TWI637170B

TWI637170B - 對醋酸格拉替雷（ＧＬＡＴＩＲＡＭＥＲＡＣＥＴＡＴＥ）反應之生物標記ｍＲＮＡ效力分析

Info

Publication number: TWI637170B
Application number: TW103109072A
Authority: TW
Inventors: 傑佛瑞Ｐ史密斯; 彼得Ｅ里斯基
Original assignee: 麥蘭股份有限公司
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2018-10-01
Also published as: TW201447297A; JP2016512432A; AU2014244550B2; AR095520A1; US20140272987A1; CN105377308A; CN105377308B; WO2014159685A2; WO2014159685A3; JP6553018B2; AU2014244550A1; US10344330B2; EP2971173A2; HK1222123A1; EP2971173A4; CA2903805A1

Abstract

本發明說明用於決定醋酸格拉替雷(GA)之測試批的效力，其係藉由定量及比較mRNA反應之生物標記的位準，該mRNA反應之生物標記係由小鼠T細胞對GA測試批或GA參考標準批的刺激起反應所產生的，其中T細胞係從用GA測試批或參考標準批來免疫的小鼠獲得。亦說明供鑑別使用於本發明的分析中之mRNA反應之生物標記的方法。

Description

對醋酸格拉替雷(GLATIRAMER ACETATE)反應之生物標記mRNA效力分析

此申請案基於35 U.S.C.119(e)、主張2013年3月14日提申之美國專利臨時申請案第61/786,108號之利益，且其之整體併入本文以作為參考資料。

本發明係有關於對醋酸格拉替雷(GLATIRAMER)反應之生物標記mRNA效力分析。

發明背景

醋酸格拉替雷為一種批准用於治療多發性硬化症之合成性胜肽藥物。其係由含有下列胺基酸之合成性多肽之醋酸鹽組成：L-麩胺酸、L-丙胺酸、L-酪胺酸及L-離胺酸。現在販售為Copaxone®之醋酸格拉替雷注射劑指示出降低具有復發緩解型多發性硬化症(RRMS)的病人之復發的頻率，包括已經歷首次臨床發作(clinical episode)且有符合多發性硬化症的MRI特徵的病人。

認為醋酸格拉替雷係經由調節負責多發性硬化症發病機制之免疫過程而對多發性硬化症起作用。尤其，據信Copaxone®於多發性硬化症之作用機制至少部分由T細胞活性所媒介。

在製造醋酸格拉替雷的期間，需要有把藥物作用機制考慮進去，用於展現藥學用途的藥物批之間始終如一的效力，快速、敏感、可靠及具成本效益的效力分析。

發明概要

本發明係有關於一種用於醋酸格拉替雷(GA)之新的效力分析，其中GA測試批的效力係藉由定量及比較至少一個反應之生物標記mRNA來決定，該至少一個反應之生物標記mRNA係由GA特異性T細胞對GA測試批和GA參考標準批起反應所表現的。GA特異性T細胞係從用GA測試批或參考標準批來免疫的小鼠獲得。亦說明供鑑別使用於分析中之mRNA反應之生物標記的方法。

於具體例中，本發明係有關於一種用於決定GA測試批的效力之方法，該方法包含：用確定量的GA參考標準批予以免疫一測試動物；培養由該經免疫的測試動物移除的淋巴結細胞；於預定量的GA參考標準批存在下，孵育包含預定數量的該經培養的淋巴結細胞之至少一個樣本，以及於預定量的GA測試批存在下，孵育包含預定數量的該經培養的淋巴結細胞之至少一個樣本；測量用該預定量的GA參考標準批孵育的該淋巴結細胞內，至少一個GA反應之生物標記mRNA的量，以及測量用該預定量的GA測試批孵育的該淋巴結細胞內，該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，以及；比較用該預定量的GA測試批來孵育的該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，和用該預定量的GA參考標準批來孵育的該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量；藉此決定GA測試批的相對效力。

於相關具體例中，該動物為一種小鼠。於某些具體例中，該小鼠為一種雌性SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J，或(SJL/J x BALB/c)F1小鼠。於具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素或細胞介素受體的基因所轉錄。於相關具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素的基因所轉錄，其中該細胞介素為IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1b、IL-13、IL-17，或其等之任一組合。於某些具體例中，該至少一個醋酸格拉替雷反應之生物標記mRNA係由編碼IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ，或其等之任一組合的基因所轉錄。於其他具體例中，該至少一個醋酸格拉替雷反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素受體的基因所轉錄，其中該細胞介素受體為CD69、CD25，或是二者。於具體例中，在用GA參考標準批進行小鼠免疫9-11天之後，測量淋巴結細胞培養物內該至少一個生物標記mRNA。

於具體例中，本發明的方法進一步包含決定是否GA測試批具有所欲的相對效力。於此等具體例中，該所欲的相對效力，為GA參考標準批之效力的例如至少大約90%至大約125%，或者該所欲的相對效力為該GA參考標準批之效力的至少大約95%至大約125%。

於本發明的具體例中，該至少一個反應之生物標記mRNA係由即時PCR來測量。於相關具體例中，該反應之生物標記mRNA係於開始孵育之後大約4至大約6小時的時候測量。於某些具體例中，一蛋白合成抑制劑，如環己醯亞胺添加至該GA參考標準批孵育的該淋巴結細胞，以及該GA測試批孵育的該淋巴結細胞。GA參考標準批孵育的淋巴結細胞，以及GA測試批孵育的淋巴結細胞。

於本發明的方法具體例中，該參考標準批為Copaxone。

本發明進一步有關於一種用於決定GA參考標準批的效力之方法，該方法包含：用確定量的GA測試批予以免疫一測試動物；培養由該經免疫的測試動物移除的淋巴結細胞；於預定量的GA測試批存在下，孵育包含預定數量的該經培養的淋巴結細胞之至少一個樣本，以及於預定量的GA參考標準批存在下，孵育包含預定數量的該經培養的淋巴結細胞之至少一個樣本；測量用該預定量的GA測試批孵育的該淋巴結細胞內，至少一個GA反應之生物標記mRNA的量，以及測量用該預定量的GA參考標準批孵育的該淋巴結細胞內，該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，以及；比較用該預定量的GA參考標準批來孵育的該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，和用該預定量的GA測試批來孵育的該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量；藉此決定GA參考標準批的相對效力。

於相關具體例中，該動物為一種小鼠。於某些具體例中，該小鼠為一種雌性SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J，或(SJL/J x BALB/c)F1小鼠。於具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素或細胞介素受體的基因所轉錄。於相關具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素的基因所轉錄，其中該細胞介素為IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1b、IL-13、IL-17，或其等之任一組合。於某些具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ，或其等之任一組合的基因所轉錄。於其他具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素受體的基因所轉錄，其中該細胞介素受體為CD69、CD25，或是二者。於具體例中，在用GA參考標準批進行小鼠免疫9-11天之後，測量淋巴結細胞培養物內該至少一個生物標記mRNA。

於具體例中，本發明的方法進一步包含決定是否GA測試批具有所欲的相對效力。於此等具體例中，該所欲的相對效力為該GA參考標準批之效力的例如至少大約90%至大約125%，或者該所欲的相對效力為該GA參考標準批之效力的至少大約95%至大約125%。

於本發明的具體例中，該至少一個反應之生物標記mRNA係由即時PCR來測量。於相關具體例中，該反應之生物標記mRNA係於開始孵育之後大約4至大約6小時的時候測量。於某些具體例中，GA參考標準批孵育的淋巴結細胞，以及GA測試批孵育的淋巴結細胞，添加一種蛋白合成抑制劑，如環己醯亞胺。

於本發明的方法具體例中，該參考標準批為Copaxone。

亦提供一種用於製備包含GA的藥學組成物之方法，其中在該方法的期間，對GA測試批進行測試來決定，與GA參考標準批的效力相比，是否該GA測試批具有所欲的效力，該方法包含決定該GA測試批的效力其與該參考標準批的效力作比較，其中藉由測量至少一個GA反應之生物標記mRNA的量來決定該GA測試批和該參考標準批的效力，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由已經用確定量的GA參考標準批予以免疫之測試哺乳動物，移除的淋巴結細胞培養物細胞所生產的，其中於預定量的該GA參考標準批存在下，孵育包含預定數量的該經培養的淋巴結細胞之至少一個樣本，以及其中於相同預定量的該GA測試批存在下，孵育包含實質完全相同預定數量的該經培養的淋巴結細胞之至少一個樣本，以及其中與該GA參考標準批的效力相比，只有該GA測試批被決定具有所欲的效力，該GA測試批才會摻合至該藥學組成物內。

於相關具體例中，該動物為一種小鼠。於某些具體例中，該小鼠為一種雌性SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J，或是(SJL/J x BALB/c)F1小鼠。於具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素或細胞介素受體的基因所轉錄。於相關具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼一種細胞介素的基因所轉錄，其中該細胞介素為IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1b、IL-13、IL-17，或是其等之任一組合。於某些具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ，或是其等之任一組合的一種基因所轉錄。於其他具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素受體的一種基因所轉錄，其中該細胞介素受體為CD69、CD25，或是二者。於具體例中，在用GA參考標準批進行小鼠免疫9至11天之後，測量淋巴結細胞培養物內該至少一個生物標記mRNA。

於具體例中，本發明的方法進一步包含決定是否GA測試批具有所欲的相對效力。於此等具體例中，該所欲的相對效力為醋酸格拉替雷參考標準批之效力的例如至少大約90%至大約125%，或者該所欲的相對效力為醋酸格拉替雷參考標準批之效力的至少大約95%至大約125%。

於本發明的方法具體例中，該參考標準批為Copaxone。

本發明進一步有關於一種鑑別用於GA T細胞效力分析之GA反應之生物標記mRNA之方法，該方法包含：用確定量的GA予以免疫一測試動物；用對照抗原予以免疫一測試動物；培養由該經GA免疫的測試動物移除的淋巴結細胞，且分別培養由該對照抗原免疫的測試動物移除的淋巴結細胞；於預定量的該GA存在下孵育至少一個樣本，該至少一個樣本包含來自該經GA免疫的測試動物、預定數量的該經培養的淋巴結細胞，以及於預定量的GA測試批存在下孵育至少一個樣本，該至少一個樣本包含由該經對照抗原免疫的測試動物移除、預定數量的該經培養的淋巴結細胞；測量來自該經GA免疫的測試動物的該經孵育的淋巴結細胞內，候選反應之生物標記mRNA的量，及測量來自該經對照抗原免疫的測試動物的該經孵育的淋巴結細胞內，該候選反應之生物標記mRNA的量，以及；比較來自該經GA免疫的測試動物的該經孵育的淋巴結細胞內，該候選反應之生物標記mRNA的量，和來自該經對照抗原免疫的測試動物的該經孵育的淋巴結細胞內，該候選反應之生物標記mRNA的量；其中設若來自該經GA免疫的測試動物的該經孵育的淋巴結細胞內，測得的該候選反應之生物標記mRNA的量，顯著高於來自該經對照抗原免疫的測試動物的該經孵育的淋巴結細胞內，該候選反應之生物標記mRNA的量，則該候選反應之生物標記mRNA鑑定為反應之生物標記mRNA。

於某些具體例中，本發明係有關於一種用於決定GA測試批的效力和交叉效力(cross-potency)之方法，該方法包含：用確定量的GA參考標準批予以免疫第一測試動物；用確定量的GA測試批予以免疫第二測試動物；培養由該經免疫的第一測試動物移除的淋巴結細胞，且分別培養由該經免疫的第二測試動物移除的淋巴結細胞；於預定量的該GA參考標準批存在下孵育至少一個樣本，該至少一個樣本包含來自該經免疫的第一測試動物、預定數量的該經培養的淋巴結細胞，及於預定量的該GA測試批存在下孵育至少一個樣本，該至少一個樣本包含來自該經免疫的第一測試動物、預定數量的該經培養的淋巴結細胞；於預定量的該GA參考標準批存在下孵育至少一個樣本，該至少一個樣本包含來自該經免疫的第二測試動物、預定數量的該經培養的淋巴結細胞，以及於預定量的GA測試批存在下孵育至少一個樣本，該至少一個樣本包含來自該經免疫的第二測試動物、預定數量的該經培養的淋巴結細胞；測量用預定量的該GA參考標準批來孵育的、來自該經免疫的第一測試動物之該淋巴結細胞內，至少一個GA反應之生物標記mRNA的量，以及測量用預定量的該GA測試批來孵育的、來自該經免疫的第一測試動物之該淋巴結細胞內，該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量；測量用預定量的該GA參考標準批來孵育的、來自該經免疫的第二測試動物之該淋巴結細胞內，該至少一個(at the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，以及測量用預定量的該GA測試批來孵育的、來自該經免疫的第二測試動物之該淋巴結細胞內，該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量；比較用預定量的該GA測試批來孵育的、來自該經免疫的第一測試動物之該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，和用預定量的該GA參考標準批來孵育的、來自該經免疫的第一測試動物之該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，藉此來決定該GA測試批的相對效力；比較用預定量的該GA測試批來孵育的、來自該經免疫的第二測試動物之該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，和用預定量的該GA參考標準批來孵育的、來自該經免疫的第二測試動物之該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，藉此來決定該GA參考標準批的相對效力；比較用預定量的該GA測試批來孵育的、來自該經免疫的第一測試動物之該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，和用預定量的該GA測試批來孵育的、來自該經免疫的第二測試動物之該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量；藉此來決定該GA測試批的交叉效力。

於此等具體例中，該第一測試動物及該第二測試動物可以選自於：相同小鼠品系的小鼠：HLA-配對的小鼠；同窩出生者及；雙胎。於具體例中，該第一測試動物及該第二測試動物屬於相同小鼠品系，以及其中該小鼠品系係選自於：雌性CSJLF1/JRj、雌性SJL/J、雌性BALB/cByJ、雌性CD-1、雌性C57BL/10J，及雌性(SJL/J x BALB/c)F1。於具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素或細胞介素受體的基因所轉錄。於相關具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素的基因所轉錄，其中該細胞介素為IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-1b、IL-13、IL-17，或其等之任一組合。於某些具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ，或其等之任一組合的基因所轉錄。於其他具體例中，該至少一個GA反應之生物標記mRNA係由編碼細胞介素受體的基因所轉錄，其中該細胞介素受體為CD69、CD25，或是二者。於具體例中，在用GA參考標準批進行小鼠免疫9-11天之後，測量淋巴結細胞培養物內該至少一個生物標記mRNA。

於具體例中，本發明的方法進一步包含決定是否GA測試批具有所欲的相對效力、所欲的相對交叉效力，或是二者。於此等具體例中，該所欲的相對效力或所欲的相對交叉效力，為GA參考標準批之效力的例如至少大約90%至大約125%，或者該所欲的相對效力或所欲的相對交叉效力為GA參考標準批之效力的至少大約95%至大約125%。

於本發明的方法具體例中，該參考標準批為Copaxone。

本發明亦提供一種用於決定第二醋酸格拉替雷(GA)批之(second lot of GA)效力的方法，該方法包含：用確定量的第一GA批予以免疫一測試動物；培養由該經免疫的測試動物移除的淋巴結細胞；於預定量的該第一GA批存在下，孵育包含預定數量的該經培養的淋巴結細胞之至少一個樣本，以及於預定量的第二GA批存在下，孵育包含預定數量的該經培養的淋巴結細胞之至少一個樣本；測量用預定量的該第一GA批來孵育的該淋巴結細胞內，至少一個GA反應之生物標記mRNA的量，及測量用預定量的該第二GA批來孵育的該淋巴結細胞內，該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，以及；比較用預定量的該第二GA批來孵育的該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，和用預定量的該第一GA批來孵育的該淋巴結細胞內，測得的該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量；藉此決定該第二GA批的相對效力。於此等具體例中，該第一GA批可以為Copaxone、GA參考標準批，或GA測試批。於此等具體例中，該第二GA批可以為Copaxone、GA參考標準批，或GA測試批。

參引合併(INCORPORATION BY REFERENCE)

本說明書提及之所有的刊物、專利及專利申請案係併入本文以作為參考資料，猶如明確且個別地表明各個個別的刊物、專利或專利申請案併入作為參考資料。

所附的申請專利範圍詳細地列舉本發明的新穎特徵。參照下列列舉出闡釋性具體例的詳細說明，闡釋性具體例使用本發明的原理，及附圖會更瞭解本發明的特徵及優點，附圖中：圖1. 初級LN細胞對不同濃度的GA起反應所表現的mIL-2 Mrna。此圖顯示本文表6內呈現的資料圖。來自經GA免疫的小鼠之LN細胞係於擬體內(ex vivo)用不同濃度的GA或Copaxone刺激，以及測量mIL-2 mRNA。IL-2 mRNA位準表達為與DCCM1(培養基)對照相比，倍數的增加。變化vs.對照之mRNA位準係繪製為GA刺激濃度的函數。A.使用六個GA濃度(1、2.5、5、10、15和25μg/mL)來刺激LN細胞。B.使用五個GA濃度(1、2.5、5、10和15μg/mL)來刺激LN細胞。關於A和B二者，菱形表示用GMA(醋酸格拉替雷，Mylan Pharmaceuticals,Inc.)刺激的組別3細胞(來自用GA免疫的小鼠)之mIL-2 mRNA表現。正方形表示用Copaxone(Teva Pharmaceuticals USA,Inc.)刺激的組別3細胞之表現。三角形表示用GMA刺激的組別4細胞(來自用甘露糖醇免疫的小鼠)之表現。X表示用Copaxone刺激的組別4細胞。資料係繪製為半對數。此外，繪圖加上對數趨勢線/迴歸(logarithmic trendline/regression)。所有的r²值為>0.90或 90%。

圖2.初級LN細胞對GA刺激起反應所表現的細胞介素Mrna。此圖顯示本文表8-12內呈現的資料之概要。來自經GA免疫的小鼠之LN細胞係於擬體內用GA刺激，以及如所示於刺激後4小時(淺色的長條)和刺激後6小時(深色的長條)，測量細胞介素mRNA。細胞介素mRNA位準表達為與DCCM1(培養基)對照相比之下，倍數的增加。

圖3.來自經GA免疫的CD-1小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：IL-2及IL-4。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。A.來自品系CD-1小鼠之LN細胞內之IL-2 mRNA的表現。B.來自品系CD-1小鼠之LN細胞內之IL-4 mRNA的表現。

圖4.來自經GA免疫的CD-1小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：IL-5及IL-10。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。A.來自品系CD-1小鼠之LN細胞內之IL-5 mRNA的表現。B.來自品系CD-1小鼠之LN細胞內之IL-10 mRNA的表現。

