CN101743470A - 共聚物测定 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于评价一种氨基酸共聚物的一种或多种特性的方法和组合物。

Description

共聚物测定
领域
在此披露的主题总体涉及对络合的肽或多肽混合物进行表征的方法。更具体地说，在此披露的主题涉及基于细胞的方法，用于评价一种氨基酸聚合物的一种或多种特性。
背景
聚合物1是一种多肽的络合的混合物，这些多肽从以下氨基酸的聚合中得以制备：谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸以及酪氨酸。共聚物1也被称为醋酸格拉默，并且具有以下结构式：
(Glu，Ala，Lys，Tyr)x XCH3COOH
(C5H9NO4·C3H7NO2·C6H14N2O2·C9H11NO3)x·XC2H4O2
醋酸格拉默(GA)是
Figure G2008800211734D00011
(Teva Pharmaceutical IndustriesLtd.，Israel)的活性组分，它包括合成的多肽的醋酸盐，这些多肽包含四种自然发生的氨基酸：L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-酪氨酸、以及L-赖氨酸，其中报告的平均摩尔分数分别是0.141、0.427、0.095、以及0.338。
醋酸格拉默用于治疗复发-缓解形式的多发性硬化症(RRMS)
概述
本发明提供了用于评价一种候选药剂(例如，一种氨基酸共聚物，例如共聚物-1；例如，醋酸格拉默)中的一种或多种特性的方法和组合物。在一方面，对于生理、药效学、药物代谢动力学、或药学特性，包括但不限于效能(potency)、特异性、稳定性、生物活性(例如，对于作为(例如)用于治疗自身免疫性和/或炎性疾病、病症或机能障碍的药物配制品的稳定性)，本发明提供了用于评价一种氨基酸共聚物制备品的多个实施方案。
在一个实施方案中，在此说明的一种方法或测定包括(a)将(i)产生或分泌由一种促炎分子所调节的一种或多种蛋白质的至少一个细胞、与(ii)一定量的氨基酸共聚物、以及(iii)该促炎分子，在足以诱导这个或这些细胞产生或分泌所调节的蛋白质的一个浓度下以及一段时间中进行接触。可检测一种或多种受调节的蛋白质(或者对于该一种或多种受调节的蛋白质的报告基因)的产生、分泌、诱导、存在或水平，并将其与这种氨基酸共聚物的一种特性相联系。在另一个实施方案中，用于评价一个氨基酸共聚物的方法包括：(a)提供至少一个细胞，该细胞能够表达由一种细胞因子所诱导的蛋白；(b)将该至少一个细胞与一定量的这种氨基酸共聚物以及这种细胞因子在一个浓度以及一个时间段内相接触，该浓度以及该时间段足以诱导该细胞表达所诱导的蛋白质；(c)测量所诱导的蛋白质的表达、分泌、诱导、存在或水平；并且(d)将所诱导的蛋白质的经测量的表达、分泌、诱导、存在或水平与对于一种上市的醋酸格拉默的药物制剂的一个参考值、一种细胞诱导特性分布或一种药物规格进行比较以评价这种氨基酸共聚物的一种特性。能够表达由细胞因子所诱导的蛋白质的细胞是以下细胞，与在这种细胞因子的缺失下这个细胞将要表达的相比，在暴露于足够水平的细胞因子时这个细胞将会表达更多的这种蛋白质。当然，在这种细胞因子的缺失下这个细胞可以表达这种蛋白质。这个细胞能够表达多于一种的由该细胞因子所诱导的蛋白质。产生或分泌这种蛋白质的细胞是表达这种蛋白质的细胞。
还说明了用于评价一种氨基酸共聚物的一种特性的方法，包括：(a)提供至少一个细胞，该细胞能够表达由一种细胞因子所诱导的蛋白质；(b)将该至少一个细胞与一定数量的这种氨基酸共聚物以及这种细胞因子在一个浓度以及一个时间段内相接触，该浓度以及该时间段足以诱导该细胞表达由这种细胞因子所诱导的一种或多种蛋白质；并且(c)对所诱导的蛋白质进行检测以评价这种氨基酸共聚物的一种特性。
还说明了评价一种氨基酸共聚物的一种特性的方法，该方法包括：(a)提供了至少一个细胞，该细胞能够分泌或产生由一个细胞因子所调节的一种或多种蛋白；(b)将该至少一个细胞与一定量的这种氨基酸共聚物以及所述细胞因子在一个浓度以及一个时间段内相接触，该浓度以及该时间段足以诱导该细胞分泌或产生由这种细胞因子所调节的一种或多种蛋白质；并且(c)对所调节的一种或多种蛋白质进行检测以评价这种氨基酸共聚物的一种特性。
这种氨基酸共聚物制备品的(例如，一种测试氨基酸共聚物制备品的)一种或多种特性(如效能、特异性、稳定性、和/或生物活性)可以通过以下方法进行评价：将来自于这种测定的结果(例如，对应于一种受调节的蛋白质的诱导、产生、分泌、存在或水平的定性或定量的测定值)与一个参考值进行比较，例如，预先确定的与共聚物的效能、特异性、稳定性、和/或生物活性的特定水平相关联的一个值，例如，预先确定的与适宜于用于治疗在此说明的疾病、失调、或机能障碍的一种药物配置品的共聚物的效能、特异性、稳定性、和/或生物活性的水平相关联的一个值)。在一个实施方案中，该参考值是对于一种上市的醋酸格拉默的药物制剂的对于效能、特异性、稳定性、和/或生物活性的一种细胞因子诱导特性分布、等价范围、或药物规格。在其他实施方案中，该参考值是通过直接测量一种参比化合物(例如，一种参比的醋酸格拉默制剂)的一种特性所确定的一个值。在一个实施方案中，这个测试值如果在该参考值的25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％或更小之内则被认为与这个参考值是可比的。
在一个实施方案中，在该测定中所使用的细胞是一个白细胞，例如一个髓样细胞，例如一个髓样细胞系或原代细胞，例如血液单核细胞(例如，T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、等等)、血液多形核细胞(例如，嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、嗜中性细胞、巨核细胞、等等)、树突细胞、以及胸腺细胞。这个细胞可以是一个致瘤性髓样细胞系，如THP-1、U937、SiHa、或HL-60。另外地，可以使用哺乳动物的外周血单核细胞、连同衍生自骨髓的单核细胞以及单核细胞。
在一个实施方案中，这种促炎分子是一种促炎细胞因子，例如选择下组，其构成为：肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、以及白细胞介素-8(IL-8)。在另一个实施方案中，这种促炎分子是LPS。
在一个实施方案中，由这种促炎分子所调节的蛋白质(在测定中检测了它的诱导、产生、分泌、存在或水平)是一种趋化因子，例如一种由IFN-γ调节的趋化因子。在一个实施方案中，这种趋化因子是选择下组，其构成为：γ-干扰素诱导蛋白10(IP-10)、干扰素诱导T细胞α-化学吸引物(I-TAC)、由γ-干扰素诱导的单核因子(MIG)。由IFN-γ所诱导的其他可溶性蛋白质或细胞因子，包括那些在表1中所显示的。受调节的蛋白质的诱导、产生、分泌、存在或水平可直接(例如)通过一种基于抗体的方法(如ELISA)，或间接的(例如)通过领域内已知的检测对于这种蛋白质的转录物的技术或通过使用一种受体基因测定来进行检测。
在一些实施方案中，将这个或这些细胞暴露至这种氨基酸共聚物以及这种促炎细胞因子导致了这些由细胞因子调节的蛋白质中的一种或多种的协同诱导。在一个实例中，将髓样细胞暴露至这种氨基酸共聚物(例如，醋酸格拉默)并且IFNγ导致了由一种或多种由IFNγ诱导的趋化因子或细胞因子(例如，IP-10、I-TAC、MIG、和/或其他CXCR3)的协同诱导。在一个实施方案中，受调节的细胞因子的诱导可以是超过对照值(例如，超过阴性对照，其中没有促炎分子和/或没有共聚物)至少5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍、300倍或更多。
本发明进一步提供了制备醋酸格拉默的一种药物组合物的方法，包括制备一个批次的醋酸格拉默，通过在此说明的一种方法来评价这种组合物的效能、特异性、生物活性和/或稳定性，并且如果检测到预先确定的水平的一种或多种由该细胞因子所调节的蛋白质和/或如果将这种受调节的蛋白质诱导到参考值的80％至125％之内(例如，至少80％、85％、90％、95％、98％、100％、110％、115％、120％、125％)的水平，则确定这种醋酸格拉默克对于药物用途是可接受的。
