CN105377308B - 醋酸格拉替雷响应生物标志物mRNA效力测定 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于通过定量及比较在响应于醋酸格拉替雷(GA)测试批或参考标准批的刺激的小鼠T细胞中产生的mRNA响应生物标志物的水平来确定GA测试批的效力的测定，其中T细胞从用GA测试批或参考标准批免疫的小鼠获得。还描述了用于鉴定在本发明的测定中有用的mRNA响应生物标志物的方法。

Description

醋酸格拉替雷响应生物标志物mRNA效力测定

本申请根据35U.S.C.119(e)要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请号61/786,108的权益，且该临时专利申请通过引用全文并入。

发明背景

醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate)为批准用于治疗多发性硬化症的合成肽药物。其由含有下列氨基酸的合成多肽的醋酸盐组成：L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸及L-赖氨酸。当前作为销售的醋酸格拉替雷注射剂指示降低了患有复发缓解型多发性硬化症(RRMS)的患者的复发频率，所述患者包括已经历首次临床发作(clinical episode)且具有符合多发性硬化症的MRI特征的患者。

认为醋酸格拉替雷通过改变导致疾病发病机理的免疫过程而对多发性硬化症起作用。尤其，认为在多发性硬化症中的作用机理至少部分由T细胞活性的免疫调节所介导。

在生产醋酸格拉替雷期间，需要把药物的作用机理考虑进去的快速、灵敏、可靠且具有成本效益的效力测定来证明用于药学用途的药物批次之间的一致的效力。

发明内容

本发明涉及醋酸格拉替雷(GA)的新的效力测定，其中GA测试批的效力通过定量及比较至少一种响应生物标志物mRNA来确定，该响应生物标志物mRNA由响应GA测试批和GA参考标准批的刺激的GA特异性T细胞表达。GA特异性T细胞从用GA测试批或参考标准批免疫的小鼠获得。还描述了用于鉴定在测定中使用的mRNA响应生物标志物的方法。

在实施方案中，本发明涉及用于确定GA测试批的效力的方法，该方法包括：用确定量的GA参考标准批对测试动物进行免疫；培养从经免疫的测试动物中移取的淋巴结细胞；在预定量的GA参考标准批的存在下，温育至少一个包含预定数目的培养的淋巴结细胞的样品，并在预定量的GA测试批的存在下，温育至少一个包含预定数目的培养的淋巴结细胞的样品；测量与预定量的GA参考标准批温育的淋巴结细胞中至少一种GA响应生物标志物mRNA的量，以及与预定量的GA测试批温育的淋巴结细胞中所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量；以及将在与预定量的GA测试批温育的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量与在与预定量的GA参考标准批温育的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较；由此确定GA测试批的相对效力。

在相关实施方案中，所述测试动物为小鼠。在某些实施方案中，所述小鼠为雌性SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J或(SJL/J x BALB/c)F1小鼠。在实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子或细胞因子受体的基因转录。在相关实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子的基因转录，其中所述细胞因子为IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1b、IL-13、IL-17或其任意组合。在某些实施方案中，所述至少一种醋酸格拉替雷响应生物标志物mRNA从编码IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ或其任意组合的基因转录。在其他实施方案中，所述至少一种醋酸格拉替雷响应生物标志物mRNA从编码细胞因子受体的基因转录，其中所述细胞因子受体为CD69、CD25或二者。在实施方案中，在用GA参考标准批对小鼠进行免疫后9-11天，在淋巴结细胞的培养物中测量所述至少一种生物标志物mRNA。

在实施方案中，本发明的方法进一步包括确定所述GA测试批是否具有期望的相对效力。在这些实施方案中，所述期望的相对效力为，例如所述GA参考标准批的效力的至少约90％至约125％，或者所述期望的相对效力为所述GA参考标准批的效力的至少约95％至约125％。

在本发明的实施方案中，所述至少一种响应生物标志物mRNA通过实时PCR进行测量。在相关实施方案中，所述响应生物标志物mRNA在温育开始后约4至约6小时时进行测量。在某些实施方案中，将蛋白质合成抑制剂如环己酰亚胺添加至与GA参考标准批的淋巴结细胞的温育中，以及与GA测试批的淋巴结细胞的温育中。

在本发明的方法的实施方案中，所述参考标准批为克帕松(Copaxone)。

本发明进一步涉及用于确定GA参考标准批的效力的方法，该方法包括：用确定量的GA测试批对测试动物进行免疫；培养从经免疫的测试动物中移取的淋巴结细胞；在预定量的GA测试批的存在下，温育至少一个包含预定数目的培养的淋巴结细胞的样品，并在预定量的GA参考标准批的存在下，温育至少一个包含预定数目的培养的淋巴结细胞的样品；测量与预定量的GA测试批温育的淋巴结细胞中至少一种GA响应生物标志物mRNA的量，以及与预定量的GA参考标准批温育的淋巴结细胞中所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量；以及将在与预定量的GA参考标准批温育的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量与在与预定量的GA测试批温育的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较；由此确定GA参考标准批的相对效力。

在相关实施方案中，所述测试动物为小鼠。在某些实施方案中，所述小鼠为雌性SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J或(SJL/J x BALB/c)F1小鼠。在实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子或细胞因子受体的基因转录。在相关实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子的基因转录，其中所述细胞因子为IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1b、IL-13、IL-17或其任意组合。在某些实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ或其任意组合的基因转录。在其他实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子受体的基因转录，其中所述细胞因子受体为CD69、CD25或二者。在实施方案中，在用GA参考标准批对小鼠进行免疫后9-11天，在淋巴结细胞的培养物中测量所述至少一种生物标志物mRNA。

在实施方案中，本发明的方法进一步包括确定所述GA测试批是否具有期望的相对效力。在这些实施方案中，所述期望的相对效力为，例如所述GA参考标准批的效力的至少约90％至约125％，或者所述期望的相对效力为所述GA参考标准批的效力的至少约95％至约125％。

在本发明的实施方案中，所述至少一种响应生物标志物mRNA通过实时PCR进行测量。在相关实施方案中，所述响应生物标志物mRNA在温育开始后约4至约6小时时进行测量。在某些实施方案中，将蛋白质合成抑制剂如环己酰亚胺添加至与GA参考标准批的淋巴结细胞的温育中，以及与GA测试批的淋巴结细胞的温育中。

在本发明的方法的实施方案中，所述参考标准批为克帕松。

还提供了用于制备包含GA的药物组合物的方法，其中在该方法中，对GA测试批进行测试以确定GA测试批是否具有相对于GA参考标准批的效力的期望的效力，所述方法包括：确定所述GA测试批的效力并将其与所述参考标准批的效力进行比较，其中通过测量在从已用确定量的GA参考标准批免疫的测试哺乳动物中移取的淋巴结细胞的培养物的细胞中产生的至少一种GA响应生物标志物mRNA的量来确定所述GA测试批和所述参考标准批的效力，其中在预定量的GA参考标准批的存在下，温育至少一个包含预定数目的培养的淋巴结细胞的样品，并且其中在相同预定量的GA测试批的存在下，温育至少一个包含基本上相同预定数目的培养的淋巴结细胞的样品，并且其中仅当确定所述GA测试批具有相对于所述参考标准批的效力的所期望的效力时，才将所述GA测试批混合至所述药物组合物中。

在相关实施方案中，所述测试动物为小鼠。在某些实施方案中，所述小鼠为雌性SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J或(SJL/J x BALB/c)F1小鼠。在实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子或细胞因子受体的基因转录。在相关实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子的基因转录，其中所述细胞因子为IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1b、IL-13、IL-17或其任意组合。在某些实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ或其任意组合的基因转录。在其他实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子受体的基因转录，其中所述细胞因子受体为CD69、CD25或二者。在实施方案中，在用GA参考标准批对小鼠进行免疫后9-11天，在淋巴结细胞的培养物中测量所述至少一种生物标志物mRNA。

在实施方案中，本发明的方法进一步包括确定所述GA测试批是否具有期望的相对效力。在这些实施方案中，所述期望的相对效力为，例如所述醋酸格拉替雷参考标准批的效力的至少约90％至约125％，或者所述期望的相对效力为所述醋酸格拉替雷参考标准批的效力的至少约95％至约125％。

在本发明的实施方案中，所述至少一种响应生物标志物mRNA通过实时PCR进行测量。在相关实施方案中，所述响应生物标志物mRNA在温育开始后约4至约6小时时进行测量。在某些实施方案中，将蛋白质合成抑制剂如环己酰亚胺添加至与GA参考标准批的淋巴结细胞的温育中，以及与GA测试批的淋巴结细胞的温育中。

在本发明的方法的实施方案中，所述参考标准批为克帕松。

本发明进一步涉及用于鉴定在GA T细胞效力测定中使用的GA响应生物标志物mRNA的方法，该方法包括：用确定量的GA对测试动物进行免疫；用对照抗原对测试动物进行免疫；培养从GA免疫的测试动物中移取的淋巴结细胞，并单独培养从对照抗原免疫的测试动物中移取的淋巴结细胞；在预定量的GA的存在下温育至少一个包含来自GA免疫的测试动物的预定数目的培养的淋巴结细胞的样品，并在预定量的GA测试批的存在下温育至少一个包含从对照抗原免疫的测试动物中移取的预定数目的培养的淋巴结细胞的样品；测量来自GA免疫的测试动物的温育的淋巴结细胞中候选响应生物标志物mRNA的量，并测量来自对照抗原免疫的测试动物的温育的淋巴结细胞中候选响应生物标志物mRNA的量；以及将来自GA免疫的测试动物的温育的淋巴结细胞中候选响应生物标志物mRNA的量与来自对照抗原免疫的测试动物的温育的淋巴结细胞中候选响应生物标志物mRNA的量进行比较；其中如果在来自GA免疫的测试动物的温育的淋巴结细胞中测量的候选响应生物标志物mRNA的量显著高于来自对照抗原免疫的测试动物的温育的淋巴结细胞中候选响应生物标志物mRNA的量，则将候选响应生物标志物mRNA鉴定为响应生物标志物mRNA。

在某些实施方案中，本发明涉及用于确定GA测试批的效力和交叉效力的方法，所述方法包括：用确定量的GA参考标准批对第一测试动物进行免疫；用确定量的GA测试批对第二测试动物进行免疫；培养从经免疫的第一测试动物中移取的淋巴结细胞，并单独培养从经免疫的第二测试动物中移取的淋巴结细胞；在预定量的GA参考标准批的存在下温育至少一个包含来自经免疫的第一测试动物的预定数目的培养的淋巴结细胞的样品，并在预定量的GA测试批的存在下温育至少一个包含来自经免疫的第一测试动物的预定数目的培养的淋巴结细胞的样品；在预定量的GA参考标准批的存在下温育至少一个包含来自经免疫的第二测试动物的预定数目的培养的淋巴结细胞的样品，并在预定量的GA测试批的存在下温育至少一个包含来自经免疫的第二测试动物的预定数目的培养的淋巴结细胞的样品；测量以下的量：与预定量的GA参考标准批温育的、来自经免疫的第一测试动物的淋巴结细胞中的至少一种GA响应生物标志物mRNA，以及与预定量的GA测试批温育的、来自经免疫的第一测试动物的淋巴结细胞中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量；测量以下的量：与预定量的GA参考标准批温育的、来自经免疫的第二测试动物的淋巴结细胞中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA，以及与预定量的GA测试批温育的、来自经免疫的第二测试动物的淋巴结细胞中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量；将在与预定量的GA测试批温育的、来自经免疫的第一测试动物的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量，与在与预定量的GA参考标准批温育的、来自经免疫的第一测试动物的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较，由此确定GA测试批的相对效力；将在与预定量的GA测试批温育的、来自经免疫的第二测试动物的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量，与在与预定量的GA参考标准批温育的、来自经免疫的第二测试动物的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较；由此确定GA参考标准批的相对效力；将在与预定量的GA测试批温育的、来自经免疫的第一测试动物的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量，与在与预定量的GA测试批温育的、来自经免疫的第二测试动物的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较；由此确定GA测试批的交叉效力。

在这些实施方案中，所述第一测试动物和所述第二测试动物可以选自：相同小鼠品系的小鼠：HLA匹配的小鼠；同窝出生的小鼠；以及双胎。在实施方案中，所述第一测试动物和所述第二测试动物为相同的小鼠品系，并且其中所述小鼠品系选自：雌性CSJLF1/JRj、雌性SJL/J、雌性BALB/cByJ、雌性CD-1、雌性C57BL/10J以及雌性(SJL/J x BALB/c)F1。在实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子或细胞因子受体的基因转录。在相关实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子的基因转录，其中所述细胞因子为IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1b、IL-13、IL-17或其任意组合。在某些实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ或其任意组合的基因转录。在其他实施方案中，所述至少一种GA响应生物标志物mRNA从编码细胞因子受体的基因转录，其中所述细胞因子受体为CD69、CD25或二者。在实施方案中，在用GA参考标准批对小鼠进行免疫后9-11天，在淋巴结细胞的培养物中测量所述至少一种生物标志物mRNA。

在实施方案中，本发明的方法进一步包括确定所述GA测试批是否具有期望的相对效力、期望的相对交叉效力或两者。在这些实施方案中，所述期望的相对效力或期望的相对交叉效力为，例如所述GA参考标准批的效力的至少约90％至约125％，或者所述期望的相对效力或期望的相对交叉效力为所述GA参考标准批的效力的至少约95％至约125％。

在本发明的实施方案中，所述至少一种响应生物标志物mRNA通过实时PCR进行测量。在相关实施方案中，所述响应生物标志物mRNA在温育开始后约4至约6小时时进行测量。在某些实施方案中，将蛋白质合成抑制剂如环己酰亚胺添加至与GA参考标准批的淋巴结细胞的温育中，以及与GA测试批的淋巴结细胞的温育中。

在本发明的方法的实施方案中，所述参考标准批为克帕松。

本发明还提供了用于确定第二GA批的效力的方法，该方法包括：用确定量的第一GA批对测试动物进行免疫；培养从经免疫的测试动物中移取的淋巴结细胞；在预定量的第一GA批的存在下，温育至少一个包含预定数目的培养的淋巴结细胞的样品，并在预定量的第二GA批的存在下，温育至少一个包含预定数目的培养的淋巴结细胞的样品；测量与预定量的第一GA批温育的淋巴结细胞中至少一种GA响应生物标志物mRNA的量，以及与预定量的第二GA批温育的淋巴结细胞中所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量；以及将在与预定量的第二GA批温育的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量与在与预定量的第一GA批温育的淋巴结细胞中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较；由此确定第二GA批的相对效力。在这些实施方案中，所述第一GA批可为克帕松、GA参考标准批或GA测试批。在这些实施方案中，所述第二GA批可为克帕松、GA参考标准批或GA测试批。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而以相同程度并入本文，犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附的权利要求书中特别地提出。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：

图1.响应于不同浓度的GA在初级LN细胞中表达的mIL-2mRNA。该图示出了本文表6中呈现的数据的图。用不同浓度的GA或克帕松离体(ex vivo)刺激来自GA免疫的小鼠的LN细胞，并测量mIL-2mRNA。IL-2mRNA水平表示为相对于DCCM1(培养基)对照的倍数增加。A.使用六个GA浓度(1、2.5、5、10、15和25μg/mL)来刺激LN细胞。B.使用五个GA浓度(1、2.5、5、10和15μg/mL)来刺激LN细胞。对于A和B二者，菱形表示用GMA(醋酸格拉替雷，MylanPharmaceuticals,Inc.)刺激的组3细胞(来自用GA免疫的小鼠)中的mIL-2mRNA的表达。正方形表示用克帕松(Teva Pharmaceuticals USA,Inc.)刺激的组3细胞中的表达。三角形表示用GMA刺激的组4细胞(来自用甘露糖醇免疫的小鼠)中的表达。X表示用克帕松刺激的组4细胞。数据绘制在半对数上。此外，将对数趋势线/回归(logarithmic trendline/regression)添加至图上。所有的r²值均>0.90或90％。

图2.响应于GA刺激在初级LN细胞中表达的细胞因子mRNA。该图示出了本文表8-12中呈现的数据的汇总。用GA离体刺激来自GA免疫的小鼠的LN细胞，并如所指示的在刺激后4小时(浅色的条)和刺激后6小时(深色的条)测量细胞因子mRNA。细胞因子mRNA水平表示为相对于DCCM1(培养基)对照的倍数增加。

图3.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的CD-1小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：IL-2及IL-4。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平。A.来自品系CD-1小鼠的LN细胞中的IL-2mRNA表达。B.来自品系CD-1小鼠的LN细胞中的IL-4mRNA表达。

图4.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的CD-1小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：IL-5及IL-10。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平绘制。A.来自品系CD-1小鼠的LN细胞中的IL-5mRNA表达。B.来自品系CD-1小鼠的LN细胞中的IL-10mRNA表达。

图5.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的CD-1小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：IL-13及IFN-γ。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平。A.来自品系CD-1小鼠的LN细胞中的IL-13mRNA表达。B.来自品系CD-1小鼠的LN细胞中的IFN-γmRNA表达。

图6.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：TNF-α及IL-2。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平。A.来自品系CD-1小鼠的LN细胞中的TNF-αmRNA表达。B.来自品系BALB/cByJ小鼠的LN细胞中的IL-2mRNA表达。

图7.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的BALB/cByJ小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：IL-4及IL-5。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平。A.来自品系BALB/cByJ小鼠的LN细胞中的IL-4mRNA表达。B.来自品系BALB/cByJ小鼠的LN细胞中的IL-5mRNA表达。

图8.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的BALB/cByJ小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：IL-10及IL-13。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平。A.来自品系BALB/cByJ小鼠的LN细胞中的IL-10mRNA表达。B.来自品系BALB/cByJ小鼠的LN细胞中的IL-13mRNA表达。

图9.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的BALB/cByJ小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：IFN-γ及TNF-α。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平。A.来自品系BALB/cByJ小鼠的LN细胞中的IFN-γmRNA表达。B.来自品系BALB/cByJ小鼠的LN细胞中的TNF-αmRNA表达。

图10.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的SJL/J小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：IL-2及IL-4。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平。A.来自品系SJL/J小鼠的LN细胞中的IL-2mRNA表达。B.来自品系SJL/J小鼠的LN细胞中的IL-4mRNA表达。

图11.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的SJL/J小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：IL-5及IL-10。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平。A.来自品系SJL/J小鼠的LN细胞中的IL-5mRNA表达。B.来自品系SJL/J小鼠的LN细胞中的IL-10mRNA表达。

图12.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的SJL/J小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：IL-13及IFN-γ。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平。A.来自品系SJL/J小鼠的LN细胞中的IL-13mRNA表达。B.来自品系SJL/J小鼠的LN细胞中的IFN-γmRNA表达。