圖5.來自經GA免疫的CD-1小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：IL-13及IFN-γ。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。A.來自品系CD-1小鼠之LN細胞內之IL-13 mRNA的表現。B.來自品系CD-1小鼠之LN細胞內之IFN-γ mRNA的表現。

圖6.來自經GA免疫的小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：TNF-α及IL-2。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。A.來自品系CD-1小鼠之LN細胞內之TNF-α mRNA的表現。B.來自品系BALB/cByJ小鼠之LN細胞內之IL-2 mRNA的表現。

圖7.來自經GA免疫的BALB/cByJ小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：IL-4及IL-5。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。A.來自品系BALB/cByJ小鼠之LN細胞內之IL-4 mRNA的表現。B.來自品系BALB/cByJ小鼠之LN細胞內之IL-5 mRNA的表現。

圖8.來自經GA免疫的BALB/cByJ小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：IL-10及IL-13。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。A.來自品系BALB/cByJ小鼠之LN細胞內之IL-10 mRNA的表現。B.來自品系BALB/cByJ小鼠之LN細胞內之IL-13 mRNA的表現。

圖9.來自經GA免疫的BALB/cByJ小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：IFN-γ及TNF-α。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。A.來自品系BALB/cByJ小鼠之LN細胞內之IFN-γ mRNA的表現。B.來自品系BALB/cByJ 小鼠之LN細胞內之TNF-α mRNA的表現。

圖10.來自經GA免疫的SJL/J小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：IL-2及IL-4。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。A.來自品系SJL/J小鼠之LN細胞內之IL-2 mRNA的表現。B.來自品系SJL/J小鼠之LN細胞內之IL-4 mRNA的表現。

圖11.來自經GA免疫的SJL/J小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：IL-5及IL-10。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。A.來自品系SJL/J小鼠之LN細胞內之IL-5 mRNA的表現。B.來自品系SJL/J小鼠之LN細胞內之IL-10 mRNA的表現。

圖12.來自經GA免疫的SJL/J小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：IL-13及IFN-γ。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。A.來自品系SJL/J小鼠之LN細胞內之IL-13 mRNA的表現。B.來自品系SJL/J小鼠之LN細胞內之IFN-γ mRNA的表現。

圖13.來自經GA免疫的SJL/J小鼠之初級LN細胞對GA刺激起反應之反應之生物標記mRNA的表現位準：TNF-α。mRNA位準表達為倍數變化vs.對照係繪製為GA刺激濃度的函數。圖顯示來自品系SJL/J小鼠之LN細胞內之TNF-α mRNA的表現。

較佳實施例之詳細說明醋酸格拉替雷(GA)

GA係由合成性多肽之醋酸鹽組成，其含有四種天然存在的胺基酸：L-麩胺酸、L-丙胺酸、L-酪胺酸及L-離胺酸，分別具有0.141、0.427、0.095及0.338之平均莫耳分率。GA之平均分子量為5,000-9,000道耳頓。化學上，GA被定名為具有L-丙胺酸、L-離胺酸及L-酪胺酸、醋酸(鹽)之L-麩胺酸聚合物。

GA之實驗式為(C₅H₉NO₄‧C₃H₇NO₂‧C₆H₁₄N₂O₂‧C₉H₁₁NO₃)_x‧xC₂H₄O₂(CAS-147245-92-9，醫師案頭參考(Physician’s Desk Reference))。

當使用於本文中，除非特別說明，否則“GA”係提及GA(醋酸格拉替雷)，包括例如Mylan Pharmaceuticals,Inc.生產的GA“GMA”，以及Teva Pharmaceuticals USA,Inc.生產的GA“Cop”或“Copaxone”。

用於測試醋酸格拉替雷生產批之效力分析

本發明係有關於用於展現製造藥學用途可接受的GA藥物批之間始終如一的效力之效力分析。藥物許可機構一般在許可過程期間要求藥物的效力測試，以及要求開發可以於許可後用來決定批對批(lot to lot)一致性的效力分析。此等分析不止可用於確保例行製造期間，批的一致性，而且還有可用於評估製造方法中藥物批後續的變化。

效力為產品特定的測量法(product-specific measurement)，以及各個產品必須分別地評估分析。據信GA於多發性硬化症(MS)之作用機制至少部分由T細胞活性之免疫調節所媒介。因而T細胞對GA之免疫反應為GA溶液內存在的抗原決定位之特異且敏感的測量法。因為T細胞能區分溶液內存在的不同但非常相似的胜肽之獨特的能力，所以分析培養物內GA-特異性T細胞之細胞介素分泌剖析(profile)及免疫活性，可以辨別GA批之間的免疫相關差異。在這方面，藉由接觸(primed)像是GA參考標準批，及用像是GA測試批來挑戰，及/或反之亦然的動物體內之T細胞反應所顯示之免疫同一性(immunologic identity)，可以指示出參考標準批和測試批是完全相同的。致敏的(primed)T細胞對後續的挑戰起反應而釋放的細胞介素，是一項額外的T細胞反應之免疫同一性(immunologic identity)測量法。細胞介素的釋放剖析有可能可以偵測已知GA批內存在的特定抗原決定位之細小差異。

於本發明的具體例中，GA生產批或GA測試批的相對效力係藉由比較代表T細胞對GA測試批的免疫反應之數值，對於代表T細胞對GA參考標準批相同的反應之數值來決定。此效力測定說明了GA測試批的刺激能力。於本發明的方法中，用確定量或預定量的GA參考標準批予以免疫一測試動物，以及培養由該動物移除的淋巴結之淋巴結細胞。該經培養的淋巴結細胞之一個樣本係經由用確定量或預定量的GA參考標準批予以孵育來刺激，以及該經培養的淋巴結細胞之第二樣本係經由用相同確定量或預定量的GA生產批或GA測試批予以孵育來刺激。接而測量各樣本內GA反應之生物標記mRNA的量，並比較該量以達到相對效力(the amounts compared to arrive at a relative potency)。

於於分別的具體例中，測定GA的相對交叉效力。相對交叉效力是比較交叉免疫作用(across immunizations)的效力，也就是，其比較得自於不同動物的測試及/或參考標準GA刺激的T細胞(或用要比較的任何二批GA來刺激的T細胞)的效力，其中各動物係用GA測試批或參考標準批予以免疫。此測量提供深入的了解GA測試批之免疫能力，例如GA測試批引出免疫反應之能力。此測量亦提供深入的了解GA參考標準批之免疫能力。於此等具體例中，該方法包含免疫至少二個測試動物，第一個用GA參考標準批，以及第二個用確定量的GA測試批。由該經免疫的第一及第二測試動物移除的淋巴結細胞係分別培養。產生了從各動物移除、經培養的淋巴結細胞之於分別的樣本，各個含有預定數量的該經培養的淋巴結細胞。用預定量的GA參考標準批及預定量的GA測試批獨立孵育各個樣本。因而，產生了至少四個孵育或刺激的樣本，舉例而言如表A中所示：

測量用預定量的該GA參考標準批來孵育的(表示為孵育A)、來自該經免疫的第一測試動物之該淋巴結細胞內，至少一個GA反應之生物標記mRNA的量，以及測量用預定量的該GA測試批來孵育的(表示為孵育B)、來自該經免疫的第一測試動物之該淋巴結細胞內，該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量。同樣地，測量用預定量的該GA參考標準批來孵育的(表示為孵育C)、來自該經免疫的第二測試動物之該淋巴結細胞內，該至少一個(at the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，以及測量用預定量的該GA測試批來孵育的(表示為孵育D)、來自該經免疫的第二測試動物之該淋巴結細胞內，該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量。

於具體例中，以如上說明的方式進行效力測定，其中於孵育B中該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，係與孵育A中該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量作比較。於具體例中，於孵育C中該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，係與孵育D中該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量作比較。

為了決定交叉效力，於孵育C中該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，係與孵育A中該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量作比較。於具體例中，於孵育B中該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量，係與孵育D中該至少一個(the least one)GA反應之生物標記mRNA的量作比較。

舉例而言，使用從本文表29(IL-2)、表31(IL-4)，及表35(IL-13)呈現的實例所得到，表B中列舉的資料，可以進行如下所示之交叉效力的計算。

關於IL-2，Copaxone交叉效力計算如下：C/A=17.5/20.0=.875，或87.5%。

關於IL-2，GMA交叉效力計算如下：B/D=16.9/15.7=1.08，或108%。

關於IL-4，Copaxone交叉效力計算如下：C/A=21.8/22.6=.965，或96.5%

關於IL-4，GMA交叉效力計算如下：B/D=18.8/18.3=1.03，或103%。

關於IL-13，Copaxone交叉效力計算如下：C/A=17.5/13.5=1.3，或130%

關於IL-13，GMA交叉效力計算如下：B/D=8.6/11.5=.748，或74.8%。

於具體例中，效力係建立在二個生產批組成的基礎上。於具體例中，在可能添加GA生產批之前，之後，否則就是認為適合時使用本發明的方法。

美國專利第7,429,374號(2008年9月30日頒佈)、美國專利第7,923,215號(2011年8月12日頒佈)，與美國專利申請案第2011/0189706號(2011年8月4日公開)，各者標題為，“Process for the Measurement of the Potency of Glatiramer Acetate”，以及各者在此完整地併入本案以作為參考資料，說明GA效力分析，該GA效力分析會測量分泌的細胞介素(蛋白質)位準。

於本發明的方法中，測量一個或多個反應之生物標記mRNA的表現位準。mRNA的表現位準(from)不必然平行蛋白質表現。因而，不能利用蛋白質分泌分析之反應之生物標記，可以使用mRNA的表現位準來提供關於反應之生物標記的資訊。舉例而言，mRNA分析的優點是mRNA可以在比mRNA衍生的分泌蛋白質更早的時間偵測到，導致更快速的分析。除時間選擇的問題之外，還有二種分析之間已觀察到某些反應之生物標記的劑量反應效應的差異問題。重要地，如美國專利第7,429,374號所述，來自經GA免疫的小鼠之GA刺激後的細胞，探測不到的細胞介素，由本文所顯示的mRNA分析明確地偵測到。

於具體例中，當藉由mRNA擴增來進行定量時，可以正規化(normalized)成內部對照的表達方式，例如參考或管家(housekeeping)基因，如GAPDH或β-肌動蛋白。再者，效力或交叉效力可以表達為，與對照相比倍數的增加，如同本文實施例中所述，實施例中DCCM-1未刺激的資料為對照。於具體例中，樣本內GA反應之生物標記mRNA的效力或交叉效力表達為倍數變化vs對照。於具體例中，以下列方式來計算樣本內GA反應之生物標記mRNA之倍數變化vs對照：1)將反應之生物標記mRNA位準正規化(normalizing)成使用同樣的樣本所獲得之參考或管家基因，以及2)將正規化的反應之生物標記mRNA位準除以負對照的位準。於具體例中，負對照的位準為培養基對照。

於具體例中，在評估效力或交叉效力方面，可以執行詳細的劑量反應曲線之統計比較來證明劑量反應曲線之相似性。可以使用文獻中或是熟悉此藝者已知的任何方法來證明劑量反應曲線之相似性。於具體例中，劑量反應曲線之間的相似性係以劑量反應曲線之間(between)或之中(among)，0至大約15%變異百分比為基礎來決定。於具體例中，劑量反應曲線之間的相似性係以劑量反應曲線之間(between)或之中(among)，0%、大約1%、大約2%、大約3%、大約4%、大約5%、大約6%、大約7%、大約8%、大約9%、大約10%、大約11%、大約12%、大約13%、大約14%，或大約15%變異百分比為基礎來決定。於具體例中，劑量反應曲線之間的相似性係以劑量反應曲線之間(between)或之中(among)，0%至大約3%、0%至大約4%、0%至大約5%、0%至大約6%、0%至大約7%、0%至大約8%、0%至大約9%、0%至大約10%、0%至大約11%、0%至大約12%、0%至大約13%、0%至大約14%、大約1%至大約3%、大約1%至大約4%、大約1%至大約5%、大約1%至大約6%、大約1%至大約7%、大約1%至大約8%、大約1%至大約9%、大約1%至大約10%、大約1%至大約11%、大約1%至大約12%、大約 1%至大約13%、大約1%至大約14%、大約2%至大約4%、大約2%至大約5%、大約2%至大約6%、大約2%至大約7%、大約2%至大約8%、大約2%至大約9%、大約2%至大約10%、大約2%至大約11%、大約2%至大約12%、大約2%至大約13%、大約2%至大約14%、大約2%至大約15%、大約3%至大約5%、大約3%至大約6%、大約3%至大約7%、大約3%至大約8%、大約3%至大約9%、大約3%至大約10%、大約3%至大約11%、大約3%至大約12%、大約3%至大約13%、大約3%至大約14%、大約3%至大約15%、大約4%至大約7%、大約4%至大約8%、大約4%至大約9%、大約4%至大約10%、大約4%至大約11%、大約4%至大約12%、大約4%至大約13%、大約4%至大約14%、大約4%至大約15%、大約5%至大約8%、大約5%至大約9%、大約5%至大約10%、大約5%至大約11%、大約5%至大約12%、大約5%至大約13%、大約5%至大約14%、大約5%至大約15%、大約6%至大約9%、大約6%至大約10%、大約6%至大約11%、大約6%至大約12%、大約6%至大約13%、大約6%至大約14%、大約6%至大約15%、大約7%至大約10%、大約7%至大約11%、大約7%至大約12%、大約7%至大約13%、大約7%至大約14%、大約7%至大約15%、大約8%至大約11%、大約8%至大約12%、大約8%至大約13%、大約8%至大約14%、大約8%至大約15%、大約9%至大約12%、大約9%至大約13%、大約9%至大約14%、大約9%至大約15%、大約10%至大約13%、大約10%至大約14%、大約10%至大約15%、大約11%至大約14%、大約11%至大約15%、大約1%、大約2%、大約3%、大約4%、大約5%、大約6%、大約7%、大約8%、大約9%、大約10%、大約11%、大約12%、大約13%、大約14%，或大約15%變異百分比為基礎來決定。

使用任何本技藝已知的或是文獻中說明的合適RT-PCR定量方法是預期的。Wong and Medrano,2005,Biotechniques 39：57-85,“Real-Time PCR for mRNA Quantitation”，中描述定量方法，其之全體併入本文中以作為參考資料。

於具體例中，本發明的方法使用熟悉此藝者用已知的方法確認為有用的任何參考或是管家基因。於具體例中，使用的參考或管家基因係選自於：GAPDH、β-肌動蛋白、Atp5b、B2m、Cyc1、Hprt、Gapdh、18S RNA，以及Rp113a。

於本發明的具體例中，決定相對效力及或相對交叉效力進行的比較係表達為觀察到的mRNA生物標記的表現比率、比例或百分比。

於本發明的具體例中，GA測試批的效力或交叉效力與GA參考標準批的效力或交叉效力作比較，以獲得GA測試批的相對效力或交叉效力。於相對效力或交叉效力為100%(其亦可以表達為1.0)的具體例中，GA測試批及GA參考標準批的效力或交叉效力是相等的。於具體例中，所欲的相對效力為大約80%至大約120%。於具體例中，所欲的相對效力為大約85%至大約115%。於具體例中，所欲的相對效力為大約90%至大約110%。於具體例中，所欲的相對交叉效力為大約70%至大約130%。於具體例中，所欲的相對交叉效力為大約65%至大約135%。於某些具體例中，與該參考標準批的效力或交叉效力相比，該所欲的效力或所欲的交叉效力(該所欲的相對效力或所欲的相對交叉效力)，為大約或至少大約65%、大約或至少大約66%、大約或至少大約67%、大約或至少大約68%、大約或至少大約69%、大約或至少大約70%、大約或至少大約71%、大約或至少大約72%、大約或至少大約73%、大約或至少大約74%、大約或至少大約75%、大約或至少大約75%、大約或至少大約76%、大約或至少大約77%、大約或至少大約78%、大約或至少大約79%、大約或至少大約80%、大約或至少大約81%、大約或至少大約82%、大約或至少大約83%、大約或至少大約84%、大約或至少大約85%、大約或至少大約86%、大約或至少大約87%、大約或至少大約88%、大約或至少大約89%、大約或至少大約90%、大約或至少大約91%、大約或至少大約92%、大約或至少大約93%、大約或至少大約94%、大約或至少大約95%、大約或至少大約96%、大約或至少大約97%、大約或至少大約98%、大約或至少大約99%、大約或至少大約100%、大約或至少大約101%、大約或至少大約102%、大約或至少大約103%、大約或至少大約104%、大約或至少大約105%、大約或至少大約106%、大約或至少大約107%、大約或至少大約108%、大約或至少大約109%、大約或至少大約110%、大約或至少大約111%、大約或至少大約112%、大約或至少大約113%、大約或至少大約114%、大約或至少大約115%、大約或至少大約116%、大約或至少大約117%、大約或至少大約118%、大約或至少大約119%、大約或至少大約120%、大約或至少大約121%、大約或至少大約122%、大約或至少大約123%、大約或至少大約124%、大約或至少大約125%、大約或至少大約126%、大約或至少大約127%、大約或至少大約128%、大約或至少大約129%、大約或至少大約130%、大約或至少大約131%、大約或至少大約132%、大約或至少大約133%、大約或至少大約134%，或大約或至少大約135%。於某些具體例中，該所欲的相對效力或交叉效力為大約68%至大約132%、大約70%至大約130%、大約72%至大約128%、大約75%至大約125%、大約80%至大約120%、大約85%至大約115%、大約65%至大約110%、大約68%至大約110%、大約70%至大約110%、大約72%至大約110%、大約78%至大約110%、大約80%至大約110%、大約90%至大約110%、大約95%至大約105%、大約85%至大約110%、大約90%至大約110%、大約95%至大約110%、大約96%至大約110%、大約97%至大約110%、大約98%至大約110%、大約99%至大約110%、大約100%至大約110%、大約65%至大約105%、大約68%至大約105%、大約70%至大約105%、大約72%至大約105%、大約80%至大約105%、大約85%至大約105%、大約90%至大約105%、大約95%至大約105%、大約96%至大約105%、大約97%至大約105%、大約98%至大約105%、大約99%至大約105%、大約 100%至大約105%、大約65%至大約100%、大約68%至大約100%、大約70%至大約100%、大約72%至大約100%、大約75%至大約100%、大約78%至大約100%、大約80%至大約100%、大約81%至大約100%、大約82%至大約100%、大約83%至大約100%、大約84%至大約100%、大約85%至大約100%、大約86%至大約100%、大約87%至大約100%、大約88%至大約100%、大約89%至大約100%、大約90%至大約100%、大約91%至大約100%、大約92%至大約100%、大約93%至大約100%、大約94%至大約100%、大約95%至大約100%、大約96%至大約100%、大約97%至大約100%、大約98%至大約100%、大約99%至大約100%、大約95%至大約99%、大約96%至大約99%、大約97%至大約99%、大約70%至大約135%、大約75%至大約135%、大約80%至大約135%、大約85%至大約135%、大約90%至大約135%、大約75%至大約130%、大約80%至大約130%、大約85%至大約130%、大約90%至大約130%、大約80%至大約125%、大約85%至大約125%、大約90%至大約125%、大約85%至大約120%、大約90%至大約120%，或大約95%至大約120%。