还说明了用于制备包含醋酸格拉默的一种药物组合物的方法，包括：将L-丙氨酸、受苄基保护的L-谷氨酸、受三氟乙酸(TFA)保护的L-赖氨酸以及L-酪氨酸的N-羧基酸酐进行聚合，以产生一种受保护的共聚物；对这种受保护的共聚物进行处理以使这种受保护的共聚物部分地解聚并且使受苄基保护的基团脱保护，并且使受TFA保护的赖氨酸脱保护以产生醋酸格拉默；并且将该醋酸格拉默分离出，其中这种改进包括：在一种细胞因子以及所分离的醋酸格拉默的样品的存在下对一个髓样细胞或一个原代髓样细胞系中的由细胞因子诱导的蛋白质的表达进行测量，并且将这种表达与参考值进行比较。在本制备方法的不同实施方案中：这种细胞因子是IFNγ；如果所测量的表达与该参考值之间的差异在一个预先确定的范围之内，则这项改进进一步包括选择这种经纯化的醋酸格拉默用于一种药物组合物的制备；并且这项改进进一步包括：制备一种药物组合物，该组合物包括所选择的经纯化的醋酸格拉默中的至少一部分。
以上已经对在此所披露的主题中的某些方面进行了叙述，它们通过本披露的主题而全部或部分得以解决，在如以下在此进行最佳说明与所附的实例和附图相联系时，随着说明的进行其他方面将变得明显。
附图的简要说明
图1展示了在大概24小时内在不同包含血清或无血清的培养基中在恒定的IFNγ的浓度下(10ng/ml)IP-10、I-TAC、以及MIG的分泌。在50、10、2、以及0μg/ml醋酸格拉默(GA)下对10％FBS条件进行测试。在50和0μg/ml GA下对2％FBS、0％FBS、以及X-VIVO15条件进行了分析。M表示在100μg/ml下所测定的甘露糖对照载体。柱条上方的数字表示超过该对照值(0μg/ml)的增加倍数。
详细说明
现在将在下文中参照附图对在此披露的主题进行更全面的说明，在附图中显示了在此披露的主题中的实施方案中的一些、而非其全部。本领域的普通技术人员会想起在此所给出的在此披露的主题中的多个变更以及其他实施方案，对于本领域的普通技术人员而言在此披露的主题涉及具有在上述说明和附图中所呈现的传授内容的益处。因此，应当理解的是在此披露的主题不应当限于所披露的特定额实施方案，并且变更和其他实施方案旨在包含在所附的权利要求的范围之内。虽然在此采用了特定的术语，但是它们仅在属类和说明性的意义上进行使用，并且不用于限制性的目的。
在长期的专利法律条约之后，术语“一种”、“一个”、以及“该”当在本申请(包括这些权利要求)中使用时是指“一个或多个”。因此(例如)，提及“一个样品”包括多个样品，除非内容明确地指向相反处(例如，多个样品)，以及等等。
通过引用将所有公开文献、专利申请、专利、以及其他参考文件全部结合在此，其程度就如同对每个单独的公开文献、专利申请、专利、以及其他参考文献专门地以及单独地指明通过引用进行结合。应当理解的是，尽管在此参考了多个专利申请、专利、以及其他参考文献，但是这种参考文献并不构成一种承认，即这些文件中的任何一个形成了本领域内通常的大体知识的部分。
概况
本发明提供了用于评价一种共聚物制备品的一个或多个特性的方法和组合物，该制备品可用作一种治疗性制备品，例如用于治疗一种自身免疫性、神经退行性、脱髓鞘性或炎性病症。在此说明的这些测定可以是在本领域中已知的任何一种形式，包括细胞培养测定、器官培养测定、或离体测定。
如在此所使用，“共聚物”、“氨基酸共聚物”、或“氨基酸共聚物配制品”是多肽的异质性混合物，这些多肽由限定的多个不同的氨基酸所构成(典型地在2至10个之间的不同的氨基酸，如在3至6个之间)。共聚物可从单独的氨基酸的聚合作用中得以制备，或可进行重组生产。术语“氨基酸”不局限于自然发生的氨基酸，而可以包括氨基酸的衍生物和/或氨基酸的类似物。例如，在包括酪氨酸氨基酸的氨基酸共聚物中，这些氨基酸中的一个或多个可以是高酪氨酸。而且，在两个相邻的残基之间具有一个或多个非肽键或模拟肽的键的氨基酸共聚物包括在这一定义之内。考虑到在这种混合物中每种多肽的分子量，共聚物是不一致的。
在本发明的一个实施方案中，这种氨基酸共聚物是多肽的混合物，这些多肽包括氨基酸Y、E、A、以及K；Y、F、A、以及K；V、Y、A、以及K；V、W、A、以及K；V、E、A、以及K；Y、F、A、以及K；V、W、A、以及K；W、E、A以及K，或F、E、A、以及K。在本发明的另一个实施方案中，这种氨基酸聚合物包含四种不同的氨基酸，每一个均来自以下组中的不同的一个：(a)赖氨酸和精氨酸；(b)谷氨酸和天冬氨酸；(c)丙氨酸和甘氨酸；(d)酪氨酸和色氨酸。根据本发明的这个实施方案的特定的共聚物包括多肽的混合物，这些多肽包括丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、以及酪氨酸。在一个实施方案中，这种共聚物包括多肽的混合物，这些多肽由氨基酸Y、E、A、以及K所构成，也被称为共聚物1(Cop 1)或醋酸格拉默。在另一个实施方案中，这种氨基酸共聚物含有三个不同的氨基酸，每一个均来自三个以上提及的组(a)至(d)中的不同的一个，例如Y、A、以及K；Y、E、以及K；K、E、以及A；或者Y、E、以及A。
在另一个实施方案中，这种氨基酸共聚物包括选自下组的氨基酸，该组的构成为：丙氨酸-谷氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸(A-E-K-Y-A)、丙氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸(A-E-K-V-A)、丙氨酸-谷氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸(A-E-K-F-A)、丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸-谷氨酸(A-K-Y-A-E)、谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸(E-A-K-Y-A)、丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸(A-K-V-A-E)、以及谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸(E-A-K-V-A)、丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸(A-K-F-A-E)、以及谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸(E-A-K-F-A)。
“促炎分子”是刺激了白细胞、上皮细胞、基质细胞的激活的分子，或导致了炎性免疫反应的扩增或传播的基质细胞。促炎分子可诱导产生激活标记物(例如，CD69、CD25、CD54、CD40配体、CD11b、CD62L、CD83、CD95)、和/或其他促炎细胞因子的分泌、和/或来自免疫细胞的趋化因子的分泌(如CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、以及肥大细胞)。促炎细胞因子是一种小的、分泌的蛋白质，它具有如在此说明的促炎分子的特性，例如IFN-γ。这种定义不排除还可能在一些背景中具有抗炎性活性的分子。
“趋化因子”是一种具有趋化活性的细胞因子。趋化因子的实例包括IL-8、RANTES、MIP-1a、MCP-1、IP-10、Mig、I-TAC、TARC、I-309。
在此说明的不同方法可用于通过将一种测定共聚物制备品与一种或多种预先确定的参考值(如对于醋酸格拉默的效能、特异性、稳定性、以及生物活性的药物规格值)进行比较来评价这种测试共聚物制备品的一种或多种特性，如效能、特异性、稳定性、纯度、以及生物活性。在一些例子中，可以通过与一种已知的药剂进行比较来确定参考值。这种已知的药剂在此是指“参比药剂”或“参比化合物”。本发明的一种优选的参比药剂是一种氨基酸共聚物(例如，醋酸格拉默的一种药物制剂)，它适宜作为一种药物配制品来进行使用，例如它已显示出在一种或多种自身免疫性、退行性、脱髓鞘性、和/或炎性病症或病况中具有治疗效果。提及“治疗效果”旨在指该药剂能够预防、治疗、或减轻与这种病症或病况相关联的症状。
在一个实施方案中，这个参考值是对于醋酸格拉默的一种预先确定的药物规格值。在一个实施方案中，这个参考值是醋酸格拉默的药物制剂。在一个实施方案中，当与外源性提供的细胞因子和共聚物1进行共同给药时，在不同细胞类型中观察到由细胞因子调节的蛋白质的协同诱导。如在此所使用，术语“协同的”是指以下两种或多种药剂(例如，醋酸格拉默和一种细胞因子)，与每个单一药剂单独用的各自的效果之和相比，它们在组合中要更加有效。这种由细胞因子调节的蛋白质的协同诱导作用可用于对一种测定共聚物制备品进行包括生物活性的多种特性的筛选，这些特性与醋酸格拉默是可比的。
