss der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids nicht nur das Controller- Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen spezifisch binden, sondern auch beim Vorgang der Strangverdrängung mittels Controller-Oligonukleotid mitwirken. Die Struktur des zweiten Bereichs muss folglich für die Herbeiführung einer räumlichen Nähe zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem entsprechenden Doppelstrang-Ende (im Einzelnen, dem 3'-Ende des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes) geeignet sein.
Die Gestaltung der Struktur des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids wird in mehreren Ausführungsformen genauer dargestellt. Dabei werden die Anordnung der Oligonukleotid-Segmente und die verwendeten Modifikationen berücksichtigt, welche zu einem Stopp in der Polymerase-katalysierten Synthese führen.
Die Länge des zweiten Bereichs liegt zwischen 3 und 60, insbesondere zwischen 5 und 40, insbesondere zwischen 6 und 15 Nukleotiden oder ihren Äquivalenten.
Die Sequenz des zweiten Bereichs kann willkürlich gewählt sein. Insbesondere ist sie nicht komplementär mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder mit dem zweiten Primer- Oligonukleotid und/oder mit dem ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid. Weiterhin enthält sie insbesondere keine selbstkomplementären Segmente, wie Hairpins oder Stemmloops.
Die Sequenz des zweiten Bereichs ist insbesondere auf die Sequenz des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids abgestimmt, so dass beide Sequenzen unter Reaktionsbedingungen eine Bindung eingehen können. In einer Ausführungsform ist diese Bindung unter Reaktionsbedingungen reversibel: es besteht somit ein Gleichgewicht zwischen aneinander gebundenen Komponenten und nicht-gebundenen Komponenten.
Die Sequenz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides ist insbesondere dermaßen gewählt, dass die Anzahl von komplementären Basen, welche mit dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotid binden können, zwischen 1 und 40, insbesondere zwischen 3 und 20, insbesondere zwischen 6 und 15 liegt.
Die Funktion des zweiten Bereichs besteht unter anderem in Bindung des Controller- Oligonukleotides. In einer Ausführungsform ist diese Bindung insbesondere spezifisch, so dass ein zweiter Bereich eines ersten Primer-Oligonukleotides ein spezifisches Controller-Oligonukleotid binden kann. In einer anderen Ausführungsform kann ein zweiter Bereich mehr als nur ein Controller-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen binden.
Es besteht im Allgemeinen keine Notwendigkeit in einer perfekten Übereinstimmung in der Sequenz zwischen dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides und dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides. Das Maß der Komplementarität zwischen dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides und dem ersten Bereich des Controller- Oligonukleotides kann zwischen 20 % und 100 %, insbesondere zwischen 50 % und 100 %, insbesondere zwischen 80 % und 100 % liegen. Die jeweils komplementären Bereiche können unmittelbar aneinander anschließend positioniert sein oder auch nicht-komplementäre Sequenz- Segmente dazwischen umfassen.
Der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides kann in einer Ausführungsform mindestens eine Tm-modifizierende Modifikation einschließen. Durch Einführung solcher Modifikationen kann die Stabilität der Bindung zwischen dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides und dem ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides modifiziert werden. Beispielsweise können Tm-erhöhende Modifikationen (Nukleotid-Modifikationen oder nicht-Nukleotid-Modifikationen) verwendet werden, wie LNA-Nukleotide, 2-Amino-Adenosine oder MGB-Modifikationen. Andererseits können auch Tm-Senkende Modifikationen verwendet werden, wie beispielsweise Inosin-Nukleotide. In der Struktur des zweiten Bereichs können auch Linker (z.B. C3, C6, HEG- Linker) integriert werden.
Für die Strangverdrängung muss das Controller-Oligonukleotid in räumliche Nähe des Doppelstrang-Endes der zu amplifizierenden Nukleinsäure gebracht werden. Dieses Doppelstrang-Ende besteht aus Segmenten des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer- Verlängerungsproduktes und einem entsprechend dazu komplementären 3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Der Polynukleotid-Schwanz bindet vorwiegend komplementär das Controller-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen und bewirkt damit eine vorübergehende Annäherung des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotides und des ersten Bereichs eines verlängerten Primer- Verlängerungsproduktes, so dass eine komplementäre Bindung zwischen diesen Elementen im Rahmen eines Strangverdrängungsvorgangs initiiert werden kann.
In einer Ausführungsform führt die Bindung des Controller-Oligonukleotides an den Polynukleotid- Schwanz des ersten Primer-Oligonukleotides unmittelbar zu einem solchen Kontakt. Das bedeutet, dass der Polynukleotid-Schwanz und der erste Primer-Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides unmittelbar aneinander gekoppelt sein müssen. Dank einer solchen Anordnung kann es nach einer Bindung eines Controller-Oligonukleotids in seinem ersten Bereich unmittelbar zu einem Kontakt zwischen komplementären Basen des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotides und zu entsprechenden Basen des ersten Primer-Bereichs kommen, so dass eine Strangverdrängung initiiert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform liegen zwischen Strukturen des Polynukleotid-Schwanzes und dem ersten Primer-Bereich andere Strukturen des zweiten Bereichs des ersten Primer- Oligonukleotides. Nach einer Bindung eines Controller-Oligonukleotids an den Polynukleotid- Schwanz ist dieser somit nicht unmittelbar an den ersten Primer-Bereich positioniert, sondern in einer gewissen Distanz dazu. Die Strukturen zwischen dem unkopierbarem Polynukleotid- Schwanz und dem kopierbaren ersten Primer-Bereich des Primer-Oligonukleotides können einen solchen Abstand generieren. Dieser Abstand hat einen Wert, welcher zwischen 0,1 und 20 nm, insbesondere zwischen 0,1 und 5 nm, insbesondere zwischen 0,1 und 1 nm liegt.
Solche Strukturen stellen beispielsweise Linker (z.B. C3 oder C6 oder HEG-Linker) oder nicht zum Controller-Oligonukleotid komplementäre Segmente dar (z.B. in Form von nicht-komplementären, nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen). Die Länge dieser Strukturen kann im Allgemeinen in Ketten-Atomen ausgemessen werden. Diese Länge beträgt zwischen 1 und 200 Atomen, insbesondere zwischen 1 und 50 Kettenatomen, insbesondere zwischen 1 und 10 Kettenatomen.
Damit der Polynukleotid-Schwanz von der Polymerase unter Amplifikationsbedingungen unkopierbar bleibt, umfasst der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides im allgemeinen Sequenz-Anordnungen bzw. Strukturen, welche einen Stopp der Polymerase in der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes bewirken, nachdem die Polymerase den ersten Primer- Bereich erfolgreich kopiert hat. Diese Strukturen sollen das Kopieren des Polynukleotid- Schwanzes des zweiten Bereichs verhindern. Der Polynukleotid-Schwanz bleibt somit insbesondere von der Polymerase unkopiert.
In einer Ausführungsform liegen solche Strukturen zwischen dem ersten Primer-Bereich und dem Polynukleotid-Schwanz.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Sequenz des Polynukleotid-Schwanzes Nukleotid- Modifikationen einschließen, welche zum Stopp der Polymerase führen. Dadurch kann ein Sequenzsegment des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids beide Funktionen umfassen: es ist sowohl ein Polynukleotid-Schwanz als auch eine zum Stopp der Polymerase führende Sequenz aus Nukleotid-Modifikationen.
Modifikationen im zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotid, welche zu einem Synthese- Stopp führen und somit den Polynukleotid-Schwanz unkopierbar lassen, werden in dieser Anmeldung unter dem Begriff "erste Blockierungs-Einheit oder ein Stopp-Bereich" zusammengefasst. Nachfolgend sind weitere Ausführungsformen von Strukturen angeführt, welche zum Stopp in der Synthese des zweiten Stranges führen können.
Mehrere Bausteine bei der Oligonukleotid-Synthese sind bekannt, welche die Polymerase beim Ablesen der Matrize hindern und zur Termination der Polymerase-Synthese führen. Beispielsweise sind nicht-kopierbare Nukleotid-Modifikationen oder Nicht-Nukleotid-Modifikationen bekannt. Es gibt auch Synthese-Arten/Anordnungen von Nukleotid-Monomeren innerhalb eines Oligonukleotides, welche zum Stopp der Polymerase führen (z.B. 5'-5-Anordnung oder 3'- 3'Anordnung). Primer-Oligonukleotide mit einem nicht kopierbaren Polynukleotid-Schwanz sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt (z.B. Scorpion-Primer-Strukturen bzw. Primer für Bindung an die feste Phase). Beide Primer-Varianten beschreiben Primer-Oligonukleotid-Strukturen, welche in der Lage sind, einerseits die Synthese eines Stranges zu initiieren, so dass eine Primer- Verlängerungsreaktion stattfinden kann. Es resultiert ein erster Strang, welcher im Primer- Verlängerungs-Produkt auch die Primer-Struktur mit Schwanz integriert. Bei der Synthese eines komplementären Stranges zum ersten Primer-Verlängerungs-Produkt, z.B. im Rahmen einer PCR- Reaktion, wird der zweite Strang bis zur "Blockierungs-Einheit/Stopp-Struktur" der Primer-Struktur verlängert. Beide beschriebenen Primer-Strukturen sind dermaßen konzipiert, dass der 5'-Anteil des Primer-Oligonukleotides einzelsträngig bleibt und nicht von der Polymerase kopiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welcher in seiner gesamten Länge eine konventionelle Anordnung von 5'- nach 3'- aufweist und nicht-kopierbare Nukleotid-Modifikationen einschließt. Zu solchen nicht- kopierbaren Nukleotid-Modifikationen zählen beispielsweise 2'-0-Alkyl-RNA Modifikationen, PNA, und Morpholino. Diese Modifikationen können unterschiedlich im zweiten Primer-Bereich verteilt sein.
Der Anteil von nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen kann im Polynukleotid-Schwanz zwischen 20 % und 100 % liegen, insbesondere beträgt er mehr als 50% der Nukleotid-Bausteine. Insbesondere liegen diese Nukleotid-Modifikationen im 3'-Segment des zweiten Bereichs und grenzen somit an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides an.
In einer Ausführungsform ist die Sequenz der nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen zumindest teilweise komplementär zu der Sequenz im Matrizenstrang, so dass die Primer-Bindung an die Matrize unter Einbeziehung von zumindest einem Teil dieser Nukleotid-Modifikationen stattfindet. In einer weiteren Ausführungsform ist die Sequenz der nicht-kopierbaren Nukleotid- Modifikationen nicht-komplementär zu der Sequenz im Matrizenstrang.
Die nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen werden insbesondere aneinander kovalent gekoppelt und stellen somit ein Sequenz-Segment im zweiten Bereich dar. Die Länge dieses Segments umfasst zwischen 1 und 40, insbesondere zwischen 1 und 20 Nukleotid-Modifikationen, insbesondere zwischen 3 und 10 Nukleotid-Modifikationen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zweite Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welcher in seiner gesamten Länge eine konventionelle Anordnung von 5'-3' aufweist und nicht-kopierbare Nukleotid-Modifikationen einschließt (z.B. 2'-0-Alkyl- Modifikationen) und mindestens einen Nicht-Nukleotid-Linker (z.B. C3, C6, HEG-Linker) einschließt. Ein Nicht-Nukleotid-Linker hat die Funktion, benachbarte Nukleotide oder Nukleotid- Modifikationen kovalent zu verbinden und gleichzeitig die Synthese-Funktion der Polymerase ortspezifisch zu unterbrechen.
Ein solcher Nicht-Nukleotid-Linker soll die Strukturen des Polynukleotid-Schwanzes und des ersten Primer-Bereichs nicht zu weit voneinander entfernen. Vielmehr sollte der Polynukleotid-Schwanz in einer räumlichen Nähe zum ersten Primer-Bereich sein. Unter einem Nicht-Nukleotid-Linker werden Modifikationen zusammengefasst, welche in ihrer Länge nicht länger sind als 200 Ketten- Atome, insbesondere nicht länger als 50 Ketten-Atome, insbesondere nicht länger als 10 Ketten- Atome. Die Minimal-Länge eines solchen Linkers kann ein Atom betragen. Ein Beispiel für solche Nicht-Nukleotid-Linker stellen gerade oder verzweigte Alkyl-Linker mit einer Alkyl-Kette dar, welche mindestens ein Kohlenstoff-Atom einschließt, insbesondere mindestens 2 bis 30, insbesondere 4 bis 18. Solche Linker sind in der Oligonukleotid-Chemie hinreichend bekannt (z.B. C3, C6 oder C12 Linker) und können während einer Festphasen-Synthese von Oligonukleotiden zwischen der Sequenz des Polynukleotid-Schwanzes und der Sequenz des ersten Bereichs des ersten Primer- Oligonukleotides eingeführt werden. Ein anderes Beispiel für solche Nicht-Nukleotid-Linker stellen lineare oder verzweigte Polyethylen-Glykol-Derivate dar. Ein bekanntes Beispiel in der Oligonukleotid-Chemie stellt Hexaethylenglycol (HEG) dar. Ein weiteres Beispiel für solche Nicht- Nukleotid-Linker stellen abasische Modifikationen dar (z.B. THF-Modifikation, als Analog von D- Ribose).
Wenn eine oder mehrere solcher Modifikationen in einen zweiten Bereich integriert sind, können sie eine Polymerase in ihrer Kopier-Funktion während ihrer Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsprodukts effektiv stören, so dass Segmente nach einer solchen Modifikation unkopiert bleiben. Die Anzahl von solchen Modifikationen im zweiten Bereich kann zwischen 1 und 100 liegen, insbesondere zwischen 1 und 10, insbesondere zwischen 1 und 3.
Die Position eines solchen Nicht-Nukleotid-Linkers kann am 3'-Ende des zweiten Bereichs liegen und somit den Übergang vom ersten Bereich zum zweiten Bereich des Primer-Oligonukleotids darstellen.
Die Lage des Nicht-Nukleotid-Linkers im mittleren Segment des zweiten Bereichs kann ebenfalls verwendet werden. Damit wird ein Polynukleotid-Schwanz in mindestens zwei Segmente geteilt. In dieser Ausführungsform schließt das 3'-Segment des Polynukleotid-Schwanzes mindestens eine, insbesondere mehrere, z.B. zwischen 2 und 20, insbesondere zwischen 2 und 10 nicht- kopierbare Nukleotid-Modifikationen ein. Diese nicht-kopierbaren Nukleotid-Modifikationen liegen insbesondere am Übergang zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich des Primer- Oligonukleotides. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welcher in seiner gesamten Länge eine Anordnung von 5'-nach 3'- aufweist und zumindest ein Nukleotid-Monomer in einer "umgekehrten" Anordnung von 3'-nach 5'- einschließt und welche am Übergang zwischen dem ersten und dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides positioniert sind.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, wobei ein solcher Polynukleotid-Schwanz vollständig aus Nukleotiden besteht, welche in umgekehrter Anordnung direkt an den ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotides angrenzen, so dass die Kopplung des ersten und des zweiten Bereichs durch 5'- 5' Position erfolgt. Ein Vorteil einer solchen Anordnung ist, dass die Polymerase nach einer Kopierung des ersten Bereichs an eine "umgekehrte" Anordnung von Nukleotiden trifft, was typischerweise zur Termination der Synthese an dieser Stelle führt.
Bei einer "umgekehrten" Anordnung von Nukleotiden in der Gesamtlänge des Polynukleotid- Schwanzes soll insbesondere das 3'-terminale Nukleotid des Polynukleotid-Schwanzes an seinem 3'-OH-Ende blockiert sein, um Nebenreaktionen vorzubeugen. Alternativ kann auch ein terminales Nukleotid verwendet werden, welches gar keine 3'-OH Gruppe aufweist, z.B. ein Dideoxy- Nukleotid.
In einer solchen Ausführungsform soll natürlich auch die entsprechende Nukleotid-Anordnung im Controller-Oligonukleotid angepasst werden. In einem solchen Fall müssen der erste und der zweite Bereich des Controller-Oligonukleotids in 3'-3' Anordnung verknüpft werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zweite Bereich des Primer-Oligonukleotides einen Polynukleotid-Schwanz, welcher in seiner gesamten Länge eine konventionelle Anordnung von 5'- nach 3'- aufweist und mindestens eine Nukleotid-Modifikation einschließt, welche für die Polymerase keine komplementäre Nukleobase darstellt, wenn die Synthese mit ausschließlich natürlichen dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP oder dUTP) durchgeführt wird.
Beispielsweise können Iso-dG bzw. Iso-dC Nukleotid-Modifikationen als einzelne, insbesondere aber mehrere (mindestens 2 bis 20) Nukleotid-Modifikationen im zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids integriert sein. Weitere Beispiele für Nukleobasen-Modifikationen stellen verschiedene Modifikationen des erweiterten genetischen Alphabets dar. Solche Nukleotid- Modifikationen unterstützen insbesondere keine komplementäre Basen-Paarung mit natürlichen Nukleotiden, so dass eine Polymerase (zumindest theoretisch) kein Nukleotid aus der Reihe (dATP, dCTP, dGTP, dTTP oder dUTP) einbaut. In der Realität kann es dennoch zum rudimentären Einbau kommen, insbesondere bei höheren Konzentrationen von dNTP-Substraten und prolongierten Inkubationszeiten (z.B. 60 min oder länger). Daher sollen insbesondere mehrere solche Nukleotid-Modifikationen positioniert an benachbarten Stellen zum Einsatz kommen. Der Stopp der Polymerase-Synthese wird durch Fehlen von passenden komplementären Substraten für diese Modifikationen bewirkt. Oligonukleotide mit Iso-dC bzw. Iso-dG können mit Standardverfahren synthetisiert werden und sind von mehreren kommerziellen Anbietern erhältlich (z.B. Trilink-Technologies, Eurogentec, Biomers GmbH). Wahlweise kann auch die Sequenz des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids an die Sequenz eines solchen zweiten Primer- Bereichs angepasst werden. Dabei können komplementäre Nukleobasen des erweiterten genetischen Alphabets in den ersten Bereich des Controller-Oligonukleotides entsprechend während der chemischen Synthese integriert werden. Beispielsweise kann Iso-dG im zweiten Bereich des ersten Primer-Nukleotids integriert sein, sein komplementäres Nukleotid (lso-dC-5- Me) kann an der passenden Stelle im ersten Bereich des Controller-Oligonukleotids platziert werden.
Zusammenfassend, kann die Termination der Synthese von der Polymerase im zweiten Bereich auf verschiedene Art und Weise erreicht werden. Diese Blockade erfolgt insbesondere allerdings erst, wenn die Polymerase den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotides kopiert hat. Damit wird sichergestellt, dass ein zweites Primer-Verlängerungsprodukt eine passende Primer- Bindungsstelle in seinem 3'-Segment besitzt. Diese Primer-Bindungsstelle wird im Rahmen der Strangverdrängung freigelegt und steht somit für eine erneute Bindung eines weiteren ersten Primer-Oligonukleotids zur Verfügung.
Bei der Synthese des komplementären Stranges zum ersten Primer-Verlängerungsprodukt bleibt die Primer-Verlängerungsreaktion vor dem Polynukleotid-Schwanz stehen. Da dieser Polynukleotid-Schwanz für die Interaktion mit dem Controller-Oligonukleotid dadurch einzelsträngig bleibt und somit für die Bindung zur Verfügung steht, unterstützt dieser die Initiierung der Strangverdrängungs-Reaktion durch das Controller-Oligonukleotid, indem er die entsprechenden komplementäre Segmente des Controller-Oligonukleotids in unmittelbare Nähe des passenden Duplex-Endes bringt. Der Abstand zwischen dem komplementären Teil des Controller-Oligonukleotides (zweiter Bereich) und dem komplementären Teil des verlängerten Primer-Oligonukleotid (erster Bereich) wird dadurch auf ein Minimum reduziert. Solche räumliche Nähe erleichtert die Initiierung der Strangverdrängung.
Im Rahmen einer schematischen Darstellung einer nukleinsäurevermittelten Strangverdrängungs- Reaktion liegt nun eine komplementäre Sequenz von Controller-Oligonukleotid unmittelbar in der Nähe des passenden Duplex-Endes. Dabei kommt es zur Konkurrenz um die Bindung an den ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids zwischen dem Strang des Controller- Oligonukleotides und dem zum Primer komplementären Matrizenstrang. Durch repetitive Schließung und Formierung von Basenpaarung zwischen dem Primer-Bereich und dem komplementären Segment des Controller-Oligonukleotids (zweiter Bereich des Controller- Nukleotides) bzw. dem komplementären Segment des Matrizenstranges kommt es zur Initiierung des nukleinsäurevermittelten Strangverdrängungs-Vorgangs.
Im Allgemeinen ist die Ausbeute der Initiierung der Stang-Verdrängung umso höher, je näher der entsprechende komplementäre Sequenzabschnitt des Controller-Oligonukleotides zum komplementären Segment des Primer-Bereichs liegt. Bei Vergrößerung dieses Abstandes sinkt dagegen die Ausbeute der Initiierung der Strangverdrängung. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es nicht zwingend notwendig, dass die Initiierung der Strangverdrängung mit maximaler Ausbeute funktioniert. Daher können Abstände zwischen dem 5'-Segment des ersten Primer-Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids, welcher eine Bindung mit einem komplementären Strang der Matrize eingeht und eine komplementäre Duplex bildet, und einem entsprechend komplementären Sequenzabschnitt im Controller-Oligonukleotid, wenn gebunden an den Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des ersten Primer- Oligonukleotides, in folgenden Bereichen liegen: zwischen 0,1 und 20 nm, insbesondere zwischen 0,1 und 5 nm, insbesondere zwischen 0,1 und 1 nm. In bestimmten Ausführungsformen beträgt diese Distanz weniger als 1 nm. In anderen Einheiten ausgedrückt entspricht dieser Abstand einer Strecke von weniger als 200 Atomen, insbesondere weniger als 50 Atomen, insbesondere weniger als 10 Atomen. In bestimmten Ausführungsformen ist diese Distanz ein Atom. Die Angaben zur Distanz sollen lediglich zur Orientierung dienen und veranschaulichen, dass kürzere Distanzen zwischen diesen Strukturen signifikante Vorteile bieten. Die Messung dieser Distanz ist in vielen Fällen nur durch Analyse der genauen Strukturen von Oligonukleotiden und Ausmessung von Sequenzabständen bzw. von Linker-Längen möglich.
Der erste Primer kann auch noch weitere Sequenzabschnitte umfassen, welche nicht zur Interaktion mit Controller-Oligonukleotid oder Matrizen-Strang benötigt werden. Solche Sequenzabschnitte können beispielsweise weitere Oligonukleotide binden, welche als Detektionssonden oder Immobilisierungspartner bei einer Bindung an die feste Phase verwendet werden.
Primer-Funktion des ersten Primer-Oligonukleotides
Das erste Primer-Oligonukleotid kann in mehreren Teil-Schritten verwendet werden. In erster Linie übernimmt es eine Primer-Funktion in der Amplifikation. Dabei wird die Primer- Verlängerungsreaktion unter Verwendung des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes als Matrize ausgeführt. In einer weiteren Ausführungsform kann das erste Primer-Oligonukleotid zu Beginn der Amplifikationsreaktion die Start-Nukleinsäurekette als Matrize verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann das erste Primer-Oligonukleotid bei der Erstellung / Bereitstellung einer Start-Nukleinsäurekette verwendet werden.
Im Rahmen der Amplifikation dient der erste Primer als Initiator der Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes unter Verwendung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes als Matrize. Das 3 '-Segment des ersten Primers umfasst eine Sequenz, welche vorwiegend komplementär an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt binden kann. Die enzymatische Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotid unter Verwendung des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes als Matrize führt zur Ausbildung des ersten Primer- Verlängerungsproduktes. Ein solches erstes Primer-Verlängerungsprodukt umfasst die Zielsequenz bzw. ihre Sequenz-Anteile. Im Verlauf der Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes wird die Sequenz des kopierbaren Anteils des ersten Primer- Oligonukleotids von der Polymerase als Matrize erkannt und eine entsprechende komplementäre Sequenz wird synthetisiert, so dass eine entsprechende Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid resultiert. Die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes erfolgt bis einschließlich des 5'-Segments des zweiten Primer-Oligonukleotids. Unmittelbar nach der Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes ist dieses Produkt an das zweite Primer- Verlängerungsprodukt gebunden und bildet doppelsträngigen Komplex. Das zweite Primer- Verlängerungsprodukt wird aus diesem Komplex sequenzspezifisch durch das Controller- Oligonukleotid verdrängt. Dabei bindet das Controller-Oligonukleotid an das erste Primer- Verlängerungsprodukt. Nach einer erfolgreichen Strangverdrängung durch Controller- Oligonukleotid kann das zweite Primer-Verlängerungsprodukt wiederum selbst als Matrize für die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes dienen. Das nun frei gewordene 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes kann ein weiteres zweites Primer-Oligonukleotid binden, so dass eine neue Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes initiiert werden kann.