图13.响应于采用GA的刺激在来自GA免疫的SJL/J小鼠的初级LN细胞中的响应生物标志物mRNA表达水平：TNF-α。作为GA刺激浓度的函数绘制表示为相对于对照的倍数变化的mRNA水平。图中示出了来自品系SJL/J小鼠的LN细胞中的TNF-αmRNA表达。

具体实施方式

醋酸格拉替雷(GA)

GA由合成多肽的醋酸盐组成，所述合成多肽含有四种天然存在的氨基酸：L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸及L-赖氨酸，它们分别具有0.141、0.427、0.095及0.338的平均摩尔分数。GA的平均分子量为5,000-9,000道耳顿。化学上，GA被命名为具有L-丙氨酸、L-赖氨酸及L-酪氨酸、醋酸(盐)的L-谷氨酸聚合物。

GA的经验式为(C₅H₉NO₄·C₃H₇NO₂·C₆H₁₄N₂O₂·C₉H₁₁NO₃)_x·xC₂H₄O₂(CAS-147245-92-9,医师案头参考(Physician’s Desk Reference))。

如本文所用的，除非特别说明，“GA”通常指GA，包括，例如由MylanPharmaceuticals,Inc.生产的GA即“GMA”，以及由Teva Pharmaceuticals USA,Inc.生产的GA，即“Cop”或“克帕松”。

用于测试醋酸格拉替雷生产批的效力测定

本发明涉及用于证明在药学用途可接受的GA的生产中的药物批之间一致的效力的效力测定。药物审批机构通常在审批过程中要求药物的效力测试，并要求可用于确定批准后批与批(lot to lot)一致性的效力测定的开发。这样的测定不仅用于确保常规生产期间的批一致性，而且还用于评估生产过程变化后的药物批。

效力为产品特异性测量(product-specific measurement)，并且必须针对各个产品单独地评估测定。GA在多发性硬化症(MS)中的作用机理被认为部分地由T细胞活性的免疫调节所介导。因此T细胞对GA的免疫响应为GA溶液中存在的表位的特异且灵敏的度量。由于T细胞区分溶液中存在的不同但非常相似的肽的独特的能力，因此分析培养物中的GA特异性T细胞的细胞因子分泌谱(profile)及免疫活性，可以区分GA批之间的免疫相关差异。在这方面，如通过用例如GA参考标准批预致敏的(primed)的以及用例如GA测试批攻击的和/或反之亦然的动物中的T细胞响应所显示的免疫特性(immunologic identity)，可以表明参考标准批和测试批是相同的。由响应于后续攻击的预致敏的T细胞释放细胞因子，是一项T细胞响应的免疫同一性的另外的度量。细胞因子的释放曲线潜在地可以检测在给定GA批中存在的特定表位的细小差异。

在本发明的实施方案中，生产批或测试批的GA相对效力通过比较表示T细胞对GA测试批的免疫响应的值与表示T细胞对GA参考标准批的相同响应的值来确定。该效力测定描述了GA测试批的刺激能力。在本发明的方法中，用确定量或预定量的GA参考标准批对测试动物进行免疫，并培养来自从该动物中移取的淋巴结的淋巴结细胞。通过与确定量或预定量的GA参考标准批温育来刺激培养的淋巴结细胞的样品，并通过与相同确定量或预定量的GA生产批或GA测试批温育来刺激培养的淋巴结细胞的第二样品。随后测量各样品中的GA响应生物标志物mRNA的量，并比较该量以得到相对效力。

在单独的实施方案中，测定GA的相对交叉效力。相对交叉效力比较整个免疫的效力，即，其比较从不同动物获得的测试和/或参考标准GA刺激的T细胞(或用要比较的任何两个GA批刺激的T细胞)的效力，其中各动物用GA测试批或参考标准批进行免疫。该测量提供了对GA测试批的免疫能力，例如GA测试批引起免疫响应的能力的深入了解。该测量还提供了对GA参考标准批的免疫能力的深入了解。在这些实施方案中，该方法包括对至少两个测试动物进行免疫，第一个用GA参考标准批，而第二个用确定量的GA测试批。分别培养从经免疫的第一和第二测试动物中移取的淋巴结细胞。产生了从各动物中移取的培养的淋巴结细胞的单独的样品，各个样品含有预定数目的培养的淋巴结细胞。分别与预定量的GA参考标准批及预定量的GA测试批温育各个样品。因此，产生了至少四个温育或刺激样品，例如，如表A中所示的：

表A用于确定GA的交叉效力的样品

测试动物	免疫抗原	温育	刺激抗原
				1	参考标准批	A	参考标准批
1	参考标准批	B	测试批
				2	测试批	C	参考标准批
2	测试批	D	测试批

在与预定量的GA参考标准批温育的来自经免疫的第一测试动物的淋巴结细胞(表示为温育A)中测量至少一种GA响应生物标志物mRNA的量，并在与预定量的GA测试批温育的来自经免疫的第一测试动物的淋巴结细胞(表示为温育B)中测量所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量。类似地，在与预定量的GA参考标准批温育的来自经免疫的第二测试动物的淋巴结细胞(表示为温育C)中测量所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量，并在与预定量的GA测试批温育的来自经免疫的第二测试动物的淋巴结细胞(表示为温育D)中测量所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量。

在实施方案中，如上所述进行效力测定，其中将温育B中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量与温育A中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较。在实施方案中，将温育C中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量与温育D中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较。

为确定交叉效力，将温育C中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量与温育A中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较。在实施方案中，将温育B中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量与温育D中的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较。

例如，通过使用表B中列举的从本文表29(IL-2)、表31(IL-4)和表35(IL-13)中呈现的实例中得到的数据，可以如下所示进行交叉效力的计算。

表B.示例交叉效力计算

对于IL-2，克帕松交叉效力计算如下：

C/A＝17.5/20.0＝0.875，或87.5％。

对于IL-2，GMA交叉效力计算如下：

B/D＝16.9/15.7＝1.08，或108％。

对于IL-4，克帕松交叉效力计算如下：

C/A＝21.8/22.6＝0.965，或96.5％

对于IL-4，GMA交叉效力计算如下：

B/D＝18.8/18.3＝1.03，或103％。

对于IL-13，克帕松交叉效力计算如下：

C/A＝17.5/13.5＝1.3，或130％

对于IL-13，GMA交叉效力计算如下：

B/D＝8.6/11.5＝0.748，或74.8％。

在实施方案中，效力基于两个生产批的比较。在实施方案中，在可能向GA的药物组合物中添加GA生产批之前、之后或者在认为适合的其他时间使用本发明的方法。

各自名称为“Process for the Measurement of the Potency of GlatiramerAcetate”且各自通过引用全文并入本文的美国专利号7,429,374(2008年9月30日授权)、7,923,215(2011年4月12日授权)以及美国专利申请公开号2011/0189706(2011年8月4日公开)描述了GA效力测定，在该测定中测量了分泌的细胞因子(蛋白质)水平。

在本发明的方法中，测量一种或多种响应生物标志物mRNA的表达水平。mRNA表达水平不必要与蛋白质表达平行。因此，可以使用mRNA表达水平来提供使用分泌蛋白质测定不能获得的关于响应生物标志物的信息。例如，mRNA测定的一个优点是mRNA可以比来源于mRNA的分泌蛋白质早得多地检测到，从而导致更快速的测定。除了时间问题外，已观察到区分两种类型的测定的某些响应生物标志物的剂量反应效应。重要的是，在对来自GA免疫的小鼠的细胞进行GA刺激后，由如本文所示的mRNA测定明确地检测到了被美国专利号7,429,374描述为检测不到的细胞因子。

在实施方案中，当通过mRNA扩增来进行定量时，可以将数据相对于内部对照，例如参考或持家基因，如GAPDH或β-肌动蛋白的表达进行归一化。此外，效力或交叉效力可以表示为如本文实施例中所述的相对于对照的倍数增加，其中DCCM-1未刺激数据为对照。在实施方案中，对于样品中的GA响应生物标志物mRNA，效力或交叉效力表示为相对于对照的倍数变化。在实施方案中，以下列方式来计算样品中的GA响应生物标志物mRNA相对于对照的倍数变化：1)将响应生物标志物mRNA的水平相对于使用相同的样品获得的参考或持家基因进行归一化，以及2)将响应生物标志物mRNA的归一化水平除以阴性对照水平。在实施方案中，阴性对照水平为培养基对照。

在实施方案中，为评价效力或交叉效力，可以进行详细的剂量反应曲线的统计比较来证明剂量反应曲线的相似性。可以使用文献中或本领域技术人员已知的任何方法来证明剂量反应曲线的相似性。在实施方案中，基于剂量反应曲线之间或之中0至约15％的百分比差异来确定剂量反应曲线之间的相似性。在实施方案中，基于剂量反应曲线之间或之中0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％的百分比差异来确定剂量反应曲线之间的相似性。在实施方案中，基于剂量反应曲线之间或之中0％至约3％、0％至约4％、0％至约5％、0％至约6％、0％至约7％、0％至约8％、0％至约9％、0％至约10％、0％至约11％、0％至约12％、0％至约13％、0％至约14％、约1％至约3％、约1％至约4％、约1％至约5％、约1％至约6％、约1％至约7％、约1％至约8％、约1％至约9％、约1％至约10％、约1％至约11％、约1％至约12％、约1％至约13％、约1％至约14％、约2％至约4％、约2％至约5％、约2％至约6％、约2％至约7％、约2％至约8％、约2％至约9％、约2％至约10％、约2％至约11％、约2％至约12％、约2％至约13％、约2％至约14％、约2％至约15％、约3％至约5％、约3％至约6％、约3％至约7％、约3％至约8％、约3％至约9％、约3％至约10％、约3％至约11％、约3％至约12％、约3％至约13％、约3％至约14％、约3％至约15％、约4％至约7％、约4％至约8％、约4％至约9％、约4％至约10％、约4％至约11％、约4％至约12％、约4％至约13％、约4％至约14％、约4％至约15％、约5％至约8％、约5％至约9％、约5％至约10％、约5％至约11％、约5％至约12％、约5％至约13％、约5％至约14％、约5％至约15％、约6％至约9％、约6％至约10％、约6％至约11％、约6％至约12％、约6％至约13％、约6％至约14％、约6％至约15％、约7％至约10％、约7％至约11％、约7％至约12％、约7％至约13％、约7％至约14％、约7％至约15％、约8％至约11％、约8％至约12％、约8％至约13％、约8％至约14％、约8％至约15％、约9％至约12％、约9％至约13％、约9％至约14％、约9％至约15％、约10％至约13％、约10％至约14％、约10％至约15％、约11％至约14％、约11％至约15％，约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％的百分比差异来确定剂量反应曲线之间的相似性。

考虑使用本领域已知的或文献中描述的任何合适的RT-PCR定量方法。定量方法由例如Wong和Medrano,2005,Biotechniques 39:57-85,“Real-Time PCR for mRNAQuantitation”进行了描述，该文献通过引用全文并入本文。

在实施方案中，在本发明的方法中使用被本领域技术人员通过已知方法确认为有用的任何参考或持家基因。在实施方案中，使用的参考或持家基因选自：GAPDH、β-肌动蛋白、Atp5b、B2m、Cyc1、Hprt、Gapdh、18S RNA以及Rp113a。

在本发明的实施方案中，将为确定相对效力和相对交叉效力而进行的比较表达为观察到的mRNA生物标志物表达的量的比率、比例或百分比。

在本发明的实施方案中，将GA测试批的效力或交叉效力与GA参考标准批的效力或交叉效力进行比较，以获得GA测试批的相对效力或交叉效力。在其中相对效力或交叉效力为100％(其也可以表示为1.0)的实施方案中，GA测试批和GA参考标准批的效力或交叉效力是相等的。在实施方案中，期望的相对效力为约80％至约120％。在实施方案中，期望的相对效力为约85％至约115％。在实施方案中，期望的相对效力为约90％至约110％。在实施方案中，期望的相对交叉效力为约70％至约130％。在实施方案中，期望的相对交叉效力为约65％至约135％。在某些实施方案中，相对于参考标准批的效力或交叉效力的期望的效力或期望的交叉效力(期望的相对效力或期望的相对交叉效力)为约或至少约65％、约或至少约66％、约或至少约67％、约或至少约68％、约或至少约69％、约或至少约70％、约或至少约71％、约或至少约72％、约或至少约73％、约或至少约74％、约或至少约75％、约或至少约75％、约或至少约76％、约或至少约77％、约或至少约78％、约或至少约79％、约或至少约80％、约或至少约81％、约或至少约82％、约或至少约83％、约或至少约84％、约或至少约85％、约或至少约86％、约或至少约87％、约或至少约88％、约或至少约89％、约或至少约90％、约或至少约91％、约或至少约92％、约或至少约93％、约或至少约94％、约或至少约95％、约或至少约96％、约或至少约97％、约或至少约98％、约或至少约99％、约或至少约100％、约或至少约101％、约或至少约102％、约或至少约103％、约或至少约104％、约或至少约105％、约或至少约106％、约或至少约107％、约或至少约108％、约或至少约109％、约或至少约110％、约或至少约111％、约或至少约112％、约或至少约113％、约或至少约114％、约或至少约115％、约或至少约116％、约或至少约117％、约或至少约118％、约或至少约119％、约或至少约120％、约或至少约121％、约或至少约122％、约或至少约123％、约或至少约124％、约或至少约125％、约或至少约126％、约或至少约127％、约或至少约128％、约或至少约129％、约或至少约130％、约或至少约131％、约或至少约132％、约或至少约133％、约或至少约134％、或者约或至少约135％。在实施方案中，期望的相对效力或交叉效力为约68％至约132％、约70％至约130％、约72％至约128％、约75％至约125％、约80％至约120％、约85％至约115％、约65％至约110％、约68％至约110％、约70％至约110％、约72％至约110％、约78％至约110％、约80％至约110％、约90％至约110％、约95％至约105％、约85％至约110％、约90％至约110％、约95％至约110％、约96％至约110％、约97％至约110％、约98％至约110％、约99％至约110％、约100％至约110％、约65％至约105％、约68％至约105％、约70％至约105％、约72％至约105％、约80％至约105％、约85％至约105％、约90％至约105％、约95％至约105％、约96％至约105％、约97％至约105％、约98％至约105％、约99％至约105％、约100％至约105％、约65％至约100％、约68％至约100％、约70％至约100％、约72％至约100％、约75％至约100％、约78％至约100％、约80％至约100％、约81％至约100％、约82％至约100％、约83％至约100％、约84％至约100％、约85％至约100％、约86％至约100％、约87％至约100％、约88％至约100％、约89％至约100％、约90％至约100％、约91％至约100％、约92％至约100％、约93％至约100％、约94％至约100％、约95％至约100％、约96％至约100％、约97％至约100％、约98％至约100％、约99％至约100％、约95％至约99％、约96％至约99％、约97％至约99％、约70％至约135％、约75％至约135％、约80％至约135％、约85％至约135％、约90％至约135％、约75％至约130％、约80％至约130％、约85％至约130％、约90％至约130％、约80％至约125％、约85％至约125％、约90％至约125％、约85％至约120％、约90％至约120％、或约95％至约120％。

动物

根据本发明的测试动物或测试哺乳动物为可以用于评价化合物的任何动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴子等。

可以根据本领域技术人员已知的方法结合本文实施例中提供的教导来鉴定合适的测试动物。例如，许多小鼠品系是本领域已知的并可从包括Jackson Laboratories、Charles River、Taconic等来源商购获得。关于可用的近交小鼠品系的信息可获自公开的文献及数据库，包括国际小鼠品系资源(International Mouse Strain Resource)(EppigJT和Strivens M,1999,Finding a mouse:the International Mouse Strain Resource(IMSR).Trends in Genetics 15:81-82)。本文实施例中描述了对若干小鼠品系的增加的细胞因子分泌水平的评估。实施例进一步描述了对响应生物标志物mRNA的评估，所述响应生物标志物mRNA来自编码可能在本发明的方法中测量的细胞因子的基因。

在实施方案中，所述测试动物为小鼠。在实施方案中，小鼠品系具有MHC单元型(haplotype)b、d或s2。在实施方案中，小鼠品系为CSJLF1/JRj、SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J或(SJL/J x BALB/c)F1。在实施方案中，小鼠为雌性CSJLF1/JRj、雌性SJL/J、雌性BALB/cByJ、雌性CD-1、雌性C57BL/10J或雌性(SJL/J x BALB/c)F1小鼠。

在通过比较来自各自用不同GA批免疫的不同小鼠的样品中的响应生物标志物mRNA表达来确定交叉效力的实施方案中，小鼠在免疫相关基因座方面具有基本相同的基因型。在实施方案中，小鼠选自：相同小鼠品系的小鼠：HLA匹配的小鼠；同窝出生的小鼠；以及双胎。在实施方案中，小鼠为基因相同的或基本上基因相同的。

免疫

在本文和公开的文献，例如美国专利号7,429,374和7,923,215中描述了在本发明的方法中有用的动物免疫程序。本领域技术人员可确定诱导T细胞对GA的响应的其他有效的免疫程序。在实施方案中，用在CFA乳剂中的250μg的GA或在CFA乳剂中的甘露糖醇经由足垫(足底)和或下肢/踝注射来对小鼠进行免疫。在实施方案中，用约200至约500μg、约200至约450μg、约200至约350μg、约200至约300μg、约200至约250μg、约250至约500μg、约250至约450μg、约250至约400μg、约250至约350μg、或约250至约300μg的GA来对小鼠进行免疫。

在实施方案中，通过使用具有27-G，1/2英寸针的1mL注射器注射至四个足垫中的每一个来对8周龄的动物进行免疫。对于足底注射，可以用0.1mL的总注射体积(约10μL至各个前足垫并且40μL至各个后足垫)来对小鼠进行免疫。对于皮下(例如下肢)注射，可以用0.1mL的总注射体积(例如，约25μL至各个前下肢并且25μL至各个后肢踝)来对各只小鼠进行免疫。

T细胞培养

在本发明的方法中，考虑来自测试动物中任何来源的T细胞的离体GA刺激。在实施方案中，T细胞来自淋巴结、脾脏、骨髓或外周血。可以如本文实施例中所述或通过本领域中已知的任何方法或使用文献中公开的方法来获得T细胞。