醋酸格拉默已被批准用于减少患有复发-缓解的多发性硬化症的病人中复发的频度。多发性硬化症已被归于一种自身免疫性疾病。醋酸格拉默已被披露用于治疗其他自身免疫疾病、炎性非自身免疫疾病，并且促进神经再生，和/或防止或抑制原发性神经系统损伤之后的继发性变性。此外，醋酸格拉默已被披露为用于免疫介导性疾病连同与脱髓鞘相关的疾病的治疗。在此披露的这些方法可用于就作为用于这些病症中任何一种的药物制剂的稳定性来评价一种醋酸格拉默制剂的活性。
体外测定
本发明的这些方法和组合物包括用于评价一种候选药剂(例如，一种氨基酸共聚物)的一种或多种特性的测定。在一个实施方案中，使用体外测定对一种测试共聚物制备物进行筛选，以评价这种共聚物制备对由一种促炎细胞因子调节的一种或多种蛋白质的生产和/或分泌的作用。将在一种测试共聚物制备物的存在下由促炎细胞因子调节的这种或这些蛋白质的水平与在一种参比药剂的存在下在相同的细胞类型中由促炎细胞因子调节的那种或那些蛋白质的水平进行比较。诱导的水平(即，定性或定量的水平)和本质(即，蛋白质的种类)在此是指“细胞因子诱导特性分布”。这种细胞因子诱导特性分布能用于评估一种氨基酸共聚物的一种或多种特性，如效能、稳定性、特异性、以及生物活性。在一个实施方案中，当一种测试共聚物制备物的细胞因子诱导特性分布(例如，诱导的水平或相似的被诱导的蛋白质的数目、或二者皆有)在对于一种共聚物药物组合物(例如，多个
Figure G2008800211734D00101
)的一个参考值或特性分布的大约80％与大约125％之间，包括大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％、大约100％、大约105％、大约110％、大约115％、大约120％、达到大约125％时，则将这种测定共聚物制备物说明为是适宜作为一种药物组合物的。在另一个实施方案中，当一种测试共聚物制备物的细胞因子诱导特性分布(例如，诱导的水平或相似的被诱导的蛋白质的数目、或二者皆有)在一种参比共聚物制备物(例如，
Figure G2008800211734D00102
)的大约80％与大约125％之间，包括大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％、大约100％、大约105％、大约110％、大约115％、120％、达到大约125％时，则将这种测试共聚物制备物说明为是具有与这种参比共聚物制备物基本上相同的特性的。
在一个实施方案中，这种参考物是一种氨基酸共聚物，该氨基酸共聚物在一种或多种自身免疫性或炎性病症方面具有已知的治疗效果。在一个特定的实施方案中，这种参比药剂是醋酸格拉默。这个参考值可以是一个预先确定的值，该值对应于醋酸格拉默的某个水平的效能、纯度、稳定性或其他活性。
将一个或多个能够产生或分泌由细胞因子调节的蛋白质的细胞与一种候选药剂或一种参比药剂在一个浓度以及一个时间段内相接触，该浓度以及该时间段足以诱导这种由细胞因子调节的蛋白质。这种测定可包括两种或多种细胞类型，它们可以是原代细胞、细胞系、或它们的组合。对于诱导由细胞因子调节的蛋白质所足够的这种浓度和时间是以下情况，即这导致了这种由细胞因子调节的蛋白质的可检测的产生或分泌高于缺失这种候选或参比药剂时该蛋白质的水平(例如，高于由这种细胞因子所调节的蛋白质的基线水平)。这种候选药剂的浓度可以按照以下浓度存在于测定培养基中：至少约0.05μg/mL、至少约1μg/mL、至少约2μg/mL、至少约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约375、约400、约425、约450、约475、至少约500μg/mL或更大，只要该浓度没有达到细胞毒性的浓度。
可以用能够分泌或产生这种由细胞因子调节的蛋白质将这种候选药剂或参比药剂孵育(即，“接触”)至少约1小时、至少约1.5小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、约5小时、约6小时、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约40、约45、约48或更多小时。
在一个实施方案中，可外源性地将以上说明的调节这种蛋白质表达的促炎细胞因子的量加至这种测定培养基中。可以在加入这种测试或参比共聚物制备物之前、同时、或之后加入这种细胞因子。在一个实施方案中，在这种测试或参比共聚物制备物加入的同时加入这种细胞因子。这种细胞因子可以按照以下浓度存在于测定培养基中：至少约1ng/ml、至少约2ng/ml、至少约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约40、至少约50ng/ml或更大，只要该浓度没有达到细胞毒性的浓度。在一些实施方案中，这种细胞因子异源性地表达于这种测定的宿主细胞中。这种异源性的基因可在一种组成型或一种可诱导性的启动子的控制之下。
在本发明的不同方面，在此说明的调节一种或多种蛋白质的产生和分泌的细胞因子是一种促炎细胞因子。促炎细胞因子典型地与一种Th1 T细胞反应相关联。在一个实施方案中，这种促炎细胞因子选自下组，该组包括但不局限于TNFα、干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-23(IL-23)、以及淋巴毒素-α。在此处说明的这些测定中，这种细胞因子按照以下浓度而存在，该浓度足以诱导由那种细胞因子调节的一种或多种蛋白质的产生或分泌。在一个实施方案中，这种由细胞因子调节的蛋白质包括由干扰素γ调节的蛋白质(例如，趋化因子)，包括γ-干扰素-诱导蛋白10(IP-10)、干扰素诱导的T细胞α化学吸引物(I-TAC)、以及由γ-干扰素诱导的单核因子(MIG)。在CNS损伤中IP-10、MIG、以及I-TAC表达于实验性自身免疫性脑炎(EAE)以及多发性硬化症(MS)，并且结合这些配体(CXCR3)的受体表达于浸润EAE和MS损伤的T细胞上连同在处于恶化过程中MS患者的脑脊液和外周的T细胞上(综述于Klein et al.(2004)J Immunol172：550-559)。
细胞
在本发明的这些方法中使用多种细胞类型，只要它们能够产生由在此说明的这些细胞因子所调节的一种或多种蛋白质。包括在内(没有限制)的是以下细胞：涉及炎症反应的细胞，例如髓样细胞系或原代细胞(例如，血液单核细胞(例如，T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、等等)、血液多形核细胞(例如，嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、嗜中性细胞、巨核细胞、等等)、以及树突细胞)；以及胸腺上皮细胞。致瘤细胞系如THP-1、U937、SiHa、以及HL-60也包括在内。其他有用的细胞可包括上皮细胞、基质细胞、以及内皮细胞(例如，原代微脉管系统、HUVEC、主动脉内皮细胞)。额外地，还可使用哺乳动物的外周血单核细胞连同衍生自骨髓的单核细胞以及通过淘洗或负性磁珠分离而分离的单核细胞。
细胞培养条件
细胞培养基的配方在文献中是熟知的，并且多种是可商购的。在一个实施方案中，将这些测定中的细胞培养于没有血清的培养基中。用于制备没有血清的培养基的方法在本领域内是熟知的。这些成分可包括氨基酸(D和/L-氨基酸)，如谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、以及缬氨酸以及它们的衍生物；酸性可溶的亚基团如硫胺素、抗坏血酸、三价铁化合物、二价铁化合物、嘌呤、谷胱甘肽以及磷酸二氢钠。
额外地成分可包括糖类、脱氧核糖、核糖、核苷酸、水溶性维生素、核黄素、盐类、痕量金属、脂类、醋酸盐、磷酸盐、HEPES、酚红、丙酮酸盐以及缓冲剂。
经常在培养基配方中使用的其他组分包括脂溶性维生素(包括维生素A、D、E和K)、类固醇和它们的衍生物、胆固醇、脂肪酸和脂类、Tween 80、2-巯基乙醇、连同多种补充物，包括血清(胎、马、小牛、等等)、蛋白质(胰岛素、转铁蛋白、生长因子、激素、等等)、抗生素(庆大霉素、青霉素、链霉素、两性霉素B、等等)、全蛋超滤物、以及附着因子(纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、层粘连蛋白、生腱蛋白、等等)。确定对在本发明的这些方法中有用的细胞进行繁殖的适当条件是普通技术人员所充分熟知的。
这些细胞可以按照本领域内任何一种已知的方式进行培养，包括悬浮培养、单层培养、在珠子上培养或立体培养。细胞和组织培养的方法在本领域内是熟知的，并且将其说明于(例如)Cell & Tissue Culture：Laboratory Procedures；Freshney(1987)，Culture of Animal Cells：AManual of Basic Techniques中。