動物

依據本發明之測試動物或測試哺乳動物為可以使用於評估該化合物的任何動物，例如小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、狗、猴子等等。

可以根據熟悉此藝者已知的方法組合以本文實施例中提供的教示來鑑別合適的測試動物。舉例而言，許多小鼠品系為本技藝已知以及為商業上可得的，來源包括Jackson Laboratories，Charles River，Taconic，等等。關於可利用的近親小鼠品系之資訊可得自於公開的文獻及資料庫中，包括International Mouse Strain Resource(Eppig JT and Strivens M,1999,Finding a mouse：the International Mouse Strain Resource(IMSR).Trends in Genetics 15：81-82)。本文實施例中描述幾個小鼠品系內增加的細胞介素分泌位準之評估。實施例進一步描述評估反應之生物標記mRNA，其等來自編碼本發明的方法中可能測量的細胞介素的基因。

於具體例中，該動物為一種小鼠。於具體例中，該小鼠品系具有MHC單倍型(haplotype)b、d，或s2。於具體例中，該小鼠品系為CSJLF1/JRj、SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J，或(SJL/J x BALB/c)F1。於具體例中，該小鼠為雌性CSJLF1/JRj、雌性SJL/J、雌性BALB/cByJ、雌性CD-1、雌性C57BL/10J，或是雌性(SJL/J x BALB/c)F1小鼠。

於經由比較來自各自用不同批GA予以免疫的、不同小鼠樣本內的反應之生物標記mRNA表現，來決定交叉效力之具體例中，小鼠關於免疫相關的基因座，為屬於實質相同的基因型。於具體例中，該小鼠係選自於：相同小鼠品系的小鼠：HLA-配對的小鼠；同窩出生者及；雙胎。於具體例中，小鼠為基因同一的(genetically identical)或實質上基因同一的。

免疫作用

本文和公開的文獻中，例如美國專利第7,429,374號和第7,923,215號內，中說明本發明的方法中有用的動物免疫程序。熟悉此藝者可識別其他有效誘導T細胞對GA反應之免疫程序。於具體例中，用配於CFA乳劑內250μg的GA或配於CFA乳劑內甘露糖醇、經由足墊(footpad)(蹠內的(intraplantar))及或(and or)下肢/踝(hock)注射來免疫小鼠。於具體例中，用大約200至大約500μg、大約200至大約450μg、大約200至大約350μg、大約200至大約300μg、大約200至大約250μg、大約250至大約500μg、大約250至大約450μg、大約250至大約400μg、大約250至大約350μg，或大約250至大約300μg的GA來免疫小鼠。

於具體例中，藉由使用27-G，½英吋針之1mL注射器、注射至4隻足墊(footpad)的每個足墊來免疫8週大的動物。關於蹠內的(intraplantar)注射，可以用0.1mL的總注射體積(大約10μL至各個前足墊(footpad)內及40μL至各個後足墊內)來免疫小鼠。關於皮下(如下肢)注射，可以用0.1mL的總注射體積(如，大約25μL至各個前下肢內及25μL至各個後肢的踝(hock)內)來免疫各隻小鼠。

T細胞培養

於本發明的方法中，來自測試動物內任何來源的T細胞之擬體內GA刺激是預期的。於具體例中，T細胞係來自於淋巴結、脾臟、骨髓，或末梢血液。可以如同本文實施例中所述，或是用任何本技藝已知的方法或是使用文獻中公開的方法來獲得T細胞。

舉例來說，從經免疫的小鼠來獲得T細胞，以及初次培養製備如下：於免疫之後10天，經由頸椎脫位術來犧牲經免疫的動物。移除來自經免疫小鼠的腋部及膕部的淋巴結，且并合至含有5mL冰冷的、無菌的RPMI-1640培養基之培養皿內。以5.0mL冰冷的、無菌的RPMI-1640培養基來清洗完整的淋巴結三次。用無菌的注射器之柱塞末端來按壓LN以單離LN細胞。細胞懸浮液首先通經100μm耐綸細胞粗濾器(nylon cell strainer)，然後用40mL冰冷的RPMI-1640培養基清洗一次。於4℃下、以ca.200 x g離心10分鐘之後，以40mL冰冷的RPMI-1640培養基予以再懸浮細胞沈澱物(pellet)用於細胞計數。

可以使用錐蟲藍排除(Trypan blue exclusion)法來決定懸浮液內活細胞之細胞密度如下：關於細胞計數，將0.1mL的細胞懸浮液移轉至具有0.65mL的1X DPBS及0.25 mL of 4%錐蟲藍溶液，乾淨、無菌的微量離心管內，接著添加20μL的錐蟲藍-細胞懸浮液混合物至計數腔(counting chamber)。使用Auto T4 Cellometer來測量細胞密度及生存力。在細胞計數之後，於4℃下、以ca.200 x g離心LN細胞10分鐘，以及以1.0 x 10⁷細胞/mL的細胞密度予以再懸浮於濃化的(enriched)DCCM-1培養基內。LN細胞可以平盤培養於24井組織培養平盤中用於藥物處理(刺激)。

於具體例中，在足夠發展出對GA的免疫反應的時間之後，例如免疫後大約9-11天，從小鼠得到LN細胞。

醋酸格拉替雷刺激作用

可以根據任何本技藝已知或是文獻中說明的合適方法、用抗原(GA)來刺激T細胞，例如LN細胞。舉例而言，可以依需求用預定量的GA參考標準批來刺激，來自用GA免疫的動物之預定數量的LN細胞，例如0.5mL細胞(5x10⁶細胞/井)。於分別的樣本中，可以用相同預定量的GA測試批來刺激相同預定數量的LN細胞。製備GA稀釋的樣本可以藉由添加100μL的GA(20mg/mL)至19.9mL的濃化的DCCM-1，產出100μg/mL儲備溶液，有用於依需求製備不同濃度的GA樣本。

舉例而言，於24井組織培養平盤中，添加預定量的GA測試批或GA參考標準批的儲備溶液，至含有預定數量的LN細胞的井中，來提供所欲的GA濃度。來自甘露糖醇免疫的對照動物，相同預定數量的T細胞同樣可以使用相同的程序，用相同預定量的GA測試批來處理。

於本發明的具體例中，用確定量的GA參考標準予以免疫測試動物。於該GA參考標準存在下，孵育包含來自該經免疫的動物之預定數量的淋巴結細胞之至少一個樣本，以及其中於GA測試批存在下，孵育包含來自該經免疫的動物的淋巴結細胞之至少一個樣本。此刺激能誘導涉及該免疫反應的分子表現，例如編碼細胞介素或細胞介素受體的mRNA。

於具體例中，用至少大約0.3μg/mL至大約100μg/mL濃度的GA來孵育淋巴結細胞之樣本。於具體例中，濃度為至少大約0.3μg/mL、至少大約0.4μg/mL、至少大約0.5μg/mL、至少大約0.6μg/mL、至少大約0.7μg/mL、至少大約0.8μg/mL、至少大約0.9μg/mL、至少大約1μg/mL、至少大約1.5μg/mL、至少大約2μg/mL、至少大約2.5μg/mL、至少大約3μg/mL、至少大約3.5μg/mL、至少大約4μg/mL、至少大約4.5μg/mL、至少大約5μg/mL、至少大約5.5μg/mL、至少大約6μg/mL、至少大約6.5μg/mL、至少大約7μg/mL、至少大約7.5μg/mL、至少大約8μg/mL、至少大約8.5μg/mL、至少大約9μg/mL、至少大約9.5μg/mL、至少大約10μg/mL、至少大約10.5μg/mL、至少大約11μg/mL、至少大約11.5μg/mL、至少大約12μg/mL、至少大約12.5μg/mL、至少大約13μg/mL、至少大約13.5μg/mL、至少大約14μg/mL、至少大約14.5μg/mL、至少大約15μg/mL、至少大約15.5μg/mL、至少大約16μg/mL、至少大約16.5μg/mL、至少大約17μg/mL、至少大約17.5μg/mL、至少大約18μg/mL、至少大約18.5μg/mL、至少大約19μg/mL、至少大約19.5μg/mL、至少大約20μg/mL、至少大約21.5μg/mL、至少大約22μg/mL、至少大約22.5μg/mL、至少大約23μg/mL、至少大約24μg/mL、至少大約24.5μg/mL、至少大約25μg/mL、至少大約25.5μg/mL、至少大約26μg/mL、至少大約26.5μg/mL、至少大約27μg/mL、至少大約27.5μg/mL、至少大約28μg/mL、至少大約28.5μg/mL、至少大約29μg/mL、至少大約29.5μg/mL、至少大約30μg/mL、至少大約35μg/mL、至少大約40μg/mL、至少大約45μg/mL、至少大約50μg/mL、至少大約55μg/mL、至少大約60μg/mL、至少大約65μg/mL、至少大約70μg/mL、至少大約75μg/mL、至少大約80μg/mL、至少大約85μg/mL、至少大約90μg/mL、至少大約95μg/mL，或至少大約100μg/mL。於具體例中，濃度為大約0.3至大約15μg/mL、大約0.3至大約10μg/mL、大約0.3至大約8μg/mL、大約0.3至大約6μg/mL、大約0.3至大約5μg/mL、大約0.3至大約4μg/mL、大約0.3至大約3μg/mL、大約0.3至大約2.5μg/mL、大約0.3至大約2μg/mL、大約0.3至大約1μg/mL、大約1至大約15μg/mL、大約1至大約10μg/mL、大約1至大約9μg/mL、大約1至大約8μg/mL、大約1至大約7μg/mL、大約1至大約6μg/mL、大約1至大約5μg/mL、大約1至大約4μg/mL、大約1至大約3μg/mL、大約1至大約2.5μg/mL、大約1至大約2μg/mL、大約2至大約30μg/mL、大約2至大約29μg/mL、大約2至大約28μg/mL、大約2至大約27μg/mL、大約2至大約26μg/mL、大約2至大約25μg/mL、大約2至大約24μg/mL、大約2至大約23μg/mL、大約2至大約22μg/mL、大約2至大約21μg/mL、大約2至大約20μg/mL、大約2至大約19μg/mL、大約2至大約18μg/mL、大約2至大約17μg/mL、大約2至大約16μg/mL、大約2至大約15μg/mL、大約2至大約14μg/mL、大約2至大約13μg/mL、大約2至大約12μg/mL、大約2至大約11μg/mL、大約2至大約10μg/mL、大約2至大約5μg/mL、大約2.5至大約30μg/mL、大約2.5至大約29μg/mL、大約2.5至大約28μg/mL、大約2.5至大約27μg/mL、大約2.5至大約26μg/mL、大約2.5至大約25 μg/mL、大約2.5至大約24μg/mL、大約2.5至大約23μg/mL、大約2.5至大約22μg/mL、大約2.5至大約21μg/mL、大約2.5至大約20μg/mL、大約2.5至大約19μg/mL、大約2.5至大約18μg/mL、大約2.5至大約17μg/mL、大約2.5至大約16μg/mL、大約2.5至大約15μg/mL、大約2.5至大約14μg/mL、大約2.5至大約13μg/mL、大約2.5至大約12μg/mL、大約2.5至大約11μg/mL、大約2.5至大約10μg/mL、大約2.5至大約5μg/mL、大約3至大約30μg/mL、大約3至大約29μg/mL、大約3至大約28μg/mL、大約3至大約27μg/mL、大約3至大約26μg/mL、大約3至大約25μg/mL、大約3至大約24μg/mL、大約3至大約23μg/mL、大約3至大約22μg/mL、大約3至大約21μg/mL、大約3至大約20μg/mL、大約3至大約19μg/mL、大約3至大約18μg/mL、大約3至大約17μg/mL、大約3至大約16μg/mL、大約3至大約15μg/mL、大約3至大約14μg/mL、大約3至大約13μg/mL、大約3至大約12μg/mL、大約3至大約11μg/mL、大約3至大約10μg/mL、大約3.5至大約30μg/mL、大約3.5至大約29μg/mL、大約3.5至大約28μg/mL、大約3.5至大約27μg/mL、大約3.5至大約26μg/mL、大約3.5至大約25μg/mL、大約3.5至大約24μg/mL、大約3.5至大約23μg/mL、大約3.5至大約22μg/mL、大約3.5至大約21μg/mL、大約3.5至大約20μg/mL、大約3.5至大約19μg/mL、大約3.5至大約18μg/mL、大約3.5至大約17μg/mL、大約3.5至大約16μg/mL、大約3.5至大約15μg/mL、大約3.5至大約14μg/mL、大約3.5至大約13μg/mL、大約3.5至大約12 μg/mL、大約3.5至大約11μg/mL、大約3.5至大約10μg/mL、大約4至大約30μg/mL、大約4至大約29μg/mL、大約4至大約28μg/mL、大約4至大約27μg/mL、大約4至大約26μg/mL、大約4至大約25μg/mL、大約4至大約24μg/mL、大約4至大約23μg/mL、大約4至大約22μg/mL、大約4至大約21μg/mL、大約4至大約20μg/mL、大約4至大約19μg/mL、大約4至大約18μg/mL、大約4至大約17μg/mL、大約4至大約16μg/mL、大約4至大約15μg/mL、大約4至大約14μg/mL、大約4至大約13μg/mL、大約4至大約12μg/mL、大約4至大約11μg/mL、大約4至大約10μg/mL、大約4.5至大約30μg/mL、大約4.5至大約29μg/mL、大約4.5至大約28μg/mL、大約4.5至大約27μg/mL、大約4.5至大約26μg/mL、大約4.5至大約25μg/mL、大約4.5至大約24μg/mL、大約4.5至大約23μg/mL、大約4.5至大約22μg/mL、大約4.5至大約21μg/mL、大約4.5至大約20μg/mL、大約4.5至大約19μg/mL、大約4.5至大約18μg/mL、大約4.5至大約17μg/mL、大約4.5至大約16μg/mL、大約4.5至大約15μg/mL、大約4.5至大約14μg/mL、大約4.5至大約13μg/mL、大約4.5至大約12μg/mL、大約4.5至大約11μg/mL、大約4.5至大約10μg/mL、大約5至大約75μg/mL、大約5至大約50μg/mL、大約5至大約40μg/mL、大約5至大約30μg/mL、大約5至大約29μg/mL、大約5至大約28μg/mL、大約5至大約27μg/mL、大約5至大約26μg/mL、大約5至大約25μg/mL、大約5至大約24μg/mL、大約5至大約23μg/mL、大約5至大約22μg/mL、大約5至大約21μg/mL、大約5至大約20μg/mL、大約5至大約19μg/mL、大約5至大約18μg/mL、大約5至大約17μg/mL、大約5至大約16μg/mL、大約5至大約15μg/mL、大約5至大約14μg/mL、大約5至大約13μg/mL、大約5至大約12μg/mL、大約5至大約11μg/mL、大約5至大約10μg/mL、大約10至大約75μg/mL、大約10至大約50μg/mL、大約10至大約50μg/mL、大約10至大約30μg/mL、大約10至大約25μg/mL、大約10至大約20μg/mL、大約10至大約15μg/mL、大約15至大約75μg/mL、大約15至大約50μg/mL、大約15至大約40μg/mL、大約15至大約30μg/mL、大約15至大約25μg/mL，或大約15至大約20μg/mL。

於本發明的具體例中，免疫作用使用的參考標準批為Copaxone或依需求而為任何其他批的GA。於此等具體例中，來自該經免疫的動物之細胞的分別樣本係以使用於免疫作用的該批GA來處理，以及第二細胞樣本各自用第二批的(測試批)GA來處理。於具體例中，GA參考標準批不是Copaxone。於此等具體例中，測試批可能是Copaxone或依需求而為任何其他批的GA。於具體例中，把多於一個以上的測試批的GA與第一測試批相比評估。

於決定交叉效力之具體例中，對一隻以上的小鼠進行免疫作用，各者用不同批的GA。從各個經免疫的小鼠獲得的分別的LN細胞樣本係用不同批的GA來刺激，以使得來自各個免疫作用的細胞可分別用不同批的GA來刺激。

反應之生物標記mRNA

GA-刺激可能調節的mRNA物種是預期可供使用於本發明的方法中作為反應之生物標記。於具體例中，一種反應之生物標記是由編碼以下的基因所轉錄，例如，CD25、CD69、CD71、CD86(CD86分子)、CD137、CD154、CD278(ICOS，可誘導性T細胞共刺激物)、CD279、HLA-DR、GATA3(GATA結合蛋白3)、HLA-DMA(主要組織相容性複合體，第II型，DMα)、HLA-DMB(主要組織相容性複合體，第II型，DMβ)、IFN-γ(干擾素γ)、IFN-γR2(干擾素γ受體)、IL-2(介白素2)、IL-4(介白素4)、IL-5(介白素5)、IL-6(介白素6)、IL-8(CXCL-8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、IL-10(介白素10)、IL-13(介白素13)、IL-18(介白素18)、IL-12RB1(介白素12受體，β)、IL-17A(介白素17A)、IL-17F(介白素17F)、IL-18R1(介白素18受體1)、IL-2RA(介白素2受體，α2)、IL-2RG(介白素2受體，γ)、IL4-R(介白素4受體)、IL-6R(介白素6受體)、IL-21(介白素21)、IL-22(介白素22)、IL-1β(介白素1-β)、Tbx21(T-盒(box)21)、TGFBR2(轉形生長因子，β受體II)、TNF(腫瘤壞死因子，TNF-α)、TNF-β(LT)、TGF-β、FOXP3(叉頭框(Forkhead box)P3)，或IL-10RB(介白素10受體，β)。可以使用商業上可得的服務、試劑及/或套組來評估此等基因的表現，例如，MouseWG-6 v2.0 Expression BeadChip Kit(Illumina，Inc.，San Diego，CA)。

