TW201606305A - 供評估格拉默醋酸鹽製備物之免疫同一性用的人類ｔ細胞株分析方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關於醫學領域。本發明提供產生格拉默醋酸鹽專一性人類T細胞株的方法，及分析方法，其使用此等T細胞株供展示格拉默醋酸鹽製備物之間的免疫同一性。此等分析方法允許敏感且準確的比較格拉默醋酸鹽製備物，以及找到效用作為批放行分析方法(lot-release assay)。
Description
此申請案主張2013年10月24日提申之美國專利臨時申請案第61/895,370號的優先權之利益；其之整體併入本文以作為參考資料。
本發明係有關於供評估格拉默醋酸鹽製備物之免疫同一性用的人類T細胞株分析方法。
格拉默醋酸鹽為一種批准用於治療多發性硬化症之合成性胜肽藥物。其係由含有下列胺基酸之合成性多肽之醋酸鹽組成：L-麩胺酸、L-丙胺酸、L-酪胺酸及L-離胺酸。現在販售為Copaxone®之格拉默醋酸鹽注射劑指示出降低具有復發緩解型多發性硬化症(RRMS)的病人之復發的頻率，包括已經歷首次臨床發作(clinical episode)且有符合多發性硬化症的MRI特徵的病人。
認為格拉默醋酸鹽係經由調節負責多發性硬化
症發病機制之免疫過程而對多發性硬化症起作用。尤其，據信Copaxone®於多發性硬化症之作用機制至少部分由T細胞活性所媒介。
在製造格拉默醋酸鹽的期間，為了維持藥學用途的藥物批之間的一致性，需要有可靠及具成本效益的效力分析方法供詢問格拉默醋酸鹽製備物，以展示其對格拉默醋酸鹽參考標準批之免疫同一性及/或可比較的效力。
本發明係基於發現到供產生及鑑別格拉默醋酸鹽(GA)專一性人類T細胞株的方法，該T細胞株對不同的GA製備物反應相似，但是對非正則(non-canonical)GA胜肽的反應性不同，具有不同的主要組織相容複合體限制性元素(MHC restriction element)，以及對GA刺激起反應而產生不同的細胞介素。本發明係有關於獲得GA專一性人類T細胞株的方法，該T細胞株辨識不同的GA抗原決定位，以及有關於使用此等GA專一性人類T細胞株來判定GA製備物是否為免疫同一性的方法。於具體例中，本發明係有關於一種判定GA測試製備物及GA參考標準品製備物是否為免疫同一性的方法，其使用利用所述之方法所產生的至少一個GA專一性人類T細胞株或是GA專一性人類T細胞株組(panel)。
本發明進一步有關於供製備包含GA的藥物產品或藥學組成物之方法，其包含：判定GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的，以及設若該GA測試製備
物和GA參考標準品經判定為免疫同一性的，則將該GA測試批(the GA test lot)含括於該藥物產品內。本發明亦有關於一種包含GA的藥物產品，其係藉由本發明的方法所製備的。本發明進一步有關於適合使用於本發明的方法內作為抗原呈現細胞的人類B細胞株。
本發明的分析方法能展示出GA產品製備物之免疫同一性或揭露GA產品製備物之非同一性，其具有用現存的GA批次分析方法(batch assay)不可得的準確度。本發明的分析方法不需要動物免疫作用，藉此消除分析方法對分析方法之變異性(assay-to-assay variability)，以及其不需要動物犧牲。
特別地，本發明係有關於一種判定GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的方法，其使用至少一個GA專一性人類T細胞株，該方法包含：a)用適合的抗原呈現細胞(APC)來孵育該至少一個GA專一性人類T細胞株的細胞；b)用一數量的該GA測試製備物來刺激步驟(a)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株及該適合的APC之至少一個樣本，以及分別用相同數量的該GA參考標準品來刺激步驟(a)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株及該適合的APC之至少一個樣本；c)測量步驟(b)內用該GA測試製備物刺激的該至少一個樣本的細胞之至少一個GA引出的反應，及測量步驟(b)內用該GA參考標準品刺激的該至少一個樣本的細胞之相同的至少一個GA引出的反應；以及d)比較步驟(c)內獲得的量度(measurements)；其中當步驟(d)內進
行的量度比較落在可以接受的範圍內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品判定為免疫同一性的。
於具體例中，本發明係有關於一種判定格拉默醋酸鹽(GA)測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的方法，該方法包含：測量於適合的APC存在下，用該GA測試製備物刺激的至少一個GA專一性人類T細胞株之至少一個GA引出的反應，以獲得第一個量度(measurements)，以及測量於適合的APC存在下，該至少一個GA專一性人類T細胞株對GA參考標準品之至少一個GA引出的反應，以獲得第二個量度；以及比較該第一個量度和該第二個量度；其中當該第一個量度和該第二個量度之比較落在可以接受的範圍內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品判定為免疫同一性的。
於以上的具體例中，該適合的APC能包含選自於以下所構成的群組之細胞：艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein Barr Virus)轉形的(EBV轉形的)人類B細胞，其對GA專一性人類T細胞為自體的；EBV轉形的人類B細胞，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子；對GA專一性人類T細胞為自體的PBMC；具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子之PBMC；經純化的單核球，其對GA專一性人類T細胞為自體的；經純化的單核球，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子；經純化的樹突狀細胞(dendritic cell)，其對GA專一性人類T細胞為自體的；以及經純化的樹突狀細胞，其具有涉及GA專一性人類
T細胞之抗原呈現的DR分子。
本發明亦有關於一種包含選擇GA測試製備物的藥學用途之方法，該GA測試製備物依據本發明的方法判定為具有對GA參考標準品之免疫同一性。
本發明係有關於以上的方法，其中該可以接受的範圍為大約80%至大約120%，或是大約90%至大約110%。於以上的方法之具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係選自於增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及其等之組合。於具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係反應之生物標記的產生，以及該反應之生物標記為細胞介素、趨化介素(chemokine)，或是活化標誌。於某些具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21 IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)，及IL-1b。於具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。
本發明係有關於以上的方法，其中該至少一個測量的GA引出的反應係編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及該核酸所編碼的反應之生物標記為細胞介素、趨化介素，或是活化標誌。於具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、
IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，及IL-1b。於某些具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。
本發明係有關於以上的方法，其中用該GA測試製備物刺激的細胞之至少二個GA引出的反應被測量，以及用該GA參考標準品刺激的細胞之同樣的至少二個GA引出的反應被測量。於此等具體例中，該至少二個GA引出的反應可以選自於以下的的表現：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β、IL-1b、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279、HLA-DR、IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、編碼IL-2的核酸、編碼IL-4的核酸、編碼IL-5的核酸、編碼IL-6的核酸、編碼IL-10的核酸、編碼IL-13的核酸，或編碼IL-17的核酸、編碼IL-22的核酸、編碼IFN-γ的核酸、編碼TNF-α(TNF)的核酸、編碼TNF-β(LT)的核酸、編碼TGF-β的核酸、編碼IL-1b的核酸、編碼CD69的核酸、編碼CD25的核酸、編碼CD71的核酸、編碼CD137的核酸、編碼CD154的核酸、編碼CD278的核酸、編碼CD279的核酸、編碼HLA-DR的核酸、編碼IL-8(CXCL8)的核酸、編碼RANTES(CCL5)的核酸、編碼
CCL1的核酸、編碼CXCL4的核酸，以及編碼CXCL7的核酸。
本發明係有關於以上的方法，其中該GA參考標準品為Copaxone(COP)或Mylan GA(GMA)。
本發明係有關於以上的方法，其中該適合的APC具有至少一個能夠呈現GA胜肽之HLA-DR限制性元素。於某些具體例中，該至少一個能夠呈現GA胜肽之HLA-DR限制性元素係選自於：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，和DR-15。
本發明係有關於以上的方法，其中該步驟(a)內經孵育的該至少一個GA專一性人類T細胞株為一種長期的T細胞株。於具體例中，該GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的(clonal)。於具體例中，該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在刺激之前已經維持於培養物內歷時至少大約四週，事先再刺激至少四次，或是二者都有。於具體例中，該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株已經事先再刺激至少八次。於具體例中，該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株於培養物內之維持，包含在缺乏促分裂原(mitogen)的情況下，用GA和自體的APC反復的再刺激。
本發明係有關於以上的方法，其中該刺激包括用一系列數量的該GA測試製備物中的一者，用APC予以孵育或在APC存在下，來刺激GA專一性人類T細胞的至少三個樣本之各者，以及用相同序列數量的該GA參考標準品中的一者，用APC予以孵育或在APC存在下，來刺激GA專一性人類T細胞的至少三個樣本之各者。於具體例中，該序列數
量的該GA測試製備物，及該序列數量的該GA參考標準品，包含大約1ng/mL GA至大約1mg/mL GA的上升劑量。於具體例中，該序列數量的該GA測試製備物，及該序列數量的該GA參考標準品，為大約1μg/mL GA至大約30μg/mL GA的上升劑量。