本发明的实践将采用(除非另外指明)细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA、以及免疫学的常规技术，这些技术史是在本领域之内。此类技术在文献中进行了充分地解释。参见例如Sambrook et al.，ed.(2001)Molecular Cloning ALaboratory Manual(3d Lab Edition；Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；Wu et al.，eds.，Methods In Enzymology，Vols.154and 155；Mayerand Walker，eds.(1988)Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology (Academic Press，London)；Herzenberg，Weir and Blackwell，eds.，(1996)Weir’s Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV。
蛋白质诱导的测量
如在此说明的由细胞因子诱导的蛋白质的诱导可按照多种不同的方法进行评价，这些方法中的每一种对于本领域的普通技术人员而言是已知的。这种测量可以是定性或定量的，只要这种测量能够指明在样品中所感兴趣的由细胞因子调节的蛋白质的水平是处于、高于、或低于参考值。可以将这种由细胞因子诱导的蛋白质中的一种或多种的诱导的水平、连同被诱导的特定的蛋白质(在此是指“细胞因子诱导特性分布”)与一种参比细胞因子诱导特性分布(例如，预先确定的对应于一种特定活性或活性的水平的特性分布)或与一种参比药剂以及一种阴性对照药剂中的一种或多种的细胞因子诱导特性分布进行比较。阴性对照药剂可以是例如，不具有效能或活性的药剂，或在所利用的测定的细胞类型中不诱导由细胞因子调节的蛋白质生产的药剂、或二者皆有。
这种细胞因子诱导特性分布可以被用作一种生物特性或活性的一种量度。诸如效能、特异性、以及稳定性的特性可使用这种细胞因子诱导特性分布进行评价。对于本发明的目的，通过评价一种或多种由细胞因子调节的蛋白质的诱导水平对效能和生物活性进行评价。例如，基于这些结果通过鉴定或区分这种经测定的制备物是否为醋酸格拉默对“特异性”进行评价。通过将这种候选药剂的细胞因子诱导特性分布与这种参比药剂随时间进行比较来对稳定性进行评价。在一些实施方案中，这种细胞诱导特性分布可作为一种参比药剂的等效度量方式而进行使用。
在一个实施方案中，使用一种免疫学的方法对这种由细胞因子诱导的蛋白质的诱导进行检测。可用于检测由细胞因子诱导的蛋白质诱导的免疫学方法包括但不限于，使用基于免疫学技术的竞争性和非竞争性测定系统，如蛋白质免疫印迹法、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、多重ELISA、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定、以及类似物。此类测定在本领域是例行并已知的(参见例如，Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，通过引用将其全文结合在此)。以下对示例性的免疫测定进行简要说明(但并不旨在进行限制)。
免疫沉淀实验方案通常包括从测定培养基中获得上清液(可任选地补充有蛋白磷酸盐和/或蛋白酶抑制剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟化物(phenylmethanesulphonylfluoride)(PMSF)、抑肽酶、钒酸钠)、将所感兴趣的结合分子(即，一种分子，如一种抗体，它与所感兴趣的由细胞因子调节的蛋白质进行特异性结合)加至该上清液中、在大约4℃孵育一段时间(例如，1至4小时)、将蛋白A和/或蛋白G琼脂糖凝胶珠加至细胞裂解液中，在大约4℃孵育约1小时或更多、在缓冲液中对这些珠子进行洗涤并且将这些珠子悬浮于十二烷基硫酸钠(SDS)/样品缓冲液中。结合所感兴趣的分子以便使一种特定的抗原发生沉淀的能力可通过例如，蛋白质免疫印迹法分析进行评估。本领域的普通技术人员应当知道以下参数，这些参数可被修改以增加这种结合分子与一种由细胞因子调节的蛋白质的结合并且减小背景(例如，用琼脂糖凝胶珠子对上清液进行预清除)。对于有关免疫沉淀的实验方案的进一步讨论，参见例如Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York在10.16.1，通过引用将其全文结合在此。
蛋白质免疫印迹法通常包括从测定上清液中制备蛋白质样品、在聚丙烯酰胺凝胶(例如，8％-20％SDS-PAGE，取决于抗原的分子量)中对这些蛋白质样品进行电泳、将这种蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移至一张膜(如硝酸纤维素、PVDF或尼龙)上、在封闭液(例如，具有3％BSA或脱脂奶粉的PBS)中对这张膜进行封闭、在洗涤缓冲液(例如，PB S-Tween 20)中对这张膜进行洗涤、用经封闭缓冲液稀释的所感兴趣的结合蛋白(例如，对于所感兴趣的由细胞因子调节的蛋白质特异的一种抗体)对这张进行封闭、在洗涤缓冲液中对这张膜进行洗涤、用经封闭缓冲液稀释的偶联有一种酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(如，32P或125I)的抗体(该抗体识别所结合的分子，如二抗)对这张膜进行封闭、在洗涤缓冲液中对这张膜进行洗涤、并且检测这种由细胞因子调节的蛋白质的存在。本领域的普通技术人员应该知道以下参数，这些参数可被修改以增加所检测的信号或降低背景噪音。对于有关蛋白质免疫印迹法的实验方案的进一步的讨论，参见例如Ausubel et al，eds，1994，Current Protocolsin Molecular Biology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York在10.8.1，通过引用将其全文结合在此。
ELISA包括制备由细胞因子调节的蛋白质、用所感兴趣的由细胞因子调节的蛋白质或一种包括所感兴趣的由细胞因子调节的蛋白质的测定上清液对96孔微量滴定板的空进行包被、将偶联有一种可检测的化合物(如一种酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的所感兴趣的结合分子加至孔中并孵育一段时间、并检测这种由细胞因子调节的蛋白质的存在。在ELISA中，这种所感兴趣的结合蛋白不必与一种可检测的化合物相偶联；相反，可将偶联至一种可检测的化合物的抗体(它识别所感兴趣的结合分子)加至孔中。此外，不同于用所感兴趣的由细胞因子调节的蛋白质或一种包括所感兴趣的由细胞因子调节的蛋白质的测定上清液对该孔进行包被，可将这种结合分子包被至该孔中。在此情况下，可以在将所感兴趣的由细胞因子调节的蛋白质或一种包括所感兴趣的由细胞因子调节的蛋白质的测定上清液加至经包被的孔中之后加入偶联有一种可检测的化合物的抗体。本领域的普通技术人员应当知道以下参数，这些参数可被修改以增加所检测的信号连同本领域已知的其他ELISA的变化。对于有关ELISA的进一步讨论，参见例如Ausubel et al，eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，在11.2.1通过引用将其全文结合在此。不同的ELISA试剂盒可以从多个商业来源中获得，如BioSource International(Montreal，Canada)、BD Biosciences(San Jose，CA)、R&D Systems(Minneapolis，MN)、Millipore Corp.(Bedford，MA)以及Pierce(Rockville，IL)。
还可以使用基于亲和力的利用与正在进行测量的由细胞因子调节的蛋白质(一种“亲和试剂”，如一种抗体或适体)进行特异性结合的分子的测量，连同其他技术，如基于光谱学的技术(例如，基质辅助激光解吸离子化-飞行时间(或MALDI-TOF)光谱学)。
基于亲和力的技术包括基于抗体的测定(如以上说明的免疫测定)以及利用适体(与其他分子特异性结合的核酸分子)(如ELONA)的测定。额外地，还可以考虑利用抗体和适体的测定(例如，一种三明治式的测定，利用抗体进行捕获并利用适体进行检测)。一般而言，在几乎所有形式的免疫测定中适体可被抗体代替，尽管适体允许其他测定形式，如使用核酸扩增技术(如PCD(U.S.Pat.No.4,683,202)或带有复合引物的等温扩增(U.S.Pat.Nos.6,251,639和6,692,918))的结合适体的扩增。