於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼細胞介素的基因所轉錄，細胞介素係選自於例如，IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、或IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，及IL-1β。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼活化標誌或細胞介素受體的基因所轉錄，其係選自於例如，CD25、CD69、CD71、CD86、CD137、CD154、CD278、CD279、GATA3、Tbx21、HLA-DMA、HLA-DMB、IFN-γR2、IL-12RB1、IL-2RA、IL-2RG、IL-4R、IL-6R、IL-10RB、TGFBR2、FOXP3，及HLA-DR。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼趨化介素的基因所轉錄，其係選自於例如，IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：Th1-關聯性細胞介素、Th2-關聯性細胞介素、Th17關聯性細胞介素，或是T_FH-關聯性細胞介素。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼Th1-關聯性細胞介素的基因所轉錄，以及為IFN-γ、IL-2、IL-1β、TNF-α，或CXCL1。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼Th2-關聯性細胞介素的基因所轉錄，其係選自於：IL-4、IL-5、IL-10，或IL-13。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼Th17-關聯性細胞介素的基因所轉錄，其係選自於：IL-17，及IL-22。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼T_FH-關聯性細胞介素的基因所轉錄，該T_FH-關聯性細胞介素為IL-21。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼關鍵調節關聯性細胞介素的基因所轉錄，其係選自於：IL-10及 TGF-β。

於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ、TNF-α、CD25，或是IL1-β。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、TNF-α、CD-25，或是IL1-β。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼IL-4、IL-13，或TNF-α的基因所轉錄。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ，或是CD25。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：IL-4、IL-5、IL-13、IL-17，或是CD25。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ，或是TNF-α。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、TNF-α。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：IL-4、IL-5、IL-13、IL-17，或IFN-γ。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：IL-4、IL-5、IL-13，或是IL-17。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：CD25、IL-4，或是IL-13。於具體例中，一反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：IL-4，或是IL-13。

於具體例中，該小鼠品系為CSJLF1/JRj、SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J，或(SJL/J x BALB/c)F1。於具體例中，該小鼠品系為CSJLF1/JRj、SJL/J、BALB/cByJ、CD-1、C57BL/10J，或(SJL/J x BALB/c)F1，以及該反應之生物標記mRNA係由一個基因所轉錄，該基因編碼小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、或IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，及IL-1β。於具體例中，測量一個以上的反應之生物標記mRNA。於特定的具體例中，藉由例如，多重PCR(multiplex PCR)來測量相同的樣本內一個以上的反應之生物標記mRNA。於特定的具體例中，測試動物為SJL/J小鼠，以及該反應之生物標記mRNA係由一個編碼mIL-2、mIL-4、mIl-5、mIL-13，或mIFN-γ的基因所轉錄。於特定的具體例中，測試動物為BALB/cByJ小鼠，以及該反應之生物標記mRNA係由一個編碼mIL-2、mINF-γ、mIL-4、mIL-5、mIL-10，或mIL-13的基因所轉錄。於其他的具體例中，測試動物為CD-1小鼠，以及該反應之生物標記mRNA係由一個編碼mIL-2、mINF-γ、mIL-5、mIL-10，或mIL-13的基因所轉錄。於某些具體例中，測試動物為C57BL/10J小鼠，以及該反應之生物標記mRNA係由一個編碼mIL-2，或mINF-γ的基因所轉錄。於其他的具體例中，測試動物為(SJL/J x BALB/C)F1小鼠，以及該反應之生物標記mRNA係由一個編碼以下的基因所轉錄：mIFN-γ、mTNF-α、mIL-4、mIL-5、mIL-10、mIL-13、mIL-17、mCD69，或mCD25。於具體例中，測試動物為CSJLF1/JRj 小鼠，以及該反應之生物標記mRNA係由一個編碼IL-4、IL-5、IL-13，或IL-17的基因所轉錄。

於本發明的特定具體例中，測試動物為藉由蹠內注射來免疫的BALB/cByJ小鼠，以及測量的反應之生物標記為INF-γ、IL-4，或IL-5。於具體例中，測試動物為藉由下肢注射來免疫的BALB/cByJ小鼠，以及測量的反應之生物標記為IL-2。於其他的具體例中，測試動物為藉由蹠內注射來免疫的CD-1小鼠，以及測量的反應之生物標記為IL-2、INF-γ、IL-4、IL-5，或IL-10。

本發明亦關於用於鑑別本發明之效力分析可以測量的反應之生物標記mRNA物種的方法。依照本文中的教示，熟悉此藝者可以鑑定出額外的反應之生物標記mRNAs，該額外的反應之生物標記mRNA證實能鑑別對GA刺激來自GA免疫的小鼠之T細胞起反應、會增加分泌的細胞介素mRNA物種。於具體例中，一種供用於本發明的效力分析中之合適的反應之生物標記為mRNA物種，其確定會對GA刺激來自GA免疫的小鼠之T細胞起反應、而被調節，以及其中發現於二或更多個重複測試中的調節為一致的。於具體例中，mRNA物種對GA刺激起反應而調節達至少大約2倍至大約50倍、大約2倍至大約45倍、大約2倍至大約40倍、大約2倍至大約35倍、大約2倍至大約30倍、大約2倍至大約25倍、大約2倍至大約22倍、大約2倍至大約20倍、大約2倍至大約15倍、大約2倍至大約12倍、大約2倍至大約10倍、大約2倍至大約9倍、大約2倍至大約8倍、大約2倍至大約7倍、大約2倍至大約6倍、大約2倍至大約5倍、大約2倍至大約4-fold,3倍至大約50倍、大約3倍至大約45倍、大約3倍至大約40倍、大約3倍至大約35倍、大約3倍至大約30倍、大約3倍至大約25倍、大約3倍至大約22倍、大約3倍至大約20倍、大約3倍至大約15倍、大約3倍至大約12倍、大約3倍至大約10倍、大約3倍至大約9倍、大約3倍至大約8倍、大約3倍至大約7倍、大約3倍至大約6倍、大約3倍至大約5倍、大約4倍至大約50倍、大約4倍至大約45倍、大約4倍至大約40倍、大約4倍至大約35倍、大約4倍至大約30倍、大約4倍至大約25倍、大約4倍至大約22倍、大約4倍至大約20倍、大約4倍至大約15倍、大約4倍至大約12倍、大約4倍至大約10倍、大約4倍至大約9倍、大約4倍至大約8倍、大約4倍至大約7倍、大約4倍至大約6倍、大約5倍至大約50倍、大約5倍至大約45倍、大約5倍至大約40倍、大約5倍至大約35倍、大約5倍至大約30倍、大約5倍至大約25倍、大約5倍至大約22倍、大約5倍至大約20倍、大約5倍至大約15倍、大約5倍至大約12倍、大約5倍至大約10倍、大約5倍至大約9倍、大約5倍至大約8倍、大約5倍至大約7倍、大約7倍至大約50倍、大約7倍至大約45倍、大約7倍至大約40倍、大約7倍至大約35倍、大約7倍至大約30倍、大約7倍至大約25倍、大約7倍至大約22倍、大約7倍至大約20倍、大約7倍至大約15倍、大約7倍至大約12倍、大約7倍至大約10倍、大約7倍至大約9倍、大約10倍至大約50倍、大約10倍至大約45倍、大約10倍至大約40倍、大約10倍至大約35倍、大約10倍至大約30 倍、大約10倍至大約25倍、大約10倍至大約22倍、大約10倍至大約20倍、大約10倍至大約15倍、大約15倍至大約50倍、大約15倍至大約45倍、大約15倍至大約40倍、大約15倍至大約35倍、大約15倍至大約30倍、大約15倍至大約25倍、大約15倍至大約22倍、大約15倍至大約20倍、大約20倍至大約50倍、大約20倍至大約45倍、大約20倍至大約40倍、大約20倍至大約35倍、大約20倍至大約30倍、大約20倍至大約25倍、大約25倍至大約50倍、大約25倍至大約45倍、大約25倍至大約40倍、大約25倍至大約35倍、大約25倍至大約30倍、大約30倍至大約50倍、大約30倍至大約45倍、大約30倍至大約40倍、大約30倍至大約35倍、至少大約2倍、至少大約3倍、至少大約4倍、至少大約5倍、至少大約6倍、至少大約7倍、至少大約8倍、至少大約9倍、至少大約10倍、至少大約11倍、至少大約12倍、至少大約13倍、至少大約14倍、至少大約15倍、至少大約20倍、至少大約20倍、至少大約25倍、至少大約30倍、至少大約2倍、至少大約35倍、至少大約40倍、至少大約45倍，或至少大約50倍。可能的反應之生物標記mRNA之測量係描述於本文中。

反應之生物標記mRNA之測量

可以使用一些商業上可得的分析套組和系統之任一者，或者根據任何本技藝所述的方法來定量測量反應之生物標記mRNA物種。於本發明的方法中使用本技藝已知的任何合適的定量方法來測量mRNA表現位準是預期的。舉例而言，可以使用PCR方法來進行mRNA的反轉錄和擴增，包括RT-PCR，和即時反轉錄PCR(qRT-PCR)。定量基因表現的PCR方法描述於，例如，VanGuilder等人，2008，“Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis,”Biotechniques 44：619-626，以及Bustin等人，2005，“Quantitative real-time RT-PCR-a perspective,”Journal of Molecular Endocrinology,34：597-601，其之各者全體併入本文中以作為參考資料。小鼠細胞介素mRNA之定量PCR描述於例如，Overbergh等人，1999,“Quantification of murine cytokine mRNAs using real time quantitative reverse transcriptase PCR,”Cytokine 11(4)：305-312，其併入本文中以作為參考資料，說明用於定量IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、p40、IL-13、IL-15、IFN-γ、TNF-α、TGF-β以及iNOS之探針及引子。

小鼠細胞介素RT-PCR套組是廣泛可得到的，例如，從Fisher Scientific,Life Technologies，以及SABiosciences。舉例而言，Life Technologies Cytokine Mouse 20-Plex Panel允許同時測量IP-10、MIP-1α、MCP-1、IL-13、IFN-γ、IL-1α、FGF-Basic、IL-10、IL-12、IL-17、MIG、GM-CSF、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、VEGF，以及KC。SABiosciences Mouse Common Cytokines RT² Profiler^TM PCR Array可以客製化以測量84個細胞介素基因的子集。於具體例中，使用從Life Technologies獲得的TaqMan Universal PCR Master Mix(Cat.# 4304437)以及小鼠細胞介素IL-2(Cat.# 4331182；ID Mm00434256_m1)、IL-4(Cat.# 4331182；ID Mm00445259_m1)、IL-5(Cat.# 4331182；ID Mm00439646_m1)、IL-10(Cat.# 4331182；ID Mm00439614_m1)、IL-13(Cat.# 4331182；ID Mm00434204_m1)、IFN-γ(Cat.# 4331182；ID Mm01168134_m1)以及TNF-α(Cat.# 4331182；ID Mm00443260_g1)的引子/探針。

於具體例中，使用Illumina MouseWG-6 v2.0 Expression BeadChip Kit來評估轉錄本的位準或是使用MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChip Kit(Illumina,Inc.,San Diego,CA)。轉錄體學(Transcriptome)分析可以能進行使用其他的方法，例如，RNA-Seq(Nagalakshmi等人，2010年1月，RNA-Seq：A Method for Comprehensive Transcriptome Analysis,”Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,Unit 4.11，增刊89，著作權2010John Wiley & Sons,Inc.，其之全體併入本文中以作為參考資料)。

接受準則可包括，例如各刺激以三重複(triplicate)分析，正對照ConA對標的基因之誘導作用大於或等於最高濃度的GA之誘導作用，負對照MBP對標的基因之誘導作用低於培養基對照2倍，以及NTC(無模板對照)對照之擴增在可偵測的位準以下。於具體例中，設若標的基因之PCR運轉不符合以上的接受準則，則會重複特異性運轉。

於本發明的方法中，測量一種反應之生物標記 mRNA以提供GA測試批的效力之指示。GA測試批的效力由其影響與已知的或很可能的GA作用機制相關的一種反應的能力來表示。由此可見經由GA-刺激T細胞而特異性的誘導T細胞細胞介素的表現，可以作為GA測試批效力的指標。於具體例中，反應之生物標記mRNA為由生物標記基因轉錄的RNA物種。於具體例中，測量的反應之生物標記mRNA編碼該生物標記蛋白質。於具體例中，偵測方法會測量由一個編碼生物標記蛋白質的基因所轉錄之mRNA轉錄本的任何特定的部分。於具體例中，測量的進行係藉由核酸擴增或是本技藝已知的其他偵測方法，其使用適合生產可計量信號的引子或探針來與mRNA轉錄本的任何部分雜交。

GA刺激時間是關鍵性的。一般說來，選擇容易偵測的及高度再現性的時間範圍(timeframe)，會觀察到生物標記mRNA位準的增加或減少。開始刺激後測量用GA孵育細胞的反應之最理想的時間，預期會根據特定反應之生物標記mRNA的表現剖析而變化。已經觀察到刺激對於某些生物標記mRNA表現的效應會隨著孵育的時間逐漸減少(見實施例)，因而不證明較晚的時點是有用的。

於本發明的方法具體例中，GA反應之生物標記mRNA的測量，係在GA刺激開始後大約24小時以前。於本發明的方法具體例中，GA反應之生物標記mRNA的測量係在GA刺激開始後大約23、大約22、大約21，或大約20小時以前。

於本發明的方法具體例中，GA反應之生物標記 mRNA的測量，係在用GA測試批或參考標準批開始孵育(刺激)LN細胞後大約4至大約6小時之時。於本發明的方法具體例中，GA反應之生物標記mRNA的測量，係在用GA測試批或參考標準批開始孵育LN細胞後大約1小時至大約24小時之時。於具體例中，GA反應之生物標記mRNA的測量，係在用GA測試批或參考標準批開始孵育(刺激)LN細胞後大約1小時之時、在大約1.25小時之時、在大約1.5小時之時、在大約1.75小時之時、在大約2小時之時、在大約2.25小時之時、在大約2.5小時之時、在大約2.75小時之時、在大約3小時之時、在大約3.25小時之時、在大約3.5小時之時、在大約3.75小時之時、在大約4小時之時、在大約4.25小時之時、在大約4.5小時之時、在大約4.75小時之時、在大約5小時之時、在大約5.25小時之時、在大約5.5小時之時、在大約5.75小時之時、在大約6小時之時、在大約6.25小時之時、在大約6.5小時之時、在大約6.75小時之時、在大約7小時之時、在大約7.25小時之時、在大約7.5小時之時、在大約7.75小時之時、在大約8小時之時、在大約8.25小時之時、在大約8.5小時之時、在大約8.75小時之時、在大約9小時之時、在大約9.25小時之時、在大約9.5小時之時、在大約9.75小時之時、在大約10小時之時、在大約10.25小時之時、在大約10.5小時之時、在大約10.75小時之時、在大約11小時之時、在大約11.25小時之時、在大約11.5小時之時、在大約11.75小時之時、在大約12小時之時、在大約12.5小時之時、在大約13小時之時、在大約13.5小時之時、在大約14小時之時、在大約14.5小時之時、在大約15小時之時、在大約15.5小時之時、在大約16小時之時、在大約17小時之時、在大約18小時之時、在大約19小時之時、在大約20小時之時、在大約21小時之時、在大約22小時之時、在大約23，或在大約24小時之時。

於具體例中，GA反應之生物標記mRNA的測量，係在用GA測試批或參考標準批開始孵育LN細胞後大約2小時至大約16小時、大約2小時至大約15小時大約(hours about)2小時至大約14小時、大約2小時至大約13小時、大約2小時至大約12小時、大約2小時至大約11小時、大約2小時至大約10小時、大約2小時至大約9小時、大約2小時至大約8小時、大約2小時至大約7小時、大約2小時至大約6小時、大約2.5小時至大約16小時、大約2.5小時至大約15小時大約(hours about)2.5小時至大約14小時、大約2.5小時至大約13小時、大約2.5小時至大約12小時、大約2.5小時至大約11小時、大約2.5小時至大約10小時、大約2.5小時至大約9小時、大約2.5小時至大約8小時、大約2.5小時至大約7小時、大約2.5小時至大約6小時、大約2.5小時至大約5.5小時、大約2.5小時至大約5小時、大約2.5小時至大約4小時、大約3小時至大約16小時、大約3小時至大約15小時大約(hours about)3小時至大約14小時、大約3小時至大約13小時、大約3小時至大約12小時、大約3小時至大約11小時、大約3小時至大約10小時、大約3小時至大約9小時、大約3小時至大約8小時、大約3小時至大約7小時、大約3小時至大約6小時、大約3小時至大約5.5小時、大約3小時至大約5小時、大約3小時至大約4小時、大約3.5小時至大約16小時、大約3.5小時至大約15小時大約(hours about)3.5小時至大約14小時、大約3.5小時至大約13小時、大約3.5小時至大約12小時、大約3.5小時至大約11小時、大約3.5小時至大約10小時、大約3.5小時至大約9小時、大約3.5小時至大約8小時、大約3.5小時至大約7小時、大約3.5小時至大約6小時、大約3.5小時至大約5.5小時、大約3.5小時至大約5小時、大約4小時至大約16小時、大約4小時至大約15小時、大約4小時至大約14小時、大約4小時至大約13小時、大約4小時至大約12小時、大約4小時至大約11小時、大約4小時至大約10小時、大約4小時至大約9小時、大約4小時至大約8小時、大約4小時至大約7小時、大約4小時至大約6小時、大約4小時至大約5.5小時、大約5小時至大約16小時、大約5小時至大約15小時、大約5小時至大約14小時、大約5小時至大約13小時、大約5小時至大約12小時、大約5小時至大約11小時、大約5小時至大約10小時、大約5小時至大約9小時、大約5小時至大約8小時、大約5小時至大約7小時、大約5小時至大約6小時、大約6小時至大約16小時、大約6小時至大約15小時、大約6小時至大約14小時、大約6小時至大約13小時、大約6小時至大約12小時、大約6小時至大約11小時、大約6小時至大約10小時、大約6小時至大約9小時、大約6小時至大約8小時、大約6小時至大約7小時、大約7小時至大約16小時、大約7小時至大約15小時、大約7小時至大約14小時、大約7小時至大約13小時、大約7小時至大約12小時、大約7小時至大約11小時、大約7小時至大約10小時、大約7小時至大約9小時、大約7小時至大約8小時、大約2小時至大約24小時、大約2小時至大約20小時、大約2小時至大約18小時、大約2小時至大約16小時、大約4小時至大約24小時、大約4小時至大約20小時、大約4小時至大約18小時、大約4小時至大約16小時、大約6小時至大約24小時、大約6小時至大約20小時、大約6小時至大約18小時、大約6小時至大約16小時、大約8小時至大約24小時、大約8小時至大約20小時、大約8小時至大約18小時，或大約8小時至大約16小時的時候。

