DE60009323T2 - Methoden und zusammensetzungen zur linearen isothermalen amplifikation von polynukleotidsequenzen - Google Patents

Methoden und zusammensetzungen zur linearen isothermalen amplifikation von polynukleotidsequenzen Download PDF

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    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]

Description

  • FACHGEBIET
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der Polynukleotid-Amplifikation. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Verfahren, Zusammensetzungen und Reagenzsätze zum Amplifizieren (d.h. Erzeugen vielfacher Kopien) von Ziel-Polynukleotidsequenzen, bei denen ein einzelner zusammengesetzter RNA/DNA-Primer verwendet wird, wobei die Amplifikation wahlweise die Transkription einbezieht.
  • HINTERGRUND
  • Die Entwicklung von Verfahren zur Nukleinsäure-Amplifikation und zum Nachweis der Amplifikationsprodukte haben der Detektion, Identifikation, Quantifikation und den Analysemethoden von Nukleinsäuresequenzen in den letzten Jahren Fortschritte gebracht.
  • Die Nukleinsäure-Analyse ist für die Detektion und Identifikation von Pathogenen, die Detektion von Genveränderungen, die zu definierten Phänotypen führen, die Diagnose von genetisch bedingten Erkrankungen oder Anfälligkeit für eine Erkrankung, die Untersuchung der Genexpression in der Entwicklung, der Erkrankung und als Reaktion auf definierte Reize, als auch die verschiedenen Genom-Projekte nützlich. Weitere Anwendungen der Nukleinsäure-Amplifikationsmethode sind die Detektion seltener Zellen, die Detektion von Pathogenen und die Detektion einer veränderten Genexpression bei Malignitäten und ähnliches. Die Nukleinsäure-Amplifikation ist sowohl für die qualitative Analyse, wie etwa den Nachweis des Vorhandenseins definierter Nukleinsäuresequenzen, als auch die Quantifizierung definierter Gensequenzen potentiell nützlich. Letztere ist für die Beurteilung von pathogenen Sequenzen und ihrer Mengen als auch die Bestimmung einer Genmultiplikation oder -deletion, wie oftmals in der Zelltransformation von einem normalen zu einem bösartigen Zelltyp zu finden, nützlich.
  • Der Nachweis von Sequenzveränderungen in einer Nukleinsäuresequenz ist für den Nachweis mutanter Genotypen, wie relevant für die Genanalyse, den Nachweis von Mutationen, der zu Arzneimittelresistenz führt, die Pharmakogenomik etc. wichtig. Zu den verschiedenen Methoden zum Nachweis spezifischer Mutationen zählen die Allel-spezifische Primer-Extension, die Allel-spezifische Sonden-Ligation und die differentielle Sonden-Hybridisation. Sie zum Beispiel US-Patent-Nrn. 5.888.819 ; 6.004.744 ; 5.882.867 ; 5.710.028 ; 6.027.889 ; 6.004.745 ; und WO US 88/02746 , WO 99/40219 und WO 99/29901 . Auch wurden Methoden zum Nachweis des Vorhandenseins von Sequenzveränderungen in einer definierten Nukleinsäuresequenz ohne die spezifische Kenntnis der Veränderung beschrieben. Ein Teil dieser Methoden basiert auf dem Nachweis von Fehlpaarungen, die durch Hybridisation eines Test-Amplifikationsprodukts an ein Referenz-Amplifikationsprodukt entstehen. Das Vorhandensein von Fehlpaarungen in solchen Heteroduplexen kann durch die Verwendung Fehlpaarungs-spezifischer Bindungsproteine oder durch chemische oder enzymatische Spaltung der Fehlpaarung nachgewiesen werden. Eine Methode zum Nachweisen von Sequenzveränderungen, welches auf der Hemmung der Zweigwanderung bei kreuzförmigen viersträngigen DNA-Strukturen basiert, wurde vor kurzem beschrieben. Siehe zum Beispiel Lishanski, A. et al. Nucleic Acids Res 28(9); E42 (2000). Andere Methoden basieren auf dem Nachweis spezifischer Konformationen der einzelsträngigen Amplifikationsprodukte. Die Sekundärstruktur einer einzelsträngigen DNA oder RNA hängt von der spezifischen Sequenz ab. Sequenzveränderungen bei einer Test-Zielnukleinsäure relativ zur Referenzsequenz führen zu einer veränderten Konformation. Eine veränderte Konformation eines einzelsträngigen Amplifikationsprodukts kann durch eine veränderte elektrophoretische Mobilität des Test-Amplifikationsprodukts im Vergleich zu der eines Referenz-Amplifikationsprodukts nachgewiesen werden. Ein einzelsträngiger Konformations-Polymorphismus, SSCP, wird für den Nachweis von Sequenzveränderungen breit eingesetzt. Siehe zum Beispiel Orita M., et al. Proc Natl Acad Sci USA 86(8); 2766–70 (1989); Suzuki, Y. et al. Oncogene 5(7):1037–43 (1990) und US Patent Nr. 5.871.697 . Dieses Verfahren wird auch in der mikrobiellen Identifizierung angewendet, die auf definierten Veränderungen in einer spezifischen Nukleinsäuresequenz bei unterschiedlichen Stämmen oder Spezies basiert. Der Mutationsnachweis unter Anwendung der SSCP-Methoden nützt in den meisten Fällen DNA-Amplifikationsprodukte aus, doch wurden auch RNA-SSCP-Methoden beschrieben. Die sequenzabhängige Konformation einer einzelsträngigen RNA ist wohl dokumentiert und wurde als zu einem definierten elektrophoretischen Mobilitätsmuster führend nachgewiesen. Siehe zum Beispiel Sarkar et al. Nucleic Acid Research 20(4):871–878 (1992) und Gasparini et al. Hum. Genet. 97:492–495 (1996).
  • Obschon der Nachweis des Vorhandenseins einer definierten Nukleinsäuresequenz, und ihre Sequenzanalyse, durch Sondenhybridisation durchgeführt werden kann, lässt die Methode allgemein an Empfindlichkeit zu wünschen übrig, wenn geringe Mengen der Nukleinsäuresequenz in der Testprobe vorhanden sind, zum Beispiel nur einige wenige Moleküle. Eine Lösung für dieses Hindernis bestand in der Entwicklung von Verfahren zur Erzeugung vielfacher Kopien der definierten Nukleinsäuresequenz, die sich zur weiteren Analyse eignen. Die Verfahren zur Erzeugung der vielfachen Kopien einer spezifischen Nukleinsäuresequenz sind allgemein als Zielamplifikations-Methoden definiert. Andere Methoden zur Erhöhung der Empfindlichkeit des Nachweises der Hybridisationsanalyse basieren auf der Erzeugung vielfacher Produkte aus der hybridisierten Sonde oder Sonden, zum Beispiel der Spaltung der hybridisierten Sonde zum Erhalt vielfacher Produkte oder der Ligation benachbarter Sonden zum Erhalt eines einzigartigen Hybridisations-abhängigen Produkts. Entsprechend wurde eine erhöhte Empfindlichkeit der Hybridisationsreaktion durch Methoden zur Amplifikation von Signalen erreicht, die durch das Hybridisations-Ereignis erzeugt werden, wie etwa der auf der Hybridisation verzweigter DNA-Sonden basierenden Methode.
  • Es gibt viele Varianten der Nukleinsäure-Amplifikation, zum Beispiel die exponentielle Amplifikation, die verknüpfte lineare Amplifikation, die auf Ligation basierende Amplifikation und die auf Transkription basierende Amplifikation. Ein Beispiel der exponentiellen Nukleinsäure-Amplifikationsmethode ist die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction – PCR), die in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben wurde. Siehe zum Beispiel Mullis et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263–273 (1986); Mullis K. EP 201.184 ; Mullis et al. US-Patent Nr. 4.582.788 ; Erlich et al. EP 50.424 , EP 84.796 , EP 258.017 , EP 237.362 ; und Saiki R. et al. US-Patent Nr. 4.683.194 . Die verknüpfte lineare Amplifikation ist beschrieben bei Wallace et al. in US-Patent Nr. 6.027.923 . Beispiele der auf Ligation basierenden Amplifikation sind die Ligations-Amplifikationsreaktion (LAR), wie beschrieben von Wu et al. in Genomics 4:560 (1989), und die Ligase-Kettenreaktion, wie beschrieben in EP-Anmeldung Nr. 0320308 B1 . Verschiedene Methoden der auf Transkription basierenden Amplifikation sind beschrieben in US-Patent Nrn. 5.766.849 und 5.654.142 ; und ebenso bei Kwoh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173 (1989) und Ginergeras et al. WO 88/10315 .
  • Die am häufigsten eingesetzte Ziel-Amplifikationsmethode ist die Polymerase-Kettenreaktion, PCR, die auf vielfachen Zyklen von Denaturierung, Hybridisation zweier Oligonukleotid-Primer, jeder an den entgegengesetzten Strang der Zielstränge, und die Primer-Extension durch eine Nukleotid-Polymerase zum Erhalt vielfacher doppelsträngiger Kopien der Zielsequenz basieren. Viele Varianten der PCR wurden beschrieben, und das Verfahren wird zur Amplifikation von DNA- oder RNA-Nukleinsäuresequenzen, zur Sequenzierung, zur Mutationsanalyse und weiterem eingesetzt. Auf Wärmezyklierung basierende Methoden, die einen einzelnen Primer verwenden, wurden ebenfalls beschrieben. Sie zum Beispiel US-Patent Nrn. 5.508.178 ; 5.595.891 ; 5.683.879 ; 5.130.238 ; und 5.679.512 . Der Primer kann ein chimärer DNA/RNA-Primer sein, wie beschrieben in US-Patent Nr. 5.744.308 . Andere Methoden, die von der Wärmezyklierung abhängen, sind die Ligase-Kettenreaktion (LCR) und die verwandte Reparatur-Kettenreaktion (RCR).
  • Die Ziel-Nukleinsäure-Amplifikation kann mittels vielfacher Inkubationszyklen bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt werden, d.h. der Wärmezyklierung, oder bei einer Temperatur (ein isothermer Prozess). Die Entdeckung der thermostabilen Nukleinsäure-modifizierenden Enzyme hat zu den schnellen Fortschritten bei der Nukleinsäure-Amplifikationstechnologie beigetragen. Siehe Saiki, et al. Science 239:487 (1988). Thermostabile Nukleinsäure-modifizierende Enzyme, wie etwa DNA- und RNA-Polymerasen, Ligasen, Nukleasen und ähnliche werden bei beiden, auf der Wärmezyklierung und den isothermen Amplifikationsmethoden basierenden Verfahren verwendet. Isotherme Methoden, wie etwa die Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA), sind beschrieben bei Fraiser et al. in US-Patent Nr. 5.648.211 ; Cleuziat et al. in US-Patent Nr. 5.824.517 ; und Walker et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392–396 (1992). Fu et al., Nucleic Acids Research 1997, Bd. 25, Nr. 3, beschreibt die Sequenzierung von doppelsträngiger DNA durch Strangverdrängung. Weitere isotherme Ziel-Amplifikationsmethoden sind die auf Transkription basierenden Amplifikationsmethoden, bei denen eine RNA-Polymerase-Promotorsequenz in Primer-Extensionsprodukte in einem frühen Stadium der Amplifikation eingebaut werden ( WO 89/01050 ), und eine weitere Zielsequenz, oder Ziel-komplementäre Sequenz, durch Transkriptionsschritte und Verdau eines RNA-Strangs in einem Intermediärprodukt eines DNA/RNA-Hybrids amplifiziert wird. Siehe zum Beispiel US-Patent Nrn. 5.169.766 und 4.786.600 und US 5.849.547 . Diese Methoden umfassen die Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA), die selbstunterhaltene Sequenzreplikation (3SR), die auf der Nukleinsäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA) und Varianten davon. Siehe zum Beispiel Guatelli et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874–1878 (1990); US Patent Nrn. 5.766.849 (TMA); und 5.654.142 (NASBA). Weitere Amplifikationsmethoden verwenden Template-Switch-Oligonukleotide (TSO) und Blockier-Oligonukleotide. Zum Beispiel ist die Template-Switch-Amplifikation, bei der ein chimärer DNA-Primer verwendet wird, beschrieben in US-Patent Nr. 5.679.512 und bei Patel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2969–2974 (1996), und Blockier-Oligonukleotide sind beschrieben bei Laney et al. in US-Patent Nr. 5.679.512 .
  • Die isothermen Ziel-Amplifikationsmethoden erfordern keinen Wärmezyklierer und sind daher für eine herkömmliche Instrumenten-Plattform leichter adaptierbar. Allerdings weisen die zuvor beschriebenen isothermen Ziel-Amplifikationsmethoden mehrere Nachteile auf. Die Amplifikation entsprechend den SDA-Methoden erfordert das Vorhandensein von Stellen für definierte Restriktionsenyzme, was ihre Anwendbarkeit einschränkt. Die auf Transkription basierenden Amplifikationsmethoden, wie etwa die NASBA und TMA, sind dagegen durch den erforderlichen Einbau der Polymerase-Promotorsequenz in das Amplifikationsprodukt durch einen Primer beschränkt, ein Prozess, der zur Folge einer nicht-spezifischen Amplifikation neigt. Darüber hinaus ist der Mechanismus der Amplifikation eines DNA-Ziels mittels dieser auf Transkription basierender Amplifikationsmethoden nicht wohlverstanden.
  • Ein weiterer Nachteil der derzeitigen Amplifikationsmethoden besteht in der potentiellen Verunreinigung der Testproben durch Amplifikationsprodukte vorheriger Amplifikations reaktionen, was zur Nicht-Ziel-spezifischen Amplifikation in Proben führt. Dieser Nachteil stellt ein wohlbekanntes Problem dar, das Folge des Leistungsvermögens der Ziel-Amplifikationstechnologie und der Erzeugung der Amplifikationsprodukte ist, die die Substrate für die Amplifikation stellen. Verschiedene Methoden zur Dekontamination der Testproben entweder am Ende der Amplifikationsreaktion oder vor Beginn der Zielamplifikation wurden beschrieben. Außerdem wurden auch Methoden zur Aufbewahrung der Testlösung mittels physikalischer Methoden beschrieben. Alle diese Lösungen sind mühsam und tragen zur Komplexität der Nukleinsäure-Testung im gewöhnlichen Laborumfeld bei.
  • Außerdem weisen die Amplifikationsmethoden, die den Wärmezyklierprozess anwenden, den zusätzlichen Nachteil langer Verzögerungszeiten auf, die erforderlich sind, bis der Wärmezyklierblock die "Ziel"-Temperatur für jeden Zyklus erreicht hat. Folglich erfordern die unter Anwendung von Wärmezyklierprozessen durchgeführten Amplifikationsreaktionen eine beträchtliche Menge an Zeit, um zum Abschluss zu kommen.
  • Daher besteht ein Bedarf nach verbesserten Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden, mit denen diese Nachteile überwunden werden. Mit der hierin vorgestellten Erfindung wird dieser Bedarf befriedigt und werden weitere Nutzen erzielt.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Mit der Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen für die Polynukleotid-Amplifikation, als auch Anwendungen der Amplifikationsmethoden bereitgestellt.
  • Demgemäß werden bei einem Aspekt der Erfindung Verfahren zum Amplifizieren einer Polynukleotidsequenz, die zu einer Ziel-Polynukleotidsequenz komplementär ist, bereitgestellt, welche umfassen:
    (a) Hybridisieren einer einzelsträngigen DNA-Template, welche die Zielsequenz umfasst, mit einem zusammengesetzten Primer, welcher zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst; (b) wahlweise Hybridisieren eines Polynukleotids, welches eine Terminations-Polynukleotidsequenz umfasst, an eine Region der Template, welche 5' bezüglich der Hybridisation des zusammengesetzten Primers an die Template lokalisiert ist; (c) Extendieren des zusammengesetzten Primers mit DNA-Polymerase; (d) Spalten des RNA-Abschnitts des vereinigten zusammengesetzten Primers mit einem Enzym, welches RNA von einem RNA/DNA-Hybrid spaltet, so dass ein anderer zusammengesetzter Primer an die Template hybridisieren und die Primer-Extension durch Strangverdrängung wiederholen kann, wobei vielfache Kopien der komplementären Sequenz zur Zielsequenz erzeugt werden.
  • Bei einem anderen Aspekt werden mit der Erfindung Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Polynukleotidsequenz bereitgestellt, welche umfassen: (a) Hybridisieren einer einzelsträngigen DNA-Template, die die Zielsequenz umfasst, mit einem zusammengesetzten Primer, welcher zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst; (b) Hybridisieren eines Polynukleotids, das eine Terminations-Polynukleotidsequenz umfasst, an eine Region der Template, welche 5' bezüglich der Hybridisation des zusammengesetzten Primers an die Template lokalisiert ist; (c) Extendieren des zusammengesetzten Primers mit DNA-Polymerase; (d) Spalten des RNA-Abschnitts des vereinigten zusammengesetzten Primers mit einem Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid spaltet, so dass ein anderer zusammengesetzter Primer an die Template hybridisieren und die Primer-Extension durch Strangverdrängung wiederholen kann, um verdrängte Primer-Extensionsprodukte zu erzeugen; (e) Hybridisieren eines Polynukleotids, das einen Propromotor und eine Region umfasst, welche an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt unter Bedingungen hybridisiert, die das Erfolgen der Transkription durch RNA-Polymerase ermöglichen, so dass RNA-Transkripte erzeugt werden, die zu den verdrängten Primer-Extensionsprodukten komplementäre Sequenzen umfassen, wobei vielfache Kopien der Zielsequenz erzeugt werden.
  • Hierin werden verschiedene Ausführungsformen des bei den Verfahren der Erfindung verwendeten zusammengesetzten Primers beschrieben. Zum Beispiel ist bei einigen Ausführungsformen der RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers 5' bezüglich des 3'-DNA-Abschnitts lokalisiert. Bei noch weiteren Ausführungsformen ist der 5'-RNA- Abschnitt benachbart zum 3'-DNA-Abschnitt lokalisiert. Bei den hierin beschriebenen Verfahren können ein oder mehrere zusammengesetzte Primer verwendet werden.
  • Außerdem werden hierin verschiedene Beispiele für Ausführungsformen der Polynukleotide beschrieben, die eine Terminationssequenz umfassen. Bei einigen Ausführungsformen ist das Polynukleotid, das eine Terminationssequenz umfasst, ein Template-Switch-Oligonukleotid (TSO), welches ein oder mehrere Modifikationen zur Förderung der Bindung an die Template enthalten kann (aber nicht muss). Demgemäß umfasst das TSO bei einigen Ausführungsformen eine Modifikation in der Region, die an die Template hybridisiert, wobei, unter einer gegebenen Reihe von Bedingungen, das TSO enger an die Region bindet im Vergleich zu einem TSO ohne die Modifikation. Beispiele geeigneter Modifikationen sind hierin angegeben. Bei einigen Ausführungsformen ist das Polynukleotid, das eine Terminationssequenz umfasst, eine Blockiersequenz, die, ähnlich dem TSO, ein oder mehrere Modifikationen zur Förderung der Bindung an die Template enthalten kann. Demgemäß umfasst die Blockiersequenz bei einigen Ausführungsformen eine Modifikation in der Region, die an die Template hybridisiert, wobei, unter einer gegebenen Reihe von Bedingungen, der Blocker enger an die Region bindet im Vergleich zu einem Blocker ohne die Modifikation. Beispiele geeigneter Modifikationen sind hierin angegeben.
  • Die Enzyme, die bei den Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können, sind hierin beschrieben. Zum Beispiel kann das Enzym, das RNA spaltet, eine RNaseH sein.
  • In einigen Aspekten bietet ein TSO eine Propromotor-Funktion und umfasst außerdem eine Region (die benachbart zum Promotor lokalisiert sein kann oder auch nicht), welche an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt hybridisiert. Bei anderen Ausführungsformen enthält das Polynukleotid, das den Propromotor umfasst, eine Region am 3'-Ende, die an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt hybridisiert, wobei die Extension mit DNA-Polymerase des verdrängten Extensionsprodukts einen doppelsträngigen Promotor erzeugt, von dem aus die Transkription erfolgt. Bei einigen Ausführungsformen ist das Polynukleotid, das den Propromotor umfasst, ein PTO.
  • Die Verfahren sind auf die Amplifikation jeglichen DNA-Ziels anwendbar, einschließlich zum Beispiel genomischer DNA und cDNA. Ein oder mehrere Schritte können kombiniert und/oder aufeinanderfolgend vorgenommen werden (oftmals in beliebiger Reihenfolge, solange das/die erforderliche/n Produkt(e) erzeugbar sind).
  • Die Erfindung umfasst auch Verfahren, die die Produkte der Amplifikationsmethoden der Erfindung verwenden (gewöhnlich analysieren), wie etwa die Sequenzierung und die Detektion von Sequenzveränderung(en).
  • Demgemäß werden bei einem Aspekt mit der Erfindung Verfahren zum Sequenzieren einer Ziel-Nukleotidsequenz bereitgestellt, welche umfassen: (a) Hybridisieren einer einzelsträngigen DNA-Template, die die Zielsequenz umfasst, mit einem zusammengesetzten Primer, welcher zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst; (b) wahlweise Hybridisieren eines Polynukleotids, das eine Terminations-Polynukleotidsequenz umfasst, an eine Region der Template, die 5' bezüglich der Hybridisation des zusammengesetzten Primers an die Template lokalisiert ist; (c) Extendieren des zusammengesetzten Primers mit DNA-Polymerase und einem Gemisch von dNTPs und dNTP-Analoga (die markiert oder unmarkiert sein können), so dass die Primer-Extension bei Einbau eines dNTP-Analogon, welches markiert oder unmarkiert sein kann, beendet wird; (d) Spalten des RNA-Abschnitts des vereinigten zusammengesetzten Primers mit einem Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid spaltet, so dass ein anderer zusammengesetzter Primer an die Template hybridisieren kann und die Primer-Extension durch Strangverdrängung wiederholen kann, wobei vielfache Kopien der komplementären Sequenz der Zielsequenz von variierenden Längen erzeugt werden; (e) Analysieren des Produkts aus Schritten (a) bis (d) zur Bestimmung der Sequenz.
  • Bei einem anderen Aspekt werden mit der Erfindung Verfahren zum Sequenzieren einer Ziel-Nukleotidsequenz bereitgestellt, welche umfassen: (a) Hybridisieren einer einzelsträngigen DNA-Template, die die Zielsequenz umfasst, mit einem zusammengesetzten Primer, welcher zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst; (b) Hybridisieren der Template mit einem Polynukleotid, welches eine Terminations-Polynukleotidsequenz umfasst, an eine Region der Template, die 5' bezüglich der Hybridisation des zusammengesetzten Primers an die Template lokalisiert ist; (c) Extendieren des zusammengesetzten Primers mit DNA-Polymerase; (d) Spalten des RNA-Abschnitts des vereinigten zusammengesetzten Primers mit einen Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid spaltet, so dass ein anderer zusammengesetzter Primer an die Template hybridisieren und die Primer-Extension durch Strangverdrängung wiederholen kann, um ein verdrängtes Primer-Extensionsprodukt zu erzeugen; (e) Hybridisieren eines Polynukleotids, das einen Propromotor am 5'-Ende und eine Region umfasst, die an das verdrängte Primer-Extensiosprodukt unter solchen Bedingungen hybridisiert, dass die Transkription vom Extensionsprodukt mittels RNA-Polymerase unter Verwendung eines Gemischs von rNTPs und rNTP-Analoga (die markiert oder unmarkiert sein können) erfolgt, so dass RNA-Transkripte erzeugt werden, die zu den verdrängten Primer-Extensionsprodukten komplementäre Sequenzen umfassen, und so dass die Transkription bei Einbau eines rNTP-Analogon, das markiert oder unmarkiert sein kann, beendet ist, wobei vielfache Kopien der Zielsequenz von variierenden Längen erzeugt werden; (f) Analysieren des Produkts aus Schritten (a) bis (e) zur Bestimmung der Sequenz.
  • Bei einigen Aspekten werden mit der Erfindung Verfahren zum Charakterisieren oder Analysieren der Sequenz eines Ziels bereitgestellt. Einige Aspekte basieren auf dem RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers, weshalb folglich die Ergebnisse die Information bezüglich der entsprechenden Region des Ziels wiederspiegeln, welche, sofern komplementär oder von ausreichender Komplementarität, an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers hybridisiert. Die Menge an Produkt im Vergleich zur Menge an Produkt aus der Durchführung derselben Amplifikationsreaktion an einer Referenz-Zielsequenz gibt das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Sequenz an, was wiederum das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Wildtyp-, mutanten oder allelen Varianten anzeigen kann. Verschiedene Ausführungsformen für die Sequenz-Detektion sind hierin beschrieben. So stellt die Erfindung beispielsweise Verfahren zum Nachweisen einer Mutation in einer Region einer Ziel-Polynukleotidsequenz bereit, welche das Durchführen einer hierin beschriebenen Amplifikationsmethode umfasst, wobei die Region der Ziel-Polynukleotidsequenz dem RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers entspricht und worin eine Mutation im Ziel-Polynukleotid zu nachweislich weniger Amplifikationsprodukten führt im Vergleich zu der Menge an Amplifikationsprodukten, die von einer Referenz-Template erzeugt werden, welche eine Region entsprechend dem RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers umfasst, die keine Mutation enthält. Bei diesen Ausführungsformen ist die Amplifikation durch Strangverdrängung herabgesetzt im Vergleich zur Produktion aus einer Referenz-Template, welche eine Region entsprechend dem RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers umfasst, die die Mutation nicht enthält (im Vergleich zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers).
  • Somit werden mit der Erfindung Verfahren zum Charakterisieren einer Sequenz von Interesse in einem Ziel-Polynukleotid bereitgestellt, welche Verfahren das Durchführen der Amplifikationsmethoden der Erfindung umfassen, wobei die Sequenz eines RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers bekannt ist und wobei (a) die Erzeugung nachweislich geringerer Mengen an Amplifikationsprodukten von der Template im Vergleich zur Menge an Amplifikationsprodukten von einer Referenz-Template, die eine Region komplementär zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers umfasst, anzeigt, dass das Ziel-Polynukleotid keine zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementäre Sequenz umfasst und eine Sequenz-Variante bezüglich der zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementären Sequenz darstellt; oder (b) die Erzeugung einer nachweislich größeren Menge an Amplifikationsprodukten von der Template im Vergleich zur Menge an Amplifikationsprodukten von einer Referenz-Template, die keine Region enthält, die zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementär ist, anzeigt, dass das Ziel-Polynukleotid eine zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementäre Sequenz umfasst und keine Sequenz-Variante bezüglich der zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementären Sequenz ist. Bei einer Ausführungsform umfasst die Sequenz eines RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers eine Wildtyp-Sequenz und wird die Sequenz von Interesse durch das Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der Wildtyp-Sequenz charakterisiert. Bei einer anderen Ausführungsform umfasst die Sequenz eines RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers eine mutante Sequenz und wird die Sequenz von Interesse durch Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der mutanten Sequenz charakterisiert. Bei noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Sequenz eines RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers eine allele Sequenz und wird die Sequenz von Interesse durch Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der allelen Sequenz charakterisiert.
  • Bei anderen Aspekten werden mit der Erfindung Verfahren zum Nachweisen einer Mutation (oder bei einigen Aspekten zum Charakterisieren einer Sequenz) in einem Ziel-Polynukleotid bereitgestellt, welche umfassen: (a) das Ausführen einer hierin beschriebenen Amplifikationsmethode; und (b) das Analysieren der amplifizierten Produkte der Methode auf die einzelsträngige Konformation, wobei eine Differenz in der Konformation im Vergleich zu einem einzelsträngigen Referenz-Polynukleotid eine Mutation im Ziel-Polynukleotid anzeigt. Bei anderen Ausführungsformen werden mit der Erfindung Verfahren zum Nachweisen einer Mutation (oder bei einigen Aspekten zum Charakterisieren einer Sequenz) in einem Ziel-Polynukleotid bereitgestellt, welche das Analysieren der amplifizierten Produkte eines der hierin beschriebenen Verfahren auf die einzelsträngige Konformation umfasst, wobei eine Differenz in der Konformation im Vergleich zu einem einzelsträngigen Polynukleotid eine Mutation im Ziel-Polynukleotid anzeigt (oder bei einigen Aspekten die Ziel-Sequenz charakterisiert).
  • Bei anderen Aspekten werden mit der Erfindung Verfahren zum Herstellen eines Mikroarrays bereitgestellt, welche umfassen: (a) das Ausführen einer hierin beschriebenen Amplifikationsmethode; und (b) das Anlagern der amplifizierten Produkte an einem festen Substrat zum Erhalt eines Mikroarrays der amplifizierten Produkte. Bei anderen Ausführungsformen werden Mikroarrays durch Anlagern der amplifizierten Produkte mittels einer der hierin beschriebenen Methoden auf einem festen Substrat erzeugt, um ein Mikroarray der amplifizierten Produkte zu erhalten.
  • Bei jeder dieser Anwendungen kann jegliche der Amplifikationsmethoden (einschließlich verschiedener Komponenten und verschiedener Ausführungsformen jeder der Komponenten) wie hierin beschrieben verwendet werden. Zum Beispiel kann der verwendete zusammengesetzte Primer einen 5'-RNA-Abschnitt aufweisen, der sich benachbart an den 3'-DNA-Abschnitt befindet.
  • Mit der Erfindung werden außerdem Zusammensetzungen, Reagenzsätze, Komplexe, Reaktionsgemische und -systeme bereitgestellt, die verschiedene Komponenten (und verschiedene Kombinationen der Komponenten) umfassen, wie sie bei den hierin beschriebenen Amplifikationsmethoden verwendet werden. Bei einem Aspekt beispielsweise werden mit der vorliegenden Erfindung Zusammensetzungen bereitgestellt, die einen zusammengesetzten Primer umfassen, welcher zusammengesetzte Primer einen 3'-DNA-Abschnitt und einen 5'-RNA-Abschnitt umfasst. Bei einigen Ausführungsformen befindet sich der 5'-RNA-Abschnitt benachbart zum 3'-DNA-Abschnitt. Bei noch weiteren Ausführungsformen beträgt der 5'-RNA-Abschnitt etwa 5 bis etwa 20 Nukleotide und der 3'-DNA-Abschnitt etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide. Die Zusammensetzungen umfassen außerdem eine Terminations-Polynukleotidsequenz, insbesondere zum Beispiel ein TSO, wobei das TSO eine Modifikation in der Region umfasst, die an die Template hybridisiert, wobei das TSO unter einer gegebenen Reihe von Bedingungen enger an die Region im Vergleich zu einem TSO ohne die Modifikation bindet. Bei einigen Ausführungsformen umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung jeglichen hierin beschriebenen zusammengesetzten Primer und ein TSO. Es werden außerdem Zusammensetzungen beschrieben, die einen der hierin beschriebenen zusammengesetzten Primer und eine der hierin beschriebenen Blockiersequenzen umfassen, einschließlich solcher mit Modifikationen, die die Bindung an die Template fördern. Bei anderen Ausführungsformen werden mit der Erfindung Zusammensetzungen bereitgestellt, die einen der hierin beschriebenen zusammengesetzten Primer und ein PTO umfassen.