於具體例中，本發明係有關於一種供製備包含GA的藥物產品或藥學組成物之方法，其包含：1)使經保護的格拉默醋酸鹽與氫溴酸反應以形成三氟乙醯GA，用哌啶水溶液(aqueous piperidine solution)處理該三氟乙醯共聚物-1以形成GA測試製備物，以及純化該GA測試製備物；2)判定該GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的，其係藉由：a)用適合的抗原呈現細胞(APC)來孵育至少一個GA專一性人類T細胞株的細胞；b)用一數量的該GA測試製備物來刺激步驟(a)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株及該適合的APC之至少一個樣本，以及分別用相同數量的該GA參考標準品來刺激步驟(a)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株及該適合的APC之至少一個樣本；c)測量步驟(b)內用該GA測試製備物刺激的該至少一個樣本的細胞之至少一個GA引出的反應，及測量步驟(b)內用該GA參考標準品刺激的該至少一個樣本的細胞之相同的至少一個GA引出的反應；以及d)比較步驟(c)內獲得的量度(measurements)；其中當步驟(d)內之量度比較落在可以接受的範圍內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品判定為免疫同一性的，以及其中設若判定其對該GA參考標準品有
免疫同一性，則使該GA測試製備物混合於該藥物產品或藥學組成物內。
於此等具體例中，該適合的APC能包含選自於以下所構成的群組之細胞：艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein Barr Virus)轉形的(EBV轉形的)人類B細胞，其對GA專一性人類T細胞為自體的；EBV轉形的人類B細胞，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子；對GA專一性人類T細胞為自體的PBMC；具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子之PBMC；經純化的單核球，其對GA專一性人類T細胞為自體的；經純化的單核球，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子；經純化的樹突狀細胞(dendritic cell)，其對GA專一性人類T細胞為自體的；以及經純化的樹突狀細胞，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子。
於具體例中，該可以接受的範圍為大約80%至大約120%，或是大約90%至大約110%。於以上的方法之某些具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係選自於增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及其等之組合。於具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係反應之生物標記的產生，以及該反應之生物標記為細胞介素、趨化介素(chemokine)，或是活化標誌。於某些具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21 IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)，及IL-1b。
於具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。
於具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及該核酸所編碼的反應之生物標記為細胞介素、趨化介素，或是活化標誌。於具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，及IL-1b。於某些具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，以及CXCL7。
於具體例中，其中用該GA測試製備物刺激的細胞之至少二個GA引出的反應被測量，以及用該GA參考標準品刺激的細胞之同樣的至少二個GA引出的反應被測量。於此等具體例中，該至少二個GA引出的反應可以選自於以下的的表現：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β、IL-1b、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、
CD278、CD279、HLA-DR、IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、編碼IL-2的核酸、編碼IL-4的核酸、編碼IL-5的核酸、編碼IL-6的核酸、編碼IL-10的核酸、編碼IL-13的核酸，或編碼IL-17的核酸、編碼IL-22的核酸、編碼IFN-γ的核酸、編碼TNF-α(TNF)的核酸、編碼TNF-β(LT)的核酸、編碼TGF-β的核酸、編碼IL-1b的核酸、編碼CD69的核酸、編碼CD25的核酸、編碼CD71的核酸、編碼CD137的核酸、編碼CD154的核酸、編碼CD278的核酸、編碼CD279的核酸、編碼HLA-DR的核酸、編碼IL-8(CXCL8)的核酸、編碼RANTES(CCL5)的核酸、編碼CCL1的核酸、編碼CXCL4的核酸，以及編碼CXCL7的核酸。
於具體例中，該GA參考標準品為Copaxone或GMA。
於具體例中，該適合的APC具有至少一個能夠呈現GA胜肽之HLA-DR限制性元素。於某些具體例中，該至少一個能夠呈現GA胜肽之HLA-DR限制性元素係選自於：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，以及DR-15。
於具體例中，該步驟(a)內經孵育的該至少一個GA專一性人類T細胞株為一種長期的T細胞株。於具體例中，該至少一個GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的。於具體例中，該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在刺激之前已經維持於培養物內歷時至少大約四週，事先再刺激至少四次，或是二者都有。於具體例中，該至少一個長
期的GA專一性人類T細胞株已經事先再刺激至少八次。於具體例中，該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株於培養物內之維持，包含在缺乏促分裂原(mitogen)的情況下，用GA和自體的APC反復的再刺激。
於具體例中，該刺激包括用一系列數量的該GA測試製備物中的一者，用APC予以孵育或在APC存在下，來刺激GA專一性人類T細胞的至少三個樣本之各者，以及用相同序列數量的該GA參考標準品中的一者，用APC予以孵育或在APC存在下，來刺激GA專一性人類T細胞的至少三個樣本之各者。於具體例中，該序列數量的該GA測試製備物，及該序列數量的該GA參考標準品，包含大約1ng/mL GA至大約1mg/mL GA的上升劑量。於具體例中，該序列數量的該GA測試製備物，及該序列數量的該GA參考標準品，為大約1μg/mL GA至大約30μg/mL GA的上升劑量。
本發明進一步有關於一種供產生及鑑別GA專一性人類T細胞株的方法，該方法包含：a)獲得一個細胞樣本，其中該細胞樣本包含來自人類供給者之T細胞及適合的APC；b)由步驟(a)之該細胞樣本製備培養物，其中該培養物包含GA；c)用IL-2孵育步驟(b)之該培養物；d)分析步驟(c)之該培養物，其係藉由製備至少一個測試培養物，其包含來自步驟(c)之該培養物的細胞、適合的APC，及GA測試製備物，製備來自步驟(c)之該培養物之至少一個對照培養物，以及(i)測量該至少一個測試培養物之至少一個GA引出的反應；(ii)測量該對照培養物相同的至少一個GA引出的反
應；以及e)比較步驟(d)(i)的量度和步驟(d)(ii)的量度；其中該產生的GA專一性人類T細胞株係基於步驟(d)(i)內測量的該至少一個GA引出的反應，相對於步驟(d)(ii)內測量的該至少一個GA引出的反應，之增高來鑑別；以及f)選擇性地擴展該培養物，以及使用該擴展的培養物來重複步驟(d)及(e)，以進一步特徵化該經鑑別的GA專一性人類T細胞株。
於此等具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應可以選自於增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及其等之組合。於相關的具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應為反應之生物標記的產生，以及該反應之生物標記為細胞介素、活化標誌，或是趨化介素。於某些具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，及IL-1b。於具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。於相關的具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及該編碼的反應之生物標記為細胞介素、活化標誌，或是趨化介素。於某些具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、
IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，及IL-1b。於具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。於具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。
於本發明的具體例中，步驟(e)包含測量該經培養的T細胞對於GA之至少二個GA引出的反應，以及步驟(f)包含測量該經培養的T細胞對於對照抗原之同樣的至少二個GA引出的反應。於相關具體例中，該至少二個GA引出的反應係選自於以下的的表現：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β、IL-1b、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279、HLA-DR、IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、編碼IL-2的核酸、編碼IL-4的核酸、編碼IL-5的核酸、編碼IL-6的核酸、編碼IL-10的核酸、編碼IL-13的核酸，或編碼IL-17的核酸、編碼IL-21的核酸、編碼IL-22的核酸、編碼IFN-γ的核酸、編碼TNF-α(TNF)的核酸、編碼TNF-β(LT)的核酸、編碼TGF-β的核酸、編碼IL-1b的核酸、編碼CD69的核酸、編碼CD25的核酸、編碼CD71的核酸、編碼CD137的核酸、編碼CD154的核酸、編碼CD278的核酸、編碼CD279的核酸、編碼HLA-DR的核酸、編碼IL-8(CXCL8)的核酸、編碼RANTES(CCL5)的核酸、編碼CCL1的核酸、編碼CXCL4的
核酸，以及編碼CXCL7的核酸。