反應之生物標記mRNA小組

於具體例中，使用本發明的方法來測量一組生物標記mRNA物種。於具體例中，mRNAs小組係，例如藉由多重PCR來同時測量。

於具體例中，本發明係有關於一種組成物，其包含一組生物標記物種。

於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含至少二個mRNA物種。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含2 to 50 mRNA物種。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少30個、至少 35個、至少40個、至少45，或是至少50個mRNA物種。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含2至50、2至5、2至10、2至12、2至15、2至20、2至25、2至30、2至35、2至40、2至45、3至50、3至5、3至10、3至12、3至15、3至20、3至25、3至30、3至35、3至40、3至45、4至50、4至10、4至12、4至15、4至20、4至25、4至30、4至35、4至40、4至45、5至50、5至10、5至12、5至15、5至20、5至25、5至30、5至35、5至40、5至45、6至50、6至12、6至15、6至20、6至25、6至30、6至35、6至40、6至45、7至50、7至12、7至15、7至20、7至25、7至30、7至35、7至40、7至45、8至50、8至15、8至20、8至25、8至30、8至35、8至40、8至45、9至50、9至15、9至20、9至25、9至30、9至35、9至40、9至45、10至50、10至15、10至20、10至25、10至30、10至35、10至40、10至45、12至50、12至20、12至25、12至30、12至35、12至40、12至45、15至50、15至25、15至30、15至40、20至50、20至25、20至30、20至40、25至50、25至40、30至50，或是30至45個mRNA物種。

於具體例中，一組反應之生物標記mRNA物種包含至少二個mRNA物種，各者由編碼以下的基因所轉錄：CD25、CD69、CD71、CD86(CD86分子)、CD137、CD154、CD278(ICOS，可誘導性T細胞共刺激物)、CD279、HLA-DR、GATA3(GATA結合蛋白3)、HLA-DMA(主要組織相容性複合體，第II型，DM脉)、HLA-DMB(主要組織相容性複合體，第II型，DM刍)、IFN-γ(干擾素γ)、IFN-γR2(干擾素γ受體)、 IL-2(介白素2)、IL-4(介白素4)、IL-5(介白素5)、IL-6(介白素6)、IL-8(CXCL-8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、IL-10(介白素10)、IL-13(介白素13)、IL-18(介白素18)、IL-12RB1(介白素12受體，β)、IL-17A(介白素17A)、IL-17F(介白素17F)、IL-18R1(介白素18受體1)、IL-2RA(介白素2受體，脉2)、IL-2RG(介白素2受體，γ)、IL4-R(介白素4受體)、IL-6R(介白素6受體)、IL-21(介白素21)、IL-22(介白素22)、IL-1β(介白素1-β)、Tbx21(T-盒(box)21)、TGFBR2(轉形生長因子，β受體II)、TNF(腫瘤壞死因子，TNF-α)、TNF-β(LT)、TGF-β、FOXP3(叉頭框(Forkhead box)P3)，或IL-10RB(介白素10受體，β)。可以使用商業上可得的服務、試劑及/或套組來評估此等基因的表現，例如，Mouse WG-6 v2.0 Expression BeadChip Kit(Illumina，Inc.，San Diego，CA)。

於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含至少一個mRNA物種，其係由一個編碼選自於以下的細胞介素的基因所轉錄：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，及IL-1b。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含至少一個mRNA物種，其係由一個編碼選自於以下的活化標誌或細胞介素受體的基因所轉錄：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含至少一個mRNA物種，其係由一個編碼選自於以下的趨化介素的基因所轉錄： IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含選自於以下的至少一個mRNA物種：由一個編碼Th1-關聯性細胞介素的基因所轉錄之mRNA物種、由一個編碼Th2-關聯性細胞介素的基因所轉錄之mRNA物種、由一個編碼Th17關聯性細胞介素的基因所轉錄之mRNA物種，以及由一個編碼T_FH-關聯性細胞介素的基因所轉錄之mRNA物種。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由一個編碼Th1-關聯性細胞介素的基因所轉錄之至少一個mRNA物種。於具體例中，該Th1-關聯性細胞介素為IFN-γ、IL-2、IL-1β、TNF-α，或CXCL1。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由一個編碼Th2-關聯性細胞介素的基因所轉錄之至少一個mRNA物種。於具體例中，該Th1-關聯性細胞介素為IL-4、IL-5、IL-10，或IL-13。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由一個編碼Th17-關聯性細胞介素的基因所轉錄之至少一個mRNA物種。於具體例中，該Th17-關聯性細胞介素為IL-17或IL-22。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由一個編碼T_FH-關聯性細胞介素的基因所轉錄之至少一個mRNA物種。於具體例中，該T_FH-關聯性細胞介素為IL-21。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含至少一個mRNA物種，其係由一個編碼關鍵調節關聯性細胞介素的基因所轉錄。於具體例中，關鍵調節關聯性細胞介素係選自於IL-10及TGF-β。

於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ、TNF-α、CD25，以及IL1-β。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、TNF-α、CD-25，及IL1-β。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：IL-4、IL-13，及TNF-α。

於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ，或CD25。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：IL-4、IL-5、IL-13、IL-17，或CD25。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ，及TNF-α。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22，及TNF-α。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：IL-4、IL-5、IL-13、IL-17，及IFN-γ。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：IL-4、IL-5、IL-13，及IL-17。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：CD25、IL-4，及IL-13。於具體例中，生物標記mRNA物種小組包含由編碼以下的基因所轉錄之mRNA物種：IL-4及IL-13。

於具體例中，生物標記mRNA物種小組中的mRNA物種的測量，係在用GA測試批或參考標準批開始孵育(刺激)LN細胞後大約4至大約6小時之時。

於具體例中，生物標記mRNA物種小組中的mRNA物種的測量，係在用GA測試批或參考標準批開始孵育(刺激)LN細胞後大約6小時之時。

於本發明的方法具體例中，反應之生物標記mRNA物種小組中的mRNA物種的測量，係在GA刺激開始後大約24小時以前。於本發明的方法具體例中，反應之生物標記mRNA物種小組中的mRNA物種的測量，係在GA刺激開始後大約23、大約22、大約21，或大約20小時以前。

於本發明的方法具體例中，反應之生物標記mRNA物種小組中的mRNA物種的測量，係在用GA測試批或參考標準批開始孵育(刺激)LN細胞後大約4至大約6小時之時。於本發明的方法具體例中，GA反應之生物標記mRNA的測量，係在用GA測試批或參考標準批開始孵育LN細胞後大約1至大約24小時之時。於具體例中，GA反應之生物標記mRNA的測量，係在用GA測試批或參考標準批開始孵育(刺激)LN細胞後大約1小時之時、在大約1.25小時之時、在大約1.5小時之時、在大約1.75小時之時、在大約2小時之時、在大約2.25小時之時、在大約2.5小時之時、在大約2.75小時之時、在大約3小時之時、在大約3.25小時之時、在大約3.5小時之時、在大約3.75小時之時、在大約4小時之時、在大約4.25小時之時、在大約4.5小時之時、在大約4.75小時之時、在大約5小時之時、在大約5.25小時之時、在大約5.5小時之時、在大約5.75小時之時、在大約6小時之時、在大約6.25小時之時、在大約6.5小時之時、在大約6.75小時之時、在大約7小時之時、在大約7.25小時之時、在大約7.5小時之時、在大約7.75小時之時、在大約8小時之時、在大約8.25小時之時、在大約8.5小時之時、在大約8.75小時之時、在大約9小時之時、在大約9.25小時之時、在大約9.5小時之時、在大約9.75小時之時、在大約10小時之時、在大約10.25小時之時、在大約10.5小時之時、在大約10.75小時之時、在大約11小時之時、在大約11.25小時之時、在大約11.5小時之時、在大約11.75小時之時、在大約12小時之時、在大約12.5小時之時、在大約13小時之時、在大約13.5小時之時、在大約14小時之時、在大約14.5小時之時、在大約15小時之時、在大約15.5小時之時、在大約16小時之時、在大約17小時之時、在大約18小時之時、在大約19小時之時、在大約20小時之時、在大約21小時之時、在大約22小時之時、在大約23，或是在大約24小時之時。

於具體例中，反應之生物標記mRNA物種小組中的mRNA物種的測量，係在用GA測試批或參考標準批開始孵育(刺激)LN細胞後大約2小時至大約16小時、大約2小時至大約15小時大約(hours about)2小時至大約14小時、大約2小時至大約13小時、大約2小時至大約12小時、大約2小時至大約11小時、大約2小時至大約10小時、大約2小時至大約9小時、大約2小時至大約8小時、大約2小時至大約7小時、大約2小時至大約6小時、大約2.5小時至大約16小時、大約2.5小時至大約15小時大約(hours about)2.5小時至大約14小時、大約2.5小時至大約13小時、大約2.5小時至大約12小時、大約2.5小時至大約11小時、大約2.5小時至大約10小時、大約2.5小時至大約9小時、大約2.5小時至大約8小時、大約2.5小時至大約7小時、大約2.5小時至大約6小時、大約2.5小時至大約5.5小時、大約2.5小時至大約5小時、大約2.5小時至大約4小時、大約3小時至大約16小時、大約3小時至大約15小時大約(hours about)3小時至大約14小時、大約3小時至大約13小時、大約3小時至大約12小時、大約3小時至大約11小時、大約3小時至大約10小時、大約3小時至大約9小時、大約3小時至大約8小時、大約3小時至大約7小時、大約3小時至大約6小時、大約3小時至大約5.5小時、大約3小時至大約5小時、大約3小時至大約4小時、大約3.5小時至大約16小時、大約3.5小時至大約15小時大約(hours about)3.5小時至大約14小時、大約3.5小時至大約13小時、大約3.5小時至大約12小時、大約3.5小時至大約11小時、大約3.5小時至大約10小時、大約3.5小時至大約9小時、大約3.5小時至大約8小時、大約3.5小時至大約7小時、大約3.5小時至大約6小時、大約3.5小時至大約5.5小時、大約3.5小時至大約5小時、大約4小時至大約16小時、大約4小時至大約15小時、大約4小時至大約14小時、大約4小時至大約13小時、大約4小時至大約12小時、大約4小時至大約11小時、大約4小時至大約10小時、大約4小時至大約9小時、大約4小時至大約 8小時、大約4小時至大約7小時、大約4小時至大約6小時、大約4小時至大約5.5小時、大約5小時至大約16小時、大約5小時至大約15小時、大約5小時至大約14小時、大約5小時至大約13小時、大約5小時至大約12小時、大約5小時至大約11小時、大約5小時至大約10小時、大約5小時至大約9小時、大約5小時至大約8小時、大約5小時至大約7小時、大約5小時至大約6小時、大約6小時至大約16小時、大約6小時至大約15小時、大約6小時至大約14小時、大約6小時至大約13小時、大約6小時至大約12小時、大約6小時至大約11小時、大約6小時至大約10小時、大約6小時至大約9小時、大約6小時至大約8小時、大約6小時至大約7小時、大約7小時至大約16小時、大約7小時至大約15小時、大約7小時至大約14小時、大約7小時至大約13小時、大約7小時至大約12小時、大約7小時至大約11小時、大約7小時至大約10小時、大約7小時至大約9小時、大約7小時至大約8小時、大約2小時至大約24小時、大約2小時至大約20小時、大約2小時至大約18小時、大約2小時至大約16小時、大約4小時至大約24小時、大約4小時至大約20小時、大約4小時至大約18小時、大約4小時至大約16小時、大約6小時至大約24小時、大約6小時至大約20小時、大約6小時至大約18小時、大約6小時至大約16小時、大約8小時至大約24小時、大約8小時至大約20小時、大約8小時至大約18小時，或大約8小時至大約16小時。

於具體例中，用一種蛋白合成抑制劑，例如環己醯亞胺來處理LN細胞，在用GA刺激之後或在用GA刺激時(upon)。

實施例 實施例I. 開發可測量用醋酸格拉替雷挑戰以後，來自醋酸格拉替雷免疫小鼠的淋巴結細胞內反應之生物標記mRNA，之醋酸格拉替雷的效力分析

開發醋酸格拉替雷(GA)的效力分析，測量用GA挑戰以後，來自GA免疫的(SJL/J x BALB/C)F1小鼠品系的T細胞的反應之生物標記mRNA。從經免疫小鼠獲得的LN細胞顯示出對GA刺激起反應而實質增加細胞介素mRNA位準早在刺激之後2小時，必定不遲於4小時。

分析的開發

進行三個實驗來評估不同的時點、反應之生物標記mRNAs、分析的格式，以及供使用於效力分析的試劑。表1顯示三個研究的實驗設計，以及各者進行的免疫作用。

表1內總結三個實驗之各者，雌性(SJL/J x BALB/C)F1雜交種(Jackson Laboratory)小鼠係藉由足墊注射250μg GMA(Mylan Pharmaceuticals,Inc.)與CFA(Sigma Aldrich)，或是甘露糖醇與CFA(作為負對照)來免疫。GA溶液用杜貝可氏(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝液稀釋成5mg/mL。接而藉由使混合稀釋的GA溶液(5mg/mL)與CFA(1：1)直到徹底乳化來製備劑量溶液。各隻小鼠接受0.1mL的總注射體積(250μg GA)。於第0天進行小鼠免疫。於免疫之後第10天經由頸椎脫位術來犧牲經免疫的動物。於淨化器潔淨工作台上無菌移除腋部及膕部的淋巴結，以及移轉至含有大約5mL無菌的RPMI-1640培養基之無菌培養皿內。以~5mL的RPMI培養基來清洗LN三次，以及用注射器之柱塞來按壓LN以單離LN細胞。將細胞懸浮液移轉至無菌的50mL錐形管內，用大約40mL的RPMI培養基清洗，於大約4℃下、以大約200 x g離心10分鐘，以及再懸浮於RPMI 1640培養基內用於細胞計數。將細胞懸浮液於大約4℃下、以大約200 x g離心10分鐘，以及再懸浮於冰冷濃化的(enriched)DCCM-1培養基內。LN細胞(2.5x10⁶細胞/cm²)予以平盤培養於48井組織培養平盤的井中以及用GA或對照予以刺激。

在大約37℃的潮濕CO₂孵化器孵育指示的時間之後，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Cat.#74104)以從經處理的細胞來單離總RNA。細胞溶解於RNA溶解緩衝液內，移轉至Qiagen旋轉管柱、清洗，以及用DEPC-處理的水洗提RNA離開管柱。各個RNA樣本使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems，Cat. #4368814)來合成cDNA。使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，Cat.# 4304437)及標的細胞介素及參考內部對照之特異性引子/探針進行PCR反應。小鼠細胞介素IL-2(Cat.# 4331182；ID Mm00434256_m1)，IL-4(Cat.# 4331182；ID Mm00445259_m1)，IL-5(Cat.# 4331182；ID Mm00439646_m1)，IFN-γ(Cat.# 4331182；ID Mm01168134_m1)，IL-10(ID Mm00439614_m1)，以及TNF-α(Mm00443260_g1)之引子/探針係得自於Life Technologies。細胞介素mRNA的表現使用即時PCR系統(7500，Applied Biosystems)進行定量分析。

實驗1(組別1A小鼠)中使用的刺激及mRNA的表現結果顯示於表2-5內。以下列方式來計算各細胞介素之倍數變化vs對照：1)將小鼠細胞介素擴增物的位準正規化成同樣的樣本之GAPDH的內部探針，以及2)將細胞介素的mRNA表現位準除以觀察到的DCCM1(培養基)對照位準。(DCCM1來自Beit Haemek Ltd.；Cat.號碼05 010 1A)。2小時組沒有進行MBP處理。(MBP來自Bachem；Cat號碼H-1964.0001)關於各個評估的時間，研究DCCM1及與DCCM1比較，亦即2小時代表2小時與DCCM1比較，4小時=4小時等等，以及作為各個時點之代表性的對照。

表2顯示於指示的刺激之後2、4、6，以及24小時，LN細胞內偵測的小鼠IL-2 mRNA位準。於此等時點觀察到，與DCCM1負對照相比，mIL-2 mRNA表現增加大約5.3倍至大約20.8倍，且最大的增加在6小時的時候。在24小時的時候，增加量已經下降至比2小時的時候觀察到的更低。

表3顯示於指示的刺激後2、4、6，以及24小時，LN細胞內偵測的小鼠IL-4 mRNA位準。於此等時點觀察到，與DCCM1對照相比，mIL-4 mRNA表現增加大約10倍至大約16.5倍，且最大的增加在刺激之後6小時的時候。

表4顯示於指示的刺激之後2、4、6，以及24小時，LN細胞內偵測的小鼠IL-5 mRNA位準。於此等時點觀察到，與DCCM1對照相比，mIL-5 mRNA表現增加大約1.6倍至大約5.1倍，且最大的增加在6小時的時候。在24小時的時候，增加量已經下降至1.9，和2小時的時候觀察到的差不多。

表5顯示於指示的刺激後2、4、6，以及24小時，LN細胞內偵測的小鼠INF-γ mRNA位準。於此等時點觀察到，與DCCM1對照相比，INF-γ表現增加1.3倍至大約4.6倍。在6小時之後，觀察到增加量值矯直(level off)。

時間過程研究亦使用由樣本單離的總RNA來測量mIL-10及mTNF-α的mRNA的表現位準。結果顯示用GA刺激後之LN細胞的mRNA位準沒有顯著增加(資料未顯示)。用GA來處理之LN細胞mRNA位準的倍數變化和假(mock)-處理的對照(DCCM1)之LN細胞內mRNA位準的倍數變化作比較，在刺激後6及24小時二者都是大約1。

於實驗2(使用組別2A小鼠；關於設計見表1)方面，於如同實驗1使用的相似條件下進行，將46井及98井平盤格式(資料未顯示)作比較。測量46-井平盤格式(RNeasy Mini Kit,Qiagen)及98井平盤格式(SV 96 Total RNA Isolation System,Promega)，在用GA(10μg/ml)、MBP(10μg/ml)，及ConA(2.5μg/ml)予以刺激後4小時及6小時二者之mIL-2及mIL-4 mRNA位準，以及與DCCM1對照比較。觀察到GA處理的樣本4小時之IL-2的表現分別為48井和96井格式的對照之IL-2的表現之16.3和29.5倍，以及於6小時之IL-2的表現分別為48井和96井格式的對照之21.0和41.7倍。觀察到GA處理的樣本4小時之IL-4的表現分別為48井和96井格式的對照之IL-4的表現之8.5和8.0倍，以及於6小時之IL-4的表現分別為48井和96井格式的對照之14.0和16.5倍。