  • Es werden außerdem Zusammensetzungen beschrieben, die einen der Komplexe (die generell als Intermediate bezüglich der Amplifikations-Endprodukte betrachtet werden) umfassen, wie hierin beschrieben (siehe auch die Figuren für eine schematische Darstellung dieser verschiedenen Komplexe). Zum Beispiel werden Zusammensetzungen beschrieben, die einen Komplex aus (a) einem Template-Strang; und (b) einem zusammengesetzten Primer umfassen, welcher zusammengesetzte Primer einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt umfasst. Der RNA-Abschnitt kann 5' oder auch angrenzend an den DNA-Abschnitt lokalisiert sein. Bei einigen Ausführungsformen umfasst der Komplex weiterhin ein Polynukleotid, welches eine Terminationssequenz umfasst (die zum Beispiel ein TSO oder eine Blockiersequenz sein kann). Bei einigen Ausführungsformen umfasst der Komplex außerdem ein PTO.
  • Bei einem anderen Aspekt werden mit der Erfindung Reaktionsgemische (oder Zusammensetzungen, die Reaktionsgemische umfassen) bereitgestellt, die verschiedene Kombinationen der hierin beschriebenen Komponenten enthalten. Zum Beispiel werden mit der Erfindung Reaktionsgemische bereitgestellt, die umfassen: (a) eine Polynukleotid-Template; (b) einen zusammengesetzten Primer, der einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt umfasst; und (c) DNA-Polymerase und (d) eine Terminations-Polynukleotidsequenz, die ein TSO umfasst. Wie hierin beschrieben, kann jeder der zusammengesetzten Primer (oder eine Vielzahl der zusammengesetzten Primer) im Reaktionsgemisch enthalten sein, einschließlich eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt umfasst, der an den 3'-DNA-Abschnitt angrenzt. Das Reaktionsgemisch könnte außerdem ein Enzym umfassen, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid spaltet, wie etwa RNaseH. Ein Reaktionsgemisch der Erfindung kann außerdem eines der Polynukleotide umfassen, die die hierin beschriebenen Terminationssequenzen umfassen, als auch ein Polynukleotid, das einen Propromotor und eine Region umfasst, die an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt hybridisiert, und eine RNA-Polymerase. Ein Reaktionsgemisch der Erfindung kann auch ein PTO umfassen.
  • Bei einem anderen Aspekt werden mit der Erfindung Reagenzsätze zum Durchführen der hierin beschriebenen Methoden bereitgestellt. Diese Reagenzsätze enthalten in geeigneter Verpackung, die allgemein (doch nicht erforderlicherweise) mit geeigneten Anleitungen versehen ist, ein oder mehrere der bei den Amplifikationsmethoden verwendeten Komponenten. Zum Beispiel werden mit der Erfindung Reagenzsätze bereitgestellt, die einen zusammengesetzten Primer umfassen, welcher einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt (welcher 5' und außerdem angrenzend an den 3'-DNA-Abschnitt lokalisiert sein kann) und ein Polynukleotid enthält, das eine Terminations-Polynukleotidsequenz einschließlich eines TSO umfasst. Der zusammengesetzte Primer in den Reagenzsätzen kann ein beliebiger der hierin beschriebenen sein. Die Reagenzsätze können weiterhin Komponenten enthalten, wie eines von (a) einem Polynukleotid, das einen Propromotor umfasst; (b) eines der hierin beschriebenen Enzyme, wie etwa ein Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid spaltet (z.B. RHaseH); und (c) ein Polynukleotid, das einen Propromotor und eine Region umfasst, die an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt hybridisiert.
  • Es werden außerdem Systeme zur Ausführung der hierin beschriebenen Amplifikationsmethoden beschrieben. Zum Beispiel kann bei der Erfindung ein System zum Amplifizieren einer Ziel-Polynukleotidsequenz oder ihres Komplements verwendet werden, welches umfasst: (a) einen zusammengesetzten Primer, welcher einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt umfasst; (b) DNA-Polymerase; und (c) ein Enzym, welches RNA von einem RNA/DNA-Hybrid spaltet (wie etwa RNaseH). Der zusammengesetzte Primer kann ein beliebiger (einer oder mehrere) der hierin beschriebenen sein, einschließlich eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt angrenzend an den 3'-DNA-Abschnitt umfasst.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A–1C zeigt eine diagrammatische Darstellung eines isothermen linearen Amplifikationsprozesses mit einem einzelnen zusammengesetzten Primer.
  • 2A–2C zeigt eine diagrammatische Darstellung eines verstärkten isothermen linearen Nukleinsäure-Amplifikationsprozesses mit einem einzelnen Primer unter Einbeziehung der Transkription und unter Verwendung einer Template-Switch-Oligonukleotidsequenz.
  • 3A–3D zeigt eine diagrammatische Darstellung eines verstärkten isothermen linearen Nukleinsäure-Amplifikationsprozesses mit einem einzelnen zusammengesetzten Primer unter Einbeziehung der Transkription und unter Verwendung einer Blockiersequenz-Komponente.
  • 4 zeigt eine diagrammatische Darstellung des Nachweises einer Mutation in einer Template-Sequenz unter Anwendung des isothermen linearen Amplifikationsprozesses mit einem einzelnen Primer. "X" kennzeichnet eine Mutation an der Ziel-DNA an einer zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementären Stelle. Wie gezeigt, ist die Amplifikation der Ziel-Nukleinsäure blockiert, wenn eine Mutation vorhanden ist.
  • 5 zeigt ein mit Ethidiumbromid angefärbtes PAGE-Gel der isothermen linearen Amplifikationsprodukte eines synthetischen DNA-Ziels.
  • 6 zeigt ein Autoradiogramm der PAGE-Analyse der Hybridisation von DNA-Amplifikationsprodukten an eine spezifische Sonde.
  • 7 zeigt ein mit Ethidiumbromid angefärbtes PAGE-Gel, bei dem die Effizienz der aus der Überlappungs-Extension erzeugten ssRNA-Transkriptionsprodukte verglichen wird.
  • 8 zeigt einen mit Ethidiumbromid angefärbten PAGE-Gelvergleich der isothermen linearen Amplifikation mit und ohne einem 3'-blockierten PTO.
  • 9 zeigt ein Autoradiogramm einer an Amplifikationsprodukte hybridisierten Sonde, die durch isotherme lineare Amplifikation einer J-Gensequenz von genomischer E. coli-DNA erzeugt wurden.
  • 10 zeigt ein mit Ethidiumbromid angefärbtes PAGE-Gel der RNA-Produkte der isothermen linearen Amplifikation, wie unter Verwendung dreier verschiedener Konstruktionen des zusammengesetzten Primers erzeugt.
  • AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Mit der Erfindung werden Verfahren, Zusammensetzungen und Reagenzsätze zum Amplifizieren von Polynukleotidsequenzen bereitgestellt. Die Verfahren umfassen generell die Verwendung eines zusammengesetzten RNA/DNA-Primers, wahlweise einer Terminationssequenz und, bei Ausführungsformen, bei denen die Transkription angewendet wird, eine Propromotor-Oligonukleotidsequenz.
  • In einer allgemeinen Zusammenfassung arbeiten die Amplifikationsverfahren wie folgt:
    Ein zusammengesetzter RNA/DNA-Primer bildet die Grundlage für die Replikation der Zielsequenz. Bei einigen Ausführungsformen stellt eine Terminationssequenz die Grundlage für einen Endpunkt der Replikation entweder durch Ablenken oder Blockieren einer weiteren Replikation entlang des Zielstranges dar. Wie nachstehend beschrieben, ist bei einigen Ausführungsformen das Polynukleotid, das eine Terminationssequenz umfasst, ein Template-Switch-Oligonukleotid (TSO), das Sequenzen enthält, die nicht von ausreichender Komplementarität zum Hybridisieren an den Template-Strang sind (über Sequenzen hinaus, die von ausreichender Komplementarität zum Hybridisieren sind); bei anderen Ausführungsformen umfasst die Terminationssequenz in erster Linie Sequenzen, die von ausreichender Komplementarität zum Hybridisieren an den Template-Strang sind. DNA-Polymerase bewirkt das Kopieren der Zielsequenz vom Primer. Ein Enzym, das RNA von einem RNA/DNA- Hybrid spaltet (wie etwa RNaseH), spaltet (entfernt) die RNA-Sequenz vom Hybrid, was die Sequenz am Template-Strang zum Binden durch einen anderen zusammengesetzten Primer verfügbar zurücklässt. Ein weiterer Strang wird durch DNA-Polymerase erzeugt, welcher den zuvor replizierten Strang verdrängt, was zu einem verdrängten Extensionsprodukt führt. Wahlweise bindet ein Polynukleotid, das einen Propromotor und eine Region umfasst, die an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt hybridisiert (die zum Beispiel ein Template-Switch-Oligonukleotid oder Propromotor-Template-Oligonukleotid sein kann), die Sequenzen von ausreichender Komplementarität zum Hybridisieren an das 3'-Ende des verdrängten Extensionsprodukts enthält, an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt. Der Promotor steuert die Transkription (über DNA-abhängige RNA-Polymerase) zum Erhalt von Sense-RNA-Produkten.
  • Demgemäß werden mit der Erfindung Verfahren zum Erzeugen mindestens einer Kopie einer Ziel-Polynukleotidsequenz (generell Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Polynukleotidsequenz) bereitgestellt, welche das Kombinieren und Umsetzen des folgenden umfassen: (a) ein einzelsträngiges Ziel-Polynukleotid, das eine Zielsequenz umfasst; (b) einen zusammengesetzten Primer, der einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst; (c) eine DNA-Polymerase; (d) Desoxyribonukleosidtriphosphate oder geeignete Analoga; (e) ein Enzym wie etwa RNaseH, welches RNA von einem RNA/DNA-Duplex spaltet; und (f) generell, doch optional, ein Polynukleotid, das eine Terminationssequenz umfasst, z.B. eines der hierin beschriebenen, welches einen Abschnitt (oder eine Region) umfasst, die an das Template-Polynukleotid hybridisiert. Eine Terminationssequenz wird verwendet, wenn die auf Transkription basierende Amplifikation (siehe unten) ebenfalls angewendet wird. Die Kombination wird geeigneten Bedingungen unterworfen, so dass (a) der zusammengesetzte Primer (und wahlweise ein Polynukleotid, das eine Terminationssequenz umfasst) an die Template hybridisiert; (b) die Primer-Extension vom zusammengesetzten Primer zum Erhalt eines Duplex erfolgt; (c) RNaseH die RNA des zusammengesetzten Primers vom RNA/DNA-Duplex spaltet; (d) ein weiterer zusammengesetzter Primer an die Template hybridisiert und eine weitere Runde der Primer-Extension (vermittelt durch DNA-Polymerase) erfolgt, wobei der bereits kopierte Strang von der Template verdrängt wird.
  • Wahlweise ist auch folgendes in der Amplifikationsreaktion (entweder gleichzeitig mit den oben aufgelisteten Komponenten oder separat zugegeben) enthalten: (e) ein Polynukleotid, das eine Propromotor-Sequenz (die in einer beliebigen aus einer Reihe von Formen vorliegen kann, wie hierin beschrieben) und eine Region umfasst, die an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt hybridisiert; (f) Ribonukleosidtriphosphate oder geeignete Analoga; und (g) RNA-Polymerase, unter derartigen Bedingungen, dass die Transkription des verdrängten Stranges erfolgen kann. Einzelheiten bezüglich der verschiedenen Komponenten der Verfahren der vorliegenden Erfindung sind nachstehend angegeben.
  • Bei einigen Ausführungsformen werden mit der Erfindung Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) bereitgestellt. Für die Sequenziermethoden werden geeignete dNTPs (oder, wenn Ausführungsformen, die auf der auf Transkription basierenden Amplifikation beruhen, angewendet werden, geeignete rNTPs), die markiert oder unmarkiert sein können, verwendet. Demgemäß werden mit der Erfindung Verfahren zum Sequenzieren einer Ziel-Nukleotidsequenz bereitgestellt, welche die oben beschriebenen Verfahren umfassen, worin dNTPs und dNTP-Analoga, welche Primerelongations-Terminatoren sind, die markiert oder unmarkiert sein können, und/oder rNTPs und rNTP-Analoga, welche Primerelongations-Terminatoren sind, die markiert oder unmarkiert sein können, verwendet werden und das Amplifikationsprodukt für die Sequenzinformation analysiert wird, wie nachstehend beschrieben.
  • Bei anderen Ausführungsformen werden mit der Erfindung Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäuresequenz-Mutationen und/oder zum Charakterisieren der Zielsequenz(en) bereitgestellt. Bei einer Ausführungsform wird das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Mutation in einem Ziel-Polynukleotid ausgehend von der Amplifizierbarkeit des Ziel-Polynukleotids unter Verwendung eines zusammengesetzten Primers, dessen RNA-Abschnitt entweder die mutierte Sequenz enthält oder dem sie fehlt, unter Verwendung der Verfahren der Erfindung nachgewiesen. Bei einer anderen Ausführungsform werden die amplifizierten Produkte zum Nachweisen von Mutationen durch Hybridisieren mit spezifischen Sonden verwendet. Bei noch einer anderen Ausführungsform werden die amplifizierten Produkte zum Nachweisen und/oder Identifizieren von Einzelstrang-Konformations-Polymorphismen in einem Ziel-Polynukleotid verwendet.
  • Bei noch darüber hinausgehenden Ausführungsformen werden mit der Erfindung Verfahren zum Erzeugen von Mikroarrays von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) unter Verwendung der amplifizierten Produkte der linearen oder verstärkten linearen Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
  • Weitere Verfahren, bei denen die hierin beschriebenen Amplifikationsprodukte Verwendung finden, werden im folgenden vorgestellt.
  • Vorteile der Amplifikationsmethoden der Erfindung
  • Die Amplifikationsmethoden der Erfindung bieten mehrere wesentliche Vorteile gegenüber anderen Verfahren der Nukleinsäure-Amplifikation. Die Bildung der geprimten Template, die Primer-Extension und die Verdrängung des zuvor erzeugten Extensionsprodukts hängt von der Spaltung des RNA-Abschnitts des hybridisierten Primers durch eine Ribonuklease-Aktivität ab. Daher fehlt dem Primer-Extensionsprodukt der am 5'-gelegenste Abschnitt des Primers. Folglich enthält das aus dem Komplex des Extensionsprodukts und des Template-Switch-Oligonukleotids, oder des Promotor-Template-Oligonukleotids, erzeugte RNA-Transkriptionsprodukt an seinem 3'-Ende nicht die zu diesem Abschnitt des Primers komplementäre Sequenz. Daher sind die Amplifikationsprodukte nicht zum Hybridisieren an den Primer für eine produktive Amplifikation in der Lage, was die Amplifikationsverfahren der Erfindung resistent gegenüber einer nicht-spezifischen Amplifikation aufgrund einer Kontamination mit durch vorangegangene Amplifikationsreaktionen erzeugten Produkten macht. Dieses Merkmal unterscheidet es eindeutig von anderen bekannten Zielamplifikations-Verfahren wie der PCR, NASBA und ähnlichen, und macht die Verfahren der Erfindung für die üblicherweise in klinischen Labors, Testlabors mit hohem Durchsatz und ähnlichem verwendeten Plattformen mit offenen Reagenzröhrchen geeignet.
  • Die einzigartige Anforderung des Spaltens des RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers in der hybridisierten und extendierten Form mittels einer Ribonuklease wie RNaseH zum weiteren Vorantreiben der Amplifikation der Ziel-Nukleinsäuresequenz führt zur ausschließlichen Amplifikation des DNA-Ziels. Daher ist eine Anwendung der Verfahren der Erfindung zur Amplifikation genomischer DNA-Ziele in Gegenwart von überschüssiger mRNA möglich. Dieses Merkmal ist zur exakten Quantifizierung der Gendosis nützlich. Ist die Test-Zielnukleinsäuresequenz RNA, so wird das Ziel zunächst zum Erhalt von cDNA, die unter Anwendung der Verfahren der Erfindung amplifizierbar ist, transkribiert.
  • Die Verfahren der Erfindung ermöglichen außerdem die Amplifikation von Ziel-Nukleinsäuren bei hoher Genauigkeit bezüglich der Template. Jedes Amplifikationsprodukt stellt eine direkte Kopie der Zielsequenz in der Input-Template-DNA (bei den linearen Amplifikationsverfahren) oder der Input-Template-DNA und den Primer-Extensionsprodukten der Input-Template-DNA (bei den verstärkten linearen Amplifikationsverfahren) dar.
  • Die Verfahren der Erfindung erfordern keine Wärmezyklierung, da die Amplifikation isotherm vorgenommen werden kann. Dieses Merkmal bietet zahlreiche Vorteile, einschließlich einer erleichterten Automatisierung und Anpassung für eine Amplifikation mit hohem Durchsatz und/oder Analyse der Nukleinsäuren. Zum Beispiel werden auf den Amplifikationsverfahren der Erfindung basierende Sequenziermethoden durch die isotherme Durchführbarkeit der Reaktionen vereinfacht. Weitere Verfahren, von denen berichtet wurde, erfordern eine Wärmezyklierung zur Abtrennung der Primer-Extensionsprodukte von der Zielsequenz. Die isotherme Reaktion ist schneller als die durch Wärmezyklierung erreichte Reaktion und eignet sich zur Durchführung der Sequenzierung einer Zielnukleinsäure in miniaturisierten Vorrichtungen.
  • Ein weiterer Vorteil der Verfahren der Erfindung ist der, dass lediglich ein einzelner Primer erforderlich ist. Ein einzelner Primer wird zur Erzielung einer Primer-Extension in eine Richtung, die zur Amplifikation der Template-Nukleinsäure führt, ausgenützt. Dies mildert die zahlreichen Nachteile in Verbindung mit der Verwendung von Primer-Paaren, zum Beispiel die Kosten zur Konstruktion und Herstellung zweier Sätze von Primern, das Erfordernis einer vorherigen Kenntnis einer zusätzlichen Sequenzregion innerhalb der Template-Nukleinsäure und die erhöhte Wahrscheinlichkeit, dass amplifizierte Produkte das Ergebnis eines nicht-spezifischen Priming sind.
  • Die isothermen linearen Amplifikationsverfahren der Erfindung eignen sich auch zur Anwendung für den Nachweis von Nukleinsäure-Zielen, der Quantifizierung definierter Nukleinsäuresequenzen und der Herstellung von Sonden für definierte Nukleinsäuresequenzen. Die Verfahren der Erfindung sind für den qualitativen Nachweis einer Nukleinsäuresequenz, die quantitative Bestimmung der Menge der Ziel-Nukleinsäuresequenz, den Nachweis des Vorhandenseins definierter Sequenzveränderungen, wie für die Genotypisierung erforderlich, und die Sequenzierung nützlich. Die Produkte der Amplifikation gemäß den Verfahren der Erfindung sind einzelsträngig und mittels verschiedener bekannter Nukleinsäure-Nachweismethoden ohne weiteres nachweisbar.
  • Die Verfahren der Erfindung sind außerdem für die Multiplex-Analyse von Nukleinsäuresequenzen nützlich. Das heißt, dass verschiedene Zielsequenzen in einem einzigen Reaktionsgemisch gleichzeitig amplifiziert werden können. Die verschiedenen Zielsequenzen können Teil einer einzelnen genomischen DNA sein oder können spezifische Sequenzen verschiedener Nukleinsäure-Ziele darstellen, die in einer einzelnen Testprobe vorhanden sein können. So sind die Verfahren der Erfindung beispielsweise für den Nachweis des Vorhandenseins verschiedener Pathogene in einer einzelnen biologischen Probe nützlich. Entsprechend kann in ein und derselben Reaktion gleichzeitig die Bestimmung verschiedener polymorpher Stellen in einer einzelnen genomischen DNA-Probe vorgenommen werden.
  • Es versteht sich von selbst, dass als generell "umfasste" Komponenten oder Aspekte bezüglich aller hierin beschriebenen Ausführungsformen die Erfindung außerdem Ausführungsformen einbezieht, die aus diesen Komponenten oder Aspekten "im wesentlichen bestehen". Die Erfindung umfasst außerdem Ausführungsformen, die aus diesen Komponenten oder Aspekten "bestehen". Dies trifft auf alle hierin beschriebenen Ausführungsformen zu.
  • Allgemeine Techniken
  • Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung werden, sofern nicht anders angegeben, die herkömmlichen Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), Mikrobiologie, Zellbiologie, Biochemie und Immunologie, die innerhalb der Sachkenntnisse des Gebiets liegen, angewandt. Diese Techniken sind in der Literatur umfassend erläutert, wie z.B. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, Hg., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, Hg., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., Hg., 1987, und überarbeitete Auflagen); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., Hg., 1994).
  • Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Primer, Oligonukleotide und Polynukleotide können unter Anwendung im Fachgebiet bekannter standardmäßiger Techniken erzeugt werden.
  • Definitionen
  • Bei einer "Zielsequenz", wie hierin verwendet, handelt es sich um eine Polynukleotidsequenz von Interesse, deren Amplifikation erwünscht ist. Die Zielsequenz kann bezüglich ihrer tatsächlichen Sequenz bekannt oder unbekannt sein. Generell handelt es sich bei einer "Template", wie hierin verwendet, um ein Polynukleotid, das die Ziel-Nukleotidsequenz enthält. In einigen Fällen werden die Begriffe "Zielsequenz", "Template-DNA", "Template-Polynukleotid", "Ziel-Nukleinsäure", "Ziel-Polynukleotid" und Varianten davon austauschbar verwendet.
  • "Amplifikation", wie hierin verwendet, bezieht sich generell auf ein Verfahren zur Herstellung vielfacher Kopien einer gewünschten Sequenz. "Vielfache Kopien" meint mindestens 2 Kopien. Ein "Kopie" meint nicht unbedingt eine perfekte Sequenz-Komplementarität oder -Identität zur Templatesequenz. Zum Beispiel können Kopien Nukleotid-Analoga wie Desoxyinosin, absichtliche Sequenzveränderungen (wie etwa durch einen Primer eingeführte Sequenzveränderungen, der eine Sequenz umfasst, die an die Template hybridisierbar, jedoch nicht zu ihr komplementär ist) und/oder Sequenzfehler, die während der Amplifikation auftreten, umfassen.
  • "Polynukleotid" oder "Nukleinsäure", wie hierin austauschbar verwendet, bezieht sich auf Polymere von Nukleotiden einer beliebigen Länge und umfasst DNA und RNA. Die Nukleotide können Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide, modifizierte Nukleotide oder Basen und/oder deren Analoga oder jegliches Substrat sein, das in ein Polymer durch DNA- oder RNA-Polymerase eingebaut werden kann. Ein Polynukleotid kann modifizierte Nukleotide umfassen, wie etwa methylierte Nukleotide und deren Analoga. Sofern vorhanden, kann eine Modifikation der Nukleotidstruktur vor oder nach Zusammenbau des Polymers vorgenommen werden. Die Sequenz der Nukleotide kann durch nicht-nukleotidische Komponenten unterbrochen sein. Ein Polynukleotid kann ferner nach der Polymerisation modifiziert werden, zum Beispiel durch Konjugation mit einer markierten Komponente. Zu weiteren Arten von Modifikationen zählen z.B. "Kappen", die Substitution eines oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, Internukleotid-Modifikationen, wie z.B. solche mit ungeladenen Bindungen (z.B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Cabamate etc.) und mit geladenen Bindungen (z.B. Phosphorthioate, Phosphordithioate etc.), solche, die anhängende Komponenten enthalten, wie zum Beispiel Proteine (z.B. Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, ply-L-Lysin etc.), solche mit Interkalatoren (z.B. Acridin, Psoralen etc.), solche, die Chelatbildner enthalten (z.B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle etc.), solche, die Alkylatoren enthalten, solche mit modifizierten Verknüpfungen (z.B. Alpha-anomere Nukleinsäuren etc.), als auch unmodifizierte Formen des/r Polynukleotids/e. Ferner kann jegliche der gewöhnlich in Zuckern vorhandenen Hydroxylgruppen ersetzt werden, zum Beispiel durch Phosphonatgruppen, Phosphatgruppen, mittels standardmäßiger Schutzgruppen geschützt oder zum Erhalt zusätzlicher Verknüpfungen mit weiteren Nukleotiden aktiviert oder an feste Träger konjugiert werden. Das 5'- und 3'-terminale OH kann phosphoryliert oder mit Aminen oder organischen Schutzgruppen-Komponenten von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen substituiert werden. Andere Hydroxyle können ebenfalls zu standardmäßigen Schutzgruppen derivatisiert werden. Polynukleotide können außerdem analoge Formen der Ribose- oder Desoxyribose-Zucker enthalten, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, einschließlich zum Beispiel 2'-O-Methyl-, 2'-O-Allyl-, 2'-Fluoro- oder 2'-Azidoribose, carbocyclische Zucker-Analoga, α-anomere Zucker, epimere Zucker wie Arabinose, Xylosen oder Lyxosen, Pyranose-Zucker, Furanose-Zucker, Sedoheptulosen, acyclische Analoga und abasische Nukleosid-Analoga wie Methylribosid. Eine oder mehrere Phosphodiester-Verknüpfungen können durch alternative Verknüpfungsgruppen ersetzt werden. Zu diesen alternativen Verknüpfungsgruppen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Ausführungsformen, bei denen Phosphat durch P(O)S ("Thioat"), P(S)S ("Dithioat"), (O)NR2 ("Amidst"), P(O)R, P(O)OR', CO oder CH2 ("Formacetal") ersetzt ist, worin jedes R oder R' unabhängig H oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (1–20 C) ist, das wahlweise eine Ether-(-O-)-Bindung, Aryl, Alkenyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl oder Araldyl enthält. Nicht alle Verknüpfungen in einem Polynukleotid brauchen identisch zu sein. Die vorangegangene Beschreibung gilt für alle hierin genannten Polynukleotide, einschließlich RNA und DNA.
  • "Oligonukleotid", wie hierin verwendet, bezieht sich generell auf kurze, generell einzelsträngige, generell synthetische Polynukleotide, die allgemein, doch nicht erforderlicherweise, weniger als etwa 200 Nukleotide lang sind. Zu den Oligonukleotiden der vorliegenden Erfindung der zählen der zusammengesetzte Primer, TSO, PTO und die Blockiersequenz. Die Begriffe "Oligonukleotid" und "Polynukleotid" schließen sich nicht gegenseitig aus. Die obige Beschreibung für Polynukleotide ist gleichermaßen und völlig auf Oligonukleotide anwendbar.
  • Bei einem "Primer" handelt es sich generell um ein kurzes einzelsträngiges Polynukleotid, generell mit einer freien 3'-OH-Gruppe, das an ein potentiell in einer Probe von Interesse vorhandenes Ziel durch Hybridisieren mit einer Zielsequenz bindet und daraufhin die Polymerisation eines zum Ziel komplementären Polynukleotids fördert.
  • Bei einer "Terminations-Polynukleotidsequenz" oder "Terminationssequenz", wie hierin austauschbar verwendet, handelt es sich um eine Polynukleotidsequenz, die die Beendigung der DNA-Replikation durch DNA-Polymerase bezüglich der Template, die die Zielsequenz umfasst, bewirkt. Eine Terminationssequenz umfasst einen Abschnitt (oder eine Region), die generell an die Template an einer Lokalisation 5' zum Terminationspunkt (Stelle) hybridisiert. Der hybridisierbare Abschnitt kann die gesamte Terminationssequenz umfassen oder auch nicht. Beispiele geeigneter Terminations-Polynukleotidsequenzen (wie etwa Blockiersequenzen und TSO) sind hierin angegeben.
  • "Blockersequenz" oder "Blockiersequenz", wie hierin austauschbar verwendet, stellt ein Beispiel einer Terminationssequenz dar und bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das, generell bei hoher Affinität, an die Template-Nukleinsäure an einer Lokalisation 5' zur Terminationsstelle bindet und die Beendigung der DNA-Replikation durch DNA-Polymerase bezüglich der die Zielsequenz enthaltenden Template bewirkt. Ihr 3'-Ende kann für die Extension durch DNA-Polymerase blockiert sein oder auch nicht.
  • "Terminationsstelle" oder "Terminationspunkt", wie hierin austauschbar verwendet, bezieht sich auf die Stelle, den Punkt oder die Region der Template, die durch die DNA-Polymerase vor Beendigung der Polymerisation (generell Primer-Extension) oder dem Template-Switch zuletzt repliziert wird. Zum Beispiel ist dies bezüglich eines TSO die Position oder Region in der Zielsequenz, die zum 3'-Ende des Primer-Extensionsprodukts vor dem Switchen der Template vom Template-Polynukleotid zum unhybridisierten Abschnitt des TSO komplementär ist.
  • "Protopromotor-Sequenz" und "Propromotor-Sequenz", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine einzelsträngige Region einer DNA-Sequenz, die in doppelsträngiger Form zum Vermitteln der RNA-Transkription fähig ist. In einigen Zusammenhängen werden "Protopromotor-Sequenz", "Protopromotor", "Propromotor-Sequenz", "Propromotor" "Promotorsequenz" und "Promotor" austauschbar verwendet.
  • "Template-Switch-Oligonukleotid (TSO)", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das einen Abschnitt (oder eine Region) umfasst, die an eine Template an einer Lokalisation 5' zur Terminationsstelle der Primer-Extension hybridisierbar ist und die zur Bewirkung eines Template-Switch während des Prozesses der Primer-Extension durch eine DNA-Polymerase fähig ist. TSOs sind im Fachgebiet allgemein bekannt. "Template-Switch" bezieht sich auf einen Wechsel der Template-Nukleinsäure, generell von der Ziel-Nukleinsäure zum unhybridisierten Abschnitt eines TSO, während des Verlaufs einer einzelnen Runde der Primer-Extension.
  • "Propromotor-Template-Oligonukleotid (PTO)", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das eine Propromotor-Sequenz und einen Abschnitt, generell am 3'-Abschnitt, umfasst, der an die 3'-Region eines Primer-Extensionsprodukts hybridisierbar ist. Die Propromotor-Sequenz und der hybridisierbare Abschnitt können gleiche, unterschiedliche oder überlappende Nukleotide eines Oligonukleotids sein.
  • Eine erste Sequenz, die einer zweiten Sequenz "entspricht", wie etwa einem RNA-Abschnitt eines zusammengesetzten Primers, bedeutet, dass die erste Sequenz beträchtliche Sequenzidentität bezüglich der zweiten Sequenz aufweist. Dieser Begriff wird allgemein im Zusammenhang mit dem Nachweis von Mutationen oder der Charakterisierung von Sequenzen eines Ziels verwendet.
  • Eine "Hemmung" bedeutet eine Herabsetzung oder Verminderung einer Aktivität, Funktion und/oder Menge im Vergleich zu einer Referenz.
  • Bei einem "Komplex" handelt es sich um eine Vereinigung von Komponenten. Ein Komplex kann stabil sein oder auch nicht und kann direkt oder indirekt nachweisbar sein. Wie hierin beschrieben, kann zum Beispiel anhand bestimmter Komponenten einer Reaktion und dem Typ des/r Produkts/e der Reaktion das Vorhandensein eines Komplexes gefolgert werden. Für die Zwecke dieser Erfindung handelt es sich bei einem Komplex generell um ein Zwischenprodukt bezüglich des/r endgültigen Amplifikationsprodukts/e.
  • Ein "Abschnitt" oder eine "Region", wie hierin austauschbar verwendet, eines Polynukleotids oder Oligonukleotids ist gegeben durch eine aufeinanderfolgende Sequenz von 2 oder mehr Basen. Bei anderen Ausführungsformen besteht eine Region oder ein Abschnitt aus mindestens etwa 3, 5, 10, 15, 20, 25 aufeinanderfolgenden Nukleotiden.
  • Eine Region, Abschnitt oder Sequenz, die an eine andere Sequenz "angrenzt", folgt dieser Region, Abschnitt oder Sequenz direkt. Zum Beispiel grenzt ein RNA-Abschnitt, der benachbart zu einem 5'-DNA-Abschnitt eines zusammengesetzten Primers liegt, direkt an diese Region an. Eine Veranschaulichung dieses Beispiels ist in 1A–1C zu finden.