作为实例，从经免疫的小鼠中获得T细胞，并且如下制备原始培养物：免疫后十天，经由颈脱位法处死免疫的动物。移取来自经免疫的小鼠的腋区及腘区中的淋巴结，并将该淋巴结集中至含有5mL冰冷的无菌RPMI-1640培养基的培养皿(petri dish)中。将完整的淋巴结在5.0mL冰冷的无菌RPMI 1640培养基中清洗三次。通过用无菌注射器的柱塞末端按压LN来分离LN细胞。首先使细胞悬浮液通过100μm尼龙细胞粗滤器(cell strainer)，并随后用40mL冰冷的RPMI-1640培养基清洗一次。在4℃下以约200x g离心10分钟后，将细胞沉淀物(cell pellet)重悬浮于40mL的RPMI-1640培养基中用于细胞计数。

可以使用台盼蓝排除(Trypan blue exclusion)法来按如下确定悬浮液中活细胞的细胞密度：为进行细胞计数，将0.1mL的细胞悬浮液转移至具有0.65mL的1X DPBS及0.25mL的4％台盼蓝溶液的干净无菌的微量离心管中，接着将20μL的台盼蓝细胞悬浮液混合物添加至计数室(counting chamber)。使用Auto T4Cellometer来测量细胞密度及活力。在细胞计数之后，将LN细胞在4℃下以约200x g离心10分钟，并以1.0x10⁷个细胞/mL的细胞密度悬浮于富集DCCM-1培养基中。可将LN细胞接种于24孔组织培养板中用于药物处理(刺激)。

在实施方案中，在发展出对GA的免疫响应的足够时间之后，例如免疫后约9-11天，从小鼠中获得LN细胞。

醋酸格拉替雷刺激

可以根据本领域中已知或文献中描述的任何合适的方法用抗原(GA)来刺激T细胞，例如LN细胞。例如，根据需要可以用预定量的GA参考标准批来刺激来自用GA免疫的动物的预定数目的LN细胞，例如0.5mL细胞(5x10⁶个细胞/孔)。在单独的样品中，可以用相同预定量的GA测试批来刺激相同预定数目的LN细胞。可以通过将100μL的GA(20mg/mL)添加至19.9mL的富集DCCM-1培养基中产生100μg/mL储备溶液以根据需要制备不同浓度的GA样品来制备GA稀释样品。

例如，在24孔组织培养板中，将预定量的GA测试批或GA参考标准批的储备溶液添加至含有预定数目的LN细胞的孔中，以提供所期望的GA浓度。类似地，来自用甘露糖醇免疫的对照动物的相同预定数目的T细胞可以使用相同的程序用相同预定量的GA批进行处理。

在本发明的实施方案中，用确定量的GA参考标准对测试动物进行免疫。在GA参考标准的存在下，温育至少一个包含来自经免疫的动物的预定数目的淋巴结细胞的样品，并在GA测试批的存在下，温育至少一个来自经免疫的动物的淋巴结细胞的样品。该刺激可诱导参与免疫响应的分子，例如编码细胞因子和细胞因子受体的mRNA的表达。

在实施方案中，淋巴结细胞的样品与浓度为至少约0.3μg/mL至约100μg/mL的GA一起温育。在实施方案中，该浓度为至少约0.3μg/mL、至少约0.4μg/mL、至少约0.5μg/mL、至少约0.6μg/mL、至少约0.7μg/mL、至少约0.8μg/mL、至少约0.9μg/mL、至少约1μg/mL、至少约1.5μg/mL、至少约2μg/mL、至少约2.5μg/mL、至少约3μg/mL、至少约3.5μg/mL、至少约4μg/mL、至少约4.5μg/mL、至少约5μg/mL、至少约5.5μg/mL、至少约6μg/mL、至少约6.5μg/mL、至少约7μg/mL、至少约7.5μg/mL、至少约8μg/mL、至少约8.5μg/mL、至少约9μg/mL、至少约9.5μg/mL、至少约10μg/mL、至少约10.5μg/mL、至少约11μg/mL、至少约11.5μg/mL、至少约12μg/mL、至少约12.5μg/mL、至少约13μg/mL、至少约13.5μg/mL、至少约14μg/mL、至少约14.5μg/mL、至少约15μg/mL、至少约15.5μg/mL、至少约16μg/mL、至少约16.5μg/mL、至少约17μg/mL、至少约17.5μg/mL、至少约18μg/mL、至少约18.5μg/mL、至少约19μg/mL、至少约19.5μg/mL、至少约20μg/mL、至少约21.5μg/mL、至少约22μg/mL、至少约22.5μg/mL、至少约23μg/mL、至少约24μg/mL、至少约24.5μg/mL、至少约25μg/mL、至少约25.5μg/mL、至少约26μg/mL、至少约26.5μg/mL、至少约27μg/mL、至少约27.5μg/mL、至少约28μg/mL、至少约28.5μg/mL、至少约29μg/mL、至少约29.5μg/mL、至少约30μg/mL、至少约35μg/mL、至少约40μg/mL、至少约45μg/mL、至少约50μg/mL、至少约55μg/mL、至少约60μg/mL、至少约65μg/mL、至少约70μg/mL、至少约75μg/mL、至少约80μg/mL、至少约85μg/mL、至少约90μg/mL、至少约95μg/mL或至少约100μg/mL。在实施方案中，该浓度为约0.3至约15μg/mL、约0.3至约10μg/mL、约0.3至约8μg/mL、约0.3至约6μg/mL、约0.3至约5μg/mL、约0.3至约4μg/mL、约0.3至约3μg/mL、约0.3至约2.5μg/mL、约0.3至约2μg/mL、约0.3至约1μg/mL、约1至约15μg/mL、约1至约10μg/mL、约1至约9μg/mL、约1至约8μg/mL、约1至约7μg/mL、约1至约6μg/mL、约1至约5μg/mL、约1至约4μg/mL、约1至约3μg/mL、约1至约2.5μg/mL、约1至约2μg/mL、约2至约30μg/mL、约2至约29μg/mL、约2至约28μg/mL、约2至约27μg/mL、约2至约26μg/mL、约2至约25μg/mL、约2至约24μg/mL、约2至约23μg/mL、约2至约22μg/mL、约2至约21μg/mL、约2至约20μg/mL、约2至约19μg/mL、约2至约18μg/mL、约2至约17μg/mL、约2至约16μg/mL、约2至约15μg/mL、约2至约14μg/mL、约2至约13μg/mL、约2至约12μg/mL、约2至约11μg/mL、约2至约10μg/mL、约2至约5μg/mL、约2.5至约30μg/mL、约2.5至约29μg/mL、约2.5至约28μg/mL、约2.5至约27μg/mL、约2.5至约26μg/mL、约2.5至约25μg/mL、约2.5至约24μg/mL、约2.5至约23μg/mL、约2.5至约22μg/mL、约2.5至约21μg/mL、约2.5至约20μg/mL、约2.5至约19μg/mL、约2.5至约18μg/mL、约2.5至约17μg/mL、约2.5至约16μg/mL、约2.5至约15μg/mL、约2.5至约14μg/mL、约2.5至约13μg/mL、约2.5至约12μg/mL、约2.5至约11μg/mL、约2.5至约10μg/mL、约2.5至约5μg/mL、约3至约30μg/mL、约3至约29μg/mL、约3至约28μg/mL、约3至约27μg/mL、约3至约26μg/mL、约3至约25μg/mL、约3至约24μg/mL、约3至约23μg/mL、约3至约22μg/mL、约3至约21μg/mL、约3至约20μg/mL、约3至约19μg/mL、约3至约18μg/mL、约3至约17μg/mL、约3至约16μg/mL、约3至约15μg/mL、约3至约14μg/mL、约3至约13μg/mL、约3至约12μg/mL、约3至约11μg/mL、约3至约10μg/mL、约3.5至约30μg/mL、约3.5至约29μg/mL、约3.5至约28μg/mL、约3.5至约27μg/mL、约3.5至约26μg/mL、约3.5至约25μg/mL、约3.5至约24μg/mL、约3.5至约23μg/mL、约3.5至约22μg/mL、约3.5至约21μg/mL、约3.5至约20μg/mL、约3.5至约19μg/mL、约3.5至约18μg/mL、约3.5至约17μg/mL、约3.5至约16μg/mL、约3.5至约15μg/mL、约3.5至约14μg/mL、约3.5至约13μg/mL、约3.5至约12μg/mL、约3.5至约11μg/mL、约3.5至约10μg/mL、约4至约30μg/mL、约4至约29μg/mL、约4至约28μg/mL、约4至约27μg/mL、约4至约26μg/mL、约4至约25μg/mL、约4至约24μg/mL、约4至约23μg/mL、约4至约22μg/mL、约4至约21μg/mL、约4至约20μg/mL、约4至约19μg/mL、约4至约18μg/mL、约4至约17μg/mL、约4至约16μg/mL、约4至约15μg/mL、约4至约14μg/mL、约4至约13μg/mL、约4至约12μg/mL、约4至约11μg/mL、约4至约10μg/mL、约4.5至约30μg/mL、约4.5至约29μg/mL、约4.5至约28μg/mL、约4.5至约27μg/mL、约4.5至约26μg/mL、约4.5至约25μg/mL、约4.5至约24μg/mL、约4.5至约23μg/mL、约4.5至约22μg/mL、约4.5至约21μg/mL、约4.5至约20μg/mL、约4.5至约19μg/mL、约4.5至约18μg/mL、约4.5至约17μg/mL、约4.5至约16μg/mL、约4.5至约15μg/mL、约4.5至约14μg/mL、约4.5至约13μg/mL、约4.5至约12μg/mL、约4.5至约11μg/mL、约4.5至约10μg/mL、约5至约75μg/mL、约5至约50μg/mL、约5至约40μg/mL、约5至约30μg/mL、约5至约29μg/mL、约5至约28μg/mL、约5至约27μg/mL、约5至约26μg/mL、约5至约25μg/mL、约5至约24μg/mL、约5至约23μg/mL、约5至约22μg/mL、约5至约21μg/mL、约5至约20μg/mL、约5至约19μg/mL、约5至约18μg/mL、约5至约17μg/mL、约5至约16μg/mL、约5至约15μg/mL、约5至约14μg/mL、约5至约13μg/mL、约5至约12μg/mL、约5至约11μg/mL、约5至约10μg/mL、约10至约75μg/mL、约10至约50μg/mL、约10至约50μg/mL、约10至约30μg/mL、约10至约25μg/mL、约10至约20μg/mL、约10至约15μg/mL、约15至约75μg/mL、约15至约50μg/mL、约15至约40μg/mL、约15至约30μg/mL、约15至约25μg/mL、或约15至约20μg/mL。

在本发明的实施方案中，用于免疫的GA参考标准批为克帕松或需要的任何其他GA批。在这些实施方案中，采用用于免疫的GA批来处理来自经免疫的动物的细胞的单独的样品，并用第二GA批(测试批)来分别处理细胞的第二样品。在实施方案中，GA参考标准批不是克帕松。在这些实施方案中，测试批可以是克帕松或需要的任何其他GA批。在实施方案中，将多于一个GA测试批与第一测试批进行并行评价。

在其中确定交叉效力的实施方案中，分别用不同的GA批对多于一只小鼠进行免疫。用不同的GA批刺激从各个免疫的小鼠获得的LN细胞的各个样品，以使得来自各个免疫的细胞分别用各个不同的GA批进行刺激。

响应生物标志物mRNA

考虑将通过GA刺激潜在调节的mRNA种类用作本发明的方法中的响应生物标志物。在实施方案中，响应生物标志物为从编码以下的基因转录的mRNA：例如，CD25、CD69、CD71、CD86(CD86分子)、CD137、CD154、CD278(ICOS，可诱导的T细胞共刺激物)、CD279、HLA-DR、GATA3(GATA结合蛋白3)、HLA-DMA(主要组织相容性复合物，II类，DMα)、HLA-DMB(主要组织相容性复合物，II类，DMβ)、IFN-γ(干扰素γ)、IFN-γR2(干扰素γ受体)、IL-2(白介素2)、IL-4(白介素4)、IL-5(白介素5)、IL-6(白介素6)、IL-8(CXCL-8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、IL-10(白介素10)、IL-13(白介素13)、IL-18(白介素18)、IL-12RB1(白介素12受体，β)、IL-17A(白介素17A)、IL-17F(白介素17F)、IL-18R1(白介素18受体1)、IL-2RA(白介素2受体，α2)、IL-2RG(白介素2受体，γ)、IL4-R(白介素4受体)、IL-6R(白介素6受体)、IL-21(白介素21)、IL-22(白介素22)、IL-1β(白介素1-β)、Tbx21(T-box 21)、TGFBR2(转化生长因子，β受体II)、TNF(肿瘤坏死因子，TNF-α)、TNF-β(LT)、TGF-β、FOXP3(叉头框P3)、或IL-10RB(白介素10受体，β)。可以使用商业上可获得的服务、试剂和/或试剂盒，例如，MouseWG-6v2.0Expression BeadChip Kit(Illumina,Inc.,San Diego,CA)来评价这些基因的表达。

在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码选自例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13或IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β和IL-1β的细胞因子的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码选自例如CD25、CD69、CD71、CD86、CD137、CD154、CD278、CD279、GATA3、Tbx21、HLA-DMA、HLA-DMB、IFN-γR2、IL-12RB1、IL-2RA、IL-2RG、IL-4R、IL-6R、IL-10RB、TGFBR2、FOXP3和HLA-DR的活化标志物或细胞因子受体的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码选自例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7的趋化因子的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码Th1相关细胞因子、Th2相关细胞因子、Th17相关细胞因子或T_FH相关细胞因子的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码Th1相关细胞因子的基因转录，并且为IFN-γ、IL-2、IL-1β、TNF-α或CXCL1。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码选自IL-4、IL-5、IL-10或IL-13的Th2相关细胞因子的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码选自IL-17和IL-22的Th17相关细胞因子的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码T_FH相关细胞因子的基因转录，该T_FH相关细胞因子为IL-21。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码选自IL-10和TGF-β的关键调节性相关细胞因子的基因转录。

在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ、TNF-α、CD25或IL1-β的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、TNF-α、CD-25或IL1-β的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码IL-4、IL-13或TNF-α的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ或CD25的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码IL-4、IL-5、IL-13、IL-17或CD25的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ或TNF-α的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、TNF-α的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码IL-4、IL-5、IL-13、IL-17或IFN-γ的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码IL-4、IL-5、IL-13或IL-17的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码CD25、IL-4或IL-13的基因转录。在实施方案中，响应生物标志物mRNA从编码IL-4或IL-13的基因转录。

在实施方案中，小鼠品系为CSJLF1/JRj、SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J或(SJL/J x BALB/c)F1。在实施方案中，小鼠品系为CSJLF1/JRj、SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J或(SJL/J x BALB/c)F1，并且响应生物标志物mRNA从编码鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、或IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β和IL-1β的基因转录。在实施方案中，测量多于一种响应生物标志物mRNA。在特定的实施方案中，例如通过多重PCR(multiplex PCR)在相同样品中测量多于一种响应生物标志物mRNA。在特定的实施方案中，测试动物为SJL/J小鼠，并且响应生物标志物mRNA从编码mIL-2、mIL-4、mIl-5、mIL-13或mIFN-γ的基因转录。在特定的实施方案中，测试动物为BALB/cByJ小鼠，并且响应生物标志物mRNA从编码mIL-2、mINF-γ、mIL-4、mIL-5、mIL-10或mIL-13的基因转录。在其他实施方案中，测试动物为CD-1小鼠，并且响应生物标志物mRNA从编码mIL-2、mINF-γ、mIL-5、mIL-10或mIL-13的基因转录。在某些实施方案中，测试动物为C57BL/10J小鼠，并且响应生物标志物mRNA从编码mIL-2或mINF-γ的基因转录。在其他实施方案中，测试动物为(SJL/J x BALB/C)F1小鼠，并且响应生物标志物mRNA从编码mIFN-γ、mTNF-α、mIL-4、mIL-5、mIL-10、mIL-13、mIL-17、mCD69或mCD25的基因转录。在实施方案中，测试动物为CSJLF1/JRj小鼠，并且响应生物标志物mRNA从编码IL-4、IL-5、IL-13或IL-17的基因转录。

在本发明的特定实施方案中，测试动物为通过足底注射免疫的BALB/cByJ小鼠，并且测量的响应生物标志物为INF-γ、IL-4或IL-5。在实施方案中，测试动物为通过下肢注射免疫的BALB/cByJ小鼠，并且测量的响应生物标志物为IL-2。在其他实施方案中，测试动物为通过足底注射免疫的CD-1小鼠，并且测量的响应生物标志物为IL-2、INF-γ、IL-4、IL-5或IL-10。

本发明还涉及用于鉴定可在本发明的效力测定中测量的响应生物标志物mRNA种类的方法。根据本文中提出的教导，本领域技术人员可以鉴定另外的响应生物标志物mRNA，本文的教导证明了对响应于来自用GA免疫的小鼠的T细胞的GA刺激而增加的细胞因子mRNA种类的鉴定。在实施方案中，用于本发明的效力测定的合适的响应生物标志物为mRNA种类，该mRNA种类被确定为响应于来自用GA免疫的小鼠的T细胞的GA刺激而被调节，并且其中发现该调节在两个或更多个重复测试中是一致的。在实施方案中，mRNA种类响应于GA刺激被调节了至少约2倍至约50倍、约2倍至约45倍、约2倍至约40倍、约2倍至约35倍、约2倍至约30倍、约2倍至约25倍、约2倍至约22倍、约2倍至约20倍、约2倍至约15倍、约2倍至约12倍、约2倍至约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍、约2倍至约5倍、约2倍至约4倍、3倍至约50倍、约3倍至约45倍、约3倍至约40倍、约3倍至约35倍、约3倍至约30倍、约3倍至约25倍、约3倍至约22倍、约3倍至约20倍、约3倍至约15倍、约3倍至约12倍、约3倍至约10倍、约3倍至约9倍、约3倍至约8倍、约3倍至约7倍、约3倍至约6倍、约3倍至约5倍、约4倍至约50倍、约4倍至约45倍、约4倍至约40倍、约4倍至约35倍、约4倍至约30倍、约4倍至约25倍、约4倍至约22倍、约4倍至约20倍、约4倍至约15倍、约4倍至约12倍、约4倍至约10倍、约4倍至约9倍、约4倍至约8倍、约4倍至约7倍、约4倍至约6倍、约5倍至约50倍、约5倍至约45倍、约5倍至约40倍、约5倍至约35倍、约5倍至约30倍、约5倍至约25倍、约5倍至约22倍、约5倍至约20倍、约5倍至约15倍、约5倍至约12倍、约5倍至约10倍、约5倍至约9倍、约5倍至约8倍、约5倍至约7倍、约7倍至约50倍、约7倍至约45倍、约7倍至约40倍、约7倍至约35倍、约7倍至约30倍、约7倍至约25倍、约7倍至约22倍、约7倍至约20倍、约7倍至约15倍、约7倍至约12倍、约7倍至约10倍、约7倍至约9倍、约10倍至约50倍、约10倍至约45倍、约10倍至约40倍、约10倍至约35倍、约10倍至约30倍、约10倍至约25倍、约10倍至约22倍、约10倍至约20倍、约10倍至约15倍、约15倍至约50倍、约15倍至约45倍、约15倍至约40倍、约15倍至约35倍、约15倍至约30倍、约15倍至约25倍、约15倍至约22倍、约15倍至约20倍、约20倍至约50倍、约20倍至约45倍、约20倍至约40倍、约20倍至约35倍、约20倍至约30倍、约20倍至约25倍、约25倍至约50倍、约25倍至约45倍、约25倍至约40倍、约25倍至约35倍、约25倍至约30倍、约30倍至约50倍、约30倍至约45倍、约30倍至约40倍、约30倍至约35倍，至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约2倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍。潜在的响应生物标志物mRNA的测量在本文其他地方进行了描述。