於具體例中，該適合的APC為自體的細胞。於具體例中，該適合的APC為自體的PBMC。於具體例中，該適合的APC為用抗有絲分裂劑，譬如絲裂黴素C(mitomycin C)，處理的自體的PBMC。於具體例中，該適合的APC具有至少一個能夠呈現GA胜肽之HLA-DR限制性元素。於某些具體例中，該至少一個能夠呈現GA胜肽之HLA-DR限制性元素係選自於：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，以及DR-15。
本發明亦有關於一種依據此等方法而獲得的GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該產生的GA專一性人類T細胞株為一種長期的T細胞株。於具體例中，該產生的GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的。
於本發明的具體例中，步驟(b)或(c)的該培養物沒有添加促分裂原(mitogen)。
於具體例中，該方法進一步包含特徵化該經鑑別的GA專一性人類T細胞株，其中該特徵化包含下列中的一者或多者：a)確認或再確認該經鑑別的GA專一性人類T細胞株之GA專一性；b)判定該經鑑別的GA專一性人類T細胞株之MHC限制性；c)判定該經鑑別的GA專一性人類T細胞株之反應之生物標記的剖繪(profile)；以及d)判定該經鑑別的GA專一性人類T細胞株對至少一個非正則(non-canonical)GA胜肽的反應性。
於具體例中，該方法進一步包含特特徵化該經鑑
別的GA專一性人類T細胞株對非正則GA胜肽的反應，其係藉由：製備至少一個測試培養物，其包含該經鑑別的GA專一性人類T細胞株的細胞、適合的APC，及非正則GA胜肽；製備包含該經鑑別的GA專一性人類T細胞株的細胞之至少一個對照培養物；測量該至少一個測試培養物之至少一個GA引出的反應；測量該對照培養物相同的至少一個GA引出的反應；以及比較該測試培養物和該對照培養物之GA引出的反應的量度；其中根據該測試培養物相對於該對照培養物之至少一個GA引出的反應之增高，來鑑別出會對該非正則GA胜肽的刺激起反應之該GA專一性人類T細胞株。
本發明亦有關於一種長期的GA專一性人類T細胞株，其中該長期的GA專一性人類T細胞株對於GA測試製備物之刺激能夠產生的至少一個測量的反應，相對於對於對照抗原之刺激相同的該至少一個測量的反應而言是增高的，該至少一個測量的反應包含增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，或是其等之組合。於具體例中，該GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的。
於具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係選自於增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及其等之組合。於具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係反應之生物標記的產生，以及該反應之生物標記為細胞介素、趨化介素(chemokine)，或是活化標誌。於某些具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，
或IL-17、IL-21 IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)，及IL-1b。於具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。
於具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及該核酸所編碼的反應之生物標記為細胞介素、趨化介素，或是活化標誌。於具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，及IL-1b。於某些具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，以及CXCL7。
於具體例中，用該GA測試製備物刺激的細胞之至少二個GA引出的反應被測量，以及用該GA參考標準品刺激的細胞之同樣的至少二個GA引出的反應被測量。於此等具體例中，該至少二個GA引出的反應可以選自於以下的的表現：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β、
IL-1b、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279、HLA-DR、IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、編碼IL-2的核酸、編碼IL-4的核酸、編碼IL-5的核酸、編碼IL-6的核酸、編碼IL-10的核酸、編碼IL-13的核酸，或編碼IL-17的核酸、編碼IL-22的核酸、編碼IFN-γ的核酸、編碼TNF-α(TNF)的核酸、編碼TNF-β(LT)的核酸、編碼TGF-β的核酸、編碼IL-1b的核酸、編碼CD69的核酸、編碼CD25的核酸、編碼CD71的核酸、編碼CD137的核酸、編碼CD154的核酸、編碼CD278的核酸、編碼CD279的核酸、編碼HLA-DR的核酸、編碼IL-8(CXCL8)的核酸、編碼RANTES(CCL5)的核酸、編碼CCL1的核酸、編碼CXCL4的核酸，以及編碼CXCL7的核酸。一種包含抗原呈現細胞之APC株，其能夠呈現抗原給請求項90之該長期的GA專一性人類T細胞株。
於具體例中，該APC株係選自於：艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein Barr Virus)轉形的(EBV轉形的)人類B細胞，其對GA專一性人類T細胞為自體的；EBV轉形的人類B細胞，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子；對GA專一性人類T細胞為自體的PBMC；具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子之PBMC；經純化的單核球，其對GA專一性人類T細胞為自體的；經純化的單核球，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子；經純化的樹突狀細胞(dendritic cell)，其對GA專一性人類T細胞為自體的；以及經純化的樹突狀細胞，其具有涉及
GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子。
於具體例中，該長期的GA專一性人類T細胞株係藉由培養歷時至少大約四週而產生。於具體例中，該長期的GA專一性人類T細胞株係藉由用GMA或COP製備物來刺激而產生。
本發明亦有關於一種GA專一性人類T細胞株之分析方法組(assay panel)，供用於判定GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的，其中該分析方法組包含下列GA專一性人類T細胞株：a)一GA專一性人類T細胞株，其係藉由在第一GA製備物存在下，培養人類T細胞而產生；b)一GA專一性人類T細胞株，其係藉由在第二GA製備物存在下，培養人類T細胞而產生；以及c)對至少一個非正則GA胜肽不會反應的GA專一性人類T細胞株。於具體例中，(a)或(b)之GA專一性人類T細胞株也是(c)之GA專一性人類T細胞株。
於具體例中，(c)之該非正則GA胜肽係由和Copaxone®內之胺基酸酪胺酸(Y)、麩胺酸(E)、丙胺酸(A)，及離胺酸(K)的比率，不相同的莫耳比率(molar ratio)之胺基酸酪胺酸(Y)、麩胺酸(E)、丙胺酸(A)，及離胺酸(K)所組成。於具體例中，請求項105之分析方法組，其中(c)之該非正則GA胜肽係由胺基酸酪胺酸(Y)、麩胺酸(E)、丙胺酸(A)，及離胺酸(K)中的任何一者、二者或三者所組成。於具體例中，請求項105之分析方法組，其進一步包含對至少一個非正則GA胜肽會反應的GA專一性人類T細胞株。
於某些具體例中，本發明係有關於以上的分析方法組，其中(a)之該GA專一性人類T細胞株係選自於下列所構成的群組：222-AG12、222-BA11、222-BC11、165-B5G、165-C4G、165-C5G、165-C8G、165-D8G、165-E7G、165-E9G、165-F10G、165-F5G、165-F8G，及165-H11G；(b)之該GA專一性人類T細胞株係選自於下列所構成的群組：222-1C5、222-1H12、222-2B11、222-2B8、222-2C1、222-2C3、222-2D2、222-2D8、222-2E1、222-1F8、222-2F12、222-2G4、222-1G8、222-2G12、165-B6C、165-B10C、165-C4C、165-C7C、165-D2C、165-D3C、165-D11C、165-E3C、165-F3C、165-F6C、205-1B4、205-1B7、205-1C4、205-1D1、205-1E1、205-1F2、205-1F4、205-1H1、205-1H3、205-1H5、205-1H7、205-1H9，及205-1H11；以及(c)之該GA專一性人類T細胞株係選自於下列所構成的群組：222-AG12、165-B5G、165-D8G、165-E7G、165-E9G、165-F5G、165-F10G、222-1H12、222-2F12、165-B10C、165-C4C、165-C7C、165-D11C、165-E3C、165-F3C、165-F6C，及205-1H7。
於具體例中，(a)之該GA專一性人類T細胞株係選自於下列所構成的群組：222-AG12、222-AG12、222-BA11、222-BC11、165-B5G、165-C5G、165-C8G、165-D8G、165-E9G、165-F10G、165-F5G、165-F8G，及165-H11G；(b)之該GA專一性人類T細胞株係選自於下列所構成的群組：222-1C5、222-1H12、222-2B8、222-2C3、
222-2E1、222-1F8、222-2F12、222-2G4、222-1G8、165-C4C、165-C7C、165-D2C、165-D3C、205-1B4、205-1B7、205-1C4，及205-1F4；以及(c)之該GA專一性人類T細胞株係選自於下列所構成的群組：222-AG12、165-B5G、165-D8G、165-E7G、165-E9G、165-F5G、165-F10G、222-1H12、222-2F12、165-B10C、165-C4C、165-C7C、165-D11C、165-E3C、165-F3C、165-F6C，及205-1H7。
於某些具體例中，(a)之該GA專一性人類T細胞株係選自於165-B5G或165-D8G所構成的群組；(b)之該GA專一性人類T細胞株係選自於222-1H12或222-2E1所構成的群組；以及(c)之該GA專一性人類T細胞株係222-AG12。
於具體例中，該分析方法組包含或進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有第一個已知的GA反應之生物標記的剖繪，以及包含或進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有不同於該第一個已知的GA反應之生物標記的剖繪之第二個已知的GA反應之生物標記的剖繪。
於具體例中，該分析方法組包含或進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有第一個已知的MHC限制性，以及包含或進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有不同於該第一個已知的MHC限制性之第二個已知的MHC限制性。於具體例中，該分析方法組包含或進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有能夠呈現GA胜肽之HLA-DR限制性元素。於具體例中，該第一