  • Bei einem "Reaktionsgemisch" handelt es sich um eine Zusammenstellung von Komponenten, die unter geeigneten Bedingungen zum Erhalt eines Komplexes (der ein Intermediat sein kann) und/oder eines oder mehrerer Produkte reagiert.
  • "Ein", "eine" und "der/die/das" und ähnliches bezieht, sofern nicht anders angegeben, auch die Pluralformen ein.
  • "Umfassend" bedeutet beinhaltend.
  • Bedingungen, die das Stattfinden eines Ereignisses "zulassen", oder Bedingungen, die zum Stattfinden eines Ereignisses "geeignet" sind, wie z.B. die Hybridisation, Strangverlängerung und ähnliches, oder "geeignete" Bedingungen sind Bedingungen, die das Stattfinden derartiger Ereignisse nicht verhindern. Daher erlauben, fördern, erleichtern diese Bedingungen das Ereignis und/oder sind für das Ereignis zweckdienlich. Diese im Fachgebiet bekannten und hierin beschriebenen Bedingungen hängen zum Beispiel von der Natur der Nukleotidsequenz, der Temperatur und den Pufferbedingungen ab. Diese Bedingungen hängen auch davon ab, welches Ereignis erwünscht ist, wie z.B. die Hybridisation, Spaltung, Strangverlängerung oder Transkription.
  • Sequenz-"Mutation", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliche Sequenzveränderung in einer interessierenden Sequenz im Vergleich zu einer Referenzsequenz. Eine Referenzsequenz kann eine Wildtyp-Sequenz oder eine andere Sequenz, zu der der Vergleich einer interessierenden Sequenz gewünscht wird, sein. Eine Sequenzmutation umfasst einzelne Nukleotidaustäusche oder Veränderungen von mehr als einem Nukleotid in einer Sequenz aufgrund von Mechanismen wie einer Substitution, Deletion oder Insertion. Bei einem einzelnen Nukleotid-Polymorphismus (SNP) handelt es sich ebenfalls um eine Sequenzmutation, wie hierin verwendet.
  • "Einzelsträngiger Konformations-Polymorphismus" und "SSCP", wie hierin verwendet, beziehen sich generell auf die spezifische Konformation einer einzelsträngigen Nukleinsäure, wie durch ihre spezifische Nukleinsäuresequenz gegeben. Eine Veränderung der Sequenz des einzelsträngigen Polynukleotids, wie etwa eine einzelne Nukleotid-Substitution, Deletionen oder Insertionen, führen zu einer Veränderung oder einem Polymorphismus der Konformation des einzelsträngigen Polynukleotids. Die Konformation des Polynukleotids ist allgemein unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren nachweisbar, identifizierbar und/oder unterscheidbar, z.B. mittels der elektrophoretischen Mobilität, wie mittels Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese und/oder Anfälligkeit für einen Endonuklease-Verdau gemessen.
  • "Mikroarray" und "Array", wie hierin austauschbar verwendet, beziehen sich auf eine Anordnung einer Sammlung von Nukleotidsequenzen in einer zentralisierten Lokalisation. Arrays können auf einem festen Substrat, wie z.B. einem Glasträger, oder einem halbfesten Substrat, wie z.B. einer Nitrocellulosemembran, angeordnet sein. Die Nukleotidsequenzen können DNA, RNA oder jegliche Vertauschungen davon sein.
  • Der Begriff "3'" bezieht sich generell auf eine Region oder Position in einem Polynukleotid oder Oligonukleotid 3' (stromabwärts) einer anderen Region oder Position im gleichen Polynukleotid oder Oligonukleotid.
  • Der Begriff "5'" bezieht sich generell auf eine Region oder Position in einem Polynukleotid oder Oligonukleotid 5' (stromaufwärts) einer anderen Region oder Position im gleichen Polynukleotid oder Oligonukleotid.
  • Die Begriffe "3'-DNA-Abschnitt", "3'-DNA-Region", "3'-RNA-Abschnitt" und "3'-RNA-Region" beziehen sich auf den Abschnitt oder die Region eines Polynukleotids oder Oligonukleotids, die zum 3'-Ende des Polynukleotids oder Oligonukleotids zu lokalisiert ist und können das/die am 3'-gelegenste(n) Nukleotide) oder die an das 3'-gelegenste Nukleotid desselben Polynukleotids oder Oligonukleotids gebundenen Komponenten beinhalten oder auch nicht. Das oder die 3'-gelegensten Nukleotide können vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18, sogar noch bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide betragen.
  • Die Begriffe "5'-DNA-Abschnitt", "5'-DNA-Region", "5'-RNA-Abschnitt" und "5'-RNA-Region" beziehen sich auf den Abschnitt oder die Region eines Polynukleotids oder Oligonukleotids, die zum 5'-Ende des Polynukleotids oder Oligonukleotids zu lokalisiert ist und kann das/die 5'-gelegenste(n) Nukleotide) oder die an das 5'-gelegenste Nukleotid desselben Polynukleotids oder Oligonukleotids gebundenen Komponenten beinhalten oder auch nicht. Das oder die 5'-gelegensten Nukleotide können vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18, sogar noch bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide betragen.
  • "Detektion" umfasst jegliche Methoden des Nachweises, einschließlich des direkten und indirekten Nachweises. Zum Beispiel können "nachweislich weniger" Produkte direkt oder indirekt beobachtet werden und gibt der Begriff jegliche Verminderung (einschließlich keine Produkte) wieder. Entsprechend meint "nachweislich mehr" Produkt jegliche Zunahme, ob nun direkt oder indirekt beobachtet.
  • Bei den Verfahren der Erfindung angewendete Komponenten und Reaktionsbedingungen
  • Template-Nukleinsäure
  • Das zu amplifizierende Nukleinsäure-(NA)-Ziel umfasst Nukleinsäuren aus einer beliebigen Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, die DNA (dsDNA und ssDNA) oder RNA sein können, einschließlich tRNA, mRNA, rRNA, Mitochondrien-DNA und -RNA, Chloroplasten-DNA und -RNA, DNA-RNA-Hybride, oder Gemische davon, Gene, Chromosomen, Plasmide, die Genome von biologischem Material wie Mikroorganismen, z.B. Bakterien, Hefen, Viren, Viroiden, Schimmelpilzen, Pilzen, Pflanzen, Tieren, Menschen, und Fragmente davon. Für den Erhalt und die Reinigung der Nukleinsäuren werden standardmäßige Techniken des Fachgebiets angewendet. Die Amplifikation eines RNA-Ziels erfordert anfänglich die cDNA-Synthese, wie im Fachgebiet bekannt. Die Amplifikation eines DNA-RNA-Hybrids erfordert die Denaturierung des Hybrids zum Erhalt einer ssDNA, oder die Denaturierung, gefolgt von reverser Transkription zum Erhalt einer cDNA. Die Ziel-Nukleinsäure kann in lediglich einer geringfügigeren Fraktion eines komplexen Gemisches, wie etwa einer biologischen Probe, bestehen und kann aus verschiedenartigem biologischem Material mittels im Fachgebiet wohlbekannter Verfahrensweisen erhalten werden.
  • Der Ausgangsschritt der Amplifikation einer Ziel-Nukleinsäuresequenz besteht darin, das Ziel einzelsträngig zu machen. Besteht die Ziel-Nukleinsäure in einer doppelsträngigen (ds) DNA, so ist der Ausgangsschritt die Denaturierung des Ziels. Der Denaturierungsschritt kann in einer Wärmedenaturierung oder einer anderen im Fachgebiet bekannten Methode bestehen, z.B. einer Alkalibehandlung. Ist das Ziel RNA, so kann der Ausgangsschritt in der Synthese einer einzelsträngigen cDNA bestehen. Techniken für die Synthese von cDNA aus RNA sind im Fachgebiet bekannt.
  • Zusammengesetzter Primer
  • Bei den Amplifikationsverfahren der Erfindung wird ein einzelner zusammengesetzter Primer verwendet, der sich aus RNA- und DNA-Abschnitten zusammensetzt. Die zusammengesetzte Konstruktion des Primers ist für die anschließende Verdrängung des Primer-Extensionsprodukts durch Binden eines neuen (zusätzlichen) zusammengesetzten Primers und Extendieren des neuen Primers durch die Polymerase entscheidend. Außerdem führt die Abspaltung des RNA-Abschnitts des Primer-Extensionsprodukts zur Erzeugung eines Amplifikationsprodukts, das kein Substrat für die Amplifikation durch den zusammengesetzten Primer ist, wie nachstehend beschrieben.
  • Zusammengesetzte Primer zur Anwendung bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen mindestens einen RNA-Abschnitt, der fähig ist zum (a) Binden (Hybridisieren) an eine Sequenz auf der Ziel-Nukleinsäure (Template) unabhängig von der Hybridisation des/der DNA-Abschnitts/e an eine Sequenz auf der Ziel-Nukleinsäure; und (b) Gespalten werden mit einer Ribonuklease im an die Ziel-DNA hybridisierten Zustand. Die zusammengesetzten Primer binden an die Ziel-Nukleinsäure und bilden dabei einen partiellen Heteroduplex, in welchem lediglich der RNA-Abschnitt des Primers bei Kontakt mit einer Ribonuklease wie RNaseH abgespalten wird, während der Zielstrang intakt bleibt, was die Vereinigung mit einem anderen zusammengesetzten Primer ermöglicht.
  • Die zusammengesetzten Primer umfassen auch einen 3'-DNA-Abschnitt, der zum Hybridisieren an eine Sequenz auf der Ziel-Nukleinsäure (Template) fähig ist, so dass seine Hybridisation an die Zielsequenz (Template) gegenüber der des Nukleinsäure-Strangs, der von der Ziel-Nukleinsäure durch die DNA-Polymerase verdrängt wird, begünstigt ist. Diese Primer können auf der Grundlage wohlbekannter Faktoren rationell konstruiert werden, die die Nukleinsäure-Bindungsaffinität beeinflussen, wie etwa die Sequenzlänge und/oder -identität, als auch die Hybridisationsbedingungen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Hybridisation des 3'-DNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers an seine komplementäre Sequenz in der Ziel-Nukleinsäure gegenüber der Hybridisation der homologen Sequenz im 5'-Ende des verdrängten Strangs an die Ziel-Nukleinsäure begünstigt.
  • Die Erzeugung von Primern, die für die Extension durch Polymerisation geeignet sind, ist im Fachgebiet wohlbekannt und zum Beispiel beschrieben in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 99/42618 (und den darin angegebenen Literaturstellen). Der zusammengesetzte Primer umfasst eine Kombination aus RNA und DNA (siehe obige Definition), wobei das 3'-Endnukleotid ein für die Nukleinsäure-Extension geeignetes Nukleotid ist. Das 3'-Endnukleotid kann ein beliebiges Nukleotid oder Analogon sein, das bei Vorhandensein in einem Primer durch eine DNA-Polymerase extendierbar ist. Generell weist das 3'-Endnukleotid ein 3'-OH auf. Zu geeigneten Primern zählen solche, die mindestens einen Abschnitt aus RNA und mindestens einen Abschnitt aus DNA umfassen. Wie in Beispiel 5 gezeigt (das die relative Leistung der verschiedenen, für die Amplifikation von E. coli-J-Gen verwendeten Primer zeigt) können für ein Gen die zusammengesetzten Primer einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt (in welchem der RNA-Abschnitt angrenzend an den 3'-DNA-Abschnitt liegt); oder 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit einem dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfassen. Demgemäß umfasst bei einer Ausführungsform der zusammengesetzte Primer einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt, worin vorzugsweise der RNA-Abschnitt an den 3'-DNA-Abschnitt angrenzt. Bei einer anderen Ausführungsform umfasst der zusammengesetzte Primer 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit mindestens einem dazwischenliegenden RNA-Abschnitt (d.h. einem RNA-Abschnitt zwischen den beiden DNA-Abschnitten). Bei noch einer anderen Ausführungsform umfasst der zusammen gesetzte Primer der vorliegenden Erfindung einen 3'-DNA-Abschnitt und mindestens einen dazwischenliegenden RNA-Abschnitt (d.h. einen RNA-Abschnitt zwischen DNA-Abschnitten).
  • Die Länge eines RNA-Abschnitt in einem zusammengesetzten Primer, der einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt umfasst, kann vorzugsweise etwa 1 bis etwa 25, bevorzugter etwa 3 bis etwa 20, sogar noch bevorzugter etwa 4 bis 15 und am bevorzugtesten etwa 5 bis etwa 10 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt umfasst, kann ein RNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 3, 4, 5 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze bei etwa einem von 10, 15, 20, 25, 30 Nukleotiden liegt.
  • Die Länge des 5'-RNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst, kann vorzugsweise etwa 3 bis etwa 25 Nukleotide, bevorzugter etwa 5 bis etwa 20 Nukleotide, sogar noch bevorzugter etwa 7 bis etwa 18 Nukleotide, vorzugsweise etwa 8 bis etwa 17 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 10 bis etwa 15 Nukleotide betragen. Bei anderen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst, kann der 5'-RNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 3, 5, 7, 8, 10 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 15, 17, 18, 20 Nukleotiden beträgt.
  • Bei Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst und weiterhin Nicht-5'-RNA-Abschnitt(e) umfasst, kann ein Nicht-5'-RNA-Abschnitt vorzugsweise etwa 1 bis etwa 7 Nukleotide, bevorzugter etwa 2 bis etwa 6 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 5 Nukleotide betragen. Bei bestimmten Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst und außerdem Nicht-5'-RNA-Abschnitt(e) umfasst, kann ein Nicht-5'-RNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 2, 3, 5 Nukleotiden umfassen, wobei die Obergrenze bei etwa einem von 5, 6, 7, 10 Nukleotiden liegt.
  • Bei Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst, wobei der 5'-RNA-Abschnitt angrenzend an den 3'-DNA-Abschnitt liegt, kann die Länge des 5'-RNA-Abschnitts vorzugsweise etwa 3 bis etwa 25 Nukleotide, bevorzugter etwa 5 bis etwa 20 Nukleotide, sogar noch bevorzugter etwa 7 bis etwa 18 Nukleotide, vorzugsweise etwa 8 bis etwa 17 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 10 bis etwa 18 Nukleotide betragen. Bei bestimmten Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst, wobei der 5'-RNA-Abschnitt angrenzend an den 3'-DNA-Abschnitt liegt, kann der 5'-RNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 3, 5, 7,8, 10 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze bei etwa einem von 15, 17, 18, 20 Nukleotiden liegt.
  • Die Länge eines dazwischenliegenden RNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer, der 5'- und 3'-DNA-Abschnitte bei mindestens einem dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann vorzugsweise etwa 1 bis etwa 7 Nukleotide, bevorzugter etwa 2 bis etwa 6 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 5 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der 5'- und 3'-DNA-Abschnitte bei mindestens einem dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann ein dazwischenliegender RNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 2, 3, 5 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 5, 6, 7, 10 Nukleotiden beträgt. Die Länge eines dazwischenliegenden RNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer, der einen 3'-DNA-Abschnitt und mindestens einen dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann vorzugsweise etwa 1 bis etwa 7 Nukleotide, bevorzugter etwa 2 bis etwa 6 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 5 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 3'-DNA-Abschnitt und mindestens einen dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann ein dazwischenliegender RNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 2, 3, 5 Nukleotiden betragen, wobei die Oberbegrenze etwa eines von 5, 6, 7, 10 Nukleotiden beträgt. In einem zusammengesetzten Primer, der einen 3'-DNA-Abschnitt und mindestens einen dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst und außerdem einen 5'-RNA-Abschnitt umfasst, kann der 5'-RNA-Abschnitt vorzugsweise etwa 3 bis etwa 25 Nukleotide, bevorzugter etwa 5 bis etwa 20 Nukleotide, sogar noch bevorzugter etwa 7 bis etwa 18 Nukleotide, vorzugsweise etwa 8 bis etwa 17 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 10 bis etwa 15 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 3'-DNA-Abschnitt und mindestens einen dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst und außerdem einen 5'-RNA-Abschnitt umfasst, kann der 5'-RNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 3, 5, 7, 8, 10 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 15, 17, 18, 20 Nukleotiden beträgt.
  • Die Länge des 3'-DNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer, der einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt umfasst, kann vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18, sogar noch bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 und am bevorzugtesten etwa 7 bis etwa 12 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt umfasst, kann der 3'-DNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 10, 12, 15, 18, 20, 22 Nukleotiden beträgt.
  • Die Länge des 3'-DNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst, kann vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20 Nukleotide, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18 Nukleotide, sogar noch bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 7 bis etwa 12 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst, kann der 3'-DNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 10, 12, 15, 18, 20, 22 Nukleotiden beträgt.
  • Bei Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst und außerdem einen Nicht-3'-DNA-Abschnitt(e) umfasst, kann ein Nicht-3'-DNA-Abschnitt vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 Nukleotide, bevorzugter etwa 2 bis etwa 8 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 6 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst und außerdem einen Nicht-3'-DNA-Abschnitt(e) umfasst, kann ein Nicht-3'-DNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 2, 3, 5 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 6, 8, 10, 12 Nukleotiden beträgt.
  • Bei Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst, wobei der 5'-RNA-Abschnitt angrenzend an den 3'-DNA-Abschnitt liegt, kann die Länge des 3'-DNA-Abschnitts vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20 Nukleotide, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18 Nukleotide, sogar noch bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 7 bis etwa 12 Nukleotide betragen. Bei bestimmten Ausführungsformen des Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst, wobei der 5'-RNA-Abschnitt angrenzend an den 3'-DNA-Abschnitt liegt, kann der 3'-DNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 10, 12, 15, 18, 20, 22 Nukleotiden beträgt.
  • Die Länge eines Nicht-3'-DNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer, der 5'-und 3'-DNA-Abschnitte mit mindestens einem dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 Nukleotide, bevorzugter etwa 2 bis etwa 8 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 6 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines Primers, der 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit mindestens einem dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann ein Nicht-3'-DNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 2, 3, 5 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 6, 8, 10, 12 Nukleotiden beträgt.
  • Die Länge des 3'-DNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer, der 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit mindestens einem dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20 Nukleotide, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18 Nukleotide, sogar noch bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 7 bis 12 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit mindestens einem dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann der 3'-DNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 10, 12, 15, 18, 20, 22 Nukleotiden beträgt.
  • Die Länge eines Nicht-3'-DNA-Abschnitts (d.h. eines anderen DNA-Abschnitts als dem 3'-DNA-Abschnitt) in einem zusammengesetzten Primer, der einen 3'-DNA-Abschnitt und mindestens einen dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 Nukleotide, bevorzugter etwa 2 bis etwa 8 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 6 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 3'-DNA-Abschnitt und mindestens einen dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann ein Nicht-3'-DNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 6, 8, 10, 12 Nukleotiden beträgt. Die Länge des 3'-DNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer, der einen 3'-DNA-Abschnitt und mindestens einen dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20 Nukleotide, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18 Nukleotide, sogar noch bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 7 bis etwa 12 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen eines zusammengesetzten Primers, der einen 3'-DNA-Abschnitt und mindestens einen dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst, kann der 3'-DNA-Abschnitt mindestens etwa eines von 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 10, 12, 15, 18, 20, 22 Nukleotiden beträgt. Es ist klar, dass die Längen der verschiedenen Abschnitte größer oder kleiner sein können, je nach Eignung unter den Reaktionsbedingungen der Verfahren dieser Erfindung.
  • Bei einigen Ausführungsformen umfasst der 5'-RNA-Abschnitt eines zusammengesetzten Primers das 5'-gelegenste Nukleotid des Primers. Bei einigen Ausführungsformen umfasst der 5'-RNA-Abschnitt eines zusammengesetzten Primers das 5'-gelegenste Nukleotid des Primers. Bei anderen Ausführungsformen umfasst der 3'-DNA-Abschnitt eines zusammengesetzten Primers das 3'-gelegenste Nukleotid des Primers. Bei anderen Ausführungsformen liegt der 3'-DNA-Abschnitt angrenzend an den 5'-RNA-Abschnitt und umfasst er das 3'-gelegenste Nukleotid des Primers (wobei der 5'-RNA-Abschnitt das 5'-gelegenste Nukleotid des Primers umfasst).
  • Die Gesamtlänge des zusammengesetzten Primers kann vorzugsweise etwa 10 bis etwa 40 Nukleotide, bevorzugter etwa 15 bis etwa 30 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 20 bis etwa 25 Nukleotide betragen. Bei einigen Ausführungsformen kann die Länge mindestens etwa eines von 10, 15, 20, 25 Nukleotiden betragen, wobei die Obergrenze etwa eines von 25, 30, 40, 50 Nukleotiden beträgt. Es ist klar, dass die Länge größer oder kleiner sein kann, je nach Eignung unter den Reaktionsbedingungen der Verfahren dieser Erfindung.
  • Um die Hybridisation zu bewirken (welche, wie im Fachgebiet wohlbekannt und wohlverstanden, von weiteren Faktoren abhängt, wie zum Beispiel der Ionenstärke und der Temperatur), sind die zusammengesetzten Primer zur Verwendung bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise von mindestens etwa 60%, bevorzugter von mindestens etwa 75%, sogar noch bevorzugter von mindestens etwa 90% und am bevorzugtesten von mindestens etwa 95% Komplementarität zur Ziel-Nukleinsäure. Die einzelnen DNA- und RNA-Abschnitte der zusammengesetzten Primer sind vorzugsweise von mindestens etwa 60%, bevorzugter von mindestens etwa 75%, sogar noch bevorzugter von mindestens etwa 90% und am bevorzugtesten von mindestens etwa 95% Komplementarität zur Ziel-Nukleinsäure.
  • Wie hierin beschrieben, können ein oder mehrere zusammengesetzte Primer bei einer Amplifikationsreaktion verwendet werden.
  • Polynukleotid, umfassend eine Terminations-Polynukleotidsequenz
  • Einige Ausführungsformen der Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen, insbesondere bei Anwendung einer auf Transkription basierenden Amplifikation, ein Polynukleotid, das eine Terminationssequenz enthält, wofür Beispiele im folgenden bereitgestellt werden.
  • Template-Switch-Oligonukleotid
  • Ein zweites Oligonukleotid, das bei den Amplifikationsverfahren der Erfindung verwendet werden kann, ist ein Terminations-Switch-Oligonukleotid (TSO). Bei einer Ausführungsform fungiert das TSO als eine Terminationssequenz. Bei einer anderen Ausführungsform fungiert das TSO als eine Terminationssequenz und stellt eine Propromotor-Sequenz zur Verfügung.
  • Die auf einem Template-Switch-Oligonukleotid basierenden zuvor beschriebenen Amplifikationsverfahren wurden hinsichtlich der Konzentration dieses Oligonukleotids aufgrund der Hemmung der Hybridisation des zweiten Primers, oder des zweiten Hybridisationsschritts desselben Primers, wenn das Verfahren auf die Nutzung einer einzelnen Primer-Spezies hin angelegt ist, eingeschränkt. Die Verfahren der Erfindung sind frei von dieser Einschränkung. Im Gegensatz zu bisher beschriebenen Verfahren unter Verwendung von TSOs kann das Template-Switch-Oligonukleotid bei hoher Konzentration zur Amplifikation gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Dieses Merkmal gewährleistet eine wirksame Hybridisation des Oligonukleotids an den Zielstrang und maximiert die Ausbeute des trimolekularen Komplexes, des Substrats für die Primerextension und des Template-Switch. Eine weitere Eigenschaft dieses Merkmals besteht in der wirksamen Hybridisation des verdrängten Primer-Extensionsprodukts an das Template-Switch-Oligonukleotid zum Erhalt eines Substrats für die RNA-Polymerase, wie beschrieben.
  • Ein TSO umfasst einen 3'-Abschnitt, der an das Ziel hybridisieren kann, und einen 5'-Abschnitt, der auf einen Strang-Switch während der Polymerisation hin ausgelegt ist (siehe 2A–2C). Die Konstruktion eines TSO, das den Strang-Switch bewirken kann, ist im Fachgebiet bekannt, wie zuvor beschrieben bei Patel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:2969–2974.
  • Der 3'-Abschnitt hybridisiert an die Template an einer Lokalisation 5' zur Position oder Region im Template-Polynukleotid, die komplementär zum 3'-Ende des Primer-Extensionsprodukts vor dem Switchen der Template vom Template-Polynukleotid zum unhybridisierten Abschnitt des TSO ("Terminationsstelle") ist.
  • Bei einer Ausführungsform wird der Strang-Switch durch das Vorhandensein gegenseitig komplementärer kurzer Sequenzen in den TSO-Segmenten unmittelbar 5' und 3' zur Junktion zwischen den hybridisierten und nicht-hybridisierten Abschnitten des TSO gefördert. Ohne auf eine Theorie festgelegt sein zu wollen, ist eine Erklärung die, dass in dem Falle, dass das Primer-Extensionsprodukt in den Abschnitt der Ziel-Nukleinsäure extendiert wird, der an das TSO (durch Verdrängung des hybridisierten Abschnitts des TSO) hybridisiert wird, das 3'-Ende des Primer-Extensionsprodukts eine kurze Sequenz umfassen würde, die an ihre komplementäre kurze Sequenz in dem Segment des TSO unmittelbar angrenzend an die Anknüpfungsstelle zwischen den hybridisierten und nicht-hybridisierten Abschnitten des TSO binden kann. Dies erhöht die Wirksamkeit des Template-Switching, indem die Wahrscheinlichkeit steigt, dass das Primer-Extensionsprodukt zum TSO-Schwanzabschnitt als eine Template switchen würde. Die Länge der kurzen komplementären Sequenzen beträgt vorzugsweise etwa 3 bis etwa 20 Nukleotide, bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide, und am bevorzugtesten etwa 7 bis etwa 10 Nukleotide. Bei einigen Ausführungsformen beträgt die Länge mindestens etwa eines von 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotiden, wobei die Obergrenze etwa eines von 10, 15, 20, 25 Nukleotiden beträgt. Es ist klar, dass die Länge größer oder kleiner sein kann, je nach Eignung unter den Reaktionsbedingungen der Verfahren dieser Erfindung.
  • Bei einigen Ausführungsformen umfasst der 5'-Abschnitt des TSO eine Sequenz (im folgenden "Propromotor-Sequenz"), die auf die Bildung eines doppelsträngigen Promotors einer RNA-Polymerase hin gestaltet ist. Diese Ausführungsform des TSO würde sowohl als eine Terminationssequenz als auch zur Bereitstellung einer Promotor-Template fungieren. Bei dieser Ausführungsform dient die Propromotor-Sequenz des TSO als eine Template zum Einbau einer Propromotor-Sequenz (generell komplementär zur Propromotor-Sequenz des Template-TSO) in das Primer-Extensionsprodukt. Die anschließende Hybridisation eines TSO, das eine Propromotor-Sequenz umfasst, die an die Propromotor-Sequenz des Primer-Extensionsprodukts hybridisierbar ist, führt zur Bildung eines doppelsträngigen Promotors, welcher die Transkription durch eine geeignete RNA-Polymerase bewirken kann. Promotor-Sequenzen, die die Transkription einer Template-DNA erlauben, sind im Fachgebiet bekannt, ebenso wie Verfahren zu ihrem Erhalt und/oder Herstellung. Vorzugsweise ist die Promotor-Sequenz so gewählt, dass sie eine optimale Transkriptionsaktivität der jeweilig verwendeten RNA-Polymerase bereitstellt. Kriterien für diese Auswahl, d.h. einer bestimmten Promotor-Sequenz, die durch eine bestimmte RNA-Polymerase besonders begünstigt ist, sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel sind die Sequenzen der Promotoren für die Transkription durch T7-DNA-abhängige RNA-Polymerase und SP6 im Fachgebiet bekannt. Die Promotor-Sequenz kann aus einer prokaryontischen oder eukaryontischen Quelle stammen.
  • Bei einer Ausführungsform grenzt die Promotor-Sequenz an eine Sequenz an, die zur Schaffung einer verbesserten, oder optimaleren, Transkription durch die verwendete RNA-Polymerase hin gestaltet ist. Bei einigen Ausführungsformen ist die Sequenz nicht mit der Ziel-Nukleinsäure verwandt (d.h. sie hybridisiert im wesentlichen nicht). Eine optimalere Transkription erfolgt, wenn die trankriptionelle Aktivität der Polymerase von einem Promotor, der funktionsfähig mit der Sequenz verknüpft ist, größer ist als von einem Promotor, der nicht verknüpft ist. Die Sequenz-Anforderungen für eine optimale Transkription sind allgemein im Fachgebiet bekannt und wie zuvor für verschiedene DNA-abhängige RNA-Polymerasen beschrieben, wie z.B. in US-Patent Nrn. 5.766.849 und 5.654.142 .
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Segment des 3'-Abschnitts des TSO (einschließlich des gesamten 3'-Abschnitts, der an Ziel hybridisiert), das an die Template-DNA hybridisiert, so an die Template-DNA gebunden, dass die Verdrängung des TSO durch die Polymerase, die die Primer-Extension bewirkt, wesentlich, oder zumindest ausreichend, gehemmt ist. Zu geeigneten Verfahren zur Erzielung dieser Bindung zählen die im Fachgebiet bekannten Techniken, wie etwa die Verwendung eines Zytosin-Analogons, das eine heterocyclische G-Klammer-Modifikation enthält (beschrieben bei Flanagan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96(7):3513–8); und "locked" Nukleinsäuren (beschrieben z.B. bei Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8(16):2219–22; und Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97(10):5633–8). Zu weiteren geeigneten Verfahren zählen die Verwendung, wo geeignet, von Sequenzen mit einem hohen GC-Gehalt und/oder die Vernetzung. Jegliche dieser Verfahren zum Erhalt einer erhöhten Bindung können einzeln oder in Kombination angewendet werden. Die Verdrängung des TSO ist beträchtlich oder ausreichend gehemmt, wenn die Polymerase die Template vom Ziel-Nukleinsäure-Strang zum unhybridisierten Abschnitt des TSO in mindestens etwa 25%, vorzugsweise mindestens etwa 50%, noch bevorzugter mindestens etwa 75% und am bevorzugtesten mindestens etwa 90% der Ereignissen der Primer-Extension switched. Eine beträchtlich oder ausreichend gehemmte TSO-Verdrängung kann auch empirisch indiziert sein, wenn die Amplifikationsverfahren zu einem zufriedenstellenden Ergebnis bezüglich der Menge des gewünschten Produkts führen. Generell bindet, unter einem gegebenen Set von Bedingungen, das "modifizierte" TSO enger an die Template als ein nicht in dieser Weise modifiziertes TSO.
  • Die Länge des TSO-Abschnitts, der an den Ziel-Nukleinsäure-Strang hybridisiert, beträgt vorzugsweise etwa 15 bis 50 Nukleotide, bevorzugter etwa 20 bis 45 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 25 bis 40 Nukleotide. Bei anderen Ausführungsformen beträgt die Länge mindestens etwa eines der folgenden: 10, 15, 20, 25, 30; und weniger als etwa eines der folgenden: 35, 40, 45, 50, 55. Es ist klar, dass die Länge größer oder kleiner sein kann, je nach Eignung unter den Reaktionsbedingungen der Verfahren dieser Erfindung. Die Komplementarität des TSO-Abschnitts, der an den Ziel-Nukleinsäure-Strang hybridisiert, beträgt vorzugsweise mindestens etwa 25%, bevorzugter mindestens etwa 50%, sogar noch bevorzugter mindestens etwa 75% und am bevorzugtesten mindestens etwa 90%, zu seiner vorgesehenen Bindungssequenz an der Ziel-Nukleinsäure.