基于亲和力的测定可以处于竞争或直接反应的形式，利用三明治型的形式，并且可进一步是异质性(例如，利用固体支持物)或同质性的(例如，发生在一个单一的相中)和/或利用免疫沉淀反应。大多数测定涉及使用经标记的亲和力试剂(例如，抗体、多肽、或适体)；这些标记物可以是，例如酶性的，荧光的、化学发光的、放射性的、或染料性的分子。将这些信号从探针中进行扩增的测定也是已知的；它们的实例是利用生物素和抗生物素蛋白、以及经酶标记的以及介导性免疫测定(如，ELISA和ELONA测定)的测定。
在一个异质性的形式中，这种测定利用了两相(典型地是水性液体和固体)。典型地，一种由细胞因子调节的蛋白质特异的亲和力试剂与一种固体支持物相连接以便促进这种由细胞因子调节的蛋白质与样品的主体分开。在反应一段时间(该时间足以允许形成亲和力试剂/由细胞因子调节的蛋白质的复合物)之后，在检测所结合的多肽之前典型地对包含这种抗体的固体支持物或表面进行洗涤。在这种测定中用于测量由细胞因子调节的蛋白质的亲和力试剂可提供在一个支持物(例如，固体或半固体)上；替代性地，样品中的多肽可被固定在一种支持物或表面上。可使用的支持物的实例是硝酸纤维素(例如，以膜或微量滴定孔的形式)、聚氯乙烯(例如，在薄片或微量滴定孔中)、聚苯乙烯胶乳(例如，在珠子或微量滴定板中)、聚偏二氟乙烯、重氮化的纸、尼龙膜、活化的珠子、玻璃以及蛋白A珠。用于这些测定的标准的以及竞争性形式在本领域内是已知的。
阵列型的异质性测定适宜于在利用多种由细胞因子调节的蛋白质来实施本发明的这些方法时测量由细胞因子调节的蛋白质的水平。在本发明的这些方法的实施中所使用的阵列型测定一般会利用具有两种或多种捕获试剂的固体底物，这些捕获试剂对于与处于预先测定的模式(例如，网格)的底物相结合的不同的由细胞因子调节的蛋白质而言是特异的。将这种样品(例如，测定上清液)施用至底物上并且通过这些捕获试剂将样品中的由细胞因子调节的蛋白质进行结合。在去除该样品(并进行适当洗涤)之后，使用适当的检测试剂的混合物对所结合的由细胞因子调节的蛋白质进行检测，这些检测试剂与不同的由细胞因子调节的蛋白质进行特异性结合。这种检测试剂的结合一般使用一种可视系统(如一种基于荧光染色的系统)来完成。因为这些捕获试剂被安置在处于预先测定的模式的底物上，所以阵列型测定提供了检测多种由细胞因子调节的蛋白质的优势，而不需多重性检测系统。
在一种均质性形式中，这种测定发生在一个单一的相(例如，水性液相)中。典型地，用一种亲和力试剂对这种样品进行孵育，这种亲和力试剂对于处于溶液中的由细胞因子调节的蛋白质而言是特异的。例如，可能正是处于将所形成的任何一种亲和力试剂/抗体复合物进行沉淀的条件之下。用于这些测定的标准的以及竞争性的形式在本领域内是已知的。
在一个标准的(直接反应)形式中，直接对由细胞因子调节的蛋白质/亲和力试剂的复合物进行监测。这可以通过以下方法来完成，例如确定一种经标记的检测试剂的量，该检测试剂与由细胞因子调节的蛋白质/亲和力试剂的复合物相结合。在一种竞争性的形式中，通过监测对该复合物中已知量值的经标记的由细胞因子调节的蛋白质(或其他竞争性配体)的结合的竞争性作用来推导出样品中由细胞因子调节的蛋白质的量值。结合或复合物形成的量值可进行定性或定量地确定。
除了免疫测定，可通过评价编码了这些由细胞因子调节的蛋白质的基因的表达、或报告基因的表达的模式而对诱导进行测量。例如，可通过Northern分析、PCR、RT-PCR、Taq Man分析、核糖核酸酶保护测定、FRET检测、监测一种或多种分子信标、与一个寡核苷酸阵列进行杂交、与一个cDNA阵列进行杂交、与一个多核苷酸阵列进行杂交、与一个液态的微阵列进行杂交、与一个微电阵列(microelectricarray)进行杂交、cDNA测序、克隆杂交、cDNA片段指纹图谱、以及类似物而对表达的模式进行评价。所选择的特定的方法将取决于以下因素，如所回收的RNA的量值、技术人员的偏好、可供使用的试剂和设备、检测器、以及类似物。
如本领域的普通技术人员应当理解，检测这种信号的模式将取决于在测定中所利用的确切的检测系统。例如，如果利用了一种经放射性标记的检测试剂，则使用以下技术将对该信号进行测量，这种技术能够对来自该样品的信号进行定量或能够将来自该样品的信号与来自参比样品的信号进行比较，如闪烁计数法、放射自显影法(典型地与扫描光密度测定法相组合)、以及类似方法。如果使用了一种化学发光的检测系统，于是典型地使用一个光度计来测量该信号。用于检测来自检测系统的信号的方法在本领域内是熟知的并且不需要在这里进行进一步说明。
在对多于一种的由细胞因子调节的蛋白质进行测量时，这个样品被分成多个等分部分，其中将分开的等分部分用于测量不同的由细胞因子调节的蛋白质(尽管考虑了将这种样品分成多个等分部分以便允许对一个特定样品中的由细胞因子调节的蛋白质的水平进行多重确定)。替代性地，可对该样品(或来自其中的一个等分部分)进行测试以便使用一种测定来确定在单一反应中多个由细胞因子调节的蛋白质的水平，这种测定能够测量在一个单一的测定(如一种阵列类型的测定或利用多重性检测技术的测定(例如，一个利用标记有不同的荧光染料标记物的测定试剂的测定)中不同的由细胞因子调节的蛋白质的逐个的水平。
进行“重复的”测量在本领域内是常见的。重复的测量通常通过以下方法而获得：将一个样品分解成多个等分部分，并分开地测量相同的测定系统中的分开的反应中的这种或这些生物标记物。重复的测量对于本发明的这些方法而言不是必需的，但本发明的多个实施方案会利用重复的测试，特别是二重或三重测定。在一些实施方案中，使用从相同的细胞培养物中获得的细胞的分开的等分部分来对这种参比试剂和候选试剂进行测定。在另一个实施方案中，使用同一批次的细胞对这种参比试剂(和/或阴性对照)或候选试剂进行测定。在这个实施方案中，对每种试剂测定不同的次数，在多次测量之间替换测定培养基，并且允许这些细胞在每次测量之后恢复到适当的细胞密度。
可以使用任何一种能够执行这些方法和/或记录这些结果的装置来执行在此说明的这些方法和/或对这些结果进行记录。可进行使用的装置的实例包括但不限于电子计算性装置，包括所有类型的计算机。在执行在此说明的这些方法和/或将其记录于计算机时，可进行使用以便将该计算机配置为执行这些方法的步骤的计算机程序可被包含在任何一种能够包含该计算机程序的计算机可读介质中。可进行使用的计算机可读介质的实例包括但不限于磁盘、CD-ROM、DVD、ROM、RAM、以及其他记忆或计算机存储装置。可进行使用以便将该计算机配置为执行这些方法的步骤和/或对这些结果进行记录的计算机程序还可提供于整个电子网络中，例如整个英特网、一个内部网、或其他网络。
将一个测量值与一个参考值进行比较的方法可以按照对于所讨论的由细胞因子调节的蛋白质的任何一种适合于该测量值和参考值的类型的常规方式来进行。如以上所讨论，“测量”可使用定性或定量的测量技术来进行，并且将一个测量值与一个参考值进行比较的方式可根据所采用的测量技术而进行变化。例如，当将一个定性的比色测定用于测量由细胞因子调节的蛋白质的水平时，可通过对已着色的反应产物的强度进行视觉比较、或通过将来自这种已着色的反应的产物的密度测量或光谱测量的数据进行比较(例如，将衍生自该测量装置的数字数据或图像数据(如直方图)进行比较)来对这些水平进行比较。然而，预期的是在本发明的这些方法中所使用的测量值最常见地将会是定量值(例如，浓度的定量测量，如每毫升样品中由细胞因子调节的蛋白质的纳克数、或绝对量)。在其他实例中，测量值是定性的。如对于定性测量，可通过审查这些数字数据、或通过审查这些数据的表述(例如，审查图像表述，如柱形图或线形图)来进行这种比较。
测量值如果它是一个参考值的大约80％至大约125％，则通常被认为是与该参考值基本上相似。
进行比较的方法可以是手动过的(如，由该方法的实施者进行视觉观察)或者它可以是自动的。例如，测定装置(如，用于测量化学发光信号的光度计)可包括电路或软件，它使测量装置能够对于一种由细胞因子诱导的蛋白质来对一个测量值与一个参考值进行比较。替代性地，分开的装置(例如，一种数字计算机)可用于对这种或这些测量值与这种或这些参考值进行比较。用于比较的自动装置可包括对于正在测量的这种或这些由细胞因子调节的蛋白质的所储存的参考值，或者它们可将这种或这些测量值与衍生于同时进行测量的参比样品(例如，醋酸格拉默样品)的参考值进行比较。
如对于本领域的普通技术人员而言应当是明显的，在对于所测试的这种或这些生物标记物而进行测量时，与该参考值进行比较的测量值是考虑了这些重复测量的一个值。通过将这些测量值的平均值或中位值作为“测量值”进行使用而考虑了这些重复的测量。
制备醋酸格拉默的方法