HLA-DR限制性元素係選自於：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，和DR-15；以及其中該第二HLA-DR限制性元素係選自於：DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，和DR-15。
於具體例中，該分析方法組包含或進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有第一個已知的GA生物標記反應的剖繪，以及至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有第二個已知的GA生物標記反應的剖繪。於具體例中，該第一個及第二個已知的GA生物標記反應的剖繪各自包含至少一個細胞介素、至少一個趨化介素、至少一個活化標誌、至少一個編碼細胞介素的核酸、至少一個編碼趨化介素的核酸，或是至少一個編碼活化標誌的核酸。於具體例中，該第一個及第二個已知的GA生物標記反應的剖繪各自包含選自於以下的至少一個細胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，以及IL-1b。於某些具體例中，該第一個及第二個已知的GA生物標記反應的剖繪各自包含選自於以下的至少一個活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，以及HLA-DR。於具體例中，該第一個及第二個已知的GA生物標記反應的剖繪各自包含選自於以下的至少一個趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，以及CXCL7。於具體例中，該第一個及第二個已知的GA生物標記反應的剖繪各自包含至少一個編碼細胞介素的核酸，該
細胞介素係選自於下列所構成的群組：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，以及IL-1b。於具體例中，該第一個及第二個已知的GA生物標記反應的剖繪各自包含至少一個編碼活化標誌的核酸，該活化標誌係選自於：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，以及HLA-DR。於具體例中，該第一個及第二個已知的GA生物標記反應的剖繪各自包含至少一個編碼趨化介素的核酸，該趨化介素係選自於：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，以及CXCL7。
於具體例中，該分析方法組內的該GA專一性人類T細胞株為長期的T細胞株。於具體例中，該分析方法組內的該GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的。於相關具體例中，該GA專一性人類T細胞株已經培養歷時至少大約四週及/或再刺激至少四次。於具體例中，該GA專一性人類T細胞株已經再刺激至少八次。
於具體例中，該非正則GA胜肽係選自於：胜肽026、GLT 631、GAT 631、GAT111、LT11、GT11、GT 41、GL14，以及GA 64。該非正則GA胜肽係胜肽026。於具體例中，該分析方法組包含或進一步包含對一個非正則GA胜肽不會反應的二個至六個GA專一性人類T細胞株，其中各GA專一性人類T細胞株對不同的非正則GA胜肽不會反應。於具體例中，該分析方法組包含或進一步包含對一個非正則GA胜肽不會反應的二個GA專一性人類T細胞株，其
中該二個GA專一性人類T細胞株中之一者對一個選自於以下之非正則GA胜肽不會反應：胜肽026、GLT 631、GAT 631、GAT111、LT11、GT11、GT 41、GL 14、GT41S，及GA64，以及該二個GA專一性人類T細胞株之另一者對一個選自於以下之非正則GA胜肽不會反應：胜肽026、GLT 631、GAT 631、GAT111、LT11、GT11、GT 41、GL 14、GT 41S，及GA 64。於具體例中，該二個GA專一性人類T細胞株中之一者對一個選自於以下之非正則GA胜肽不會反應：胜肽026、GLT 631、GAT 631、LT11，及GL 14，以及該二個GA專一性人類T細胞株之另一者對一個選自於以下之非正則GA胜肽不會反應：胜肽026、GLT 631、GAT 631、LT11，及GL 14。於具體例中，該二個GA專一性人類T細胞株中之一者對胜肽026不會反應，以及該二個GA專一性人類T細胞株之另一者對GLT 631、GAT 631、LT11，或GL14不會反應。
於某些具體例中，(a)、(b)，以及(c)中之各個GA專一性人類T細胞株為CD4+。於相關具體例中，(a)、(b)，以及(c)中之各個GA專一性人類T細胞株包含超過98%的CD4+細胞。於具體例中，(a)、(b)，以及(c)中之各個GA專一性人類T細胞株包含超過99%的CD4+細胞。於具體例中，(a)、(b)，以及(c)中之各個GA專一性人類T細胞株不是CD8+。於相關具體例中，(a)、(b)，以及(c)中之各個GA專一性人類T細胞株包含少於2%的CD8+細胞。於某些具體例中，(a)、(b)，以及(c)中之各個GA專一性人類T細胞株包含
少於1%的CD8+細胞。
本發明亦有關於一種使用分析方法組來判定格拉默醋酸鹽(GA)測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的方法，該方法包含：1)用適合的APC來孵育分析方法組內各個GA專一性人類T細胞株的細胞；2)用一數量的該GA測試製備物，來刺激步驟(1)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株之各者預定數目的細胞；3)用相同數量的該GA參考標準品，來分別刺激步驟(1)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株之各者相同預定數目的細胞；4)測量步驟(2)和(3)內經刺激的該GA專一性人類T細胞株之各者的至少一個GA引出的反應；以及5)比較用該GA測試製備物刺激的各GA專一性人類T細胞株獲得的該至少一個GA引出的反應之量度(measurement)，及用該GA參考標準品刺激的相同GA專一性人類T細胞株獲得的該至少一個GA引出的反應之量度；其中當步驟(5)內的量度比較落在可以接受的範圍內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品判定為免疫同一性的。
於具體例中，該適合的APC能包含選自於以下所構成的群組之細胞：艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein Barr Virus)轉形的(EBV轉形的)人類B細胞，其對GA專一性人類T細胞為自體的；EBV轉形的人類B細胞，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子；對GA專一性人類T細胞為自體的PBMC；具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子之PBMC；經純化的單核球，其對GA專一性
人類T細胞為自體的；經純化的單核球，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子；經純化的樹突狀細胞(dendritic cell)，其對GA專一性人類T細胞為自體的；以及經純化的樹突狀細胞，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子。
於具體例中，該可以接受的範圍為大約80%至大約120%，或是大約90%至大約110%。於以上的方法之具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係選自於增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及其等之組合。於具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係反應之生物標記的產生，以及該反應之生物標記為細胞介素、趨化介素(chemokine)，或是活化標誌。於某些具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21 IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)，及IL-1b。於具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，該反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。
於具體例中，該至少一個測量的GA引出的反應係編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及該核酸所編碼的反應之生物標記為細胞介素、趨化介素，或是活化標誌。於具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的細
胞介素：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，及IL-1b。於某些具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，該編碼的反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，以及CXCL7。
於具體例中，用該GA測試製備物刺激的細胞之至少二個GA引出的反應被測量，以及用該GA參考標準品刺激的細胞之同樣的至少二個GA引出的反應被測量。於此等具體例中，該至少二個GA引出的反應可以選自於以下的的表現：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β、IL-1b、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279、HLA-DR、IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、編碼IL-2的核酸、編碼IL-4的核酸、編碼IL-5的核酸、編碼IL-6的核酸、編碼IL-10的核酸、編碼IL-13的核酸，或編碼IL-17的核酸、編碼IL-22的核酸、編碼IFN-γ的核酸、編碼TNF-α(TNF)的核酸、編碼TNF-β(LT)的核酸、編碼TGF-β的核酸、編碼IL-1b的核酸、編碼CD69的核酸、編碼CD25的核酸、編碼CD71的核酸、編碼CD137的核酸、編碼CD154的核酸、編碼CD278的核酸、編碼CD279的核酸、編碼HLA-DR的核酸、編碼IL-8(CXCL8)的核酸、
編碼RANTES(CCL5)的核酸、編碼CCL1的核酸、編碼CXCL4的核酸，以及編碼CXCL7的核酸。
於具體例中，該GA參考標準品為Copaxone或是GMA。
於具體例中，該適合的APC具有至少一個能夠呈現GA胜肽之HLA-DR限制性元素。於某些具體例中，該至少一個能夠呈現GA胜肽之HLA-DR限制性元素係選自於：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，以及DR-15。