  • Blockersequenz
  • Bei einigen Ausführungsformen wird die Terminationssequenz der Primerextension durch eine Blockersequenz bereitgestellt. Bei der Blockersequenz handelt es sich um ein Polynukleotid, gewöhnlich ein synthetisches Polynukleotid, das einzelsträngig ist und eine Sequenz umfasst, die an ein Segment der Ziel-Nukleinsäuresequenz 5' zur Position in der Zielsequenz, die komplementär zum 3'-Ende des Primer-Extensionsprodukts ("Terminationsstelle") ist, hybridisierbar, vorzugsweise komplementär ist. Der Blocker umfasst Nukleotide, die an die Ziel-Nukleinsäure bei einer Affinität, vorzugsweise einer hohen Affinität, so binden, dass die Blockersequenz der Verdrängung durch DNA-Polymerase im Verlauf der Primerextension in vorzugsweise mehr als etwa 30%, bevorzugter mehr als etwa 50%, sogar noch bevorzugter mehr als etwa 75% und am bevorzugtesten mehr als etwa 90% der Primerextensions-Ereignissen standhält. Die Länge und Zusammensetzung des Blocker-Polynukleotids sollte derart sein, dass eine übermäßige willkürliche nicht-spezifische Hybridisation unter den Bedingungen der Verfahren der vorliegenden Erfindung vermieden wird. Die Länge des Blocker-Polynukleotids beträgt vorzugsweise etwa 3 bis etwa 30 Nukleotide, bevorzugter etwa 5 bis etwa 25 Nukleotide, sogar noch bevorzugter etwa 8 bis etwa 20 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 10 bis etwa 15 Nukleotide. Bei anderen Ausführungsformen beträgt das Blocker-Polynukleotid mindestens etwa eines der folgenden: 3, 5, 8, 10, 15; und weniger als etwa eines der folgenden: 20, 25, 30, 35. Es ist klar, dass die Länge größer oder kleiner sein kann, je nach Eignung unter den Reaktionsbedingungen der Verfahren dieser Erfindung. Die Komplementarität des Blocker-Polynukleotids beträgt vorzugsweise mindestens etwa 25%, bevorzugter mindestens etwa 50%, sogar noch bevorzugter mindestens etwa 75% und am bevorzugtesten mindestens etwa 90% zu seiner vorgesehenen Bindungssequenz an der Ziel-Nukleinsäure.
  • Bei einer Ausführungsform umfasst die Blockersequenz ein Segment, das an die Ziel-DNA hybridisiert und so an die Ziel-DNA gebunden wird, dass die Verdrängung der Blockersequenz durch die Polymerase, die die Primerextension bewirkt, wesentlich, oder zumindest ausreichend, gehemmt wird. Geeignete Methoden zur Erzielung dieser Bindung und Bestimmung der wesentlichen, oder ausreichenden Hemmung der Verdrängung sind wie oben für das bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete TSO beschrieben.
  • Bei einer Ausführungsform kann das Blocker-Polynukleotid nicht wirksam als ein Primer für die Nukleinsäure-Extension fungieren (d.h. die Extension von der Blockersequenz ist reduziert oder gehemmt). Die Methoden zum Blockieren der Primerfunktion des Blocker-Polynukleotids umfassen jegliche, die die Anfügung von Nukleotiden an das 3'-Ende des Primers durch eine DNA-Polymerase verhindern. Diese Techniken sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel die Substitution oder Modifikation der 3'-Hydroxylgruppe oder den Einbau eines modifizierten Nukleotids, wie etwa eines Didesoxynukleotids, in die 3'-gelegenste Position des Blocker-Polynukleotids, das nicht zum Verankern zusätzlicher Nukleotide durch eine DNA-Polymerase in der Lage ist.
  • Polynukleotid, umfassend einen Propromotor und eine Region, die an ein verdrängtes Primer-Extensionsprodukt hybridisiert
  • Bei einigen Ausführungsformen wird ein Polynukleotid verwendet, das einen Propromotor und Region umfasst, die an ein verdrängtes Primer-Extensionsprodukt hybridisiert. Bei einigen Ausführungsformen ist das Polynukleotid ein TSO, das eine Propromotor-Sequenz enthält, wie oben erörtert. Bei anderen Ausführungsformen ist die Propromotor-Sequenz in einem PTO enthalten, wie nachstehend beschrieben.
  • Propromotor-Template-Oligonukleotid
  • Bei einigen Ausführungsformen wird bei den Verfahren eine Promotorsequenz für die Transkription verwendet, wie durch ein Propromotor-Template-Oligonukleotid (PTO) bereitgestellt.
  • Bei einem PTO zur Verwendung bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein einzelsträngiges Polynukleotid, generell DNA, das eine Propromotor-Sequenz umfasst, die zur Bildung eines ds-Promotors einer RNA-Polymerase gestaltet ist, und einen Abschnitt, der zum Hybridisieren an das 3'-Ende des Primer-Extensionsprodukts fähig ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Propromotor-Sequenz im 5'-Abschnitt des Oligonukleotids lokalisiert und ist die hybridisierende Sequenz im 3'-Abschnitt des Oligonukleotids lokalisiert. Bei einer Ausführungsform, und am typischsten, sind die Promotor- und die hybridiserenden Sequenzen unterschiedliche Sequenzen. Bei einer anderen Ausführungsform überlappen sich die Promotor- und hybridisierenden Sequenzen bei Sequenzidentität. Bei noch einer anderen Ausführungsform sind die Promotor- und hybridiserenden Sequenzen dieselbe Sequenz und befinden sich daher in derselben Lokalisation auf dem PTO. Bei den Ausführungsformen, bei denen die Hybridisation des PTO an das Primer-Extensionsprodukt zu einem Duplex führt, der einen Überhang enthält (das 5'-Ende des PTO, das nicht an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt hybridisiert und typischerweise die gesamte oder einen Teil der Propromotor-Sequenz umfasst), wobei DNA-Polymerase den Überhang ausfüllt und dadurch einen doppelsträngigen Promotor schafft, der zur Bewirkung der Transkription mittels einer geeigneten RNA-Polymerase fähig ist.
  • Die Promotorsequenzen, die die Transkription einer Template-DNA ermöglichen, sind im Fachgebiet bekannt und wurden oben erörtert. Vorzugsweise wird die Promotorsequenz so gewählt, dass sie eine optimale Transkriptionsaktivität der speziell verwendeten RNA-Polymerase bereitstellt. Kriterien für diese Auswahl, d.h. eine durch eine bestimmte RNA-Polymerase besonders bevorzugte spezielle Promotorsequenz, sind im Fachgebiet ebenfalls bekannt. Zum Beispiel sind die Sequenzen der Promotoren für die Transkription durch T7-DNA-abhängige RNA-Polymerase und SP6 im Fachgebiet bekannt. Die Promotor-Sequenz kann sowohl aus einer prokaryontischen als auch eukaryontischen Quelle stammen.
  • Bei einigen Ausführungsformen umfasst das PTO eine dazwischenliegende Sequenz zwischen einer Propromotor-Sequenz und einem Abschnitt, der zum Hybridisieren an das 3'-Ende des Primer-Extensionsprodukts in der Lage ist. Die geeignete Länge der dazwischenliegenden Sequenz kann empirisch bestimmt werden und kann mindestens etwa 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15 Nukleotide betragen. Die geeignete Sequenzidentität der dazwischenliegenden Sequenz kann ebenfalls empirisch bestimmt werden, und die Sequenz wird so gestaltet, dass sie vorzugsweise, doch nicht erforderlicherweise, den Grad der Amplifikation im Vergleich zum Fehlen der Sequenz erhöht. Bei einer Ausführungsform ist die dazwischenliegende Sequenz eine Sequenz, die zur Bereitstellung einer verbesserten, oder optimaleren, Transkription durch die verwendete RNA-Polymerase gestaltet ist. Generell ist die Sequenz nicht mit der Ziel-Nukleinsäure verwandt (d.h. sie hybridisiert nicht wesentlich). Eine optimalere Transkription erfolgt, wenn die Transkriptionsaktivität der Polymerase von einem Promotor, der funktionsfähig an diese Sequenz geknüpft ist, größer ist als von einem Promotor, der nicht in dieser Weise verknüpft ist. Die Sequenz-Anforderungen für eine optimale Transkription sind im Fachgebiet allgemein bekannt und wie zuvor beschrieben für verschiedene DNA-abhängige RNA-Polymerasen, wie z.B. in US-Patent Nrn. 5766849 und 5654142 , und können außerdem empirisch bestimmt werden.
  • Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das PTO eine Sequenz, die 5' zur Propromotor-Sequenz lokalisiert ist, d.h. das PTO umfasst zusätzliche Nukleotide (die transkriptionale regulatorische Sequenzen sein können oder auch nicht), die 5' zur Propromotor-Sequenz lokalisiert sind. Allgemein, doch nicht erforderlicherweise, ist die Sequenz nicht an das Primer-Extensionsprodukt hybridisierbar.
  • Bei einer Ausführungsform kann das PTO nicht wirksam als ein Primer für die Nukleinsäure-Extension fungieren. Techniken zum Blockieren der Primerfunktion des PTO umfassen jegliche, die die Addition von Nukleotiden an das 3'-Ende des PTO durch eine DNA-Polymerase verhindern. Diese Techniken sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel die Substitution oder Modifikation der 3'-Hydroxylgruppe oder den Einbau eines modifizierten Nukleotids, wie etwa eines Didesoxynukleotids, in die 3'-gelegenste Position des PTO, das nicht zum Verankern von durch eine DNA-Polymerase hinzuaddierten Nukleotiden fähig ist. Es ist auch möglich, das 3'-Ende unter Verwendung einer Markierung oder eines kleinen Moleküls zu blockieren, das ein Element eines spezifischen Bindungspaares ist, wie etwa Biotin.
  • Die Länge des Abschnitts des PTO, der an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt hybridisiert, beträgt vorzugsweise etwa 5 bis etwa 50 Nukleotide, bevorzugter etwa 10 bis etwa 40 Nukleotide, sogar noch bevorzugter etwa 15 bis etwa 35 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 20 bis 30 Nukleotide. Bei einigen Ausführungsformen ist der hybridisierende Abschnitt mindestens etwa eines der folgenden: 3, 5, 10, 15, 20; oder weniger als etwa eines der folgenden: 30, 40, 50, 60. Die Komplementarität des hybridisierenden Abschnitts beträgt vorzugsweise mindestens etwa 25%, bevorzugter mindestens etwa 50%, sogar noch bevorzugter mindestens etwa 75% und am bevorzugtesten mindestens etwa 90% zu seiner vorgesehenen Bindungssequenz an der Ziel-Nukleinsäure.
  • DNA-Polymerase, Ribonuklease und RNA-Polymerase
  • Bei den Amplifikationsverfahren der Erfindung werden die folgenden Enzyme verwendet: eine DNA-Polymerase, Ribonuklease wie RNaseH und wahlweise eine DNA-abhängige RNA-Polymerase.
  • Die DNA-Polymerasen zur Verwendung bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind zum Bewirken der Extension des zusammengesetzten Primers gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung fähig. Demgemäß ist eine bevorzugte Polymerase eine solche, die zum Extendieren eines Nukleinsäure-Primers entlang einer Nukleinsäure-Template fähig ist, die sich zumindest hauptsächlich aus Desoxynukleotiden zusammensetzt. Die Polymerase sollte zum Verdrängen eines Nukleinsäure-Strangs vom Polynukleotid fähig sein, an das der verdrängte Strang gebunden ist, und generell ist es um so besser, je mehr Strang-verdrängende Kapazität die Polymerase zeigt (d.h. im Vergleich zu anderen Polymerasen, die keine so große Strang-verdrängende Kapazität aufweisen). Vorzugsweise weist die DNA-Polymerase eine hohe Bindungsaffinität an das 3'-Ende eines Oligonukleotids auf, das an einen Nukleinsäurestrang hybridisiert ist. Vorzugsweise besitzt die DNA-Polymerase keine wesentliche Nick-Aktivität. Vorzugsweise weist die Polymerase wenig oder keine 5'→3'-Exonukleoase-Aktivität auf, um die Zerlegung von Primern, Terminations- oder Primerextensions-Polynukleotiden zu minimieren. Generell hängt diese Exonuklease-Aktivität von Faktoren wie dem pH-Wert, der Salzkonzentration, davon, ob die Template doppel- oder einzelsträngig ist usw. ab, die alle einem Fachmann des Gebiets vertraut sind. Mutante DNA-Polymerasen, in denen die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität deletiert ist, sind im Fachgebiet bekannt und eignen sich für die hierin beschriebenen Amplifikationsmethoden. Geeignete DNA-Polymerasen zur Verwendung bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen solche, wie in US-Patent Nrn. 5648211 und 5744312 beschrieben, die exo– Vent (New England Biolabs), exo– Deep Vent (New England Biolabs), Bst (BioRad), exo– Pfu (Stratagene), Bca (Panvera), Taq in Sequenziergüte (Promega) und thermostabile DNA-Polymerasen von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus umfassen. Bevorzugt ist, dass die DNA-Polymerase die Primer-Extensionsprodukte von der Template-Nukleinsäure in mindestens etwa 25%, bevorzugter mindestens etwa 50%, sogar noch bevorzugter mindestens etwa 75% und am bevorzugtesten mindestens etwa 90% des Vorkommens eines Kontakts zwischen der Polymerase und dem 5'-Ende des Primer-Extensionsprodukts verdrängt. Bei einigen Ausführungsformen ist die Verwendung thermostabiler DNA-Polymerasen mit Strang-verdrängender Aktivität bevorzugt. Solche Polymerasen sind im Fachgebiet bekannt und z.B. beschrieben in US-Patent Nr. 5744312 (und den darin angegebenen Literaturstellen). Vorzugsweise weist die DNA-Polymerase wenig oder keine Proofreading-Aktivität auf.
  • Die Ribonuklease zur Verwendung bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist zum Abspalten von Ribonukleotiden in einem RNA/DNA-Hybrid fähig. Vorzugsweise spaltet die Ribonuklease die Ribonukleotide unabhängig von der Art und Identität der Nukleotide in Nachbarschaft zu dem abzuspaltenden Ribonukleotid. Bevorzugt ist, dass die Ribonuklease unabhängig von der Sequenzidentität spaltet. Beispiele geeigneter Ribonukleasen für die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind im Fachgebiet wohlbekannt und beinhalten RibonukleaseH (RNaseH).
  • Die DNA-abhängige RNA-Polymerase zur Verwendung bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind im Fachgebiet bekannt. Es können entweder eukaryontische oder prokaryontische Polymerasen verwendet werden. Zu Beispielen zählen T7-, T3- und SP6-RNA-Polymerasen. Generell ist die gewählte RNA-Polymerase zum Transkribieren von der durch das TSO oder PTO bereitgestellten Promotor-Sequenz fähig, wie hierin beschrieben. Generell ist die RNA-Polymerase eine DNA-abhängige Polymerase, die vorzugsweise zum Transkribieren von einer einzelsträngigen DNA-Template fähig ist, solange die Promotor-Region doppelsträngig ist.
  • Allgemein sollten die bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzyme keinen wesentlichen Abbau der Nukleinsäure-Komponenten der Verfahren und Zusammensetzungen bewirken.
  • Reaktionsbedingungen und Nachweis
  • Geeignete Reaktionsmedien und -bedingungen zur Ausführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung sind solche, die eine Nukleinsäure-Amplifikation gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung zulassen. Solche Medien und Bedingungen sind Fachleuten des Gebiets bekannt und sind beschrieben in verschiedenen Veröffentlichungen, wie US-Patent Nr. 5.679.512 und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 99/42618 . Zum Beispiel kann ein Puffer der Tris-Puffer sein, obschon auch andere Puffer verwendet werden können, solange die Pufferkomponenten nicht inhibitorisch für die Enzymkomponenten der Verfahren der Erfindung sind. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise etwa 5 bis etwa 11, bevorzugter etwa 6 bis etwa 10, sogar noch bevorzugter etwa 7 bis etwa 9 und am bevorzugtesten etwa 7,5 bis etwa 8,5. Das Reaktionsmedium kann auch zweiwertige Metallionen wie Mg2+ oder Mn2+ bei einer Endkonzentration der freien Ionen umfassen, die innerhalb des Bereichs von etwa 0,01 bis etwa 10 mM und am bevorzugtesten von etwa 1 bis 5 mM liegt. Das Reaktionsmedium kann auch andere Salze enthalten, wie etwa KCl, die zur Gesamtionenstärke des Mediums beitragen. Zum Beispiel beträgt der Bereich eines Salzes wie KCl vorzugsweise etwa 0 bis etwa 100 mM, bevorzugter etwa 0 bis etwa 75 mM und am bevorzugtesten etwa 0 bis etwa 50 mM. Das Reaktionsmedium kann außerdem Zusatzstoffe enthalten, die die Wirkungsweise der Amplifikationsreaktionen beeinflussen könnten, doch nicht wesentlich für die Aktivität der Enzymkomponenten der Verfahren sind. Zu solchen Zusatzstoffen zählen Proteine wie BSA und nichtionische Detergenzien wie NP40 oder Triton. Auch Reagenzien wie DTT, die zum Aufrechterhalten der Enzymaktivitäten in der Lage sind, können enthalten sein. Solche Reagenzien sind im Fachgebiet bekannt. Wo geeignet, kann auch ein RNase-Inhibitor (wie Rnasine), der die Aktivität der bei der Methode verwendeten RNase nicht hemmt, enthalten sein. Jeglicher Aspekt der Verfahren der vorliegenden Erfindung kann bei derselben oder bei variierenden Temperaturen erfolgen. Vorzugsweise werden die Reaktionen isotherm vorgenommen, was den mühsamen Wärmezyklierprozess umgeht. Die Amplifikationsreaktion wird bei einer Temperatur vorgenommen, die die Hybridisation der Oligonukleotide (Primer, TSO, Blockersequenz und/oder PTO) der vorliegenden Erfindung an das Template-Polynukleotid erlaubt und die die Aktivität der verwendeten Enzyme nicht wesentlich hemmt. Die Temperatur kann im Bereich von vorzugsweise etwa 25°C bis etwa 85°C, bevorzugter etwa 30°C bis etwa 75°C und am bevorzugtesten etwa 37°C bis etwa 70°C liegen. Bei einigen Ausführungsformen, die die RNA-Transkription einbeziehen, ist die Temperatur für die Transkriptionsschritte geringer als die Temperaturen) für die vorangegangenen Schritte. Bei diesen Ausführungsformen kann die Temperatur der Transkriptionsschritte im Bereich von vorzugsweise etwa 25°C bis etwa 85°C, bevorzugter etwa 30°C bis etwa 75°C und am bevorzugtesten etwa 37°C bis etwa 70°C liegen.
  • Nukleotid und/oder Nukleotid-Analoga, wie etwa Desoxyribonukleosidtriphosphate, die für die Synthese der Primer-Extensionsprodukte bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden können, werden in einer Menge von vorzugsweise etwa 50 bis etwa 2500 μM, bevorzugter etwa 100 bis etwa 2000 μM, sogar nach bevorzugter etwa 500 bis etwa 1700 μM und am bevorzugtesten etwa 800 bis etwa 1500 μM bereitgestellt.
  • Bei einigen Ausführungsformen ist ein Nukleotid oder Nukleotid-Analogon, dessen Vorhandensein im Primerextensionsstrang die Verdrängung des Strangs fördert (z.B. durch Bewirken einer Basenpaarung, die schwächer als die herkömmliche AT-, CG-Basenpaarung ist), einbezogen. Zu solchen Nukleotiden oder Nukleotid-Analoga zählen Desoxyinosin und andere modifizierte Basen, die alle im Fachgebiet bekannt sind. Nukleotide und/oder Nukleotid-Analoga, wie etwa Ribonukleosidtriphosphate, die zur Synthese der RNA-Transkripte bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in einer Menge von vorzugsweise etwa 0,25 bis etwa 6 mM, bevorzugter etwa 0,5 bis etwa 5 mM, sogar noch bevorzugter etwa 0,75 bis etwa 4 mM und am bevorzugtesten etwa 1 bis etwa 3 mM bereitgestellt.
  • Die Oligonukleotid-Komponenten der Amplifikationsreaktionen der Erfindung liegen generell in einem Überschuss gegenüber der zu amplifizierenden Zahl der Ziel-Nukleinsäuresequenzen vor. Sie können bei etwa oder mindestens etwa einem der folgenden bereitgestellt werden: dem 10-, 102-, 104-, 106-, 108-, 1010-, 1012-fachen der Menge der Ziel-Nukleinsäure. Zusammengesetzte Primer, TSO, PTO und die Blockersequenz können jeweils zu etwa oder mindestens zu etwa einer der folgenden Konzentrationen bereitgestellt werden: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1000 nM, 2500 nM, 5000 nM.
  • Bei einer Ausführungsform werden die vorangegangenen Komponenten gleichzeitig bei Beginn des Amplifikationsprozesses zugegeben. Bei einer anderen Ausführungsform werden die Komponenten in einer beliebigen Reihenfolge vor oder nach geeigneten Zeitpunkten während des Amplifikationsprozesses zugegeben, wie durch die Amplifikationsreaktion erforderlich und/oder zulässig. Diese Zeitpunkte, von denen einige nachstehend vermerkt sind, lassen sich durch einen Fachmann des Gebiets ohne weiteres identifizieren. Die für die Nukleinsäure-Amplifikation gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzyme können dem Reaktionsgemisch entweder vor dem Nukleinsäure-Denaturierungsschritt, im Anschluss an den Denaturierungsschritt oder im Anschluss an die Hybridisation des Primers und/oder der Blockersequenz an die Ziel-DNA zugegeben werden, wie durch ihre Wärmestabilität und/oder andere den Fachleuten des Gebiets bekannten Überlegungen bestimmt.
  • Die Amplifikationsreaktionen können zu verschiedenen Zeitpunkten gestoppt und zu einem späteren Zeitpunkt wieder aufgenommen werden. Diese Zeitpunkte können durch einen Fachmann des Gebiets ohne weiteres identifiziert werden. Verfahren zum Stoppen der Reaktionen sind im Fachgebiet bekannt, einschließlich zum Beispiel des Abkühlens des Reaktionsgemischs auf eine Temperatur, die die Enzymaktivität hemmt. Verfahren zum Wiederaufnehmen der Reaktionen sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt, einschließlich zum Beispiel einer Erhöhung der Temperatur des Reaktionsgemischs auf eine Temperatur, die die Enzymaktivität zulässt. Bei einigen Ausführungsformen werden ein oder mehrere der Komponenten der Reaktionen vor, bei oder im Anschluss an die Wiederaufnahme der Reaktionen ersetzt. Alternativ kann die Reaktion ohne Unterbrechung ablaufen (d.h. vom Start bis zur Vollendung) gelassen werden.
  • Der Nachweis der Amplifikationsprodukte ist für das Vorhandensein der Zielsequenz maßgeblich. Eine quantitative Analyse ist ebenfalls machbar. Direkte und indirekte Nachweismethoden (einschließlich der Quantifizierung) sind im Fachgebiet wohlbekannt. Zum Beispiel kann durch Vergleichen der Menge an aus einer Testprobe amplifiziertem Produkt, die eine unbekannte Menge eines die Zielsequenz enthaltenden Polynukleotids enthält, zum Produkt der Amplifikation einer Referenzprobe, die eine bekannte Menge eines die Zielsequenz enthaltenden Polynukleotids enthält, die Menge an Zielsequenz in der Testprobe bestimmt werden. Die Amplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung können auch auf die Analyse der Sequenzveränderungen und die Sequenzierung der Ziel-Nukleinsäure ausgeweitet werden. Weiterhin könnte der Nachweis zum Beispiel durch Untersuchen der Translationsprodukte aus den RNA-Amplifikationsprodukten erfolgen.
  • Amplifikationsmethoden der vorliegenden Erfindung
  • Im Folgenden finden sich Beispiele für die Amplifikationsmethoden der Erfindung. Es ist klar, dass verschiedene andere Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die oben wiedergegebene allgemeine Beschreibung vorgenommen werden können. Zum Beispiel bedeutet die Bezugnahme auf die Verwendung eines zusammengesetzten Primers, dass ein beliebiger der hierin beschriebenen zusammengesetzten Primer verwendet werden kann.
  • Bei einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Amplifizieren einer zu einer Ziel-Nukleotidsequenz komplementären Nukleotidsequenz bereitgestellt. Bei diesem Verfahren wird eine isotherme lineare Amplifikation der Nukleinsäuresequenz erzielt. Bei einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Polynukleotidsequenz bereitgestellt, wobei das amplifizierte Produkt Sense-RNA ist, was hierin manchmal als eine "verstärkte" lineare Amplifikationsmethode bezeichnet wird. Bei einer Ausführungsform wird eine Methode zur verstärkten isothermen linearen Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz, welches auf TSO basiert, bereitgestellt (im folgenden "Methode 1" genannt). Bei einer anderen Ausführungsform wird eine Methode zur verstärkten isothermen linearen Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz, welche eine Blockiersequenz ist und auf PTO basiert, bereitgestellt (im folgenden "Methode 2" genannt).
  • Lineare Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz, resultierend in komplementärem DNA-Produkt
  • Wenn nicht an die Transkription geknüpft, sorgt das Amplifikationsverfahren der Erfindung für eine isotherme lineare Amplifikation einer Ziel-Nukleinsäuresequenz. Das Verfahren verwendet einen einzelnen zusammengesetzten Primer. Bei einer Ausführungsform wendet das Verfahren außerdem eine Terminationssequenz an, z.B. eine Blockiersequenz, wie in Methode 2 beschrieben, oder ein TSO, wie in Methode 1 beschrieben. Methoden 1 und 2 sind nachstehend beschrieben. Sofern die lineare Amplifikation nicht mit einer Transkription verknüpft ist, sind die Komponenten und Schritte, die zur Bildung eines Komplexes führen, der eine Promotorsequenz für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase umfasst, nicht einbezogen.
  • Die Terminationssequenz (entweder TSO oder die Blockiersequenz-Komponente, sofern verwendet) wird zum Erhalt eines Produkts mit definiertem 3'-Ende hinzugefügt. Bei einigen Ausführungsformen hemmten die natürliche(n) Sequenz(en) innerhalb der Template 5' zur Primer-Bindungsstelle die Nukleinsäure-Polymerisation, so dass eine Termination der Primer-Extension erzielt wird. Solche natürlichen Sequenzen sind im Fachgebiet bekannt, zum Beispiel GC-reiche Sequenzen, oder können empirisch bestimmt werden. Die Verwendung einer Terminationssequenz ist bei Amplifikation von genomischer DNA von besonderem Nutzen, um ein definiertes Ende der Primer-Extension zu schaffen. Ist dieses Merkmal nicht erwünscht, so kann die isotherme lineare Amplifikation gemäß den Verfahren der Erfindung ohne Terminationssequenz durchgeführt werden. Die isotherme lineare Amplifikation verwendet außerdem zwei Enzyme, eine DNA-Polymerase und eine Ribonuklease wie RNaseH. Eine schematische Beschreibung der isothermen linearen Nukleinsäure-Amplifikation der Erfindung ist in 1A–1C gezeigt.
  • Ähnlich den nachstehend beschriebenen Methoden 1 und 2 ist die lineare Amplifikationsmethode auf das Amplifizieren eines einzelsträngigen DNA-Ziels ausgelegt. Ist das zu amplifizierende Ziel dsDNA, so wird das Ziel zunächst denaturiert, um ein einzelsträngiges Ziel zu erhalten. Die Denaturierung des Ziels kann unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Methoden wie einer Wärme- oder Alkalibehandlung durchgeführt werden. Ist das Ziel eine einzelsträngige RNA, wie etwa mRNA oder virale RNA, so wird das Ziel zum Erhalt eines cDNA-Ziels mittels im Gebiet bekannter Methoden transkribiert.
  • Wie in 1A–1C gezeigt, umfasst die isotherme lineare Amplifikationsmethode der Erfindung Schritte ähnlich den einleitenden Schritten der unten beschriebenen und in 2A–2C und 3A–3D gezeigten verstärkten linearen Amplifikationsmethoden (Methoden 1 und 2). Die Ziel-Nukleinsäure wird mit einem zusammengesetzten Primer, DNA-Polymerase, einer Ribonuklease wie RNaseH und wahlweise einer Blockiersequenz-Komponente oder TSO, wie oben beschrieben, kombiniert. Bei einer Ausführungsform enthält jede Amplifikationsreaktion zusammengesetzte Primer einer identischen Sequenz. Bei einer anderen Ausführungsform enthält jede Amplifikationsreaktion ein Gemisch aus zusammengesetzten Primer-Varianten, wobei die Varianten für zwei oder mehr homologe, doch nicht-identische Sequenzen steht, und worin alle zum Hybridisieren an dieselbe Ziel-Nukleinsäuresequenz in der Lage sind. Die Komplementarität beträgt vorzugsweise mindestens etwa 50%, bevorzugter mindestens etwa 75% und am bevorzugtesten mindestens etwa 90%. Zu Vorteilen dieser Ausführungsform zählt die Einführbarkeit verschiedener interessierender Sequenzen in die Primer-Extensionsprodukte. Bei noch einer anderen Ausführungsform enthält jede Amplifikationsreaktion ein Gemisch aus zusammengesetzten Primern, wobei die Primer für zwei oder mehr nicht-identische Sequenzen stehen, die von geringer oder keiner Homologie sind, und wobei die Primer vorzugsweise an verschiedene Ziel-Nukleinsäuresequenzen oder verschiedene Stellen entlang desselben Ziel-Nukleinsäurestrangs hybridisieren. Zu Vorteilen dieser Ausführungsform zählen die Multiplex-Detektion und/oder Analyse der Ziel-Nukleinsäuren durch Amplifikation einer Vielzahl von Ziel-Nukleinsäure-Spezies in einer einzigen Amplifikationsreaktion.
  • 1A–1C zeigt eine Ausführungsform, die eine Terminationssequenz enthält. Der zusammengesetzte Primer und die Terminationssequenz (TSO oder Blockiersequenz-Komponente) hybridisieren an denselben Strang des Ziels und bilden einen trimolekularen Komplex, XX (1A–1C). Das 3'-Ende des zusammengesetzten Primers wird durch die Polymerase entlang des Zielstrangs bis zur Stelle der Hybridisation des TSO oder der Blockiersequenz-Komponente zum Erhalt des Komplexes XXI (1A–1C) extendiert. Eine Ribonuklease wie RNaseH spaltet die RNA, generell den 5'-RNA-Abschnitt des extendierten Primers des Komplexes XXI (1A–1C) zum Erhalt des Komplexes XXII (1A–1C). Ein zweiter zusammengesetzter Primer bindet an Komplex XXII (1A–1C) durch Hybridisation des RNA-, generell des 5'-RNA-Abschnitts zum Erhalt des Komplexes XXIII (1A–1C). Der freie 3'-Abschnitt des gebundenen zusammengesetzten Primers verdrängt dann das 5'-Ende des Primer-Extensionsprodukts und hybridisiert an das Ziel zum Erhalt des Komplexes XXIV (1A–1C). Die Hybridisation des 3'-Endes des zusammengesetzten Primers an das Ziel ist generell gegenüber der Hybridisation des 5'-Endes des Primer-Extensionsprodukts begünstigt, da das hybridisierte 3'-Ende des Primers eine Bindungsstelle der DNA-Polymerase ist, die dann das 3'-Ende des Primers entlang des Ziels extendieren wird. Die Primer-Extension führt zur Verdrängung des ersten Primer-Extensionsprodukts zum Erhalt vom Komplex XXV (1A–1C). Der Vorgang wird zum Erhalt vielfacher einzelsträngiger DNA-Verdrängungsprodukte wiederholt, die generell komplementär zur Zielsequenz sind.