Weiterhin kann das erste Primer-Oligonukleotid als Initiator der Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes ausgehend von der Start-Nukleinsäurekette zu Beginn der Amplifikation dienen. In einer Ausführungsform ist die Sequenz des ersten Primers vollständig komplementär zum entsprechenden Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäurekette. In einer weiteren Ausführungsform ist die Sequenz des ersten Primer-Oligonukleotides nur teilweise komplementär zum entsprechenden Sequenzsegment einer Start-Nukleinsäurekette. Diese abweichende Komplementarität soll das erste Primer-Oligonukleotid allerdings nicht daran hindern, eine vorwiegend sequenzspezifische Primer-Verlängerungsreaktion zu starten. Die jeweiligen Unterschiede in der Komplementarität des ersten Primer-Oligonukleotides zur jeweiligen Position in der Start-Nukleinsäurekette liegen insbesondere im 5'-Segment des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides, so dass im 3'-Segment vorwiegend komplementäre Basenpaarung und Initiierung der Synthese möglich ist. Für die Initiierung der Synthese sollen beispielsweise besonders die ersten 4 - 10 Positionen im 3'-Segment vollkomplementär zur Matrize (Start- Nukleinsäurekette) sein. Die restlichen Nukleotidpositionen können von einer perfekten Komplementarität abweichen. Das Ausmaß einer perfekten Komplementarität im restlichen 5'- Segment des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides kann somit Bereiche umfassen zwischen 50% bis 100%, insbesondere zwischen 80% und 100% der Basenzusammensetzung. Je nach Länge des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides, umfassend die Sequenz- Abweichungen von 1 bis maximal 15 Positionen, insbesondere 1 bis maximal 5 Positionen. Das erste Primer-Oligonukleotid kann somit eine Synthese von einer Start-Nukleinsäurekette initiieren. Bei einer darauffolgenden Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes werden kopierbare Sequenzabschnitte des ersten Primer-Oligonukleotides von der Polymerase kopiert, so dass wiederum in darauf folgenden Synthese-Zyklen eine vollkomplementäre Primer- Bindungsstelle innerhalb des zweiten Primer-Verlängerungsprodukte für die Bindung des ersten Primer-Oligonukleotides ausgebildet wird und in darauf folgenden Synthese-Zyklen zur Verfügung steht. In einer weiteren Ausführungsform kann das erste Primer-Oligonukleotid im Rahmen der Vorbereitung einer Start-Nukleinsäurekette verwendet werden. Dabei kann ein solches erstes Primer-Oligonukleotid an eine Nukleinsäure (z.B. eine einzelsträngige genomische DNA oder RNA oder ihre Äquivalente umfassend einer Zielsequenz) vorwiegend / insbesondere sequenzspezifisch binden und in Anwesenheit einer Polymerase eine matrizenabhängige Primer- Verlängerungsreaktion initiieren. Die Bindungsposition ist dermaßen gewählt, dass das Primer- Verlängerungsprodukt eine gewünschte Zielsequenz umfasst. Durch die Verlängerung des ersten Primer-Oligonukleotides resultiert ein Nukleinsäure-Strang, welcher eine zur Matrize komplementäre Sequenz aufweist. Ein solcher Strang kann von der Matrize abgelöst werden (z.B. durch Hitze oder Alkalie) und damit in eine einzelsträngige Form überführt werden. Eine solche einzelsträngige Nukleinsäurekette kann als Start-Nukleinsäurekette zu Beginn der Amplifikation dienen. Eine solche Start-Nukleinsäurekette umfasst in ihrem 5'-Segment die Sequenzanteile des ersten Primer-Oligonukleotides, weiterhin umfasst sie eine Zielsequenz oder ihre Äquivalente und eine Primer-Bindungsstelle für das zweite Primer-Oligonukleotid. Weitere Schritte sind im Abschnitt„Start-Nukleinsäurekette“ erläutert.
Die Synthese des ersten Primer-Verlängerungsproduktes ist eine Primer-Verlängerungsreaktion und bildet einen Teilschritt in der Amplifikation. Die Reaktionsbedingungen während dieses Schrittes sind entsprechend angepasst. Die Reaktions-Temperatur und die Reaktions-Zeit sind dermaßen gewählt, dass die Reaktion erfolgreich stattfinden kann. Die jeweils vorteilhafteste Temperatur in diesem Schritt hängt von der verwendeten Polymerase ab und von der Bindungsstärke des jeweiligen ersten Primer-Oligonukleotides an seine Primer-Bindungsstelle und umfasst beispielsweise Bereiche von 15°C bis 75°C, insbesondere von 20 bis 65°C, insbesondere von 25°C bis 65°C. Die Konzentration des ersten Primer-Oligonukleotides umfasst Bereiche von 0,01 pmol/l bis 50 pmol/l, insbesondere von 0,1 pmol/l bis 20 pmol/l, insbesondere von 0,1 pmol/l bis 10 pmol/l.
In einer Ausführungsform verlaufen alle Schritte der Amplifikation unter stringenten Bedingungen, welche die Ausbildung von unspezifischen Produkten / Nebenprodukten verhindern bzw. verlangsamen. Zu solchen Bedingungen zählen beispielsweise höhere Temperaturen, beispielsweise über 50°C.
Falls mehr als eine spezifische Nukleinsäurekette in einem Ansatz amplifiziert werden muss, werden in einer Ausführungsform insbesondere jeweils sequenzspezifische Primer- Oligonukleotide für die Amplifikation von entsprechenden jeweiligen Zielsequenzen verwendet.
Insbesondere sind Sequenzen des ersten und zweiten Primer-Oligonukleotides und des Controller- Oligonukleotides dermaßen aneinander angepasst, dass Nebenreaktionen, z.B. Primer-Dimer- Ausbildung, minimiert sind. Zu diesem Zweck sind beispielsweise die Sequenz des ersten und des zweiten Primer-Oligonukleotides aneinander dermaßen angepasst, dass beide Primer- Oligonukleotide nicht in der Lage sind, eine Amplifikations-Reaktion in Abwesenheit einer passenden Matrize und/oder einer Zielsequenz und/oder einer Start-Nukleinsäurekette zu starten bzw. zu unterstützen. Das kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass das zweite Primer- Oligonukleotid keine Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid umfasst und das erste Primer-Oligonukleotid keine Primer-Bindungsstelle für das zweite Primer-Oligonukleotid umfasst. Weiterhin soll vermieden werden, dass die Primer-Sequenzen ausgedehnte eigen komplementäre Strukturen (Self-complement) umfassen.
In einer Ausführungsform verläuft die Synthese des ersten und des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes bei gleicher Temperatur. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Synthese des ersten und des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes bei unterschiedlichen Temperaturen. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes und die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid bei gleicher Temperatur. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes und die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid bei unterschiedlichen Temperaturen.
Primer-Oligonukleotide umfassend zusätzliche Sequenz-Segmente:
Die oben angeführten Strukturen des ersten Primers und des zweiten Primers können als sogenannte„Basis-Struktur des Primers“ bzw.„Minimale Struktur des Primers“ aufgefasst werden.
Solche Basis-Strukturen von Oligonukleotiden mit Primer-Funktion (z.B. erstes Primer- Oligonukleotid, zweites Primer-Oligonukleotid, ggf. drittes Primer-Oligonukleotid, ggf. viertes Primer-Oligonukleotid usw.) umfassen Sequenz-Segmente, welche für die Ausführung des Amplifikations-Verfahrens vorteilhaft sind, beispielsweise den ersten und zweiten Bereich des ersten Primers.
Eine solche Basis-Struktur der Primer kann durch weitere, zusätzliche Sequenz-Segmente erweitert werden. Solche zusätzlichen Sequenz-Segmente umfassen Strukturen, welche ihrerseits zwar nicht für die Ausführung des Amplifikations-Verfahrens notwendig sind, dennoch für andere Aufgaben nützlich sein können.
Solche zusätzliche Sequenz-Segmente können optional in einen Primer eingeführt werden und für weitere Funktionen bzw. Reaktionen eingesetzt werden. Dadurch können die von der Polymerase synthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte (ausgehend z.B. vom ersten und /oder vom zweiten Primer) mit solchen Sequenzen-Segmenten verbunden werden. Dadurch wird eine Integration solcher zusätzlichen Sequenz-Segmente und Primer-Verlängerungsprodukte zu einer molekularen Struktur erreicht. Eine solche Integration kann in gewissen Ausführungsformen vorteilhaft sein. Eine Vielzahl von Anwendungen für Primer-Sequenzen mit zusätzlichen Sequenz-Segmenten sind einem Fachmann bekannt.
Mehrere Funktionen sind einem Fachmann bekannt, welche durch zusätzliche Sequenz-Segmente des Primers unterstützt werden. Die Einführung von zusätzlichen Strukturen kann beispielsweise als Mittel zur Vermittlung einer intermolekularen oder intramolekularen Bindung verwendet werden. Einem Fachmann sind mehrere Beispiele solcher Strukturen bekannt. Beispielsweise können Sonden nach einem solchen Prinzip einer intra-molekularen Bindung gestaltet werden, z.B. im Rahmen von Scorpion- Primern. Beispielsweise können weiterhin Sequenzsegmente zur Bindung von weiteren Oligonukleotiden dienen. Dabei kann eine sequenz-spezifische inter-molekulare Bindung unter Verwendung von stringenten Bedingungen zustande kommen. Solche Interaktionen können beispielsweise für die Bindung von Amplifikations-Produkten an eine feste Phase durch komplementäre Bindung an immobilisierte Oligonukleotide verwendet werden.
Ein weiteres Beispiel stellt Einführung von sogenannten Adaptor-Sequenzen und / oder Verwendung von weiteren Sequenz-Segmenten zur eindeutigen Kodierung bzw. sequenz spezifischen Markierung von Primern und davon ausgehenden Primer-Verlängerungsprodukten (sogenanntes Primer Barcoding). Das wird beispielsweise für NGS-Library Preparation verwendet (Stählberg et al Nucleic Acids Res. 2016 Jun 20; 44(1 1 ): e105). Bei der Sequenz-Analyse von Primer-Verlängerungs-Produkten kann durch eine solche Markierung eine spätere Zuordnung von Sequenzen erfolgen.
Noch ein weiteres Beispiel stellt die Verwendung von weiteren Sequenz-Segmenten zur Einführung von spezifischen Sequenzen mit Bindung von gewissen Proteinen, z.B. Restrictions- Endonukleasen etc.
Noch ein weiteres Beispiel stellt die Verwendung von weiteren Sequenz-Segmenten zur Einführung von Abstand-Halter-Sequenzen (Spacer-Sequences), welche keinen spezifischen interaktions-Partner binden sollen, sondern vorwiegend zur Erhöhung des Abstandes zwischen benachbarten Sequenzen dienen.
Solche zusätzlichen Sequenzen können entweder am kopierbaren Anteil des Primers positioniert werden oder an den unkopierbaren Anteil des Primers angefügt werden. Mehrere Faktoren spielen eine Rolle bei der Beurteilung, ob ein Sequenzsegment kopiert wird oder nicht. Beispielsweise kann Positionierung des Sequenzsegmentes im jeweiligen Oligonukleotid, verwendete Nukleotid- Modifikationen (z.B. C3, HEG, 2'-Ome etc.) darüber entscheiden, ob ein Sequenz-Segment als Template während eines Verfahrensschrittes verwendet wird oder nicht.
In einer Ausführungsform wird ein zusätzliches Sequenz-Segment in kopierbaren Bereich des Primers, z.B. am 5'-Segment des kopierbaren Anteils des zweiten Primers, eingeführt, so dass beispielsweise bei der Ablesung der Primer-Sequenz während eines Synthese-Vorgangs einer Zielsequenz auch zusätzliche Sequenz-Segmente von der Polymerase ebenfalls abgelesen werden. Die Länge eines solchen zusätzlichen Sequenz-Segments umfasst Bereiche von 3 bis 50 Nukleotiden. Die Zusammensetzung dieser Sequenz-Segmente läßt bei dieser Ausführungsform die Synthese durch eine Polymerase zu, dieses Sequenz-Segment dient also als Matrize für Polymerase-abhängige Synthese. In einem solchen Segment werden beispielsweise natürliche Nukleotide verwendet, z.B. dA, dG, dC, dT. In einer weiteren Ausführungsform können zusätzliche Sequenz-Segmente beispielsweise am 5'- Terminus des Primers positioniert sein, welches nicht bei der Synthese von spezifischen Amplifikations-Fragmenten umfassend eine Zielsequenz kopiert werden soll. Dies kann beispielsweise durch Positionierung einer oder mehrerer Modifikationen bzw. chemischen Gruppen erreicht werden, welche Polymerase an der Synthese eines komplementären Stranges hindert (z.B. HEG, C3, ein Segment umfassend 4 - 10 Nukleotide mit 2'-Ome Modifikationen etc.). Eine solche Modifikation kann beispielsweise am 5'-Terminus des kopierbaren Anteils des zweiten Primers positioniert sein und die Fortführung der Synthese behindern. Beispielsweise kann am 5'- Ende des kopierbaren Segments des zweiten Primers eine HEG-Gruppe eingeführt werden, und danach ein zusätzliches Sequenz-Segment.
Weiterhin kann ein zusätzliches Sequenz-Segment am 5'-Terminus des zweiten Bereichs des ersten Primers positioniert werden. Durch eine solche Lokalisation von zusätzlichen Sequenz- Segmenten wird die Synthese eines komplementären Stranges während einer regulären Synthese von spezifischen Amplifikations-Produkten umfassend eine Zielsequenz verhindert.
Die Länge eines solchen zusätzlichen Sequenz-Segments umfasst Bereiche von 3 bis 50 Nukleotide. Die Basen-Zusammensetzung kann beispielsweise natürliche Nukleobasen (A,G, C, T, U, Inosine) oder Modifikationen an unterschiedlichen Positionen von Nukleotiden umfassen (z.B. an den Basen, wie 2-Amino-Adenin, Iso-Guanin, Iso-Cytosine, 5-Propargyl-Uridine, 5-Propargyl- Cytosine oder am Zucker-Phosphat-Rückgrat, wie beispielsweise LNA, 2'-Ome, 2'-Halogen etc.). In einer gewissen Ausführungsform werden ein erster Primer und zusätzliche Sequenz-Segmente zu einem Oligonukleotid zusammengefasst. In einer gewissen weiteren Ausführungsform werden ein zweiter Primer und zusätzliche Sequenz-Segmente zu einem Oligonukleotid zusammengefasst.
Solche zusätzlichen Sequenz-Segmente werden in einem Oligonukleotid dermaßen gestaltet, dass sie das Amplifikations-Verfahren von Zielsequenzen nicht verhindern. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, dass hemmende Interaktionen mit den für das Verfahren wesentlichen Strukturen der Primer bzw. Controller vermieden bzw. vermindert werden. In bestimmten Ausführungsformen können zusätzliche Strukturen unter den gewählten Reaktionsbedingungen mit anderen Primer- Bereichen komplementäre Doppelsträng-Segmente ausbilden. Insbesondere verhindern solche doppelsträngige Segmente allerdings eine spezifische Amplifikation einer Zielsequenz nicht. In bestimmten Ausführungsformen interagieren bzw. binden solche zusätzliche Sequenz-Segmente nicht an den ersten oder zweiten Primer-Bereich des ersten Primers. In bestimmten Ausführungsformen interagieren solche zusätzliche Sequenz-Segmente nicht mit dem Controller- Oligonukleotid. In bestimmten Ausführungsformen interagieren solche zusätzliche Sequenz- Segmente nicht mit anderen Primern in der Reaktion. In bestimmten Ausführungsformen interagieren solche zusätzliche Sequenz-Segmente nicht mit P1 1-Ext oder P2.1 -Ext oder anderen Amplifikations-Fragmenten umfassend eine Zielsequenz. In bestimmten Ausführungsformen bilden solche zusätzliche Sequenz-Segmente keine unter Reaktionsbedingungen stabile doppelsträngige Abschnitte mit dem ersten oder zweiten Bereich des ersten Primers, welche die Funktion des ersten oder des zweiten Bereichs vollständig verhindern.
In bestimmten Ausführungsformen interagieren bzw. binden solche zusätzliche Sequenz- Segmente nicht an den zweiten Primer. In bestimmten Ausführungsformen interagieren solche zusätzliche Sequenz-Segmente insbesondere nicht mit dem 3'-Segment des zweiten Primers.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der erste Primer an seinem 5'-Terminus des zweiten Bereichs ein zusätzliches Sequenz-Segment des ersten Primers (Zusatzsequenz Variante P1 ). Dieses Segment umfasst optional eine Sequenz von 10 - 50 Nukleotiden, welche nicht mit dem Amplifikations-Verfahren von Zielsequenzen interferiert (z.B. keine sekundären Strukturen mit Primern bildet). Weiterhin umfasst dieses Segment optional eine Sequenz von etwa 5 bis 15 Nukleotiden des kopierbaren ersten Bereichs des ersten Primers. Die Zusatzsequenz Variante P1 umfasst natürliche Nukleotide als Monomere (A, C, G,T) und kann potenziell als Matrize für eine Polymerase dienen.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der zweite Primer an seinem 5'-Terminus ein zusätzliches Sequenz-Segment des zweiten Primers (Zusatzsequenz Variante P2). Dieses Segment umfasst optional eine Sequenz von 10 - 50 Nukleotiden, welche nicht mit dem Amplifikations-Verfahren von Zielsequenzen interferiert (z.B. keine sekundären Strukturen mit Primern bildet). Weiterhin umfasst dieses Segment optional eine Sequenz von etwa 5 bis 15 Nukleotiden des kopierbaren Bereichs des zweiten Primers. Die Zusatzsequenz Variante P2 umfasst natürliche Nukleotide als Monomere (A, C, G,T) und kann potenziell als Matrize für eine Polymerase dienen.
Es wurde beobachtet, dass solche Oligonukleotide umfassend einen ersten Primer und Zusatzsequenz Variante P1 oder Oligonukleotide umfassend einen zweiten Primer und Zusatzsequenz Variante P2 im geringeren Maß anfällig für Neben-Reaktionen sind, als Oligonukleotide umfassend nur einen ersten Primer, oder Oligonukleotide umfassend nur einen zweiten Primer. In bestimmten Ausführungsformen kann beispielsweise die Generierung und / oder Amplifikation von unspezifischen Primer-Dimer-Strukturen verzögert werden. In einer solchen Nebenreaktion kann somit optional die Bildung von Nebenprodukten umfassend keine Zielsequenz verringert oder verzögert werden. Dadurch kann beispielsweise der vorzeitige Verbrauch von Primern reduziert oder verzögert werden. Vorteilhaft ist beispielsweise der Einsatz von solchen Oligonukleotiden, wenn durch Nebenreaktionen Primer-Dimere umfassend ersten Primer (PD P1 ) oder Primer-Dimere umfassend zweiten Primer (PD P2) erzeugt werden und zum vorzeitigen Verbrauch von Primern in der Reaktion führen. Verwendung von Primern mit solchen zusätzlichen Strukturen (erster Primer mit Zusatzsequenz Variante P1 und / oder zweiter Primer mit Zusatzsequenz Variante P2) ist in gewissen Ausführungsformen vom Vorteil, wenn in einer Amplifikations-Reaktion unspezifische Reaktionen beobachtet werden. Solche Nebenreaktionen können durch mehrere Faktoren begünstigt werden, dazu zählen unter anderem:
• längere Reaktionszeiten (z.B. in Bereichen zwischen 1 hr und 100 hr) • höhere Konzentrationen von Primern werden verwendet (z.B. in Bereichen zwischen 1 mitioI/I und 1 mmol/l)
• höhere Konzentrationen von Polymerase werden verwendet (z.B. in Bereichen über 10 Unit / 10 mI)
• Multiplex-Reaktionen (z.B. Amplifikation von mehr als 10 unterschiedlichen Zielsequenzen in einem Reaktions-Ansatz).
• hohe Konzentrationen von komplexen Nukleinsäureketten im Reaktions-Ansatz (z.B.
Konzentrationen über 1 pg hgDNA in 50 mI)
Einzelne Faktoren können dabei alleine oder in Kombination mit anderen Faktoren Nebenreaktionen begünstigen.
Im Allgemeinen kann man gegen Nebenreaktionen (z.B. unspezifische Primer-Dimer Bildung) Vorgehen, indem man Reaktions-Komponenten und / oder Reaktions-Bedingungen optimiert, beispielsweise durch Reduzierung von Konzentrationen von einzelnen Komponenten, kürzere Reaktions-Zeiten, Sequenz-Gestaltung von Primer-Sequenzen, Wahl von stringenteren Reaktions- Bedingungen. Die in einer vorteilhaften Ausführungsform angeführten zusätzliche Sequenz- Segmente (Oligonukleotide umfassend einen ersten Primer und Zusatzsequenz Variante P1 oder Oligonukleotide umfassend einen zweiten Primer und Zusatzsequenz Variante P2) stellen eine weitere Möglichkeit dar, gewisse Nebenreaktionen zu verzögern.
In Ausführungsbeispielen werden Primer-Oligonukleotide mit zusätzlichen Sequenz-Segmenten gezeigt. In diesen Ausführungsbeispielen werden zusätzliche Sequenz-Segmente verwendet, welche nicht an der spezifischen Amplifikation einer Zielsequenz teilnehmen und zur Verzögerung von Neben-Reaktionen beitragen. Somit werden Oligonukleotide umfassend einen ersten Primer und Zusatzsequenz Variante P1 und Oligonukleotide umfassend einen zweiten Primer und Zusatzsequenz Variante P2 verwendet.
Ein Fachmann wird erkennen, dass ein Oligonukleotid neben einer Primer-Struktur, welche für die spezifische Amplifikation einer Zielsequenz vorteilhaft ist (diese Struktur kann auch als„Basis- Struktur“ oder „Minimal-Struktur“ bezeichnet werden), auch weitere, zusätzliche Sequenz- Segmente umfassen kann (z.B. Zusatzsequenz Variante P1 oder Zusatzsequenz Variante P2). Solche zusätzliche Sequenz-Segmente können eine Vielzahl von unterschiedlichen weiteren vorteilhaften bzw. nützlichen Eigenschaften bzw. Funktionen vermitteln.
Bestimmte Ausführungsformen des Controller-Oligonukleotids
Der Aufbau und Funktion des Controller-Oligonukleotides wird am Beispiel des ersten Controller- Oligonukleotide erläutert. Der Aufbau des zweiten Controller-Oligonukleotides folgt gleichen Regeln. Die Unterschiede zwischen dem ersten und dem zweiten Controller können je nach Ausführungsform beispielsweise in konkreten Zusammensetzungen der Sequenzen, verwendeten Längen der jeweiligen Bereiche, sowie Nukleotid-Modifikationen liegen. Ein Controller-Oligonukleotid umfasst:
- Einen ersten einzelsträngigen Bereich, welcher an den Polynukleotid-Schwanz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides binden kann,
- einen zweiten einzelsträngigen Bereich, welcher an den ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotides im Wesentlichen komplementär binden kann,
- einen dritten einzelsträngigen Bereich, welcher zumindest zu einem Segment des
Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Verlängerungsprodukts im Wesentlichen komplementär ist,
und das Controller-Oligonukleotid dient nicht als Matrize für die Primerverlängerung des ersten oder des zweiten Primer-Oligonukleotids.
Im Allgemeinen wird die Sequenz des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotides an die Sequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure angepasst, da diese als Matrize für die Reihenfolge der Nukleotide im Verlängerungsprodukt eines ersten Primers maßgeblich ist. Die Sequenz des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotids wird an die Sequenz des ersten Primer-Bereiches angepasst. Die Struktur des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides wird an die Sequenz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides angepasst, vor allem an die Beschaffenheit des Polynukleotid-Schwanzes.