於具體例中，其中該步驟(a)內經孵育的該至少一個GA專一性人類T細胞株為一種長期的T細胞株。於具體例中，該至少一個GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的。於具體例中，該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在刺激之前已經維持於培養物內歷時至少大約四週，事先再刺激至少四次，或是二者都有。於具體例中，該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株已經事先再刺激至少八次。於具體例中，該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株於培養物內之維持，包含在缺乏促分裂原(mitogen)的情況下，用GA和自體的APC反復的再刺激。
於具體例中，該刺激包括用一系列數量的該GA測試製備物中的一者，用APC予以孵育或在APC存在下，來刺激GA專一性人類T細胞的至少三個樣本之各者，以及用相同序列數量的該GA參考標準品中的一者，用APC予以孵育或在APC存在下，來刺激GA專一性人類T細胞的至少
三個樣本之各者。於具體例中，該序列數量的該GA測試製備物，及該序列數量的該GA參考標準品，包含大約1ng/mL GA至大約1mg/mL GA的上升劑量。於具體例中，該序列數量的該GA測試製備物，及該序列數量的該GA參考標準品，為大約1μg/mL GA至大約30μg/mL GA的上升劑量。
本發明亦有關於一種包含GA的藥物產品或藥學組成物，其係藉由一種方法而製備，該方法包含：1)使經保護的格拉默醋酸鹽與氫溴酸反應以形成三氟乙醯GA，用哌啶水溶液(aqueous piperidine solution)處理該三氟乙醯共聚物-1來形成GA，以及純化該GA，而製備GA測試製備物；2)判定該GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的，其係藉由：a)用適合的抗原呈現細胞(APC)來孵育該至少一個GA專一性人類T細胞株的細胞；b)用一數量的該GA測試製備物來刺激至少一個樣本，該至少一個樣本包含(a)內孵育的該至少一個GA專一性人類T細胞株之預定數目的細胞，以及分別用該數量的該GA參考標準品來刺激至少一個樣本，該至少一個樣本包含步驟(a)內孵育的該至少一個GA專一性人類T細胞株之相同預定數目的細胞；c)測量步驟(b)內用該GA測試製備物刺激的該至少一個GA專一性人類T細胞株之至少一個GA引出的反應，及測量步驟(b)內用該GA參考標準品刺激的該至少一個GA專一性人類T細胞株之相同的至少一個GA引出的反應；以及d)比較步驟(b)內用該GA測試製備物刺激的該至少一個GA專一性人類T細胞株之至少一個樣本的細胞，該至少一個GA引出的反應
之量度(measurement)，及步驟(b)內用該GA測試製備物刺激的該至少一個GA專一性人類T細胞株之至少一個樣本的細胞，該相同的至少一個GA引出的反應之量度；其中當步驟(d)內之量度比較落在可以接受的範圍內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品判定為免疫同一性的，以及其中設若判定其對該GA參考標準品有免疫同一性，則使該GA測試製備物混合於該藥物產品或藥學組成物內。
本發明額外地有關於一種包含GA的藥物產品或藥學組成物，其係藉由一種方法而製備，該方法包含：1)使經保護的格拉默醋酸鹽與氫溴酸反應以形成三氟乙醯GA，用哌啶水溶液(aqueous piperidine solution)來處理該三氟乙醯共聚物-1來形成GA，以及純化該GA，而製備GA測試製備物；2)使用請求項1-24、25-46，或是139-160之方法來判定該GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的。
本發明進一步有關於一種套組，其包含本發明的分析方法組、用於分析方法組內各個GA專一性人類T細胞株之適合的APC，以及GA參考標準品。
本說明書提及之所有的刊物、專利及專利申請案係併入本文以作為參考資料，猶如明確且個別地表明各個個別的刊物、專利或專利申請案併入作為參考資料。
所附的申請專利範圍詳細地列舉本發明的新穎
特徵。參照下列列舉出闡釋性具體例的詳細說明，闡釋性具體例使用本發明的原理，及附圖會更瞭解本發明的特徵及優點。
圖1.一種供鑑別GA專一性人類T細胞株的方法。此圖顯示依據本發明的方法能用來鑑別GA專一性人類T細胞株之一系列的步驟。
圖2A及2B.供給者1 GMA擴展的T細胞株AG12、BC11、AG11及BA11對自體的APC呈現的GMA起反應之增殖作用。此圖顯示細胞增殖之ATP分析的結果，其係使用在自體的APC存在下，用0、1、10，或100μg/mL GMA(Mylan Pharmaceuticals，Inc.)所孵育之四個供給者1 GMA擴展的T細胞株來進行。零對照樣本(zero control sample)係用APC孵育但是無抗原。2A.供給者1 T細胞株AG12(深灰色長條)及BC11(淺灰色長條)在自體的APC存在下，對增高濃度的GA起反應之增殖作用。2B.供給者1 T細胞株AG11(深灰色長條)及BA11(淺灰色長條)在自體的APC存在下，對增高濃度的GA起反應之增殖作用。
圖3A-3C.供給者1 GMA擴展的T細胞株對自體的APC呈現的GMA或COP起反應之增殖作用。此圖顯示ATP分析的結果，其係使用增高濃度的GA和自體的APC所孵育之三個供給者1 GMA T細胞株來進行。3A.用0、0.3、1、3、10，或30μg/mL GMA(Mylan Pharmaceuticals，Inc.；深灰色長條)或Copaxone(Teva Pharmaceuticals USA，Inc.；淺灰色長條)和自體的APC所孵育的供給者1 T細胞株BA11之
增殖作用。3B.用0、1、3，或10μg/mL GMA(深灰色長條)或Copaxone(淺灰色長條)和自體的APC所孵育的供給者1 T細胞株BC11(淺灰色長條)之增殖作用。3C.用0、3、10，和30μg/mL GMA(深灰色長條)或Copaxone(淺灰色長條)和自體的APC所孵育的供給者1 T細胞株AG12之增殖作用。
圖4A及4B.由於供給者1 GMA擴展的T細胞株對EBV轉形的B-LCL呈現的GMA或COP起反應所致之IFN-γ產生。此圖顯示IFN-γ分析的結果，其係使用在自體的EBV轉形的B-LCL存在下，GMA、COP，或破傷風類毒素(Tetanus Toxoid)(Mylan Pharmaceuticals，Inc.)所孵育之二個供給者1 GMA擴展的T細胞株之懸浮液來進行。4A.在自體的EBV轉形的B-LCL(深灰色長條)或來自一個對偶基因匹配的供給者之EBV轉形的B-LCL(206 B-LCL；淺灰色長條)存在下，供給者1 T細胞株AG11所產生的IFN-γ。4B.在自體的EBV轉形的B-LCL(深灰色長條)或來自一個對偶基因匹配的供給者之EBV轉形的B-LCL(206 B-LCL；淺灰色長條)存在下，供給者1 T細胞株AG12所產生的IFN-γ。
圖5A-5G.七個供給者1 COP擴展的T細胞株對自體的APC呈現的GMA或COP起反應之增殖作用。此圖顯示增殖作用之ATP分析的結果，其係使用0、1、3，或10μg/mL GMA(Mylan Pharmaceuticals，Inc.)和自體的APC所孵育的四個供給者1 COP T細胞株來進行。零對照樣本係用自體的APC孵育但是無抗原。5A.供給者1 T細胞株2D8對GMA(深灰色長條)或COP(淺灰色長條)起反應之增殖作用。5B.供給
者1 T細胞株1H12對GMA(深灰色長條)或COP(淺灰色長條)起反應之增殖作用。5C.供給者1 T細胞株2F12對GMA(深灰色長條)或COP(淺灰色長條)起反應之增殖作用。5D.供給者1 T細胞株2B8對GMA(深灰色長條)或COP(淺灰色長條)起反應之增殖作用。5E.供給者1 T細胞株1C5對GMA(深灰色長條)或COP(淺灰色長條)起反應之增殖作用。5F.供給者1 T細胞株2B11對GMA(深灰色長條)或COP(淺灰色長條)起反應之增殖作用。5G.供給者1 T細胞株2E1對GMA(深灰色長條)或COP(淺灰色長條)起反應之增殖作用。
圖6A-6F.由於供給者1 COP擴展的T細胞株對自體的APC呈現的GMA或COP起反應所致之細胞介素分泌作用。6A.供給者1 T細胞株2D8對三個濃度的GMA各者所致之細胞介素分泌作用。6B.供給者1 T細胞株2D8對三個濃度的COP各者所致之細胞介素分泌作用。6C.供給者1 T細胞株1H12對三個濃度的GMA各者所致之細胞介素分泌作用。6D.供給者1 T細胞株1H12對三個濃度的COP各者所致之細胞介素分泌作用。6E.供給者1 T細胞株2F12對三個濃度的GMA各者所致之細胞介素分泌作用。6F.供給者1 T細胞株2F12對三個濃度的COP各者所致之細胞介素分泌作用。箭頭表示各細胞介素資料集之對照樣本分泌位準的位置，接著從左至右為用自體的APC呈現的1μg/mL GA、3μg/mL GA、10μg/mL GA，及MBP作為對照所刺激的細胞之分泌位準。
圖7A及7B.供給者2 T細胞株1A7在自體的APC 的存在下，對GMA或COP起反應之增殖作用及IFN-γ的產生。7A.顯示出供給者2 T細胞株1A7對0、0.1、0.3、1、3、10、30，或100μg/mL的GMA的刺激起反應之增殖作用。7B.顯示出供給者2 T細胞株1A7對0、0.1、0.3、1、3、10、30，或100μg/mL的GMA的刺激起反應之IFN-γ的分泌作用。於各實驗中，淺灰色0μg/mL抗原長條代表含有1μg/mL破傷風類毒素、自體的APC及無GA之對照樣本，以及深灰色0μg/mL抗原長條代表含有自體的APC及無GA之對照樣本。
圖8.供給者4 T細胞株205-1C4對COP、胜肽026、GAT 631、GLT 631起反應之增殖作用。顯示出供給者4 T細胞株205-1C4對0、1、10及30μg/mL COP、胜肽026、GAT 631、GLT 631的刺激起反應之增殖作用。
圖9A及9B.供給者3 T細胞株165-B5G及165-C4G之HLA-DR限制性。9A.在有或沒有COP孵育的供給者3、5，或6絲裂黴素處理的APC存在下，供給者3 T細胞株165-B5G之增殖作用。9B.在有或沒有GMA孵育的供給者3、5，或6絲裂黴素處理的APC的存在下，供給者3 T細胞株165-C4G之增殖作用。於二個圖中：空的長條=無抗原；實心長條=20μg/mL GA。
圖10A及10B.供給者3 T細胞株165-C5G及165-E9G之HLA-DR限制性。10A.在有或沒有COP孵育的供給者3、5，或6絲裂黴素處理的APC的存在下，供給者3 T細胞株165-C5G之增殖作用。10B.在有或沒有COP孵育的供
給者3、5，或6絲裂黴素處理的APC的存在下，供給者3 T細胞株165-E9G之增殖作用。於二個圖中：空的長條=無抗原；實心長條=20μg/mL COP。
圖11A及11B.供給者3 T細胞株165-F5G及165-F10G之HLA-DR限制性。11A.在有或沒有COP孵育的供給者3、5，或6絲裂黴素處理的APC的存在下，供給者3 T細胞株165-F5G之增殖作用。11B.在有或沒有GMA孵育的供給者3、5，或7絲裂黴素處理的APC的存在下，供給者3 T細胞株165-F10G之增殖作用。於二個圖中：空的長條=無抗原；實心長條=20μg/mL GA。
圖12A及12B.供給者3 T細胞株165-B6C及165-C7C之HLA-DR限制性。12A.在有或沒有COP孵育的絲裂黴素處理的供給者3、5，或6之APC的存在下，供給者3 T細胞株165-B6C之增殖作用。12B.在有或沒有COP孵育的供給者3、5，或6之APC的存在下，供給者3 T細胞株165-C7C之增殖作用。於二個圖中：空的長條=無抗原；實心長條=20μg/mL COP。