  • Die einzelsträngige DNA (d.h. die verdrängten Primer-Extensionsprodukte) der isothermen linearen Amplifikationsmethode ist mittels einer von vielen im Fachgebiet bekannten Detektionsmethoden ohne weiteres nachweisbar. Verschiedene für den Nachweis einzelsträngiger Nukleinsäure-Moleküle geeignete homogene oder heterogene Detektionsmethoden wurden zuvor beschrieben, einschließlich der Identifikation durch Größen- und/oder Wanderungseigenschaften bei der Gelelektrophorese oder durch Hybridisation an Sequenz-spezifische Sonden.
  • Die Detektion des Amplifikationsprodukts ist für das Vorhandensein der Zielsequenz indikativ. Eine quantitative Analyse ist ebenfalls machbar. Zum Beispiel kann durch Vergleichen der Menge an aus einer Testprobe amplifiziertem Produkt, die eine unbekannte Menge eines Polynukleotids enthält, welches eine Zielsequenz für das Produkt der Amplifikation einer Referenz-Probe enthält, die eine bekannte Menge eines die Zielsequenz enthaltenden Polynukleotids umfasst, die Menge an Zielsequenz in der Testprobe bestimmt werden. Die Amplifikationsmethoden der vorliegenden Erfindung können auch auf die Analyse von Sequenzveränderungen und die Sequenzierung der Ziel-Nukleinsäure ausgeweitet werden.
  • Die Erzeugung mindestens einer, mindestens 10, mindestens etwa 100, mindestens etwa 1000, mindestens etwa 105, mindestens etwa 107, mindestens etwa 109, mindestens etwa 1012 komplementärer Kopien jeder Kopie des Template-Polynukleotids kann erwartet werden, was zu einer mindestens 1-, mindestens 10-, mindestens 100-, mindestens 1000-, mindestens etwa 105-, mindestens etwa 107-, mindestens 109-, mindestens etwa 1012-fachen Steigerung bezüglich jeder Kopie des Template-Polynukleotids führt.
  • Verstärkte lineare Amplifikation, resultierend in Sense-RNA-Produkt
  • Mit der vorliegenden Erfindung werden auch Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Polynukleotidsequenz bereitgestellt, worin das amplifizierte Produkt eine RNA ist, die die Sense-Sequenz (d.h. dieselbe Sequenz wie das Ziel) enthält. Die Amplifikation der Ziel-Nukleinsäure gemäß Methode 1, was zur Erzeugung eines einzigartigen interme diären Amplifikationsprodukts führt, das mit Ziel- und Template-Switch-Oligonukleotid(TSO) verbundene Abschnitte umfasst, ermöglicht die Kopplung der linearen Amplifikation an die Transkription. Der durch die Hybridisation des Template-Switch-Oligonukleotids und des verdrängten Primer-Extensionsprodukts gebildete Komplex stellt ein Substrat für die Transkription durch die RNA-Polymerase dar, was ein RNA-Produkt desselben Sense wie die Ausgangs-Zielsequenz erzeugt. Entsprechend führt die Amplifikation des Nukleinsäure-Ziels gemäß Methode 2 zur Bildung eines verdrängten Primer-Extensionsprodukts, welches bei Hybridisation an das Promotor-Template-Oligonukleotid einen Komplex bildet, der ein Substrat für die RNA-Polymerase ist. Wie in Methode 1 führt dieser Vorgang zur Kopplung der linearen Amplifikation an die Transkription. Die Erzeugung von vorzugsweise mindestens etwa 1, bevorzugter mindestens etwa 50, sogar noch bevorzugter mindestens etwa 75, darüber hinaus noch bevorzugter mindestens etwa 100 und am bevorzugtesten mindestens etwa 1000 RNA-Transkriptionsprodukten aus jedem Primer-Extensionsprodukt wird erwartet, was zu vorzugsweise mindestens etwa einer 1-, bevorzugter mindestens etwa 50-, sogar noch bevorzugter mindestens etwa 75-, darüber hinaus noch bevorzugter mindestens etwa 100- und am bevorzugtesten mindestens etwa 1000-fachen Steigerung bei den nicht mit der Transkription verknüpften Amplifikationsmethoden führt.
  • Nachstehend sind zwei Beispiele für die Methoden beschrieben.
  • Methode 1 – Auf TSO basierende verstärkte lineare Nukleinsäure-Amplifikation
  • Bei einer Ausführungsform ist die auf TSO basierende lineare Amplifikationsmethode der vorliegenden Erfindung an die Transkription von den Primer-Extensionsprodukten geknüpft, wodurch eine verstärkte Nukleinsäure-Amplifikation erzielt wird. Eine schematische Beschreibung dieser neuartigen Amplifikationsmethode, der Methode 1, ist in 2A–2C gezeigt.
  • Die auf TSO basierende Nukleinsäure-Amplifikationsmethode der Erfindung verwendet einen einzelnen zusammengesetzten Primer, wie oben beschrieben. Bei einem zweiten, bei der Amplifikationsmethode der Erfindung verwendeten Oligonukleotid handelt es sich um ein Template-Switch-Oligonukleotid (TSO), wie ebenfalls oben beschrieben. Die Amplifikationsmethode der Erfindung verwendet die folgenden Enzyme: eine DNA-Polymerase, eine Ribonuklease wie RNaseH und eine DNA-abhängige RNA-Polymerase. Das zu amplifizierende Nukleinsäure-Ziel kann DNA oder RNA sein. Die Amplifikation eines RNA-Ziels erfordert eine anfängliche cDNA-Synthese, wie im Fachgebiet bekannt.
  • Mit der neuartigen, auf TSO basierenden verstärkten linearen Amplifikationsmethode der vorliegenden Erfindung können vielfache Kopien eines zur Ziel-DNA-Sequenz homologen (d.h. Sense) RNA-Produkts erzeugt werden.
  • Die einzelsträngige Ziel-Nukleinsäure wird mit dem zusammengesetzten Primer, einem TSO-Oligonukleotid, DNA-Polymerase, Ribonuklease, z.B. RNaseH, einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase und Nukleotiden, z.B. Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs) und Ribonukleosidtriphosphaten (rNTPs) in einem für die Nukleinsäure-Hybridisation und -Amplifikation geeigneten Reaktionsmedium kombiniert, wie im Fachgebiet bekannt. Ein geeignetes Reaktionsmedium und Bedingungen sind wie oben beschrieben. Bei einer Ausführungsform wird die Transkription bei einer unterschiedlichen Temperatur, allgemein einer niedrigeren, als der bei den vorangegangenen Schritten vorgenommen. Bei einer anderen Ausführungsform werden alle Schritte der Methoden isotherm vorgenommen.
  • Bei einer Ausführungsform enthält jede Amplifikationsreaktion zusammengesetzte Primer einer identischen Sequenz. Bei einer anderen Ausführungsform enthält jede Amplifikationsreaktion ein Gemisch aus zusammengesetzten Primer-Varianten, wobei die Varianten zwei oder mehrere homologe, doch nicht-identische Sequenzen darstellen und wobei alle zum Hybridisieren an dieselbe Ziel-Nukleinsäuresequenz in der Lage sind. Die Homologie (Sequenzidentität) beträgt vorzugsweise mindestens etwa 50%, bevorzugter mindestens etwa 75% und am bevorzugtesten mindestens etwa 90%. Die Vorteile dieser Ausführungsform beinhalten die Einführbarkeit verschiedener interessierender Sequenzen in die Primer-Extensionsprodukte. Bei noch einer weiteren Ausführungsform enthält jede Amplifikationsreaktion ein Gemisch aus zusammengesetzten Primern, wobei die Primer zwei oder mehrere nicht-identische Sequenzen darstellen, die von geringer oder keiner Homologie sind, und wobei die Primer präferentiell an verschiedene Ziel-Nukleinsäuresequenzen oder verschiedene Stellen entlang desselben Ziel-Nukleinsäuresstrangs hybridisieren. Zu den Vorteilen dieser Ausführungsform zählen die Multiplex-Detektion und/oder Analyse der Ziel-Nukleinsäuren durch Amplifikation einer Vielzahl von Ziel-Nukleinsäure-Spezies in einer einzelnen Amplifikationsreaktion.
  • Bei einer Ausführungsform fungiert das TSO als eine Terminationssequenz und verfügt über eine Propromotor-Sequenz. Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das TSO keine Propromotor-Sequenz. Bei dieser Ausführungsform wird eine Propromotor-Sequenz durch ein anderes Oligonukleotid, z.B. ein PTO, separat bereitgestellt, das eine Propromotor-Sequenz umfasst und an den 3'-Abschnitt des Primer-Extensionsprodukts so hybridisierbar ist, dass die Transkription des Primer-Extensionsprodukts erfolgen kann.
  • Der einzelne zusammengesetzte Primer und das TSO hybridisieren dann an denselben Strang der zu amplifizierenden Nukleinsäure. Die beiden Oligonukleotide können der Probe, bei der das Vorhandensein des Nukleinsäure-Ziels vermutet wird, vor dem Denaturierungsschritt der Ziel-Nukleinsäure zugegeben werden. Die Hybridisation der beiden Oligonukleotide an den Ziel-Strang führt zur Bildung des trimolekularen Komplexes I (2A–2C).
  • Die Primer-Extension erfolgt durch eine DNA-Polymerase. Der Primer wird entlang des Ziel-Nukleinsäurestrangs des Komplexes I (2A–2C) bis zur Stelle der TSO-Hybridisation extendiert. Das Template-Switching vom Zielstrang zum unhybridisierten 5'-Abschnitt des TSO und die weitere Primer-Extension entlang der TSO-Template führt zur Bildung des trimolekularen Komplexes II. Letzterer umfasst eine Ziel-Nukleinsäure, das TSO und das erste Primer-Extensionsprodukt. Beim ersten Primer-Extensionsprodukt handelt es sich um eine einmalige DNA, die sowohl den Ziel-abhängigen Abschnitt (d.h. eine zur Ziel-Nukleinsäure komplementäre Sequenz) als auch einen TSO-abhängigen Abschnitt (d.h. eine zum unhybridisierten Abschnitt des TSO komplementäre Sequenz) umfasst.
  • Bei Komplex II (2A–2C) handelt es sich um ein Substrat sowohl für eine RNA-Polymerase als auch eine Ribonuklease wie RNaseH. Die DNA-abhängige RNA-Polymerase bindet an den funktionellen ds-Promotor des Komplexes II und transkribiert das erste Primer-Extensionsprodukt, wodurch ein Sense-RNA-Produkt III (2A–2C) entsteht. Eine Ribonuklease, z.B. RNaseH, die für die Zerlegung des RNA-Strangs eines RNA/DNA-Heteroduplex spezifisch ist, zerlegt den 5'-Abschnitt des Primer-Extensionsprodukts in Komplex II, was den trimolekularen Komplex IV ergibt.
  • Freier zusammengesetzter Primer hybridisiert an die Primer-komplementäre Stelle der Ziel-Nukleinsäure in Komplex IV (2A–2C). Diese Hybridisation führt zur Bildung des Komplexes V (2A–2C), worin lediglich der RNA-Abschnitt, allgemein der 5'-RNA-Abschnitt, des Primers an den Zielstrang hybridisiert wird. Die Verdrängung des 5'-gelegensten Abschnitts des Primer-Extensionsprodukts durch den 3'-DNA-Abschnitt des teilweise hybridisierten Primers führt zur Bildung des Komplexes VI (2A–2C), welcher ein Substrat für eine DNA-Polymerase ist. Die Extension des Primers entlang des Zielstrangs (VII; 2A–2C) führt zur Verdrängung des ersten Primer-Extensionsprodukts vom Komplex. Wiederholte Primer-Extensionen und Strangverdrängungen führen zur Erzeugung vielfacher Kopien der Polynukleotide, die zur Ziel-Nukleinsäure zumindest im wesentlichen komplementär sind.
  • Das wie oben beschrieben erzeugte Primer-Extensionsprodukt wird als eine Template für die Transkription bei der Ausführungsform verwendet, bei der TSO, das eine Propromotor-Sequenz umfasst, vorhanden ist. Das verdrängte Primer-Extensionsprodukt (VIII; 2A–2C) hybridisiert an das freie TSO-Oligonukleotid, was den Teilduplex IX (2A–2C) ergibt. Komplex (Duplex) IX umfasst einen doppelsträngigen Abschnitt an einem Ende und zwei nicht-komplementäre Einzelstränge, die jeweils vom Primer-Extensionsprodukt und dem TSO stammen. Der doppelsträngige Abschnitt dieses Teilduplex enthält einen völlig funktionellen doppelsträngigen Promotor für die DNA-abhängige RNA-Polymerase. Letzterer bindet an den Promotor des Teilduplex IX und transkribiert das Primer-Extensionsprodukt, was vielfache Kopien eines Sense-RNA-Produkts X (2A–2C) ergibt.
  • Die Produkte der oben beschriebenen Amplifikation können entweder durch homogene oder heterogene Detektionsmethoden nachgewiesen werden, einschließlich der Identifikation durch Größen- und/oder Wanderungseigenschaften bei der Gelelektrophorese oder durch Hybridisation an Sequenz-spezifische Sonden. Der Nachweis des Amplifikationsprodukts ist für das Vorhandensein der Ziel-Nukleinsäure indikativ. Eine quantitative Analyse ist ebenfalls möglich. Zum Beispiel ist durch Vergleich der Menge an Produkt, das aus einer Testprobe amplifiziert wurde, die eine unbekannte Menge eines Polynukleotids enthält, welches eine Zielsequenz für das Amplifikationsprodukt einer Referenz-Probe enthält, die eine bekannte Menge eines Polynukleotids aufweist, das die Zielsequenz enthält, die Menge an Zielsequenz in der Testprobe bestimmbar. Eine Erweiterung der neuen Amplifikationsmethode auf die Analyse von Sequenzveränderungen und die Sequenzierung der Ziel-Nukleinsäure ist ebenfalls machbar, wie oben beschrieben.
  • Methode 2 – Auf Blockiersequenz basierende verstärkte Nukleinsäure-Amplifikation
  • Bei einer anderen Ausführungsform ist die auf einer Blockiersequenz basierende lineare Amplifikationsmethode der vorliegenden Erfindung an die Transkription von den Primer-Extensionsprodukten geknüpft, wodurch eine verstärkte Nukleinsäure-Amplifikation erzielt wird. Diese alternative verstärkte lineare Amplifikation, die Methode 2, die keinen Template-Switch-Schritt einbezieht, ist in 3A–3D gezeigt.
  • Methode 2 verwendet den einzelnen zusammengesetzten Primer wie bei der oben beschriebenen Methode 1, eine Blockiersequenz-Komponente, die entweder ein Oligonukleotid oder eine Oligonukleotid-Analogon ist, welches, wie oben beschrieben, außerdem zum Hybridisieren an eine Sequenz auf demselben Ziel-Nukleinsäurestrang wie der einzelne Primer fähig ist, und ein drittes Oligonukleotid, die Promotor-Template (PTO), die, wie oben beschrieben, einen 3'-Abschnitt umfasst, welcher zum Hybridisieren an das 3'-Ende des verdrängten Extensionsprodukts fähig ist (und vorzugsweise komplementär ist), und einen 5'-Abschnitt, welcher an seinem 5'-Ende eine Sequenz eines Promotors für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase enthält. Wie bei der oben beschriebenen TSO ist die unmittelbar an die Promotor-Sequenz angrenzende Sequenz so gestaltet, dass sie für eine vorzugsweise optimale transkriptionelle Aktivität durch die bei der Amplifikation gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendete RNA-Polymerase sorgt. Die Blockiersequenz-Komponente ist so gestaltet, dass sie an die Zielsequenz an einer Stelle hybridisiert, die stromaufwärts, zum 5'-Ende des Ziels hin, relativ zur Hybridisationsstelle des einzelnen Primers, lokalisiert ist. Als alternative Angabe, und wie oben beschrieben, hybridisiert die Blockiersequenz an ein Segment der Ziel-Nukleinsäuresequenz 5' der Position in der Zielsequenz, die komplementär zum 3'-Ende des Primer-Extensionsprodukts ist. Die Blockiersequenz bindet bei ausreichend hoher Affinität, um die Primer-Extension an der Stelle der Blocker-Hybridisation an das Ziel zu blockieren. Dieses Merkmal sorgt für einen starken Stopp der Primer-Extension durch die Polymerase und definiert das 3'-Ende des Primer-Extensionsprodukts.
  • Wie in Methode 1, ist die Ziel-Nukleinsäure für die Amplifikation gemäß Methode 2 eine einzelsträngige DNA. Ist die Ziel-Nukleinsäure eine dsDNA, so wird das Ziel zunächst durch Denaturierung einzelsträngig gemacht. Die Denaturierung des dsDNA-Ziels kann durch Erhitzen oder eine andere im Fachgebiet bekannte Methode, z.B. eine Alkalibehandlung, vorgenommen werden. Ist die Ziel-Nukleinsäure RNA, z.B. mRNA, so wird das Ziel zunächst durch im Fachgebiet bekannte Methoden revers transkribiert, um eine cDNA zu erzeugen, die dann gemäß der Methode der Erfindung amplifiziert wird.
  • Das einzelsträngige Nukleinsäure-Ziel wird mit dem einzelnen zusammengesetzten Primer, der Blockierkomponente, der Propromotor-Template (PTO), DNA-Polymerase, Ribonuklease wie RNaseH, einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase und Nukleotiden, wie z.B. NTPs (z.B. dNTPs und rNTPs) kombiniert, wie für Methode 1 beschrieben wurde. Ein geeignetes Reaktionsmedium und die Bedingungen sind wie oben beschrieben. Bei einer Ausführungsform wird die Transkription bei einer unterschiedlichen Temperatur, allgemein einer niedrigeren, als der der vorangegangenen Schritte durchgeführt. Bei einer anderen Ausführungsform werden alle Schritte der Methoden isotherm vorgenommen.
  • Bei einer Ausführungsform enthält jede Amplifikationsreaktion zusammengesetzte Primer einer identischen Sequenz. Bei einer anderen Ausführungsform enthält jede Amplifikationsreaktion ein Gemisch aus zusammengesetzten Primer-Varianten, wobei die Varianten zwei oder mehrere homologe, jedoch nicht-identische Sequenzen darstellen und wobei alle zum Hybridisieren an dieselbe Ziel-Nukleinsäuresequenz fähig sind. Die Homologie (Sequenzidentität) beträgt vorzugsweise mindestens etwa 50%, bevorzugter mindestens etwa 75% und am bevorzugtesten mindestens etwa 90%. Zu den Vorteilen dieser Ausführungsform zählt die Einführbarkeit unterschiedlicher interessierender Sequenzen in die Primer-Extensionsprodukte. Bei noch einer weiteren Ausführungsform enthält jede Amplifikationsreaktion ein Gemisch von zusammengesetzten Primern, wobei die Primer zwei oder mehrere nicht-identische Sequenzen darstellen, die von geringer oder keiner Homologie sind, und wobei die Primer präferentiell an unterschiedliche Ziel-Nukleinsäuresequenzen oder unterschiedliche Stellen entlang desselben Ziel-Nukleinsäurestrangs hybridisieren. Zu den Vorteilen dieser Ausführungsform zählt die Multiplex-Detektion und/oder Analyse der Ziel-Nukleinsäuren durch Amplifikation einer Vielzahl von Ziel-Nukleinsäure-Spezies in einer einzigen Amplifikationsreaktion.
  • Der einzelne zusammengesetzte Primer und die Blockiersequenz-Komponente hybridisieren an denselben Zielstrang, wobei sie einen trimolekularen Komplex bilden. Der Primer wird entlang des Ziels bis zur Hybridisationsstelle der Blockiersequenz extendiert, wodurch Komplex XII (3A–3D) gebildet wird.
  • Wie bei Methode 1 spaltet eine Ribonuklease, z.B. RNaseH, den RNA-Abschnitt, allgemein den 5'-RNA-Abschnitt, des einzelnen zusammengesetzten Primers des Komplex XII, wodurch Komplex XIII (3A–3D) entsteht. Wie oben beschrieben, ist das Enzym zum Spalten des RNA-Strangs von einem RNA/DNA-Hybrid spezifisch und verdaut keine einzelsträngige RNA. Daher zerlegt die Ribonuklease den freien zusammengesetzten Primer nicht. Die folgenden Schritte, wie in 3A–3D veranschaulicht, der Primer-Hybridisation (XIV), der Verdrängung des 5'-Endes des Primer-Extensionsprodukts durch den 3'-DNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers (XV), der Primer-Extension und der Verdrängung des ersten Primer-Extensionsprodukts (XVI) verlaufen wie bei Methode 1, was vielfache Kopien des verdrängten Extensionsprodukts ergibt (XVII). Anders als das Verdrängungsprodukt aus Methode 1 ist XVII zur Zielsequenz völlig komplementär und umfasst keinen 3'-Endabschnitt, der nicht komplementär zum Ziel ist. Wiederholte Primer-Extensionen und Strangver drängungen führen zur Erzeugung vielfacher Kopien der Polynukleotide, die zur Ziel-Nukleinsäure komplementär sind.
  • Das Promotor-Template-Oligonukleotid (PTO) bindet an das verdrängte Extensionsprodukt, was den Komplex XVIII (3A–3D) ergibt, durch Hybridisation des 3'-Endabschnitts (A) der Propromotor-Template an das 3'-Ende des verdrängten Primer-Extensionsprodukts. Wie oben beschrieben kann das 3'-Ende des PTO blockiert sein oder auch nicht. Ist das 3'-Ende der Propromotor-Template nicht blockiert, so wird die Template entlang des verdrängten Primer-Extensionsprodukts extendiert. Das 3'-Ende des verdrängten Produkts wird durch die Nukleotid-(DNA)-Polymerase entlang des B-Abschnitts (siehe 3A–3D) der hybridisierten Propromotor-Template extendiert, was Komplex XIX ergibt, welche an ihrem einen Ende eine ds-Promotor-Sequenz umfasst, die durch die DNA-abhängige RNA-Polymerase genutzt werden kann. Komplex XIX ist in 3A–3D als das Produkt der Hybridisation einer Promotor-Template dargestellt, in der das 3'-Ende für eine Extension durch die Polymerase blockiert ist. Ist alternativ das 3'-Ende der Promotor-Template nicht blockiert, so führt die Extension des 3'-Endes entlang des verdrängten Primer-Extensionsprodukts zur Bildung eines vollständig doppelsträngigen Komplexes. Die DNA-abhängige RNA-Polymerase transkribiert das extendierte verdrängte Primer-Extensionsprodukt des Komplexes XIX, in beiden Formen (bei der Wahl der RNA-Polymerase muss ihre Fähigkeit zum Transkribieren von einer ds und/oder ssDNA-Template berücksichtigt werden), d.h. entweder den Teilduplex oder die vollständig doppelsträngigen Duplexformen des Komplexes. Mittels dieses Transkriptionsschritts werden vielfache Kopien eines einzelsträngigen RNA-Produkts erzeugt.
  • Die Produkte der oben beschriebenen Amplifikation können entweder durch homogene oder durch heterogene Detektionsmethoden nachgewiesen werden, einschließlich der Identifikation mittels Größen- und/oder Wanderungseigenschaften bei der Gelelektrophorese oder durch die Hybridisation an Sequenz-spezifische Sonden. Der Nachweis des Amplifikationsprodukts ist für das Vorhandensein der Ziel-Nukleinsäure indikativ. Eine quantitative Analyse ist ebenfalls möglich. Zum Beispiel kann durch Vergleich der Menge an aus einer Testprobe amplifiziertem Produkt, die eine unbekannte Menge eines Polynukleotids enthält, welches eine Zielsequenz für das Amplifikationsprodukt aus einer Referenzprobe enthält, die eine bekannte Menge eines Polynukleotids umfasst, welches die Zielsequenz enthält, die Menge an Zielsequenz in der Testprobe bestimmt werden. Die Amplifikationsmethoden der vorliegenden Erfindung können auch auf die Analyse von Sequenzveränderungen und die Sequenzierung der Ziel-Nukleinsäure, wie oben beschrieben, ausgeweitet werden.
  • Verfahren unter Anwendung der Amplifikationsmethoden und Zusammensetzungen der Erfindung
  • Die Methoden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können für vielfältige Zwecke ausgenützt werden. Für Veranschaulichungszwecke werden Methoden zur Sequenzierung, Genotypisierung (Nukleinsäure-Mutationsdetektion), Mikroarray-Herstellung unter Verwendung der mittels der Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugten amplifizierten Nukleinsäure-Produkte und zur Charakterisierung der Nukleinsäure-Sequenzen beschrieben.
  • Isotherme Sequenzierung definierter Nukleinsäure-Ziele unter Anwendung der linearen Amplifikationsmethode der Erfindung
  • Die isothermen linearen Amplifikationsmethoden der Erfindung sind zum Beispiel zur Sequenzierung einer definierten Nukleinsäure-Zielsequenz nützlich. Der Sequenzierungsprozess wird ausgeführt, wie für die hierin beschriebenen Amplifikationsmethoden erläutert. Über die Nukleotide hinaus, z.B. natürliche Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs), die für die Amplifikationsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, enthält das Sequenzierungs-Reaktionsgemisch außerdem die geeigneten Nukleotidtriphosphat-Analoga, die markiert oder unmarkiert sein können, die bei Einbau in ein Primer-Extensionsprodukt die Termination der Nukleotid-Polymerisation bewirken. Diese Analoga werden häufig bei anderen Sequenzierungsmethoden verwendet und sind im Fachgebiet wohlbekannt, wie etwa die Didesoxyribonukleotide. Sie können markiert sein, z.B. mit Fluorochromen oder Radioisotopen. Die Markierungen können auch Marker sein, die sich zur Massenspektroskopie eignen. Die Markierung kann auch ein kleines Molekül sein, das ein Partner eines spezifischen Bindungspaares ist, und können im Anschluss an die Bindung des anderen Partners des spezifischen Bindungspaars, wie etwa Biotin und Streptavidin, jeweils mit dem letzten, an ein Enzym konjugierten Partner des Bindungspaars, welches die Erzeugung eines nachweisbaren Signals katalysiert, das mittels Verfahren wie der Colorimetrie, Fluorometrie oder Chemilumineszenz detektiert werden könnte, nachgewiesen werden. All die obigen Beispiele sind im Fachgebiet wohlbekannt. Diese werden in das Primer-Extensionsprodukt durch die Polymerase eingebaut und dienen zum Stoppen einer weiteren Extension entlang der Zielsequenz. Die resultierenden verkürzten Extensionsprodukte werden markiert. Die angesammelten vervielfachten verdrängten Primer-Extensionsprodukte variieren in ihrer Länge entsprechend der Stellen des Einbaus jedes der Analoga, die die verschiedenen Sequenzlokalisationen eines komplementären Nukleotids auf der Zielsequenz repräsentieren.
  • Die Analyse der Reaktionsprodukte zur Klärung der Sequenzinformation kann unter Anwendung einer von verschiedenen, im Fachgebiet bekannten Methoden durchgeführt werden. Zu diesen Methoden zählen die Gelelektrophorese und die Detektion der markierten Banden unter Verwendung eines geeigneten Scanners, die Sequenzierung durch Gelelektrophorese und der direkte Nachweis der radiomarkierten Bande durch Phosphoreszenz, z.B. mit einem Molecular Dynamics-Lesegerät, der Kapillarelektrophorese, versehen mit einem für die bei der Reaktion verwendeten Markierungen spezifischen Detektor und ähnliches. Die Markierung kann auch ein Ligand für ein Bindungsprotein sein, welches zum Nachweis der Markierung in Kombination mit einem an das Bindungsprotein konjugierten Enzym verwendet wird, wie etwa einem Biotin-markierten Kettenterminator und an ein Enzym konjugiertem Streptavidin. Die Markierung wird durch die enzymatische Aktivität des Enzyms nachgewiesen, die ein nachweisbares Signal erzeugt. Wie bei anderen im Fachgebiet bekannten Sequenzierungsmethoden werden die Sequenzierungsreaktionen für die 4 Nukleotid-Typen (A, C, G, T) entweder in einem einzigen Reaktionsgefäß oder in separaten Reaktionsgefäßen (jeweils eines für jeden der vier Nukleotid-Typen) vorgenommen. Die Wahl der anzuwendenden Methode hängt von praktischen Überlegungen ab, die für einen Fachmann des Gebiets leicht erkennbar sein werden, wie etwa bezüglich der verwendeten Nukleotidtriphosphat-Analoga und/oder -Markierungen. Ist daher zum Beispiel jedes der Analoga unterschiedlich markiert, so kann die Sequenzierungsreaktion in einem einzigen Gefäß vorgenommen werden. Die Überlegungen bezüglich der Wahl des Reagenz und der Reaktionsbedingungen für eine optimale Ausführung der Sequenzierungsanalyse gemäß den Verfahren der Erfindung sind ähnlich jenen für andere zuvor beschriebene Sequenzierungsmethoden. Das Reagenz und die Reaktionsbedingungen sollten wie oben für die linearen Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden der vorliegenden Erfindung beschrieben sein.
  • Isotherme Sequenzierung definierter Nukleinsäure-Ziele unter Anwendung der verstärkten linearen Amplifikationsmethoden (Methoden 1 und 2) der Erfindung
  • Die auf Transkription basierende Sequenzierung wurde zuvor zum Beispiel bei Sasaki et al., PNAS, 95:3455–3460, 1998, beschrieben. Die Einbeziehung von rNTP-Analoga, die markiert oder unmarkiert sein können, die bei Einbau in ein RNA-Transkript eine Termination der rNTP-Polymerisation im Reaktionsgemisch bei den verstärkten linearen Amplifikationsmethoden bewirkt, führt zur Erzeugung verkürzter RNA-Produkte, die aus der Blockierung der RNA-Polymerase an den Einbaustellen der Analoga resultieren. Geeignete rNTP-Analoga sind im Fachgebiet bekannt. Letztere werden gegenüber dem komplementären Nukleotid am verdrängten Extensionsprodukt in den relevanten Komplexen entsprechend der angewendeten Methode (Methode 1 oder Methode 2) eingebaut.
  • Die Analyse der Reaktionsprodukte zur Klärung der Sequenzinformation wird unter Anwendung einer aus einer Vielzahl von Methoden durchgeführt, wie im Fachgebiet bekannt. Zu diesen Methoden zählen die oben beschriebenen Methoden für die Sequenzierung definierter Nukleinsäure-Ziele unter Anwendung der (nicht-verstärkten) linearen Amplifikationsmethoden der Erfindung.
  • Auf dem RNA-Abschnitt basierende isotherme Mutationsdetektion unter Anwendung der Amplifikationsmethoden der Erfindung
  • Die einzigartigen Eigenschaften des zusammengesetzten Primers zur Verwendung bei den isothermen Amplifikationsmethoden der Erfindung bieten die Grundlage für eine isotherme Methode zum Nachweis definierter Mutationen, oder polymorpher Stellen (wie etwa SNPs), in einer Ziel-Nukleinsäuresequenz. Die Methode ist zum Genotypi sieren, Detektieren einer Mutation, die zu Arzneimittelresistenz führt, und ähnlichem nützlich. Diese Methoden sind zum Charakterisieren von Sequenzen in einer Region im Template-Strang anwendbar, die generell an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers hybridisieren – daher die Bezugnahme auf "definierte" Mutationen, die bezüglich ihrer Lokalisation definiert sind.