Ein Controller-Oligonukleotid kann auch weitere Sequenz-Segmente einschließen, welche nicht zum ersten, zweiten oder dritten Bereich gehören. Diese Sequenzen können beispielsweise als flankierende Sequenzen am 3'- und am 5'-Ende angebracht werden. Insbesondere stören diese Sequenzsegmente die Funktion des Controller-Oligonukleotids nicht.
Die Struktur des Controller-Oligonukleotids weist insbesondere folgende Eigenschaften auf:
Die einzelnen Bereiche sind untereinander kovalent gebunden. Die Bindung kann beispielsweise via konventionelle 5'-3' Bindung erfolgen. Es kann beispielsweise eine Phospho-Diesterbindung oder eine Nuklease-resistente Phospho-Thioester Bindung verwendet werden.
Ein Controller-Oligonukleotid kann mittels seines ersten Bereichs an den Polynukleotid-Schwanz des ersten Primer-Oligonukleotides binden, wobei die Bindung vorwiegend durch Hybridisierung komplementärer Basen vermittelt wird. Die Länge dieses ersten Bereichs beträgt 3 - 80 Nukleotide, insbesondere 4 - 40 Nukleotide, insbesondere 6 - 20 Nukleotide. Das Ausmaß an Sequenzübereinstimmung zwischen der Sequenz des ersten Bereichs des Controller- Oligonukleotids und der Sequenz des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotide kann zwischen 20 % und 100 %, insbesondere zwischen 50 % und 100 %, insbesondere zwischen 80 % und 100 % liegen. Die Bindung des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids sollte insbesondere spezifisch an den zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids unter Reaktionsbedingungen erfolgen.
Die Sequenz des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotids ist insbesondere dermaßen gewählt, dass die Anzahl von komplementären Basen, welche mit dem zweiten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids komplementär binden können, zwischen 1 und 40, insbesondere zwischen 3 und 20, insbesondere zwischen 6 und 15 liegt.
Da das Controller-Oligonukleotid keine Matrize für die Polymerase darstellt, kann es Nukleotid- Modifikationen einschließen, welche die Polymerase-Funktion nicht unterstützen, welche sowohl Basenmodifikationen und / oder Zucker-Phosphat-Rückgrad-Modifikationen sein können. Das Controller-Oligonukleotid kann beispielsweise in seinem ersten Bereich Nukleotide und/oder Nukleotid-Modifikationen einschließen, welche aus der folgenden Liste ausgewählt sind: DNA, RNA, LNA („locked nucleic acids“ Analoga mit 2'-4' Brückenbindung im Zuckerrest), UNA („unlocked nucleid acids“ ohne Bindung zwischen 2'-3'-Atomen des Zuckerrestes), PNA („peptide nucleic acids“ Analoga), PTO (Phosphorothioate), Morpholino-Analoga, 2'-0-Alkyl-RNA Modifikationen (wie 2'-OMe, 2'-0 Propargyl, 2'-0-(2-Methoxyethyl), 2'-0-Propyl-Amin), 2 - Halogen-RNA, 2'-Amino-RNA etc. Diese Nukleotide oder Nukleotid-Modifikationen sind untereinander beispielsweise durch konventionelle 5'-3'- Bindung oder 5'-2' Bindung verknüpft. Es kann beispielsweise eine Phospho-Diesterbindung oder eine Nuklease-resistente Phospho- Thioester Bindung verwendet werden.
Das Controller-Oligonukleotid kann in seinem ersten Bereich Nukleotide und/oder Nukleotid- Modifikationen einschließen, wobei die Nukleobasen aus der folgenden Liste ausgewählt sind: Adenine und seine Analoga, Guanine und seine Analoga, Cytosine und seine Analoga, Uracil und seine Analoga, Thymine und seine Analoga, Inosine oder andere Universalbasen (z.B. Nitroindol), 2-Amino-Adenin und seine Analoga, Iso-Cytosine und seine Analoga, Iso-Guanine und seine Analoga.
Das Controller-Oligonukleotid kann in seinem ersten Bereich Nicht-Nukleotid-Verbindungen einschließen, welche aus der folgenden Liste ausgewählt sind: Interkalierende Stoffe, welche die Bindungsstärke zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid beeinflussen können, z.B. MGB, Naphthalene etc. Gleiche Elemente können auch im zweiten Bereich des ersten Primers verwendet werden.
Das Controller-Oligonukleotid kann in seinem ersten Bereich Nicht-Nukleotid-Verbindungen einschließen, z.B. Linker wie C3, C6, HEG Linker, welche einzelne Segmente des ersten Bereichs untereinander verknüpfen.
Das Controller-Oligonukleotid kann mittels seines zweiten Bereichs an den ersten Primer-Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids binden, wobei die Bindung im Wesentlichen durch Hybridisierung komplementärer Basen vermittelt wird.
Die Länge des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotids ist an die Länge des ersten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotids angepasst und stimmt mit dieser insbesondere überein. Sie liegt zwischen ca. 3-30 Nukleotiden, insbesondere zwischen 5 und 20 Nukleotiden. Die Sequenz des zweiten Bereichs des Controller-Oligonukleotids ist insbesondere komplementär zum ersten Bereich des ersten Primer-Oligonukleotids. Das Maß der Übereinstimmung in Komplementarität liegt zwischen 80 % und 100 %, insbesondere zwischen 95 % und 100 %, insbesondere bei 100 %. Der zweite Bereich des Controller-Oligonukleotids schließt insbesondere Nukleotid-Modifikationen ein, welche die Polymerase an der Verlängerung des ersten Primer- Oligonukleotides hindern allerdings die Ausbildung von komplementären Doppelsträngen nicht blockieren oder nicht wesentlich hindern, beispielsweise 2'-0-Alkyl RNA-Analoga (z.B. 2'-0-Me, 2'-0-(2-Methoxyethyl), 2'-0-Propyl, 2'-0-Propargyl Nukleotid-Modifikationen), LNA, PNA oder Morpholino Nukleotid-Modifikationen. Einzelne Nukleotid-Monomere sind insbesondere via 5'-3'- Bindung verknüpft, aber auch eine alternative 5'-2'-Bindung zwischen Nukleotid-Monomeren kann verwendet werden.
Die Sequenz-Länge und ihre Beschaffenheit des ersten und des zweiten Bereichs des Controller- Oligonukleotides sind insbesondere dermaßen gewählt, dass die Bindung dieser Bereiche an das erste Primer-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen mindestens in einem Reaktions-Schritt des Verfahrens reversibel ist. Das bedeutet, dass das Controller-Oligonukleotid und das erste Primer-Oligonukleotid zwar spezifisch an einander binden können, diese Bindung soll allerdings nicht zur Ausbildung eines unter Reaktionsbedingungen dauerhaft stabilen Komplexes aus beiden Elementen führen.
Vielmehr soll ein Gleichgewicht zwischen einer gebunden Komplex-Form aus Controller- Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid und einer freien Form von einzelnen Komponenten unter Reaktionsbedingungen zumindest in einem Reaktions-Schritt angestrebt bzw. ermöglicht werden. Damit wird sichergestellt, dass zumindest ein Anteil der ersten Primer- Oligonukleotide unter Reaktionsbedingungen in freier Form vorliegt und mit der Matrize interagieren kann, um eine Primer-Verlängerungsreaktion zu initiieren. Andererseits, wird damit sichergestellt, dass entsprechende Sequenzbereiche des Controller-Oligonukleotides zur Bindung mit einem verlängerten Primer-Oligonukleotid zur Verfügung stehen.
Durch Temperatur-Wahl während der Reaktion kann der Anteil von freien, einzelsträngigen und somit reaktionsfähigen Komponenten beeinflusst werden: durch Absenkung der Temperatur binden erste Primer-Oligonukleotide an die Controller-Oligonukleotide, so dass beide Teilnehmer einen komplementären doppelsträngigen Komplex binden. Damit kann die Konzentration einzelsträngiger Formen einzelner Komponenten abgesenkt werden. Eine Erhöhung der Temperatur kann zur Dissoziation beider Komponenten in einzelsträngige Form führen. Im Bereich der Schmelz-Temperatur des Komplexes (Controller-Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid) liegen ca. 50% der Komponenten in einzelsträngiger Form und ca. 50% als doppelsträngiger Komplex vor. Durch Verwendung entsprechender Temperaturen kann somit die Konzentration einzelsträngiger Formen im Reaktionsgemisch beeinflusst werden.
Bei Ausführungsformen des Amplifikationsverfahrens, welche Temperatur-Wechsel zwischen einzelnen Reaktions-Schritten umfassen, können gewünschte Reaktionsbedingungen während entsprechender Reaktions-Schritte herbeigeführt werden. Beispielsweise durch die Verwendung von Temperatur-Bereichen etwa in Höhe von der Schmelztemperatur von Komplexen aus Controller-Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid können Anteile von jeweils freien Formen einzelner Komponenten beeinflusst werden. Dabei führt die verwendete Temperatur zu einer Destabilisierung von Komplexen umfassend Controller-Oligonukleotid / erstes Primer- Oligonukleotid, so dass während dieses Reaktionsschrittes einzelne Komplex-Komponenten zumindest vorübergehend einzelsträngig werden und damit in die Lage versetzt werden, mit anderen Reaktionspartnern zu interagieren. Beispielsweise kann ein erster Sequenzbereich des Controller-Oligonukleotides aus dem doppelsträngigen Komplex mit einem nicht-verlängerten ersten Primer freigesetzt werden und kann somit mit dem zweiten Sequenzbereich eines verlängerten ersten Primer-Oligonukleotides interagieren und damit eine Strangverdrängung initiieren. Andererseits, führt die Freisetzung eines ersten, nicht verlängerten Primer- Oligonukleotides aus einem Komplex umfassend Controller-Oligonukleotid / erster Primer- Oligonukleotid dazu, dass der erste Primer-Bereich einzelsträngig wird und somit mit der Matrize interagieren kann, so dass eine Primer-Verlängerung durch eine Polymerase initiiert werden kann.
Die verwendete Temperatur muss dabei nicht exakt der Schmelztemperatur des Komplexes aus Controller-Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid entsprechen. Es genügt, wenn eine Temperatur in einem Reaktionsschritt etwa im Bereich der Schmelztemperatur verwendet wird. Beispielsweise umfasst die Temperatur in einem der Reaktionsschritte Bereiche von Tm +/- 10°C, insbesondere Tm +/- 5°C, insbesondere Tm +/- 3°C des Komplexes aus Controller-Oligonukleotid / erstes Primer-Oligonukleotid.
Eine solche Temperatur kann beispielsweise im Rahmen des Reaktions-Schrittes eingestellt werden, welcher eine sequenzspezifische Strand Verdrängung durch das Controller-Oligonukleotid umfasst.
Bei Ausführungsformen des Amplifikationsverfahrens, welche keinen Temperatur-Wechsel zwischen einzelnen Reaktions-Schritten umfassen und wo die Amplifikation unter isothermalen Bedingungen verläuft, werden über die Gesamtdauer der Amplifikationsreaktion Reaktionsbedingungen aufrechterhalten, bei welchen ein Gleichgewicht zwischen einer Komplex- Form aus Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid und einer freien Form von einzelnen Komponenten möglich ist.
Das Verhältnis zwischen einer Komplex-Form aus Controller-Oligonukleotid und dem ersten Primer-Oligonukleotid und freien Formen einzelner Komponenten kann sowohl durch Reaktionsbedingungen (z.B. Temperatur und Mg2+ Konzentration) als auch durch Strukturen und Konzentrationen einzelner Komponenten beeinflusst werden.
Die Sequenz-Länge und ihre Beschaffenheit des ersten und des zweiten Bereichs des Controller- Oligonukleotides sind in einer Ausführungsform so gewählt, dass unter gegebenen Reaktionsbedingungen (z.B. im Reaktionsschritt einer Strangverdrängung durch das Controller- Oligonukleotid) das Verhältnis zwischen einem Anteil eines freien Controller-Oligonukleotids und einem Anteil eines Controller-Oligonukleotids im Komplex mit einem ersten Primer-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst: von 1 :100 bis 100:1 , insbesondere von 1 :30 bis 30:1 , besonders von 1 :10 bis 10:1 . Das Verhältnis zwischen einem Anteil eines freien ersten Primer-Oligonukleotid und einem Anteil eines ersten Primer-Oligonukleotids im Komplex mit einem Controller-Oligonukleotid umfasst Bereiche von 1 : 100 bis 100:1 , insbesondere von 1 :30 bis 30:1 , insbesondere von 1 :10 bis 10:1 .
In einer Ausführungsform ist die Konzentration des ersten Primer-Oligonukleotides höher als die Konzentration des Controller-Oligonukleotides. Dadurch liegt ein Überschuss des ersten Primers in der Reaktion vor und das Controller-Oligonukleotid muss für seine Wirkung aus der Bindung mit dem ersten Primer durch die Wahl einer entsprechenden Reaktionstemperatur freigesetzt werden. Im Allgemeinen erfolgt das durch eine Temperaturerhöhung, bis hinreichende Konzentrationen von freien Formen des Controller-Oligonukleotids vorliegen.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Konzentration des ersten Primer-Oligonukleotides niedriger als die Konzentration des Controller-Oligonukleotides. Dadurch liegt ein Überschuss des Controller-Oligonukleotids vor und das erste Primer-Oligonukleotid muss für seine Wirkung aus der Bindung mit dem Controller-Oligonukleotid durch die Wahl einer entsprechenden Reaktionstemperatur freigesetzt werden. Im Allgemeinen erfolgt das durch eine Temperaturerhöhung, bis hinreichende Konzentrationen von freien Formen des ersten Primer- Oligonukleotids vorliegen.
Bei isothermalen Bedingungen liegt ein Gleichgewicht vor: gewisse Anteile des ersten Primer- Oligonukleotides und Controller-Oligonukleotides sind aneinander gebunden, andere dagegen sind als einzelsträngige Form in der Reaktion vorhanden.
Das Controller-Oligonukleotid kann mittels seines dritten Bereichs an mindestens ein Segment des spezifisch synthetisierten Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotids binden. Die Bindung erfolgt insbesondere durch Hybridisierung komplementärer Basen zwischen dem Controller-Oligonukleotid und dem von der Polymerase synthetisierten Verlängerungsprodukt.
Zur Unterstützung der Strangverdrängungsreaktion soll die Sequenz des dritten Bereichs insbesondere eine hohe Komplementarität zum Verlängerungsprodukt aufweisen. In einer Ausführungsform ist die Sequenz des dritten Bereichs zu 100 % zu dem Verlängerungsprodukt komplementär.
Die Bindung des dritten Bereichs erfolgt insbesondere an das Segment des Verlängerungsproduktes, welches unmittelbar an den ersten Bereich des ersten Primer- Oligonukleotides anschließt. Somit liegt das Segment des Verlängerungsprodukts insbesondere im 5'-Segment des gesamten Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotids.
Die Bindung des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotids erfolgt insbesondere nicht über die gesamte Länge des Verlängerungsprodukts des ersten Primer-Oligonukleotides. Insbesondere bleibt ein Segment am 3'-Ende des Verlängerungsproduktes ungebunden. Dieses 3'-ständige Segment ist für die Bindung des zweiten Primer-Oligonukleotides notwendig. Die Länge des dritten Bereichs ist entsprechend dermaßen angepasst, dass der dritte Bereich zum einen an das 5'-ständige Segment des Verlängerungsproduktes bindet, andererseits das 3'- ständige Segment des Verlängerungsproduktes nicht bindet.
Die Gesamtlänge des dritten Bereichs des Controller-Oligonukleotids beträgt von 2 bis 100, insbesondere von 6 bis 60, insbesondere von 10 bis 40 Nukleotide oder ihrer Äquivalente. Das Controller-Oligonukleotid kann mit dem Segment des Verlängerungsproduktes über diese Länge eine komplementäre Bindung eingehen und damit dieses 5'-ständige Segment des Verlängerungsprodukts aus der Bindung mit seinem komplementären Matrizen-Strang verdrängen.
Die Länge des 3'-ständigen Segments des Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller- Oligonukleotid gebunden wird, umfasst beispielsweise Bereiche zwischen 20 und 200 Nukleotide, insbesondere zwischen 20 und 100 Nukleotide, insbesondere zwischen 30 und 80, insbesondere zwischen 30 und 60 Nukleotide.
Dieses 3'-ständige Segment des Verlängerungsprodukts wird nicht vom Controller-Oligonukleotid aus der Bindung mit dem Matrizenstrang verdrängt. Auch bei vollständig gebundenem dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids an sein komplementäres Segment des Verlängerungsproduktes kann das erste Primer-Verlängerungsprodukt via seinem 3'-ständigen Segment mit dem Matrizenstrang gebunden bleiben.
In einer Ausführungsform ist die Sequenzlänge dieses 3'-Segmentes dermaßen gewählt, dass die beiden Primer-Verlängerungsprodukte bei Bindung von nur einem Controller nicht dissoziieren. Es bedarf also die gleichzeitige Bindung von beiden Controllern an ihre entsprechenden Primer- Verlängerungsprodukte, damit diese von einander dissoziieren können.
Das Controller-Oligonukleotid hat insgesamt eine passende Struktur, um seine Funktion auszuführen: unter entsprechenden Reaktionsbedingungen ist es in der Lage, das verlängerte erste Primer-Oligonukleotid aus der Bindung mit dem Matrizenstrang sequenzspezifisch zu verdrängen, wodurch der Matrizenstrang in eine einzelsträngige Form überführt wird und somit für weitere Bindungen mit einem neuen ersten Primer-Oligonukleotid und deren zielsequenz spezifischer Verlängerung durch die Polymerase zur Verfügung steht.
Um die Funktion der Strangverdrängung zu erfüllen, sollten Bereiche eins, zwei und drei des Controller-Oligonukleotids vorwiegend in einzelsträngiger Form unter Reaktionsbedingungen vorliegen. Daher sollten doppelsträngige selbstkomplementäre Strukturen (z.B. Hairpins) in diesen Bereichen nach Möglichkeit vermieden werden, da sie die Funktionalität des Controller- Oligonukleotides herabsetzen können.
Das Controller-Oligonukleotid soll im erfindungsgemäßen Verfahren nicht als Matrize auftreten, daher soll das erste Primer-Oligonukleotid, wenn angelagert an das Controller-Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen, nicht von der Polymerase verlängert werden. Dies wird insbesondere durch die Verwendung von Nukleotid-Modifikationen erreicht, welche die Polymerase am Kopieren des Stranges hindern. Insbesondere bleibt das 3'-Ende des ersten Primer-Oligonukleotid nicht verlängert, wenn das erste Primer-Oligonukleotid an das Controller- Oligonukleotid unter Reaktionsbedingungen bindet.
Das Ausmaß der Blockade/Hinderung/Verlangsamung/Erschwerung der Reaktion kann zwischen vollständiger Ausprägung dieser Eigenschaft (z.B. 100 % Blockade unter gegebenen Reaktionsbedingungen) und einer partiellen Ausprägung dieser Eigenschaft liegen (z.B. 30-90 % Blockade unter gegebenen Reaktionsbedingungen). Insbesondere werden Nukleotid- Modifikationen, welche einzeln oder in einer Reihe aneinander gekoppelt (z.B. als Sequenzfragment bestehend aus modifizierten Nukleotiden) mehr als 70 %, insbesondere mehr als 90 %, insbesondere mehr als 95 %, und insbesondere 100 % die Verlängerung eines ersten Primers verhindern können.
Die Nukleotid-Modifikationen können Basen-Modifikationen und/oder Zucker-Phosphat-Rest Modifikationen umfassen. Die Zucker-Phosphat-Modifikationen sind vorteilhaft, da durch Kombination mit konventionellen Nukleobasen eine beliebige komplementäre Sequenz eines Controller-Oligonukleotides zusammengestellt werden kann. Die Nukleotide mit Modifikationen im Zucker-Phosphat-Rest, welche zur Hinderung bzw. Blockade der Synthese der Polymerase führen können, schließen beispielsweise ein: 2'-0-Alkyl-Modifikationen (z.B. 2'-0-Methyl, 2'-0-(2- Methoxyethyl), 2'-0-Propyl, 2'-0-Propargyl Nukleotid-Modifikationen), 2'-Amino-2'-Deoxy- Nukleotid-Modifikationen, 2'-Amino-Alkyl-2'-Deoxy-Nukleotid-Modifikationen, PNA, Morpholino- Modifikationen usw.
Die Blockade kann sowohl durch eine einzelne Nukleotid-Modifikation erfolgen oder erst durch Kopplung von mehreren Nukleotid-Modifikationen in Reihe erfolgen (z.B. als Sequenzfragment bestehend aus modifizierten Nukleotiden). Beispielsweise können mindestens 2, insbesondere mindestens 5, insbesondere mindestens 10 solcher Nukleotid-Modifikationen nebeneinander im Controller-Oligonukleotid gekoppelt sein.
Ein Controller-Oligonukleotid kann eine einheitliche Art von Nukleotid-Modifikationen aufweisen oder auch mindestens zwei verschiedene Arten der Nukleotid-Modifizierung umfassen.
Die Position solcher Nukleotid-Modifikationen im Controller-Oligonukleotid soll insbesondere die Polymerase daran hindern, das 3'-Ende eines am Controller-Oligonukleotid gebundenen ersten Primer-Oligonukleotids zu verlängern.
In einer Ausführungsform sind solche Nukleotid-Modifikationen im zweiten Bereich des Controller- Oligonukleotids lokalisiert. In einerweiteren Ausführungsform sind solche Nukleotid-Modifikationen im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids lokalisiert. In einerweiteren Ausführungsform sind solche Nukleotid-Modifikationen im zweiten und im dritten Bereich des Controller-Oligonukleotids lokalisiert. Beispielsweise besteht der zweite Bereich des Controller-Oligonukleotids zu mindestens 20 % seiner Positionen aus solchen Nukleotid-Modifikationen, insbesondere zu mindestens 50 %.
Beispielsweise besteht der dritte Bereich des Controller-Oligonukleotids zu mindestens 20 % seiner Positionen aus solchen Nukleotid-Modifikationen, insbesondere zu mindestens 50 %, insbesondere zu mindestens 90%. In einer Ausführungsform umfasst der gesamte dritte Bereich Nukleotid-Modifikationen, welche eine Polymerase daran hindern, einen an einen solchen Bereich gebundenen Primer unter Verwendung des Controller-Oligonukleotides als Matrize zu verlängern. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der gesamte dritte und zweite Bereich solche Nukleotid-Modifikationen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der gesamte erste, zweite und dritte Bereich solche Nukleotid-Modifikationen. Somit kann das Controller-Oligonukleotid vollständig aus solchen Nukleotid-Modifikationen bestehen. Solche modifizierten Controller- Oligonukleotide können beispielsweise bei Multiplex-Analysen verwendet werden, bei welchen weitere Primer verwendet werden. Dadurch soll verhindert werden, dass es zu unbeabsichtigten Primer-Verlängerungs-Reaktionen an einem oder mehreren Controller-Oligonukleotiden kommt.
Die Sequenz der Nukleobasen von diesen Nukleotid-Modifikationen ist den Anforderungen an die Sequenz im jeweiligen Bereich angepasst.
Den restlichen Anteil können beispielsweise natürliche Nukleotide ausmachen, oder Nukleotid- Modifikationen, welche die Polymerasen-Funktion gar nicht oder nur unwesentlich hindern z.B. DNA-Nukleotide, PTO-Nukleotide, LNA-Nukleotide, RNA-Nukleotide. Dabei können weitere Modifikationen, beispielsweise Basenmodifikationen wie 2-Amino-Adenosin, 2-Aminopurine, 5- Methyl-Cytosine, Inosine, 5-Nitroindole, 7-Deaza-Adenosin, 7-Deaza-Guanosin, 5-Propyl-Cytosin, 5-Propyl-Uridin oder Nicht-Nukleotid-Modifikationen wie Farbstoffe, oder MGB-Modifikationen etc. z.B. zur Anpassung von Bindungsstärken von einzelnen Bereichen der Controller-Oligonukleotide verwendet werden. Die einzelnen Nukleotid-Monomere können via konventionelle 5'-3'-Bindung untereinander gekoppelt werden oder auch abweichend via 5'-2'-Bindung.