圖13A及13B.供給者3 T細胞株165-D3C及165-F3C之HLA-DR限制性。13A.在有或沒有GMA孵育的絲裂黴素處理的供給者3、5，或7之APC的存在下，供給者3 T細胞株165-D3C之增殖作用。13B.在有或沒有COP孵育的供給者3、5，或6之APC的存在下，供給者3 T細胞株165-F3C之增殖作用。於二個圖中：空的長條=無抗原；實心長條=20μg/mL GA。
圖14A及14B.供給者3 T細胞株165-F6C及205-1H7之HLA-DR限制性。14A.在有或沒有COP孵育的供給者3、5，或7絲裂黴素處理的APC的存在下進行刺激後，供給者3 T細胞株165-F5G之增殖作用。14B.在有或沒有COP孵育的供給者3、5，或6絲裂黴素處理的APC的存在下，供給者4 T細胞株205-1H7之增殖作用。於二個圖中：各對之左方長條=無抗原；各對之右方長條=20μg/mL COP。
圖15A及15B.根據流動式細胞測量術來特徵化GA專一性人類T細胞株165-E9G CD4及CD8的表現。15A.用PE或FITC標記的非專一性對照小鼠抗-IgG1單株抗體之結合如指示。15B.用PE標記的抗-CD8單株抗體及用FITC標記的抗CD4單株抗體之結合如指示。
圖16A及16B.根據流動式細胞測量術來特徵化GA專一性人類T細胞株165-F5G CD4及CD8的表現。15A.用PE或FITC標記的非專一性對照小鼠抗-IgG1單株抗體之結合如指示。15B.用PE標記的抗-CD8單株抗體及用FITC標記的抗CD4單株抗體之結合如指示。
圖17A及17B.對改變的GA批(GA Lot)009起反應之供給者1 T細胞株之增殖作用。17A.顯示出供給者1 T細胞株222-2D8對0、1、2、2.5及5μg/mL COP，以及改變的GA批009的刺激起反應之增殖作用。17B.顯示出供給者1 T細胞株222-2F12對0、1、2、2.5及5μg/mL COP，以及變化的GA批009的刺激起反應之增殖作用。
圖18A及18B.對改變的GA批009起反應之供給者 3 T細胞株之增殖作用。18A.顯示出供給者3 T細胞株165-F3C對0、1、2、2.5及5μg/mL COP，以及改變的GA批009的刺激起反應之增殖作用。18B.顯示出供給者1 T細胞株165-F6C對0、1、2、2.5及5μg/mL COP，以及變化的GA批009的刺激起反應之增殖作用。
圖19A及19B.對改變的GA批009起反應之供給者4 T細胞株之增殖作用。19A.顯示出供給者4 T細胞株205-1C4對0、1、2、2.5及5μg/mL COP，以及改變的GA批009的刺激起反應之增殖作用。19B.顯示出供給者1 T細胞株205-1C4對0、1、2、2.5及5μg/mL COP，以及變化的GA批009的刺激起反應之增殖作用。
Copaxone®於多發性硬化症之作用機制至少部分由T細胞活性之免疫調節所媒介，以及T細胞對GA之免疫反應為GA製備物內存在的抗原決定位之特異且敏感的測量法。因為各別的T細胞區分不同但非常相似的胜肽之獨特的能力，所以分析培養物內GA專一性人類T細胞株之GA引出的反應，可以區分GA製備物之間的免疫相關差異。在這方面，GA專一性人類T細胞株對於GA測試製備物及GA參考標準品之均等的GA引出的反應，可以指出GA參考標準品及GA測試製備物具有免疫同一性。本發明係基於證明能夠產生及鑑別GA專一性人類T細胞株，以及使用來測試不同的GA製備物之免疫同一性。再者，已經顯示出能夠產生
會鑑別不同的GA抗原決定位之GA專一性人類T細胞株。結果，能夠產生，鑑別及於分析方法組內平行地(in parallel)使用的GA專一性人類T細胞株，其會辨識許多，即使不是全部，不同的GA抗原決定位，以容許以高度信賴度的方式來判定比較的GA製備物具有免疫同一性。
格拉默醋酸鹽(GA)係由合成性多肽之醋酸鹽組成，其含有四種天然存在的胺基酸：L-麩胺酸、L-丙胺酸、L-酪胺酸以及L-離胺酸，分別具有0.141、0.427、0.095及0.338之平均莫耳分率。GA之平均分子量為5,000-9,000道耳頓。化學上，GA被定名為具有L-丙胺酸、L-離胺酸以及L-酪胺酸、醋酸(鹽)之L-麩胺酸聚合物。格拉默醋酸鹽之實驗式為(C5H9NO4‧C3H7NO2‧C6H14N2O2‧C9H11NO3)x‧xC2H4O2(CAS-147245-92-9，醫師案頭參考(Physician’s Desk Reference))。
當使用於本文中，“GA”係提及格拉默醋酸鹽，包括例如Mylan Pharmaceuticals，Inc.生產的格拉默醋酸鹽“GMA”，以及Teva Pharmaceuticals USA，Inc.生產及販售的格拉默醋酸鹽，“Cop”或“Copaxone”。FDA於1996年批准Copaxone用於治療降低復發緩解型多發性硬化症(RRMS)。其之組成描述於文獻中，例如美國專利第3,849,550號，“Therapeutic copolymer”，以及美國專利第5,800,808號，“Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers”，以及於Copaxone ®(Teva Pharmaceuticals
USA，Inc.)之產品標示上，各者之整體併入本文以作為參考資料。
GA可以藉由已知及公開的方法來產生。生產Copaxone的方法已經描述於，例如美國專利第3,849,550號，“Therapeutic copolymer”，以及美國專利第5,800,808號，“Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers”。根據美國專利第5,800,808號，共聚物-1可以藉由本技藝已知的方法來製備，舉例而言藉由美國專利第3,849,550號中揭示的方法，其中酪胺酸、丙胺酸及y-苯甲麩胺酸酯(y-benzyl glutamate)之N-羧酸酐(N-carboxyanhydrides)係於無水二烷內，加上二乙胺作為起始劑、於周圍溫度下聚合。麩胺酸的y-羧酸基團之去阻隔(deblocking)係透過配於冰醋酸內之溴化氫來作用，以及接著藉由1M哌啶而從離胺酸殘基移除三氟乙醯基團。
於本發明的方法之具體例中，一種GA專一性人類T細胞株對GA的測試或產生製備物、批(lot)或批次(batch)，之GA引出的反應係與GA參考標準品製備物之相同GA引出的反應作比較。於具體例中，一種GA測試製備物是希望測試的任何GA製備物、批或批次。於具體例中，該GA測試製備物是新製造的GA製備物。於其他具體例中，該GA測試製備物不是新製造的GA製備物，但是仍然是希望測試的，例如要評估該製備物的擱置壽命(shelf-life)。一
種GA參考標準品批或GA參考標準品亦可以是希望的任何GA製備物、批或批次，例如GMA或COP。於具體例中，本發明的方法用來比較二個或更多個GA的測試或產生製備物、批(lot)或批次，對彼此，或是對希望的任何另一個GA製備物。於具體例中，該GA測試製備物是GMA製備物。於具體例中，該GA測試製備物和GA參考標準品是不同的GMA製備物。於具體例中，多重的GA測試製備物係與GA參考標準品作比較。於具體例中，比較的GA製備物為，例如GMA製備物與COP製備物、二個GMA製備物，或是另一個製造商製造的GA製備物以及GMA或COP。
本發明係有關於有用於評估GA製備物之GA專一性人類T細胞株分析方法。此等分析方法，例如在製造的期間或是在製造方法改變以後，可以確保GA製備物的一致性。於具體例中，本發明的方法係用來判定GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的，其係藉由在用GA測試製備物或GA參考標準品分別刺激細胞株之後，比較GA專一性人類T細胞株之至少一個GA引出的反應。根據本文呈現的結果，可以產生及鑑別出GA專一性人類T細胞株，其能夠分辨一種刺激的GA製備物之組成內隱微的差異。當用來刺激GA專一性人類T細胞株時，刺激抗原之隱微的差異導致GA專一性人類T細胞株之GA引出的反應上可測量的差異。
本發明的分析方法亦有用於判定GA測試製備物
之相對的效力，例如GA測試製備物與GA參考標準品相比時之效力。此等方法係有用於確保在製造可以接受的藥學用途之格拉默醋酸鹽的期間，藥物製備物之間一致的效力。
於本發明的具體例中，至少一個GA引出的反應係於GA測試製備物的分析方法中予以測量，以及與GA參考標準品之相同GA引出的反應作比較，以提供所欲的相對效力。所欲的相對效力可以表達為，例如對GA測試製備物的反應比上對GA參考標準品的反應之比率，或部分、分率(fraction)，或百分率，當量度(measurement)相等時百分率為100。
於本發明的具體例中，產生或測試製備物之GA的相對效力係藉由比較一個代表GA專一性人類T細胞株對GA測試製備物之免疫反應之數值，和一個代表相同細胞株對GA參考標準品之相同的免疫反應之數值來判定。此效力判定說明了GA測試製備物的刺激能力。於具體例中，本發明的效力分析方法係用來判定一GA製備物是否具有所欲的效力。
圖1顯示依據本發明的方法供產生及鑑別COP或GMA專一性人類T細胞株的一般方案。
最初，從正常、健康、未曾接受過GA(GA-naïve)的供給者獲得細胞樣本。採集供給者PBMC供使用，例如經由白血球分離術(leukapheresis)或靜脈穿刺。在第0天用一數量的起始胜肽(GA製備物)來刺激大約5 x 105至大約1 x 106
細胞/mL的密度之採集的細胞。於具體例中，採集的細胞最初係以大約5 x 105細胞/mL、大約6 x 105細胞/mL、大約7 x 105細胞/mL、大約8x 105細胞/mL、大約9 x 105細胞/mL，或是1 x 106細胞/mL，細胞/mL的密度來刺激。培養經刺激的細胞，以及於具體例中週期性地用生長促進劑，例如IL-2來處理，然後篩選對起始胜肽有反應性的部分。用起始胜肽及適合的APC，以及視需要加上生長促進劑，來再刺激細胞株培養物對起始胜肽有反應性的剩餘部分。經再刺激的GA有反應的細胞株培養物接而篩選抗原專一性，其係藉由使用如同本文中所述的專一性分析方法，來比較細胞在MHC匹配的APC的存在下，對起始胜肽刺激的反應，以及在MHC匹配的APC的存在下，適合的對照例如其他的GA製備物，及其他的(不相關的)抗原例如破傷風類毒素，細胞的反應。一種對GA起反應但不對不相關的抗原起反應之細胞株被鑑別為GA專一性人類T細胞株。剩餘的細胞株培養物之再刺激係如前用起始胜肽及適合的APC，以及視需要加上生長促進劑，例如供細胞株擴展或是製備供確認GA專一性的分析方法，或是進一步特徵化該細胞株的分析方法。特徵化分析方法進一步測試一種經鑑別的GA反應性(responsive)的人類T細胞株，例如MHC限制性、對GA刺激起反應而產生反應之生物標記，或是對非正則GA胜肽的反應性。
於某些具體例中，篩選GA反應性的T細胞株，以及篩選GA專一性係在起始的刺激之後一起進行。於此等具
體例中，各別在MHC匹配的APC的存在下，使用無抗原對照和不相關的抗原對照二者是預期的。於具體例中，人類T細胞株之GA專一性的起始判定係於再刺激細胞株之後予以確認。於具體例中，一種經鑑別的GA專一性人類T細胞株於多回的再刺激之後，例如在至少2至10回或是更多回的再刺激之後，證明為GA專一性的。於具體例中，一種經鑑別的GA專一性人類T細胞株於至少2回、至少3回、至少4回、至少5回、至少6回、至少7回、至少8回、至少9回、至少10回、3至10回、4至10回、5至10回、6至10回、7至10回、8至10回、9至10回、2至9回、2至8回、2至7回、2至6回、2至5回、2至4回、3至9回、3至8回、3至7回、3至6回、3至5回、4至9回、4至8回、4至7回、4至6回、5至9回、5至8回、5至7回、6至9回、6至8回、7至9回，或是8至10回的再刺激之後，證明為GA專一性的。