  • Bei der für die Methode der Erfindung geeigneten Ziel-Nukleinsäuresequenz handelt es sich um ssDNA. Die Präparierung eines ssDNA-Ziels aus einem dsDNA-Ziel oder einem RNA-Ziel kann jedoch wie oben beschrieben und im Fachgebiet bekannt vorgenommen werden.
  • Eine Ausführungsform der Methode der Erfindung ist in 4 schematisch dargestellt. Bei dieser Ausführungsform ist/sind der/die RNA-Abschnitt(e) des zusammengesetzten Primers auf eine Komplementarität zur Sequenz der Testziel-Nukleinsäure hin gestaltet, in welcher das Vorhandensein einer Sequenzveränderung vermutet wird. Als alternative Angabe umfasst der Primer ein oder mehrere RNA-Abschnitte, die eine Sequenz umfassen, die komplementär zur Referenzsequenz (zum Beispiel eine Wildtyp-Sequenz) ist, gegen die die Sequenz in der Testziel-Nukleinsäure verglichen werden soll. Bei einigen Ausführungsformen sind die veränderte Sequenz (d.h. die eine Sequenzveränderung umfassende Sequenz) und die Referenzsequenz Allele. Die Sequenzveränderung kann eine einzelne Nukleotid-Substitution, eine Deletion oder Insertion sein. Die Stelle der Sequenzveränderung ist in 4 schematisch durch X markiert.
  • Bei einer anderen Ausführungsform ist/sind der/die RNA-Abschnitt(e) des zusammengesetzten Primers auf eine Komplementarität zur in der Testziel-Nukleinsäure vermuteten veränderten Sequenz hin gestaltet. Als alternative Angabe umfasst der Primer ein oder mehrere RNA-Abschnitte, die eine Sequenz umfassen, die zur Testziel-Nukleinsäure komplementär und daher nicht zur Referenzsequenz (zum Beispiel eine Wildtyp-Sequenz) komplementär ist, gegen die die Sequenz in der Testziel-Nukleinsäure verglichen werden soll. Bei einigen Ausführungsformen sind die veränderte Sequenz (d.h. die eine Sequenzveränderung umfassende Sequenz) und die Referenzsequenz Allele.
  • Der RNA-Abschnitt, allgemein ein 5'-RNA-Abschnitt, des zusammengesetzten Primers umfasst eine Sequenz, die zu einer bekannten normalen Wildtyp-Sequenz oder einem bekannten Mutanten oder einem polymorphen Genotyp komplementär ist. Allgemein umfasst ein geeigneter zusammengesetzter Primer einen RNA-Abschnitt, der das präferentielle Hybridisieren des Primers an eine Ziel-Nukleinsäure erlaubt, wenn die Ziel-Nukleinsäure eine zum RNA-Abschnitt des Primers komplementäre Sequenz aufweist, verglichen zum Vorliegen einer Fehlpaarung (d.h. der Primer besitzt die mutierte Sequenz, das Ziel jedoch nicht, oder umgekehrt), wobei die Ziel-Nukleinsäure ein gebundenes Primer-Extensionsprodukt und einen abgespaltenen 5'-RNA-Abschnitt aufweist. Wie in 4 gezeigt, verhindert das Vorhandensein der Sequenzveränderung nicht generell den einleitenden Schritt der Amplifikation. Der zusammengesetzte Primer hybridisiert an die Zielsequenz, was den ersten trimolekularen Komplex erzeugt, und wird extendiert. Eine Ribonuklease wie RNaseH spaltet dann den RNA-Abschnitt des extendierten Primers des Komplexes. Zwar ist es wahrscheinlich, dass das Vorhandensein eines fehlgepaarten Basenpaars das Spaltungsmuster des RNA/DNA-Hybrids beeinflusst, doch findet die Spaltung nichtsdestotrotz wahrscheinlich statt. Der nächste Schritt der Bindung eines zusammengesetzten Primers an den Komplex durch Hybridisation des 5'-RNA-Abschnitts wird durch eine Fehlpaarung gehemmt, vorzugsweise verhindert. Diese Wirkung hängt von Faktoren wie der Größe des hybridisierenden Oligonukleotids und der Stringenz der Reaktionsbedingungen ab. Diese Faktoren werden bei der Konstruktion des zusammengesetzten Primers gemäß im Fachgebiet wohlbekannter und routinemäßiger Techniken berücksichtigt. Auch ist es möglich, dass die Fehlpaarung die Spaltung des oder der RNA-Abschnitte des zusammengesetzten Primers hemmt, was die Amplifikation der Zielsequenz verhindert. Eine andere Möglichkeit ist, dass die Fehlpaarung zu einer geringeren Spaltleistung des RNA-Abschnitts des Primers führt, was zu einer geringeren Amplifikationsleistung oder der Erzeugung von geringeren Mengen an Amplifikationsprodukt führt. Die Unfähigkeit des zusammengesetzten Primers, bei diesem Amplifikationsschritt an das Ziel zu hybridisieren, verhindert weitere Schritte der Strangverdrängung bei der Primer-Extension und der Erzeugung vielfacher Kopien der Amplifikationsprodukte. Es ist klar, dass die Detektion einer Mutation mittels der Methoden der vorliegenden Erfindung auf der Abwesenheit oder dem Vorhandensein eines Primer-Extensionsprodukts, oder quantitativen Vergleichen der Menge an angesammelten Primer-Extensionsprodukten basieren kann. Umfasst der zusammengesetzte Primer beispielsweise die Referenzsequenz (zum Beispiel Wildtyp), so kann das Vorhandensein einer Mutation im Zielstrang zu nicht nachweisbaren Amplifikationsprodukten führen; alternativ kann es zu nachweisbaren Produkten führen, jedoch zu geringeren Mengen als bei einer Produktion aus einem Templatestrang ohne die Mutation.
  • Umfasst ein zusammengesetzter Primer einen RNA-Abschnitt, allgemein einen 5'-RNA-Abschnitt, der vollkommen komplementär zu einem mutanten Genotyp ist, so wird die Amplifikation einer Sequenz, die vom normalen Genotyp stammt, verhindert werden, während ein mutantes Genotyp-Ziel amplifiziert wird. Daher wird in diesem Fall der Nachweis und/oder die quantitative Bestimmung der vervielfachten Kopien des Amplifikationsprodukts für das Vorhandensein einer Zielsequenz des mutanten Genotyps indikativ sein. Zum Beispiel könnten Parallelreaktionen, die entweder die interessierende Nukleinsäureprobe oder die Referenzprobe der Ziel-Nukleinsäure mit einer Wildtyp-Sequenz enthalten, vorgenommen werden. Die Ansammlung einer größeren Menge an Primer-Extensionsprodukten in der ersteren im Vergleich zur letzteren Reaktion wäre für das Vorhandensein eines mutanten Genotyps in der Probe von Interesse indikativ. Umfasst alternativ der zusammengesetzte Primer eine 5'-RNA-Sequenz, die vollkommen komplementär zu einer normalen Genotyp-Sequenz des Testziels ist, so wird die Amplifikation einer Zielsequenz des mutanten Genotyps verhindert, wobei der Nachweis und/oder die quantitative Bestimmung der Amplifikationsprodukte für einen normalen Genotyp indikativ ist.
  • Jegliche der Amplifikationsmethoden der vorliegenden Erfindung ist zum Nachweis einer Mutation, wie oben beschrieben, geeignet.
  • Auf 3'-Nukleotid basierende isotherme Mutationsdetektion unter Anwendung der Amplifikationsmethoden der Erfindung
  • Bei dieser Methode wird die Komplementarität des 3'-gelegensten Nukleotids eines zusammengesetzten Primers zum Charakterisieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer mutierten Sequenz ausgenützt. Für die Primer-Extension ist die Hybridisation des 3'-gelegensten Nukleotids des zusammengesetzten Primers an eine Ziel-Nukleinsäure erforderlich. Daher indiziert Produktamplifikation, dass die Ziel-Nukleinsäure die durch das 3'-gelegenste Nukleotid des zusammengesetzten Primers definierte Sequenz enthält. Eine verminderte oder nicht erfolgte Produktamplifikation weist dagegen darauf hin, dass die Ziel-Nukleinsäure eine Sequenzveränderung enthält, die zumindest die zum 3'-gelegensten Nukleotid des zusammengesetzten Primers komplementäre Base umfasst. Das Fehlen der Sequenz kann an einer Punktmutation, einem Einzelnukleotid-Polymorphismus, der Insertion oder Deletion eines Sequenzsegments, das die durch das 3'-gelegenste Nukleotid definierte Sequenz beinhaltet.
  • Bei einer Ausführungsform werden Genotyp-spezifische Primer, die so konstruiert sind, dass sie das 3'-gelegenste Nukleotid entsprechend den verschiedenen Sequenzen an der Nukleotid-Positionsvariante (zum Beispiel aufgrund von Allelismus) aufweisen, zur Amplifikation gemäß den Methoden der Erfindung verwendet. Das Vorhandensein der Amplifikationsprodukte würde darauf hinweisen, dass die Ziel-Nukleinsäure die Sequenz umfasst, die durch das 3'-gelegenste Nukleotid des speziell verwendeten Primers definiert ist. Die Abwesenheit oder das Fehlen (im Vergleich zu einer Referenz-Nukleinsäure, deren Sequenz durch das 3'-gelegenste Nukleotid des speziell verwendeten Primers definiert ist) von Amplifikationsprodukten würde darauf hinweisen, dass die Ziel-Nukleinsäure die Sequenz, die durch das 3'-gelegenste Nukleotid des speziell verwendeten Primers definiert ist, nicht umfasst.
  • Mutationsdetektion auf der Grundlage eines einzelsträngigen Konformations-Polymorphismus unter Ausnutzung der Amplifikationsmethoden der Erfindung
  • Die gemäß den Methoden der vorliegenden Erfindung erzeugten DNA- oder RNA-Amplifikationsprodukte eignen sich auch zur Analyse für den Nachweis einer Veränderung in der Ziel-Nukleinsäuresequenz im Vergleich zu einer Referenz- Nukleinsäuresequenz, die bis auf die Sequenzveränderung mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz identisch ist, wie im folgenden erörtert werden wird.
  • Die Produkte der linearen Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden (DNA) und der verstärkten linearen Amplifikationsmethoden (RNA), wie zuvor beschrieben, eignen sich zum auf einzelsträngigem Konformations-Polymorphismus (SSCP oder rSSCP) basierenden Mutationsnachweis. Insofern, als das RNA-Produkt der neuartigen Amplifikationsmethoden kein Substrat zur weiteren Amplifikation darstellt, erfordert die Sequenzamplifikation gemäß den neuartigen Methoden nicht das Vorhandensein von Agenzien, die die Sekundärstrukturen im einzelsträngigen Produkt reduzieren. Die von anderen beschriebenen, auf Transkription basierenden Amplifikationsmethoden werden in Gegenwart von Agenzien ausgeführt, die die Sekundärstrukturen reduzieren, wie etwa DMSO. Daher wird vorausgesetzt, dass die verstärkten linearen Amplifikationsmethoden der vorliegenden Erfindung mit geeigneten Methoden zum Nachweis eines einzelsträngigen Konformations-Polymorphismus direkt verknüpft werden können, wie etwa einer elektrophoretischen Trennmethode zur Identifikation spezifischer Mobilitätsmuster der einzelsträngigen RNA-Produkte für die Klärung des Vorhandenseins spezifischer Sequenzmerkmale oder des Vorhandenseins irgendeines Unterschieds in einer Test-Nukleinsäure im Vergleich zu einer Referenz-Nukleinsäure.
  • Auf Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese basierende Methoden können zum Nachweis und der Analyse der verschiedenen einzelsträngigen Konformations-Isomeren verwendet werden. Alternativ ist es wahrscheinlich, dass die Spaltung des einzelsträngigen DNA- oder RNA-Produkts unter Verwendung von Nukleasen, die Sequenz-abhängige Sekundärstrukturen erkennen, zur Bestimmung eines Sequenz-spezifischen Konformations-Polymorphismus nützlich ist. Solche Nukleasen sind im Fachgebiet bekannt, wie etwa der Cleavage-Assay (Third Wave). Die elektrophoretischen Methoden eignen sich potentiell eher für Mutations- oder Genotypisierungs-Nachweismethoden bei hohem Durchsatz.
  • Die Bestimmung der Sequenz-spezifischen Elektrophoresemuster für eine gegebene Nukleinsäuresequenz ist zum Nachweis der spezifischen Allele einer Testsequenz nützlich. Weiterhin wird erwartet, dass ein elektrophoretisches Mobilitätsmuster für die verschiedenen Allele gut differenziert werden könnte, was die Detektion zweier Allele in einer einzelnen genomischen DNA-Probe, wie für den heterozygoten Genotyp erforderlich, oder multipler Allele ermöglichen würde. Jegliche Veränderung in der Test-Nukleinsäuresequenz, wie z.B. eine Basensubstitution, Insertion oder Deletion, könnte unter Anwendung dieser Methode nachgewiesen werden. Von der Methode wird ein Nutzen beim Nachweisen eines spezifischen Einzelbasen-Polymorphismus, SNP, und der Entdeckung neuer SNPs erwartet.
  • Methoden zur Herstellung von Mikroarrays der Nukleinsäuren
  • Die einzelsträngige Natur der Produkte der zuvor beschriebenen linearen Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden (DNA) und der verstärkten linearen Amplifikationsmethoden (RNA) sind besonders zur Herstellung von Mikroarrays geeignet, die die Amplifikationsprodukte umfassen.
  • Mehrere Techniken zur Anlagerung von Nukleinsäuren an ein festes Substrat, z.B. einen Glasträger, sind im Fachgebiet wohlbekannt. Eine Methode besteht im Einbau modifizierter Basen oder Analoga, die eine Komponente enthalten, die zum Anlagern an ein festes Substrat fähig ist, wie etwa eine Amingruppe, ein Derivat einer Amingruppe oder eine andere Gruppe mit einer positiven Ladung, in die amplifizierten Nukleinsäuren. Das amplifizierte Produkt wird dann mit einem festen Substrat, z.B. einem Glasträger, in Kontakt gebracht, welches mit einem Aldehyd oder einer anderen reaktiven Gruppe beschichtet ist, die eine kovalente Bindung mit der am Amplifikationsprodukt befindlichen reaktiven Gruppe bilden und kovalent an den Glasträger gebunden werden wird. Weitere Methoden, wie unter Anwendung einer Aminopropylsilican-Oberflächenchemie, sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt und dargestellt unter http://www.cmt.corning.com und httpa/cmgm.standard.ecu/pbrown1.
  • Die Bindung von Gruppen an den Primer, die später zu reaktiven Gruppen umgewandelt werden könnten, ist unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Methoden ebenfalls möglich. Jegliche Anbindung an Nukleotide des zusammengesetzten Primers wird Teil des einzelsträngigen DNA-Produkts der linearen Amplifikationsmethoden werden, die dann an die feste Oberfläche des Mikroarrays angelagert werden könnten.
  • Die Amplifikationsprodukte der Methoden der vorliegenden Erfindung können weiter modifiziert werden, z.B. durch Spaltung in Fragmente oder durch Bindung an nachweisbare Markierungen, und zwar vor oder nach Anlagerung an das feste Substrat, was von den Erfordernissen und/oder Möglichkeiten der angewendeten Techniken abhängt.
  • Charakterisierung der Nukleinsäuren
  • Die mittels der Methoden der Erfindung erhaltenen Amplifikationsprodukte sind besonders zugänglich für eine weitere Charakterisierung, teilweise deshalb, weil die Produkte einzelsträngig sind. Die amplifizierten Produkte, ob DNA oder RNA, können unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Sonden-Hybridisationstechniken wie dem Southern- und Northern-Blotting analysiert werden. Die amplifizierten Produkte können auch durch Zusammenbringen mit Mikroarrays, die Oligonukleotid-Sonden umfassen, analysiert werden. Die Identität der Sonden sorgt für die Charakterisierung der Sequenzidentität der Amplifikationsprodukte, und folglich durch Extrapolierung der Identität der Template-Nukleinsäure, die in einer Probe, in der ein Gehalt an Template-Nukleinsäure vermutet wird, vorhanden ist.
  • Zusammensetzungen und Reagenzsätze der Erfindung
  • Mit der Erfindung werden auch die bei den hierin beschriebenen Methoden verwendeten Zusammensetzungen und Reagenzsätze bereitgestellt. Die Zusammensetzungen können in jeglicher der hierin beschriebenen Komponente(n), Reaktionsgemischen und/oder Intermediaten, als auch einer beliebigen Kombination davon, bestehen. Zum Beispiel wird mit der Erfindung ein Präparat bereitgestellt, das einen zusammengesetzten Primer umfasst, wobei der zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst. Bei einem anderen Beispiel wird mit der Erfindung ein Präparat bereitgestellt, das einen zusammengesetzten Primer umfasst, wobei der zusammengesetzte Primer einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA- Abschnitt umfasst. Bei einer Ausführungsform grenzt der RNA-Abschnitt an den DNA-Abschnitt an. Bei einem anderen Beispiel wird mit der Erfindung ein Präparat bereitgestellt, das einen zusammengesetzten Primer umfasst, wobei der zusammengesetzte Primer 5'- und 3'-DNA-Abschnitte bei mindestens einem dazwischenliegenden RNA-Abschnitt umfasst. Bei anderen Beispielen wird mit der Erfindung ein Präparat bereitgestellt, das einen zusammengesetzten Primer umfasst, der durch Anlagerung einer Komponente weiter derivatisiert ist, die die Bindung eines Polynukleotids, das den zusammengesetzten Primer umfasst, an ein festes Substrat bewirken kann, wie zur Herstellung von Nukleinsäure-Mikroarrays verwendet. Bei einigen Ausführungsformen wird der zusammengesetzte Primer durch Anbindung einer positiv geladenen Komponente wie einem Amin weiter derivatisiert. Bei weiteren Ausführungsformen wird mit der Erfindung ein Pärparat bereitgestellt, das ein TSO (d.h. eine der hierin beschriebenen TSO-Ausführungsformen, einschließlich TSOs, die ein oder mehrere Modifikationen enthalten, die die Bindung an die Template fördern) umfasst. Bei einigen Ausführungsformen umfassen die Zusammensetzungen einen zusammengesetzten Primer und eine Terminationssequenz. Bei anderen Ausführungsformen wird mit der Erfindung ein Präparat bereitgestellt, das ein Polynukleotid umfasst, das eine Propromotor-Sequenz, z.B. ein TSO oder PTO (d.h. eine der hierin beschriebenen Ausführungsformen) enthält und darüber hinaus einen zusammengesetzten Primer und/oder eine Blockiersequenz beinhalten kann. Bei einigen Ausführungsformen wird mit der Erfindung ein Präparat bereitgestellt, das eine Blockiersequenz umfasst (d.h. eine hierin beschriebenen Ausführungsformen, einschließlich Blockiersequenzen mit Modifikationen).
  • Bei andern Ausführungsformen werden mit der Erfindung Zusammensetzungen bereitgestellt, die umfassen: (a) einen zusammengesetzten Primer, wobei der zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst (bei einigen Ausführungsformen grenzt der RNA-Abschnitt an den DNA-Abschnitt an); und (b) eine Terminationssequenz. Bei einigen Ausführungsformen ist die Terminationssequenz ein TSO. Bei anderen Ausführungsformen ist die Terminationssequenz eine Blockiersequenz. Bei einigen Ausführungsformen umfasst der zusammengesetzte Primer eine 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt (bei bestimmten Ausführungsformen grenzt der RNA-Abschnitt an den DNA-Abschnitt an). Bei anderen Ausführungsformen umfasst der zusammengesetzte Primer 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit mindestens einem dazwischenliegenden RNA-Abschnitt. Bei einigen Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung (a) einen zusammengesetzten Primer; (b) ein Polynukleotid, das eine Terminationssequenz umfasst; (c) ein Poylnukleotid, das eine Propromotor-Sequenz umfasst. Bei einigen Ausführungsformen wird die Propromotor-Sequenz durch ein PTO bereitgestellt. Bei anderen Ausführungsformen wird die Propromotor-Sequenz durch eine TSO bereitgestellt. Jede der obigen Zusammensetzungen kann außerdem eine Template (welche eine Zielsequenz umfasst) und/oder eines der hierin beschriebenen Enzyme (z.B. DNA-Polymerase, RNaseH und/oder RNA-Polymerase) umfassen. Die Zusammensetzungen liegen generell in wässriger Form, vorzugsweise in einem geeigneten Puffer, vor.
  • Mit der Erfindung werden auch Zusammensetzungen bereitgestellt, die die hierin beschriebenen Amplifikationsprodukte umfassen. Demgemäß wird mit der Erfindung eine Population von DNA-(Antisense) oder RNA-(Sense)-Molekülen bereitgestellt, die Kopien einer Zielsequenz sind und mittels einer der hierin beschriebenen Methoden erzeugt werden.
  • Die Zusammensetzungen liegen generell in einem geeigneten Medium vor, obschon sie auch in lyophilisierter Form vorliegen können. Zu geeigneten Medien zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, wässrige Medien (wie etwa reines Wasser oder Puffer).
  • Mit der Erfindung werden Reagenzsätze zum Ausführen der Methoden der Erfindung bereitgestellt. Entsprechend wird eine Vielzahl von Reagenzsätzen in einer geeigneten Verpackung bereitgestellt. Die Reagenzsätze können für einen oder mehrere der hierin beschriebenen Anwendungen vorgesehen sein und können entsprechend Instruktionen für eine oder mehrere der folgenden Anwendungen enthalten: das Amplifizieren einer Nukleotidsequenz; das Sequenzieren der amplifizierten Polynukleotide; und das Detektieren einer Sequenzmutation in amplifizierten Polynukleotiden.
  • Die Reagenzsätze der Erfindung umfassen einen oder mehrere Behälter, die eine Kombination der hierin beschriebenen Komponenten enthalten, wobei im folgenden Beispiele dieser Reagenzsätze wiedergegeben werden. Ein Reagenzsatz kann einen der hierin beschriebenen zusammengesetzten Primer umfassen. Bei einigen Ausführungsformen umfasst ein Reagenzsatz zwei oder mehrere zusammengesetzte Primer, die separat abgepackt sein können oder auch nicht. Bei anderen Ausführungsformen umfasst ein Reagenzsatz einen zusammengesetzten Primer und eine Terminationssequenz (einen beliebigen der hierin beschriebenen). Ein Reagenzsatz kann einen zusammengesetzten Primer, ein Polynukleotid, umfassend eine Terminationssequenz, und ein Polynukleotid, umfassend eine Propromotor-Sequenz (die ein PTO oder TSO sein kann) umfassen. Der zusammengesetzte Primer kann markiert oder unmarkiert sein. Die Reagenzsätze können auch wahlweise einen oder mehrere der hierin beschriebenen Enzyme, als auch Desoxynukleosidtriphosphate und/oder Ribonukleosidtriphosphate enthalten. Die Reagenzsätze können außerdem einen oder mehrere geeignete Puffer (wie hierin beschrieben) enthalten. Für die Nukleinsäure-Sequenzierung nützliche Reagenzsätze können wahlweise markierte oder unmarkierte Nukleotid-Analoga enthalten, die auf Einbau in ein Primer-Extensionsprodukt die Termination der Nukleotid-Polymerisation bewirken. Ein oder mehrere Reagenzien im Reagenzsatz können als ein trockenes, gewöhnlich ein lyophilisiertes Pulver, enthalten sein, die gewöhnlich Exzipienzien umfassen, die bei Auflösung eine Reagenzlösung in den geeigneten Konzentrationen zum Durchführen einer der hierin beschriebenen Methoden bereitstellen. Jede Komponente kann in separaten Behältern abgepackt sein, oder es können einige Komponenten in einem Behälter kombiniert werden, der sowohl Kreuzreaktivität als auch Haltbarkeit ermöglicht.
  • Die Reagenzsätze der Erfindung können wahlweise einen Satz Anleitungen, im allgemeinen schriftliche Anleitungen, enthalten, obschon auch elektronische Speichermedien (z.B. Magnetdisketten oder Videokassetten), die Anleitungen enthalten, akzeptabel sind, die sich auf die Verwendung der Komponenten der Methoden der vorliegenden Erfindung für die angestrebte Nukleinsäure-Amplifikation und/oder, je nach Eignung, auf die Verwendung der Amplifikationsprodukte zu Zwecken wie der Nukleinsäure-Sequenzierung und der Detektion von Sequenzmutationen beziehen. Die dem Reagenzsatz beigelegten Anleitungen enthalten allgemein eine Information bezüglich der Reagenzien (ob im Reagenzsatz enthalten oder nicht), die zum Ausführen der Methoden der vorliegenden Erfindung erforderlich sind, Anleitungen zum Gebrauch des Reagenzsatzes und/oder den geeigneten Reaktionsbedingungen.
  • Die Komponente(n) des Reagenzsatzes kann in einem bequem geeigneten Packungsmaterial abgepackt sein. Die Komponenten können einzeln oder in ein oder vielfachen Kombinationen abgepackt sein. Dort, wo Reagenzsätze zum Ausführen der verstärkten linearen Amplifikationsmethoden der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, wird die RNA-Polymerase (sofern enthalten) vorzugsweise separat von den Komponenten bereitgestellt, die bei den Schritten vor den Transkriptionsschritten Verwendung finden.
  • Die relativen Mengen der verschiedenen Komponenten in den Reagenzsätzen können breit variieren, um Konzentrationen der Reagenzien bereitzustellen, die die Reaktionen, die zur Ausführung der hierin beschriebenen Methoden und/oder zur weiteren Optimierung der Empfindlichkeit eines Assays erfolgen müssen, wesentlich optimieren.
  • Mit der Erfindung werden außerdem Systeme zum Bewirken der hierin beschriebenen Methoden bereitgestellt. Diese System umfassen verschiedene Kombinationen der oben erörterten Komponenten. Zum Beispiel wird mit der Erfindung bei einigen Ausführungsformen ein System bereitgestellt, das sich zur Erzeugung einer Ziel-Polynukleotidsequenz (oder zum Amplifizieren der Ziel-Polynukleotidsequenz) eignet und welches umfasst: (a) einen zusammengesetzten Primer (einen der hierin beschriebenen); (b) DNA-Polymerase; und (c) Ribonuklease. Bei einigen Ausführungsformen umfasst das System außerdem ein Polynukleotid, das eine Terminationssequenz umfasst (eine der hierin beschriebenen). Bei einigen Ausführungsformen umfasst das System darüber hinaus ein Polynukleotid, das eine Propromotor-Sequenz (die ein PTO oder TSO sein kann) und eine DNA-abhängige RNA-Polymerase umfasst. Jede der Ausführungsformen des Systems kann außerdem eine Template-(Ziel)-Sequenz umfassen, wie hierin beschrieben.
  • Mit der Erfindung werden außerdem Reaktionsgemische (oder Zusammensetzungen, die Reaktionsgemische umfassen) bereitgestellt, die verschiedene Kombinationen der hierin beschriebenen Komponenten enthalten. Bei einigen Ausführungsformen werden mit der Erfindung Reaktionsgemische bereitgestellt, die umfassen: (a) eine Polynukleotid-Template; (b) einen zusammengesetzten Primer, der einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt umfasst; und (c) DNA-Polymerase. Wie hierin beschrieben, kann jeglicher der zusammengesetzten Primer im Reaktionsgemisch enthalten sein (oder eine Vielzahl der zusammengesetzten Primer), einschließlich eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt umfasst, der an den 3'-DNA-Abschnitt angrenzt. Das Reaktionsgemisch könnte ferner auch ein Enzym umfassen, welches RNA von einem RNA/DNA-Hybrid spaltet, wie z.B. RNaseH. Ein Reaktionsgemisch der Erfindung kann außerdem eines der Polynukleotide umfassen, das die hierin beschriebenen Terminationssequenzen enthält. Ein anderes Beispiel eines Reaktionsgemischs ist (a) ein verdrängtes Primer-Extensionsprodukt (das als solches an seinem 5'-Ende eine zum 3'-DNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementäre Sequenz, doch nicht zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementäre Sequenzen enthält); (b) ein Polynukleotid, das eine Propromotor-Sequenz (zum Beispiel ein PTO) umfasst; und (c) RNA-Polymerase. Andere Reaktionsgemische sind hierin beschrieben und sind von der Erfindung umfasst.
  • Die Erfindung umfasst auch Zusammensetzungen, die einen der Komplexe (die bei den hierin beschriebenen Methoden Zwischenprodukte darstellen) enthalten, wie hierin beschrieben. Die Komplexe sind in 1–4 schematisch dargestellt. Zum Beispiel ist ein Komplex der Erfindung ein solcher, welcher umfasst: (a) einen Template-Strang; und (b) einen zusammengesetzten Primer, welcher zusammengesetzte Primer einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt umfasst. Der zusammengesetzte Primer kann einen RNA-Abschnitt enthalten, welcher 5'- und angrenzend an den 3'-DNA-Abschnitt liegt. Der Komplex kann außerdem ein Polynukleotid umfassen, das eine Terminationssequenz (z.B. ein TSO oder eine Blockiersequenz) enthält. Der Komplex kann auch ein Polynukleotid umfassen, das einen Propromotor, z.B. ein PTO, enthält.
  • Die folgenden Beispiele sollen zur Veranschaulichung, doch nicht zur Einschränkung der Erfindung dienen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Allgemeine Methoden
  • Die allgemeinen Methoden, die in diesem Beispiel beschrieben werden, werden auch bei anderen hierin angegebenen Beispielen angewendet.
  • Puffer
  • Die Puffer, die in den gesamten Beispielen verwendet wurden, wurden aus den folgenden Materialien hergestellt:
    • TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA
    • TBE-Puffer: 89 mM Tris-Base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,3
    • FX-Puffer: 20 mM Tris-SO4, pH 9,0, 20 mM (NH4)2SO4, 0,1% NP-40
  • Isotherme lineare Amplifikation unter Verwendung von einem einzelnen chimären Primers, DNA-Polymerase und RNaseH
  • Die Sequenzamplifikation wurde in 15-μl-Reaktionen vorgenommen, die 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, 6,0 mM MgCl2, 1,0 mM dATP, 1,0 mM dCTP, 1,0 mM dTTP, 0,8 mM dGTP, 0,2 mM dITP (dNTPs von Amersham), 0–6% DMSO, 0–8% Glycerol, 0–100 μg/ml acetyliertes BSA (Ambion, Austin, TX), 0,6 Einheiten/μl rekombinanten Ribonukleasehemmer (rRNasin, Promega, Madison, WI), 0,5–5 μM zusammengesetzten Primer IA005 und 100–200 nM Promotor-Template-Oligonukleotid (PTO) IA015C enthielten. Beim zusammengesetzten Primer IA005 handelt es sich um einen 20-mer-Primer mit der Sequenz: ACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NR: 1).
  • Beim Promotor-Template-Oligonukleotid (PTO) IA015C handelt es sich um ein 55-mer-Oligonukleotid mit der Sequenz:
    ggAATTCTAATACgACTCACTATgggAgAgCggTACgCTgATCAAAgATCCgTg-Biotin (SEQ ID NR: 12).