Ein Segment des Controller-Oligonukleotids mit Nukleotid-Modifikationen, welche die Verlängerung vom 3'-Ende eines an den Controller-Oligonukleotid gebundenen ersten Primer- Oligonukleotids durch die Polymerase verhindern, wird als "zweite Blockierungs-Einheit" bezeichnet. Die Länge dieses Segments kann zwischen 1 bis 50 Nukleotid-Modifikationen einschließen, insbesondere zwischen 4 und 30. Dieses Segment kann beispielsweise dermaßen im Controller-Oligonukleotid lokalisiert sein, dass das 3'-Ende des gebundenen ersten Primer- Oligonukleotids in diesem Segment liegt. Somit kann dieses Segment die Bereiche zwei und drei überspannen.
In einer Ausführungsform werden insbesondere keine Linker-Strukturen oder Spacer-Strukturen, wie C3, C6, HEG-Linker zur Verhinderung der Verlängerung des 3'-Ende eines an das Controller- Oligonukleotid gebundenen ersten Primer-Oligonukleotids verwendet. In einer Ausführungsform umfasst ein Controller-Oligonukleotid in seinem dritten Bereich mindestens eine Komponente des Detektions-Systems (z.B. Fluoreszenzreporter oder Fluoreszenzquencher oder einen Donor-Fluorophor). Die Position dieser Komponente liegt in einer Ausführungsform am 5'-Ende des Controller-Oligonukleotides. In einer anderen Ausführungsform liegt diese Komponente im inneren Sequenzsegment des dritten Bereichs. Dabei kann die Distanz bis zum 5'-Ende des Controller-Oligonukleotides zwischen 2 bis 50 Nukleotide betragen, insbesondere zwischen 2 und 20, insbesondere zwischen 2 und 10 Nukleotiden. Bei einer gleichzeitigen Bindung der Oligonukleotid-Sonde und des Controller-Oligonukleotides am selben ersten Primer-Verlängerungsprodukt kommt es dabei zu einer räumlichen Nähe der beiden Komponenten des Detektions-Systems (z.B. zwischen einem Fluoreszenzreporter an der Oligonukleotid-Sonde und einem Donor-Fluorophor am Controller-Oligonukleotid).
Das Controller-Oligonukleotid kann außer Bereichen eins, zwei und drei noch weitere Sequenzsegmente umfassen, welche beispielsweise im 5'-Segment oder 3'-Segment des Controller-Oligonukleotids die oben genannten Bereiche flankieren. Solche Sequenzelemente können beispielsweise für weitere Funktionen verwendet werden, wie beispielsweise Interaktion mit Sonden, Bindung an feste Phase etc. Solche Bereiche stören insbesondere die Funktion der Bereiche eins bis drei nicht. Die Länge dieser flankierenden Sequenzen kann beispielsweise zwischen 1 bis 50 Nukleotide betragen. Weiterhin kann ein Controller-Oligonukleotid mindestes ein Element zur Immobilisierung an einer festen Phase umfassen, z.B. ein Biotin-Rest. Weiterhin kann ein Controller-Oligonukleotid mindestes ein Element zu Detektion umfassen, z.B. einen Fluoreszenz-Farbstoff.
In Anwesenheit von einem Controller-Oligonukleotid werden neusynthetisierte Sequenzen auf ihre Sequenz-Inhalte durch die Interaktion mit dem Controller-Oligonukleotid überprüft.
• Bei korrekter Übereinstimmung mit vorgegebenen Sequenzinhalten des Controller- Oligonukleotides erfolgt eine Strangverdrängung, wobei die Matrizen-Stränge von neusynthetisierten Strängen abgelöst werden. Dabei werden Primer-Bindungsstellen in den einzelsträngigen Zustand überführt und stehen für eine neue Interaktion mit Primern und somit für eine weitere Synthese zur Verfügung. Somit wird das System aus beiden Primer-Verlängerungsprodukten in einen aktiven Zustand versetzt. Das Controller- Oligonukleotid hat somit eine aktivierende Wirkung auf das System.
• Bei fehlender Übereinstimmung mit vorgegebenen Sequenzinhalten des Controller- Oligonukleotides wird die Strangverdrängung der Matrizen-Stränge von neusynthetisierten Strängen beeinflusst. Die Strangverdrängung und /oder Ablösung wird entweder quantitativ verlangsamt oder komplett aufgehoben. Es kommt somit gar nicht oder seltener zur Überführung von Primer-Bindungsstellen in den einzelsträngigen Zustand. Somit stehen für eine neue Interaktion mit Primern gar keine oder quantitativ gesehen weniger Primer- Bindungsstellen zur Verfügung. Somit wird das System aus beiden Primer- Verlängerungsprodukten seltener in einen aktiven Zustand versetzt bzw. ein aktiver Zustand wird gar nicht erreicht.
Die Effizienz der Doppelstrang-Öffnung der neusynthetisierten Primer-Verlängerungsprodukte nach jedem einzelnen Synthese-Schritt wirkt sich auf die potenziell erreichbaren Ausbeuten in darauf folgenden Zyklen aus: je weniger freier/einzelsträngiger Primer-Bindungsstellen einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette zu Beginn eines Synthese-Schrittes zur Verfügung gestellt werden, um so geringer ist die Anzahl von neusynthetisierten Strängen der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette in diesem Schritt. Anders ausgedrückt: Die Ausbeute eines Synthese-Zyklus ist proportional zu der Menge an Primer-Bindungsstellen, welche für die Interaktion mit entsprechenden komplementären Primern zur Verfügung stehen. Insgesamt kann dadurch ein Regelungs-Kreis realisiert werden.
Dieser Regelungs-Kreis entspricht einer Echtzeit-Kontrolle (real-time / on-line control) von synthetisierten Fragmenten: Die Sequenz-Kontrolle erfolgt im Reaktionsansatz während die Amplifikation stattfindet. Diese Sequenzkontrolle erfolgt nach einem vorgegebenen Muster und das Oligonukleotid-System (durch Strang-Öffnende Wirkung des Controller-Oligonukleotids) kann ohne äußere Einmischung zwischen "korrekten" und "nicht-korrekten" Zuständen entscheiden. Im korrekten Zustand wird die Synthese von Sequenzen fortgesetzt, im nicht-korrekten Zustand wird die Synthese entweder verlangsamt oder vollständig verhindert. Die resultierenden Unterschiede in Ausbeuten an„korrekten“ und„nicht-korrekten“ Sequenzen nach jedem Schritt wirken sich auf die gesamte Amplifikation aus, welche eine Vielzahl solcher Schritte umfasst.
Bei einer exponentiellen Amplifikation ist diese Abhängigkeit exponentiell, so dass sogar geringfügige Unterschiede in der Effizienz im Rahmen eines einzelnen Synthese-Zyklus aufgrund von Sequenzunterschieden eine signifikante zeitliche Verzögerung der Gesamtamplifikation bedeuten können, bzw. das vollständige Ausbleiben einer detektierbaren Amplifikation in einem vorgegebenen Zeitrahmen bewirken.
Dieser Effekt der Echtzeit-Kontrolle der neusynthetisierten Nukleinsäureketten ist verbunden mit dem Einsatz des Controller-Oligonukleotides und der Einfluss des Controller-Oligonukleotids im Rahmen einer Amplifikation geht somit über die Länge von Primer-Oligonukleotiden deutlich hinaus.
Reaktionsbedingungen bei der Strangverdrängungsreaktion
Die Verdrängung des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt mittels einer sequenzabhängigen Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid bildet einen Teilschritt in der Amplifikation. Die Reaktionsbedingungen während dieses Schrittes sind entsprechend angepasst. Die Reaktions-Temperatur und die Reaktions-Zeit sind dermaßen gewählt, dass die Reaktion erfolgreich stattfinden kann.
In einer Ausführungsform verläuft die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid bis zur Ablösung / Dissoziation des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes aus der Bindung mit dem ersten Primer-Verlängerungsprodukt. Eine solche Dissoziation des 3'-Segment des ersten Primer- Verlängerungsproduktes von komplementären Anteilen des zweiten Primerverlängerungsproduktes kann spontan erfolgen im Rahmen einer Temperatur-abhängigen / Temperatur-bedingten Trennung von beiden Primer- Verlängerungsprodukten. Eine solche Dissoziation wirkt sich günstig auf Kinetik der Amplifikationsreaktion aus und kann durch die Wahl der Reaktionsbedingungen beeinflusst werden, z.B. mittels Temperatur-Bedingungen. Die Temperatur-Bedingungen werden deshalb dermaßen gewählt, dass eine erfolgreiche Strangverdrängung durch komplementäre Bindung des Controller-Oligonukleotides eine Dissoziation des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes vom 3'-Segment des ersten Primer- Verlängerungsproduktes begünstigt.
Aufgrund der Wirkung von beiden Controllern kann die Reaktion entsprechend schnell verlaufen.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Länge des Controllers und die Länge der Primer- Verlängerungsprodukte dermaßen gewählt, dass die Bindung eines einzigen Controller- Oligonukleotides für eine Trennung von beiden Primer- Verlängerungsprodukten nicht ausreicht. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn die neu synthetisierten Stränge erst durch gleichzeitige Bindung von beiden Controller-Oligonukleotiden an ihre komplementäre Segmente dissoziieren können.
In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Strangverdrängung durch das Controller- Oligonukleotid bis zur Ablösung / Dissoziation eines 3'-Segmentes des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes (P2.1-Ext) aus der komplementären Bindung mit dem ersten Primer- Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext), wobei dieses 3'-Segment des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes (P2.1-Ext) zumindest einen komplementären Bereich zum ersten Primer umfasst und ein komplementäres Segment zum ersten Primerverlängerungsprodukt (P1 .1 -Ext), welches erst bei der enzymatischen Synthese entstanden ist. Dabei kommt es zur Ausbildung eines Komplexes (C1 .1/ P1 .1 -Ext / P2.1 .-Ext), welcher sowohl das erste Primer- Verlängerungsprodukt (P1 .1 -Ext), das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 -Ext) sowie das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) umfasst. In einem solchen Komplex liegt das 3'-Segment des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes zumindest vorübergehend in einzelsträngiger Form vor, da es vom Controller-Oligonukleotid aus seiner Bindung mit dem ersten Primer- Verlängerungsprodukt verdrängt werden kann. Schematisch dargestellt, besteht ein Gleichgewicht zwischen Bindung und Ablösung des P2.1 -Ext an das P1 .1 -Ext. Das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes (P1 .1-Ext) liegt in einem solchen Komplex komplementär hybridisiert an das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1 -Ext).
Aufgrund einer teilweise offenen Primer-Bindungsstelle für das erste Primer-Oligonukleotid (3'- Segment des zweiten Primer-Verlängerungsprodukts) kann ein neues Primer- Verlängerungsprodukt (P1 .2) an ein einzelsträngiges Sequenzsegment des noch im Komplex liegenden (P2.1-Ext) unter Reaktionsbedingungen binden und somit eine Synthese eines neuen ersten Primer-Verlängerungsproduktes (P1 .2-Ext) durch eine Polymerase initiieren. In der Regel verläuft diese Reaktion mit verminderter Geschwindigkeit, da das 3'-Segment des P2.1 -Ext nicht dauerhaft einzelsträngig vorliegt, sondern im kompetitiven Verhalten mit dem Controller- Oligonukleotid steht und damit abwechselnd einzelsträngige und doppelsträngige Zustände durch Bindung an das P1 1 -Ext aufweist.
Fortführung dieser neugestarteten Synthese von P1 2-Ext unter Verwendung des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes als Matrize (P2.1 -Ext) kann durch Polymerase-bedingte Strangverdrängung ebenfalls zur Dissoziierung des Komplexes (C1 .1/ P1 1 -Ext / P2.1 .-Ext) führen. Dabei wirken das Controller-Oligonukleotid, temperatur-abhängige Doppelstrang-Destabilisierung und Strang-Verdrängung durch die Polymerase synergistisch und komplementär. Es resultiert eine Dissoziation des 3'-Segments des ersten Primer-Verlängerungsproduktes (P1 .1-Ext) von komplementären Anteilen des zweiten Primerverlängerungsproduktes (P2.1-Ext).
Eine solche Dissoziation wirkt sich günstig auf Kinetik der Amplifikationsreaktion aus und kann durch die Wahl der Reaktionsbedingungen beeinflusst werden, z.B. mittels Temperatur- Bedingungen. Das Mitwirken der Polymerase-vermittelten syntheseabhängigen Strangverdrängung an der Dissoziierung von P1 .1-Ext und P2.1 -Ext hat einen begünstigenden Effekt bei der Strangtrennung.
Die Temperatur in diesem Schritt umfasst beispielsweise Bereiche von 15°C bis 75°C, insbesondere von 30°C bis 70°C, insbesondere von 50°C bis 70°C.
Bei gegebener Länge des ersten Bereichs des Controller-Oligonukleotides und des zweiten Bereichs des ersten Primer-Oligonukleotides (umfassend beispielsweise Bereiche von 3 bis 25 Nukleotid-Monomere, insbesondere von 5 bis 15 Nukleotid-Monomere) kann eine Strangverdrängungsreaktion im Allgemeinen erfolgreich initiiert werden. Bei vollständiger Komplementarität des Controller-Oligonukleotids zu entsprechenden Anteilen des ersten Primer- Verlängerungsproduktes kann das Controller-Oligonukleotid an das erste Primer- Verlängerungsprodukt bis auf das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes binden und das zweite Primer-Verlängerungsprodukt verdrängen. Das zweite Primer- Verlängerungsprodukt verbleibt somit in Verbindung mit dem 3'-Segment des ersten Primer- Verlängerungsproduktes. Diese Stärke dieser Verbindung kann Temperatur-abhängig beeinflusst werden. Beim Erreichen einer kritischen Temperatur kann diese Verbindung zerfallen und beide Primer-Verlängerungsprodukte dissoziieren. Je kürzer die Sequenz des 3'-Segmentes ist, umso instabiler ist diese Verbindung und umso niedriger kann die Temperatur sein, welche eine spontane Dissoziation herbeiführt.
Eine spontane Dissoziation kann beispielsweise im Temperatur-Bereich erreicht werden, welcher etwa bei der Schmelztemperatur liegt. In einer Ausführungsform liegt die Temperatur der Schritte der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid etwa bei der Schmelztemperatur (Tm +/- 3°C) des Komplexes umfassend das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und dem zweiten Primer- Oligonukleotid bzw. dem zweiten Primer-Verlängerungsprodukt. In einer Ausführungsform liegt die Temperatur der Schritte der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid etwa bei der Schmelztemperatur (Tm +/- 5°C) des Komplexes umfassend das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller- Oligonukleotid gebunden wird, und dem zweiten Primer-Oligonukleotid bzw. dem zweiten Primer- Verlängerungsprodukt.
In einer Ausführungsform liegt die Temperatur der Schritte der Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid über der Schmelztemperatur des Komplexes umfassend das 3'-Segment des ersten Primer-Verlängerungsproduktes, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und dem zweiten Primer-Oligonukleotid bzw. dem zweiten Primer- Verlängerungsprodukt. Eine solche Temperatur umfasst Temperatur-Bereiche von etwa Tm + 5°C bis Tm+20°C, besser von Tm+5°C bis Tm +10°C. Durch Verwendung einer höheren Temperatur kann das Gleichgewicht in diesem Reaktionsschritt in Richtung Dissoziation verschoben werden. Dadurch kann die Kinetik der Reaktion günstig beeinflusst werden. Verwendung von zu niedrigen Temperaturen im Schritt der Strangverdrängung mittels Controller-Oligonukleotid kann zu einer signifikanten Verlangsamung der Amplifikation führen.
In einer Ausführungsform umfasst ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt ein 3'-Segment, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und welches Sequenzlängen von 9 bis etwa 18 Nukleotiden umfasst. Bei dieser Ausführungsform kann eine spontane Dissoziation in der Regel bereits bei Temperatur-Bereichen zwischen 40°C und 65°C erreicht werden. Auch höhere Temperaturen führen zu einer Dissoziation.
In einer Ausführungsform umfasst ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt ein 3'-Segment, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und welches Sequenzlängen von 15 bis etwa 25 Nukleotiden umfasst. Bei dieser Ausführungsform kann eine spontane Dissoziation in der Regel bereits bei Temperatur-Bereichen zwischen 50°C und 70°C erreicht werden. Auch höhere Temperaturen führen zu einer Dissoziation.
In einer Ausführungsform umfasst ein erstes Primer-Verlängerungsprodukt ein 3'-Segment, welches nicht vom Controller-Oligonukleotid gebunden wird, und welches Sequenzlängen von 20 bis etwa 40 Nukleotiden umfasst. Bei dieser Ausführungsform kann eine spontane Dissoziation in der Regel bereits bei Temperatur-Bereichen zwischen 50°C und 75°C erreicht werden. Auch höhere Temperaturen führen zu einer Dissoziation.
Die Zusammensetzung des 3'-Segmentes des ersten Primer-Verlängerungsproduktes und ggf. eine Einführung von Schmelztemperatur-beeinflussenden Oligonukleotid-Modifikationen (z.B. MGB) bzw. Reaktionsbedingungen (z.B. TPAC, Betaine) kann die Wahl der Temperatur beeinflussen. Eine entsprechende Anpassung kann daher vorgenommen werden.
In einer Ausführungsform verlaufen alle Schritte der Amplifikation unter stringenten Bedingungen, welche die Ausbildung von unspezifischen Produkten / Nebenprodukten verhindern bzw. verlangsamen. Zu solchen Bedingungen zählen beispielsweise höhere Temperaturen, beispielsweise über 50°C.
In einer Ausführungsform verlaufen die Einzelschritte der Strangverdrängung durch Controller- Oligonukleotide bei gleicher Temperatur wie die Synthese des ersten und des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes. In einer weiteren Ausführungsform verlaufen die Einzelschritte der Strangverdrängung durch Controller-Oligonukleotide bei einer Temperatur, welche von der Temperatur der jeweiligen Synthese des ersten und des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes abweicht. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Synthese des ersten Primer- Verlängerungsproduktes und die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid bei gleicher Temperatur. In einer weiteren Ausführungsform verläuft die Synthese des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes und die Strangverdrängung durch das Controller-Oligonukleotid bei gleicher Temperatur.
Die Konzentration des Controller-Oligonukleotides umfasst Bereiche von 0,01 pmol/l bis 50 pmol/l, insbesondere von 0,1 pmol/l bis 20 pmol/l, insbesondere von 0,1 pmol/l bis 10 pmol/l.
Beispiele
Beispiel 1: Erstellung einer Start-Nukleinsäurekette mittels einer Primer-Verlängerung ausgehend von doppelsträngigen Nukleinsäureketten
In diesem Beispiel wird die Herstellung einer Start-Nukleinsäurekette (M1 .1 und M 2.1 ) mit einem Segment M1 .1 .6 oder M2.1 .6 umfassend modifizierte Nukleotide dargestellt (Fig. 9 A-D und Fig. 20 A-D)
Die Herstellung der Start-Nukleinsäure erfolgte durch Primer-Verlängerung ausgehend von doppelsträngigen Nukleinsäureketten umfassend die Zielsequenzen. Es wurden Primer verwendet, welche auch in der späteren Amplifikation als erster und zweiter Primer eingesetzt wurden.
Dabei wurden doppelsträngige Nukleinsäureketten (umfassend Zielsequenzen und korrespondierende komplementäre Strängen) in die Reaktion gegeben. Beide Stränge können als Matrizen für Primer-Verlängerung dienen. Die doppelsträngige Matrizen wurden durch initiale Denaturierung unter Reaktionsbedingungen in einzelsträngige Form überführt. Im weiteren Reaktionsschritt wurden Primer (welche auch in der späteren Amplifikation verwendet wurden) an ihre komplementären Sequenzsegmente hybridisiert und durch Taq Polymerase verlängert. Diese Schritte wurden einmal wiederholt (Denaturierung und Primer-Verlängerung).
Die so erhaltenen Reaktions-Gemische umfassten nach Ablauf der Reaktion beide Primer- Verlängerungsprodukte (das erste und das zweite Primer-Verlängerungsprodukte), welche als Start-Nukleinsäureketten im Amplifikationsverfahren (Beispiel 2) verwendet wurden. Durch Verwendung von beiden Primern (welche auch in Amplifikation eingesetzt werden, Beispiel 2) umfassten die resultierenden Produkte auch den ersten und den zweiten Bereich des jeweiligen Primers.
Die Primer-Verlängerungs-Reaktion ausgehend von doppelsträngigen Nukleinsäureketten wurde wie folgt durchgeführt:
Der erste und zweite Primer wurden jeweils in Konzentrationen von 1 pmol/l eingesetzt. DNA- Matrizen wurden in ca. 0,05 bis 0,5 nmol/l eingesetzt.
Die weiteren Reaktionsbedingungen waren:
1 x Isothermal Puffer (New England Biolabs, catalog # B0537S; in einfacher Konzentration enthält der Puffer: 20 mM Tris-HCI; 10 mM (NH4)2S04 ; 50 mM KCl; 2 mM MgS04; 0.1 % Tween® 20;pH 8.8@25°C) ; dNTP (dATP, dCTP, dUTP, dGTP), je 200 pmol/l;
Die Herstellung der Start-Nukleinsäureketten erfolgte mit Taq-Polymerase (NEB). Die Taq Polymerase lag im Reaktionsansatz in einfacher Konzentration vor (ca. 100-fache Verdünnung der Stock-Lösung).
Die thermischen Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
Initiale Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten.
Annealing und Elongation bei 50 °C für 1 h.
Denaturierung bei 95 °C für 1 Minute.
Annealing und Elongation bei 50 °C für 1 h.
Primer:
Das erste Primer-Oligonukleotid: P1 F5-50-AE2051
5' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTTT ACCT GT AT 7878 658678871 TACCTGTATTCC 3' (SEQ ID NO 001 )
Der unterstrichende Sequenzteil (Position 1-12 vom 3'-Ende) entspricht dem ersten Bereich eines Primers und kann an eine Matrize sequenzspezifisch hybridisieren und von der Polymerase verlängert werden.
Die nummerierten Positionen stehen für modifizierte Nukleotidanaloga als Bausteine der Kette:
5 = 2'-0-Me A (2'-0-Methyl-Adenosine)
6 = 2'-0-Me G (2'-0-Methyl-Guanosine)
7 = 2'-0-Me C (2'-0-Methyl-Cytosine)
8 = 2'-0-Me U (2'-0-Methyl-Uridine)
Dieses Primer-Oligonukleotid umfasst den ersten Bereich (Positionen 1 - 12 vom 3'-Ende), den zweiten Bereich (C3-Linker, sowie Positionen 13 - 24 vom 3'-Ende), sowie ein Segment mit einer Zusatzsequenz Variante P1 (Positionen 25 - 57 vom 3'-Ende). Der erste Bereich und der zweite Bereich sind für die Ausführung einer spezifischen Amplifikation notwendig und können als„Basis- Struktur des ersten Primers“ oder „Minimal-Struktur des ersten Primers“ zusammengefasst werden. Die Zusatzsequenz Variante P1 stellt ein Beispiel für zusätzliche Sequenz-Segmente, welche am ersten Primer-Oligonukleotid integriert werden können. Positionen 1 - 12 dienen als Matrize bei der Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes. C3-Modifikation und der zweite Bereich verhindern eine Fortsetzung der Synthese an Positionen 25 - 57 während einer Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Das zweite Primer-Oligonukleotid: P1F5G2-1001-103_2xlnv
5' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTT GT CAACCAT87876856 87871 GTCAACCATAAT 3'(SEQ ID NO 002)
Der unterstrichende Sequenzteil (Position 1-12 vom 3'-Ende) entspricht dem ersten Bereich eines Primers und kann an eine Matrize sequenzspezifisch hybridisieren und von der Polymerase verlängert werden.
Beide Primer umfassten folgende Zusammensetzung:
A = 2'-deoxy-Adenosin; C = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Modifikationen (Dieses Sequenzsegment entspricht dem zweiten Bereich eines Primers):
1 = C3-Linker
Die nummerierten Positionen stehen für modifizierte Nukleotidanaloga als Bausteine der Kette:
5 = 2'-0-Me A (2'-0-Methyl-Adenosine)
6 = 2'-0-Me G (2'-0-Methyl-Guanosine)
7 = 2'-0-Me C (2'-0-Methyl-Cytosine)
8 = 2'-0-Me U (2'-0-Methyl-Uridine)
Die Nukleotide und Modifikationen sind untereinander mit Phosphodiesterbindungen verknüpft.