响应生物标志物mRNA的测量

可以使用许多可商购的测定试剂盒和系统中的任一个，或者根据本领域中所述的任何方法来定量测量响应生物标志物mRNA种类。考虑在本发明的方法中使用本领域已知的用于测量mRNA表达水平的任何合适的定量方法。例如，可以使用PCR方法(包括RT-PCR)和实时逆转录PCR(qRT-PCR)来进行mRNA的逆转录和扩增。用于定量基因表达的PCR方法由，例如，VanGuilder等人,2008,“Twenty-five years of quantitative PCR for geneexpression analysis,”Biotechniques 44:619-626，以及Bustin等人,2005,“Quantitative real-time RT-PCR–a perspective,”Journal of MolecularEndocrinology,34:597-601进行了描述，这些文献分别通过引用全文并入本文。小鼠细胞因子mRNA的定量PCR由，例如，Overbergh等人,1999,“Quantification of murinecytokine mRNAs using real time quantitative reverse transcriptase PCR,”Cytokine 11(4):305-312进行了描述，该文献通过引用并入本文，描述了用于定量IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、p40、IL-13、IL-15、IFN-γ、TNF-α、TGF-β和iNOS的探针和引物。

小鼠细胞因子RT-PCR试剂盒可广泛地获得，例如，从Fisher Scientific、LifeTechnologies以及SABiosciences获得。例如，Life Technologies Cytokine Mouse 20-Plex Panel同时允许IP-10、MIP-1α、MCP-1、IL-13、IFN-γ、IL-1α、碱性FGF、IL-10、IL-12、IL-17、MIG、GM-CSF、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、VEGF和KC的测量。SABiosciencesMouse Common Cytokines RT²Profiler^TMPCR Array可被定制为用于测量84个细胞因子基因的亚组。在实施方案中，使用从Life Technologies获得的TaqMan通用PCR主混合物(TaqMan Universal PCR Master Mix)(目录号4304437)以及小鼠细胞因子引物/探针IL-2(目录号4331182；ID Mm00434256_m1)、IL-4(目录号4331182；ID Mm00445259_m1)、IL-5(目录号4331182；ID Mm00439646_m1)、IL-10(目录号4331182；ID Mm00439614_m1)、IL-13(目录号4331182；ID Mm00434204_m1)、IFN-γ(目录号4331182；ID Mm01168134_m1)和TNF-α(目录号4331182；ID Mm00443260_g1)。

在实施方案中，使用Illumina MouseWG-6v2.0Expression BeadChip试剂盒来评估转录水平，或者使用MouseRef-8v2.0Expression BeadChip试剂盒(Illumina,Inc.,SanDiego,CA)。转录组分析可以使用其他方法，例如，RNA-Seq(Nagalakshmi等人,2010年1月,RNA-Seq:A Method for Comprehensive Transcriptome Analysis,”Current Protocolsin Molecular Biology,Wiley Interscience,Unit 4.11,增刊(Supplement)89,Copyright 2010John Wiley&Sons,Inc.,该文献通过引用全文并入本文)进行。

接受标准可包括，例如，一式三份对各刺激的分析，由阳性对照ConA对靶基因的诱导大于或等于由最高浓度的GA引起的诱导，由阴性对照MBP对靶基因的诱导低于培养基对照的2倍，以及NTC(无模板对照)对照的扩增在可检测水平以下。在实施方案中，如果靶基因的PCR运行不符合以上的接受标准，则将重复特定的运行。

在本发明的方法中，测量响应生物标志物mRNA以提供GA测试批的效力的指示。GA测试批的效力由其产生与已知的或可能的GA作用机理相关的响应的能力来表示。由此由T细胞的GA刺激对T细胞细胞因子表达的特异性诱导可以作为GA测试批效力的指标。在实施方案中，响应生物标志物mRNA为由生物标志物基因转录的RNA种类。在实施方案中，测量的响应生物标志物mRNA编码该生物标志物蛋白质。在实施方案中，检测方法测量从编码生物标志物蛋白质的基因转录的mRNA转录物的任何给定部分。在实施方案中，通过采用引物或探针的核酸扩增或本领域已知的其他检测方法进行测量，所述引物或探针与如适于产生可量化信号的mRNA转录物的任何部分杂交。

GA刺激时间是关键性的。通常，选择观察到生物标志物mRNA水平的可易于检测且高度再现的增加或减少的时间范围(timeframe)。预期刺激开始后测量对细胞与GA温育的响应的最佳时间会根据特定响应生物标志物mRNA的表达谱而变化。已经观察到刺激对某些生物标志物mRNA表达的影响会随着温育时间的推移而逐渐减少(参见实施例)，因而并不能证明较晚的时间点是有用的。

在本发明方法的实施方案中，GA响应生物标志物mRNA在GA刺激开始后约24小时之前进行测量。在本发明方法的实施方案中，GA响应生物标志物mRNA在GA刺激开始后约23、约22、约21或约20小时之前进行测量。

在本发明方法的实施方案中，GA响应生物标志物mRNA在LN细胞与GA测试批或参考标准批开始温育(刺激)后约4至约6小时时进行测量。在本发明方法的实施方案中，GA响应生物标志物mRNA在LN细胞与GA测试批或参考标准批开始温育后约1小时至约24小时时进行测量。在实施方案中，GA响应生物标志物mRNA在LN细胞与GA测试批或参考标准批开始温育(刺激)后约1小时、约1.25小时、约1.5小时、约1.75小时、约2小时、约2.25小时、约2.5小时、约2.75小时、约3小时、约3.25小时、约3.5小时、约3.75小时、约4小时、约4.25小时、约4.5小时、约4.75小时、约5小时、约5.25小时、约5.5小时、约5.75小时、约6小时、约6.25小时、约6.5小时、约6.75小时、约7小时、约7.25小时、约7.5小时、约7.75小时、约8小时、约8.25小时、约8.5小时、约8.75小时、约9小时、约9.25小时、约9.5小时、约9.75小时、约10小时、约10.25小时、约10.5小时、约10.75小时、约11小时、约11.25小时、约11.5小时、约11.75小时、约12小时、约12.5小时、约13小时、约13.5小时、约14小时、约14.5小时、约15小时、约15.5小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23或约24小时时进行测量。

在实施方案中，GA响应生物标志物mRNA在LN细胞与GA测试批或参考标准批开始温育(刺激)后约2小时至约16小时、约2小时至约15小时约2小时至约14小时、约2小时至约13小时、约2小时至约12小时、约2小时至约11小时、约2小时至约10小时、约2小时至约9小时、约2小时至约8小时、约2小时至约7小时、约2小时至约6小时、约2.5小时至约16小时、约2.5小时至约15小时约2.5小时至约14小时、约2.5小时至约13小时、约2.5小时至约12小时、约2.5小时至约11小时、约2.5小时至约10小时、约2.5小时至约9小时、约2.5小时至约8小时、约2.5小时至约7小时、约2.5小时至约6小时、约2.5小时至约5.5小时、约2.5小时至约5小时、约2.5小时至约4小时、约3小时至约16小时、约3小时至约15小时约3小时至约14小时、约3小时至约13小时、约3小时至约12小时、约3小时至约11小时、约3小时至约10小时、约3小时至约9小时、约3小时至约8小时、约3小时至约7小时、约3小时至约6小时、约3小时至约5.5小时、约3小时至约5小时、约3小时至约4小时、约3.5小时至约16小时、约3.5小时至约15小时约3.5小时至约14小时、约3.5小时至约13小时、约3.5小时至约12小时、约3.5小时至约11小时、约3.5小时至约10小时、约3.5小时至约9小时、约3.5小时至约8小时、约3.5小时至约7小时、约3.5小时至约6小时、约3.5小时至约5.5小时、约3.5小时至约5小时、约4小时至约16小时、约4小时至约15小时、约4小时至约14小时、约4小时至约13小时、约4小时至约12小时、约4小时至约11小时、约4小时至约10小时、约4小时至约9小时、约4小时至约8小时、约4小时至约7小时、约4小时至约6小时、约4小时至约5.5小时、约5小时至约16小时、约5小时至约15小时、约5小时至约14小时、约5小时至约13小时、约5小时至约12小时、约5小时至约11小时、约5小时至约10小时、约5小时至约9小时、约5小时至约8小时、约5小时至约7小时、约5小时至约6小时、约6小时至约16小时、约6小时至约15小时、约6小时至约14小时、约6小时至约13小时、约6小时至约12小时、约6小时至约11小时、约6小时至约10小时、约6小时至约9小时、约6小时至约8小时、约6小时至约7小时、约7小时至约16小时、约7小时至约15小时、约7小时至约14小时、约7小时至约13小时、约7小时至约12小时、约7小时至约11小时、约7小时至约10小时、约7小时至约9小时、约7小时至约8小时、约2小时至约24小时、约2小时至约20小时、约2小时至约18小时、约2小时至约16小时、约4小时至约24小时、约4小时至约20小时、约4小时至约18小时、约4小时至约16小时、约6小时至约24小时、约6小时至约20小时、约6小时至约18小时、约6小时至约16小时、约8小时至约24小时、约8小时至约20小时、约8小时至约18小时、或约8小时至约16小时时进行测量。

响应生物标志物mRNA组(Panel)

在实施方案中，使用本发明的方法来测量一组生物标志物mRNA种类。在实施方案中，该组中的mRNA例如通过多重PCR同时进行测量。

在实施方案中，本发明涉及包含一组生物标志物种类的组合物。

在实施方案中，一组生物标志物mRNA种类包含至少两种mRNA种类。在实施方案中，一组生物标志物mRNA种类包含2至50种mRNA种类。在实施方案中，一组生物标志物mRNA种类包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种或至少50种mRNA种类。在实施方案中，一组生物标志物mRNA种类包含2至50、2至5、2至10、2至12、2至15、2至20、2至25、2至30、2至35、2至40、2至45、3至50、3至5、3至10、3至12、3至15、3至20、3至25、3至30、3至35、3至40、3至45、4至50、4至10、4至12、4至15、4至20、4至25、4至30、4至35、4至40、4至45、5至50、5至10、5至12、5至15、5至20、5至25、5至30、5至35、5至40、5至45、6至50、6至12、6至15、6至20、6至25、6至30、6至35、6至40、6至45、7至50、7至12、7至15、7至20、7至25、7至30、7至35、7至40、7至45、8至50、8至15、8至20、8至25、8至30、8至35、8至40、8至45、9至50、9至15、9至20、9至25、9至30、9至35、9至40、9至45、10至50、10至15、10至20、10至25、10至30、10至35、10至40、10至45、12至50、12至20、12至25、12至30、12至35、12至40、12至45、15至50、15至25、15至30、15至40、20至50、20至25、20至30、20至40、25至50、25至40、30至50或30至45种mRNA种类。

在实施方案中，一组生物标志物mRNA种类包含至少两种mRNA种类，各种类从编码以下的基因转录：CD25、CD69、CD71、CD86(CD86分子)、CD137、CD154、CD278(ICOS，可诱导的T细胞共刺激物)、CD279、HLA-DR、GATA3(GATA结合蛋白3)、HLA-DMA(主要组织相容性复合物，II类，DMα)、HLA-DMB(主要组织相容性复合物，II类，DMβ)、IFN-γ(干扰素γ)、IFN-γR2(干扰素γ受体)、IL-2(白介素2)、IL-4(白介素4)、IL-5(白介素5)、IL-6(白介素6)、IL-8(CXCL-8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、IL-10(白介素10)、IL-13(白介素13)、IL-18(白介素18)、IL-12RB1(白介素12受体，β)、IL-17A(白介素17A)、IL-17F(白介素17F)、IL-18R1(白介素18受体1)、IL-2RA(白介素2受体，α2)、IL-2RG(白介素2受体，γ)、IL4-R(白介素4受体)、IL-6R(白介素6受体)、IL-21(白介素21)、IL-22(白介素22)、IL-1β(白介素1-β)、TBX21(T-box 21)、TGFBR2(转化生长因子，β受体II)、TNF(肿瘤坏死因子，TNF-α)、TNF-β(LT)、TGF-β、FOXP3(叉头框P3)或IL-10RB(白介素10受体，β)。可以使用商业上可获得的服务、试剂和/或试剂盒，例如，MouseWG-6v2.0Expression BeadChip试剂盒(Illumina,Inc.,San Diego,CA)来评价这些基因的表达。

在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码选自IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β和IL-1b的细胞因子的基因转录的至少一种mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码选自CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR的活化标志物或细胞因子受体的基因转录的至少一种mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码选自IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7的趋化因子的基因转录的至少一种mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含选自以下的至少一种mRNA种类：从编码Th1相关细胞因子的基因转录的mRNA种类、从编码Th2相关细胞因子的基因转录的mRNA种类、从编码Th17相关细胞因子的基因转录的mRNA种类以及从编码T_FH相关细胞因子的基因转录的mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码Th1相关细胞因子的基因转录的至少一种mRNA种类。在实施方案中，该Th1相关细胞因子为IFN-γ、IL-2、IL-1β、TNF-α或CXCL1。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码Th2相关细胞因子的基因转录的至少一种mRNA种类。在实施方案中，该Th1相关细胞因子为IL-4、IL-5、IL-10或IL-13。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码Th17相关细胞因子的基因转录的至少一种mRNA种类。在实施方案中，该Th17相关细胞因子为IL-17或IL-22。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码T_FH相关细胞因子的基因转录的至少一种响应生物标志物mRNA。在实施方案中，该T_FH相关细胞因子为IL-21。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码关键调节性相关细胞因子的基因转录的至少一种mRNA种类。在实施方案中，关键调节性相关细胞因子选自IL-10和TGF-β。

在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ、TNF-α、CD25和IL1-β的基因转录的mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、TNF-α、CD-25和IL1-β的基因转录的mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码IL-4、IL-13和TNF-α的基因转录的mRNA种类。

在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ或CD25的基因转录的mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码IL-4、IL-5、IL-13、IL-17或CD25的基因转录的mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ和TNF-α的基因转录的mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22和TNF-α的基因转录的mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ的基因转录的mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码IL-4、IL-5、IL-13和IL-17的基因转录的mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码CD25、IL-4和IL-13的基因转录的mRNA种类。在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类包含从编码IL-4和IL-13的基因转录的mRNA种类。

在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类中的mRNA种类在LN细胞与GA测试批或参考标准批开始温育(刺激)后约4至约6小时时进行测量。

在实施方案中，该组生物标志物mRNA种类中的mRNA种类在LN细胞与GA测试批或参考标准批开始温育(刺激)后约6小时时进行测量。

在本发明方法的实施方案中，该组响应生物标志物mRNA种类中的mRNA种类在GA刺激开始后约24小时之前进行测量。在本发明方法的实施方案中，该组响应生物标志物mRNA种类中的mRNA种类在GA刺激开始后约23、约22、约21或约20小时之前进行测量。

在本发明方法的实施方案中，该组响应生物标志物mRNA种类中的mRNA种类在LN细胞与GA测试批或参考标准批开始温育(刺激)后约4至约6小时时进行测量。在本发明方法的实施方案中，该GA响应生物标志物mRNA在LN细胞与GA测试批或参考标准批开始温育后约1小时至约24小时时进行测量。在实施方案中，该GA响应生物标志物mRNA在LN细胞与GA测试批或参考标准批开始温育(刺激)后约1小时、约1.25小时、约1.5小时、约1.75小时、约2小时、约2.25小时、约2.5小时、约2.75小时、约3小时、约3.25小时、约3.5小时、约3.75小时、约4小时、约4.25小时、约4.5小时、约4.75小时、约5小时、约5.25小时、约5.5小时、约5.75小时、约6小时、约6.25小时、约6.5小时、约6.75小时、约7小时、约7.25小时、约7.5小时、约7.75小时、约8小时、约8.25小时、约8.5小时、约8.75小时、约9小时、约9.25小时、约9.5小时、约9.75小时、约10小时、约10.25小时、约10.5小时、约10.75小时、约11小时、约11.25小时、约11.5小时、约11.75小时、约12小时、约12.5小时、约13小时、约13.5小时、约14小时、约14.5小时、约15小时、约15.5小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23或约24小时时进行测量。

在实施方案中，该组响应生物标志物mRNA种类中的mRNA种类在LN细胞与GA测试批或参考标准批开始温育(刺激)后约2小时至约16小时、约2小时至约15小时约2小时至约14小时、约2小时至约13小时、约2小时至约12小时、约2小时至约11小时、约2小时至约10小时、约2小时至约9小时、约2小时至约8小时、约2小时至约7小时、约2小时至约6小时、约2.5小时至约16小时、约2.5小时至约15小时约2.5小时至约14小时、约2.5小时至约13小时、约2.5小时至约12小时、约2.5小时至约11小时、约2.5小时至约10小时、约2.5小时至约9小时、约2.5小时至约8小时、约2.5小时至约7小时、约2.5小时至约6小时、约2.5小时至约5.5小时、约2.5小时至约5小时、约2.5小时至约4小时、约3小时至约16小时、约3小时至约15小时约3小时至约14小时、约3小时至约13小时、约3小时至约12小时、约3小时至约11小时、约3小时至约10小时、约3小时至约9小时、约3小时至约8小时、约3小时至约7小时、约3小时至约6小时、约3小时至约5.5小时、约3小时至约5小时、约3小时至约4小时、约3.5小时至约16小时、约3.5小时至约15小时约3.5小时至约14小时、约3.5小时至约13小时、约3.5小时至约12小时、约3.5小时至约11小时、约3.5小时至约10小时、约3.5小时至约9小时、约3.5小时至约8小时、约3.5小时至约7小时、约3.5小时至约6小时、约3.5小时至约5.5小时、约3.5小时至约5小时、约4小时至约16小时、约4小时至约15小时、约4小时至约14小时、约4小时至约13小时、约4小时至约12小时、约4小时至约11小时、约4小时至约10小时、约4小时至约9小时、约4小时至约8小时、约4小时至约7小时、约4小时至约6小时、约4小时至约5.5小时、约5小时至约16小时、约5小时至约15小时、约5小时至约14小时、约5小时至约13小时、约5小时至约12小时、约5小时至约11小时、约5小时至约10小时、约5小时至约9小时、约5小时至约8小时、约5小时至约7小时、约5小时至约6小时、约6小时至约16小时、约6小时至约15小时、约6小时至约14小时、约6小时至约13小时、约6小时至约12小时、约6小时至约11小时、约6小时至约10小时、约6小时至约9小时、约6小时至约8小时、约6小时至约7小时、约7小时至约16小时、约7小时至约15小时、约7小时至约14小时、约7小时至约13小时、约7小时至约12小时、约7小时至约11小时、约7小时至约10小时、约7小时至约9小时、约7小时至约8小时、约2小时至约24小时、约2小时至约20小时、约2小时至约18小时、约2小时至约16小时、约4小时至约24小时、约4小时至约20小时、约4小时至约18小时、约4小时至约16小时、约6小时至约24小时、约6小时至约20小时、约6小时至约18小时、约6小时至约16小时、约8小时至约24小时、约8小时至约20小时、约8小时至约18小时或约8小时至约16小时时进行测量。