  • Die Reaktionen wurden aus allen Komponenten bis auf die beiden Enzyme zusammengesetzt. Nach Erhitzung auf 70°C oder 99°C für 10 Sekunden in einem programmierbaren Wärmezyklierer (GeneAmp 9600, Perkin Elmer) wurden die Reaktionsgemische auf 55°C, 60°C oder 65°C heruntergekühlt, wie in den einzelnen Beispielen beschrieben. Bei Erreichen der niedrigeren Temperatur wurden 0,05 bis 0,24 Einheiten der RNaseH (verdünnt aus der 5 E/μl-Ausgangslösung unter Verwendung einer Verdünnungs/Lagerlösung: 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 30% Glycerol; Hybridase, thermostabile RNaseH, Epicentre Technologies, Madison, WI) und 1,0–5,0 Einheiten Bca-DNA-Polymerase (2 E/μl; Panvera, Madison, WI) zugegeben. Die Reaktionen wurden bei 55°C bis 65°C für 30 Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Reaktionen auf 4°C abgekühlt. Die Reaktionen können bei 4°C verbleiben, bis der RNA-Transkrdiptionsschritt erwünscht ist.
  • Verstärkte lineare Amplifikation durch RNA-Transkription des linearen ssDNA-Amplifikationsprodukts
  • Die RNA-Transkription wurde bei 37°C für 3 Stunden in 10-μl-Reaktionen vorgenommen, die 2,5 μl der obigen linearen Amplifikations-Reaktionsgemische und 40 mM Tris-HCl, pH 8,5, 70 mM KCl, 5,0 mM DTT, 12 mM MgCl2, 110 μg/ml BSA, 3 mm je rNTP (ATP, UTP, CTP, GTP, Amersham), 7,5% DMSO, 1 Einheit/μl rRNasin (Promega, Madison, WI) und 20 Einheiten T7-RNA-Polymerase (Ambion, Austin, TX) enthielten.
  • DNA-Template
  • Eine Sequenz aus der J-Genregion von E. coli K12 wurde als einer DNA-Template für mehrere der folgenden Beispiele gewählt. Drei DNA-Template wurden für diese Experimente verwendet: ein synthetisches DNA-Ziel (IA013), eine primär einzelsträngige DNA-(351 Basen)-Template, wie mittels PCR-Amplifikation erzeugt, und genomische DNA aus dem K12-Stamm von E. coli (Herstellung in Beispiel 4 beschrieben). Das synthetische DNA-Ziel IA013 umfasst:
    Figure 00790001
    Spacer18 bezieht sich auf Polyoxyethylen-Spacer. Diese wurden dem Oligo zur Verzögerung seiner Mobilität bezüglich des 100-bp-ssDNA-Produkts zugegeben. Die Sequenz der zuvor erwähnten primär einzelsträngigen DNA-(351 Basen)-Template, wie mittels PCR-Amplifikation erzeugt, ist die folgende:
    Figure 00800001
    wobei die PCR-Primer fettgedruckt und unterstrichen und die zusammengesetzten Primer fettgedruckt sind, wobei der RNA-Abschnitt kursiv dargestellt ist.
  • Erhalt des ssDNA-Ziels aus dem PCR-Amplifikationsprodukt
  • Einzelsträngige DNA-Template für die isotherme lineare Amplifikation wurde mittels PCR-Amplifikation eines 351-bp-Segments des J-Gens von E. coli unter Verwendung der Primer IA006 und IA004 hergestellt. Bei Primer IA006 handelt es sich um 23-mer mit folgender Sequenz: CGGTACGCTGATCAAAgATCCGT (SEQ ID NR: 16). Bei Primer IA004 handelt es sich um ein 26-mer mit folgender Sequenz:
    CGCATACGGAATAGCTTACCGGTCT (SEQ ID NR. 15).
  • Die PCR wurde in 100-μl-Reaktionen vorgenommen, die enthielten: 20 mM Tris-SO4, pH 9,0, 20 mM (NH4)SO4, 0,1% NP-40, 2,0 mM MgCl2, 300 μM je dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase, 400 nM Primer IA006, 400 nM 5'-Phosphat-Primer IA004 und 0,2 μl eines Rohlysats des K12-Stamms von E. coli. Ein modifiziertes "Touchdown-PCR"-Protokoll wurde mit den folgenden Parametern angewendet: 95°C für 5 Sekunden, 68°C für 1 Minute für 5 Zyklen; 94°C für 5 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 1 Minute für 5 Zyklen; 94°C für 5 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 1 Minute für 40 Zyklen; 72°C für 15 Minuten und dann gehalten auf unbestimmte Zeit bei 4°C. Primer IA004 wurde mit einem 5'-Phosphat synthetisiert, um den Sense-Strang vor dem Verdau durch Lambda-Exonuklease (Strandase-Reagenzsatz, Novagen, Madison, WI) zu schützen. Der Strandase-Verdau wurde gemäß der Empfehlung des Herstellers vorgenommen. Kurz gesagt wurde das wie oben beschrieben hergestellte PCR-Produkt aus dem Reaktionsgemisch durch Zugabe von 1/10 Volumen an 3M Natriumacetat, pH 5,2, und 0,6 Volumina Isopropanol, Abkühlen auf –20°C für 1 Stunde und Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge für 30 Minuten ausgefällt. Das DNA-Pellet wurde einmal mit 75% Ethanol gewaschen, dann vor dem Resuspension in 80 μl Wasser kurz luftgetrocknet. Die Konzentration wurde aus der O.D. bei 260 nm geschätzt und dem 60 Einheiten Lambda-Exonuklease (Strandase, Novagen) zugegeben. Der Verdau durfte bei 37°C 20 Minuten lang ablaufen, woraufhin die Reaktionen auf 75°C für 10 Minuten erhitzt und dann auf 4°C abgekühlt wurden. Die Inkubationen wurden in einem programmierbaren Wärmezyklierer (GeneAmp 9600, Perkin Elmer) vorgenommen. Die verbliebene DNA wurde unter Verwendung von QiaQuick Nucleotide Removal Columns (Qiagen, Valencia, CA) gereinigt, gefolgt von der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweise unter Verwendung der mit dem Reagenzsatz gelieferten Puffer (Qiagen, Valencia, CA). Kurz gesagt wurden 10 Volumina an Puffer PN (Qiagen) der Probe zugegeben. Das Gesamtvolumen wurde dann auf eine Qiagen-Spinsäule aufgebracht und zentrifugiert (6000 UpM für 1 Minute in einer Mikrozentrifuge). Das Filtrat wurde beseitigt und die Säule zweimal mit 500 μl Puffer PE (Qiagen) gewaschen. Die Säule wurde dann mittels Zentrifugation bei Maximalgeschwindigkeit für 3 Minuten gründlich getrocknet. Die DNA wurde in 50 μl Puffer EB (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) (Qiagen) eluiert. Die Konzentration wurde auf etwa 2,5 × 1012 Kopien/5 μl aus der O.D. bei 260 nm geschätzt. Die Gelanalyse ergab, dass eine signifikante Menge an dsDNA (weniger als die Hälfte der Gesamtmenge) zurückblieb, doch betrug der Fehler bei der Konzentration weniger als das Zweifache. Die DNA wurde auf 1011 Kopien/5 μl in TE-Puffer verdünnt. Reihenverdünnungen wurden aus der Ausgangslösung mit 1010 Kopien nach Erfordernis hergestellt. Die auf der O.D.-Messung basierende Konzentration wurde durch Limiting Dilution PCR-Analyse bestätigt.
  • Gelelektroghorese
  • Die Amplifikationsprodukte wurden auf Novex-Vorhersage-Gradientengelen aus 4–20% Polyacrylamid (Invitrogen, Carlsbad, CA; Teil-Nr. EC62255) in 1X TBE-Puffer (89 nM Tris-Base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,3) in einem Novex-Elektrophoreseapparat (EI9001-XCell II Mini Cell, Novex) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Reaktionsgemische (5 μl) aus der linearen Amplifikation oder Transkription (verstärkte lineare Amplifikation) wurden mit 1 μl an 6 × Gelladelösung (40% Sucrose, 0,25% Bromphenol-Blau, 0,25% Xylencyanol) gemischt und die gesamte Probe sofort in jedes Well eingebracht. Die Gele wurden 250 Volt für etwa 5 Minuten ausgesetzt, bis alle Proben in das Gel eingedrungen waren, woraufhin die Spannung auf 175 V für 45 Minuten herabgesetzt wurde. Die Gele wurden aus den Zwischenräumen der Kunststoffplatten entfernt und in 0,5 μg/ml Ethidiumbromid in 1X TBE-Puffer (89 mM Tris-Base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,3) angefärbt. Ein dsDNA-Molekülgrößen-Marker (Hi-Lo DNA Marker, Bionexus, San Leandro, CA) wurde in eine Bahn jedes Gelablaufs aufgenommen. Dieser Marker enthält 16 Fragmente der folgenden Größen: 50, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1400, 1550, 2000, 3000, 4000, 6000, 8000 und 10000 bp. Typischerweise konnten 50–2000 bp auf den verwendeten Gelen getrennt werden.
  • Hybridisation
  • Die Oligonukleotid-Sonden für die Hybridisations-Beispiele (IA010 für ssDNA-Produkte; IA014 für ssRNA-Produkte) wurden 5'-endmarkiert unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs, Beverly, MA) und γ-32P-ATP (Adenosin-5'-[γ-32P]triphosphat, Triethylammoniumsalz, Amersham, Piscataway, NJ; PB10218, > 5000 Ci/mmol, 10 mCi/ml). Bei Primer IA010 handelt es sich um ein 21-mer mit folgender Sequenz: ATGTCATGGTCATGGTCGTGT (SEQ ID NR. 13). Bei Primer IA014 handelt es sich um ein 31-mer mit folgender Sequenz: CTCAACACGACCATGACCATGACATTTGTTG (SEQ ID NR. 14). Die Markierungsreaktionen (50 μl Gesamtvolumen) enthielten 70 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 μg Oligo (147 pmol für Primer IA010; 101 pmol für Primer IA014), 250 μCi γ-32P-ATP und 30 Einheiten T4-Polynukleotidkinase. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 30 Minuten, gefolgt von der Entfernung des nicht eingebauten Nukleotids unter Verwendung von QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen, Valencia, CA). Die Zerfallsrate (cpm) wurde in einem Packard Minaxi Tri-Carb 4000-Reihe-Flüssigszintillationszähler mittels Cherenkov-Zählung von 1 μl des markierten Oligo bestimmt.
  • Die Hybridisation wurde in 30-μl-Reaktionen vorgenommen. DNA-Produkt (oder RNA) (10 μl) wurde 20 μl eines Sondengemischs zugegeben. Die Reaktionen enthielten 100 mM NaCl und 106 cpm der Sonde (Korrektur für Zerfall unter Anlegung einer Halbwertszeit von 14,3 Tagen). Nach der Erhitzung auf 65°C für 15 Sekunden durfte die Hybridisation bei 42°C für 30 Minuten ablaufen, gefolgt von Abkühlen auf 4°C. Diese Schritte wurden in einem programmierbaren Wärmezyklierer mit einer erhitzten Abdeckung vorgenommen (GeneAMP 9600, Perkin Elmer). Das Gesamtvolumen der Hybridisationsreaktion wurde in 10% Polyacrylamidgelen in 1X TBE-Puffer (89 mM Tris-Base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,3) bei 150 V für 3 Stunden elektrophoretisiert. Die Gele wurden aus den Glasplatten entfernt, in Plastikfolien eingewickelt und mit Autoradiographiefilm (BioMax MR, Kodak) bei –20°C über Nacht (~ 16 Stunden) mit zwei Verstärkerschirmen belichtet.
  • Beispiel 2: Isotherme lineare Amplifikation
  • Es wurde eine isotherme lineare Amplifikation unter Verwendung eines einzelnen zusammengesetzten Primers, von DNA-Polymerase, RNaseH und TSO oder Blocker vorgenommen. Reaktionsgemische, die alle oben beschriebenen Reaktionskomponenten enthielten, als auch Reaktionsgemische, die keines der Schlüsselreagenzien wie zusammengesetzter Primer, RNaseH oder Bca-DNA-Polymerase (Panvera, Madison, WI) enthielten, wurden mit 1010 Kopien des synthetischen ssDNA-Ziels (IA010 – Sequenz in Beispiel 1 aufgelistet) gespikt. Eine negative Kontrollreaktion, die alle Reagenzien, aber keine Ziel-ssDNA enthielt, wurde ebenfalls einbezogen. Die isotherme lineare Amplifikation der Ziel-DNA-Sequenz wurde wie oben beschrieben ausgeführt. Die Ziel-Denaturierung wurde bei 70°C vorgenommen und die isotherme Amplifikation bei 65°C ausgeführt.
  • Die Amplifikationsprodukte wurden mittels Gelelektrophorese (5) getrennt (Erste Bahn: Molekulargewichtsleiter; Bahnen # 1–4: keine DNA, kein Primer, keine RNaseH, keine Bca-DNA-Polymerase; Bahn 5: enthielt alle Komponenten). In den Reaktionsgemischen ohne Primer, RNaseH oder Bca-DNA-Polymerase wurden keine Amplifikationsprodukte nachgewiesen.
  • Die Sonden-IA010-Hybridisation und Autoradiographie an das ssDNA-Produkt der linearen Amplifikationsmethode, wie in 6 gezeigt (Bahnen 1–4: jeweils keine DNA, kein Primer, keine RNaseH, keine DNA-Polymerase; Bahn 5: enthielt alle Komponenten) verifizierte die Identität des Amplifikationsprodukts. Die lineare Amplifikation des synthetischen Oligonukleotid-Ziels in diesem Experiment wurde unter Verwendung eines nicht-blockierten Promotor-Template-Oligonukleotids (IA015b) vorgenommen. Bei dem Promotor-Template-Oligonukleotid IA015b handelt es sich um ein 55-mer mit der folgenden Sequenz:
    GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG (SEQ ID NR: 11). Die standardmäßigen Reaktionskomponenten der Amplifikationsreaktion, wie auch bei dieser Amplifikationsreaktion verwendet, sind oben angegeben. Der anfängliche Denaturierungsschritt wurde bei 70°C für 10 Sekunden vorgenommen. Die Reaktionen wurden auf 65°C abgekühlt und bei dieser Temperatur für weitere 30 Minuten inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Bca-Polymerase und RNaseH. In den Kontrollreaktionen (keine DNA, kein Primer, keine RNaseH, kein Bca) wurde keine Hybridisation nachgewiesen.
  • Beispiel 3: Promotor-Template-Oligonukleotid-gekoppelte isotherme lineare Amplifikation und Transkription
  • Das Promotor-Template-Oligonukleotid (PTO) enthielt zwei wesentliche Sequenzmotive: eine T7-Promotor-Sequenz (5'-TAATACGACTCACTATAGGGAg GAG (SEQ ID NR. 20)) und eine zur ssDNA-Template komplementäre Sequenz. Vier Versionen eines PTO wurden entworfen (IA012, IA012b, IA015, IA015b). Bei IA012-PTO handelt es sich um einen 67-mer mit der folgenden Sequenz:
    GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG (SEQ ID NR. 8). IA012-PTO enthielt zwei Sequenzen zusätzlich zum Kern-T7-Promotor: eine 5'-Extension (5'-GGAATTC (SEQ ID NR. 21)) und einen Spacer (5'-ATCGAGTAGCTC (SEQ ID NR. 22)) zwischen dem Promotor und der Ziel-DNA-komplementären Sequenz. IA015 ist das kürzere PTO (48-mer), dem sowohl die 5'-Extension als auch der Spacer fehlt. IA015-PTO weist folgende Sequenz auf:
    TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG (SEQ ID NR. 10). IA012b-PTO ist ein 60-mer, welches den Spacer, doch nicht die Extension enthält. IA012b-PTO weist folgende Sequenz auf:
    TAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG (SEQ ID NR. 9). IA015b enthält die Extension, doch nicht den Spacer. Die Sequenz von IA015b ist in Beispiel 2 beschrieben. Alle anderen Primer als die chimären Oligonukleotide IA005, IA019 und IA020 wurden von Keystone (Division von BioSource International, Camarillo, CA) synthetisiert und PAGE-gereinigt.
  • Ein allgemeines Schemabild für diese Amplifikationsmethode ist in 2A-2C veranschaulicht. Die Fähigkeit von IA012, IA012b, IA015 und IA015b zur Verwandlung der ssDNA-Template zu einem Substrat für T7-RNA-Polymerase wurde durch Vergleich der Menge an RNA ausgewertet, die nach Transkription der Überlappungs-Extensionsprodukte erzeugt wurde, die zwischen einem synthetischen Oligo-Produkt (IA009) und jedem der PTOs gebildet wurden. Bei dem synthetischen Oligo-Produkt IA009 handelt es sich um einen 100-mer mit der folgenden Sequenz:
    AGTGTCCACCCCTGCCGGGATTTTAACGGACAGCGTTTTGCTGCGCTCAACACGA CCATGACCATGACATTTGTTGCACGGATCTTTGATCAGCGTACCG (SEQ ID NR. 19). Die Überlappungs-Extensionen wurden in 15-μl-Reaktionen vorgenommen, die 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, 6 mM MgCl2, 1 mM je dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 100 nM IA009, 100 nM PTO und 1 Einheit Bca-DNA-Polymerase enthielten. Die Reaktionen wurden ohne Bca-DNA-Polymerase hergestellt, auf 95°C erhitzt, dann für 10 Minuten auf 60°C abgekühlt. Nach Zugabe von DNA-Polymerase wurden die Reaktionen bei 60°C für 30 Minuten inkubiert. Eine Portion (2,5 μl) des Reaktionsgemischs wurde dem standardmäßigen RNA-Transkriptions-Reaktionsgemisch zugegeben und die Transkriptionsreaktionen mittels Gelelektrophorese ausgewertet.
  • Wie in 7 gezeigt (Bahn 1: Molekulargewichtsleiter; Bahnen 2–5: Überlappungs-Extensionsprodukt aus IA012, IA012b, IA015 bzw. IA015b; Bahnen 6–13: RNA aus IA012, IA012b, IA015, IA015b, IA012, IA012b, IA015 bzw. IA015b) wurde wesentlich mehr RNA durch das Transkriptionssubstrat produziert, das mit den kürzeren PTOs (IA015, IA015b) als entweder mit IA012 oder IA012b erzeugt wurde. Das PTO, das die 5'-Extension, doch nicht den Spacer (IA015b) enthielt, erzeugte nachweislich höhere Ausbeuten an RNA. In allen Fällen zeigten sich jedoch vielfältige Produkte über die Haupt-RNA-Bande hinaus. Ein fünfter PTO wurde mit derselben Sequenz wie IA015b konstruiert, doch mit einer 3'-Blockiergruppe (Biotin) zur Eliminierung des freien 3'-OH, was die verbesserte Leistung eines 3'-blockierten PTO nachwies. Die Blockierung des freien 3'-OH des PTO schaltet seine Fähigkeit aus, den nicht-spezifischen Einbau einer funktionellen Promotorsequenz in die Amplifikationsprodukte zu veranlassen, was zur nicht-spezifischen Erzeugung von Transkriptionsprodukten führt. Der Wirkungsgrad des 3-blockierten und unblockierten PTO bei der verstärkten isothermen linearen Amplifikation wurde aus der Amplifikation eines synthetischen Oligonukleotid-Ziels unter Anwendung standardmäßiger Bedingungen ausgewertet. Das 3'-blockierte PTO (IA015c) erbrachte vergleichbare Ausbeuten an spezifischer RNA wie IA015b, doch bei beträchtlich weniger Hintergrund, wie in 8 gezeigt (Bahn 1: Molekulargewichtsleiter; Bahnen 2, 9: keine DNA, 30 Minuten; Bahnen 3, 10: keine DNA, 1 Std.; Bahnen 4, 11: keine DNA, 2 Std.; Bahnen 5, 12: 1010 Kopien IA013, 30 Min., Bahnen 6, 13: 1010 Kopien IA013, 1 Std.; Bahnen, 7, 14: 1010 Kopien IA013, 2 Std.; Bahnen 8, 15: 1011 Kopien IA013, 30 Min., Reaktionen 1 – 7 waren nicht blockiert (IA015b), Reaktionen 8–15 waren blockiert (IA015c)). Negative Kontrollreaktionen (keine DNA-Template) und Reaktionen, die 1010 Kopien des Oligo-Ziels (IA013) enthielten, wurden durch Strangverdrängung für 30 Minuten, 1 Stunde oder 2 Stunden bei 55°C amplifiziert, wobei entweder IA015b oder IA015c in die Strangverdrängungsreaktion aufgenommen war. War das 3'-OH nicht blockiert, so wurde bei allen Reaktionen eine nichtspezifische RNA erzeugt und die Identifizierung der spezifischen RNA-Bande undeutlich gemacht. Im Gegensatz dazu erzeugte das blockierte PTO in erster Linie ein einzelnes RNA-Produkt.
  • Beispiel 4: Amplifikation einer J-Gensequenz von genomischer E, coli-DNA durch die verstärkte isotherme lineare Amplifikation
  • DNA wurde aus 25 ml von E. coli K12 (ATCC 10798) isoliert und über Nacht in Trypton-NaCl-Medium gezüchtet. Die genomische DNA wurde durch Lysozym-Verdau und Aufschluss in einer chaotropen Lyselösung (Bactozol Kit, Molecular Research Center, Cincinnati, OH) isoliert, gefolgt von der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweise.
  • Kurz gesagt wurden Bakterien mittels Zentrifugation bei 6000 × g für 5 Minuten abgesammelt. Die Zellpellets wurden in Baktozym-Verdau-Puffer resuspendiert und bei 50°C für 30 Minuten inkubiert. Das resultierende Lysat war am Ende des Verdaus klar und ohne sichtbare Klumpen von unverdauten Zellen. Das Lysat wurde mit 4 Volumina an DNazol-Reagenz (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) gemischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA wurde aus der Lösung durch Zugabe von 0,6 Volumen an eiskaltem Ethanol ausgefällt. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die ausgefällte DNA mittels Zentrifugation für 5 Minuten bei Maximalgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge abgesammelt. Das DNA-Pellet wurde mit 75% Ethanol gewaschen, nochmals zentrifugiert und in 1,5 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) durch Erhitzen bei 50° bis 55°C für 30 Minuten bei häufigem Schütteln resuspendiert. Die resultierende Lösung wurde wiederholt durch eine 22-Gauge-Spritzennadel geleitet, um die DNA zu scheren und die Viskosität der Lösung zu vermindern. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen an 5 M Ammoniumacetat und 3 Volumina an eiskaltem Ethanol nochmals ausgefällt (EPI005-35). Nach Inkubation bei –20°C für 1 Stunde wurde die DNA mittels Zentrifugation bei Maximalgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge abgesammelt. Das Pellet wurde mit 75 Ethanol gewaschen, nochmals zentrifugiert und in 150 μl TE-Puffer resuspendiert. Zwei Verdünnungen in TE-Puffer wurden für die O.D.-Messung (Beckman DU640-Spektrophotometer) zubereitet, aus denen die DNA-Konzentration unter der Voraussetzung, dass 50 μg/ml dsDNA eine O.D. bei 260 nm von 1 erzeugt, berechnet. Die DNA-Konzentrationen der beiden Verdünnungen betrugen 24,2 μg/10 μl und 24,6 μg/10 μl. Der Mittelwert dieser beiden Messungen (24,4 μg/10 μl) entspricht etwa 2,5 × 109 Genomkopien/5 μl (5 fg von genomischer E. coli-DNA = 1 Kopie).
  • Verstärkte isotherme lineare Amplifikation
  • Die DNA wurde in TE-Puffer auf 109, 108 oder 107 Kopien/5 μl reihenverdünnt und durch Erhitzen auf 95°C für 5 Minuten denaturiert, gefolgt von schnellem Abkühlen auf Eis. Einzelsträngige Template-DNA wurde ebenfalls auf 109 Kopien/5 μl verdünnt. Die Reaktionen wurden ohne einen Gehalt an DNA oder mit 107, 108, 109 oder 2,5 × 109 Kopien an genomischer DNA zusammengestellt.
  • Die Amplifikation wurde in 15-μl-Reaktionen vorgenommen, die 20 ml Tris-HCl, pH 8,5, 6,0 mM MgCl2, 1,0 mM dATP, 1,0 mM dCTP, 1,0 mM dTTP, 0,8 mM dGTP, 0,2 mM dITP (dNTPs von Amserham), 6% DMSO, 8% Glycerol, 100 μg/ml acetylierte BSA (Ambion, Austin, TX), 0,6 Einheiten/μl rekombinantem Ribonuklease-Hemmer (rRNasin, Promega, Madison, WI), 5 μM zusammengesetzten Primer IA005 (Sequenz in Beispiel 1 beschrieben), 200 nM Promotor-Template-Oligonukleotid (PTO) IA015C (Sequenz in Beispiel 1 beschrieben) enthielten. Die Reaktionen wurden mit allen Komponenten mit Ausnahme der beiden Enzyme versehen. Nach Erhitzung auf 99°C für 10 Sekunden in einem programmierbaren Wärmezyklierer (GeneAmp 9600, Perkin Elmer) wurden die Reaktionen bei 60°C für 30 Minuten inkubiert. Bei Erreichen von 60°C wurden 0,6 μl RNaseH (0,05 Einheiten, verdünnt aus der 5 E/μl-Ausgangslösung in 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 30% Glycerol), Hybridase (Epicentre Technologies, Madison, WI) und 1,0 μl Bca-DNA-Polymerase (2,0 Einheiten, Panvera, Madison, WI) zugegeben. Am Ende der Inkubation bei 60°C wurden die Reaktionen auf 4°C abgekühlt. Ein Volumen von 5,0 μl Strangverdängungsprodukt wurde jeder RNA-Transkriptionsreaktion zugegeben (Gesamtvolumen 20 μl) zugegeben. Die RNA-Transkription wurde unter Anlegen der standardmäßigen Bedingungen und einer Maßstabsvergrößerung des Reaktionsvolumens auf 20 μl zur Bereitstellung von ausreichend Material für die direkte Gelanalyse (5 μl) und die Sondenhybridisation (10 μl) vorgenommen.
  • Anders als die Amplifikation des definierten einzelsträngigen synthetischen Ziels erfordert die Amplifikation der genomischen DNA gemäß dem Verfahren der Erfindung die Bildung eines definierten Stopps für die Erzeugung eines ssDNA-Produkts mit einem definierten 3'-Ende. Die Bildung eines definierten Stopps für die Primer-Extension kann durch einen Blocker erzielt werden, der an eine definierte Stelle auf dem Zielstrang hybridisiert und durch die Polymerase nicht verdrängbar ist. Alternativ bot wie im vorliegenden Beispiel eine GC-reiche Sequenz stromaufwärts der Primerstelle einen Stopppunkt für die Primer-Extension, was zur Erzeugung eines ssDNA-Produkts mit definiertem 3-Ende führte.
  • Eine erfolgreiche Amplifikation einer definierten Sequenz der genomischen DNA mittels der verstärkten isothermen linearen Amplifikationsmethode der Erfindung ist in 9 gezeigt (Bahn 1: keine DNA; Bahn 2: 107 Kopien der genomischen E. coli-DNA; Bahn 3: leer; Bahn 4: 108 Kopien der genomischen E. coli-DNA). Wie dargestellt, hybridisiert das ssRNA-Produkt an eine spezifische Oligonukleotid-Sonde.
  • Beispiel 5: Auswertung der Wirkung des Primer-Designs auf den Wirkungsgrad der verstärkten isothermen linearen Amplifikation
  • Der Wirkungsgrad jedes der drei zusammengesetzten Primer bei den Amplifikationsmethoden der Erfindung wurde ausgewertet. Die isotherme lineare Amplifikation wurde in 15-μl-Reaktionen vorgenommen, die 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, 6,0 mM MgCl2, 1,0 mM dATP, 1,0 mM dCTP, 1,0 mM dTTP, 0,8 mM dGTP, 0,2 mM dITP (dNTPs von Amersham), 6% DMSO, 8% Glycerol, 100 μg/ml acetyliertes BSA (Ambion, Austin, TX), 0,6 Einheiten/μl rekombinanten Ribonuklease-Hemmer (rRNasin, Promega, Madison, WI), 5 μM zusammengesetzten Primer, 200 nM Promotor-Template-Oligonukleotid (PTO) IA015C enthielten. Die Sequenz des PTO IA015C ist in Beispiel 1 beschrieben. Die Sequenz der zusammengesetzten Primer IA005 (20-mer) ist in Beispiel 1 beschrieben. Weitere zusammengesetzte Primersequenzen mit alphanumerischen Namen sind die folgenden:
    • IA019 (20-mer) ACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NR: 2)
    • IA020 (21-mer) GACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NR: 3)
  • Vier weitere zusammengesetzte Primersequenzen wurden verwendet, die keine alphanumerischen Namen trugen. Ihre Sequenzen sind jeweils:
    • (1) GCAAGACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NR: 4)
    • (2) GACGATGCGUCTCCAGTGT (SEQ ID NR: 5)
    • (3) GACGGATGCGGUCTCCAGUGT (SEQ ID NR: 6)
    • (4) GACGGATGCGGUCTCCAGUGUCCA (SEQ ID NR: 7)
  • Diese zusammengesetzten Primer wurden von Dharmacon Research, Inc. (Boulder, Co.) synthetisiert. Der RNA-Abschnitt des Oligonukleotids wurde unter Verwendung einer 5'-Silyl-Schutzgruppe in Verbindung mit einer säurelabilen 2'-Orthoester-Schutz gruppe (2'-Bis(acetoxyethoxy)methylether oder "2'-ACE" (Scaringe, S.A., et al. J. Am. Chem. Soc. 120:11820–11821 (1998) und Scaringe, S.A. Advanced 5'-silyl-2'-orthoester approach to RNA oligonucleotide synthesis. Methods in Enzymology (in Druck)), synthetisiert. Die Primer waren PAGE-gereinigt.
  • Die Reaktionen wurden aus allen Komponenten mit Ausnahme der beiden Enzyme zusammengestellt. Nach Erhitzung auf 70°C für 10 Sekunden in einem programierbaren Wärmezyklierer (GeneAmp 9600, Perkin Elmer) wurden die Reaktionen auf 55°C–65°C abgekühlt. Bei Erreichen der niedrigeren Temperatur wurden 0,05 Einheiten von RNaseH (verdünnt aus der 5 E/μl-Ausgangslösung unter Verwendung einer Verdünnungs/Lagerlösung: 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 30% Glycerol; Hybridase, thermostabile RNaseH, Epicentre Technologies, Madison, WI) und 2,0 Einheiten Bca-DNA-Polymerase (2 E/μl; Panvera, Madison, WI) zugegeben. Die Reaktionen wurden bei 55°C–65°C für 30 Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Reaktionen auf 4°C bis zur RNA-Transkription abgekühlt. Die RNA-Transkription wurde bei 37°C für 3 Stunden in 10-μl-Reaktionen vorgenommen, die 2,5 μl der obigen linearen Amplifikationsreaktion und 40 mM Tris-HCl, pH 8,5, 70 mM KCl, 5,0 mM DTT, 12 mM MgCl2, 110 μg/ml BSA, 3 mM je rNTP (ATP, UTP, CTP, GTP, Amersham), 7,5% DMSO, 1 Einheit/μl rRNasin (Promega, Madison, WI) und 20 Einheiten T7-RNA-Polymerase (Novagen, Madison, WI) enthielten.
  • Die Produkte der mit jedem der zusammengesetzten Primer erzeugten verstärkten linearen Amplifikation wurden mittels Gelelektrophorese getrennt, wie in 10 gezeigt (Bahn 1: Molekulargewichtsleiter; Bahnen 1,2: IA015, 60°C, Bahnen 3,4: IA019, 55°C; Bahnen 5,6: IA019, 60°C; Bahnen 7,8: IA019, 65°C; Bahnen 9,10: IA020, 55°C; Bahnen 11,12: IA020, 60°C; Bahnen 13,14: IA020, 65°C). Die zusammengesetzten Primer waren zum Hybridisieren an dieselbe Stelle auf dem Zielstrang entworfen und unterschieden sich durch die Zahl der Desoxynukleotide am 3'-Ende. Die höchste Ausbeute an RNA-Produkt wurde mit Primer IA020 erzeugt, gleichermaßen gefolgt von IA005 und IA019. Die anderen vier zusammengesetzten Primer erbrachten eine geringere Menge an RNA-Produkten. Die optimale Temperatur für den isothermen linearen Amplifikationsschritt war für die verschiedenen Primer unterschiedlich, wie zu erwarten war.