Es wurden doppelsträngige Matrizen verwendet, welche nachfolgende Zielsequenzen umfassten. Die doppelsträngigen Matrizen wurden mittels einer konventionellen PCR hergestellt. Die Tm von Doppelsträngen betrug ca. 79 bis 81 °C (gemessen am Ende der PCR-Reaktion).
Im Folgenden ist wegen der Komplementarität der beiden Stränge nur jeweils ein Strang der doppelsträngigen Matrizen angegeben (ein Strang umfasst eine Zielsequenz):
M2HAF5-2xC-GC-Gap=10
5' AAGTCAACCA TAATGGACTA CTTCGAGCAG ATCCATTAGA GGTCTGGACA
GGCAAGGAAT ACAGGTATTT TGAA 3'(SEQ ID NO 003)
M2HAF5-2xC-GC-Gap=20
5' AAGTCAACCA TAATGGACTA CTTCGAGCAG ATCCATTAGC TCCTACGCCA
GGTCTGGACA GGCAAGGAAT ACAGGTATTT TGAA 3'(SEG ID NO 004) M2HAF5-2xC-GC-Gap=30
5' AAGTCAACCA TAATGGACTA CTTCGAGCAG ATCCATTAG CTCCTCTGGA
TATAGACGCCA GGTCTGGACA GGCAAGGAAT ACAGGTATTT TGAA 3' (SEQ ID NO 005)
M2HAF5-2xC-Ex-Gap=30
5' AAGT CAAC CATA ATAT CATG AGAG ACAT CGCC TCTGG GCTA ATAA TT AG CTCC TCTG GATA TAGA CGCC AGGT GGAC TACTT CTAA TCTG TAAG AG CA GATC CCTG GACA GGCA AGGA ATAC AGGT ATTT TGAA 3' (SEC ID NO 006)
M2HAF5-2xC-Ex-Gap=20
5' AAGTC AACCA TAATA TCATG AGAGA CATCG CCTCT GGGCT AATAA TTAGC TCCTA CGCCA GGTGG ACTAC TTCTA ATCTG TAAGA GCAGA TCCCT GGAC AG GCAAG GAATAC AGGTA TTTTG AA 3' (SEC ID NO 007)
M2HAF5-2xC-Ex-Gap=0
5' AAGTC AACCA TAATA TCATGA GAGAC ATCGC CTCTG GGCTA ATAGG ACTAC TTCTA ATCTG TAAGA GCAGA TCCCT GGACA GGCAA GGAAT ACAGG TATTT TGAA 3' (SEC ID NO 008)
Als Ergebnis der Primer-Verlängerung wurden folgende Produkte erhalten (Start- Nukleinsäureketten M1 .1 und M2.1 ).:
Gemisch 1 (unter Verwendung von Matrize M2HAF5-2xC-GC-Gap=10)
Produkt: M2HAF5-2xC-GC-Gap=10_THL (Start-Nukleinsäurekette M2.1)
5' CACAA TCATCA ATACT TTTTT GTCAA CCAT8 78768 56878 71 GTC AACCA TAATG
GACTA CTTCG AGCAG ATCAT TAGAG GTCTG GACAGG CAAGG AATAC AGGTA TTTTG AA 3' (SEC ID NO 009)
Produkt: M2HAF5-2xC-GC-Gap=10_THR (Start-Nukleinsäurekette M1.1)
5 ' C AC AAT CAT C AAT ACTTTTTTT ACCT GT AT7878
658678871 TACCTGTATTCCTTGCCTGTCCAGACCTCTAATGGATCTGCTCGAAGTAGTCCAT TATGGTTGACTT 3' (SEC ID NO 010)
Gemisch 2 (unter Verwendung von Matrize M2HAF5-2xC-GC-Gap=20)
Produkt:M2HAF5-2xC-GC-Gap=20_ THL (Start-Nukleinsäurekette M2.1)
5 ' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTT GT CAACCAT 87876856
87871 GTCAACCATAATG G ACT ACTT CG AG CAG AT CCATT AG CT CCT ACG CCAGGTCTGG ACAGG C
AAGGAATACAGGTATTTTGAA 3 (SEC ID NO 01 1 ) Produkt: M2HAF5-2xC-GC-Gap=20_THR (Start-Nukleinsäurekette Ml.1)
5 ' C AC AAT CAT C AAT ACTTTTTTT ACCT GT AT7878
658678871 TACCTGTATTCCTTGCCTGTCCAGACCTGGCGTAGGAGCTAATGGATCTGCTCG AAGT AGTCCATT ATGGTT G ACTT 3' (SEQ ID NO 012)
Gemisch 3 (unter Verwendung von Matrize M2HAF5-2xC-GC-Gap=30)
Produkt: M2HAF5-2xC-GC-Gap=30_THL (Start-Nukleinsäurekette M2.1)
5' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTT GT CAACCAT87876856
87871 GT CAACCAT AATGG ACT ACTTCG AGCAG ATCCATT AGCT CCT CTGG AT AT AG ACGCCA GGTCTGGACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGAA 3' (SEC ID NO 013)
Produkt: M2HAF5-2xC-GC-Gap=30_THR (Start-Nukleinsäurekette M1.1)
5 ' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTTT ACCT GT AT7878
658678871 TACCTGTATTCCTTGCCTGTCCAGACCTGGCGTCTATATCCAGAGGAGCTAATGG AT CTGCTCG AAGT AGTCCATT ATGGTT G ACTT 3' (SEC ID NO 014)
Gemisch 4 (unter Verwendung von Matrize M2HAF5-2xC-Ex-Gap=30)
Produkt: M2HAF5-2xC-Ex-Gap=30_THL (Start-Nukleinsäurekette M2.1)
5' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTT GT CAACCAT87876856
87871 GT CAACCAT AAT AT CAT G AG AG ACATCGCCT CTGGGCT AAT AATT AGCTCCT CTGG AT ATAGACGCCAGGTGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAGGAATA CAGGTATTTTGAA 3' (SEC ID NO 015)
Produkt: M2HAF5-2xC-Ex-Gap=30_THR (Start-Nukleinsäurekette M1.1)
5 ' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTTT ACCT GT AT7878
658678871 TACCTGTATTCCTTGCCTGTCCAGGGATCTGCTCTTACAGATTAGAAGTAGTCCA CCTGGCGTCTAT ATCCAGAGGAGCTAATT ATT AGCCCAGAGGCGATGTCTCTCATGAT ATTA TGGTTGACTT 3' (SEC ID NO 016)
Gemisch 5 (unter Verwendung von Matrize M2HAF5-2xC-Ex-Gap=20)
Produkt: M2HAF5-2xC-Ex-Gap=20_ THL (Start-Nukleinsäurekette M2.1 )
5' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTT GT CAACCAT87876856
87871 GT CAACCAT AAT AT CAT GAG AG ACATCGCCT CTGGGCT AAT AATT AGCTCCT ACGCCA G GTG G ACT ACTT CT AAT CTGT AAG AG C AG AT CCCTG G AC AG G C AAG G AAT AC AG GT ATTTT G AA 3' (SEC ID NO 017) Produkt(SEQ ID NO 018):
M2HAF5-2xC-Ex-Gap=20_ THR (Start-Nukleinsäurekete M1.1)
5 ' C AC AAT CAT C AAT ACTTTTTTT ACCT GT AT7878
658678871 TACCTGTATTCCTTGCCTGTCCAGGGATCTGCTCTTACAGATTAGAAGTAGTCCA CCTGGCGTAGGAGCTAATTATTAGCCCAGAGGCGATGTCTCTCATGATATTATGGTTGACTT
3'
Gemisch 6 (unter Verwendung von Matrize M2HAF5-2xC-Ex-Gap=0)
Produkt:
M2HAF5-2xC-Ex-Gap=0_ THL (Start-Nukleinsäurekete M2.1 )
5' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTT GT CAACCAT87876856
87871 GT CAACCAT AAT AT CAT G AG AG ACATCGCCT CTGGGCT AAT AGG ACT ACTT CT AAT CT GT AAG AG C AG ATCCCT G G AC AG G C AAG G AAT ACAG GT ATTTT G AA 3' (SEQ ID NO 019)
Produkt:
M2HAF5-2xC-Ex-Gap=0_ THR (Start-Nukleinsäurekete M1.1)
5 ' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTTT ACCT GT AT7878
658678871 TACCTGTATTCCTTGCCTGTCCAGGGATCTGCTCTTACAGATTAGAAGTAGTCCT ATT AG CCC AG AG GCGATGTCTCT CAT GAT ATT ATG GTT G ACTT 3' (SEC ID NO 020)
A = 2'-deoxy-Adenosin; C = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Modifikationen: Die nummerierten Positionen stehen für modifizierte Nukleotidanaloga als Bausteine der Kette:
1 = C3-Linker
5 = 2'-0-Me A (2'-0-Methyl-Adenosine)
6 = 2'-0-Me G (2'-0-Methyl-Guanosine)
7 = 2'-0-Me C (2'-0-Methyl-Cytosine)
8 = 2'-0-Me U (2'-0-Methyl-Uridine)
Die erhaltenen Produkte der Primer-Verlängerungsreaktion entsprechen den Start- Nukleinsäureketten (M 1 .1 und M2.1 ) und umfassen entweder die Zielsequenz oder ihre komplementäre Sequenz, sowie Primer-Bindungsstellen, an welche Primer in der Amplifikation binden können. Diese Produkte wurden als Gemisch aus beiden Primer-Verlängerungsprodukten in die Amplifikation eingesetzt (Beispiel 2). Beispiel 2: Exponentielle Vermehrung von Amplifikationsfragmenten ausgehend von Start- Nukleinsäureketten
Die Amplifikation wurde unter Verwendung von zwei sequenzspezifischen Controller- Oligonukleotiden, zwei sequenzspezifischen Primern und jeweils zwei Hilfs-Oligonukleotiden (Block-Oligonukleotiden) durchgeführt.
Verwendete Oligonukleotide:
Primer:
Das erste Primer-Oligonukleotid: P1 F5-50-AE2051
5' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTTT ACCT GT AT 7878 658678871 TACCTGTATTCC 3' (SEQ ID NO 001 )
Der unterstrichende Sequenzteil (Position 1-12 vom 3'-Ende) entspricht dem ersten Bereich eines Primers und kann an eine Matrize sequenzspezifisch hybridisieren und von der Polymerase verlängert werden.
Das zweite Primer-Oligonukleotid: P1F5G2-1001-103_2xlnv
5' CACAAT CAT CAAT ACTTTTTT GT CAACCAT87876856 87871 GTCAACCATAAT 3' (SEC ID NO 002)
Der unterstrichende Sequenzteil (Position 1-12 vom 3'-Ende) entspricht dem ersten Bereich eines Primers und kann an eine Matrize sequenzspezifisch hybridisieren und von der Polymerase verlängert werden.
Beide Primer umfassten folgende Zusammensetzung:
A = 2'-deoxy-Adenosin; C = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Modifikationen: Die nummerierten Positionen stehen für modifizierte Nukleotidanaloga als Bausteine der Kette:
1 = C3-Linker
5 = 2'-0-Me A (2'-0-Methyl-Adenosine)
6 = 2'-0-Me G (2'-0-Methyl-Guanosine)
7 = 2'-0-Me C (2'-0-Methyl-Cytosine)
8 = 2'-0-Me U (2'-0-Methyl-Uridine)
Das erste Block-Oligonukleotid: BP1 F5-25001 -402
5' 7878 65867887 857786 1 TATTAA X 3' (SEC ID NO 021 ) Das zweite Block-Oligonukleotid: B1 -P1 F5G2-3501 -304_2xlnv
5'- 87876856 8787 68 755 2 CCATAA TG AAA X 3' (SEQ ID NO 022)
A = 2'-deoxy-Adenosin; C = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Modifikationen: Die nummerierten Positionen stehen für modifizierte Nukleotidanaloga als Bausteine der Kette:
1 = C3-Linker
2 = HEG-Linker
5 = 2'-0-Me A (2'-0-Methyl-Adenosine)
6 = 2'-0-Me G (2'-0-Methyl-Guanosine)
7 = 2'-0-Me C (2'-0-Methyl-Cytosine)
8 = 2'-0-Me U (2'-0-Methyl-Uridine)
X = 3 '-Phosphat-Gruppe zur Blockade einer möglichen Verlängerung durch Polymerase.
Das erste Controller-Oligonukleotid: CF 5-1001-11-6-S
5' 5 7866575667 55 665585756 GTA GAAGCATC AGAG X 3' (SEQ ID NO 023)
Das zweite Controller-Oligonukleotid: CF-1001 -L-103_2xlnv-GC-S
5' 5 6658786787 6556856877 5 885866 TTG AC GAGA CTACGAGA AG X 3' (SEQ ID NO 024)
Für die Amplifikation von M2HAF5-2xC-Ex-Gap=30_THL, M2HAF5-2xC-Ex-Gap=30_THR, M2HAF5-2xC-Ex-Gap=20_THL, M2HAF5-2xC-Ex-Gap=20_THR, M2HAF5-2xC-Ex-Gap=0_THL und M2HAF5-2xC-Ex-Gap=0_THR kamen abweichend folgende beiden Controller- Oligonukleotide zum Einsatz:
Das erste Controller-Oligonukleotid: CF 5-1001-11-6
5' 5 6657857887 8558786855 6567565877 7866575667 55 665585756 GTA GAAGCATC AGAG X 3' (SEQ ID NO 025)
Das zweite Controller-Oligonukleotid: CF5G2-1001-401_2xlnvEx
5' 5 858856777565667658687878758658 5 885866 TTG AC GAGA CTACGAGA AG X 3' (SEQ ID NO 026)
A = 2'-deoxy-Adenosin; C = 2'-deoxy-Cytosin; G = 2'-deoxy-Guanosin; T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Modifikationen: Die nummerierten Positionen stehen für modifizierte Nukleotidanaloga als Bausteine der Kette: 5 = 2'-0-Me A (2'-0-Methyl-Adenosine)
6 = 2'-0-Me G (2'-0-Methyl-Guanosine)
7 = 2'-0-Me C (2'-0-Methyl-Cytosine)
8 = 2'-0-Me U (2'-0-Methyl-Uridine)
X = 3 '-Phosphat-Gruppe zur Blockade einer möglichen Verlängerung durch Polymerase.
Die Reaktion wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Der erste und zweite Primer wurden jeweils in Konzentrationen von 0,5 pmol/l eingesetzt. Das erste und zweite Block-Oligonukleotid wurden jeweils in Konzentrationen von 5 pmol/l eingesetzt. Das erste und zweite Controller-Oligonukleotid wurden jeweils in Konzentrationen von 2 pmol/l eingesetzt. Gemische mit DNA-Matrizen (Start-Nukleinsäureketten M1 .1 und M2.1 ) aus Beispiel 1 (Gemisch 1 bis 6) wurden jeweils einzeln 6-fach und / oder 6000-fach verdünnt eingesetzt.
Die weiteren Reaktionsbedingungen waren:
1 x Isothermal Puffer (New England Biolabs, catalog # B0537S; in einfacher Konzentration enthält der Puffer: 20 mM Tris-HCI; 10 mM (NH4)2S04 ; 50 mM KCl; 2 mM MgS04; 0.1 % Tween® 20;pH 8.8@25°C) ; dNTP (dATP, dCTP, dUTP, dGTP), je 200 pmol/l;
EvaGreen Farbstoff (Jena Biosciences) in 1 :50 Verdünnung.
Die Amplifikation der erfolgte unter Verwendung von BST 2.0 -Polymerase (Stock-Lösung: Bst 2.0 Warmstart 120.000 units /ml, NEB) nach Angaben des Herstellers. Die BST Polymerase lag im Reaktionsansatz in 1200-facher Verdünnung der Polymerase Stock-Lösung vor.
Die thermischen Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
• Initiale Phase bei 65 °C für 2 Minuten.
• 125 Zyklen mit folgender Struktur
o Phase bei 50 °C für 2 min.
o Phase bei 65 °C für 2min.
• Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten.
• Aufnehmen einer Schmelzkurve.
Ergebnisse und Auswertung:
Analyse der Amplifikationsfragmente nach exponentieller Vermehrung der Start- Nukleinsäureketten
Zur Analyse der Amplifikationsreaktion und zur Bewertung der entstandenen
Amplifikationsprodukte wurden folgende Techniken genutzt:
• Fluoreszenzsignal eines interkalierenden Farbstoffes (EvaGreen)
• Schmelzkurvenanalyse von den entstandenen Amplifikationsprodukten. Amplifikation von M2HAF5-2xC-GC-Gap=10_THL und M2HAF5-2xC-GC-Gap=10_THR
Produkten ausgehend von Start-Nukleinsäureketten
Fig. 21 (A) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignal des EvaGreen- Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an das Amplifikationsprodukte entstanden sind. Dabei gehört Pfeil 1 zum 6-fach und (Pfeil 2) zum 6000-fach verdünnten Ausgangsmaterial aus Beispiel 1 . Pfeil 3 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde H20 anstelle des
Ausgangsmaterials aus Beispiel 1 eingesetzt.
Fig. 21 (B) zeigt die zu den Ansätzen gehörenden Schmelzkurven. Auf der Y-Achse ist Ableitung des Fluoreszenzsignals und auf der X-Achse die Temperatur aufgetragen. Es ist ein Peak erkennbar, der anzeigt, dass ein einheitliches Amplifikationsprodukt entstanden ist. Dabei gehören die mit Pfeil 4 gekennzeichneten Peaks zum 6-fach und 6000-fach verdünnten
Ausgansmaterial aus Beispiel 1 . Die mit Pfeil 5 markierten Kurven weisen keinen Produktpeak auf und gehören zur Negativkontrolle.
Amplifikation von M2HAF5-2xC-GC-Gap=20_THL und M2HAF5-2xC-GC-Gap=20_THR
Produkten ausgehend von Start-Nukleinsäureketten
Fig. 22 (A) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignal des EvaGreen- Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an das Amplifikationsprodukte entstanden sind. Dabei gehört Pfeil 1 zum 6-fach und Pfeil 2 zum 6000-fach verdünnten Ausgangsmaterial aus Beispiel 1 . Pfeil 3 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde H20 anstelle des
Ausgangsmaterials aus Beispiel 1 eingesetzt.
Fig. 22 (B) zeigt die zu den Ansätzen gehörenden Schmelzkurven. Auf der Y-Achse ist Ableitung des Fluoreszenzsignals und auf der X-Achse die Temperatur aufgetragen. Es ist ein Peak erkennbar, der anzeigt, dass ein einheitliches Amplifikationsprodukt entstanden ist. Dabei gehören die mit Pfeil 4 gekennzeichneten Peaks zum 6-fach und 6000-fach verdünnten
Ausgansmaterial aus Beispiel 1 . Die mit Pfeil 5 markierten Kurven weisen keinen Produktpeak auf und gehören zur Negativkontrolle.
Amplifikation von M2HAF5-2xC-Ex-Gap=30_THL und M2HAF5-2xC-Ex-Gap=30_THR Produkten ausgehend von Start-Nukleinsäureketten
Fig. 23 (A) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignal des EvaGreen- Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an das Amplifikationsprodukte entstanden sind. Dabei gehört Pfeil 1 zum 6000-fach verdünnten Ausgangsmaterial aus Beispiel 1 . Pfeil 2 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde H20 anstelle des Ausgangsmaterials aus Beispiel 1 eingesetzt.
Fig. 23 (B) zeigt die zu den Ansätzen gehörenden Schmelzkurven. Auf der Y-Achse ist Ableitung des Fluoreszenzsignals und auf der X-Achse die Temperatur aufgetragen. Es ist ein Peak erkennbar, der anzeigt, dass ein einheitliches Amplifikationsprodukt entstanden ist. Dabei gehören die mit Pfeil 3 gekennzeichneten Peaks zum 6000-fach verdünnten Ausgansmaterial aus Beispiel 1 . Die mit Pfeil 4 markierten Kurven weisen keinen Produktpeak auf und gehören zur Negativkontrolle.
Amplifikation von M2HAF5-2xC-Ex-Gap=20_THL und M2HAF5-2xC-Ex-Gap=20_THR Produkten ausgehend von Start-Nukleinsäureketten
Fig. 24 (A) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der
Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignal des EvaGreen- Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an das Amplifikationsprodukte entstanden sind. Dabei gehört Pfeil 1 zum 6000-fach verdünnten Ausgangsmaterial aus Beispiel 1 . Pfeil 2 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde H20 anstelle des Ausgangsmaterials aus Beispiel 1 eingesetzt.
Fig. 24 (B) zeigt die zu den Ansätzen gehörenden Schmelzkurven. Auf der Y-Achse ist Ableitung des Fluoreszenzsignals und auf der X-Achse die Temperatur aufgetragen. Es ist ein Peak erkennbar, der anzeigt, dass ein einheitliches Amplifikationsprodukt entstanden ist. Dabei gehören die mit Pfeil 3 gekennzeichneten Peaks zum 6000-fach verdünnten Ausgansmaterial aus Beispiel 1 . Die mit Pfeil 4 markierten Kurven weisen keinen Produktpeak auf und gehören zur Negativkontrolle.
Amplifikation von M2HAF5-2xC-Ex-Gap=0_THL und M2HAF5-2xC-Ex-Gap=0_THR Produkten ausgehend von Start-Nukleinsäureketten
Fig. 25 (A) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignal des EvaGreen- Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an das Amplifikationsprodukte entstanden sind. Dabei gehört Pfeil 1 zum 6000-fach verdünnten Ausgangsmaterial aus Beispiel 1 . Pfeil 2 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde H20 anstelle des Ausgangsmaterials aus Beispiel 1 eingesetzt. Fig. 25 (B) zeigt die zu den Ansätzen gehörenden Schmelzkurven. Auf der Y-Achse ist Ableitung des Fluoreszenzsignals und auf der X-Achse die Temperatur aufgetragen. Es ist ein Peak erkennbar, der anzeigt, dass ein einheitliches Amplifikationsprodukt entstanden ist. Dabei gehören die mit Pfeil 3 gekennzeichneten Peaks zum 6000-fach verdünnten Ausgansmaterial aus Beispiel 1 . Die mit Pfeil 4 markierten Kurven weisen keinen Produktpeak auf und gehören zur Negativkontrolle. Verwendung von Hilfs-Oligonukleotiden (Block-Oligonukleotide):
In diesem Beispiel wurde eine vorteilhafte Ausführungsform der Reaktionsbedingungen gewählt, bei welcher einerseits die Primer-Konzentration geringer war als die Konzentration von Controller- Oligonukleotid und andererseits zyklische Temperatur-Veränderungen (zwischen 50°C und 65°C) verwendet wurden.
Bei den verwendeten Oligonukleotiden bilden Primer-Oligonukleotide ein Interaktions-Paar mit den entsprechenden Controller-Oligonukleotiden (z.B. erstes Primer-Oligonukleotid und erstes Controller-Oligonukleotid). Dieses Interaktions-Paar hatte unter Reaktionsbedingungen der Amplifikation eine Schmelztemperatur von ca. 63°C (gemessen bei ca. 1 pmol/l Konzentration von beiden Komponenten unter Puffer-Bedingungen der Amplifikation). Der erste Bereich des Primer- Oligonukleotides bildete mit einem komplementären Sequenz-Anteil einer Matrize einen Komplex mit einer Schmelztemperatur von ca. 50°C (z.B. erster Bereich des ersten Primers und das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) gemessen bei ca. 1 pmol/l Konzentration von beiden Komponenten unter Puffer-Bedingungen der Amplifikation).
In einer bestimmten Ausführungsform können Primer-Controller-Kombinationen verwendet, bei welchen die Konzentration von Primer höher liegt, als die Konzentration von Controller (z.B. Primer 2 - 5 pmol/l und Controller 1 pmol/l). Bei einer solchen Ausführungsform liegt ein Überschuss Primer vor, so dass der Primer- Verlängerungsschritt bei einer Temperatur von 50°C in guten Ausbeuten verläuft, trotz partieller Bindung von Primer-Oligonukleotid an das Controller- Oligonukleotid.