本发明的这些方法和组合物用于评价一个批次的醋酸格拉默的一种或多种特性。这些方法包括制备一个批次的醋酸格拉默、使用在此说明的测定来评价稳定性、特异性、效能、以及生物活性中的一种或多种、并且将该批次的醋酸格拉默的特性与一个参比化合物(例如，一个标准化批次的醋酸格拉默，例如已被批准用于治疗性用途的醋酸格拉默)的特性或对于一种参比化合物的参考值(例如，一种用于醋酸格拉默的药物规格)进行比较。如果检测到一个预先确定水平的一种或多种由细胞因子调节的蛋白值，则将这批次的醋酸格拉默说明为是对于药物用途是可接受的。“预先确定的水平”是使用该参比化合物所检测到的或在一种对于醋酸格拉默的药物规格中所限定的水平。
已经包含了以下实例以便为本领域的普通技术人员提供实施在此披露的主题的代表性实施方案。鉴于本披露以及本领域的普通技术人员的总体水平，普通技术人员能够理解以下实例旨在仅仅是说明性的，并且可采用多种变化、变更、以及替代，而没有偏离在此披露的主题的范围。因此，通过例证并且没有通过限制来提供以下实例。
实例
实例1：共聚物测定
方法
THP-1细胞(ATCC，TIB-202)接收自美国种质保存中心(theAmerican Type Culture Collection)(ATCC)。使用一种多重-培养基直接培养的测定结合一种指示物细胞-DNA荧光色素染色测定(cat.#M-250，Bionique Testing Laboratories，Inc.，Saranac Lake，NY)，THP-1细胞已显示出没有支原体污染。细胞生长于完全生长培养基中，并且在37℃、5％CO2的培养箱中进行孵育。
在测定当天对测定培养基进行新鲜制备。该测定培养基由处于X-VIVO 15无血清培养基(Cambrex，04-418Q)的2mM Glutamax ISupplement(Invitrogen，35050-79)构成。将这些试剂过滤至一个0.2微米的醋酸纤维素过滤器单位(Nalgene，156-4020)中。过滤之后，用箔片将瓶子盖住以便使培养基避光。
在4℃下将
Figure G2008800211734D00231
(醋酸格拉默；Teva Pharmaceuticals)储存于生产商的注射器中。在无菌的、硅化的微量离心管(microfugetube)中在2X IFN-γ测定中按照2X浓度来制备样品。在测定中测试了终浓度(从0μg/ml至400μg/ml)。
用处于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的无菌的0.2％牛血清白蛋白(BSA)(Chemicon，3225-80)对人类IFN-γ(R&D Systems，285-IF-100)进行重组。
在测定之前的那天，以2x105个细胞/ml(20ml终体积)对THP-1细胞进行接种。通过在400xg、18℃下离心5min来收集这些细胞。用测定培养基(无IFN-γ)将细胞洗涤一次，并将细胞悬浮于测定培养基(无IFN-γ)中，并进行计数。将THP-1细胞以5x105个细胞/ml悬浮于测定培养基(具有0、1、10、以及100ng/ml的IFN.-γ的终浓度)中。用多通道移液器以每孔50μl从低浓度到高浓度的醋酸格拉默(50、10、2、以及0ng/ml)对细胞进行接种。将测定板在37℃、5％CO2培养箱中孵育0至23小时。
将所限定的培养基收集在未消毒的硅化的管子中。将管子以400xg、4℃离心5min。将这些上清液转移至新的硅化的管子中并且在液氮中进行快速冷冻。将经冷冻的限定的培养基储存在-80℃下，直到它们被交付用于Searchlight多重细胞因子分析(Pierce Endogen，Woburn，MA)。
结果
Figure G2008800211734D00241
对一大组蛋白质的作用
检查了连同IFN-γ.对一大组来自THP-1细胞的细胞因子、趋化因子、可溶性受体、以及蛋白酶的作用。除了
Figure G2008800211734D00243
之外，在趋化因子，IP-10(表1)的分泌方面诱导了显著性增加。IP-10是一种由IFN-γ调节的趋化因子，它与CXCR3受体相结合。有趣的是，
Figure G2008800211734D00244
治疗还导致在24hr在培养基中观察到较高水平的IFN-γ，即使在实验开始时外源性地加入了IFN-γ。
Figure G2008800211734D00251
对IFN-γ产生的作用部分解释了其对IP-10分泌的协同作用。其他趋化因子，如MCP-1和MDC(它们分别于CCR2和CCR4相结合)，也显示出对于
Figure G2008800211734D00252
的牢固的分泌反应，尽管这种诱导的幅值并不与用IP-10(表1)观察到的幅值一样高。类似地，其他细胞因子(如IL6)显示出对于
Figure G2008800211734D00253
和IFN-γ的协同反应。一些趋化因子(如RANTES和TARC)和细胞因子(如IL-10、IL12、p70、TNFα、TIMP1、以及MMP9)显示出用
Figure G2008800211734D00254
治疗的小量增加。
表1.
Figure G2008800211734D00255
治疗对来自THP-1细胞的趋化因子和细胞因子分泌的作用
  趋化因子   IP10   MCP1   MDC   I309   IL-8   MIP1α   RANTES   TARC
  IFNγ单独(10ng/ml)   17.9*   32.3*   2.2*   1.6*   25.6*   10.5*   96.7*   11.7*
  IFNγ+.50μg/ml I356   4060.5*   688.2*   23.6*   15.6*   217.1*   73.9*   352.2*   35.2*
  增加的倍数   226.3   21.3   10.6   9.7   8.5   7.1   3.6   3.0
  细胞因子   IFNγ   IL-6   IL1β   IL-10   IL12p70   TNFα
IFNγ单独(10ng/ml) 470.9* 0.2* 0.2* 0.4* 4.6* 33.3*
  IFNγ+.50μg/ml I356   4575.9*   3.8*   0.5*   0.7*   8.9*   61.3*
  增加的倍数   9.7   19.0   2.4   2.0   1.9   1.8
  受体/蛋白酶   ICAM1   MMP2   TNFR1   TNFR2   TIMP1   MMP9
  IFNγ单独(10ng/ml)   46.4*   158.2*   6.9*   11.0*   3848.4*   39.1*
  IFNγ+.50μg/ml I356   279.9*   915.9*   35.8*   34.4*   6364.3*   8.9*
  增加的倍数   6.0   5.8   5.2   3.1   1.7   0.2
*pg/ml
协同效应
这种测定的一些实施方案显示出一种协同效应。图1展示了
Figure G2008800211734D00256
和IFN-γ对IP-10以及其他趋化因子的分泌的协同效应。单独用IFN-γ进行处理的THP-1细胞仅显示适度产生IP-10、I-TAC、以及MIG(所有CXCR3配体)。将
Figure G2008800211734D00261
连同IFN-γ加入诱导了对所有三种趋化因子的分泌的显著性、浓度依赖性的作用。在50μg/ml
Figure G2008800211734D00262
以及10ng/ml IFN-γ的存在下所分泌的IP-10、I-TAC、以及MIG的水平与单独包含IFN-γ相比，分别增加了329、412、以及573倍。在24小时所测量的IFN-γ水平也显示出用
Figure G2008800211734D00263
处理的一种浓度依赖性增加。在不同浓度的胎牛血清(FBS)的存在下对这些THP-1细胞进行培养或将其培养于X-VIVO15无血清的培养基中。
Figure G2008800211734D00264
诱导了所有三种趋化因子(IP-10、MIG和I-TAC)的可靠的分泌，连同在所有条件下分泌IFN-γ；然而，在X-VIVO15无血清的限定性培养基中所培养的细胞显示出超过基线的最高倍数的诱导。用其他两种人类髓样细胞系(U-937和HL-60)；并且用原代的人类树突细胞看到了一种类似的反应。
表2显示了用
Figure G2008800211734D00265
和IFN-γ处理在23小时超过单独使用IFN-γ的对于IP-10、I-TAC、以及MIG的诱导倍数。超过基线的诱导倍数在1至10ng/ml IFN-γ为最大。重要的是，当在IFN-γ的缺失下用
Figure G2008800211734D00266