  • Beispiel 6: Isotherme Sequenzierung der Nukleinsäure-Ziele unter Anwendung der linearen Amplifikationsmethoden
  • Die zu analysierenden Nukleinsäuresequenzen wurden zunächst aus ihren Quellen isoliert. Nicht-beschränkende Beispiele für die in diesem Beispiel verwendeten Quellen sind Tiere, Pflanzen, Bakterien, Viren, Hefe oder Pilze. Entstammt die Quelle der Nukleinsäuren (DNA oder RNA) tierischen Geweben, so wird das Gewebe homogenisiert oder beschallt oder einer Kraft unterzogen, die die Heraustrennung einzelner Zellen aus dem Bindegewebe erlaubt. Es muss Vorsicht walten, um den Zerlegung der DNA und RNA, insbesondere der mRNA, und das Scheren der genomischen DNA während der Handhabung des Gewebes zu vermeiden. Tierische Zellen können auch aus kommerziellen Quellen erhalten werden, d.h. von Gibco BRL, oder aus nicht-kommerziellen Quellen, d.h. von American Tissue Type Culture (ATCC). In Abhängigkeit von der Form der gewünschten Nukleinsäure kann genomische DNA, Gesamt-RNA oder mRNA mittels folgender standardmäßiger Protokolle isoliert werden, wie zu finden bei Sambrook et al. supra. Protokolle zur Isolierung von Nukleinsäure aus pflanzlichen Zellen sind auch zu finden in Current Protocols in Molecular Biology supra. Stammt die Quelle der Nukleinsäure aus Nicht-Säuger-Quellen, zum Beispiel von Bakterien, Hefen, Pilzen oder Viren, so werden geringfügig unterschiedliche Protokolle zur Isolierung der Nukleinsäure angewendet. Diese Protokolle sind zu finden bei Sambrook et al. oder Current Protocols in Molecular Biology für Bakterien, Hefen, Pilze und Viren.
  • Die Amplifikation der definierten Ziel-Nukleinsäuresequenz wird wie für die oben beschriebene isotherme lineare Amplifikation ausgeführt. Etwa 102 bis 1012 Kopien werden für die Template verwendet. Über die natürlichen Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) hinaus, die für die Amplifikationsmethode verwendet werden, umfasst das Sequenzierungs-Reaktionsgemisch die markierten Triphosphat-Analoga. Wird jedes Analogon in individueller Weise markiert, so können alle vier im gleichen Reaktionsröhrchen zugesetzt werden. Wird im anderen Falle jedes Nukleotid-Analogon mit derselben Markierung markiert, so werden die Sequenzierungsreaktionen in vier verschiedenen Reaktionsröhrchen vorgenommen, wobei jedes Reaktionsgemisch eines der Nukleotid-Analoga enthält. Diese Analoga werden in das Primer-Extensionsprodukt mittels der Polymerase eingebaut und dienen zum Stoppen einer weiteren Extension entlang der Zielsequenz. Die resultierenden verkürzten Extensionsprodukte werden markiert. Die angesammelten vervielfachten verdrängten Primer-Extensionsprodukte variieren hinsichtlich ihrer Länge entsprechend der Einbaustelle jedes der Analoga, welche die verschiedenen Sequenzlokalisationen eines komplementären Nukleotids auf der Zielsequenz repräsentieren. Die Analyse der Reaktionsprodukte zur Klärung der Sequenzinformation kann durch Laufenlassen der Produkte in einem Gel vorgenommen werden. Alternativ können ebenso gut andere Analysemethoden angewendet werden. Wie bei anderen Sequenzierungsmethoden, werden die Sequenzierungsreaktionen entweder in einem einzigen Reaktionsgefäß oder in separaten Reaktionsgefäßen vorgenommen. Die Wahl der anzuwendenden Methode hängt von den verwendeten Nukleotidtriphosphat-Analoga ab. Wird daher jedes der Analoga unterschiedlich markiert, so kann die Sequenzierungsreaktion in einem einzigen Gefäß durchgeführt werden. Die Überlegungen bezüglich der Wahl des Reagenz und der Reaktionsbedingungen für eine optimale Ausführung der Sequenzierungsanalyse gemäß der Methode der Erfindung sind ähnliche wie bei den zuvor beschriebenen Methoden.
  • Die Vielzahl der Primer-Extensionsprodukte, die hinsichtlich ihrer Größe entsprechend dem spezifischen Einbau des Elongationsterminators differieren, werden unter Anwendung einer aus einer Vielfalt im Fachgebiet bekannter Methoden nach Größe aufgetrennt. Das Profil der Vielzahl der mit jedem der Terminator-Analoga erzeugten Primer-Extensionsprodukte ist für die Nukleotidsequenz der Test-Nukleinsäuresequenz indikativ.
  • Beispiel 7: Sequenzierung der Nukleinsäure-Ziele unter Anwendung der verstärkten Amplifikation
  • Die Amplifikation der definierten Ziel-Nukleinsäuresequenz wird wie für die isotherme lineare Amplifikation beschrieben durchgeführt, was die Transkription umfasst, wie hierin beschrieben. Es können entweder TSOs oder PTOs zum Anhängen der Protopromotor-Sequenz an das Produkt der isothermen linearen Amplifikation verwendet werden. Über die natürlichen Ribonukleotidtriphosphate (rRTPs) hinaus, die bei der verstärkten linearen Amplifikationsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfasst das Sequenzierungs-Reaktionsgemisch auch die geeigneten markierten Triphosphat-Analoga, die bei anderen im Fachgebiet bekannten Sequenzierungsmethoden herkömmlicherweise verwendet werden. Diese werden in das Extensionsprodukt mittels der RNA-Polymerase eingebaut und dienen zum Stopfen einer weiteren Extension entlang der Zielsequenz. Die resultierenden verkürzten Extensionsprodukte werden markiert. Die angesammelten vervielfachten verdrängten Extensionsprodukte variieren hinsichtlich ihrer Länge entsprechend der Einbaustelle jedes der Analoga, welche die verschiedenen Sequenzlokalisationen eines komplementären Nukleotids an der Zielsequenz repräsentieren. Die Analyse der Reaktionsprodukte zur Klärung der Sequenzinformation kann wie im obigen Sequenzierungsbeispiel angegeben vorgenommen werden.
  • Beispiel 8: Genotypisierung unter Anwendung der verstärkten isothermen linearen Amplifikation und eines Gentoyp-spezifischen zusammengesetzten Primers
  • Genomische DNA wird aus Testzellen unter Anwendung der in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Methoden oder anderer einem Fachmann des Gebietes bekannter Methoden isoliert. Verschiedene Organismen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Bakterien, Viren, Pilze, Hefen, Pflanzen und Tiere werden genotypisiert. Genotyp-spezifische Primer werden so konstruiert, dass sie entweder ein 3'-End-Nukleotid umfassen, welches an einen Genotyp einer spezifischen Nukleinsäuresequenz hybridisiert oder an das Genotyp-Gegenstück hybridisiert. Die Sequenzabweichung, die spezifische Genotypen bestimmt, kann eine Punktmutation, ein einzelner Nukleotid-Polymorphismus (SNP), Insertionen, Deletionen und ähnliches sein.
  • Die Amplifikation der definierten Ziel-Nukleinsäuresequenz wird wie für die Amplifikation der genomischen E. coli-Sequenz im obigen Beispiel beschrieben durchgeführt. Unter Verwendung des Genotyp-spezifischen Primers und einer DNA-Polymerase, der die Proofreading-Aktivität fehlt, weist die Erzeugung von Amplifikationsprodukt auf das Vorhandensein der Zielsequenz des definierten Genotyps hin. Eine Sequenzabweichung, die die Hybridisation des 3'-Endes des Primers an die Ziel-Nukleinsäuresequenz verhindert, wird eine Amplifikation verhindern. Das Amplifikationsprodukt wird mittels einer von verschiedenen Detektionsmethoden für eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, die im Fachgebiet bekannt ist, nachgewiesen. Zum Beispiel wird die Hybridisation spezifisch markierter Oligonukleotid-Sonden an das Amplifikationsprodukt mittels Gelelektrophorese nachgewiesen.
  • In Fällen, bei denen die Genotypisierung diploider Zellen erforderlich ist, wie bei der Bestimmung eines homozygoten oder heterozygoten Genotyps, ist die Durchführung der Amplifikation der spezifischen Nukleinsäure-Zielsequenz unter Verwendung spezifischer Primer durchführbar, die entweder für den Wildtyp- oder den mutanten Genotyp, oder den einen Genotyp und den anderen Genotyp, entworfen sind. Die Amplifikationsreaktionen unter Verwendung der spezifischen Primer werden in separaten Reaktionsgefäßen vorgenommen. Der Nachweis des Amplifikationsprodukts in lediglich einem Reaktionsröhrchen oder eine geringere Menge an Amplifikationsprodukt ist für einen homozygoten Genotyp indikativ, d.h. entweder eine Wildtyp- oder Mutanten-Homozygote. Der Nachweis des Amplifikationsprodukts in beiden Amplifikationsreaktionen zeigt einen heterozygoten Genotyp an.
  • Beispiel 9: Auf dem RNA-Abschnitt basierende isotherme Mutationsdetektion unter Anwendung der Amplifikationsmethoden
  • Die hierin beschriebenen isothermen Amplifikationsmethoden werden für den Nachweis definierter Mutationen, oder polymorpher Stellen (wie etwa SNPs), in einer Ziel-Nukleinsäuresequenz angewendet. Die Methoden werden zur Genotypisierung oder zum Nachweis einer Mutation angewendet, die zu einer Wirkstoffresistenz führt. Bei der Ziel-Nukleinsäuresequenz handelt es sich um einzelsträngige (ss) DNA. Das einzelsträngige DNA-Ziel wird aus einem doppelsträngigen DNA-Ziel oder einem RNA-Ziel unter Anwendung der hierin beschriebenen isothermen Amplifikationsmethoden präpariert.
  • Wie in 4 gezeigt, wird ein zusammengesetzter Primer, der komplementär zu einer Wildtyp-DNA-Sequenz ist, in Kombination mit einem ssDNA-Ziel verwendet, das eine Mutation innerhalb des zu untersuchenden Allels aufweist oder bei dem diese vermutet wird. Etwa 102 bis etwa 1012 Kopien des ssDNA-Ziels und etwa 0,05–5 μM des zusammengesetzten Primers werden verwendet. Das Vorhandensein der Sequenzveränderung verhindert den anfänglichen Schritt der Amplifikation nicht, bei dem der zusammengesetzte Primer an die Zielsequenz zur Bildung des ersten trimolekularen Komplexes hybridisiert und ein Extensionsprodukt erzeugt wird. Eine Ribonuklease, RNaseH, spaltet dann den RNA-Abschnitt des extendierten Primers des Komplexes. Die Spaltung des RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers, oder des Primer-Extensionsprodukts, durch RNaseH wird durch das Vorhandensein einer Fehlpaarung beeinflusst. Dies kann die Spaltung verhindern, das Spaltungsmuster verändern oder die Wirksamkeit der Spaltung vermindern. Der nächste Schritt der Bindung eines zusammengesetzten Primers an den Komplex durch Hybridisation des 5'-RNA-Abschnitts wird durch eine Fehlpaarung aus dem oben beschriebenen Grunde gehemmt. Die Unfähigkeit des zusammengesetzten Primers zum Hybridisieren an das Ziel verhindert weitere Schritte der Strangverdrängung bei der Primer-Extension und der Erzeugung vielfacher Kopien der Amplifikationsprodukte. Die Amplifikationsprodukte, oder ihr Fehlen, werden durch Gelelektrophorese oder andere gleichwertige Methoden sichtbar gemacht.
  • Zu Faktoren, die zur Hemmung der Primer-Hybridisation beitragen, zählen die Größe des hybridisierenden Oligonukleotids und die Stringenz der Reaktionsbedingungen. Diese Faktoren werden beim Entwurf des zusammengesetzten Primers gemäß im Fachgebiet wohlbekannter und routinemäßiger Techniken erwogen.
  • Ein zusammengesetzter Primer, der zu einer mutierten DNA-Sequenz komplementär ist, wird ebenfalls in Kombination mit einem Wildtyp-ssDNA-Ziel bei der oben beschriebenen isothermen Amplifikationsmethode verwendet. In diesem Fall bindet der Primer an die Ziel-DNA und vollzieht die Extension. Nach einer Behandlung mit RNaseH kann allerdings aufgrund der Nukleotid-Fehlpaarung kein weiterer Primer an die Wildtyp-DNA binden, weshalb wenig oder kein Amplifikationsprodukt erhalten wird. Die Amplifikationsprodukte, oder ihr Fehlen, werden durch Gelelektrophorese oder andere gleichwertige Methoden sichtbar gemacht.
  • Es werden außerdem Parallelreaktionen vorgenommen, die entweder die interessierende Nukleinsäure-Probe oder eine Referenz-Probe der Ziel-Nukleinsäure mit einer Wildtyp-Sequenz enthalten. Eine Ansammlung einer größeren Menge an Primer-Extensionsprodukten in ersterer relativ zu letzterer Reaktion ist für das Vorhandensein eines mutanten Genotyps in der interessierenden Probe indikativ. Umfasst alternativ der zusammengesetzte Primer eine 5'-RNA-Sequenz, die vollkommen komplementär zu einer normalen Genotyp-Sequenz des Testziels ist, so verhindert dies die Amplifikation einer Zielsequenz des mutanten Genotyps und zeigt der Nachweis und/oder die quantitative Bestimmung der Amplifikationsprodukte einen normalen Genotyp an.
  • Beispiel 10: Genotypisierung unter Anwendung der isothermen Amplifikationsmethoden und der Genotyp-spezifischen Sonden-Hybridisation
  • Die Methoden zur Sequenzierung durch Hybridisation sind in den vorangegangenen Beispielen beschrieben. Die Bestimmung der Sequenzidentität durch Hybridisation der spezifischen Sonde ist unter Anwendung der isothermen Methode der Erfindung insofern besonders vorteilhaft, als das mittels der Methode der Erfindung erzeugte Amplifikationsprodukt einzelsträngig und ohne weiteres zur Verwendung bei der Hybridisation der spezifischen Sonden verfügbar ist. Die für einen definierten Genotyp spezifischen Sonden werden unter Anwendung im Fachgebiet bekannter Methoden entworfen. Eine Bestimmung der Hybridisationskriterien, die die selektive Sonden-Hybridisation an Amplifikationsprodukte fördern, wie durch Amplifikation eines Genotyps und nicht des anderen erzeugt, ist möglich. Eine Sequenzabweichung von lediglich einem einzelnen Nukleotid kann die Sonden-Hybridisation verhindern. Die folgenden Faktoren werden für die Hybridisationskriterien erwogen: die Sondenlänge, die Temperatur der Hybridisationsreaktion und die Pufferzusammensetzung, insbesondere die Konzentration zweiwertiger Ionen. Die für die Analyse verwendeten Sonden können in Lösung vorliegen oder können an eine feste Oberfläche gebunden werden. Weiterhin können die Sonden direkt markiert oder an einen Partner eines spezifischen Bindungspaars gebunden werden, wodurch sie zur spezifischen Bindung an den anderen Partner des spezifischen Bindungspaars in der Lage sind, das direkt oder indirekt markiert sein kann.
  • Genomische DNA wird aus Testproben mittels im Fachgebiet bekannter Methoden oder wie im obigen Beispiel beschrieben isoliert. Die Test-DNA wird mit den beschriebenen Amplifikationskomponenten, dem Ziel-spezifischen chimären Primer und der Propromotor-Sequenz (z.B. PTO) kombiniert. Die Kombination wird Inkubationsbedingungen unterzogen, wie hierin zur Erzeugung eines einzelsträngigen RNA-Amplifikationsprodukts beschrieben. Die Hybridisation des Amplifikationsprodukts an Genotyp-spezifische Sonden wird in Lösung oder als feste Phase mit daran gebundenen Genotyp-spezifischen Sonden vorgenommen. Da die Produkte der verstärkten isothermen linearen Amplifikationsmethoden einzelsträngig sind, eignen sich diese Produkte ideal zur Bindung an eine feste Phase, z.B. einen Glasträger, um ein Array von räumlich getrennten spezifischen Sonden (d.h. einen Genchip) zu erzeugen. Alternativ umfasst die feste Phase Partikel, an die spezifische Sonden gebunden werden. Der Nachweis der Sonden-Hybridisation an die Amplifikationsprodukte wird mittels verschiedener im Fachgebiet bekannter Methoden durchgeführt, wie z.B. beschrieben bei Sambrook et al., supra. Die spezifische Sonde wird markiert, woraufhin eine Veränderung der Spektraleigenschaften der Markierung aufgrund der Hybridisation nachgewiesen und durch Computer-Algorithmen aufgezeichnet wird.
  • Die Partikelbindung aufgrund der Hybridisation spezifischer Sonden an Amplifikationsprodukte wird ebenfalls zum Nachweis der Sonden-Hybridisation eingesetzt. Markierte Amplifikationsprodukte werden erzeugt und die Produkthybridisation an auf den festen Oberflächen immobilisierte Sonden nachgewiesen und durch Computer-Algorithmen aufgezeichnet. Die Erzeugung eines markierten Amplifikationsprodukts wird durch Einbau markierter rNTPs während des Transkriptionsschritts vorgenommen, indem eines der vier rNTPs durch ein rNTP-Analogon, das markiert ist, ersetzt wird. Bei der Markierung handelt es sich um einen Farbstoff, oder um ein kleines Molekül wie Biotin, welches dann durch Bindung an eine spezifische Bindungseinheit, wie etwa markiertes Streptavidin, nachgewiesen wird. Methoden zum Nachweis der Sonden-Hybridisation an feste Oberflächen sind im Fachgebiet bekannt.
  • Beispiel 11: Genotypisierung durch rSSCP (einzelsträngiger RNA-Konformations-Polymorphismus)
  • Die Genotypisierung wird durch Amplifikation der spezifischen Ziel-Nukleinsäuresequenz unter Anwendung der hierin beschriebenen Methoden und durch Bestimmung des elektrophoretischen Bandenmusters des einzelsträngigen RNA-Produkts, welches die einzelsträngige Konformation wiederspiegelt, vorgenommen. Die Verwendung von SSCP zum Nachweis einer Sequenzveränderung findet breiten Einsatz. Die Genotyp-spezifische einzelsträngige Konformation wird durch Unterziehen der Proben einer Gel- oder Kapillarelektrophorese bestimmt. Die Erzeugung eines einzelsträngigen Produkts durch Amplifikation der Ziel-Nukleinsäuresequenz gemäß der Methode der Erfindung macht diese Methode für die Genotyp-Bestimmung mittels einer Kombination aus der Amplifikationsmethode und der rSSCP-Analyse besonders geeignet.
  • Gereinigte genomische Test-DNA wird mit Komponenten der Amplifikationsmethode der Erfindung, wie oben beschrieben, und dem Ziel-spezifischen zusammengesetzten Primer und einer Propromotor-Sequenz wie PTO kombiniert. Die Kombination wird den Bedingungen für die isotherme Amplifikation der Zielsequenz unterzogen. Das Reaktionsgemisch, das das Amplifikationsprodukt enthält, wird entweder einer Gelelektrophorese oder einer Kapillarelektrophorese unter Verwendung der im Fachgebiet bekannten Instrumente und Bedingungen unterzogen. Das elektrophoretische Bandenmuster des Amplifikationsprodukts wird bestimmt. Die Sichtbarmachung des Oligonukleotidprodukts wird durch Aufnahme eines Farbstoff-Interkalators erreicht. Das elektrophoretische Muster des Amplifikationsprodukts wird mit dem der Amplifikationsprodukte verglichen, die durch Amplifikation der aus Zellen eines bekannten Genotyps erhaltenen Ziel-Nukleinsäuresequenz erzeugt werden. Jegliche Veränderung des elektrophoretischen Mobilitätsmusters ist für eine Sequenzvariabilität indikativ. Die Kombination aus der Amplifikationsmethode der Erfindung und rSSCP bietet eine einfache Methode sowohl für die Aufdeckung eines Sequenzpolymorphismus bei definierten Zielsequenzen als auch den Nachweis zuvor definierter Genotypen. Das elektrophoretische Muster bekannter Nukleinsäuresequenzen, oder definierter Genotypen, kann vorab bestimmt werden, und das durch Produkte der Amplifikation der Test-DNA erzeugte Muster mit bekannten Mustern für die Genotyp-Bestimmung verglichen werden.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00990001
  • Figure 01000001
  • Figure 01010001
  • Figure 01020001
  • Figure 01030001

Claims (30)

  1. Verfahren zum Amplifizieren einer Polynukleotidsequenz, die zu einer Ziel-Polynukleotidsequenz komplementär ist, welches umfasst: (a) Bereitstellen eines Komplexes, umfassend: (i) eine DNA-Template, die die Zielsequenz umfasst; und (ii) ein zusammengesetztes Primer-Extensionsprodukt, welches durch Extendieren mit DNA-Polymerase eines zusammengesetzten Primers erhalten wird, der einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst, wobei das zusammengesetzte Primer-Extensionsprodukt an die DNA-Template hybridisiert wird; (b) Spalten des RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primer-Extensionsprodukts mit einem Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid spaltet, so dass ein anderer zusammengesetzter Primer an die DNA-Template hybridisiert; (c) Wiederholen der Primer-Extension mit DNA-Polymerase durch Strangverdrängung; (d) Wiederholen der Schritte (b) und (c), wobei vielfache Kopien der komplementären Sequenz der Zielsequenz erzeugt werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Komplex außerdem ein Polynukleotid umfasst, welches eine Terminations-Polynukleotidsequenz umfasst, die an eine Region der Template hybridisiert ist, welche 5' bezüglich der Hybridisation des zusammengesetzten Primers an die Template liegt.
  3. Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Polynukleotidsequenz, welches das Ausführen des Verfahrens nach Anspruch 2 umfasst, und darüber hinaus umfasst: (e) Hybridisieren des verdrängten Primer-Extensionsprodukts eines Polynukleotids, welches einen Propromotor und eine Region umfasst, die an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt unter Bedingungen hybridisiert, welche das Eintreten der Transkription mittels RNA-Polymerase ermöglichen, so dass RNA-Transkripte erzeugt werden, die zu den verdrängten Primer-Extensionsprodukten komplementäre Sequenzen umfassen, wobei vielfache Kopien der Zielsequenz erzeugt werden.
  4. Verfahren zum Sequenzieren einer Ziel-Polynukleotidsequenz, welches das Ausführen des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2 umfasst, wobei die Primer-Extension das Extendieren des zusammengesetzten Primers zu einer Terminationsstelle mit DNA-Polymerase und einem Gemisch von dNTPs und dNTP-Analoga umfasst, so dass die Primer-Extension bei Einbau eines dNTP-Analogons beendet wird; wobei vielfache Kopien der komplementären Sequenz zur Zielsequenz von variierenden Längen erzeugt werden; das Analysieren des Produkts aus dem Verfahren zur Bestimmung der Sequenz.
  5. Verfahren zum Sequenzieren einer Ziel-Nukleotidsequenz, welches das Ausführen des Verfahrens nach Anspruch 2 umfasst und darüber hinaus umfasst: (e) Hybridisieren an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt eines Polynukleotids, welches einen Propromotor und eine Region umfasst, die an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt unter solchen Bedingungen hybridisiert, dass die Transkription aus dem Extensionsprodukt durch RNA-Polymerase stattfindet, unter Verwendung eines Gemischs von rNTPs und rNTP-Analoga, so dass RNA-Transkripte erzeugt werden, die Sequenzen umfassen, welche zu den verdrängten Primer-Extensionsprodukten komplementär sind, so dass die Transkription auf den Einbau eines rNTP-Analogon hin beendet wird, wobei vielfache Kopien der Zielsequenz von variierenden Längen erzeugt werden; (f) Analysieren des Produkts aus Schritten (a) bis (e) zur Bestimmung der Sequenz.
  6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der zusammengesetzte Primer einen 5'-RNA-Abschnitt benachbart an den 3'-DNA-Abschnitt umfasst.
  7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Vielzahl der zusammengesetzten Primer verwendet wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 2 oder einem der davon abhängigen Ansprüche, wobei das Polynukleotid, das eine Terminations-Polynukleotidsequenz umfasst, ein Template-Switch-Oligonukleotid (TSO) oder eine Blockiersequenz ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das TSO oder die Blockiersequenz eine Modifikation in der Region umfasst, welche an die Template hybridisiert, wobei, unter einer gegebenen Reihe von Bedingungen, das TSO oder die Blockiersequenz fester an die Region bindet im Vergleich zu einem TSO bzw. einer Blockiersequenz ohne die Modifikation.
  10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Enzym, das RNA spaltet, RNaseH ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 5 oder einem der davon abhängigen Ansprüche, wobei das Polynukleotid, das einen Propromotor und eine Region umfasst, die an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt hybridisiert, ein Template-Switch-Oligonukleotid (TSO) ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 5 oder einem der davon abhängigen Ansprüche, wobei das Polynukleotid, das den Propromotor umfasst, eine Region am 3'-Ende enthält, welche an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt hybridisiert, wobei die DNA-Polymerase-Extension des verdrängten Primer-Extensionsprodukts einen doppelsträngigen Promotoren erzeugt, woraus die Transkription erfolgt.
  13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der zusammengesetzte Primer einen 5'-RNA-Abschnitt von etwa 5 bis 20 Nukleotiden und einen 3'-DNA-Abschnitt von etwa 5 bis 15 Nukleotiden umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der 5'-RNA-Abschnitt 10 bis 15 Nukleotide und der 3'-DNA-Abschnitt 7 bis 12 Nukleotide beträgt.
  15. Verfahren zum Charakterisieren einer interessierenden Sequenz in einem Ziel-Polynukleotid, welches Verfahren umfasst: (i) Amplifizieren einer Template-Polynukleotidsequenz, welche die interessierende Sequenz enthält, mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 6 bis 10, 13 oder 14, wobei die Sequenz des RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers bekannt ist, und (ii) Vergleichen der Amplifikationsprodukte, sofern vorhanden, aus Schritt (i) mit der Menge an Amplifikationsprodukten aus einer Referenz-Template, wobei (a) die Erzeugung nachweislich geringerer Mengen an Amplifikationsprodukten von der Template im Vergleich zur Menge an Amplifikationsprodukten von der Referenz-Template, welche eine Region umfasst, die zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementär ist, anzeigt, dass das Ziel-Polynukleotid keine Sequenz umfasst, die zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementär ist und eine Sequenz-Variante bezüglich der Sequenz ist, die zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementär ist; oder (b) die Erzeugung nachweislich größerer Mengen an Amplifikationsprodukten von der Template im Vergleich zur Menge an Amplifikationsprodukten von der Referenz-Template, welche keine Region umfasst, die komplementär zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers ist, anzeigt, dass das Ziel-Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementär ist und keine Sequenz-Variante bezüglich der Sequenz ist, die zum RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementär ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Sequenz des RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers eine Sequenz umfasst, die zu einer Wildtyp-Sequenz komplementär ist, und die interessierende Sequenz beim Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der Wildtyp-Sequenz charakterisiert wird; oder die Sequenz des RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers eine Sequenz umfasst, die zu einer mutanten Sequenz komplementär ist, und die interessierende Sequenz beim Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der mutanten Sequenz charakterisiert wird; oder die Sequenz des RNA-Abschnitts des zusammengesetzten Primers eine Sequenz umfasst, die zu einer allelen Sequenz komplementär ist, und die interessierende Sequenz beim Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit der allelen Sequenz charakterisiert wird.
  17. Verfahren zum Nachweisen einer Mutation in einem Ziel-Polynukleotid durch einzelsträngigen Konformations-Polymorphismus, umfassend (a) das Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 6 bis 10, oder 13 oder 14; und (b) das Analysieren der amplifizierten Produkte aus dem Verfahren für die einzelsträngige Konformation, wobei eine Differenz bei der Konformation im Vergleich zu einem einzelsträngigen Referenz-Polynukleotid eine Mutation im Ziel-Polynukleotid anzeigt.
  18. Verfahren zum Herstellen eines Mikroarrays, umfassend (a) das Durchführen des Amplifikationsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 6 bis 10, 13 oder 14; und (b) das Anlagern der amplifizierten Produkte an ein festes Substrat zum Erhalt eines Mikroarrays der amplifizierten Produkte.
  19. Zusammensetzung, umfassend (a) einen zusammengesetzten Primer, welcher zusammengesetzte Primer einen 3'-DNA-Abschnitt und einen 5'-RNA-Abschnitt umfasst, und (b) ein Polynukleotid, welches eine Terminations-Polynukleotidsequenz umfasst, die ein Template-Switch-Oligonukleotid enthält, wobei die Terminations-Polynukleotidsequenz die Beendigung der DNA-Replikation einer Template durch DNA-Polymerase bewirkt.
  20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der zusammengesetzte Primer einen 5'-RNA-Abschnitt benachbart an den 3'-DNA-Abschnitt umfasst.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, wobei der 5'-RNA-Abschnitt etwa 5 bis 20 Nukleotide und der 3'-DNA-Abschnitt etwa 5 bis 15 Nukleotide umfasst.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 19, 20 oder 21, wobei die TSO eine Modifikation in der Region umfasst, welche an die Template hybridisiert, wobei, unter einer gegebenen Reihe von Bedingungen, die TSO enger an die Region bindet im Vergleich zu einer TSO ohne die Modifikation.
  23. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, welche außerdem ein Propromotor-Template-Oligonukleotid (PTO) umfasst.
  24. Reaktionsgemisch, umfassend (a) eine Polynukleotid-Template; (b) eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 23; und (c) DNA-Polymerase.
  25. Reagenzsatz zum Amplifizieren einer Ziel-Polynukleotidsequenz, umfassend (a) einen zusammengesetzten Primer, der einen 3'-DNA-Abschnitt und einen RNA-Abschnitt umfasst, und (b) ein Polynukleotid, das eine Terminations-Polynukleotidsequenz umfasst, welche ein Template-Switch-Oligonukleotid enthält, wobei die Terminations-Polynukleotidsequenz die Beendigung der DNA-Replikation einer Template durch DNA-Polymerase bewirkt.
  26. Reagenzsatz nach Anspruch 25, wobei der zusammengesetzte Primer einen 5'-RNA-Abschnitt umfasst, welcher sich benachbart an den 3'-DNA-Abschnitt befindet.
  27. Reaktionsgemisch oder Reagenzsatz nach einem der Ansprüche 24 bis 26, welches außerdem ein Enzym umfasst, welches RNA von einem RNA/DNA-Hybrid spaltet.
  28. Reaktionsgemisch oder Reagenzsatz nach Anspruch 27, wobei das Enzym RNaseH ist.
  29. Reaktionsgemisch oder Reagenzsatz nach einem der Ansprüche 24 bis 28, welches außerdem ein Polynukleotid umfasst, das einen Propromotor enthält.
  30. Reaktionsgemisch oder Reagenzsatz nach Anspruch 29, wobei das Polynukleotid, welches einen Propromotor enthält, ein Propromotor-Template-Oligonukleotid (PTO) ist.
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