In einer weiteren bestimmten Ausführungsform (Beispiel 2) wurden ein Gemisch aus einem Primer und einem entsprechenden Controller verwendet, bei welchem die Konzentration von Primer niedriger lag, als die Konzentration des Controller-Oligonukleotids (z.B. Primer 0,5 pmol/l und Controller 2 pmol/l). Somit lag das Controller-Oligonukleotid im Überschuss vor. Bei dieser Ausführungsform führte die Absendung der Reaktionstemperatur auf 50°C zur raschen Bindung der Primer-Oligonukleotide an die Controller-Oligonukleotide. Das reduzierte die Ausbeute im Primer-Verlängerungsschritt bei 50°C und senkte die Geschwindigkeit der Amplifikation. Um eine ausreichende Primer-Konzentration auch bei geringen Temperaturen aufrecht zu erhalten und damit Ausbeuten im Primer-Verlängerungsschritt zu erhöhen, wurden sogenannte Block- Oligonukleotide eingesetzt. Solche Block-Oligonukleotide konkurrierten mit dem Primer- Oligonukleotid um die Bindung an das Controller-Oligonukleotid, waren aber selbst nicht in der Lage von einer Polymerase verlängert zu werden.
Durch Verwendung von Block-Oligonukleotiden war es möglich, die Kombination aus Primer- Oligonukleotid und Controller-Oligonukleotid bei bestimmten(„bei bestimmten“ <- ist recht ungenau Sollten wir hier genauer formulieren z.B. in besonders niedrigen Primer-Konzentrationen) Konzentrations-Bereichen einzusetzen und mit zyklischen Temperatur- Veränderungen zu kombinieren. Dies führte zu einer Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit. Die Struktur von Block-Oligonukleotiden ist im Wesentlichen ähnlich gestaltet wie die Struktur von Primer-Oligonukleotiden, mit folgenden Unterschieden:
• Block-Oligonukleotide werden von Polymerase nicht verlängert. Das kann beispielsweise durch Blockade des 3'-Endes durch eine Modifikation erreicht werden (z.B. 3'-Phosphat, 3'-C3, dideoxi-Nukleotid), und / oder durch Einführung von terminalen Mismatches in 3'- Ende des Block-Oligonukleotides.
• Block-Oligonukleotide können in ihrer Sequenzzusammensetzung von ihren zugehörigen Primern abweichen. Die Anzahl von Sequenz-Abweichungen kann zwischen 1 Nukleotid bis 20 Nukleotide betragen.
Beim Design von Block-Oligonukleotiden ist es vorteilhaft, die Tm von Block-Oligonukleotiden an Controller-Oligonukleotide im ähnlichen Bereich zu halten, wie die Tm von Primer-Oligonukleotiden und Controller-Oligonukleotiden. Dadurch konkurrieren Block-Oligonukleotide und Primer- Oligonukleotide um die Bindung an Controller-Oligonukleotide im ähnlichen Ausmaß (z.B. Tm von Primer-Controller-Komplex plus / minus 3°C). Durch Verwendung höherer Konzentrationen von Block-Oligonukleotiden als Primer-Oligonukleotiden, kann das Bindungs-Verhältnis vorteilhaft beeinflusst werden.
Fig. 1 zeigt schematisch die Sequenzkomponenten einer Ausführungsform der Erfindung. Die Primer 1 .1 und Primer 2.1 können mit ihren jeweiligen ersten Bereichen (in 3'-Segmenten) an die jeweiligen Primerbindungsstellen in Amplifikations-Produkten vorwiegend komplementär binden und von der Polymerase verlängert werden, wobei die Primer- Verlängerungsprodukte P1 1-Ext und P2.1 -Ext gebildet werden. Der Polynukleotid-Schwanz (Primer-Überhang) des zweiten Bereichs des jeweiligen Primers bindet nicht an während der Amplifikation entstehende
Amplifikations-Fragmente 1 .1 und wird nicht von der Polymerase kopiert. Die Strangtrennung nach einem jeweiligen Polymerase-abhängigen Synthese-Vorgang erfolgt unter Mitwirkung von Controller 1 .1 und Controller 2.1 , welche an die jeweils komplementären Segmente von P1 1-Ext bzw. P2.1 -Ext binden können. Amplifikations-Produkte stellen das Ergebnis einer
matrizenabhängigen Synthese durch die Polymerase (Primer-Verlängerung) dar und können in folgenden Zyklen selbst als Matrizen auftreten (Primer-Verlängerungsprodukte, auch genannt als Primer-Extension-Produkte, P1 .1 -Ext und P2.1 -Ext). Das Amplifikationsprodukt 1 .1 umfasst P1 1 - Ext und P2.1 -Ext. C1 .1 kann an das komplementäre Segment des P1 .1-Ext komplementär binden. C2.1 kann an das komplementäre Segment des P2.1-Ext binden. Das mittlere Segment 3 wird von keinem Controller komplementär gebunden.
Das erste Primer-Verlängerungsprodukt (P1 .1-Ext) umfasst folgende Segmente (in 5'-3'- Richtung): P1 .1 E6, P1 .1 E5, P1 .1 E4, P1 .1 E3, P1 .1 E2, P1 .1 E1 . Segmente P1 .1 E6 und P1 .1 E5 werden vom ersten Primer-Oligonukleotid gebildet, Segmente P1 .1 E4 bis P1 .1 E1 werden während der Amplifikation durch die Polymerase synthetisiert.
Das zweite Primer-Verlängerungsprodukt (P2.1-Ext) umfasst folgende Segmente (in 5'-3'- Richtung): P2.1 E6, P2.1 E5, P2.1 E4, P2.1 E3, P2.1 E2, P2.1 E1 . Segmente P2.1 E6 und P2.1 E5 werden vom zweiten Primer-Oligonukleotid gebildet, Segmente P1 .1 E4 bis P1 .1 E1 werden während der Amplifikation durch die Polymerase synthetisiert.
Fig. 2 zeigt schematisch die Topographie von Komponenten einer Ausführungsform der Erfindung.
Das erste Primer-Oligonukleotid (P1 .1 ) umfasst einen ersten Bereich (P1 .1 .1 ) und einen zweiten Bereich (P1 .1 .2). Der erste Bereich kann an die jeweilige komplementäre Position in Primer- Verlängerungsprodukten binden und von der Polymerase matrizenabhängig verlängert werden. Bei einer Rücksynthese wird der erste Bereich von der Polymerase kopiert. Der zweite Bereich (Polynukleotid-Schwanz) wird nicht von der Polymerase kopiert. Dieser Bereich kann beispielsweise Nukleotid-Modifikationen umfassen, welche eine Polymerase daran hindern, diesen Bereich als Matrize zu verwenden (z.B. besteht dieser Bereich aus 2'-0-Alkyl- Modifikationen von Nukleotiden). Weiterhin kann zwischen dem ersten Bereich und dem zweiten Bereich ein Linker angebracht sein, welcher ebenfalls die Polymerase daran hindert, den zweiten Bereich als Matrize zu verwenden. Die zu erwartete Position des Stopps der Polymerase bei der Synthese des zum ersten Bereich komplementären Stranges wird hier als Stopp-1 .1 bezeichnet. Der Polynukleotid-Schwanz wird nicht von der Polymerase kopiert und bleibt dadurch einzelsträngig. Er kann zur Initiierung der Bindung des Controllers 1 .1 an das P1 1 -Ext dienen.
Der erste Primer P1 .1 kann an den Controller C1 .1 binden, wobei ein Komplex gebildet wird P1 .1/ C1 .1 -Komplex.
Das zweite Primer-Oligonukleotid (P2.1 ) umfasst einen ersten Bereich (P2.1 .1 ) und einen zweiten Bereich (P2.1 .2). Der erste Bereich kann an die jeweilige komplementäre Position in Primer-Verlängerungsprodukten binden und von der Polymerase matrizenabhängig verlängert werden. Bei einer Rücksynthese wird der erste Bereich von der Polymerase kopiert. Der zweite Bereich (Polynukleotid-Schwanz) wird nicht von der Polymerase kopiert. Dieser Bereich kann beispielsweise Nukleotid-Modifikationen umfassen, welche eine Polymerase daran hindern, diesen Bereich als Matrize zu verwenden (z.B. besteht dieser Bereich aus 2'-0-Alkyl- Modifikationen von Nukleotiden). Weiterhin kann zwischen dem ersten Bereich und dem zweiten Bereich ein Linker angebracht sein, welcher ebenfalls die Polymerase daran hindert, den zweiten Bereich als Matrize zu verwenden. Die zu erwartete Position des Stopps der Polymerase bei der Synthese des zum ersten Bereich komplementären Stranges wird hier als Stopp-2.1 bezeichnet. Der Polynukleotid-Schwanz wird nicht von der Polymerase kopiert und bleibt einzelsträngig. Er kann zur Initiierung der Bindung des Controllers 2.1 an das P2.1 -Ext dienen.
Der erste Primer P2.1 kann an den Controller C2.1 binden, wobei ein Komplex gebildet wird, der P2.1/ C2.1 -Komplex.
Insbesondere bindet P1 .1 nicht an den Controller C2.1 und P2.1 bindet nicht an C1 .1 . Segment P1 .1 .1 des ersten Primers ist identisch zum Segment P1 .1 E5 des ersten Primer- Verlängerungsproduktes. Segment P1 .1 .2 des ersten Primers ist identisch zum Segment P1 .1 E6 des ersten Primer-Verlängerungsproduktes.
Segment P2.1 .1 des zweiten Primers ist identisch zum Segment P2.1 E5 des zweiten Primer- Verlängerungsproduktes. Segment P2.1 .2 des zweiten Primers ist identisch zum Segment P2.1 E6 des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Fig. 3 zeigt schematisch die Topographie von Komponenten einer Ausführungsform der Erfindung.
Das erste Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) umfasst einen ersten Bereich (C1 .1 .1 ), einen zweiten Bereich (C1 .1 .2) und einen dritten Bereich (C1 .1 .3). Der Bereich C1 .1 .1 kann an den P1 .1 .2 vorwiegend komplementär binden. Der Bereich C1 .1 .2 kann an den P1 .1 .1 komplementär binden. Bereich C1 .1 .3 kann komplementär an das von der Polymerase synthetisierte
Verlängerungssegment des ersten Primers komplementär binden (P1 .1 E4).
Das Controller-Oligonukleotid (C1 .1 ) umfasst Modifikationen, welche eine Polymerase daran hindern, den an das Controller-Oligonukleotid gebundenen ersten Primer als Matrize zu verwenden. Dazu umfasst das Controller-Oligonukleotid Nukleotid-Modifikationen, welche eine Polymerase daran hindern, den Primer unter Verwendung des Controllers als Matrize zu verlängern. Beispielsweise umfasst C1 .1 .2 und C1 .1.3 mehrere 2'-0-Alkyl-Modifikationen von Nukleotiden. Der erste Primer P1 .1 kann an den Controller C1 .1 binden, wobei ein Komplex gebildet wird, der P1 .1/ C1 1 -Komplex.
Das zweite Controller-Oligonukleotid (C2.1 ) umfasst einen ersten Bereich (C2.1 .1 ), einen zweiten Bereich (C2.1 .2) und einen dritten Bereich (C2.1 .3). Der Bereich C2.1 .1 kann an den P2.1 .2 vorwiegend komplementär binden. Der Bereich C2.1 .2 kann an den P2.1 .1 komplementär binden. Bereich C2.1 .3 kann komplementär an das von der Polymerase synthetisierte
Verlängerungssegment des zweiten Primers komplementär binden (P2.1 E4).
Das Controller-Oligonukleotid (C2.1 ) umfasst Modifikationen, welche eine Polymerase daran hindern, den an das Controller-Oligonukleotid gebundenen zweiten Primer als Matrize zu verwenden. Dazu umfasst das Controller-Oligonukleotid Nukleotid-Modifikationen, welche eine Polymerase daran hindern, den Primer unter Verwendung des Controllers als Matrize zu verlängern. Beispielsweise umfasst C2.1 .2 und C2.1.3 mehrere 2'-0-Alkyl-Modifikationen von Nukleotiden. Der zweite Primer P21 .1 kann an den Controller C2.1 binden, wobei ein Komplex gebildet wird, der P2.1 / C2.1 -Komplex.
Die Interaktion der oben beschriebenen Primer und Controller ermöglicht somit eine
Zusammenstellung von spezifischen Controller-Primer-Paaren. Hierbei bilden Primer 1 .1 und Controller 1 .1 das Primer-Controller System 1 .1 , und Primer 2.1 und Controller 2.1 das Primer- Controller System 2.1 . Fig.4 A zeigt schematisch die Topographie des ersten synthetisierten Primer- Verlängerungsproduktes (auch Primer-Extensionsprodukt genannt, P1 .1-Ext). Der P1 .1 -Anteil am Primer-Extensionsprodukt P1 .1 umfasst den ersten Primer-Bereich und den zweiten Primer- Bereich (mit Stopp-1 .1 Modifikation und dem Polynukleotid-Schwanz 1 .1 .). Die von der
Polymerase synthetisierten Anteile liegen während einer matrizenabhängigen Synthese in 3'- Richtung des Primer-Anteils. Diese Anteile oder Segmente dienen während der weiteren Syntheseschritte als Matrizen für die Polymerase und als Primer-Bindungsstelle für Primer 2.1 (PBS P2.1 ). Das Stopp-1 .1 Element des Primers P1 .1 verhindert das Kopieren des jeweiligen Oligonukleotid-Schwanzes. Die angeführte Anordnung von Segmenten zeigt für einzelne Primer- Verlängerungsprodukte, welche Segmente vom Primer dargestellt werden und welche durch die Polymerase synthetisiert werden.
Fig. 4 B zeigt schematisch die Topographie des zweiten synthetisierten Primer- Verlängerungsproduktes (auch Primer-Extensionsprodukt genannt, P2.1-Ext). Das Primer- Extensionsprodukt 2.1 (P2.1-Ext) umfasst den P2.1 -Anteil mit dem ersten Primer-Bereich und den zweiten Primer-Bereich (mit Stopp-2.1 Modifikation und dem Polynukleotid-Schwanz 2.1 .). Die von der Polymerase synthetisierten Anteile liegen während einer matrizenabhängigen Synthese in 3'-Richtung der Primer-Anteile. Auch diese Anteile dienen während der weiteren Syntheseschritte als Matrizen für die Polymerase und als Primer-Bindungsstelle für den Primer 1 .1 (PBS P1 .1 ). Das Stopp-2.1 Element des P2.1 verhindert ebenfalls das Kopieren des jeweiligen Oligonukleotid-Schwanzes. Die angeführte Anordnung von Segmenten zeigt für einzelne Primer-Verlängerungsprodukte, welche Segmente vom Primer dargestellt werden und welche durch die Polymerase synthetisiert werden.
Fig. 5 illustriert schematisch die Controller-Bindung und die Primer-Bindung an die
Primerverlängerungsprodukte.
In A bindet Controller C1 .1 an das Primerverlängerungsprodukt P1 1-Ext. unter Ausbildung eines Doppelstrangs im 5'-Segment des von P1 .1 -Ext.
In B bindet der Controller C2.1 an das Primerverlängerungsprodukt P2.1-Ext. unter Ausbildung eines Doppelstranges im 5'-Segment von P2.1-Ext. Das mittlere Segment des jeweiligen Primerverlängerungsprodukts interagiert nicht mit den Controllern.
In C bindet Primer P1 .1 an das Primerverlängerungsprodukt P2.1 -Ext (welches eine Primer- Bindungs-Stelle für P1 .1 im 3'-Segment umfasst) unter Ausbildung eines Doppelstrangs im 3 - Segment des von P2.1-Ext.
In D bindet Primer P2.1 an das Primerverlängerungsprodukt P1 1 -Ext (welches eine Primer- Bindungs-Stelle für P2.1 im 3'-Segment umfasst) unter Ausbildung eines Doppelstrangs im 3 - Segment des von P2.1-Ext.
Fig. 6 stellt schematisch die Interaktion zwischen den Controllern (C1 .1 und C2.1 ) und den Primerverlängerungsprodukten (P1 .1 -Ext. und P2.1 -Ext.) dar. In 1 ) wird der doppelsträngige Komplex umfassend P1 1 -Ext und P2.1 -Ext unmittelbar nach einer Primer-Verlängerungsreaktion durch eine Polymerase dargestellt. Hierbei bilden beide Primer-Verlängerungsprodukte einen komplementären Doppelstrang. In 2) werden schematisch die potenziellen Interaktionspositionen für die beide Controller (C1 .1 . und C2.1 ) und den doppelsträngigen Komplex umfassend P1 1-Ext und P2.1 -Ext dargestellt. In 3) wird die Initiierung der spezifischen Bindung von dem Controller an die jeweiligen spezifischen Polynukleotid-Schwänze der Primer-Verlängerungsprodukte dargestellt, wobei C1 .1 an den Polynukleotid-Schwanz des P1 1 -Ext bindet und C2.1 an den Polynukleotid-Schwanz des P2.1 -Ext. In 4) wird eine sequenzspezifische Strangverdrängung durch den jeweiligen Controller dargestellt. Dabei bildet C1 .1 einen Doppelstrang mit Teilen von P1 1 -Ext und C2.1 einen Doppelstrang mit Teilen von P2.1 -Ext. In 5) wird ebenfalls schematisch eine sequenzspezifische Strangverdrängung durch den jeweiligen Controller dargestellt, wobei das Segment, in welchem P1 1 -Ext und P2.1 -Ext noch aneinander gebunden sind kürzer ist als in (4): Hierbei hat C1 .1 einen Doppelstrang mit Teilen von P1 1-Ext und C2.1 einen Doppelstrang mit Teilen von P2.1 -Ext ausgebildet, so dass P1 1 -Ext und P2.1 -Ext durch das mittlere Segment 3 aneinander gebunden bleiben. Die Sequenzsabschnitte des mittleren Bereichs 3 sind aneinander in Form eines komplementären Doppelstrangs gebunden. In 6) ist eine Dissoziierung bzw. Trennung von P1 1 -Ext und P2.1 -Ext voneinander nach einer Trennung der beiden Stränge im mittleren Segment 3 dargestellt. Daraus resultieren die neue Komplexe: P1 1 -Ext / C1 .1 und P2.1 -Ext / C2.1 . Beide Komplexe umfassen jeweils eine Primer-Bindungsstelle für Primer, welche in einzelsträngiger Form vorliegt.
Fig. 7 stellt schematisch eine Amplifikation durch die gleichzeitige Synthese des ersten und zweiten Primer-Verlängerungsprodukts (P1 .1 -Ext und P2.1-Ext) dar. Dabei dient P1 .1 -Ext als Matrize für die Polymerase-abhängige Synthese von P2.1 -Ext, unter Verwendung des zweiten Primers P2.1 zur Initiierung der Synthese durch die Polymerase. P2.1 -Ext dient als Matrize für die Polymerase abhängige Synthese von P1 1 -Ext, unter Verwendung des ersten Primers P1 .1 zur Initiierung der Synthese durch die Polymerase. Die jeweilige Trennung von P1 .1-Ext und P2.1-Ext nach der jeweiligen Synthese-Phase erfolgt unter Mitwirkung von beiden Controller-Oligonukleotiden (C1 .1 ) und (C2.1 ). Es resultiert eine exponentielle Amplifikation von beiden Primer- Verlängerungsprodukten P1 .1 -Ext und P2.1 -Ext.
Fig. 7 A illustriert eine Interaktion zwischen den Controllern C1 .1 und C2.1 und dem doppelsträngigen Komplex umfassend P1 .1 -Ext und P2.1 -Ext (A1 ) und eine Dissoziierung bzw. Trennung von P1 .1 -Ext und P2.1-Ext voneinander nach einer Trennung der beiden Stränge im mittleren Segment 3. Daraus resultieren die neue Komplexe: P1.1 -Ext / C1 .1 und P2.1-Ext / C2.1 . Beide Komplexe umfassen jeweils eine Primer-Bindungsstelle für Primer, welche in einzelsträngiger Form liegt. In B) und C) wird jeweils die Verwendung der Komplexe P1 .1 -Ext / C1 .1 (Fig. 7B) und P2.1-Ext/ C2.1 (Fig. 7C) als Matrizen für die Synthese gezeigt. Diese beinhalten die Primer-Bindung an jeweilige PBS (1 ), die Polymerasebindung an den Primer/PBS-Komplex (2), die Synthese des komplementären Stranges durch die Primer-Verlängerung an der jeweiligen Matrize (3), gezeigt ist die Synthese im einzelsträngigen Bereich, und die Vollendung der Synthese des komplementären Stranges durch die Primer-Verlängerung an der jeweiligen Matrize unter gleichzeitiger Verdrängung des jeweiligen Controller-Oligonukleotides (4), die Strang-Verdrängung wird hierbei durch die Polymerase vermittelt.
Nachfolgend werden die einzelnen Ausführungsformen der Amplifikation des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben. Die Synthese von jeweiligen P1 .1 -Ext oder P2.1 -Ext kann ausgehend von einer Start-Nukleinsäurekette beginnen. Die Start-Nukleinsäure wird zu Beginn der Reaktion bereitgestellt. Zunächst wird die Ausführungsform dargestellt, bei welcher M1 .1 als Start- Nukleinsäurekette verwendet wird.
Fig. 8 - 12 zeigen schematisch die Amplifikation ausgehend vom M1 .1 .
Zusammengefasst kann eine Synthese unter Verwendung einer Start-Nukleinsäurekette (M1 .1 ) (8A), von einer Polymerase, dNTPs und entsprechenden P1 .1 / C1 .1 und P2.1 / C2.1 (8B) erfolgen, so dass eine exponentielle Vermehrung von P1 1 -Ext und P2.1 -Ext (C) resultiert.
Die Start-Nukleinsäurekette (M 1 .1 ) (Fig. 8A) wird zu Beginn der Amplifikation bereitgestellt und umfasst folgende Segmente (in 5'-3'-Reihenfolge): M1 .1 .6, M1 .1 .5, M1 .1 .4, M1 .1 .3, M1 .1 .2, M1 .1 .1 , wobei diese Segmente im Wesentlichen identisch sind zu gewünschten korrespondierenden Segmenten von P1 .1-Ext (in 5'-3'-Reihenfolge): P1 .1 E6, P1 .1 E5, P1 .1 E4, P1 .1 E3, P1 .1 E2, P1 .1 E1 (Fig. 8D).
Die Bereitstellung einer solchen Start-Nukleinsäurekette M1 .1 ist einem Fachmann bekannt. Die kann mittels einer Primer-Verlängerungsreaktion unter Verwendung von P1 .1 und eines Nukleinsäurestranges umfassend einer Zielsequenz (hier Zielsequenz 1 genannt) erstellt werden (Fig. 9). Dabei wird ein P1 .1 an ein 3'-Segment einer Zielsequenz komplementär hybridisiert (Fig. 9B) so dass eine Primer-Verlängerungsreaktion stattfinden kann. Unter Verwendung einer Polymerase und entsprechenden Substraten (dNTPs) kann ein solcher Primer unter Verwendung eines Zielsequenz-umfassenden Nukleinsäurestranges verlängert werden, so dass die Zielsequenz 1 als Matrize dient und während des Vorganges kopiert wird und eine Start- Nukleinsäurekette M1 .1 synthetisiert wird (Fig. 9C). Durch eine Trennung (Fig. 9D) des synthetisierten M1 .1 vom Nukleinsäurestrang (umfassend die Zielsequenz) wird die Start- Nukleinsäurekette M1 .1 in einzelsträngige Form überführt. Eine solche Start-Nukleinsäurekette kann für die Amplifikation von P1 1-Ext und P2.1-Ext verwendet werden (Fig. 9E).