在实施方案中，在用GA刺激之后或在用GA刺激时，用蛋白质合成抑制剂例如环己酰亚胺来处理LN细胞。

实施例

实施例I.测量在用醋酸格拉替雷攻击以后来自醋酸格拉替雷免疫的小鼠的淋巴结细胞中的响应生物标志物mRNA的醋酸格拉替雷效力测定的开发

开发醋酸格拉替雷(GA)的效力测定，该测定测量对来自用GA免疫的(SJL/J xBALB/C)F1小鼠品系的T细胞进行GA攻击后的响应生物标志物mRNA表达水平。从经免疫的小鼠获得的LN细胞在刺激之后早至2小时并且必定不迟于4小时显示出响应于GA刺激的细胞因子mRNA水平的大幅度提高。

测定开发

进行三个实验来评估不同的时间点、响应生物标志物mRNA、测定形式以及用于效力测定的试剂。表1示出了三个研究的实验设计，以及在每个研究中进行的免疫。

表1.用于评价在(SJL/J x BALB/C)F1小鼠品系中的响应生物标志物mRNA的免疫

GA＝醋酸格拉替雷(GMA,Mylan Pharmaceuticals,Inc.)；

CFA＝完全弗式佐剂

对于表1中汇总的三个实验中的每一个实验，通过足垫注射250μg GMA(MylanPharmaceuticals,Inc.)和CFA(Sigma Aldrich)，或甘露糖醇和CFA(作为阴性对照)对雌性(SJL/J x BALB/C)F1杂种(Jackson Laboratory)小鼠进行免疫。用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水将GA溶液稀释至5mg/mL。随后通过混合稀释的GA溶液(5mg/mL)和CFA(1：1)直到彻底乳化来制备剂量溶液。各只小鼠接受0.1mL(250μg GA)的总注射体积。在第0天对动物进行免疫。在免疫后第10天通过颈脱位法处死免疫的动物。在净化器洁净工作台上无菌移取腋区及腘区中的淋巴结，并将该淋巴结转移至含有约5mL的无菌RPMI 1640培养基的无菌培养皿内。用约5mL的RPMI培养基将LN清洗3次，并通过用注射器柱塞按压LN来分离LN细胞。将细胞悬浮液转移至无菌的50mL锥形管内，通过在约4℃下以约200x g离心10分钟在约40mL的RPMI培养基中清洗，并重悬浮于RPMI 1640培养基中用于细胞计数。将细胞悬浮液在约4℃下以约200x g离心10分钟，并重悬浮于冰冷的富集DCCM-1培养基中。将LN细胞(2.5x10⁶个细胞/cm²)接种于48孔组织培养板的孔中并用GA或对照进行刺激。

在约37℃下在潮湿的CO₂孵箱中温育指示的时间后，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,目录号74104)从经处理的细胞中分离总RNA。将细胞在RNA裂解缓冲液中裂解，转移至Qiagen旋转柱(spin column)，清洗，并用DEPC处理的水从柱中洗脱RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)(AppliedBiosystems,目录号4368814)由各个RNA样品合成cDNA。使用TaqMan通用PCR主混合物(Applied Biosystems,目录号4304437)以及靶细胞因子的特异性引物/探针和参考内部对照进行PCR反应。针对小鼠细胞因子IL-2(目录号4331182；ID Mm00434256_m1)、IL-4(目录号4331182；ID Mm00445259_m1)、IL-5(目录号4331182；ID Mm00439646_m1)、IFN-γ(目录号4331182；ID Mm01168134_m1)、IL-10(ID Mm00439614_m1)以及TNF-α(Mm00443260_g1)的引物/探针从Life Technologies获得。使用实时PCR系统(7500，Applied Biosystems)对细胞因子mRNA的表达进行定量分析。

实验1(组1A小鼠)中使用的刺激及mRNA表达结果示于表2-5中。通过以下方法计算各细胞因子的相对于对照的倍数变化：1)将小鼠细胞因子扩增子的水平相对于相同样品的GAPDH的内部探针进行归一化，以及2)将细胞因子的mRNA表达水平除以在DCCM1(培养基)对照中观察到的水平。(DCCM1来自Beit Haemek Ltd.；目录号05 010 1A)。2小时组没有进行MBP处理。(MBP来自Bachem；目录号H-1964.0001)。针对各个评估时间，研究并比较DCCM1，即2小时代表采用DCCM1进行2小时，4小时＝4小时，等等，并且用作各个时间点的代表性对照。

表2示出了在指示的刺激后2、4、6和24小时时在LN细胞中检测到的鼠IL-2mRNA水平。在这些时间点观察到，mIL-2mRNA表达相对于DCCM1阴性对照的约5.3倍至约20.8倍的增加，且最大的增加在6小时时。到24小时时，增加量已经降至低于在2小时时观察到的水平。

表2.时程研究中对mIL-2表达的评价(实验1)

缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)；GA＝醋酸格拉替雷(GMA,Mylan Pharmaceuticals,Inc.)；SD＝标准偏差；NA＝不适用(n<3)。

表3示出了在指示的刺激后2、4、6和24小时时在LN细胞中检测到的鼠IL-4mRNA水平。在这些时间点观察到，mIL-4mRNA表达相对于DCCM1对照的约10倍至约16.5倍的增加，且在刺激后6小时时观察到最大增加量。

表3.时程研究中对mIL-4表达的评价

缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)；GA＝醋酸格拉替雷(GMA,Mylan Pharmaceuticals,Inc.)；SD＝标准偏差；NA＝不适用(n<3)。

表4示出了在指示的刺激后2、4、6和24小时时在LN细胞中检测到的鼠IL-5mRNA水平。在这些时间点观察到，mIL-5mRNA表达相对于DCCM1对照的约1.6倍至约5.1倍的增加，且在刺激后6小时时观察到最大的增加。到24小时时，增加量已经降至1.9，几乎与在2小时时观察到的水平相同。

表4.时程研究中对mIL-5表达的评价

缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)；GA＝醋酸格拉替雷(GMA,Mylan Pharmaceuticals,Inc.)；SD＝标准偏差；NA＝不适用(n<3)。

表5示出了在指示的刺激后2、4、6和24小时时在LN细胞中检测到的鼠INF-γmRNA水平。在这些时间点观察到，INF-γ表达相对于DCCM1对照的约1.3倍至约4.6倍的增加。6小时后，观察到增加量的量级趋于平稳(level off)。

在时程研究中还使用从样品中分离的总RNA来测量由mIL-10和mTNF-α进行的mRNA表达的水平。结果显示在用GA刺激后LN细胞中的mRNA水平没有显著增加(数据未显示)。在刺激后6及24小时两个时间点时，用GA处理的LN细胞中的mRNA水平相对于模拟(mock)处理的对照(DCCM1)LN细胞中的mRNA水平的倍数变化为约≤1。

表5.时程研究中对INF-γ表达的评价

缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)；GA＝醋酸格拉替雷(GMA,Mylan Pharmaceuticals,Inc.)；SD＝标准偏差；NA＝不适用(n<3)。

在如用于实验1的相似条件下进行的实验2(使用组2A小鼠；关于设计参见表1)中，将46孔与98孔板形式进行比较(数据未显示)。在用GA(10μg/ml)、MBP(10μg/ml)及ConA(2.5μg/ml)刺激后4小时及6小时时，测量46-孔板形式(RNeasy Mini Kit,Qiagen)及98孔板形式(SV96总RNA分离系统(Total RNA Isolation System),Promega)中的mIL-2及mIL-4mRNA的水平，并将该水平与DCCM1对照进行比较。观察到在GA处理的样品中在4小时时的IL-2表达分别为48孔和96孔形式中的对照的IL-2表达的16.3和29.5倍，并且在6小时时的IL-2表达分别为48孔和96孔形式中的对照的IL-2表达的21.0和41.7倍。观察到在GA处理的样品中在4小时时的IL-4表达分别为48孔和96孔形式中的对照的IL-4表达的8.5和8.0倍，并且在6小时时的IL-4表达分别为48孔和96孔形式中的对照的IL-4表达的14.0和16.5倍。

在实验3(组3A和4A小鼠；关于设计参见表1)中，测量用一系列浓度的GA刺激的LN细胞中的mIL-2mRNA。表6示出了实验3的结果。该研究包括用第二GA批、Cop(克帕松，TevaPharmaceuticals USA,Inc.，发布的商业产品)刺激的样品。Cop样品组允许比较用不同GA批免疫及刺激对细胞因子产生的影响。

表6.响应于用不同浓度的GA或克帕松刺激的初级LN细胞中的mIL-2mRNA表达水平(实验3)

缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)；GA＝醋酸格拉替雷(GMA,Mylan Pharmaceuticals,Inc.)；Cop＝克帕松；SD＝标准偏差。

*动物未进行免疫

表6示出了在指示的刺激后6小时在LN细胞中检测到的mIL-2mRNA水平。如前文，通过以下方法计算相对于对照的倍数变化：1)将小鼠细胞因子扩增子的水平相对于来自相同样品的GAPDH的内部探针进行归一化，以及2)将细胞因子的mRNA表达水平除以观察到的响应于GA刺激的DCCM1对照的水平。对于实验3，使用96-孔板形式，并使用SV 96总RNA分离系统(Promega)来进行RNA分离。组3A及4A的免疫在表1中进行了描述。

图1A及1B为比较实验3中检测的mIL-2mRNA的表达水平(在表6中描述)的图。用Cop及GA(Mylan GMA)同等地刺激mIL-2mRNA。Y轴：mIL-2的线性mRNA倍数变化。X轴：log Cop及GA(Mylan GMA)浓度值。使用对数模型来进行数据集的最佳拟合。当使用所有的浓度进行回归时，GA(Mylan GMA)及Cop处理的样品的斜率值分别为6.779及5.6834。当使用5个浓度(1至15μg/mL)进行回归时，GA(Mylan GMA)及Cop处理的样品的斜率值分别为6.214及5.962。图1A及1B中的图显示当第一GA批用于免疫时，来自经处理的细胞的IL-2mRNA通过第一GA批或第二批GA的增加的浓度的刺激以剂量依赖性方式增加。

其他的实验证明来自经处理的细胞的分泌的IL-2随着第一GA批(GMA，MylanPharmaceuticals，Inc.)或第二GA批(克帕松，Teva Pharmaceuticals USA，Inc.)(数据未显示)的增加的浓度以剂量依赖性方式增加。该剂量依赖性响应对于测试和参考化合物是一致的，与使用 还是使用Mylan GMA作为免疫抗原无关。

在第二系列的实验中，评价在用10μg/mL GA刺激后四和六小时时LN细胞中的mIL-2、mIL-4、mIL-5、mIL-10和mIFN-γmRNA的表达。结果表明来自用GA免疫的小鼠的LN细胞的GA刺激引起细胞因子mRNA水平的特异性增加。实验设计示于表7中。

表7.用于评价在(SJL/J x BALB/C)F1淋巴结细胞中的响应生物标志物mRNA的免疫和刺激

NA＝不适用；GA＝醋酸格拉替雷；MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)。

组1B动物为通过足垫注射250μg GA和CFA，或甘露糖醇和CFA(作为阴性对照)免疫的雌性(SJL/J x BALB/C)F1杂种(Jackson Laboratory)小鼠。通过混合稀释的GA溶液(5mg/mL)和CFA(1：1)来制备剂量溶液。各只小鼠接受1mL的总注射体积(250μg GA)。在第0天对动物进行免疫。在免疫后第10天经由颈脱位法处死免疫的动物。移取并分离来自经免疫的小鼠的淋巴结。将LN细胞(2.5x10⁶个细胞/cm²)接种于48孔组织培养板的孔中用于GA刺激。

使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,目录号74104)从经处理的细胞中分离总RNA。将细胞在RNA裂解缓冲液中裂解，转移至Qiagen旋转柱(spin column)，清洗，并用DEPC处理的水从柱中洗脱RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems,目录号4368814)由各个RNA样品合成cDNA。使用TaqMan通用PCR主混合物(Applied Biosystems,目录号4304437)以及靶细胞因子的特异性引物/探针和参考内部对照进行PCR反应。

使用实时PCR系统(7500，Applied Biosystems)后4和6小时对细胞因子mRNA的表达进行定量分析。

表8-12示出了用于组1B小鼠的刺激(在表7中描述的)，以及获得的mRNA表达结果。通过以下方法计算各细胞因子的相对于对照的倍数变化：1)将小鼠细胞因子扩增子的水平相对于来自相同样品的18S RNA或GAPDH mRNA的内部探针进行归一化，以及2)将细胞因子的mRNA表达水平除以观察到的响应于DCCM1(培养基)对照的相对于相同的持家基因mRNA进行了归一化的水平。

表8示出了在指示的刺激后4和6小时时在LN细胞中检测到的mIL-2mRNA水平。在这些时间点，来自用GA免疫的小鼠(组1B)的GA刺激的细胞中的mIL-2mRNA水平与DCCM-1刺激的对照相比增加了至少10倍。GA刺激并不会导致在来自用甘露糖醇+CFA免疫的对照小鼠(组2B)的细胞中检测到的mIL-2mRNA的大幅度增加。此外，mIL-2mRNA的表达在ConA阳性对照细胞中大幅度增加，但在MBP阴性对照细胞中并不会增加。观察到在GA刺激的细胞中mIL-2mRNA表达在4小时时比在6小时时的增加量更大。内部对照(参考基因)为18S rRNA。

表8.响应于GA刺激的初级LN细胞中的mIL-2mRNA表达

A.刺激后4小时

B.刺激后6小时

缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)；GA＝醋酸格拉替雷；SD＝标准偏差；NA＝不适用(n<3)。

表9示出了在指示的刺激后4和6小时时在LN细胞中检测到的mIL-4mRNA水平。在这些时间点，来自用GA免疫的小鼠(组1B)的GA刺激的细胞中的mIL-4mRNA水平与DCCM-1刺激的对照相比增加了至少8倍。GA刺激并不会导致在来自用甘露糖醇+CFA免疫的对照小鼠(组2B)的细胞中检测到的mIL-4mRNA的大幅度增加。此外，mIL-4mRNA的表达在ConA阳性对照细胞中大幅度增加，但在MBP阴性对照细胞中并不会增加。内部对照(参考基因)为18S rRNA。

表9.响应于GA刺激的初级LN细胞中的mIL-4mRNA表达

A.刺激后4小时

B.刺激后6小时

缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)；GA＝醋酸格拉替雷；SD＝标准偏差；NA＝不适用(n<3)。

表10示出了在指示的刺激后4和6小时时在LN细胞中检测到的mIL-5mRNA水平。在这些时间点，来自用GA免疫的小鼠(组1B)的GA刺激的细胞中的mIL-5mRNA水平与DCCM-1刺激的对照相比增加了至少4倍。GA刺激并不会导致在来自用甘露糖醇+CFA免疫的对照小鼠(组2B)的细胞中检测到的mIL-5mRNA的大幅度增加。此外，mIL-5mRNA的表达在ConA阳性对照细胞中大幅度增加，但在MBP阴性对照细胞中并不会增加。该实验中的数据没有相对于参考基因进行归一化。

表10.响应于GA刺激的初级LN细胞中的mIL-5mRNA表达

A.刺激后4小时

B.刺激后6小时

缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)；GA＝醋酸格拉替雷；SD＝标准偏差；NA＝不适用(n<3)。

表11示出了在指示的刺激后4和6小时时在LN细胞中检测到的mIL-10mRNA水平。在这些时间点，来自用GA免疫的小鼠(组1B)的GA刺激的细胞中的mIL-10mRNA水平与DCCM-1刺激的对照相比基本没有增加。内部对照(参考基因)为GAPDH。

表11.响应于GA刺激的初级LN细胞中的mIL-10mRNA表达

A.刺激后4小时

B.刺激后6小时

缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)；GA＝醋酸格拉替雷；SD＝标准偏差；NA＝不适用(n<3)。

表12示出了在指示的刺激后4和6小时时在LN细胞中检测到的mIFN-γmRNA水平。在这些时间点，来自用GA免疫的小鼠(组1B)的GA刺激的细胞中的mIFN-γmRNA水平与DCCM-1刺激的对照相比增加了至少约2倍并且多达约7倍。GA刺激并不会导致在来自用甘露糖醇+CFA免疫的对照小鼠(组2B)的细胞中检测到的mINF-γmRNA的大幅度增加。此外，mINF-γmRNA的表达在ConA阳性对照细胞中增加，但在MBP阴性对照细胞中并不会增加。内部对照(参考基因)为GAPDH。

表12.在GA刺激后4和6小时时初级LN细胞中的mIFN-γmRNA表达

A.刺激后4小时

B.刺激后6小时

缩写：MBP＝髓磷脂碱性蛋白(阴性对照)；ConA＝伴刀豆球蛋白A(阳性对照)；GA＝醋酸格拉替雷；SD＝标准偏差；NA＝不适用(n<3)。

图2提供了表8-12中呈现的细胞因子mRNA表达的增加的汇总

实施例II.来自三个小鼠品系的T细胞用醋酸格拉替雷刺激后的细胞因子的分泌

本实施例描述了为了评估用于获得GA特异性T细胞的GA效力测定的三个额外的小鼠品系而进行的实验。平行测试了由从CD-1、BALB/cByJ及C57BL/10J小鼠中分离的GA-特异性T细胞响应于离体GA刺激而分泌九种细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α和CXCL1(也称为KC))的动力学。将通过足底注射免疫的LN细胞与通过下肢注射免疫的细胞中的细胞因子分泌进行比较。