實驗3(組別3A和4A小鼠；關於設計見表1)方面，測量一系列濃度的GA刺激的LN細胞之mIL-2 mRNA。表6顯示實驗3的結果。此研究包括來用第二批的GA，Cop(Copaxone，Teva Pharmaceuticals USA，Inc.，發表的商業產品)刺激的樣本。Cop樣本組容許可以比較用不同批的GA來免疫及刺激，對於細胞介素生產的效應。

表6顯示於指示的刺激後6小時，LN細胞內偵測的mIL-2 mRNA位準。如前，以下列方式來計算倍數變化vs對照：1)將小鼠細胞介素擴增物的位準正規化成同樣的樣本之GAPDH的內部探針，以及2)將細胞介素的mRNA表現位準除以觀察到的對GA刺激起反應之DCCM1對照位準。實驗3方面，使用96-井平盤格式，以及使用SV 96 Total RNA Isolation System(Promega)來進行單離RNA。免疫作用of組別3A及4A are表內說明1。

圖1A及1B為比較實驗3中偵測的mIL-2 mRNA表現位準的圖(表6內說明)。mIL-2 mRNA用Cop及GA(Mylan GMA)來同等地刺激。Y軸：mIL-2線性的mRNA倍數變化。X軸：log Cop及GA(Mylan GMA)的濃度值。使用對數模式來執行資料集的最佳配適。當使用所有的濃度執行迴歸時，GA(Mylan GMA)及Cop處理的樣本之斜率值分別為6.779及5.6834，當使用5個濃度(1至15μg/mL)執行迴歸時，GA(Mylan GMA)及Cop處理的樣本之斜率值分別為6.214及5.962。圖1A及1B中的圖顯示當免疫作用使用第一批的GA時，用漸增的濃度第一批或第二批GA來刺激之經處理的細胞之IL-2 mRNA，係以劑量依賴性方式增加。

其他的實驗顯示用漸增濃度的第一批GA(GMA，Mylan Pharmaceuticals，Inc.)或第二批GA(Copaxone，Teva Pharmaceuticals USA，Inc.)(資料未顯示)，來自經處理細胞之分泌的IL-2係以劑量依賴性方式的增加。此劑量依賴性反應在測試和參考化合物方面是一致的，不受是否使用 Copaxone®或Mylan GMA作為免疫抗原的支配。

於第二系列的實驗中，評估用10μg/mL GA刺激後四和六小時的LN細胞內之mIL-2、mIL-4、mIL-5、mIL-10和mIFN-γ mRNA的表現。結果指示出來自用GA免疫的小鼠之GA-刺激的LN細胞造成細胞介素mRNA位準之特異性增加。實驗設計顯示於表7內。

組別1B動物為經由足墊注射250μg GA和CFA，或是甘露糖醇和CFA(作為負對照)免疫的雌性(SJL/J x BALB/C)F1雜交種(Jackson Laboratory)小鼠。劑量溶液係藉由混合稀釋的GA溶液(5mg/mL)和CFA(1：1)來製備。各隻小鼠接受1mL的總注射體積(250μg GA)。於第0天進行小鼠免疫。於免疫之後第10天經由頸椎脫位術來犧牲經免疫的動物。移除並單離來自經免疫小鼠的淋巴結。LN細胞(2.5x10⁶細胞/cm²)予以平盤培養於48井組織培養平盤的井中用於GA刺激。

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Cat.#74104)以從經處理的細胞單離總RNA。細胞溶解於RNA溶解緩衝液內，移轉至Qiagen旋轉管柱、清洗，以及用DEPC處理的水洗提RNA離開管柱。各個RNA樣本使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems,Cat.#4368814)來合成cDNA。使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems,Cat.# 4304437)及標的細胞介素及參考內部對照之特異性引子/探針來進行PCR反應。

細胞介素mRNA的表現在4及6小時之後，使用即時PCR系統(7500，Applied Biosystems)進行定量分析。

表8-12顯示使用於組別1B小鼠的刺激(表7內說明)，以及獲得的mRNA的表現結果。以下列方式來計算各細胞介素之倍數變化vs對照：1)將小鼠細胞介素擴增物的位準正規化成同樣的樣本之18S RNA或GAPDH mRNA的內部探針，以及2)將細胞介素的mRNA表現位準，除以觀察到的對DCCM1(培養基)對照起反應、正規化成同樣的管家基因mRNA的位準。

表8顯示於指示的刺激後4和6小時的時候，LN細胞內偵測的mIL-2 mRNA位準。於此等時點觀察到與DCCM-1刺激的對照相比，來自GA免疫的小鼠(組別1B)之GA-刺激的細胞內，mIL-2 mRNA位準增加至少大約10倍。GA-刺激不會導致來自甘露糖醇+CFA免疫的對照小鼠(組別2B)的細胞內，偵測到的mIL-2 mRNA之實質增加。再者，ConA正對照細胞內mIL-2 mRNA表現會實質增加，但是MBP負對照細胞內之mIL-2 mRNA表現不會增加。GA刺激的細胞內mIL-2 mRNA表現，在4小時的時候觀察到比6小時的時候更大的增加。內部對照(參考基因)為18S rRNA。

表9顯示於指示的刺激後4和6小時的時候，LN細胞內偵測的mIL-4 mRNA位準。於此等時點觀察到與DCCM-1刺激的對照相比，來自GA免疫的小鼠(組別1B)之GA-刺激的細胞內，mIL-4 mRNA位準增加至少8倍。GA刺激不會導致來自甘露糖醇+CFA免疫的對照小鼠(組別2B)的細胞內，偵測的mIL-4 mRNA之實質增加。再者，ConA正對照細胞內mIL-4 mRNA表現會實質增加，但是MBP負對照細胞內之mIL-4 mRNA表現不會增加。內部對照(參考基因)為18S rRNA。

表10顯示於指示的刺激後4和6小時的時候，LN細胞內偵測的mIL-5 mRNA位準。於此等時點觀察到與DCCM-1刺激的對照相比，來自GA免疫的小鼠(組別1B)之GA-刺激的細胞內，mIL-5 mRNA位準增加至少4倍。GA刺激不會導致來自甘露糖醇+CFA免疫的對照小鼠(組別2B)的細胞內，偵測的mIL-5 mRNA之實質增加。再者，ConA正對照細胞內mIL-5 mRNA表現會實質增加，但是MBP負對照細胞內之mIL-5 mRNA表現不會增加。此實驗的資料沒有正規化成參考基因。

表11顯示於指示的刺激後4和6小時的時候，LN細胞內偵測的mIL-10 mRNA位準。於此等時點觀察到與DCCM-1刺激的對照相比，來自GA免疫的小鼠(組別1B)之GA刺激的細胞內，mIL-10 mRNA位準沒有實質增加。內部對照(參考基因)為GAPDH。

表12顯示於指示的刺激後4和6小時的時候，LN細胞內偵測的mIFN-γ mRNA位準。於此等時點觀察到與DCCM-1刺激的對照相比，來自GA免疫的小鼠(組別1B)之GA刺激的細胞內，mIFN-γ mRNA位準增加至少大約2倍至多達大約7倍。GA刺激不會導致來自甘露糖醇+CFA免疫的對照小鼠(組別2B)的細胞內，偵測的mINF-γ mRNA之實質增加。再者，ConA正對照細胞內mINF-γ mRNA表現會實質增加，但是MBP負對照細胞內之mINF-γ mRNA表現不會增加。內部對照(參考基因)為GAPDH。

圖2提供表8至12內提出的細胞介素mRNA的表現增加之摘要。

實施例II.來自三個小鼠品系的T細胞用醋酸格拉替雷刺激後之細胞介素的分泌

此實施例說明實驗，執行此等實驗以評估三個額外的小鼠品系供用於獲得的GA特異性T細胞的GA效力分析。平行測試由CD-1、BALB/cByJ，及C57BL/10J小鼠單離的GA-特異性T細胞，對擬體內GA刺激起反應之九個細胞介素(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α，以及CXCL1，亦提及為KC)之分泌動力學。將藉由蹠內注射來免疫的LN細胞及藉由下肢注射來免疫的細胞之細胞介素分泌作比較。

表13顯示實驗的設計。

雌性CD-1、BALB/cByJ以及C57BL/10J小鼠(每種14隻，分別來自Hilltop Laboratories，Jackson Laboratory，以及Jackson Laboratory)係用如表13中指出的GA(GMA，Mylan Pharmaceuticals，Inc.，製備於DPBS內)或是甘露糖醇對照、經由蹠內的注射或下肢注射來免疫。藉由使用27-G， ½英吋針之1mL注射器、注射至4隻足墊內來免疫8週大的動物。關於蹠內的注射，各隻小鼠接受0.1mL的總注射體積(大約10μL至各個前足墊內及40μL至各個後足墊內)。關於下肢的皮下注射，各隻小鼠接受0.1mL的總注射體積(大約25μL至各個前下肢內，及25μL至各個後肢的踝內)。

免疫後十天，經由頸椎脫位術來犧牲經免疫的動物。移除來自經免疫小鼠的腋部及膕部的淋巴結，且按組別并合至含有5mL冰冷的、無菌的RPMI-1640培養基之培養皿內。以5.0mL冰冷的、無菌的RPMI 1640培養基來清洗完整的淋巴結三次。用無菌的注射器之柱塞末端來按壓LN以單離LN細胞。細胞懸浮液首先通經100μm耐綸細胞粗濾器，然後用40mL冰冷的RPMI-1640培養基清洗一次。於4℃下、以ca.200 x g離心10分鐘之後，以40mL RPMI-1640培養基予以再懸浮細胞沈澱物(pellet)用於細胞計數。使用錐蟲藍排除法來決定懸浮液內活細胞之細胞密度。在細胞計數之後，於4℃下、以ca.200 x g離心LN細胞10分鐘，以及以1.0 x 10⁷細胞/mL的細胞密度再懸浮於濃化的DCCM-1培養基(2mM GlutaMax，1x抗生素-抗黴菌劑，55μM 2-巰乙醇，1mM MEM丙酮酸鈉溶液，以及100μM MEM非必需胺基酸溶液配於DCCM-1培養基，Beit Haemek Ltd.；Cat.號碼05 010 1A)內。LN細胞可平盤培養於24井組織培養平盤中用於藥物刺激。

用GA免疫(組別1、2、3、5、7以及8)之各組的初級LN細胞(0.5mL，5x10⁶細胞/井)係用四種濃度的GA溶液 (使用於免疫作用之相同批次(batch)的Mylan GMA，0.5mL，終濃度0.5、1.0、2.5以及10μg/mL)來刺激。來自甘露糖醇免疫的動物(組別3、6以及9)之各組的LN細胞係使用相同的程序來處理二個GA稀釋的樣本(0.5和1.0μg/mL，或是2.5和10μg/mL GA)。

在37℃的潮濕5%CO₂孵化器孵育21小時之後，於指定的時點收穫培養基。於4℃下、以ca.200 x g離心10分鐘來移除細胞碎屑。於收集那天，藉由使用偵測Th1細胞介素(IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-1β、TNF-α、CXCL1)以及Th2細胞介素(IL-4、IL-5以及IL-10)之小鼠的TH 1/TH 2 9-Plex Tissue Culture Kit(Meso Scale Discovery；Cat號碼K15013B-2，Lot #：K0032839)，進行ELISA來決定經處理細胞之細胞介素的分泌。關於IFN-γ，培養基亦在45小時使用小鼠IFN-γ Tissue Culture Kit(Meso Scale Discovery；Cat號碼K152AEB-2，Lot# K0033074)予以分析。

製備對照樣本以監測分析的性能，包括用刀豆球蛋白A(ConA)，非特異性T細胞刺激物作為正對照，以及髓磷脂鹼性蛋白(MBP)作為負對照來刺激LN細胞。在正對照方面，用0.5mL的ConA(5μg/mL)來處理0.5mL的LN細胞(5x10⁶細胞/井)。在負對照方面，用0.5mL的MBP(20μg/mL)來處理0.5mL的LN細胞(5x10⁶細胞/井)。用假刺激(mock stimulation)(濃化的DCCM1培養基)之LN細胞係使用來監測細胞介素的背景位準。

在細胞介素的分析方面，於MULTI-SPOT平盤內或是SINGLE-SPOT平盤內孵育校正標準或是樣本，以及各細胞介素結合至其之對應的捕獲抗體。所有的測試樣本都以二重複(duplicate)來進行。使用標記以MSD SULFO-TAG^TM試劑的細胞介素特異性偵測抗體，來定量各細胞介素其之不同位置的量。由MSD SECTOR Imager 6000捕獲來自各井之各個位置、固定的SULFO-TAG^TM標記的複合體電化學發光信號，其會產生與測試樣本內捕獲的細胞介素量成比例之信號。測試樣本之內的細胞介素的位準係透過內插法而從校正曲線導出，校正曲線具有已知濃度的校正標準，使用MSD套組所提供的試劑。套組係根據製造商的協定來使用。

表14顯示測試的三個小鼠品系中各者之GA刺激的LN細胞所分泌的細胞介素。資料係表達為，經處理的細胞培養基對於對照DCCM1培養基內細胞介素濃度之反應比。

如表14內顯示，IL-2、IL-4、IL-5、IL-10以及IFN-γ的分泌似乎對GA刺激為特異性的，以及顯示隨著GA濃度有劑量依賴性的增加。於來自GA免疫的動物之GA刺激的LN細胞內，此等細胞介素的位準比沒有刺激時相同的細胞內的位準更高。再者，於甘露糖醇免疫的對照動物單離的細胞內，沒有觀察到GA處理的細胞內之細胞介素的分泌。

來自BALB/cByJ小鼠之LN細胞對GA刺激起反應分泌的IL-2、IL-4、IL-5以及IL-10(組別4-6)，與來自CD-1小鼠之LN細胞的分泌相似或是更高(組別1-3)。雖然在~21小時GA刺激之後，於CD-1之LN細胞內之IFN-γ的分泌是比 BALB/cByJ細胞內更高的，但是來自二種品系在45hr GA孵育後的LN細胞之IFN-γ的分泌是相似的。來自三種小鼠品系任一者的細胞在GA刺激後，IL-12、TNF-α和KC的分泌沒有偵測到劑量反應。當藉由蹠內注射致敏細胞時，來自BALB/cByJ與CD-1小鼠品系之LN細胞，偵測到IL-1β之劑量反應。

BALB/cByJ細胞以劑量依賴性方式、對GA反應而分泌IL-4。藉由蹠內注射致敏的細胞和藉由下肢注射致敏的細胞對GA的反應為相似的。

來自三種小鼠品系中各者的LN細胞以劑量依賴性方式、對GA反應而分泌IL-2。BALB/cByJ細胞偵測到最高的IL-2反應。來自下肢GA注射致敏的動物之BALB/cByJ細胞似乎有比蹠內注射致敏的細胞更高的反應。於C57BL/10J小鼠方面，經由蹠內注射致敏的LN細胞與藉由下肢注射致敏的細胞，對GA刺激的IL-2反應為相似的。

來自三種小鼠品系中各者的LN細胞以劑量依賴性方式、對GA反應而分泌IFN-γ。一般說來，於所有的三種品系中，藉由蹠內GA注射致敏的細胞與藉由下肢注射致敏的細胞似乎有相似的反應，或者比藉由下肢注射致敏的細胞更高的反應。

BALB/cByJ細胞與CD1細胞以劑量依賴性方式、對GA反應而分泌IL-5。IL-5對GA的反應為劑量依賴性，以及藉由蹠內注射致敏的細胞比藉由下肢注射致敏的細胞更高。

BALB/cByJ細胞與CD1細胞以劑量依賴性方式、對GA反應而分泌IL-10。IL-10對GA的反應為劑量依賴性，以及藉由蹠內注射致敏的細胞比藉由下肢注射致敏的細胞更高。

實施例III.測量用醋酸格拉替雷挑戰以後，來自經醋酸格拉替雷免疫的CD-1、BALB/cByJ及SJL/J小鼠品系的淋巴結細胞內，反應之生物標記mRNA之醋酸格拉替雷的效力分析

本發明的GA效力分析使用來自GA免疫的CD-1、BALB/cByJ，以及SJL/J小鼠品系(分別來自Hilltop Laboratory、Jackson Laboratory，及Jackson Laboratory)之T細胞。從GA免疫小鼠獲得的LN細胞顯示出在刺激後6小時，對GA刺激起反應而實質增加的細胞介素的mRNA位準。

表15顯示三種品系各者的免疫作用之實驗設計。於第0天，用250μg GA(GMA，Mylan Pharmaceuticals,Inc.)和CFA來免疫小鼠。GA溶液(20mg/mL)用杜貝可氏(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝液稀釋成5mg/mL。用劑調配物由相等體積稀釋的GA溶液(5mg/mL)和CFA溶液所組成，，使其混合直到徹底乳化。將動物稱重以及指派組別。藉由注射至4隻足墊內來對動物給藥。每隻動物的注射體積為0.1mL(大約10μL至各個前足墊內，以及40μL至各個後足墊內)。

表16顯示關於刺激來自經免疫的小鼠的LN細胞之實驗設計。於免疫之後第10天經由頸椎脫位術來安樂死經免疫的動物。從動物單離淋巴結細胞且用表16所示之髓磷脂鹼性蛋白(MBP，負對照)、刀豆球蛋白A(ConA，正對照)或是GA進行處理。於淨化器潔淨工作台上無菌移除腋部及膕部的淋巴結。將淋巴結移轉至含有大約5mL無菌的RPMI 1640培養基之無菌培養皿內。以~5mL的RPMI培養基來清洗LN三次，以及用注射器之柱塞來按壓LN以單離LN細胞。將細胞懸浮液移轉至無菌的50mL錐形管內，及用大約40mL的RPMI培養基清洗，於大約4℃下、以大約200 x g離心10分鐘，以及再懸浮於RPMI 1640培養基內用於細胞計數。將細胞懸浮液於大約4℃下、以大約200 x g離心10分鐘，以及再懸浮於冰冷濃化的DCCM-1培養基內。播種細胞於96井組織培養平盤中。

由GA免疫的動物單離之LN細胞用表16和17內指示的GA(GMA，Mylan Pharmaceuticals。Inc.)濃度來刺激。用2.5μg/mL刀豆球蛋白(concavalin)A(ConA，非特異性T細胞刺激物)處理LN細胞來製備正對照。髓磷脂鹼性蛋白(MBP，10μg/mL)和濃化的DCCM1培養基作為負對照。所有組別的細胞各自用相同的GA批來刺激。各反應以三重複(triplicate)進行。