Die Verwendung eines Nukleinsäurestranges umfassend einer Zielsequenz für eine Primer- Verlängerungsreaktion ist einem Fachmann bekannt. Dabei kann eine solche Primer- Verlängerungsreaktion zur Bereitstellung einer Start-Nukleinsäurekette einmal durchgeführt werden oder der Vorgang kann auch zyklisch d.h. mehrmals wiederholt werden, wobei unter Verwendung des P1 .1 je eine Kopie von M1 .1 bereitgestellt werden kann. Die Trennung von M1 .1 vom Zielsequenz-umfassenden Nukleinsäurestrang und Überführung in einen Einzelstrang- Zustand sind ebenfalls einem Fachmann bekannt: das kann beispielsweise durch Temperatur erfolgen, welche zur Trennung von gebildeten Strängen führt. In der Regel kann eine Temperatur zwischen 85°C und 105°C verwendet werden. Alternativ kann eine Polymerase-abhängige Strang- Verdrängung zur Ablösung von M1 .1 vom Zielsequenz-umfassenden Strang verwendet werden. Dabei wird ein sogenannter Bumper-Primer verwendet, welcher in 3'-Richtung des Zielsequenz umfassenden Nukleinsäurestranges hybridisiert wird, so dass während dieser Synthese M1 .1 durch Polymerase verdrängt werden wird. Auch alkalische Strang-Trennung ist möglich, unter Verwendung von beispielsweise 0,1 Mol NaOH. Die Verwendung eines ersten Primers bei der Erstellung von M1 .1 ist dabei von Bedeutung: damit wird im 5'-Bereich der Start-Nukleinsäurekette ein Bereich eingeführt, welcher von der Polymerase nicht kopiert werden kann. Das ist hier der zweite Primer-Bereich des ersten Primers. Somit entspricht das Segment M1 .1 .6 dem Segment P1 .1 .2 und das Segment M1 .1 .5 dem Segment P1 .1 .1 . Segmente M1 .1 .4 bis M1 .1 .1 werden bei der Erstellung der M1 .1 durch die Zusammensetzung der Zielsequenz vorgegeben. Fig. 10 fasst schematisch zusammen, welche Segmente der Zielsequenz dabei als Matrize dienen und bei der Erstellung von M1 .1 verwendet werden: Die Zielsequenz 1 umfasst dabei folgende Segmente (5'- 3'-Anordnung): TS1 .5, TS1 .4, TS1 .3, TS1 .2, TS1 .1. Diese Segmente können am 3'-Ende vom Segment TS1 .X und am 5'-Ende vom Segment TS1 .Y flankiert werden. Segment TS1 .1 kann vorwiegend komplementär den ersten Bereich des ersten Primers (P1 .1 .1 ) binden, so dass die Polymerase ausgehend vom 3'-Ende des hybridisierten Primers die Zielsequenz kopieren kann, wobei M1 .1 generiert wird. Die Wahl einer solchen Zielsequenz ist einem Fachmann bekannt. Beispielsweise kann eine genomische DNA oder RNA eine solche Zielsequenz umfassen oder auch künstlich hergestellte Sequenzen können eine solche Zielsequenz umfassen. Fig. 10 fasst zusammen, welche Sequenzsegmente einer Zielsequenz (Fig. 10A) zu welchen Segmenten in den von einer solchen Zielsequenz abgeleiteten Produkten (umfassend M1 .1 (Fig. 10C) und P1 .1-Ext und P2.1 -Ext (Fig. 10E) führen. Basierend auf Regeln der umgekehrten Komplementarität der Stränge (reverse complement) kann ein Fachmann die gewünschte Zusammensetzung von jeweiligen Komponenten berechnen. Dabei kann sowohl die Zielsequenz der Ausgangspunkt dieser Berechnung sein, als auch Zwischenprodukte (M1 .1 ) oder auch Endprodukte (P1 1 -Ext und P2.1 -Ext). Auch die jeweils komplementären Bereiche von Primern und Controllern lassen sich somit definieren, um eine exponentielle Amplifikation zu unterstützen.
Fig. 1 1 zeigt Folgendes: Die Amplifikation startet dabei ausgehend von M1 .1 , wobei zunächst unter Hybridisierung des P2.1 an die im Wesentlichen komplementäre Primer-Bindungsstelle der M1 .1 (Segment M1 .1 .1 ) eine Primer-Verlängerungsreaktion durchgeführt wird (unter Verwendung von einer Polymerase und dNTPs), bei welcher M1 .1 als Matrize auftritt. Durch die Beschaffenheit der bereitgestellten M1 .1 wird die Polymerasen-Synthese an der Position Stopp-1 .1 der M1 .1 gestoppt. Das durch die Primer-Verlängerungsreaktion synthetisierte Produkt entspricht dem P2.1 -Ext. (Fig. 1 1 B). Unter Mitwirkung von Controller C1 .1 und C2.1 werden unter Reaktionsbedingungen die Stränge (M1 .1 und P2.1 -Ext) getrennt, so dass Primer-Bindungsstellen für erneute Primer-Bindung zur Verfügung stehen. An diese einzelsträngigen Segmente können nun erneut Primer binden und von der Polymerase verlängert werden. Fig. 12 zeigt, dass als Start-Nukleinsäurekette auch Nukleinsäureketten verwendet werden können, welche keine exakte Komplementarität zu P2.1 .1 aufweisen, bzw. welche sich in der Länge des 3'-Segments unterscheiden (M 1 .1 ; M1 .2 ; M1 .3). Entscheidend ist, dass P2.1 vorwiegend spezifisch an Segment M1 .1 .1 binden kann und von der Polymerase verlängert werden kann, so dass dabei P2.1 -Ext resultiert (Fig. 1 1 B).
Fig. 13 fasst zusammen, dass auch M2.1 in analoger Weise als Start-Nukleinsäurekette verwendet werden kann.
Fig. 14 - 15 zeigt schematisch die Primer- Verlängerung unter gleichzeitiger Verdrängung des jeweiligen Controllers aus seiner Bindung mit dem Primer-Verlängerungsprodukt.
Fig. 16 illustriert die Interaktion von C1 .1 und C2.1 mit dem Komplex aus P1 .1-Ext und P2.1 -Ext. Es erfolgt eine initiale Bindung von Controllern über jeweilige Polynukleotid-Schwänze (Fig. 16 B), was bei Sequenzübereinstimmung zwischen synthetisierten Strängen und Controller-Strängen zu einer Doppelstrang-Bildung (C1 .1/ P1 1-Ext und C2.1/P2.1 -Ext) führen kann. Dabei bleiben P1 .1 - Ext und P2.1 -Ext im mittleren Bereich (3) zunächst komplementär gebunden (Fig. 16 C). Unter entsprechenden Reaktionsbedingungen kann dieser Komplex im mittleren Bereich in Einzelstränge dissoziieren, was zur Trennung von P1 .1-Ext und P2.1 -Ext führt (Fig. 16 D).
Die Länge dieses mittleren Bereichs kann zwischen 0 und 60 Nukleotiden liegen, insbesondere zwischen 1 und 40 Nukleotiden, insbesondere zwischen 5 und 30 Nukleotiden. Dieser mittlere Bereich wird in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung von keinem der beiden Controller gebunden. Diesem mittleren Bereich 3 entsprechen Segmente P1 .1 E3 und P2.1 E3. Das korrespondierende Segment in der Zielsequenz 1 ist TS 1 .3 ; in M1 .1 ist es M1 .1 .3.
Insbesondere werden solche Reaktionsbedingungen verwendet, welche keine spontane Trennung von Doppelsträngen, umfassend P1 .1 -Ext und P2.1 -Ext in Abwesenheit von mindestens einem Controller zulassen.
Fig. 17 - 19 zeigen schematisch verschiedene Ausführungsformen von Topographien einzelner Zielsequenzen und davon abgeleiteten korrespondierenden Strängen von Start- Nukleinsäureketten und resultierenden Primer-Verlängerungsprodukten (P1 .1-Ext und P2.1-Ext).
Fig. 20 zeigt schematisch die Erstellung der Start-Nukleinsäurekette M2.1 unter Verwendung von Zielsequenz 4.
Beispiel 3: Erstellung einer Start-Nukleinsäurekette mittels einer PCR ausgehend von
einzelsträngigen Nukleinsäureketten
Es erfolgte eine Synthese von Start-Nukleinsäureketten (M1 .1 und M 2.1 ) mittels einer PCR ausgehend von einer einzelsträngigen Nukleinsäurekette umfassend die Zielsequenzen. Es wurden Primer mit einer Struktur verwendet, welche auch bei dem ersten und zweiten Primer der späteren Amplifikation eingesetzt wurden. Die erhaltenen Start-Nukleinsäureketten (M1 .1 und M 2.1 ) umfassten eine Zielsequenz bzw. eine zur Zielsequenz komplementäre Sequenz, sowie ein Segment M1.1.6 oder M2.1.6 (Überhang umfassend modifizierte Nukleotide dargestellt Fig. 9 A-D und Fig. 20 A-D)
Matrizen:
T2C-300-3001 (SEQ ID NO 27):
5'- TACCTGTATTCC TT GCCTGTCCAG GGATCTGCTC TTACAGATTA AAA TATTAGCCCAGAG GCGATGTCTC TCATGATACA GGTATTTTG AC - 3'
T2C-300-3002 (SEQ ID NO 28):
5'- TACCTGTATTCC TT GCCTGTCCAG GGATCTGCTC TTACAGATTA CTTAGAG CTTAGAG TATTAGCCCAGAG GCGATGTCTC TCATGATACA GGTATTTTG AC - 3'
(Templates wurden in einer Konzentration von ca. 0,1 nmol/l in PCR eingesetzt).
PCR-Ansatz:
Erster PCR Primer (0,5 pmol/l) (P1 F5G2-1001-101 K) (SEQ ID NO 29):
5'- CACAATCATCAATAC TTTTTT GTCAAAATA [CUCU GAUGCUCU] 1 GT CAAAATACC TGT
Der unterstrichende Sequenzteil (Position 1-14 vom 3'-Ende) entspricht dem ersten Bereich eines Primers und kann an eine Matrize sequenzspezifisch hybridisieren und von der Polymerase verlängert werden.
Zweiter PCR Primer (0,5 pmol/l) (P1 F5-001 -2203-7 ) (SEQ ID NO 30):
5'- [CUCU GAUGCUUC] 1 TACCTGTATTCCTTGC
A = 2'-deoxy-Adenosin, C = 2'-deoxy-Cytosin, G = 2'-deoxy-Guanosin, T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Der unterstrichende Sequenzteil (Position 1-16 vom 3'-Ende) entspricht dem ersten Bereich eines Primers und kann an eine Matrize sequenzspezifisch hybridisieren und von der Polymerase verlängert werden.
Der in Klammern gesetzte Bereich [CUCU GAUGCUCU] des ersten PCR Primers und der in Klammern gesetzte Bereich [CUCU GAUGCUUC] des zweiten PCR Primers umfassten Modifikationen (2'-0-Methyl Nukleotide: 2'-0-Me A (2'-0-Methyl-Adenosine), 2'-0-Me G (2'- O-Methyl-Guanosine), 2'-0-Me C (2'-0-Methyl-Cytosine), 2'-0-Me U (2'-0-Methyl-Uridine). 1 = C3-Linker. Diese Sequenzsegmente entsprechen dem zweiten Bereich eines Primers.
Taq Polymerase (NEB) (verwendet in einer Verdünnung von 1 :100 ausgehend von Stock- Lösung) 1 x Isothermal Puffer (New England Biolabs, catalog # B0537S; in einfacher Konzentration enthält der Puffer: 20 mM Tris-HCI; 10 mM (NhU^SCU ; 50 mM KCl; 2 mM MgSCU; 0.1 % Tween® 20;pH 8.8@25°C) ; dNTP (dATP, dCTP, dUTP, dGTP), je 200 pmol/l;
EvaGreen Farbstoff (Jena Biosciences) in 1 :50 Verdünnung.
Die PCR Reaktion wurde durchgeführt über 25 Zyklen. Ein Zyklus umfasste 1 min bei 54°C, 1 min bei 65°C. Eine finale Verlängerung wurde für 10 min bei 68°C durchgeführt. Für Produkte der Reaktion ausgehend von der Matrize T2C-300-3001 wurde eine Tm von ca. 80°C gemessen. Für die Produkte der Reaktion ausgehend von der Matrize T2C-300-3002 wurde eine Tm von ca. 81 °C gemessen.
Als Ergebnis der PCR-Reaktion wurden folgende Produkte erhalten (Start-Nukleinsäureketten M1 .1 und M2.1 ).:
Gemisch 7 (unter Verwendung von Matrize T2C-300-3001)
Produkt: M 1.1 -T2C-300-3001 (Start-Nukleinsäurekette M1.1) (M 1.1.3 3 Nukleotide)
5' - CACAATCATCAATAC TTTTTT GTCAAAATA [CUCU GAUGCUCU] 1 GT CAAAATACC TGTATCATGA GAGACATCGC CTCTGGGCTAATA TTT TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA 3' (SEQ ID NO 31 )
ProduktM 2.1-T2C-300-3001 (Start-Nukleinsäurekette M2.1) (M 2.1.3 = 3 Nukleotide)
5'- [CUCU GAUGCUUC] 1 TACCTGTATTCC TT GCCTGTCCAG GGATCTGCTC TTACAGATTA AAA T ATT AG C C C AG AG GCGATGTCTC TCATGATACA GGTATTTTG AC - 3' (SEQ ID NO 32)
Gemisch 8 (unter Verwendung von Matrize T2C-300-3002)
Produkt: M 1.1 -T2C-300-3002 (Start-Nukleinsäurekette M1.1) (M 1.1.3 14 Nukleotide)
5' - CACAATCATCAATAC TTTTTT GTCAAAATA [CUCU GAUGCUCU] 1 GT CAAAATACC TGTATCATGA GAGACATCGC CTCTGGGCTAATA CTCTAAG CTCTAAG TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AA GGAATACAGGTA 3' (SEQ ID NO 33)
Produkt: M 2.1 -T2C-300-3002 (Start-Nukleinsäurekette M2.1) (M 2.1.3 = 14 Nukleotide)
5'- [CUCU GAUGCUUC] 1 TACCTGTATTCC TT GCCTGTCCAG GGATCTGCTC TTACAGATTA CTTAGAG CTTAGAG TATTAGCCCAGAG GCGATGTCTC TCATGATACA GGTATTTTG AC - 3' (SEQ ID NO 34)
A = 2'-deoxy-Adenosin, C = 2'-deoxy-Cytosin, G = 2'-deoxy-Guanosin, T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin) Der in Klammem gesetzte Bereich (M 1 .1 .6) rCUCU GAUGCUCU1 der jeweiligen Start- Nukleinsäurekette M 1 .1 und der in Klammern gesetzte Bereich (M 2.1 .6) rCUCU GAUGCUUC1 der jeweiligen Start-Nukleinsäurekette M 2.1 umfassten Modifikationen (2'-0- Methyl Nukleotide: 2'-0-Me A (2'-0-Methyl-Adenosine), 2'-0-Me G (2'-0-Methyl- Guanosine), 2'-0-Me C (2'-0-Methyl-Cytosine), 2'-0-Me U (2'-0-Methyl-Uridine). 1 = C3- Linker. Diese Sequenzsegmente entsprechen einem Überhang.
Die erhaltenen Produkte der PCR entsprechen den Start-Nukleinsäureketten (M1 .1 und M2.1 ) und umfassen entweder die Zielsequenz oder ihre komplementäre Sequenz, entsprechende Überhänge (M 1 .1 .6 oder M 2.1 .6) sowie Primer-Bindungsstellen, an welche Primer in der Amplifikation binden können. Diese Produkte wurden als Gemisch aus beiden Primer- Verlängerungsprodukten in der Amplifikation eingesetzt (Beispiel 4).
Beispiel 4: Exponentielle Vermehrung von Amplifikationsfragmenten ausgehend von Start- Nukleinsäureketten
Die Amplifikation wurde unter Verwendung von zwei sequenzspezifischen Controller- Oligonukleotiden und zwei sequenzspezifischen Primern durchgeführt.
Es wurden zwei Varianten von Primern verwendet. Die erste Variante (Primer-Mix 1 ) umfassten Primer mit einer sogenannten„Basis-Struktur“ („Minimal-Struktur“), welche einen ersten Bereich und einen zweiten Bereich umfasste. Es wurden keine zusätzliche Sequenzsegmente verwendet. Primer-Mix 2 umfasste Primer mit einer Struktur, welche neben einem ersten und einem zweiten Primer-Bereich noch zusätzliche Sequenzsegmente verwendete.
Beide Primer-Mixe wurden mit gleichen Controller-Oligonukleotiden verwendet.
Verwendete Oligonukleotide:
Primer-Mix 1
Das erste Primer-Oligonukleotid: P1F5G2-1001-103 TMR
5'- TMR [CUCU GAUGCUCU ] 1 GT CAAAATACC T (SEQ ID NO 35)
Das zweite Primer-Oligonukleotid: P1F5-001-1016
5' [cucu gaugcuuc] 1 tacctgtattcc (SEQ ID NO 36)
A = 2'-deoxy-Adenosin; C = 2'-deoxy-Cytosin, G = 2'-deoxy-Guanosin, T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin) Der unterstrichende Sequenzteil (Position 1 -12 vom 3'-Ende) entspricht dem ersten Bereich eines Primers und kann an die entsprechenden Stellen einer Start-Nukleinsäurekette sequenzspezifisch hybridisieren und von der Polymerase verlängert werden. Das erste Primer-Oligonukleotid bindet an M2.1 , das zweite Primer-Oligonukleotid bindet an M1 .1.
Der in Klammern gesetzte Bereich rCUCU GAUGCUCU1 des ersten Primer-Oligonukleotides und der in Klammern gesetzte Bereich rCUCU GAUGCUUC1 des zweiten Primer- Oligonukleotides umfassten Modifikationen (2'-0-Methyl Nukleotide: 2'-0-Me A (2'-0-Methyl- Adenosine), 2'-0-Me G (2'-0-Methyl-Guanosine), 2'-0-Me C (2'-0-Methyl-Cytosine), 2'-0- Me U (2'-0-Methyl-Uridine). 1 = C3-Linker. Diese Sequenzsegmente entsprechen dem zweiten Bereich eines Primer-Oligonukleotides. Der erste Primer umfasste eine 5‘-TMR Modifikation.
Primer Mix 2
Das erste Primer-Oligonukleotid: P1F5G2-1001-103
5'- CACAATCATCAATAC TTTTTT GTCAAAATA [CUCU GAUGCUCU ] 1 GT CAAAATACC (SEQ ID N0 37)
Das zweite Primer-Oligonukleotid: P1 F5-50-AE2051
5’- CACAATCATCAATAC TTTTTT TACCTGTAT [CUCU GAUGCUUC] 1 TACCTGTATTCC (SEQ ID NO 1 )
A = 2'-deoxy-Adenosin, C = 2'-deoxy-Cytosin, G = 2'-deoxy-Guanosin, T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Der unterstrichende Sequenzteil (Position 1 -12 vom 3'-Ende) entspricht dem ersten Bereich eines Primers und kann an eine Matrize sequenzspezifisch hybridisieren und von der Polymerase verlängert werden.
Der in Klammern gesetzte Bereich rCUCU GAUGCUCU1 des ersten Primer-Oligonukleotides und der in Klammern gesetzte Bereich rCUCU GAUGCUUC1 des zweiten Primer- Oligonukleotides umfassten Modifikationen (2'-0-Methyl Nukleotide: 2'-0-Me A (2'-0-Methyl- Adenosine), 2'-0-Me G (2'-0-Methyl-Guanosine), 2'-0-Me C (2'-0-Methyl-Cytosine), 2'-0- Me U (2'-0-Methyl-Uridine). 1 = C3-Linker. Diese Sequenzsegmente entsprechen dem zweiten Bereich eines Primer-Oligonukleotides.
Diese Primer-Oligonukleotide umfassen den ersten Bereich (Positionen 1 - 12 vom 3'-Ende), den zweiten Bereich (C3-Linker, sowie Positionen 13 - 24 vom 3'-Ende), sowie je ein Segment mit einer Zusatzsequenz Variante P1 (Positionen 25 - 54 vom 3'-Ende). Der erste Bereich und der zweite Bereich sind für die Ausführung einer spezifischen Amplifikation notwendig und können als„Basis-Struktur des ersten Primers“ oder„Minimal-Struktur des ersten Primers“ zusammengefasst werden. Die Zusatzsequenz Variante P1 stellt ein Beispiel für zusätzliche Sequenz-Segmente dar, welche am ersten Primer-Oligonukleotid integriert werden können. Eine C3-Modifikation und der zweite Bereich verhindern eine Fortsetzung der Synthese an Positionen 25 - 54 während einer Synthese des zweiten Primer-Verlängerungsproduktes.
Es wurden foglende Controller-Oligonukleotiden verwendet:
Das erste Controller-Oligonukleotid: C2xCF-P1 -103-101
5' rUAUUAGCCCAGAGGCGAUGUCUCUCAUGAU ACA GGUAUU1 TTG AC AG AG CAT C AG AG AG X 3' (SEQ ID NO 38)
Das zweite Controller-Oligonukleotid: CF5-1001-11-6
5' GA GGACUACUUC UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUACAG1 GTA GAAGCATC AGAG X 3' (SEQ ID NO 25)
A = 2'-deoxy-Adenosin, C = 2'-deoxy-Cytosin, G = 2'-deoxy-Guanosin, T = 2'-deoxy-Thymidin (Thymidin)
Der in Klammern gesetzte Bereich rUAUUAGCCCAGAGGCGAUGUCUCUCAUGAU ACA GGUAUUl des ersten Controller-Oligonukleotides und der in Klammern gesetzte Bereich JA GGACUACUUC UAAUCUGUAA GAGCAGAUCC CUGGACAGGC AA GGAAUACAG1 des zweiten Controller-Oligonukleotides umfassten Modifikationen (2'-0-Methyl Nukleotide: 2'-0- Me A (2'-0-Methyl-Adenosine), 2'-0-Me G (2'-0-Methyl-Guanosine), 2'-0-Me C (2'-0- Methyl-Cytosine), 2'-0-Me U (2'-0-Methyl-Uridine). X= 3'-Phosphat-Gruppe.
Es wurden keine Hilfs-Oligonukleotide (z.B. Block-Oligonukleotide) eingesetzt.
Die Reaktion wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Der erste und zweite Primer wurden jeweils in Konzentrationen von 4 pmol/l eingesetzt. Das erste und zweite Controller-Oligonukleotid wurden jeweils in Konzentrationen von 2 pmol/l eingesetzt. Gemische mit DNA-Matrizen (Start-Nukleinsäureketten M1.1 und M2.1 ) aus Beispiel 3 (Gemisch 7 und 8) wurden jeweils einzeln 100-fach (1 :600 v:v), 1000-fach (1 :6000 v:v) und 60000-fach (1 :10000 v:v) verdünnt eingesetzt.
In einer Reihe von Ansätzen wurde ein Primer-Mix 1 mit beiden Controller-Oligonukleotiden eingesetzt. In einer weiteren Reihe von Ansätzen wurde ein Primer-Mix 2 mit beiden Controller-Oligonukleotiden eingesetzt. Die jeweiligen Konzentrationen von M1.1 und M1.2, sowie Konzentration von BST-Polymerase sind angegeben (siehe Figurenbeschreibung).
Die weiteren Reaktionsbedingungen waren:
1x Isothermal Puffer (New England Biolabs, catalog # B0537S; in einfacher Konzentration enthält der Puffer: 20 mM Tris-HCI; 10 mM (NH4)2S04 ; 50 mM KCl; 2 mM MgS04; 0.1 % Tween® 20;pH 8.8@25°C) ; dNTP (dATP, dCTP, dUTP, dGTP), je 200 pmol/l; EvaGreen Farbstoff (Jena Biosciences) in 1 :50 Verdünnung.
Die Amplifikation erfolgte unter Verwendung von BST 2.0 -Polymerase (Stock-Lösung: Bst 2.0 Warmstart 120.000 units /ml, NEB) nach Angaben des Herstellers. Die BST Polymerase lag im Reaktionsansatz in 120-facher (1 :120) bzw. 1200-facher (1 :1200) Verdünnung der Polymerase Stock-Lösung vor. Siehe Beschriftung von Figuren).
Die thermischen Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
• Initiale Phase bei 65 °C für 2 Minuten.
• 60 Zyklen mit folgenden Parametern
o Phase bei 50 °C für 2 min.
o Phase bei 65 °C für 2min.
• Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten.
• Aufnehmen einer Schmelzkurve.
Ergebnisse und Auswertung:
Die Amplifikation erfolgte unter Verwendung von Start-Nukleinsäureketten M1 .1 und M 2.1 , erstellt in Beispiel 3. Die Amplifikation verlief sowohl in Ansätzen mit einem Primer-Mix 1 als auch mit einem Primer-Mix 2. Die Reaktionskinetik (beobachtet durch Zeitpunkt des Signal- Anstiegs) der Amplifikation wurde beobachtet. Dabei zeigte sich, dass der Zeitpunkt des sichtbaren Signalanstiegs von der Input-Menge der Start-Nukleinsäureketten (Fig. 26 - 29) und auch der im Reaktionsansatz verwendeten Polymerasemenge (1 :120 bzw. 1 :1200) (Fig. 30) abhängt. Die Schmelztemperatur von erhaltenen Amplifikationsprodukten lag über 80°C. Doppelsträngige Produkte mit solchen Schmelzpunkten sind unter verwendeten Reaktionsbedingungen in Abwesenheit von Controller-Oligonukleotiden hinreichend stabil. Erst die Anwesenheit von Controller-Oligonukleotiden führt zu einer Trennung von synthetisierten Strängen, so dass eine Amplifikation erfolgen kann.