进行处理时THP-1细胞没有产生任何显著量的IP-10，并且单独使用IFN-γ(在
Figure G2008800211734D00267
的缺失下)仅诱导了少量的趋化因子的分泌。
Figure G2008800211734D00268
和IFN-γ的协同效应清楚地展示于表2中。早在用以及这些较高的IFN-γ浓度处理3至6小时就可在测定中检测到较低水平的IP-10、I-TAC和MIG；然而，这种动态的范围在18至24小时(此时可使用较低的IFN-γ浓度)是较好的。
表2在23小时处的趋化因子诱导(表达成超过对照值(0)的增加的倍数)
Figure G2008800211734D00271
剂量依赖性
表3显示了该测定的浓度依赖性。对于在每个浓度的醋酸格拉默(GA)下由IFN-γ(10ng/ml)所介导的IP-10、I-TAC、以及MIG的诱导，显示了带有标准偏差的pg/ml值。每个值代表了来自6个独立的THP-1测定的12个样品(带有两个重复点)，每个孵育了22至24小时来进行测量。在此情况下，该读数为Endogen Searchlight多重ELISA测定值。这些绝对的pg/ml数值将根据测定方法而有所不同。例如，可在Endogen Searchlight多重ELISA检测仪与标准的ELISA之间看到5至10倍的差异。绝对数目还根据孵育的时间以及IFN-γ的浓度而有所不同。但是，在同一测定形式和方法中，这种测定可用于将两种或多种共聚物制备物进行比较和/或确定一个参考值(例如，一个等量范围)用于对用一种测试制备物而获得的数值进行比较。
表3.醋酸格拉默(GA)的剂量依赖
Figure G2008800211734D00281
概述
这个实例显示了响应于来自一种促炎细胞因子(例如，IFN-γ)的刺激的由醋酸格拉默介导的细胞因子(例如，趋化因子IP-10、MIG和I-TAC)可用于评价醋酸格拉默的活性(例如，效能、纯度、随时间的稳定性、生物活性或与一种参考标准相当中的一种或多种)。通常，在一个相当的测定中具有更大增强的样品与更大的效能或稳定性相关。
在IFN-γ的存在下由醋酸格拉默介导的IP-10、MIG、和I-TAC的分泌的增强是一个意外的结果。这四种可溶性因子典型地与一种Th1促炎细胞因子反应相关，并且醋酸格拉默被认为部分地通过使Th1反应减弱并使Th2反应增强而起效。
醋酸格拉默的作用的精确机制是复杂的，并且仍然没有得到充分理解，但是本发明的这些方法提供了一种方式，该方式针对一种测试物的或候选的共聚物制备物的活性、效能、稳定性、特异性(例如，对于的等效性或对于一种药物规格的范围的等效性)来测量样品共聚物制备物。

Claims (73)

1.评价一种氨基酸共聚物的一种特性的一种方法，该方法包括：
(a)提供至少一个细胞，该细胞能够表达由一种细胞因子所诱导的一种蛋白质；
(b)将该至少一个细胞与一定量的该氨基酸共聚物以及该细胞因子在一个浓度以及一个时间段内相接触，该浓度以及该时间段足以诱导该细胞表达由该细胞因子所诱导的一种或多种蛋白质；并且
(c)检测所诱导的蛋白质以评价该氨基酸共聚物的一种特性。
2.用于评价一种氨基酸共聚物的一种方法，该方法包括：
(a)提供至少一个细胞，该细胞能够表达由一种细胞因子所诱导的一种蛋白质；
(b)将该至少一个细胞与一定量的该氨基酸共聚物以及该细胞因子在一个浓度以及一个时间段内相接触，该浓度以及该时间段足以诱导该细胞表达所诱导的蛋白质；
(c)测量所诱导的蛋白质的表达、分泌、诱导、存在或水平；并且
(d)将所诱导的蛋白质的经测量的表达、分泌、诱导、存在或水平与对于一种上市的醋酸格拉默的药物制剂的一个参考值、一种细胞诱导特性分布或的一种药物规格进行比较，以评价该氨基酸共聚物的一种特性。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该细胞因子是一种促炎细胞因子。
4.如权利要求3所述的方法，其中该细胞因子是选择下组，其构成为：肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、以及白细胞介素-8(IL-8)。
5.如权利要求4所述的方法，其中该细胞因子是IFNγ。
6.如权利要求5所述的方法，其中一种或多种IFNγ调节的蛋白质是一种由IFNγ-调节的趋化因子。
7.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该共聚物是包括以下氨基酸的一种共聚物：丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、以及酪氨酸。
8.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该细胞因子是醋酸格拉默。
9.如权利要求1所述的方法，进一步包括一个步骤(d)，该步骤将对于所诱导的蛋白质的产生、分泌、诱导、存在或水平的一个值与对于一种已上市的醋酸格拉默的药物制剂的一个参考值、细胞因子诱导特性分布或药物规格进行比较。
10.如权利要求2或权利要求9所述的方法，其中对于该上市的醋酸格拉默的药物制剂的参考值、细胞因子诱导特性分布或药物规格特性是对应于与选自下组的一种特性的一个值，该组的构成为：效能、特异性、稳定性、活性、以及它们的组合。
11.如权利要求2或权利要求9所述的方法，其中该步骤(d)包括将该值记录在一种印刷的或计算机可读的媒质之中。
12.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该至少一个细胞是选自下组，其构成为：一个髓样细胞系以及一个原代髓样细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中该至少一个细胞是一个人类髓细胞性白血病细胞系。
14.如权利要求13所述的方法，其中该人类髓细胞性白血病细胞系是选自下组，其构成为：一个人类急性单核细胞性白血病细胞系(THP-1)、一个人类白血病性单核细胞淋巴瘤细胞系(U937)、以及一个人类前髓细胞白血病细胞系(HL-60)。
15.如权利要求12所述的方法，其中该至少一个细胞是一个原代细胞，该细胞是选择下组，其构成为：一个人类外周血单核细胞(PBMC)以及一个单核细胞衍生的树突细胞。
16.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该至少一个细胞是衍生自一位受试者，该受试者具有一种自身免疫性、炎性、神经退行性、或脱髓鞘性的疾病、病症或机能障碍。
17.如权利要求16所述的方法，其中该疾病是选自下组，其构成为：多发性硬化症、类风湿性关节炎、以及炎症性肠病。
18.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中将该一个或多个细胞悬浮于一种无血清的测定培养基中。
19.如权利要求1所述的方法，其中由所述细胞因子所调节的一种或多种蛋白质是选自下组，其构成为：γ-干扰素-诱导蛋白10(IP-10)、干扰素-诱导T细胞α-化学吸引物(I-TAC)、以及由γ-干扰素所诱导的单核因子(MIG)。
20.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该氨基酸共聚物的浓度是在0.05μg/mL与1mg/mL之间。
21.如权利要求20所述的方法，其中该氨基酸共聚物的浓度是在0.1μg/mL与500μg/mL之间。
22.如权利要求21所述的方法，其中该氨基酸共聚物的浓度是在0.5μg/mL与100μg/mL之间。
23.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)中该细胞因子的浓度将该蛋白的表达诱导至一个水平，该水平大于以下各项之和：i)当该细胞在该细胞因子的缺失下与该氨基酸共聚物相接触时该蛋白的表达，并且ii)当该细胞在该氨基酸共聚物的缺失下与该细胞因子相接触时该蛋白的表达。
24.如权利要求23所述的方法，其中细胞因子的浓度是在0.01ng/mL与100ng/mL之间。
25.如权利要求24所述的方法，其中细胞因子的浓度是在1ng/mL与50ng/mL之间。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述细胞因子的浓度是大约10ng/mL。
27.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该段时间是在1小时与48小时之间。
28.如权利要求27所述的方法，其中该段时间是在6小时与36小时之间。
29.如权利要求27所述的方法，其中该段时间是在12小时与24小时之间。