於具體例中，採集的細胞係以大約1 x 105至大約1 x 106細胞/mL、大約1 x 105細胞/mL、大約1.5 x 105細胞/mL、大約2 x 105細胞/mL、大約2.5 x 105細胞/mL、大約3 x 105細胞/mL、大約3.5 x 105細胞/mL、大約4 x 105細胞/mL、大約4.5 x 105細胞/mL、大約5 x 105細胞/mL、大約6 x 105細胞/mL、大約7 x 105細胞/mL、大約8 x 105細胞/mL、大約9 x 105細胞/mL，或是1 x 106細胞/mL，的密度予以再刺激。
於本發明其他的具體例中，藉由所述的方法鑑別的GA專一性人類T細胞株，包括對非正則GA胜肽起反應之GA專一性人類T細胞株，係預期可供使用於本發明的方法
供判定GA製備物之免疫同一性。
起始的刺激使用的起始胜肽可以是希望的任何GA製備物包括，但是不限於任何COP製備物或任何GMA製備物。於具體例中，再刺激使用的胜肽係如同起始胜肽之相同的GA製備物。於具體例中，再刺激使用的胜肽濃度係如同起始胜肽使用之相同的胜肽濃度。於具體例中，該刺激的胜肽(也稱為「起始胜肽」)或再刺激胜肽係以大約1ng/mL GA至大約1mg/mL GA的濃度添加。於具體例中，起始的刺激或再刺激使用的胜肽濃度為大約1ng/mL至大約1mg/mL、大約1ng/mL至大約500μg/mL、大約1ng/mL至大約100μg/mL、大約1ng/mL至大約50μg/mL、大約1ng/mL至大約10μg/mL、大約1ng/mL至大約1μg/mL、大約1ng/mL至大約500ng/mL、大約1ng/mL至大約100ng/mL、大約100ng/mL至大約1mg/mL、大約100ng/mL至大約500μg/mL、大約100ng/mL至大約100μg/mL、大約100ng/mL至大約10μg/mL、大約100ng/mL至大約1μg/mL、大約100ng/mL至大約500ng/mL、大約500ng/mL至大約1mg/mL、大約500ng/mL至大約500μg/mL、大約500ng/mL至大約100μg/mL、大約500ng/mL至大約10μg/mL、大約500ng/mL至大約1μg/mL、大約1μg/mL至大約1mg/mL、大約1μg/mL至大約900μg/mL、大約1μg/mL至大約800μg/mL、大約1μg/mL至大約700μg/mL、大約1μg/mL至大約600μg/mL、大約1μg/mL至大約500μg/mL、大約1μg/mL至大約400μg/mL、大約1μg/mL至大約300μg/mL、大約1μg/mL至大
約200μg/mL、1μg/mL至大約100μg/mL、1μg/mL至大約90μg/mL、1μg/mL至大約80μg/mL、1μg/mL至大約70μg/mL、1μg/mL至大約60μg/mL、1μg/mL至大約50μg/mL、1μg/mL至大約40μg/mL、1μg/mL至大約30μg/mL、大約10μg/mL至大約1mg/mL、大約10μg/mL至大約900μg/mL、大約10μg/mL至大約800μg/mL、大約10μg/mL至大約700μg/mL、大約10μg/mL至大約600μg/mL、大約10μg/mL至大約500μg/mL、大約10μg/mL至大約400μg/mL、大約10μg/mL至大約300μg/mL、大約10μg/mL至大約200μg/mL、大約10μg/mL至大約100μg/mL、大約10μg/mL至大約90μg/mL、大約10μg/mL至大約80μg/mL、大約10μg/mL至大約70μg/mL、大約10μg/mL至大約60μg/mL、大約10μg/mL至大約50μg/mL、大約10μg/mL至大約40μg/mL、大約10μg/mL至大約30μg/mL、大約50μg/mL至大約1mg/mL、大約50μg/mL至大約900μg/mL、大約50μg/mL至大約800μg/mL、大約50μg/mL至大約700μg/mL、大約50μg/mL至大約600μg/mL、大約50μg/mL至大約500μg/mL、大約50μg/mL至大約400μg/mL、大約50μg/mL至大約300μg/mL、大約50μg/mL至大約200μg/mL、大約50μg/mL至大約500μg/mL、大約50μg/mL至大約90μg/mL、大約50μg/mL至大約80μg/mL、大約50μg/mL至大約70μg/mL、大約100μg/mL至大約1mg/mL、大約100μg/mL至大約900μg/mL、大約100μg/mL至大約800μg/mL、大約100μg/mL至大約700μg/mL、大約100μg/mL至大約600
μg/mL、大約100μg/mL至大約500μg/mL、大約100μg/mL至大約400μg/mL、大約100μg/mL至大約300μg/mL、大約100μg/mL至大約200μg/mL、大約100μg/mL至大約150μg/mL、大約200μg/mL至大約1mg/mL、大約200μg/mL至大約900μg/mL、大約200μg/mL至大約800μg/mL、大約200μg/mL至大約700μg/mL、大約200μg/mL至大約600μg/mL、大約200μg/mL至大約500μg/mL、大約200μg/mL至大約400μg/mL、大約200μg/mL至大約300μg/mL、大約200μg/mL至大約250μg/mL、大約300μg/mL至大約1mg/mL、大約300μg/mL至大約900μg/mL、大約300μg/mL至大約800μg/mL、大約300μg/mL至大約700μg/mL、大約300μg/mL至大約600μg/mL、大約300μg/mL至大約500μg/mL、大約300μg/mL至大約400μg/mL、大約400μg/mL至大約1mg/mL、大約400μg/mL至大約900μg/mL、大約400μg/mL至大約800μg/mL、大約400μg/mL至大約700μg/mL、大約400μg/mL至大約600μg/mL、大約400μg/mL至大約500μg/mL、大約500μg/mL至大約1mg/mL、大約500μg/mL至大約900μg/mL、大約500μg/mL至大約800μg/mL、大約500μg/mL至大約700μg/mL、大約500μg/mL至大約600μg/mL、大約750μg/mL至大約1mg/mL、大約750μg/mL至大約900μg/mL、大約750μg/mL至大約800μg/mL，或是大約800μg/mL至大約1mg/mL。
於具體例中，起始的刺激係藉由添加所欲濃度的起始胜肽至含有大約1 x 105個細胞至大約2 x 105個細胞的
細胞樣本來進行。於具體例中，該細胞樣本的體積為100至200μl，以及樣本之細胞密度為大約5 x 105細胞/mL至大約1 x 106細胞/mL。於具體例中，以大約1μg/mL至大約100μg/mL的最終胜肽濃度來添加該起始胜肽至該細胞樣本。
於具體例中，一個或更多個生長促進劑在起始的刺激之後或再刺激之後，添加至細胞培養物或樣本內一次或更多次。於具體例中，該生長促進劑為IL-2。在培養的期間，可以視需要以規則的間隔或不規則的間隔來添加該生長促進劑，譬如每2至10天，取決於例如細胞的生長速率。於具體例中，每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每8天、每9天，或是每10天來添加該生長促進劑。如同熟悉此藝者已知的，生長促進劑適合的添加量可以依據培養物的生長特徵來決定，譬如用顯微鏡來檢查的細胞健康狀況，以及pH指示劑染料所指示的培養基pH。於具體例中，每毫升的細胞培養物添加大約5至大約30單位(U)的IL-2。於具體例中，每毫升的細胞培養物添加大約10、大約15、大約17、大約18、大約19、大約20、大約21、大約22、大約23、大約5至大約30、大約5至大約25、大約5至大約20、大約5至大約15、大約5至大約10、大約10至大約30、大約10至大約25、大約10至大約20、大約10至大約15、大約15至大約30、大約15至大約25、大約15至大約20、大約20至大約30、大約20至大約25、大約25至大約30、大約17至大約23、大約18至大約22，或者大約19至大約21單位的IL-2。於具體例中，在起始的刺激之後，於D3和D6添加大
約20U/mL IL-2至細胞培養物。於具體例中，在起始的刺激之後，每3天添加大約15至大約25U/mL IL-2至細胞培養物。於具體例中，於再刺激之後18小時至2天添加大約15至大約25U/mL IL-2至細胞培養物。於具體例中，於再刺激之後18小時至24小時添加大約20U/mL IL-2至細胞培養物。於具體例中，將起始胜肽添加至含有大約5 x 105細胞/mL至大約1 x 106細胞/mL的細胞樣本。於具體例中，以大約1μg/mL至大約100μg/mL的最終胜肽濃度以大約1μg/mL至大約100μg/mL的最終濃度(at a final peptide concentration of about 1μg/mL to about 100μg/mL at a final concentration of about 1μg/mL to about 100μg/mL)來添加該起始胜肽至該細胞樣本，以及IL-2以大約15至大約25U/mL的最終濃度添加至該細胞樣本。於具體例中，在起始的刺激後及篩選反應性之前，以大約1μg/mL至大約100μg/mL的最終濃度來添加該起始胜肽至含有大約5 x 105細胞/mL至大約1 x 106細胞/mL的細胞樣本，以及IL-2以大約15至大約25U/mL的最終濃度添加至該細胞樣本至少二次。於具體例中，在起始的刺激後，於D3和D6以大約1μg/mL至大約100μg/mL的最終濃度來添加該起始胜肽至含有大約5 x 105細胞/mL至大約1 x 106細胞/mL的細胞樣本，以及IL-2以大約15至大約25U/mL的最終濃度添加至該細胞樣本。於具體例中，在起始的刺激之後，每3天以大約1μg/mL至大約100μg/mL的最終濃度來添加該起始胜肽至含有大約5 x 105細胞/mL至大約1 x 106細胞/mL的細胞樣本，以及IL-2以大約15至大約25
U/mL的最終濃度添加至該細胞樣本。
在起始胜肽的刺激後至少大約7至大約16天，如圖1中所示，篩選細胞株對起始胜肽的反應性。於具體例中，在第0天用起始胜肽進行起始刺激之後，至少大約7天、至少大約8天、至少大約9天、至少大約10天、至少大約11天、至少大約12天、至少大約13天、至少大約14天、至少大約15天、至少大約16天、大約7至大約16天、大約8至大約14天、大約8至大約12天、大約8至大約10天、大約10至大約16天、大約10至大約14天、大約12至大約16天，或者大約12至大約14天，或是只要培養物在沒有再刺激的情況下仍然是健康的，篩選細胞株對起始胜肽的反應性。於具體例中，在用起始胜肽及適合的APC進行至少一次的再刺激之後，篩選細胞株對起始胜肽的反應性。於具體例中，在第0天用起始胜肽進行起始刺激之後，接著2至10回的再刺激之後，篩選經刺激的細胞培養物對起始胜肽的反應性。因而，經刺激的細胞培養物可以在任何時間篩選，例如在超過大約14天之後，但有條件是當熟悉此藝者判定有需要時予以再刺激。
GA起始胜肽可以依據本技藝已知的方法來製備，其係藉由稀釋胜肽於溶液內，例如懸浮於水及大約20mg/mL甘露糖醇，或是於培養基。供生物分析方法之GA製備物係說明於，例如美國專利第7,429,374號內，“Process for the measurement of the potency of glatiramer acetate”，在此併入以作為參考資料。