表13示出了实验设计。

表13.试验设计：对三个小鼠品系中细胞因子分泌的评价

缩写：GA＝醋酸格拉替雷；CFA＝完全弗式佐剂(1mg/ml)。

雌性CD-1、BALB/cByJ以及C57BL/10J小鼠(每种14只，分别来自HilltopLaboratories、Jackson Laboratory以及Jackson Laboratory)如表13中指出的用GA(GMA,Mylan Pharmaceuticals,Inc.,在DPBS中制备)或甘露糖醇对照经由足底注射或下肢注射进行免疫。通过使用具有27-G，1/2英寸针的1mL注射器注射至4个足垫来免疫8周龄的动物。对于足底注射，各只小鼠接受0.1mL的总注射体积(约10μL至各个前足垫及40μL至各个后足垫)。对于下肢的皮下注射，各只小鼠接受0.1mL的总注射体积(约25μL至各个前下肢，及25μL至各个后肢踝)。

免疫后十天，经由颈脱位法处死免疫的动物。移取来自经免疫的小鼠的腋区及腘区中的淋巴结，并将该淋巴结按组集中至含有5mL冰冷的无菌RPMI-1640培养基的培养皿中。将完整的淋巴结在5.0mL冰冷的无菌RPMI 1640培养基中清洗三次。通过用无菌注射器的柱塞末端按压LN来分离LN细胞。首先使细胞悬浮液通过100μm尼龙细胞粗滤器，并随后用40mL冰冷的RPMI-1640培养基清洗一次。在4℃下以约200xg离心10分钟后，将细胞沉淀物重悬浮于40mL的RPMI-1640培养基中用于细胞计数。使用台盼蓝排除法来确定悬浮液中活细胞的细胞密度。在细胞计数后，将LN细胞在4℃下以约200x g离心10分钟，并以1.0x10⁷个细胞/mL的细胞密度重悬浮于富集DCCM-1培养基(在DCCM-1培养基中的2mM GlutaMax、1x抗生素-抗霉菌剂、55μM 2-巯基乙醇、1mM MEM丙酮酸钠溶液以及100μM MEM非必需氨基酸溶液，Beit Haemek Ltd.；目录号050101A)中。将LN细胞接种于24孔组织培养板中用于药物刺激。

用四种浓度的GA溶液(用于免疫的相同批次的Mylan GMA，0.5mL，终浓度0.5、1.0、2.5以及10μg/mL)来刺激用GA免疫的(组1、2、3、5、7以及8)各组初级LN细胞(0.5mL，5x10⁶个细胞/孔)。使用相同的程序用两个GA稀释样品(0.5和1.0μg/mL，或2.5和10μg/mL GA)来处理来自用甘露糖醇免疫的动物(组3、6和9)的各组LN细胞。

在37℃下在潮湿的5％CO₂孵箱中温育21小时后，在指定的时间点收获培养基。通过在4℃下以约200x g离心10分钟来移除细胞碎屑。在收集当天通过使用检测Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-1β、TNF-α、CXCL1)以及Th2细胞因子(IL-4、IL-5以及IL-10)的小鼠TH 1/TH 29-Plex组织培养试剂盒(Tissue Culture Kit)(Meso Scale Discovery；目录号K15013B-2，批号：K0032839)的ELISA来确定由处理的细胞分泌的细胞因子。对于IFN-γ，还使用小鼠IFN-γ组织培养试剂盒(Meso Scale Discovery；目录号K152AEB-2,Lot#K0033074)在45小时时对培养基进行分析。

制备对照样品以监测测定性能，包括用伴刀豆球蛋白A(ConA)——一种非特异性T细胞刺激物(作为阳性对照)以及髓磷脂碱性蛋白(MBP)(作为阴性对照)来刺激LN细胞。对于阳性对照，用0.5mL的ConA(5μg/mL)来处理0.5mL的LN细胞(5x10⁶个细胞/孔)。对于阴性对照，用0.5mL的MBP(20μg/mL)来处理0.5mL的LN细胞(5x10⁶个细胞/孔)。使用进行模拟刺激(富集DCCM1培养基)的LN细胞来监测细胞因子的背景水平。

对于细胞因子测定，在MULTI-SPOT或SINGLE-SPOT板中温育校正标准或样品，并使各细胞因子与其对应的捕获抗体结合。所有的测试样品都一式两份运行。使用采用MSDSULFO-TAG^TM试剂标记的细胞因子特异性检测抗体来定量各细胞因子在其不同位置上的量。通过MSD SECTOR Imager 6000捕获在各孔的各个位置上的固定的SULFO-TAG^TM标记的复合物的电化学发光信号，MSD SECTOR Imager 6000产生与测试样品中的捕获的细胞因子的量成正比的信号。使用MSD试剂盒所提供的试剂，从采用已知浓度的校正标准制作的校正曲线通过插值推导出测试样品中的细胞因子的水平。根据制造商的方案来使用试剂盒。

表14示出了由来自测试的三个小鼠品系中每个品系的GA刺激的LN细胞分泌的细胞因子。数据表示为经处理的细胞培养基与对照DCCM1培养基中细胞因子浓度的响应比。

表14.响应于对来自三个小鼠品系的LN细胞的GA刺激的细胞因子分泌

缩写：GA＝醋酸格拉替雷；CFA＝完全弗式佐剂(1mg/ml)；KC＝(CXCL1)。

如表14中所示，IL-2、IL-4、IL-5、IL-10以及IFN-γ的分泌显示对GA刺激具有特异性，并且表现出随着GA浓度的剂量依赖性增加。这些细胞因子在来自用GA免疫的动物的GA刺激的LN细胞中的水平高于其在没有刺激时相同细胞中的水平。此外，在从甘露糖醇免疫的对照动物中分离的细胞中没有观察到GA处理的细胞中细胞因子的分泌。

来自BALB/cByJ小鼠的LN细胞响应于GA刺激分泌的IL-2、IL-4、IL-5以及IL-10(组4-6)，与来自CD-1小鼠(组1-3)的LN细胞中的分泌相似或比其更高。虽然在约21小时GA刺激之后，IFN-γ分泌在CD-1LN细胞中比在BALB/cByJ细胞中更高，但在45hr GA温育后在来自这两个品系的LN细胞之间是相似的。对于来自三个小鼠品系中任一者的细胞，没有检测到GA刺激后IL-12、TNF-α和KC分泌的剂量反应。当通过足底注射预致敏细胞时，在来自BALB/cByJ与CD-1小鼠品系的LN细胞中检测到IL-1β的剂量反应。

在BALB/cByJ细胞中，IL-4以剂量依赖性方式响应于GA而分泌。在通过足底注射预致敏的细胞和通过下肢注射预致敏的细胞中对GA的响应是相似的。

在来自三个小鼠品系中每个品系的LN细胞中，IL-2以剂量依赖性方式响应于GA而分泌。在BALB/cByJ细胞中检测到最高的IL-2响应。来自通过下肢GA注射预致敏的动物的BALB/cByJ细胞显示出比通过足底注射预致敏的细胞更高的响应。在C57BL/10J小鼠中，在经由足底注射预致敏的LN细胞与通过下肢注射预致敏的细胞中，对GA刺激的IL-2响应是相似的。

在来自三个小鼠品系中每个品系的LN细胞中，IFN-γ以剂量依赖性方式响应于GA而分泌。通常，在所有的三个品系中，通过足底GA注射预致敏的细胞显示出与通过下肢注射预致敏的细胞相比相似的或更高的响应。

在BALB/cByJ细胞与CD1细胞中，IL-5以剂量依赖性方式响应于GA而分泌。IL-5对GA的响应是剂量依赖性的，且在通过足底注射预致敏的细胞中比在通过下肢注射预致敏的细胞中更高。

在BALB/cByJ细胞与CD1细胞中，IL-10以剂量依赖性方式响应于GA而分泌。IL-10对GA的响应是剂量依赖性的，且在通过足底注射预致敏的细胞中比在通过下肢注射预致敏的细胞中更高。

实施例III.测量用醋酸格拉替雷攻击以后，来自经醋酸格拉替雷免疫的CD-1、BALB/cByJ及SJL/J小鼠品系的淋巴结细胞中的响应生物标志物mRNA的醋酸格拉替雷效力测定

在本发明的GA效力测定中使用来自用GA免疫的CD-1、BALB/cByJ以及SJL/J小鼠品系(分别来自Hilltop Laboratory、Jackson Laboratory及Jackson Laboratory)的T细胞。从GA免疫的小鼠获得的LN细胞在刺激后6小时显示出响应于GA刺激的细胞因子mRNA水平的大幅度增加。

表15示出了针对三个品系中每个品系的免疫的实验设计。在第0天，用250μg GA(GMA，Mylan Pharmaceuticals,Inc.)和CFA来免疫小鼠。用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水将GA溶液(20mg/mL)稀释至5mg/mL。给药制剂由相等体积的稀释的GA溶液(5mg/mL)和CFA溶液组成，混合直到彻底乳化。将动物称重并分配至组。通过注射至4个足垫来对动物给药。每只动物的注射体积为0.1mL(约10μL至各个前足垫，以及40μL至各个后足垫)。

表15.实验设计：对三个小鼠品系中的响应生物标志物mRNA的评价

缩写：F＝雌性；GA＝醋酸格拉替雷；CFA＝完全弗式佐剂

表16示出了关于刺激来自经免疫的小鼠的LN细胞的实验设计。在免疫后第10天经由颈脱位法来对免疫的动物施以安乐死。从动物中分离淋巴结细胞并将该淋巴结细胞如表16所示采用髓磷脂碱性蛋白(MBP，阴性对照)、伴刀豆球蛋白A(ConA，阳性对照)或GA进行处理。在净化器洁净工作台上无菌移取腋区及腘区中的淋巴结。将淋巴结转移至含有约5mL的无菌RPMI 1640培养基的无菌培养皿内。随后用约5mL的RPMI培养基将LN清洗3次，并通过用注射器柱塞按压LN来分离LN细胞。将细胞悬浮液转移至无菌的50mL锥形管内，并通过在约4℃下以约200x g离心10分钟在约40mL的RPMI培养基中清洗，并重悬浮于RPMI 1640培养基中用于细胞计数。将细胞悬浮液在约4℃下以约200x g离心10分钟，并重悬浮于冰冷的富集DCCM-1培养基中。将细胞接种于96孔组织培养板中。

表16.刺激：对来自三个小鼠品系的LN细胞中的响应生物标志物mRNA的评价

用如在表16和17中指示的浓度下的GA(GMA,Mylan Pharmaceuticals,Inc.)刺激从GA免疫的动物中分离的LN细胞。通过用2.5μg/mL伴刀豆球蛋白A(ConA，一种非特异性T细胞刺激物)处理LN细胞来制备阳性对照。髓磷脂碱性蛋白(MBP，10μg/mL)和富集的DCCM-1培养基用作阴性对照。分别用相同的GA批来刺激所有组的细胞。一式三份开始各反应。

在约37℃下在潮湿的CO₂孵箱中温育6小时后，将细胞裂解用于总RNA分离。根据制造商的方案(Promega,目录号Z3500)使用SV 96总RNA分离系统从经处理的LN细胞中分离总RNA。将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗一次，并在RNA裂解缓冲液中裂解。将裂解物转移至SV 96结合板的孔中。将样品用RNA清洗溶液进行清洗并用DNA酶(DNase)进行处理。用无核酸酶的水从结合板洗脱总RNA。

根据制造商的方案(Life Technologies)使用高容量cDNA逆转录试剂盒(LifeTechnologies，以前为Applied Biosystems,目录号4368814)，由各个RNA样品一式三份合成cDNA。通过热循环仪(2720，Life Technologies)如下进行逆转录(RT)：

步骤1 步骤2 步骤3 步骤4

温度(℃) 25 37 85 4

时间(min) 10 120 5 ∞

在逆转录酶反应完成之后，将cDNA样品直接用于实时PCR以测量由刺激的细胞产生的响应生物标志物mRNA水平。为了测量响应生物标志物mRNA水平，使用从LifeTechnologies获得的TaqMan通用PCR主混合物(目录号4304437)以及针对小鼠细胞因子IL-2(目录号4331182；ID Mm00434256_m1)、IL-4(目录号4331182；ID Mm00445259_m1)、IL-5(目录号4331182；ID Mm00439646_m1)、IL-10(目录号4331182；ID Mm00439614_m1)、IL-13(目录号4331182；ID Mm00434204_m1)、IFN-γ(目录号4331182；ID Mm01168134_m1)和TNF-α(目录号4331182；ID Mm00443260_g1)的引物/探针。参考基因(内部对照)小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,目录号4352339E)也从Life Technologies获得。针对靶基因的全部探针均含有FAM染料，并且针对内部对照的探针含有染料。制备样品并使用实时PCR系统(7500,Life Technologies)在96孔板中运行样品。该系统通过持续测量PCR反应期间荧光发射的增加而允许直接检测PCR产物形成。使用相对定量方法来分析GA处理的样品中小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ和TNF-α表达相对于未处理的对照(富集DCCM-1处理的)样品的变化。实时PCR程序为：

UNG温育 AmpliTag Gold活化 40个循环

温度(℃) 50 95 95 60

时间 2min 10min 15sec 1min

将小鼠细胞因子扩增子(IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、mIFN-γ和TNF-α)的水平相对于来自相同样品的内部探针水平(GAPDH)进行归一化。使用下列方程式来计算与对照样品相比响应于GA刺激的相对增加：

ΔC_T＝C_{T_靶标}-C_{T_参考}

ΔΔC_T＝ΔC_{T_处理的}-C_{T_VC}

其中

靶标＝小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ和TNF-α

参考＝GAPDH

处理＝用GA、ConA或MBP刺激

VC(载体对照)＝与富集的DCCM-1温育

平均值的计算：

标准偏差：

其中X＝单独数据，并且n＝数据点的数目。

变异系数(CV，精确度)：

结果汇总于表17中。

表17.响应于对来自三个小鼠品系的LN细胞的GA刺激产生的响应生物标志物mRNA

表17中的数据绘制在图3至13中。对于来自所有三个小鼠品系的LN细胞中的许多响应生物标志物mRNA，观察到GA刺激浓度对mRNA水平的剂量依赖性效应。

实施例IV.验证用于定量测量在来自用GA免疫的小鼠的淋巴结细胞中用GA刺激后的细胞因子mRNA水平的实时聚合酶链反应(PCR)方法

验证实时聚合酶链反应(PCR)方法，用于定量测量GA刺激后SJL/J小鼠淋巴结细胞中的细胞因子mRNA水平。

使用一个批次的GA(Mylan GMA)来进行三个实验。通过与6种浓度(0.3至20μg/mL)的GA于37℃温育6小时来刺激初级LN细胞。从用GA或对照刺激的LN细胞中分离总RNA。由RNA合成cDNA，并通过实时PCR方法来定量测量七种小鼠细胞因子，IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、干扰素(IFN)-γ以及肿瘤坏死因子(TNF)-α的mRNA水平。

在响应GA刺激的来自GA免疫的小鼠的LN细胞中，诱导五种细胞因子，IL-2、IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的mRNA水平。mRNA水平以剂量依赖性方式增加。ConA刺激(阳性对照)后IL-2的mRNA水平的增加超过由最高浓度的GA(20μg/mL)刺激诱导的增加。阴性对照MBP没有显著诱导细胞因子mRNA水平。NTC(无模板对照)样品的扩增在可检测水平以下。表18示出了实验设计。

表18.实验设计概要

通过使用具有27-G，1/2英寸针的1mL注射器注射至4个足垫来免疫8-9周龄的雌性SJL/J小鼠。各只小鼠接受总注射体积0.1mL的在CFA中乳化的GMA(约10μL至各个前足垫及40μL至各个后足垫)。在第0天对动物进行免疫。在注射之后，将动物放回其笼子内并且每个笼子容纳≤6只动物。

在免疫后第10天经由颈脱位法处死免疫的动物。移取来自经免疫的小鼠的腋区及腘区中的淋巴结，将该淋巴结集中并放置于含有5mL冰冷的无菌RPMI-1640培养基的无菌培养皿中。将完整的淋巴结在5.0mL的无菌RPMI 1640培养基中清洗三次，并通过用无菌注射器柱塞按压LN来分离LN细胞。首先使细胞悬浮液通过100μm尼龙细胞粗滤器，并随后用40mL的冷RPMI-1640培养基清洗一次。在4℃下以约200x g离心10分钟后，将细胞沉淀物重悬浮于40mL的RPMI-1640培养基中以进行第二次清洗。在4℃下以约200x g离心10分钟后，将细胞沉淀物重悬浮于40mL的DCCM-1培养基中用于细胞计数。使用台盼蓝排除法来确定悬浮液中活细胞的细胞密度。在细胞计数后，将LN细胞以7.5x10⁶个细胞/mL的密度悬浮于富集DCCM-1培养基中。将LN细胞(0.12mL)接种于96孔组织培养板中的各个孔中。

使用富集的DCCM-1培养基作为稀释剂来制备GA(Mylan GMA)的稀释液。将GA稀释液(0.12mL)添加至96孔组织培养板的指定孔中。将从免疫的动物中分离的相同体积的LN细胞(0.12mL)添加至指定的孔中。在相同的测定中，始终通过分别用2.5μg/mL ConA和10μg/mL MBP处理LN细胞来进行阳性对照和阴性对照。使用采用模拟刺激方案(富集的DCCM-1培养基)的LN细胞来监测细胞因子的背景mRNA水平。表19中汇总了使用Mylan GA的刺激。将板在37℃下在潮湿的5％CO₂孵箱中温育6hr。

表19.从免疫的动物中分离的LN细胞的GA刺激

在温育时间结束时，通过抽吸去除来自刺激的细胞的培养基，并使用Qiagen或Promega裂解缓冲液裂解细胞。将裂解物转移至RNeasy Mini column(Qiagen)或SV 96结合板(Promega)的孔中用于RNA分离和cDNA合成。所有的测试样品均一式三份运行。

使用SV 96总RNA分离系统(Promega；目录号Z3505)进行总RNA分离。根据每个制造商的方案来进行测定程序。RNA样品储存于-70℃下直至使用。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Qiagen；目录号4368814)来合成cDNA。根据制造商的方案来进行测定程序。

使用的小鼠细胞因子引物/探针为对于IL-2(目录号4331182；ID Mm00434256_m1)、IL-4(目录号4331182；ID Mm00445259_m1)、IL-5(目录号4331182；ID Mm00439646_m1)、IL-10(目录号4331182；ID Mm00439614_m1)、IL-13(目录号4331182；ID Mm00434204_m1)、IFN-γ(目录号4331182；ID Mm01168134_m1)和TNF-α(目录号4331182；IDMm00443260_g1)。参考基因引物/探针为对于小鼠GAPDH(LifeTechnologies目录号4352339E)。