在37℃的潮濕CO₂孵化器孵育6小時之後，溶解細胞以單離RNA。根據製造商的協定使用SV 96 Total RNA Isolation System(Promega,Cat.#Z3500)而從經處理的LN細胞單離總RNA。用磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗細胞一次，以及溶解於RNA溶解緩衝液內。溶解產物移轉至SV 96結合平盤。用RNA清洗溶液清洗樣本以及用DNase來處理。用無核酸酶的水洗提總RNA離開結合平盤。

各個RNA樣本作三重複(triplicate)、根據製造商的協定(Life Technologies)使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies，從前為Applied Biosystems，Cat.#4368814)來合成cDNA。反轉錄(RT)係藉由Thermal Cycler(2720，Life Technologies)執行如下：

在反轉錄酶反應完成之後，cDNA樣本直接使用於即時PCR以測量經刺激的細胞生產的反應之生物標記mRNA位準。為了測量反應之生物標記mRNA位準，使用得自於Life Technologies的TaqMan Universal PCR Master Mix(Cat.# 4304437)以及小鼠細胞介素IL-2(Cat.# 4331182；ID Mm00434256_m1)，IL-4(Cat.# 4331182；ID Mm00445259_m1),IL-5(Cat.# 4331182；ID Mm00439646_m1)，IL-10(Cat.# 4331182；ID Mm00439614_m1)，IL-13(Cat.# 4331182；ID Mm00434204_m1)，IFN-γ(Cat.# 4331182；ID Mm01168134_m1)及TNF-α(Cat.# 4331182；ID Mm00443260_g1)引子/探針。參考基因(內部對照)小鼠的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，Cat.# 4352339E)亦得自於Life Technologies。全部用於標的基因的探針含有FAM染料，以及用於內部對照的探針含有VIC®/MGB染料。樣本會使用即時PCR系統(7500，Applied Biosystems)於96井平盤內製備以及進行。此系統藉由測量螢光發射在PCR反應的期間連續不斷地增加，而能直接偵測PCR產物形成。使用一種相對定量方法來分析GA處理的樣本與未處理的對照(濃化的DCCM1處理的)樣本相比，小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、 IL-13、IFN-γ以及TNF-α表現的變化。即時PCR程式為：

將小鼠細胞介素擴增物的位準(IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、mIFN-γ以及TNF-α)正規化成來自同樣的樣本之內部探針位準(GAPDH)。使用下列方程式來計算，與對照樣本相比，對GA刺激起反應之相對增加： △C _T=C _{T_標的}-C _{T_參考}

△△C _T=△CT _{_處理}-C _{T_VC}

增加的反應=2^-△△CT

該處

標的=小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ以及TNF-α

參考=GAPDH

處理=用GA、ConA或MBP刺激

VC(載體對照)=用濃化的DCCM1孵育

平均值的計算：

標準偏差：

該處X=個別資料及n=資料點的數量。

變異係數(CV，精確度)：

結果總結於表17內。

表17中的資料係繪製為圖3至13。所有三種小鼠品系之LN細胞內之許多反應之生物標記mRNA，觀察到GA刺激濃度對mRNA位準效應之劑量依賴性效應。

實施例IV.驗證即時聚合酶連鎖反應(PCR)方法用於定量測量GA刺激GA免疫小鼠之淋巴結細胞後的細胞介素mRNA位準

驗證即時聚合酶連鎖反應(PCR)方法，用於定量測量SJL/J小鼠淋巴結細胞於GA刺激後的細胞介素mRNA 位準。

使用一個批次(batch)的GA(Mylan GMA)來實施三個實驗。藉著用6種濃度(0.3至20μg/mL)的GA於37℃孵育6小時來刺激初級LN細胞。從用GA或對照刺激的LN細胞來單離總RNA。由RNA合成cDNA以及藉由即時PCR方法來定量測量七種小鼠細胞介素，IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、干擾素(IFN)-γ以及腫瘤壞死因子(TNF)-α之mRNA位準。

GA免疫的小鼠之LN細胞對GA反應，誘導五種細胞介素，IL-2、IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的mRNA位準。mRNA位準以劑量依賴性方式增加。ConA刺激後(正對照)IL-2 mRNA位準的增加超過最高濃度的GA(20μg/mL)刺激誘導的增加。負對照MBP沒有顯著的誘導細胞介素mRNA位準。NTC(無模板對照)樣本之擴增在可偵測的位準以下。表18顯示實驗設計。

藉由使用27-G，½英吋針之1mL注射器、注射至4隻足墊內來免疫8-9週大的雌性SJL/J小鼠。各隻小鼠接受總注射體積0.1mL、乳化於CFA內的GMA(大約10μL至各個前足墊內及40μL至各個後足墊內)。於第0天免疫動物。在注射之後，將動物放回其等的籠子內以及每個籠子住少於6隻動物。

於免疫之後第10天經由頸椎脫位術來犧牲經免疫的動物。移除來自經免疫小鼠的腋部及膕部的淋巴結，并合，及放置至含有5mL冰冷的、無菌的RPMI-1640培養基之無菌培養皿內。以5.0mL無菌的RPMI 1640培養基來清洗完整的淋巴結三次，以及用無菌的注射器之柱塞來按壓LN以單離LN細胞。細胞懸浮液首先通經100μm耐綸細胞粗濾器，然後用40mL冷的RPMI-1640培養基清洗一次。於4℃下、以大約200 x g離心10分鐘之後，以40mL的RPMI-1640培養基予以再懸浮細胞沈澱物用於第二次清洗。於4℃下、以大約200 x g離心10分鐘之後，以40mL的DCCM-1培養基予以再懸浮細胞沈澱物用於細胞計數。使用錐蟲藍排除法來決定懸浮液內活細胞之細胞密度。在細胞計數之後，LN細胞以7.5x10⁶細胞/mL的密度再懸浮於濃化的DCCM-1培養基內。將LN細胞(0.12mL)平盤培養於96井組織培養平盤的每個井中。

使用濃化的DCCM-1培養基作為稀釋液來製備GA(Mylan GMA)稀釋物。將GA稀釋物(0.12mL)添加於指派的96井組織培養平盤的井中。將由免疫的動物單離之相同體積的LN細胞(0.12mL)添加至指派的井中。於相同的分析內始終會執行正對照和負對照，正對照和負對照係用2.5μg/mL ConA和10μg/mL MBP來處理LN細胞。使用假刺激協定(濃化的DCCM1培養基)之LN細胞來監測細胞介素的背景mRNA位準。表19內總結使用Mylan GA之刺激作用。平盤在37℃的潮濕5%CO₂孵化器孵育6小時。

孵育的時間結束時，藉由抽吸從刺激的細胞移除培養基，以及使用Qiagen或是Promega溶解緩衝液來溶解細胞。將溶解產物移轉至RNeasy Mini column(Qiagen)或是SV 96 Binding Plate(Promega)的井內，用於RNA單離和cDNA合成。所有的測試樣本作三重複(triplicate)。

使用SV 96 Total RNA Isolation System(Promega,Cat.號碼Z3505)來單離總RNA。析程序係根據製造商的協定來進行。RNA樣本到使用之前一直儲存於-70℃。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems，Cat.號碼4368814)來合成cDNA。分析程序係根據製造商的協定來進行。

使用的小鼠細胞介素引子/探針為IL-2(Cat.# 4331182；ID Mm00434256_m1)，IL-4(Cat.# 4331182；ID Mm00445259_m1)，IL-5(Cat.# 4331182；ID Mm00439646_m1)，IL-10(Cat.# 4331182；ID Mm00439614_m1)，IL-13(Cat.# 4331182；ID Mm00434204_m1)，IFN-γ(Cat.# 4331182；ID Mm01168134_m1)以及TNF-α(Cat.# 4331182；ID Mm00443260_g1)。參考基因引子/探針為小鼠的GAPDH(LifeTechnologies Cat.號碼4352339E)。

使用多道移液器(multiple channel pipette)吸出cDNA樣本至指派的井內，井內含有TaqMan Universal PCR Master Mix(LifeTechnologies Cat.# 4304437)以及標的基因引子和探針。於4℃下、以2000rpm離心平盤2分鐘，以使內含物向下旋轉以及消除氣泡。樣本係使用根據製造商的建議來使用Life Technologies即時PCR系統(以前為Applied Biosystems；Model號碼7500)、於96井平盤內製備及運轉。參考基因之混和物係以相同的方式使用參考基因引子來製備。

使用相對定量方法來分析GA處理的樣本與未處理的對照(濃化的DCCM-1培養基)樣本相比，mIL-2、mIL-4、mIL-5、mIL-10、mIL-13、mIFN-γ以及TNF-α表現的變化，其使用下列的程式：

將小鼠細胞介素擴增物的位準正規化成同樣的樣本之內部探針位準(GAPDH)。使用下列方程式來計算，與對照樣本(濃化的DCCM1樣本)相比，對GA刺激起反應之相對增加：C_{T_標的}和C_{T_參考}平均值的計算：該處，標的：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ以及TNF-α

參考：GAPDH

各平均C_T值之標準偏差的計算：

該處SD#=C_{T_標的}或C_{T_參考}的SD，X=個別的資料以及n=資料點的數量。

從平均C_T值計算△C_T值：△C _T=C _{T_標的}-C _{T_參考}

△C_T值之標準偏差的計算： SD_△CT=(SD² _標的+SD² _參考)^½

該處Y^½為Y的平方根以及Y=SD² _標的+SD² _參考

△△C_T值之計算：△△C _T=△CT _{_處理}-C _{T_VC}

該處，處理：用GA、ConA或MBP孵育

VC(載體對照)：用DCCM-1孵育

△△C_T值之標準偏差的計算：△△C_T值之標準偏差與△C_T值之標準偏差相同。

誘導倍數與誘導範圍的計算：誘導倍數=

誘導範圍=2 ^-A 至2 ^-B

該處A=△△C_T+SD_△△CT以及B=△△C_T-SD_△△CT

除非明確說明，否則計算(平均值、SD和關聯的計算)係使用全浮式(full floating)小數點計算、於Microsoft Excel® Version 2007試算表內執行。表內的一些數字為圓形的(rounded)用於顯示。根據此等計算，使用離平均值之差異百分比(Percent Difference from the Mean Method)決定離群值。從各重複C_T值減去平均C_T值，以及接而除以平均C_T值且乘上100，來計算離平均值之差異百分比。當百分比4.0%(絕對值)時，該重複為離群值。當二個重複的百分比4.0%以及第三個重複的百分比差異0.5%時，指定最大的絕對值為離群值。當二個重複的百分比4.0%以及第三個重複的百分比差異<0.5%時，所有的值均使用於計算。

表20內顯示分析運轉完成的樣本分析。

^a：失敗：由於負對照MBP沒有通過接受準則。

^b：失敗：由於正對照ConA沒有通過接受準則。

^c：因先前失敗的PCR運轉而重複PCR運轉。

產生小鼠IL-2、IL-4以及參考基因GAPDH之代表性的擴增圖。7500軟體v2.0.6於擴增曲線的指數生長期自動確定各閾值。

所有測試的細胞介素於假刺激LN細胞(用DCCM-1孵育)內偵測到低位準的mRNA表現位準。用GA處理的LN細胞內IL-2、IL-4、IL-5、IL-13以及IFN-γ的mRNA位準，與DCCM-1對照相比是增加的，以及是以劑量依賴性方式和飽和的增加。SJL/J小鼠之體外GA刺激反應對於IL-10和TNF-α的mRNA位準，為微弱的誘導或是沒有誘導作用。

小鼠IL-2 mRNA的表現

於所有三個實驗中用GA來刺激LN細胞會誘導小鼠IL-2 mRNA。於Exp 1、2及3中，20μg/mL GA的刺激後之IL-2 mRNA之誘導作用分別為31.7、27.8以及42.0倍(表21)。

小鼠IL-4 mRNA表現

所有三個實驗中用GA來刺激LN細胞會誘導小鼠IL-4 mRNA。於Exp 1、2及3中，20μg/mL GA的刺激後之IL-4 mRNA之誘導作用分別為41.3、11.8及27.6倍(表22)。

小鼠IL-5 mRNA表現

所有三個實驗中用GA來刺激LN細胞會誘導小鼠IL-5 mRNA。於Exp 1、2及3中，20μg/mL GA的刺激後之IL-5 mRNA之誘導作用分別為5.2、5.3及15.2倍(表23)。

小鼠IL-10 mRNA表現

與假刺激對照相比，於任何實驗中都沒有觀察到LN細胞對GA刺激起反應之小鼠IL-10 mRNA的誘導作用(表24)。

小鼠IL-13 mRNA表現

所有三個實驗中用GA來刺激LN細胞會誘導小鼠IL-13 mRNA。於Exp 1、2及3中，20μg/mL的刺激後之IL-13 mRNA之誘導作用分別為17.6、21.3及33.9倍(表25)。

小鼠IFN-γ mRNA表現

於LN細胞內觀察到對體外GA刺激起反應之微弱的IFN-γ mRNA誘導作用。來自三個實驗的LN細胞對GA刺激起反應顯示出相似的模式。用2.5至10μg/mL GA來刺激後，IFN-γ mRNA的誘導作用達到2倍。然而，用20μg/mL GA來刺激後，所有的三個實驗之IFN-γ mRNA的表現位準下降至相似於0.3μg/mL GA刺激的刺激後觀察到的表現位準的位準(表26)。

小鼠TNF-α mRNA表現

與假刺激對照相比，LN細胞用GA刺激後沒有觀察到TNF-α mRNA的誘導作用(全體<2倍)(表27)。

因而，LN細胞內對GA刺激起反應會誘導七種細胞介素中的五種細胞介素mRNA位準，IL-2、IL-4、IL-5、IL-13以及IFN-γ。IL-10和TNF-α mRNA的表現沒有顯著地變化。所有的PCR運轉之NTC(無模板對照)樣本之擴增均低於可偵測的位準。測試所有組別的LN細胞其等對於ConA和MBP之反應。ConA處理的LN細胞之所有的細胞介素的mRNA之表現位準(2.5μg/mL)均大於用最高濃度(20μg/mL)的GA刺激後之表現位準，除了IL-10 mRNA(Exp 1，表24)和TNF-α(Exp 3，表27)之外。所有的PCR運轉對MBP處理起反應之細胞介素mRNA之表現位準均為2倍，除了IL-4(Exp 1，表22)和IL-5(Exp 3，表23)之外。重複三個PCR運轉(ConA為IL-10及MBP為IL-4 & IL-5)，以及不管是對ConA或MBP處理的反應(資料未顯示)，都獲得與原始運轉的結果可相比之相似的結果，此情況暗示著結果和分析為前後一致的。此研究的結果顯示出獨特的細胞介素誘導剖析(可誘導性vs.非可誘導性)，以及三個獨立的實驗測試的細胞介素前後一致的誘導量值(溫和至顯著的)，此情況暗示著即時PCR方法為一種用於GA免疫小鼠的LN細胞在GA刺激後之細胞介素mRNA位準的定量測量，之再現性的方法。

結論

驗證一種高度敏感的定量即時PCR方法為用於GA免疫小鼠的LN細胞於體外GA刺激後剖析和定量細胞介素mRNA。藉由使用GAPDH作為管家基因之比較性C_T方法來進行相對的定量分析。用不同濃度的GA來刺激GA免疫小鼠之LN細胞，與未刺激的LN細胞內之該等相比，導致對IL-10，TNF-α沒有誘導作用，微弱的IFN-γ誘導作用，溫和的IL-5誘導作用，以及穩健的IL-2、IL-4以及IL-13mRNA位準誘導作用。該結果指示該方法對於測量LN細胞對GA刺激起反應之細胞介素mRNA表現為敏感的、可再現的，以及有效的。

實施例V.使用即時聚合酶連鎖反應來定量測量用測試GA批和參考GA批來刺激後，小鼠淋巴結細胞內的細胞介素mRNA位準

使用即時聚合酶連鎖反應方法來測量GA免疫的 SJL/J小鼠之GA刺激的LN細胞的細胞介素mRNA的表現。以二個不同的管家基因，GAPDH和β-肌動蛋白，正規化的表現進行測試。

由六隻雌性SJL/J小鼠組成的各組係藉由以總劑量250μg之一批GA，或是甘露糖醇及沒有GA之注射至全部4隻足墊內來進行免疫作用。使用三個Copaxone批次(batch)以及三個GMA批次(batch)來免疫小鼠。GA和甘露糖醇免疫作用二者內均包括CFA。於免疫之後10天，由GA免疫小鼠單離的LN細胞樣本各自用一濃度的Copaxone批和GMA批來進行刺激。各組內包括2.5μg/mL ConA處理的LN細胞正對照及10μg/mL MBP處理的細胞之負對照。

於初始的運轉中，當細胞介素mRNA位準正規化成GAPDH mRNA位準時，觀察到缺乏再現性。因而，對樣本重複Q-PCR分析，來測量IL-2、IL-4、IL-5，以及IL-13的位準，使用GAPDH和β-肌動蛋白二者作為參考基因。表28內顯示重複運轉之實驗設計。

RNA單離及分析程序與實施例IV中所述的該等相似。觀察到的小鼠IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13 mRNA之表現位準總結於以下的表29至36內。如同表30、32、34以及36內的資料所顯示，當除IL-13之外的所有細胞介素之細胞介素mRNA位準正規化成的GAPDH mRNA時，觀察到研究的結果再次缺乏再現性。然而，當使用β-肌動蛋白作為參考管家基因時，各個分析的細胞介素mRNA觀察到COP和GMA可比較的刺激作用。

結論

使用β-肌動蛋白作為管家基因導致觀察到各種各樣的細胞介素mRNAs之可再現性的表現，當使用以Copaxone或GMA免疫的小鼠獲得的淋巴結細胞，來比較一批(a lot of)Copaxone與一批(a lot of)GMA時。於此等實驗內，從Copaxone或GMA免疫的動物獲得的小鼠淋巴結細胞以Copaxone或GMA來刺激，會導致可比較位準的IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13 mRNA。

實施例VI. 使用以刀豆球蛋白A來刺激的小鼠脾細胞以評估供使用於即時聚合酶連鎖反應方法之參考基因

為了評估用於正規化即時PCR資料的參考基因，以不同濃度的非特異性T細胞刺激物，刀豆球蛋白A(ConA)來處理的CD-1小鼠脾細胞來研究八種參考基因，β-肌動蛋白、Atp5b、B2m、Cyc1、Hprt、Gapdh、Ppia，以及Rp113a之mRNA的表現剖析。使用NormFinder程式分析資料，以及根據其等之穩定性將參考基因分等級。