Die im Primer-Mix 1 (Fig. 2 und 3) verwendeten Primer umfassten je einen ersten (P1 .1.1 und P2.1 .1 ) sowie je einen zweiten Bereich (P1 .1 .2 und P2.1 .2). Die verwendeten Controller umfassten je einen entsprechenden ersten (C1 .1 .1 und C 2.1.1 ), einen zweiten (C1 .1 .2 und C 2.1.2) sowie einen dritten (C1.1.3 und C 2.1 .3) Bereich. Das zeigt, dass Oligonukleotide mit solchen Strukturen zur Ausführung des Verfahrens ausreichend waren.
Die im Primer-Mix 2 verwendeten Primer umfassten neben einem ersten und einem zweiten Bereich noch zusätzliche Sequenzsegmente, welche am 5'-Primerterminus lagen. Diese Strukturen nehmen an der Amplifikation nicht teil, stören aber eine solche Amplifikation auch nicht. Das zeigt, dass zusätzliche Sequenzen am Primer eingeführt werden können.
Im Vergleich zu Beispiel 2 wurden in diesem Beispiel 4 keine Hilfs-Oligonukleotide (Block- Oligonukleotide) bei der Amplifikation verwendet. Hiermit wurde eine bestimmte Ausführungsform gezeigt: Verwendung von Primer-Überschuss bezogen auf die Konzentration von Controller-Oligonukleotiden bei gleichzeitiger Verwendung von zyklischen Temperatur-Bedingungen (50°C und 65°C).
Im Einzelnen:
Analyse der Amplifikations-Fragmente nach exponentieller Vermehrung ausgehend von einer Start-Nukleinsäurekette
Zur Analyse der Amplifikationsreaktion und zur Bewertung der entstandenen Amplifikationsprodukte wurden folgende Techniken genutzt:
• Fluoreszenzsignal eines interkalierenden Farbstoffes (EvaGreen)
• Schmelzkurvenanalyse von den entstandenen Amplifikationsprodukten.
Fig. 26 - 29 zeigt den Einfluss der eingesetzten Start-Nukleinsäurekette auf den Reaktionsverlauf.
Fig. 26 (A) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignals des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an, dass Amplifikationsprodukte entstanden sind. Die Ansätze enthielten bei Reaktionsstart 600-fach (Pfeill ), 6000-fach (Pfeil 2) und 60000-fach (Pfeil 3) verdünnte Ansätze aus Beispiel 3 mit Gemisch 7 (M 1.1 -T2C-300- 3001 und M 2.1 -T2C-300-3001 ). Pfeil 4 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde in der PCR zur Erzeugung von Fragmenten anstelle von Template H2O eingesetzt. In der Negativkontrolle sind keine Amplifikationsprodukte entstanden. Der Amplifikations-Ansatz wurde mit Primer-Mix 2 und entsprechenden Controller-Oligonukleotiden durchgeführt. Die BST-Polymerase wurde in 1 -zu-120-facher Verdünnung der Stock-Lösung eingesetzt.
Fig. 26 (B) zeigt die zu den Ansätzen gehörenden Schmelzkurven. Auf der Y-Achse ist Ableitung des Fluoreszenzsignals und auf der X-Achse die Temperatur aufgetragen. Es ist ein Peak erkennbar, der anzeigt, dass ein einheitliches Amplifikationsprodukt entstanden ist. Dabei gehören die mit 1 -3 gekennzeichneten Peaks zu den Ansätzen, die bei Reaktionsstart Gemisch 7 (M 1.1 -T2C-300-3001 und M 2.1 -T2C-300-3001 ) in 600-facher, 6000-facher und 60000-facher Verdünnung enthielten. Die mit 4 markierten Kurven weisen keinen Produktpeak auf und gehören zur Negativkontrolle.
Fig. 27 (A) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignals des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an, dass Amplifikationsprodukte entstanden sind. Die Ansätze enthielten bei Reaktionsstart 600-fach (Pfeill ), 6000-fach (Pfeil 2) und 60000-fach (Pfeil 3) verdünnte Ansätze aus Beispiel 3 mit Gemisch 8 (M 1.1 -T2C-300- 3002 und M 2.1 -T2C-300-3002).. Pfeil 4 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde in der PCR zur Erzeugung von Fragmenten anstelle von Template H2O eingesetzt. In der Negativkontrolle sind keine Amplifikationsprodukte entstanden. Der Amplifikations-Ansatz wurde mit Primer-Mix 2 und entsprechenden Controller-Oligonukleotiden durchgeführt. Die BST-Polymerase wurde in 1 -zu-120-facher Verdünnung der Stock-Lösung eingesetzt.
Fig. 27 (B) zeigt die zu den Ansätzen gehörenden Schmelzkurven. Auf der Y-Achse ist die Ableitung des Fluoreszenzsignals und auf der X-Achse die Temperatur aufgetragen. Es ist ein Peak erkennbar, der anzeigt, dass ein einheitliches Amplifikationsprodukt entstanden ist. Dabei gehören die mit 1 -3 gekennzeichneten Peaks zu den Ansätzen, die bei Reaktionsstart Gemisch 8 (M 1.1 -T2C-300-3002 und M 2.1 -T2C-300-3002) in 600-facher, 6000-facher und 60000-facher Verdünnung enthielten. Die mit 4 markierten Kurven weisen keinen Produktpeak auf und gehören zur Negativkontrolle.
Fig. 28 (A) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignals des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an, dass Amplifikationsprodukte entstanden sind. Die Ansätze enthielten bei Reaktionsstart 600-fach (PfeiM ), 6000-fach (Pfeil 2) und 60000-fach (Pfeil 3) verdünnte Ansätze aus Beispiel 3 mit Gemisch 7 (M 1.1 -T2C-300- 3001 und M 2.1 -T2C-300-3001 ). Pfeil 4 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde in der PCR zur Erzeugung von Fragmenten anstelle von Template H2O eingesetzt. In der Negativkontrolle sind keine Amplifikationsprodukte entstanden. Der Amplifikations-Ansatz wurde mit Primer-Mix 1 und entsprechenden Controller-Oligonukleotiden durchgeführt. Die BST-Polymerase wurde in 1 -zu-120-facher Verdünnung der Stock-Lösung eingesetzt.
Fig. 28 (B) zeigt die zu den Ansätzen gehörenden Schmelzkurven. Auf der Y-Achse ist Ableitung des Fluoreszenzsignals und auf der X-Achse die Temperatur aufgetragen. Es ist ein Peak erkennbar, der anzeigt, dass ein einheitliches Amplifikationsprodukt entstanden ist. Dabei gehören die mit 1 -3 gekennzeichneten Peaks zu den Ansätzen, die bei Reaktionsstart Gemisch 7 (M 1.1 -T2C-300-3001 und M 2.1 -T2C-300-3001 ) in 600-facher, 6000-facher und 60000-facher Verdünnung enthielten. Die mit 4 markierten Kurven weisen keinen Produktpeak auf und gehören zur Negativkontrolle.
Fig. 29 (A) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignals des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an, dass Amplifikationsprodukte entstanden sind. Die Ansätze enthielten bei Reaktionsstart 600-fach (PfeiM ), 6000-fach (Pfeil 2) und 60000-fach (Pfeil 3) verdünnte Ansätze aus Beispiel 3 mit Gemisch 8 (M 1.1 -T2C-300- 3002 und M 2.1 -T2C-300-3002). Pfeil 4 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde in der PCR zur Erzeugung von Fragmenten anstelle von Template H O eingesetzt. In der Negativkontrolle sind keine Amplifikationsprodukte entstanden. Der Amplifikations-Ansatz wurde mit Primer-Mix 1 und entsprechenden Controller-Oligonukleotiden durchgeführt. Die BST-Polymerase wurde in 1 -zu-120-facher Verdünnung der Stock-Lösung eingesetzt.
Fig. 29 (B) zeigt die zu den Ansätzen gehörenden Schmelzkurven. Auf der Y-Achse ist die Ableitung des Fluoreszenzsignals und auf der X-Achse die Temperatur aufgetragen. Es ist ein Peak erkennbar, der anzeigt, dass ein einheitliches Amplifikationsprodukt entstanden ist. Dabei gehören die mit 1 -3 gekennzeichneten Peaks zu den Ansätzen, die bei Reaktionsstart Gemisch 8 (M 1.1 -T2C-300-3002 und M 2.1 -T2C-300-3002) in 600-facher, 6000-facher und 60000-facher Verdünnung enthielten. Die mit 4 markierten Kurven weisen keinen Produktpeak auf und gehören zur Negativkontrolle.
Fig. 30 Zeigt den Einfluss der eingesetzten Polymerasenmenge auf den Reaktionsverlauf.
Fig. 30 (A) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignals des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an, dass Amplifikationsprodukte entstanden sind. Die Ansätze enthielten bei Reaktionsstart 600-fach (PfeiM ) verdünnte Ansätze aus Beispiel 3 mit Gemisch 8 (M 1.1 -T2C-300-3002 und M 2.1 -T2C-300-3002). Pfeil 2 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde in der PCR zur Erzeugung von Fragmenten anstelle von Template H O eingesetzt. In der Negativkontrolle sind keine Amplifikationsprodukte entstanden. Der Amplifikations-Ansatz wurde mit Primer-Mix 2 und entsprechenden Controller-Oligonukleotiden durchgeführt. Die BST-Polymerase wurde in 1 - zu-1200-facher Verdünnung der Stock-Lösung eingesetzt.
Fig. 30 (B) zeigt einen typischen Verlauf des EvaGreen-Fluoreszenzsignals im Laufe der Amplifikationsreaktion. Auf der Y-Achse ist die Änderung des Fluoreszenzsignals des EvaGreen-Farbstoffes und auf der X-Achse ist die Reaktionszeit (als Zyklusnummer) aufgetragen. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals zeigt an, dass Amplifikationsprodukte entstanden sind. Die Ansätze enthielten bei Reaktionsstart 600-fach (PfeiM ) verdünnte Ansätze aus Beispiel 3 mit Gemisch 8 (M 1.1 -T2C-300-3002 und M 2.1 -T2C-300-3002). Pfeil 2 zeigt den Verlauf einer Negativkontrolle, hier wurde in der PCR zur Erzeugung von Fragmenten anstelle von Template H O eingesetzt. In der Negativkontrolle sind keine Amplifikationsprodukte entstanden. Der Amplifikations-Ansatz wurde mit Primer-Mix 2 und entsprechenden Controller-Oligonukleotiden durchgeführt. Die BST-Polymerase wurde in 1 - zu-120-facher Verdünnung der Stock-Lösung eingesetzt.

Claims

Ansprüche
1 . Ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäurekette, wobei
eine Probe, die eine Start-Nukleinsäurekette (M2.1 ) umfasst, welche in 5‘-3‘-Orientierung in unmittelbarer Folge die Sequenzabschnitte M2.1 .6, M2.1 .5, M2.1 .4, M2.1 .3, M2.1 .2, M2.1 .1 umfasst, wobei M2.1 .6 modifizierte Nukleotidbausteine umfasst, so dass M2.1 .6 nicht als Matrize für die Aktivität einer matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen kann,
mit folgenden Komponenten in Kontakt gebracht wird:
a. eine erste matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA- Polymerase, sowie Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid- triphosphate) und geeignete Kofaktoren,
b. zwei Oligonukleotidprimer P1 .1 und P2.1 , wobei in 5‘-3‘-Orientierung
i. P1 .1 zwei Sequenzabschnitte P1 .1 .2 und P1 .1 .1 und ii. P2.1 zwei Sequenzabschnitte P2.1 .2 und P2.1 .1
in unmittelbarer Folge umfassen, wobei P1 .1 .1 die zu M2.1 .1 komplementäre
[hybridisierende] Sequenz aufweist [im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann] sowie P2.1 .1 die zu M2.1 .5 identische Sequenz aufweist [an das Verlängerungsprodukt von P1 .1 bindet und von diesem aus die Synthese einer M2.1 identischen Sequenz initiiert] und P1 .1 .2 nicht an M2.1 binden kann, und P2.1 .2 nicht an das
Verlängerungsprodukt von P1 .1 binden kann
und wobei
P1 .1 und P2.1 im Abschnitt P1 .1 .2 und P2.1 .2 modifizierte Nukleotidbausteine umfassen, so dass P1 .1 .2 und P2.1 .2 nicht als Matrize für die Aktivität der ersten
matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen können;
c. zwei Controller-Oligonukleotide C1 .1 und C2.1 , wobei in 5‘-3‘-Orientierung
i. C1 .1 die Sequenzabschnitte C1 .1 .3, C1 .1 .2 und C1 .1 .1 in unmittelbarer Folge umfasst, wobei C1 .1 .3 identisch zu M2.1 .2 ist, C1 .1 .2
komplementär zu P1 .1 .1 ist, und C1 .1 .1 an P1 .1 .2 binden kann, ii. C2.1 die Sequenzabschnitte C2.1 .3, C2.1 .2 und C2.1 .1 in unmittelbarer Folge umfasst, wobei C2.1 .3 komplementär zu M2.1.4 ist, C2.1 .2 komplementär zu P2.1 .1 ist, und C2.1 .1 an P2.1 .2 binden kann, und wobei C1 .1 und C2.1 in C1 .1 .2, C1 .1 .3 und C2.1 .2, C2.1 .3 modifizierte
Nukleotidbausteine umfassen, so dass C1 .1 und C2.1 nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen können.
2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei die matrizenabhängige
Nukleinsäurepolymerase ausgehend von P1 .1 ein Verlängerungsprodukt P1 1-Ext synthetisiert und ausgehend von P2.1 ein Verlängerungsprodukt P2.1-Ext synthetisiert
und P1 1 -Ext mit P2.1 -Ext einen Verlängerungsprodukt-Doppelstrang ausbilden kann und wobei
- die Länge von C1 .1 .3, C1 .1 .2, C1 .1 .3, C2.1 .3, C2.1 .2, C2.1 .1 und ggf. M2.1 .3
und/oder
die Reaktionsbedingungen
so gewählt sind, dass der Verlängerungsprodukt-Doppelstrang in Abwesenheit von C1 .1 und C2.1 stabil ist, und in Anwesenheit von C1 .1 und C2.1 voneinander getrennt wird.
3. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierten Nukleotidbausteine 2’-0-Alkylribonukleosidbausteine, insbesondere 2’- O-Methylribonukleosidbausteine, umfassen.
4. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzabschnitte M2.1 .5, M2.1 .4, M2.1 .3, M2.1 .2 und M2.1 .1 zusammen eine Länge von 20 Nukleotiden bis 200 Nukleotiden haben.
5. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass P1 .1 und P2.1 je eine Länge im Bereich von 15 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden haben.
6. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass P1 .1 .2 und P2.1 .2 je eine Länge im Bereich von 5 Nukleotiden bis 85 Nukleotiden haben, insbesondere dass P1 .1 .2 und P2.1 .2 zwischen 50% und 300% der Länge des
Sequenzabschnitts P1 .1 .1 bzw. P2.1 .1 haben.
7. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, durch gekennzeichnet, dass C1 .1 und C2.1 je eine Länge im Bereich von 20 Nukleotiden bis 100 Nukleotiden haben.
8. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, durch gekennzeichnet, dass [der weder von C1 .1 noch C2.1 abgedeckte Bereich] M2.1 .3 eine Länge von 0 bis 50 Nukleotiden, insbesondere 0 bis 25 Nukleotiden, insbesondere bis 20 Nukleotiden hat.
9. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, durch gekennzeichnet, dass [der weder von C1 .1 noch C2.1 abgedeckte Bereich] M2.1 .3 eine Länge von 0 bis 60 Nukleotiden, insbesondere 5 bis 40 Nukleotiden, insbesondere 5 bis 30 Nukleotiden umfasst.
10. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren im Wesentlichen isothermal durchgeführt wird.
1 1 . Das Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die
Reaktionstemperatur im Bereich von 50 °C bis 70 °C liegt.
12. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Start- Nukleinsäurekette (M2.1 ) durch Reaktion einer zweiten matrizenabhängigen
Nukleinsäurepolymerase erhalten wurde, indem ein an seinem 3‘-Ende die Sequenz P2.1 .1 enthaltender Oligonukleotidprimer mit einer Zielsequenz TS4.1 hybridisiert.
13. Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der an seinem 3‘-Ende die Sequenz P2.1 .1 enthaltender Oligonukleotidprimer mit P2.1 identisch ist.
14. Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der an seinem 3‘-Ende die Sequenz P2.1 .1 enthaltender Oligonukleotidprimer nur aus der Sequenz P2.1 .1 besteht.
15. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend: a. zwei Oligonukleotidprimer P1 .1 und P2.1 , wobei in 5‘-3‘-Orientierung
i. P1 .1 zwei Sequenzabschnitte P1 .1 .2 und P1 .1 .1 und
ii. P2.1 zwei Sequenzabschnitte P2.1 .2 und P2.1 .1
in unmittelbarer Folge umfassen, wobei P1 .1 .1 die zu einem auf einer Zielsequenz umfassten Sequenzabschnitt M2.1 .1 komplementäre [hybridisierende] Sequenz aufweist [im Wesentlichen sequenzspezifisch binden kann] sowie P2.1 .1 die zu einem auf einer Zielsequenz umfassten Sequenzabschnitt M2.1 .5 identische Sequenz aufweist [an das Verlängerungsprodukt von P1 .1 bindet und von diesem aus die Synthese einer M2.1 identischen Sequenz initiiert] und P1 .1 .2 nicht an M2.1 binden kann, und P2.1 .2 nicht an das Verlängerungsprodukt von P1 .1 binden kann
Hybridisieren eines ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) an den 3'-terminalen Bereich einer zu amplifizierenden Nukleinsäurekette, wobei das erste Primer- Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich (P1 .1 .1 ), der sequenzspezifisch an den 3' terminalen Bereich (M2.1 .1 und / oder P2.1 E1 ) der zu amplifizierenden
Nukleinsäurekette binden kann,
• einen zweiten Bereich (P1 .1 .2) (Primer-Überhang), der sich an das 5'- Ende des ersten Bereichs anschließt oder damit über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem ersten Controller- Oligonukleotid (C1 .1 ) gebunden werden kann und von einer für die Amplifikation verwendeten Polymerase unter den gewählten
Reaktionsbedingungen im Wesentlichen unkopiert bleibt; des Komplementärstrangs der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette, wobei das zweite Primer-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich (P2.1 .1 ), der sequenzspezifisch an den 3'-terminalen Bereich des Komplementärstrangs (P1 .1 E1 ) binden kann,
• einen zweiten Bereich (P2.1 .2) (Überhang), der sich an das 5'-Ende des ersten Bereichs anschließt oder damit über einen Linker verbunden ist, wobei der zweite Bereich von einem zweiten Controller-Oligonukleotid (C2.1 ) gebunden werden kann und von einer für die Amplifikation verwendeten Polymerase unter den gewählten Reaktionsbedingungen im Wesentlichen unkopiert bleibt; Extension des ersten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 ) unter Erhalt eines ersten Primer-Extensionsprodukts (P1 .1-Ext), welches neben dem ersten Primer- Oligonukleotid einen von der Polymerase synthetisierten Bereich umfasst;
Extension des zweiten Primer-Oligonukleotids (P2.1 ) unter Erhalt eines zweiten Primer-Extensionsprodukts (P2.1-Ext), welches neben dem zweiten Primer- Oligonukleotid einen synthetisierten Bereich umfasst;
Bindung eines ersten Controller-Oligonukleotids (C1 .1 ) an das erste Primer- Extensionsprodukt (P1 1-Ext), wobei das erste Controller-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst (Fig. 13):
• einen ersten Bereich (C1 .1 .1 ), der an den zweiten Bereich (Überhang) des ersten Primer-Extensionsprodukts (P1 .1 E6) binden kann,
• einen zweiten Bereich (C1 .1 .2), der zum ersten Bereich des zweiten Primer-Oligonukleotids (P1 .1 .1 ) im Wesentlichen komplementär ist, und
• einen dritten Bereich (C1 .1 .3), der zumindest zu einem Teil des
synthetisierten Bereiches des ersten Primer-Extensionsprodukts (P1 .1 E4) im Wesentlichen komplementär ist;
wobei das erste Controller-Oligonukleotid nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des ersten Primer-Oligonukleotids dient, und das erste Controller-Oligonukleotid an den ersten und zweiten Bereich des ersten Primer-Extensionsprodukts unter Verdrängung von komplementären Segmenten des zweiten anderen Stranges (P2.1 E1 und P2.1 E2) der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette bindet;
Bindung eines zweiten Controller-Oligonukleotids (C2.1 ) an das zweite Primer- Extensionsprodukt (P2.1-Ext), wobei das zweite Controller-Oligonukleotid folgende Bereiche umfasst:
• einen ersten Bereich (C2.1 .1 ), der an den zweiten Bereich des zweiten Primer-Extensionsprodukts (P2.1 E6) binden kann,
• einen zweiten Bereich (C2.1 .2), der zum ersten Bereich des zweiten Primer-Oligonukleotids (P2.1 .1 ) im Wesentlichen komplementär ist, und
• einen dritten Bereich (C2.1 .3), der zumindest zu einem Teil des
synthetisierten Bereiches des zweiten Primer-Extensionsprodukts (P2.1 E4) im Wesentlichen komplementär ist;
wobei das zweite Controller-Oligonukleotid nicht als Matrize für eine Primerverlängerung des zweiten Primer-Oligonukleotids dient, und das zweite Controller-Oligonukleotid an das Primer- Extensionsprodukt unter Verdrängung von komplementären Segmenten des ersten Stranges (P1 .1 E1 und P1 .1 E2) der zu amplifizierenden Nukleinsäurekette bindet und wobei
P1 .1 und P2.1 im Abschnitt P1 .1 .2 und P2.1 .2 modifizierte Nukleotidbausteine umfassen, so dass P1 .1 .2 und P2.1 .2 nicht als Matrize für die Aktivität der ersten matrizenabhängigen
Nukleinsäurepolymerase dienen können; b. zwei Controller-Oligonukleotide C1 .1 und C2.1 , wobei in 5‘-3‘-Orientierung
i. C1 .1 die Sequenzabschnitte C1 .1 .3, C1 .1 .2 und C1 .1 .1 in unmittelbarer Folge umfasst, wobei C1 .1 .3 identisch zu M2.1 .2 ist, C1 .1 .2
komplementär zu P1 .1 .1 ist, und C1 .1 .1 an P1 .1 .2 binden kann, ii. C2.1 die Sequenzabschnitte C2.1 .3, C2.1 .2 und C2.1 .1 in unmittelbarer Folge umfasst, wobei C2.1 .3 komplementär zu M2.1.4 ist, C2.1 .2 komplementär zu P2.1 .1 ist, und C2.1 .1 an P2.1 .2 binden kann, und wobei C1 .1 und C2.1 in C1 .1 .2, C1 .1 .3 und C2.1 .2, C2.1 .3 modifizierte Nukleotidbausteine umfassen, so dass C1 .1 und C2.1 nicht als Matrize für die Aktivität der ersten
matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase dienen können.
16. Der Kit nach Anspruch 15, weiterhin umfassend eine erste matrizenabhängige
Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-Polymerase, sowie optional Substrate der DNA-Polymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder
Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren, insbesondere eine mesophile matritzenabhängige Polymerase, insbesondere eine mesophile
matritzenabhängige Polymerase ohne 5'-3'-Exonukleaseaktivität.
17. Der Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 16, weiterhin umfassend eine zweite
matrizenabhängige Nukleinsäurepolymerase, insbesondere eine DNA-Polymerase, sowie optional Substrate der matrizenabhängigen Nukleinsäurepolymerase (insbesondere Ribonukleosid-triphosphate oder Desoxyribonukleosid-triphosphate) und geeignete Kofaktoren, insbesondere eine thermophile matritzenabhängige Polymerase, insbesondere eine thermophile matritzenabhängige Polymerase mit 5'-3'- Exonukleaseaktivität.
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