使用多通道移液管(multiple channel pipette)将cDNA样品移至含有TaqMan通用PCR主混合物(LifeTechnologies目录号4304437)以及靶基因引物和探针的指定的孔内。将板在4℃下以2000rpm离心2分钟，以使内容物旋降(spin down)并消除气泡。制备样品并根据制造商的建议使用Life Technologies实时PCR系统(以前为Applied Biosystems；型号7500)在96孔板中运行样品。使用参考基因引物以相同的方式制备参考基因的混和物。

使用相对定量方法来使用下列程序分析GA处理的样品中的mIL-2、mIL-4、mIL-5、mIL-10、mIL-13、mIFN-γ和TNF-α表达相对于未处理的对照(富集DCCM-1处理的)样品的变化：

UNG温育 AmpliTag Gold活化 43个循环

温度(℃) 50 95 95 60

时间 2min 10min 15sec 1min

将小鼠细胞因子扩增子的水平相对于相同样品的内部探针水平(GAPDH)进行归一化。使用下列方程式来计算与对照样品(富集的DCCM1样品)相比响应于GA刺激的相对增加：

C_{T_靶标}和C_{T_参考}的平均值的计算：

其中，靶标：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ和TNF-α

参考：GAPDH

各平均C_T值的标准偏差的计算：

其中SD_#＝C_{T_靶标}或C_{T_参考}的SD，X＝单独数据，且n＝数据点的数目。

从平均C_T值计算△C_T值：

△C_T＝C_{T_靶标}-C_{T_参考}

ΔC_T值的标准偏差的计算：

SD_△CT＝(SD² _靶标+SD² _参考)^1/2

其中，Y^1/2为Y的平方根，且Y＝SD² _靶标+SD² _参考

△△C_T值的计算：

△△C_T＝△C_{T_处理的}-C_{T_VC}

其中，处理的：与GA、ConA或MBP温育

VC(载体对照)：与DCCM-1温育

△△C_T值的标准偏差的计算：

△△C_T值的标准偏差与△C_T值的标准偏差相同。

诱导倍数与诱导范围的计算：

诱导范围＝2^-A至2^-B

其中A＝ΔΔC_T+SD_ΔΔCT且B＝ΔΔC_T-SD_ΔΔCT

除非说明，否则使用全浮点计算(full floating decimal point calculation)在MicrosoftVersion 2007电子数据表中进行计算(平均值、SD和相关的计算)。表中的一些数字四舍五入用于显示。根据这些计算，使用与平均值差异百分比方法(PercentDifference from the Mean Method)来确定异常值。通过从各重复C_T值减去平均C_T值并随后除以平均C_T值并乘以100，来计算与平均值的差异百分比。当百分比≥4.0％(绝对值)时，该重复为异常值。当两个重复的百分比≥4.0％且第三个重复的差异百分比≥0.5％时，指定最大的绝对值为异常值。当两个重复的百分比≥4.0％且第三个重复的百分比<0.5％时，所有值均用于计算。

表20中示出了在分析运行中完成的样品分析。

表20.PCR运行

P：通过，F：失败

^a：失败：由于阴性对照MBP没有通过接受标准。

^b：失败：由于阳性对照ConA没有通过接受标准。

^c：因先前失败的PCR运行而重复PCR运行。

产生小鼠IL-2、IL-4以及参考基因GAPDH的代表性扩增图。通过7500软件v2.0.6在扩增曲线的指数期中自动设置各阈值。

在模拟刺激的LN细胞(与DCCM-1温育)中检测到所有测试的细胞因子的低水平的mRNA表达。与DCCM-1对照相比用GA处理的LN细胞中IL-2、IL-4、IL-5、IL-13以及IFN-γ的mRNA水平增加，并且增加是剂量依赖性且可饱和的。在SJL/J小鼠中IL-10和TNF-α的mRNA水平响应于体外GA刺激被微弱地诱导或不被诱导。

小鼠IL-2mRNA表达

在所有三个实验中在用GA刺激的LN细胞中诱导小鼠IL-2mRNA。在实验1、2及3中，用20μg/mL GA刺激后的IL-2mRNA的诱导分别为31.7、27.8以及42.0倍(表21)。

表21.由响应于GA刺激的初级LN细胞进行的小鼠IL-2的表达

(实时PCR运行G1R1_011613_P2、G2R1_012113_P2、G3R1_012313_P2)

小鼠IL-4mRNA表达

在所有三个实验中在用GA刺激的LN细胞中诱导小鼠IL-4mRNA。在实验1、2及3中，用20μg/mL GA刺激后的IL-4mRNA的诱导分别为41.3、11.8以及27.6倍(表22)。

表22.由响应于GA刺激的初级LN细胞进行的小鼠IL-4的表达

(实时PCR运行G1R1_011613_P2、G2R1_012113_P2、G3R1_012313_P2)

小鼠IL-5mRNA表达

在所有三个实验中在用GA刺激的LN细胞中诱导小鼠IL-5mRNA。在实验1、2及3中，用20μg/mL GA刺激后，分别观察到IL-5mRNA的5.2、5.3和15.2倍的诱导(表23)。

表23.由响应于GA刺激的初级LN细胞进行的小鼠IL-5的表达

(实时PCR运行G1R2_011713_P2、G2R3_012213_P2、G3R3_012313_P2)

小鼠IL-10mRNA表达

与模拟刺激的对照相比，在任何实验中在响应于GA刺激的LN细胞中均没有观察到小鼠IL-10mRNA的诱导(表24)。

表24.来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-10的表达

(实时PCR运行G1R2_011713_P2、G2R3_012213_P2、G3R3_012313_P2)

小鼠IL-13mRNA表达

在所有三个实验中在用GA刺激的LN细胞中诱导小鼠IL-13mRNA。对于实验1、2及3，用20μg/mL刺激后的IL-13mRNA的诱导分别为17.6、21.3和33.9倍(表25)。

表25.来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-13的表达

(实时PCR运行G1R3_011713_P1、G2R2_012113_P1、G3R2_012313_P1)

小鼠IFN-γmRNA表达

在响应于体外GA刺激的LN细胞中观察到IFN-γmRNA的弱诱导。来自三个实验的LN细胞显示出响应于GA刺激的相似模式。用2.5至10μg/mL GA刺激后，IFN-γmRNA的诱导达到≥2倍。然而，在所有三个实验中，在用20μg/mL GA刺激后，IFN-γmRNA的表达水平下降至与用0.3μg/mL GA刺激刺激后观察到的水平相似的水平(表26)。

表26.来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IFN-γ的表达

(实时PCR运行G1R3_011713_P1、G2R2_012113_P1、G3R2_012313_P1)

小鼠TNF-αmRNA表达

与模拟刺激的对照相比，在用GA刺激后在LN细胞中没有观察到TNF-αmRNA的诱导(全部<2倍)(表27)。

表27.来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠TNF-α的表达

(实时PCR运行G1R4_011813_P1、G2R4_012213_P1、G3R4_012313_P1)

因此，在响应于GA刺激的LN细胞中诱导七种细胞因子中的五种细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-13以及IFN-γ的mRNA水平。IL-10和TNF-αmRNA的表达没有显著地变化。对于所有的PCR运行，NTC(无模板对照)样品的扩增均低于可检测水平。测试所有组的LN细胞对ConA和MBP的响应。除了IL-10mRNA(实验1，表24)和TNF-α(实验3，表27)外，来自ConA处理的LN细胞(2.5μg/mL)的所有细胞因子mRNA的表达水平均大于用最高浓度(20μg/mL)的GA刺激后的表达水平。在所有的PCR运行中，除了IL-4(实验1，表22)和IL-5(实验3，表23)外，响应于MBP处理的细胞因子mRNA的表达水平均≤2倍。重复三个PCR运行(ConA针对IL-10，且MBP针对IL-4和IL-5)，并且无论响应于ConA处理还是MBP处理，都获得了与原始运行的结果相比相似的结果(数据未显示)，表明结果和测定是一致的。该研究的结果显示出独特的细胞因子诱导谱(可诱导的与不可诱导的)，以及三个独立实验的测试的细胞因子的一致的诱导量级(轻微的至显著的)，表明实时PCR方法为用于GA免疫小鼠的LN细胞在GA刺激后的细胞因子mRNA水平的定量测量的可再现的方法。

结论

验证高度灵敏的定量实时PCR方法用于分析(profiling)和定量GA免疫小鼠的LN细胞在体外GA刺激后的细胞因子mRNA。通过使用GAPDH作为持家基因的比较性C_T方法来进行相对定量分析。用不同浓度的GA刺激GA免疫小鼠的LN细胞，与未刺激的LN细胞中的那些相比，导致对IL-10、TNF-α没有诱导，对IFN-γ的微弱诱导，对IL-5的中等诱导，以及对IL-2、IL-4以及IL-13mRNA水平的稳健(robust)诱导。该结果表明该方法对于测量响应于GA刺激的LN细胞中细胞因子mRNA表达为灵敏的、可再现的且有效的。

实施例V.使用实时聚合酶链反应来定量测量用测试GA批和参考GA批刺激后小鼠淋巴结细胞中的细胞因子mRNA水平

使用实时聚合酶链反应方法来测量来自GA免疫的SJL/J小鼠的GA刺激的LN细胞的细胞因子mRNA的表达。测试了以两种不同的持家基因，即GAPDH和β-肌动蛋白，对表达进行的归一化。

通过将总剂量250μg的一个GA批或甘露糖醇以及零剂量的GA注射至全部4个足垫来对由六只雌性SJL/J小鼠组成的各组进行免疫。使用三个克帕松批次(batch)以及三个GMA批次来免疫小鼠。GA和甘露糖醇免疫均包括CFA。在免疫后10天，从免疫的小鼠中分离的LN细胞样品分别用一定浓度的克帕松批和GMA批来进行刺激。各组中包括2.5μg/mL ConA处理的LN细胞的阳性对照以及10μg/mL MBP处理的细胞的阴性对照。

在初始的运行中，当细胞因子mRNA水平相对于GAPDH mRNA水平进行归一化时，观察到缺乏再现性。因而，对样品重复Q-PCR分析，来测量IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13的水平，并使用GAPDH和β-肌动蛋白二者作为参考基因。表28中示出了重复运行的实验设计。

表28.实验设计概要(GAPDH和Act-β归一化)

RNA分离及分析程序与实施例IV中所述的那些相似。观察到的小鼠IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13mRNA的表达水平汇总于以下的表29至表36中。如由表30、32、34以及36中的数据所显示的，当除IL-13外的所有细胞因子的细胞因子mRNA水平相对于GAPDH mRNA进行归一化时，再次观察到研究结果中缺乏再现性。然而，当使用β-肌动蛋白作为参考持家基因时，针对分析的各种细胞因子mRNA观察到由COP和GMA引起的相当的刺激。

表29.来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-2的表达(相对于Actβ进行归一化)

表30：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-2的表达(相对于GAPDH进行归一化)

表31：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-4的表达(相对于Actβ进行归一化)

表32：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-4的表达(相对于GAPDH进行归一化)

表33：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-5的表达(相对于Actβ进行归一化)

表34：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-5的表达(相对于GAPDH进行归一化)

表35：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-13的表达(相对于Actβ进行归一化)

表36：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-13的表达(相对于GAPDH进行归一化)

结论

当使用从用克帕松或GMA免疫的小鼠中获得的淋巴结细胞来比较克帕松批与GMA批时，观察到使用β-肌动蛋白作为持家基因导致多种细胞因子mRNA的可再现表达。在这些实验中，用克帕松或GMA刺激从克帕松或GMA免疫的动物中获得的小鼠淋巴结细胞导致相当水平的IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13mRNA。

实施例VI.使用以伴刀豆球蛋白A刺激的小鼠脾细胞评价用于实时聚合酶链反应方法的参考基因

为了评价用于实时PCR数据的归一化的参考基因，在采用不同浓度的伴刀豆球蛋白A(ConA)——一种非特异性T细胞刺激物处理的CD-1小鼠脾细胞中，研究八种参考基因，即β-肌动蛋白、Atp5b、B2m、Cyc1、Hprt、Gapdh、Ppia和Rp113a的mRNA表达谱。使用NormFinder程序分析数据，并根据其稳定性将参考基因分等级。

测试的八种参考基因列于表37中，且用于扩增和检测的引物/探针示于表38中。

表37：测试的参考基因

表38：引物/探针特性

通过用5.0mL的无菌1X DPBS重建5mg冻干粉末来制备1mg/mL ConA储备溶液(ConA-SS1)。通过将40μL的ConA-SS1(1mg/mL)添加至1.96mL的DMEM-10培养基中来将ConA-SS1溶液进一步稀释成20μg/mL(ConA-SS2)。制备不同浓度的ConA稀释样品。对于96孔组织培养板，在具有120μL的脾细胞的孔中添加120μL的各个ConA样品。

从四只雌性CD-1小鼠(8周龄)中获得脾细胞，并将脾细胞悬浮于组织培养基DMEM-10中。使用台盼蓝排除法来确定悬浮液中活细胞的细胞密度。在细胞计数之后，在DMEM-10培养基中以7.5x10⁶个细胞/mL的密度制备脾细胞悬浮液。将ConA稀释样品(0.12mL)添加至96孔组织培养板的指定孔中。将相同体积的制备的脾细胞(0.12mL)添加至指定的孔中。使用模拟刺激(DMEM-10培养基)的脾细胞来监测各基因的背景mRNA水平。表39中汇总了采用ConA的刺激。将板在37℃下在潮湿的5％CO₂孵箱中温育6hr。

表39.从CD-1小鼠中分离的脾细胞的ConA刺激

根据研究方法XBL 12094 M01[1]，在刺激后6小时从ConA处理的脾细胞中分离总RNA。简言之，在温育时间结束时，将处理的脾细胞用PBS清洗并用RNA裂解缓冲液裂解。将裂解物转移至96孔结合板，并使用SV 96总RNA分离系统(Promega；目录号Z3505)来分离总RNA。将样品用RNA清洗溶液清洗并用DNA酶溶液进行处理。在DNA酶活性停止以及再次用RNA清洗溶液清洗样品后，通过真空歧管系统用无核酸酶的水将RNA样品洗脱至96孔板。RNA样品储存于约-70℃下。

如先前针对PHA 040-036和PHA 040-037描述的，由总RNA合成cDNA。简言之，制备高容量cDNA逆转录主混合物(High Capacity cDNA Reverse Transcription master mix)并将其分配至96孔板的指定孔。将RNA样品转移至各个孔。根据表40中的程序通过热循环仪(2720，Applied Biosystems)来进行逆转录。

表40.逆转录程序

在完成逆转录反应之后，将cDNA样品直接用于实时PCR或储存于约-20℃下。

使用各参考基因的特异性引物/探针来进行实时PCR。简言之，通过混合TaqMan通用PCR主混合物(目录号4304437)、cDNA样品和特异性参考基因的引物/探针来制备PCR样品。使用实时PCR系统(7500，Applied Biosystems)来执行样品板。实时PCR的程序汇总于表41中。

表41.RT-PCR程序

NormFinder Excel宏处理以线性标度提供的数据。因而，初始将C_T值转变成线性标度。确定在全部样品中在参考基因内的最低的样品C_T值，并将其任意设定为1.0。使用下列方程式来计算所有其他样品的相对量(RQ)：

按照分子诊断实验室网站(Molecular Diagnostic Laboratory Website)的说明，以NormFinder分析处理数据。

结果与讨论

通过实时PCR来评价全部八种参考基因的表达水平并将值直接报告为循环阈值(C_T)。C_T定义为对于达到检测的特定阈值水平的荧光所需要的循环数，并与样品中存在的初始RNA模板的量逆相关。

根据对ConA刺激响应的脾细胞中的表达水平，可以将这些参考基因划分成丰富类(ActB，具有22.8的平均C_T值)、中等丰富类(Atp5b、B2m、GAPDH、Ppia和Rpl13a)以及低丰富类(Cyc1和Hprt，具有>29的平均C_T值)(表42)。

表42.C_T汇总表

基因名	平均值(C<sub>T</sub>)	最小值(C<sub>T</sub>)	最大值(C<sub>T</sub>)
				ActB	22.8	20.8	24.6
Atp5b	26.7	24.0	29.3
				B2m	25.4	23.3	27.0
Cyc1	29.1	26.6	31.9
				Hprt	31.6	29.1	34.7
Gapdh	26.8	25.3	28.9
				Ppia	26.4	23.4	30.3
Rp113a	26.0	24.1	28.2

对于各参考基因，与DMEM-10对照相比，用低浓度的ConA(0.03至0.1μg/mL)处理的样品的C_T值保持相对恒定。C_T值显示随ConA浓度增加(0.3至3μg/mL)而减少。对于响应于ConA刺激的所有参考基因均观察到该模式。对于用1和3μg/mL的ConA处理的样品中的GAPDH基因，C_T值的减少略微较小。结果表明在用>0.3μg/mL的浓度的ConA处理的样品中，参考基因的表达可能被上调。

结论

对数据进行分析表明使用两种持家基因(即，在所有先前实验中使用的GAPDH，以及似乎相当稳定的β-肌动蛋白)，是归一化数据的合理选择。

实施例VII.使用实时聚合酶链反应方法定量测量在三个相同的实验中在醋酸格拉替雷刺激后小鼠淋巴结细胞中的细胞因子的mRNA水平

使用实时聚合酶链反应方法来测量来自GA免疫小鼠的GA刺激的LN细胞中的IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13mRNA的表达。进行三个相同的实验。在各个实验中，用GA来免疫小鼠，并使用六种浓度中的每种浓度的用于免疫的相同批次(batch)的GA刺激各组小鼠的LN细胞。使用GAPDH和β-肌动蛋白作为参考基因。

实验设计在表43中示出。三组中的各组由约8-12周龄的四只雌性CSJLF1/JRj(Janvier Labs)小鼠组成。在第0天，通过将0.1mL注射体积注射至4个足垫(约10μL至各个前足垫，40μL至各个后足垫)来免疫小鼠。免疫包含总剂量250μg的一个GA批(克帕松批次P53974)+CFA(0.5mg/mL)。在免疫后第10天，从动物中分离淋巴细胞，并用富集的DCCM-1(模拟刺激的载体对照)、2.5μg/mL伴刀豆球蛋白A(ConA，阳性对照)或GA来刺激淋巴细胞。