30.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该氨基酸共聚物的浓度是在0.5μg/mL与100μg/mL之间，该细胞因子以在1ng/mL与50ng/mL而存在，并且该段时间是在12小时与24小时之间，该细胞是THP-1细胞，该共聚物是醋酸格拉默、并且该细胞因子是IFNγ。
31.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤(c)中的所述检测包括一种基于抗体的方法。
32.如权利要求31所述的方法，其中该基于抗体的方法包括免疫沉淀反应。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述基于抗体的方法包括一种酶联免疫吸附测定(ELISA)。
34.一种用于比较氨基酸共聚物的至少两个样品的方法，该方法包括：
(a)提供一种类型的至少一个细胞，该细胞能够表达由一种细胞因子所诱导的一种蛋白质；
(b)将该细胞类型的至少一个细胞与以下各项分开地进行接触：
(i)一定量的一种氨基酸共聚物的一个第一样品，该第一样品是在足以诱导该细胞表达由该细胞因子所诱导的蛋白质的一种浓度下以及一段时间中进行该接触；以及
(ii)一定量的一种氨基酸共聚物的一个第二样品，该第二样品是在以诱导该细胞表达由该细胞因子所诱导的蛋白质的一种浓度下以及一段时间中进行该接触；
(c)检测在步骤(b)(i)中由该至少一个细胞所表达的由细胞因子诱导的蛋白质以评估该氨基酸共聚物的第一样品的一种特性；
(d)检测在步骤(b)(ii)中由该至少一个细胞所表达的由细胞因子诱导的蛋白质以评估该氨基酸共聚物的第二样品的一种特性；并且，
(e)将该氨基酸共聚物的第一样品的特性与该氨基酸共聚物的第二样品的特性进行比较以便确定该第一与第二样品之间的一种相似性。
35.如权利要求34所述的方法，其中这些氨基酸共聚物样品中的至少一个是一个参比标准品。
36.如权利要求34所述的方法，其中这些氨基酸共聚物样品中的至少一个是醋酸格拉默。
37.如权利要求34所述的方法，其中该至少一个细胞是选自下组，其构成为：一个髓样细胞系以及一个原代髓样细胞。
38.如权利要求37所述的方法，其中该髓样细胞系包括一个人类髓细胞白血病细胞系。
39.如权利要求37所述的方法，其中该人类髓细胞性白血病细胞系是选自下组，其构成为：一种人类急性单核细胞性白血病细胞系(THP-1)、一种人类白血病性单核细胞淋巴瘤细胞系(U937)、以及一种人类前髓细胞白血病细胞系(HL-60)。
40.如权利要求37所述的方法，其中该原代髓样细胞是选择下组，其构成为：一个人类外周血单核细胞(PBMC)以及一个单核细胞衍生的树突细胞。
41.如权利要求34所述的方法，其中该至少一个细胞是衍生自一位受试者，该受试者具有一种自身免疫性、炎性、神经退行性、或脱髓鞘性的疾病。
42.如权利要求41所述的方法，其中该疾病是选自下组，其构成为：多发性硬化症、类风湿性关节炎、以及炎症性肠病。
43.如权利要求34所述的方法，其中将该一个或多个细胞悬浮于一种测定的培养基中。
44.如权利要求42所述的方法，其中该测定的培养基是一种无血清的测定培养基。
45.如权利要求35所述的方法，其中由所述细胞因子调节的一种或多种蛋白质是选自下组，其构成为：γ-干扰素-诱导蛋白10(IP-10)、干扰素-诱导T细胞α-化学吸引物(I-TAC)、以及由γ-干扰素所诱导的单核因子(MIG)。
46.如权利要求35所述的方法，其中一种氨基酸共聚物的第一样品与一种氨基酸共聚物的第二样品的浓度是在0.05μg/mL与1mg/mL之间。
47.如权利要求46所述的方法，其中该氨基酸共聚物的浓度是在0.1μg/mL与500μg/mL之间。
48.如权利要求47所述的方法，其中该氨基酸共聚物的浓度是在0.5μg/mL与100μg/mL之间。
49.如实施方案35所述的方法，其中所述细胞因子是一种促炎细胞因子。
50.如权利要求49所述的方法，其中该细胞因子是选择下组，其构成为：肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、以及白细胞介素-8(IL-8)。
51.如权利要求50所述的方法，其中该细胞因子是IFNγ。
52.如权利要求34所述的方法，其中该细胞因子的浓度是在0.01ng/mL与100ng/mL之间。
53.如权利要求52所述的方法，其中该细胞因子的浓度是在1ng/mL与50ng/mL之间。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述细胞因子的浓度是大约10ng/mL。
55.如权利要求34所述的方法，其中该段时间是在1小时与48小时之间。
56.如权利要求55所述的方法，其中该段时间是在6小时与36小时之间。
57.如权利要求56所述的方法，其中该段时间是在12小时与24小时之间。
58.如权利要求34所述的方法，其中在步骤(d)中的所述检测包括一种基于抗体的方法。
59.如权利要求58所述的方法，其中该基于抗体的方法包括免疫沉淀反应。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述基于抗体的方法包括一种酶联免疫吸附测定(ELISA)。
61.如权利要求34所述的方法，其中一种氨基酸共聚物的第一样品与一种氨基酸共聚物的第二样品中的至少一个具有一种已知的功效，用于在需要治疗一种自身免疫性、脱髓鞘性、神经退行性或炎性疾病的一种受试者体内治疗该疾病。
62.如权利要求61所述的方法，其中该疾病是选自下组，其构成为：多发性硬化症、类风湿性关节炎、以及炎症性肠病。
63.如权利要求34所述的方法，其中一种氨基酸共聚物的第一样品的特性是在一种氨基酸共聚物的第二样品的特性的80％至120％的范围之内。
64.一种制备醋酸格拉默的药物组合物的方法，该方法包括：
(a)提供一个批次的醋酸格拉默；
(b)根据权利要求1至31中任何一项评价该批次的一种特性，并且
(c)如果由该细胞因子所调节的一种或多种蛋白质的水平与对于醋酸格拉默的一个参考值相匹配，则确定该批次对于药物用途是可接受的。
65.如权利要求64所述的方法，其中该参考值是对于一种上市的醋酸格拉默的药物制剂的对于效能、特异性、稳定性、和/或生物活性的一种细胞因子诱导特性分布、等价范围或药物规格。
66.评价一种氨基酸共聚物制备品的活性、效能、特异性或稳定性的一种方法，该方法包括：
(a)提供一种髓样细胞；
(b)将该细胞与(i)一定量的该氨基酸共聚物以及(ii)IFNγ进行接触，IFNγ是在足以诱导该细胞表达一种由IFNγ-诱导的蛋白质的一个浓度下以及一段时间中进行接触；并且
(c)将该由IFNγ-诱导的蛋白质的存在、水平、生产、分泌、诱导与对于醋酸格拉默的一个参考值进行比较。
67.如权利要求66所述的方法，其中该参考值是对于一种上市的醋酸格拉默的药物制剂的对于活性、效能、特异性或稳定性的一种细胞因子诱导特性分布、等价范围或药物规格。
68.如权利要求2或权利要求8所述的方法，其中该比较步骤包括确定在所测量的该一种或多种所诱导的蛋白质的表达、分泌、诱导、存在或水平与对于一种上市的醋酸格拉默的药物制剂的参考值、细胞因子诱导特性分布或药物规格之间的差异是否在一个预先确定的范围之内。
69.如权利要求67所述的方法进一步包括，如果该差异是在一个预先确定的范围之间：则对该共聚物进行分类、选择、接受、放弃、发货、或扣留；将共聚物加工成药物产品、将包括该共聚物的一种产品进行运送、将该共聚物移至一个新的位置；或在商业中对该共聚物进行配制、标记、包装、销售、提供销售、或发货。
70.一种用于制备包含醋酸格拉默的药物组合物的方法：将L-丙氨酸、受苄基保护的L-谷氨酸、受三氟乙酸(TFA)保护的L-赖氨酸以及L-酪氨酸的N-羧基酸酐进行聚合，以产生一种受保护的共聚物；将该受保护的共聚物进行处理以使该受保护的共聚物部分地解聚并且使受苄基保护的基团脱保护，并且使受TFA保护的赖氨酸脱保护以产生醋酸格拉默；并且将该醋酸格拉默分离出，
其中该改进包括：
在一种细胞因子以及所分离的醋酸格拉默的一个样品的存在下对一个髓样细胞或一个原代髓样细胞系中的一种由细胞因子诱导的蛋白质的表达进行测量，并且将该表达与参考值进行比较。
71.如权利要求69所述的方法，其中该细胞因子是IFNγ。
72.如权利要求69所述的方法，其中该项改进进一步包括：
如果在所测量的表达与该参考值之间的差异在一个预先确定的范围之内，选择该纯化的醋酸格拉默用于一种药物组合物的制备。
73.如权利要求71所述的方法，其中该项改进进一步包括：
制备一种药物组合物，该组合物包括该选择的经纯化的醋酸格拉默的至少一部分。
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