測試的八種參考基因列於表37內，以及使用於擴增和偵測的引子/探針顯示於表38內。

1mg/mL ConA儲備溶液(ConA-SS1)係藉由用5.0mL無菌的1X DPBS來復原5mg冷凍乾燥粉末而製備。 ConA-SS1溶液進一步藉由添加40μL的ConA-SS1(1mg/mL)至1.96mL的DMEM-10培養基而稀釋成20μg/mL(CoNA-SS2)。製備不同濃度的ConA稀釋的樣本。於96井組織培養平盤方面，添加120μL的各個ConA樣本於具有120μL的脾細胞之井內。

從四隻雌性CD-1小鼠(8週大)獲得脾細胞(Splenocytes)以及懸浮於組織培養基DMEM-10內。使用錐蟲藍排除法來決定懸浮液內活細胞之細胞密度。在細胞計數之後，以7.5x10⁶細胞/mL的密度配於DMEM-10培養基內以製備脾細胞懸浮液。將ConA稀釋的樣本(0.12mL)添加於96井組織培養平盤的指派的井中。將相同體積製備的脾細胞(0.12mL)添加至指派的井中。使用假刺激(DMEM-10培養基)之脾細胞來監測各個基因的背景mRNA位準。表39內總結ConA之刺激作用。平盤在37℃的潮濕5%CO₂孵化器孵育6小時。

根據研究方法XBL 12094 M01[1]，於刺激後6小時由ConA處理的脾細胞單離總RNA。簡言之，孵育時間結束時，用PBS清洗經處理的脾細胞以及溶解於RNA溶解緩衝液內。溶解產物移轉至96井結合平盤，以及使用SV 96 Total RNA Isolation System(Promega，Cat.號碼Z3505)來單離總RNA。用RNA清洗溶液清洗樣本以及用DNase溶液予以處理。在DNase活性停止之後以及再次用RNA清洗溶液清洗樣本，藉由真空歧管系統、用無核酸酶的水將RNA樣本洗提至96井平盤。RNA樣本儲存於ca -70℃。

如先前說明的PHA 040-036和PHA 040-037由總RNA來合成cDNA。簡言之，製備High Capacity cDNA Reverse Transcription master mix以及分配至96井平盤內指派的井。將RNA樣本移轉至各個井。反轉錄(RT)係藉由Thermal Cycler(2720，Applied Biosystems)、根據表40內的程式來執行。

在反轉錄反應完成之後，cDNA樣本直接使用於即時PCR或是儲存於ca -20℃。

即時PCR係使用各個參考基因的特異性引子/探針來執行。簡言之，PCR樣本係藉由混和TaqMan Universal PCR Master Mix(Cat.# 4304437)、cDNA樣本及特異性參考基因之引子/探針來製備。使用即時PCR系統(7500，Applied Biosystems)來執行樣本平盤。即時PCR的程式總結於表41內。

NormFinder Excel大量處理資料以提供線性的標度。因而，C_T值最初轉變成線性的標度。鑑定全部的樣本參考基因之最低的樣本C_T值，以及任意設定為1.0。使用下列方程式來計算所有其他樣本的相對數量(RQ)：RQ=1/(2^{(Ct_樣本-Ct_min)})

以NormFinder分析處理資料，遵循Molecular Diagnostic Laboratory Website之指示。

結果和討論

經由系統PCR來評估所有的八種參考基因之表現位準以及數值直接記述為循環閾值(cycle threshold)(C_T)。C_T係定義為達到偵測特異性閾值位準需要的螢光之循環數量，以及與樣本內存在之初始的RNA模板的量反向相關。

根據脾細胞對ConA刺激起反應之表現位準，可以把此等參考基因劃分成豐富等級(ActB平均C_T值為22.8)、中等豐富等級(Atp5b、B2m、GAPDH、Ppia以及Rp113a)以及低豐富等級(Cyc1和Hprt之平均C_T值>29)(表42)。

關於各個參考基因，用低濃度的ConA(0.03至0.1μg/mL)處理的樣本與DMEM-10對照相比，C_T值仍保持是相對固定的。C_T值似乎隨ConA的濃度增加而減少(0.3至3μg/mL)。對ConA刺激起反應之所有的參考基因均觀察到此模式。用1和3μg/mL的ConA來處理之樣本，GAPDH基因的C_T值的減少幅度稍微地小。結果暗示用>0.3μg/mL的濃度之ConA處理的樣本，參考基因的表現可能被向上調控。

結論

分析的資料暗示使用二個管家基因，所有先前的實驗使用的GAPDH，以及似乎相當穩定的β-肌動蛋白，為以正規化資料合理的選擇。

實施例VII.使用即時聚合酶連鎖反應方法來定量三個完全相同的實驗中，用醋酸格拉替雷刺激刺激後小鼠淋巴結細胞內的細胞介素mRNA位準

使用即時聚合酶連鎖反應方法來測量GA免疫小鼠的GA-刺激LN細胞內之IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13 mRNA的表現。進行三個完全相同的實驗。於各個實驗中，用GA來免疫小鼠，以及和免疫作用使用的相同批次(batch)，六種濃度的GA之各者用於刺激各組小鼠的LN細胞。使用 GAPDH和β-肌動蛋白作為參考基因。

表43內顯示實驗設計。三組之各者係由大概8-12週大的四隻雌性CSJLF1/JRj(Janvier Labs)小鼠所組成。於第0天，藉由注射0.1mL注射體積至4隻足墊內(大約10μL至各個前足墊內，40μL至各個後足墊內)來免疫小鼠。免疫作用含有總劑量250μg的一批GA(Copaxone批次(batch)P53974)+CFA(0.5mg/mL)。於免疫後第十天，由動物單離淋巴細胞，以及用濃化的DCCM-1(假刺激載體對照)、2.5μg/mL刀豆球蛋白A(ConA，正對照)或是GA來進行刺激。

於免疫作用之後10天，由免疫小鼠單離的LN細胞樣本各自用如同表43內顯示的0.3、1、2.5、5、10，或是20μg/mL的Copaxone批次(batch)P53974來刺激。

經刺激的LN細胞在大約37℃的潮濕CO₂孵化器孵育6小時之後，使用SV 96 Total RNA Isolation System(Promega,Cat.#Z3500)、根據製造商的協定來單離總RNA。各個RNA樣本使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies，從前為Applied Biosystems)、根據製造商的協定來合成cDNA。反轉錄係用Thermal Cycler(2720，Life Technologies)、使用下列的程式來執行：

以下的表44內列舉細胞介素和管家基因之小鼠引子/探針(Life Technologies)。

使用TaqMan Universal PCR Master Mix II(Life Technologies)，以及利用即時PCR系統(7500，Life Technologies)、使用下列即時PCR的程式於96井平盤內進行，以製備樣本：

使用如先前所述之標準的△△C_T方法來計算細胞介素mRNA的位準。觀察到之小鼠IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13 mRNA的表現位準總結於以下的表45至48內。在以GAPDH和β-肌動蛋白基因表現予以正規化以後，細胞介素mRNA的位準之倍數增加是可比較的。

表49內概述最高的GA刺激的濃度，20μg/mL來刺激之三個組別的樣本之mRNA位準的誘導倍數(fold induction)。

結論

由GA免疫小鼠單離的淋巴結(LN)細胞內之小鼠IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13的表現位準，係於用GA刺激之GA免疫小鼠的LN細胞內進行測量。在以GAPDH和β-肌動蛋白基因表現予以正規化以後，細胞介素mRNA的位準之倍數增加是可比較的。再者，由GA免疫的小鼠單離之LN細胞對GA刺激起反應，而增加了小鼠細胞介素IL-2、IL-4、IL-5以及IL-13之mRNA表現位準，以及此等增加為劑量依賴性的。

IL-2 mRNA之測量顯示出最大的變異性，而於此等實驗中偵測IL-4、IL-5，及IL-13 mRNA對GA刺激起反應為更加可再現的。此等結果暗示測量GA免疫小鼠的GA刺激LN細胞之IL-4、IL-5，或是IL-13 mRNA，可能會提供比測量IL-2 mRNA更加可再現且可靠的評估方法。

實施例VIII. 使用即時聚合酶連鎖反應方法來比較十二批GA刺激後之小鼠LN細胞內的細胞介素mRNA表現

使用即時聚合酶連鎖反應方法來測量GA免疫小鼠，用十二批GA中之一者刺激後之LN細胞內之IL-2、IL-4、 IL-5以及IL-13 mRNA的表現。免疫作用使用一批GA(Copaxone P53974)。用於刺激的GA批包括八批Copaxone(P53974，X06511，X06841，X06861，X06941，X06741，X06901，P63020)，以及四批GMA(GMA批)(GMA/0.02/001/13，GMA/0.02/002/13，GMA/0.02/003/13，以及GMA/R&D/026/11)。

實驗設計顯示於表50之內。於第0天藉由注射0.1mL注射體積至4隻足墊內(大約10μL至各個前足墊內，40μL至各個後足墊內)，來免疫二十隻大概8-12週大的雌性CSJLF1/JRj小鼠(Janvier Labs)。免疫作用含有總劑量為250μg的一批GA(Copaxone批次(batch)P53974)+CFA(0.5mg/mL)。於免疫後第十天，由動物單離出淋巴細胞，以及用如同表50內所顯示的濃化的DCCM-1(假刺激載體對照)、2.5μg/mL刀豆球蛋白A(ConA，正對照)，或是0.3、1、2.5、5、10或20μg/mL的Copaxone批次(batch)P53974來進行刺激作用。

使用SV 96 Total RNA Isolation System(Promega，Cat.#Z3500)、根據製造商的協定，而從經刺激的LN細胞予以單離出總RNA。各個RNA樣本係以三重複(triplicate)的方式、使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies，從前為Applied Biosystems)、根據製造商的協定來合成cDNA。反轉錄作用係用Thermal Cycler(2720，Life Technologies)、使用下列的程式來執行：

所使用的細胞介素以及管家基因之小鼠引子/探針係來自於Life Technologies：β-肌動蛋白(參考基因，Cat.# Mm00607939_s1)，GAPDH(參考基因，Cat.# Mm99999915_g1)，IL-2(標的基因，Cat.# Mm00434256_m1)， IL-4(標的基因，Cat.# Mm00445259_m1)，IL-5(標的基因，Mm00439646_m1)，IL-13(標的基因，Mm00434204_m1)，IL-17，以及CD25)。

使用如先前所述之標準的△△C_T方法來計算細胞介素mRNA的位準。以下的表51至71總結觀察到的小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17，以及CD25 mRNA的表現位準。

用Copaxone批C1至C8來刺激的樣本內IL-2、IL-4、IL-5，以及IL-13之表現位準觀察到變異。Mylan批M1、M2和M3之間觀察到的變異不大於Copaxone之間觀察到的變異。然而，用GMA批M4(變更批GMA/R&D/026/11，為合成的前五分鐘不提供麩胺酸所造成)來刺激的LN細胞顯示出顯著更低的細胞介素表現位準，以及不同的誘導模式(表57、61、65、67和69)。

用四批Copaxone和四批Mylan GA來刺激的LN細胞內，顯示出IL-17之濃度依賴性誘導作用(表68和69)。刺激後6小時所取得的樣本觀察到CD25(IL-2ra)mRNA之刺激作用，但是量值較小以及顯然無劑量反應。(表70和71)。以β-肌動蛋白來正規化之細胞介素mRNA的表現位準比以 GAPDH來正規化的該等細胞介素mRNA的表現位準，顯示出較小的變異性。

結論

由GA免疫小鼠單離的淋巴結(LN)細胞內之小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17，以及CD25的表現位準，係於用體外GA刺激之GA免疫小鼠的LN細胞內進行測量。使用十二個不同的GA批進行刺激，包括一個變更的製造批次(batch)的GMA。用Copaxone®批C1至C8來刺激的樣本內，觀察到IL-2、IL-4、IL-5，以及IL-13之表現位準之變異。Mylan批M1、M2和M3之間觀察到的變異不超過Copaxone®批之間觀察到的變異量值。用GMA批M4(變更批GMA/R&D/026/11，為合成的前五分鐘不提供麩胺酸所造成)來刺激的LN細胞顯示出顯著更低的細胞介素表現位準，以及不同的誘導模式。於用四批Copaxone®和四批Mylan GA來刺激的LN細胞內，顯示出的IL-17濃度依賴性誘導。

實施例IX.測量用醋酸格拉替雷挑戰以後，來自GA免疫的CSJLF1/JRj小鼠的T細胞內，一組反應之生物標記mRNA，來決定醋酸格拉替雷測試批的效力

如實施例III中所述，CSJLF1/JRj小鼠各自用250μg的GA參考標準批(Copaxone，Teva Pharmaceuticals USA,Inc.)予以免疫。於免疫後第十天，由動物來單離淋巴結細胞，以及用髓磷脂鹼性蛋白(MBP，負對照)、刀豆球蛋白A(ConA，正對照)的GA測試批(GMA，Mylan Pharmaceuticals，Inc.，以0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，及15μg/mL)及GA參考標準批(以0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，及15μg/mL)來刺激分別的樣本。

在4和6小時之後，溶解各個樣本的細胞，如先前所述進行單離總RNA、合成cDNA以及藉由即時PCR來測量和GA反應之生物標記mRNA IL-4、IL-5、IL-13、IL-17的量。GMA免疫小鼠的細胞測量的各個生物標記mRNA的量與Copaxone免疫小鼠測量的量進行比較，來決定相對效力。

縱然本發明的較佳具體例已經顯示及說明於本文中，明顯地對熟悉此藝者而言提供此等具體例僅作為舉例。熟悉此藝者會想到很多的變異、變化，以及取代，且不背離本發明。應該瞭解到可以使用本文中所說明的具體例之各種替代方案來實施本發明。下列申請專利範圍意欲定義本發明的範疇，以及在此等申請專利範圍內之方法及結構和由此涵蓋之其等均等物。

Claims

一種用於決定醋酸格拉替雷(GA)測試批(test lot)之相對效力的方法，該方法包含：(a)培養從一以確定量的GA參考標準批(reference standard lot)免疫之測試動物移除的淋巴結細胞；(b)於預定量的該GA參考標準批存在下，孵育包含預定數量的該經培養的淋巴結細胞之至少三個樣本中之各者；以及於預定量的該GA測試批存在下，孵育相同數量的包含預定數量的該經培養的淋巴結細胞之樣本；(c)測量用該預定量的GA參考標準批孵育的該經培養的淋巴結細胞之該至少三個樣本中之各者內，不同的GA反應之生物標記mRNA物種的量；以及測量用該預定量的GA測試批孵育的該淋巴結細胞之該複數個樣本中之各者內，該對應的GA反應之生物標記mRNA物種的量；其中該GA反應之生物標記mRNA物種中之至少一者係由編碼一Th1-關聯性細胞介素的一基因所轉錄，該GA反應之生物標記mRNA物種中之至少一者係由編碼一Th2-關聯性細胞介素的一基因所轉錄，以及該GA反應之生物標記mRNA物種中之至少一者係由編碼一Th17-關聯性細胞介素的一基因所轉錄，以及；(d)將用該預定量的GA測試批孵育的該淋巴結細胞內所測得的各個GA反應之生物標記mRNA物種的量，和用該預定量的GA參考標準批孵育的該淋巴結細胞內所測得的該相對的GA反應之生物標記mRNA物種的量做比較；藉此決定該GA測試批的相對效力。
如請求項1之方法，其中該測試動物為小鼠。
如請求項1之方法，其中該GA反應之生物標記mRNA物種中之至少一者係由編碼一Th_FH-關聯性細胞介素的一基因所轉錄。
如請求項3之方法，其中該Th_FH-關聯性細胞介素係IL-21。
如請求項1-4中任一項之方法，其中該GA反應之生物標記mRNA物種中之至少一者係由編碼一關鍵調節關聯性細胞介素的一基因所轉錄。
如請求項5之方法，其中該關鍵調節關聯性細胞介素係選自於：IL-10及TGF-β。
如請求項1-4中任一項之方法，其中該Th1-關聯性細胞介素係選自於：IFN-γ、IL-2、IL-1β、TNF-α及CXCL1。
如請求項1-4中任一項之方法，其中該Th2-關聯性細胞介素係選自於：IL-4、IL-5、IL-10及IL-13。
如請求項1-4中任一項之方法，其中該Th17-關聯性細胞介素係選自於：IL-17及IL-22。
如請求項9之方法，其中所測得的該GA反應之生物標記mRNA物種中之至少一者為：(a)由一個編碼細胞介素的基因所轉錄，其中該細胞介素係選自於下列所構成的群組：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、或IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，及IL-1β；(b)由一個編碼活化標誌或細胞介素受體的基因所轉錄，其中該活化標誌或細胞介素受體係選自於下列所構成的群組：CD25、CD69、CD71、CD86、CD137、CD154、CD278、CD279、GATA3、Tbx21、HLA-DMA、HLA-DMB、IFN-γR2、IL-12RB1、IL-2RA、IL-2RG、IL-4R、IL-6R、IL-10RB、TGFBR2、FOXP3，及HLA-DR；或是(c)由一個編碼趨化介素的基因所轉錄，其中該趨化介素係選自於下列所構成的群組：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。
如請求項6之方法，其中所測得的該GA反應之生物標記mRNA物種中之至少一者係由編碼以下的一基因所轉錄：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-22、IFN-γ、TNF-α、CD25或IL1-β。
如請求項11之方法，其中所測得的該GA反應之生物標記mRNA物種中之至少一者係由編碼以下的基因所轉錄：CD25、IL-4或IL-13。
如請求項1之方法，其進一步包含決定是否該GA測試批具有所欲的相對效力。
如請求項13之方法，其中該所欲的相對效力為該GA參考標準批之效力的至少大約90%至大約125%。
如請求項14之方法，其中該所欲的相對效力為該GA參考標準批之效力的至少大約95%至大約125%。
如請求項1之方法，其中該至少一個反應之生物標記mRNA係藉由即時聚合酶連鎖反應(Real-Time PCR)來測量。
如請求項1之方法，其中該反應之生物標記mRNA中之各者係於開始孵育之後大約4小時至大約6小時的時候測量。
如請求項1之方法，其中一蛋白合成抑制劑添加至使用該GA參考標準批之該淋巴結細胞的孵育，以及添加至使用該GA測試批之該淋巴結細胞的孵育。
如請求項1之方法，其中該參考標準批為Copaxone，或者非Copaxone的一批GA(a lot of GA)。