在免疫后10天，将从免疫小鼠中分离的LN细胞样品分别用如表43中所示的0.3、1、2.5、5、10或20μg/mL的克帕松批次P53974进行刺激。

表43：实验设计概要

根据制造商的方案(Promega,目录号Z3500)使用SV 96总RNA分离系统从在约37℃下在潮湿的CO₂孵箱中温育6小时后的经刺激的LN细胞中分离总RNA。根据制造商的方案使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies，以前为Applied Biosystems)一式三份由各个RNA样品合成cDNA。使用下列程序用热循环仪(2720，Life Technologies)来进行逆转录：

以下的表44中列出了针对细胞因子和持家基因的小鼠引物/探针(LifeTechnologies)。

表44.小鼠引物/探针

引物	测试基因	Life Technologies ID
			肌动蛋白,β(Actβ)	参考基因	Mm00607939_s1
GAPDH	参考基因	Mm99999915_g1
			细胞因子IL-2	靶基因	Mm00434256_m1
细胞因子IL-4	靶基因	Mm00445259_m1
			细胞因子IL-5	靶基因	Mm00439646_m1
细胞因子IL-13	靶基因	Mm00434204_m1

使用TaqMan通用PCR主混合物II(Life Technologies)制备样品，并使用下列实时PCR程序利用实时PCR系统(7500，Life Technologies)在96孔板中运行样品：

使用如先前所述的标准△△C_T方法来计算细胞因子mRNA的水平。观察到的小鼠IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13mRNA的表达水平汇总于以下的表45至48中。以GAPDH与β-肌动蛋白基因表达归一化后的细胞因子mRNA水平的倍数增加是相当的。

表45：来自响应于GA刺激的LN细胞的mIL-2的表达

表46：来自响应于GA刺激的LN细胞的mIL-4的表达

表47：来自响应于GA刺激的LN细胞的mIL-5的表达

表48：来自响应于GA刺激的LN细胞的mIL-13的表达

表49中汇总了用最高的GA刺激浓度(20μg/mL)刺激的样品的三个组的mRNA水平的诱导倍数。

表49：在20μg/mL GA刺激下细胞因子mRNA诱导的比较

结论

在用GA刺激的GA免疫小鼠LN细胞中测量从GA免疫的小鼠中分离的淋巴结(LN)细胞中的小鼠IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13的表达水平。在以GAPDH和β-肌动蛋白基因表达归一化后的细胞因子mRNA水平的倍数增加是相当的。此外，在从用GA免疫的小鼠中分离的LN细胞中小鼠细胞因子IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13的mRNA表达水平响应于GA刺激而增加，且这些增加是剂量依赖性的。

IL-2mRNA的测量显示出最大的变异性，而在这些实验中对响应于GA刺激的IL-4、IL-5及IL-13mRNA的检测的再现性更好。这些结果表明对在来自GA免疫小鼠的LN细胞中的GA刺激的IL-4、IL-5或IL-13mRNA的测量，可能会提供比IL-2mRNA的测量再现性更好且更可靠的评估方法。

实施例VIII.使用实时聚合酶链反应方法比较用十二批GA刺激后的小鼠LN细胞中的细胞因子mRNA表达

使用实时聚合酶链反应方法来测量，在用十二批GA中的一批刺激后来自GA免疫小鼠的LN细胞中的IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13mRNA的表达。一批GA(克帕松P53974)用于免疫。用于刺激的GA批包括八个克帕松批(P53974、X06511、X06841、X06861、X06941、X06741、X06901、P63020)，以及四个GMA批(GMA/0.02/001/13、GMA/0.02/002/13、GMA/0.02/003/13以及GMA/R&D/026/11)。

实验设计在表50中示出。在第0天通过将0.1mL注射体积注射至4个足垫(约10μL至各个前足垫，40μL至各个后足垫)，来免疫二十只约8-12周龄的雌性CSJLF1/JRj小鼠(Janvier Labs)。免疫含有总剂量为250μg的一批GA(克帕松批次P53974)+CFA(0.5mg/mL)。在免疫后第10天，从动物中分离出淋巴细胞，并用如表50中所示的富集DCCM-1(模拟刺激的载体对照)、2.5μg/mL伴刀豆球蛋白A(ConA，阳性对照)或0.3、1、2.5、5、10或20μg/mL的克帕松批次P53974来刺激淋巴细胞。

表50：实验设计概要

根据制造商的方案(Promega，目录号Z3500)使用SV 96总RNA分离系统，从经刺激的LN细胞中分离出总RNA。根据制造商的方案使用高容量cDNA逆转录试剂盒(LifeTechnologies，以前为Applied Biosystems)一式三份由各个RNA样品合成cDNA。使用下列程序通过热循环仪(2720，Life Technologies)来进行逆转录：

所使用的针对细胞因子以及持家基因的小鼠引物/探针来自Life Technologies：β-肌动蛋白(参考基因，目录号Mm00607939_s1)、GAPDH(参考基因，目录号Mm99999915_g1)、IL-2(靶基因，目录号Mm00434256_m1)、IL-4(靶基因，目录号Mm00445259_m1)、IL-5(靶基因，Mm00439646_m1)、IL-13(靶基因，Mm00434204_m1)、IL-17以及CD25)。

使用TaqMan通用PCR主混合物II(Life Technologies)制备样品，并利用实时PCR系统(7500，Life Technologies)使用下列RT-PCR程序在96孔板中运行样品：

使用如先前所述的标准△△C_T方法来计算细胞因子mRNA的水平。在以下的表51至表71中汇总了观察到的小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和CD25mRNA的表达水平。

观察到用克帕松批C1至C8刺激的样品中的IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13的表达水平之间的变异。观察到的Mylan批M1、M2和M3之间的变异不大于观察到的克帕松之间的变异。然而，用GMA批M4(变更批GMA/R&D/026/11，通过在合成的前五分钟抑制酪氨酸制造)刺激的LN细胞显示出显著更低的细胞因子表达水平，以及不同的诱导模式(表57、61、65、67和69)。

在用四个克帕松批和四个Mylan GA批刺激的LN细胞中IL-17显示出浓度依赖性诱导(表68和69)。在刺激后6小时所取得的样品中观察到CD25(IL-2ra)mRNA的刺激，但量值较小且明显无剂量反应。(表70和71)。以β-肌动蛋白归一化的细胞因子mRNA的表达水平显示出比以GAPDH归一化的细胞因子mRNA的表达水平更小的变异性。

表51：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-2的表达(板1:C1-C3)

表52：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-2的表达(板2:C4-C6)

表53：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-2的表达(板3:C7-C8)

表54：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-4的表达(板1:C1-C3)

表55：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-4的表达(板2:C4-C6)

表56：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-4的表达(板3:C7-C8)

表57：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-4的表达(板1-3:M1-M4)

表58：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-5的表达(板1:C1-C3)

表59：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-5的表达(板2:C4-C6)

表60：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-5的表达(板3:C7-C8)

表61：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-5的表达(板1-3:M1-M4)

表62：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-13的表达(板1:C1-C3)

表63：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-13的表达(板2:C4-C6)

表64：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-13的表达(板3:C7-C8)

表65：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-13的表达(板1-3:M1-M4)

表66：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-2的表达(板1-2：C3、C6、M1、M2)

表67：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-2的表达(板3：C7-C8、M3-M4)

表68：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-17的表达(板1-2：C3、C6、M1、M2)

表69：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠IL-17的表达(板3：C7-C8、M3-M4)

表70：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠CD25的表达(板1-2：C3、C6、M1、M2)

表71：来自响应于GA刺激的初级LN细胞的小鼠CD25的表达(板3：C7-C8、M3-M4)

结论

在体外GA刺激的GA免疫小鼠LN细胞中测量从GA免疫小鼠中分离的淋巴结(LN)细胞中的鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和CD25的表达水平。使用十二个不同的GA批进行刺激，包括变更的GMA生产批次。观察到用批C1至C8刺激的样品中的IL-2、IL-4、IL-5和IL-13的表达水平间的变异。观察到的Mylan批M1、M2和M3之间的变异在观察到的批之间的变异的量值内。用GMA批M4(变更批GMA/R&D/026/11，通过在合成的前五分钟抑制酪氨酸制造)刺激的LN细胞显示出显著更低的细胞因子表达水平，以及不同的诱导模式。在用四个批和四个Mylan GA批刺激的LN细胞中，IL-17显示出浓度依赖性诱导。

实施例IX.通过测量用醋酸格拉替雷攻击以后，来自GA免疫的CSJLF1/JRj小鼠的T细胞中的一组响应生物标志物mRNA，来确定醋酸格拉替雷测试批的效力

如实施例III中所述，将CSJLF1/JRj小鼠分别用250μg的GA参考标准批(克帕松，Teva Pharmaceuticals USA,Inc.)进行免疫。在免疫后第10天，从动物中分离出淋巴结细胞，并用髓磷脂碱性蛋白(MBP，阴性对照)、伴刀豆球蛋白A(ConA，阳性对照)、GA测试批(GMA，Mylan Pharmaceuticals,Inc，0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和15μg/mL)以及GA参考标准批(0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和15μg/mL)来刺激各个样品。

在4和6小时之后，如先前所述，裂解各个样品中的细胞，分离总RNA，合成cDNA，并通过实时PCR来测量GA响应生物标志物mRNA IL-4、IL-5、IL-13、IL-17的量。将在GMA免疫小鼠的细胞中测量的各种生物标志物mRNA的量与在克帕松免疫小鼠中测量的量进行比较，以确定相对效力。

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (26)

1.一种用于确定醋酸格拉替雷(GA)测试批的效力的方法，该方法包括：

a)培养从经确定量的GA参考标准批免疫的测试动物中移取的淋巴结细胞；

b)在预定量的GA参考标准批的存在下，温育包含预定数目的培养的淋巴结细胞的至少三个样品中的每一个，并在预定量的GA测试批的存在下，温育包含预定数目的培养的淋巴结细胞的至少三个样品中的每一个；

c)测量与预定量的GA参考标准批温育的至少三个样品中的每一个的淋巴结细胞中不同的GA响应生物标志物mRNA种类的量，以及与预定量的GA测试批温育的至少三个样品中的每一个的淋巴结细胞中相同GA响应生物标志物mRNA种类的量，其中至少一种GA响应生物标志物mRNA种类从编码Th1相关细胞因子的基因转录，至少一种GA响应生物标志物mRNA种类从编码Th2相关细胞因子的基因转录，以及至少一种GA响应生物标志物mRNA种类从编码Th17相关细胞因子的基因转录；以及

d)将在与预定量的GA测试批温育的淋巴结细胞中测量的每一种GA响应生物标志物mRNA种类的量与在与预定量的GA参考标准批温育的淋巴结细胞中测量的每一种GA响应生物标志物mRNA种类的量进行比较；

由此确定GA测试批的相对效力；

其中，所述GA响应生物标志物选自IL-2、IL-4、IL-5、IL-13和IL-17。

2.权利要求1的方法，其中所述测试动物为小鼠。

3.权利要求1的方法，进一步包括确定所述GA测试批是否具有期望的相对效力。

4.权利要求3的方法，其中所述期望的相对效力为所述GA参考标准批的效力的至少约90％至约125％。

5.权利要求4的方法，其中所述期望的相对效力为所述GA参考标准批的效力的至少约95％至约125％。

6.权利要求1的方法，其中所述响应生物标志物mRNA种类中的至少一种通过实时PCR进行测量。

7.权利要求1的方法，其中所述响应生物标志物mRNA种类中的至少一种在温育开始后约4至约6小时时进行测量。

8.权利要求1的方法，其中将蛋白质合成抑制剂添加至与所述GA参考标准批的淋巴结细胞的温育中，以及与所述GA测试批的淋巴结细胞的温育中。

9.权利要求1的方法，其中所述参考标准批为克帕松，或者不是克帕松的GA批。

10.一种用于制备包含GA的药物组合物的方法，包括确定GA测试批是否具有相对于GA参考标准批的效力的期望的效力，

确定所述GA测试批的效力并将其与所述参考标准批的效力进行比较，其中通过测量在从已用确定量的GA参考标准批免疫的测试哺乳动物中移取的淋巴结细胞的培养物的细胞中产生的至少一种GA响应生物标志物mRNA种类的量来确定所述GA测试批和所述参考标准批的效力，其中在预定量的GA参考标准批的存在下，温育至少一个包含预定数目的培养的淋巴结细胞的样品，其中在相同预定量的GA测试批的存在下，温育至少一个包含基本上相同预定数目的培养的淋巴结细胞的样品；以及

其中，如下确定所述GA测试批的效力：测定至少三个不同的GA响应生物标志物mRNA种类的量，所述GA响应生物标志物mRNA种类是从经确定量的GA参考标准批免疫的测试哺乳动物中移取的淋巴结细胞培养物中的细胞中生成的，其中所述至少三个不同的GA响应生物标志物mRNA种类的量在不同的样品中测定，每个所述样品中均包含预定数目的经培养的从经确定量的GA参考标准批免疫的测试哺乳动物中移取的淋巴结细胞，其中每个样品均在预定量的GA测试批的存在下温育；

其中，如下确定所述GA参考标准批的效力：测定至少三个不同的GA响应生物标志物mRNA种类的量，所述GA响应生物标志物mRNA种类是从经免疫的测试哺乳动物中移取的淋巴结细胞培养物中的细胞中生成的，其中所述至少三个不同的GA响应生物标志物mRNA种类的量在不同的样品中测定，每个所述样品中均包含预定数目的经培养的从经确定量的GA参考标准批免疫的测试哺乳动物中移取的淋巴结细胞，其中每个样品均在预定量的GA参考标准批的存在下温育；

其中至少一种GA响应生物标志物mRNA种类从编码Th1相关细胞因子的基因转录，至少一种GA响应生物标志物mRNA种类从编码Th2相关细胞因子的基因转录，以及至少一种GA响应生物标志物mRNA种类从编码Th17相关细胞因子的基因转录，以及

仅当确定所述GA测试批具有所期望的相对效力时，才将所述GA测试批混合至所述药物组合物中；并且

其中，所述GA响应生物标志物选自IL-2、IL-4、IL-5、IL-13和IL-17。

11.权利要求10的方法，其中所述测试哺乳动物为小鼠。

12.权利要求10的方法，其中所述期望的相对效力为所述GA参考标准批的效力的至少约90％至约125％。

13.权利要求12的方法，其中所述期望的相对效力为所述GA参考标准批的效力的至少约95％至约125％。

14.权利要求10的方法，其中所述至少三种GA响应生物标志物mRNA种类通过实时PCR进行测量。

15.权利要求10的方法，其中所述至少三种GA响应生物标志物mRNA种类在温育开始后约4至约6小时时进行测量。

16.权利要求10的方法，其中将蛋白质合成抑制剂添加至与所述GA参考标准批的淋巴结细胞的温育中，以及与所述GA测试批的淋巴结细胞的温育中。

17.权利要求10的方法，其中所述参考标准批为克帕松，或者不是克帕松的GA批。

18.一种用于确定GA测试批的效力和交叉效力的方法，所述方法包括：

a)用确定量的GA参考标准批对第一测试动物进行免疫；

b)用确定量的GA测试批对第二测试动物进行免疫；

c)培养从经免疫的第一测试动物中移取的淋巴结细胞，并单独培养从经免疫的第二测试动物中移取的淋巴结细胞；

d)在预定量的GA参考标准批的存在下温育至少三个样品，每个样品均包含来自经免疫的第一测试动物的预定数目的培养的淋巴结细胞，并在预定量的GA测试批的存在下温育至少三个样品，每个样品均包含来自经免疫的第一测试动物的预定数目的培养的淋巴结细胞；

e)在预定量的GA参考标准批的存在下温育至少三个样品，每个样品均包含来自经免疫的第二测试动物的预定数目的培养的淋巴结细胞，并在预定量的GA测试批的存在下温育至少三个样品，每个样品均包含来自经免疫的第二测试动物的预定数目的培养的淋巴结细胞；

f)在d)中所述至少三个样品的每一个中测量以下的量：(i)与预定量的GA参考标准批温育的、来自经免疫的第一测试动物的淋巴结细胞中的不同的GA响应生物标志物mRNA，以及(ii)与预定量的GA测试批温育的、来自经免疫的第一测试动物的淋巴结细胞中的相同的GA响应生物标志物mRNA；

g)在e)中所述至少三个样品的每一个中测量以下的量：(i)与预定量的GA参考标准批温育的、来自经免疫的第二测试动物的淋巴结细胞中的在f)中测量的每种GA响应生物标志物mRNA，以及(ii)与预定量的GA测试批温育的、来自经免疫的第二测试动物的淋巴结细胞中的所述相同的GA响应生物标志物mRNA；

h)将在f)(ii)中测量的每种GA响应生物标志物mRNA的量，与在f)(i)中测量的所述至少一种GA响应生物标志物mRNA的量进行比较，由此对每种GA响应生物标志物mRNA确定GA测试批的相对效力；

i)将在g)(ii)中测量的每种GA响应生物标志物mRNA的量，与在g)(i)中测量的所述的相同的GA响应生物标志物mRNA的量进行比较，由此对每种GA响应生物标志物mRNA确定GA参考标准批的相对效力；

j)将在f)(ii)中测量的每种GA响应生物标志物mRNA的量，与在g)(ii)中测量的所述相同的GA响应生物标志物mRNA的量进行比较；由此确定GA测试批的交叉效力；以及

其中至少一种GA响应生物标志物mRNA种类从编码Th1相关细胞因子的基因转录，至少一种GA响应生物标志物mRNA种类从编码Th2相关细胞因子的基因转录，以及至少一种GA响应生物标志物mRNA种类从编码Th17相关细胞因子的基因转录；并且

其中，所述GA响应生物标志物选自IL-2、IL-4、IL-5、IL-13和IL-17。

19.权利要求18的方法，其中所述第一测试动物和所述第二测试动物为选自以下的小鼠：相同小鼠品系的小鼠：HLA匹配的小鼠；同窝出生的小鼠；以及双胎。

20.权利要求18的方法，进一步包括确定所述GA测试批是否具有期望的相对效力、期望的交叉效力或二者。

21.权利要求20的方法，其中所述GA测试批的期望的相对效力、期望的相对交叉效力或二者为至少约75％至约125％。

22.权利要求21的方法，其中所述期望的相对效力或期望的相对交叉效力或二者为至少约80％至约120％。

23.权利要求18的方法，其中所述响应生物标志物mRNA种类通过实时PCR进行测量。

24.权利要求18的方法，其中所述响应生物标志物mRNA在温育开始后约4至约6小时时进行测量。

25.权利要求18的方法，其中将蛋白质合成抑制剂添加至与所述GA参考标准批的淋巴结细胞的温育中，以及与所述GA测试批的淋巴结细胞的温育中。

26.权利要求18的方法，其中所述参考标准批为克帕松，或者不是克帕松的GA批。