如同圖1中所述及描繪的，在起始的刺激後，篩選T細胞培養物之GA反應性。透過製備測試培養物來進行篩選，該測試培養物包含胜肽及適合的APC，以及測量導致的T細胞培養物之GA引出的反應。於使用供給者PBMC之具體例中，供給者PBMC已經含有自體的APC。適合供本發明的方法使用的APC為能夠呈現抗原給T細胞的細胞，包括例如艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein Barr Virus)轉形的(EBV轉形的)人類B細胞，其對GA專一性人類T細胞為自體的；EBV轉形的人類B細胞，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子；經純化的單核球，其對GA專一性人類T細胞為自體的；經純化的樹突狀細胞，其對GA專一性人類T細胞為自體的；對GA專一性人類T細胞為自體的PBMC；EBV轉形的人類B細胞，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子；經純化的單核球，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子，經純化的樹突狀細胞，其具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子，以及具有涉及GA專一性人類T細胞之抗原呈現的DR分子之PBMC。
於具體例中，在使用前藉由任何已知的方法來抑制APC之增殖，包括暴露於γ放射線或是暴露於抗有絲分裂劑，譬如絲裂黴素C(mitomycin C)。
於具體例中，一種T細胞培養物係以以下的細胞密度來篩選GA反應性：大約1 x 105至大約5 x 105細胞/mL、
大約1 x 105細胞/mL、大約1.5 x 105細胞/mL、大約2 x 105細胞/mL、大約2.5 x 105細胞/mL、大約3 x 105細胞/mL、大約3.5 x 105細胞/mL、大約4 x 105細胞/mL、大約4.5 x 105細胞/mL，或是大約5 x 105細胞/mL。
於具體例中，存在的APC數目為等於所使用的T細胞數目或是所使用的T細胞數目的二倍。於具體例中，存在的自體的絲裂黴素處理的PBMC為大約2.5 x 105至大約5 x 106細胞/mL。於具體例中，存在的自體的絲裂黴素處理的PBMC為大約1 x 106至2 x 106細胞/mL。於具體例中，存在的自體的絲裂黴素處理的PBMC為大約2.5 x 106細胞/mL。
於具體例中，存在的自體的絲裂黴素處理的B-LCL為大約1 x 105-1 x 106細胞/mL存在。於具體例中，存在的自體的絲裂黴素處理的B-LCL為大約1 x 105-5 x 105細胞/mL存在。於具體例中，存在的自體的絲裂黴素處理的B-LCL為大約1 x 105細胞/mL、大約1.5 x 105細胞/mL、大約2 x 105細胞/mL、大約2.5 x 105細胞/mL，或是大約5 x 105細胞/mL。於具體例中，本發明的方法之篩選或特徵化分析方法所使用的APC數目係依需要來調整，以增高GA引出的反應，舉例而言與負對照相比之最小的所欲位準。於具體例中，GA引出的反應與負對照相比之最小的所欲位準為1.5倍(亦即，反應為高於大約50%)至大約1000倍，如同以下所述的。
測得的GA引出的反應係與對照所測得的相同反
應相比，譬如含有適合的APC、缺少抗原(GA)的培養物，或是存在適合作為負對照之不相關的抗原的培養物，相同的T細胞株之反應。篩選之讀出可以來自GA引出的反應偏好的任何合適的分析方法，其包括，但是不限於增殖分析方法或是反應之生物標記的分析方法，其中該培養物產生的至少一個細胞介素、細胞介素受體、趨化介素，或T細胞活化標誌的量予以測量。於具體例中，該GA引出的反應係編碼反應之生物標記的核酸之表現。依據用GA培養的T細胞株及對照培養物所測得的GA引出的反應之比較結果，而鑑別出GA專一性人類T細胞株。
於具體例中，一種GA有反應的(reactive)或反應性(responsive)T細胞株係根據GA刺激的該測試培養物所測得的至少一個GA引出的反應之增高來鑑別，該增高係統計上大於無抗原對照培養物或不相關的抗原對照培養物，所測得的相同的至少一個GA引出的反應。於具體例中，一種GA有反應的或反應性T細胞株係藉由以下方式來鑑別：該測試培養物之GA引出的反應，相對於該對照，增高大約1.5倍(亦即，反應為高於大約50%)至大約1000倍、大約1.5倍至大約2倍、大約1.5倍至大約3倍、大約1.5倍至大約4倍、大約1.5倍至大約5倍、大約1.5倍至大約6倍、大約1.5倍至大約7倍、大約1.5倍至大約8倍、大約1.5倍至大約9倍、大約2倍至大約3倍、大約2倍至大約4倍、大約2倍至大約5倍、大約2倍至大約6倍、大約2倍至大約7倍、大約2倍至大約8倍、大約2倍至大約9倍、大約2倍至大約10倍、大約3倍至
大約4倍、大約3倍至大約5倍、大約3倍至大約6倍、大約3倍至大約7倍、大約3倍至大約8倍、大約3倍至大約9倍、大約3倍至大約10倍、大約4倍至大約5倍、大約4倍至大約6倍、大約4倍至大約7倍、大約4倍至大約8倍、大約4倍至大約9倍、大約4倍至大約10倍、大約5倍至大約6倍、大約5倍至大約7倍、大約5倍至大約8倍、大約5倍至大約9倍、大約5倍至大約10倍、大約6倍至大約7倍、大約6倍至大約8倍、大約6倍至大約9倍、大約6倍至大約10倍、大約7倍至大約8倍、大約7倍至大約9倍、大約7倍至大約10倍、大約8倍至大約9倍、大約8倍至大約10倍、大約1.5倍至大約80倍、大約1.5倍至大約70倍、大約1.5倍至大約60倍、大約1.5倍至大約50倍、大約1.5倍至大約40倍、大約1.5倍至大約30倍、大約1.5倍至大約20倍、大約2倍至大約80倍、大約1.5倍至大約70倍、大約1.5倍至大約60倍、大約1.5倍至大約50倍、大約1.5倍至大約40倍、大約1.5倍至大約30倍、大約1.5倍至大約20倍、大約2倍至大約80倍、大約2倍至大約70倍、大約2倍至大約60倍、大約2倍至大約50倍、大約2倍至大約40倍、大約2倍至大約30倍、大約2倍至大約20倍、大約3倍至大約80倍、大約3倍至大約70倍、大約3倍至大約60倍、大約3倍至大約50倍、大約3倍至大約40倍、大約3倍至大約30倍、大約3倍至大約20倍、大約5倍至大約80倍、大約5倍至大約70倍、大約5倍至大約60倍、大約5倍至大約50倍、大約5倍至大約40倍、大約5倍至大約30倍、大約3倍至大約20倍、大約10倍至大約80倍、大約10倍至大約60倍、大約
10倍至大約40倍，或大約10倍至大約20倍、至少大約1.5倍、至少大約2倍、至少大約2.5倍、至少大約3倍、至少大約3.5倍、至少大約4倍、至少大約4.5倍、至少大約5倍、至少大約6倍、至少大約7倍、至少大約8倍、至少大約9倍，或至少大約10倍。
於某些具體例中，一種GA有反應的或反應性T細胞株係由GA刺激的該測試培養物之增殖作用，相對於無抗原對照培養物或不相關的抗原對照培養物之增殖作用，增高至少50%來鑑別。於具體例中，一種GA有反應的或反應性T細胞株係根據GA刺激的該測試培養物所測得的二個或更多個GA引出的反應，相對於無抗原對照培養物或不相關的抗原對照培養物所測得的相同的二個或更多個GA引出的反應，之增高來鑑別。於具體例中，測量2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個GA引出的反應。
進一步如圖1中所示，該GA有反應的T細胞株予以篩選GA專一性。於具體例中，GA專一性的測試和GA反應性的分析方法同時進行，其係藉由額外篩選對適合的負對照抗原，譬如來自不相關的蛋白質之胜肽，不會反應的T細胞株。於具體例中，測試T細胞株的GA專一性係藉由比較用GA刺激測試培養物所測得之至少一個GA引出的反應，相對於含有負對照抗原之培養物所測得之同樣的至少一個GA引出的反應。於具體例中，負對照抗原培養物含有一種負對照抗原，例如破傷風類毒素、MBP、CMV、PPD，
或同種異體的(allogeneic)MHC。
一種經鑑別的GA有反應的T細胞株之GA專一性的測試方法可以作用為GA反應性的確認測試。於具體例中，在專一性的測試之前先確認GA的反應性。於具體例中，一種經鑑別的GA有反應的或GA專一性的人類T細胞株係在培養的任何時間點予以再確認，例如在冷凍的培養物解凍之後。於具體例中，當一種T細胞株對GA參考標準品之反應性的確認測試為陰性時，該T細胞株不再視為GA專一性或有反應的，並且可以丟棄。
於具體例中，一種GA專一性人類T細胞株係藉由對GA刺激起反應所測得的一個(平均值)GA引出的反應來鑑別，該GA引出的反應係統計上大於(平均值)負對照GA引出的反應。
於具體例中，一種GA專一性T細胞株係根據GA刺激的該測試培養物所測得的至少一個GA引出的反應，相對於負對照培養物所測得的同樣的至少一個GA引出的反應，之增高來鑑別。於具體例中，該增高為大約1.5倍至大約10倍(亦即，反應為高於大約50%至高於大約1000%)、大約1.5倍至大約2倍、大約1.5倍至大約3倍、大約1.5倍至大約4倍、大約1.5倍至大約5倍、大約1.5倍至大約6倍、大約1.5倍至大約7倍、大約1.5倍至大約8倍、大約1.5倍至大約9倍、大約2倍至大約10倍、大約2倍至大約3倍、大約2倍至大約4倍、大約2倍至大約5倍、大約2倍至大約6倍、大約2倍至大約7倍、大約2倍至大約8倍、大約2倍至大約9倍、大
約3倍至大約10倍、大約3倍至大約4倍、大約3倍至大約5倍、大約3倍至大約6倍、大約3倍至大約7倍、大約3倍至大約8倍、大約3倍至大約9倍、大約4倍至大約10倍、大約4倍至大約5倍、大約4倍至大約6倍、大約4倍至大約7倍、大約4倍至大約8倍、大約4倍至大約9倍、大約5倍至大約10倍、大約5倍至大約6倍、大約5倍至大約7倍、大約5倍至大約8倍、大約5倍至大約9倍、大約6倍至大約10倍、大約6倍至大約7倍、大約6倍至大約8倍、大約6倍至大約9倍、大約7倍至大約10倍、大約7倍至大約8倍、大約7倍至大約9倍、大約8倍至大約10倍、大約8倍至大約9倍、至少大約1.5倍、至少大約2倍、至少大約2.5倍、至少大約3倍、至少大約3.5倍、至少大約4倍、至少大約4.5倍、至少大約5倍、至少大約6倍、至少大約7倍、至少大約8倍、至少大約9倍，或至少大約10倍。
於具體例中，一種GA專一性人類T細胞株係使用下式來鑑別：對於測試抗原之GA引出的反應減去對於對照相同的反應÷對於參考抗原之GA引出的反應減去對於對照的反應=0.8至1.2，或是80%至120%。該比較因而落在可以接受的範圍或界線內。於此等具體例中，基於「單一參考批(reference lot)、單一劑量分析」來判定T細胞株為GA專一性的。於具體例中，當一個GA劑量、二個不同的GA劑量、三個不同的GA劑量，或更多個不同的GA劑量之單一參考、單一劑量分析比較數值落在可以接受的範圍內時，鑑
別出一種人類T細胞株之GA專一性。
於具體例中，用來獲得上式的分母值之參考抗原，是用來起始及刺激T細胞株同樣的抗原。於具體例中，用測試抗原刺激後觀察到的GA引出的反應，不超過用來獲得該細胞株的抗原刺激後觀察到的數值之20%以上或以下。於具體例中，設若人類T細胞株於分析方法的多數運轉內符合此等準則、在任何的測試濃度都沒有顯示出較大的偏差，以及測試和參考抗原反應值具有相似的劑量反應曲線且於曲線形狀上沒有大的偏差，則其等被鑑別為GA專一性的。
以上的具體例中，可以使用任何合適的對照，譬如無抗原對照或不相關的抗原對照。
於以上的具體例中，該可以接受的範圍為，譬如大約80%至大約120%、大約75%至大約120%、大約75%至大約115%、大約75%至大約110%、大約75%至大約105%、大約75%至大約100%、大約80%至大約125%、大約85%至大約125%、大約90%至大約125%、大約95%至大約125%、大約100%至大約125%、大約80%至大約118%、大約80%至大約115%、大約80%至大約112%、大約80%至大約110%、大約80%至大約108%、大約80%至大約105%、大約80%至大約102%、大約80%至大約101%、大約80%至大約100%、大約80%至大約99%、大約80%至大約98%、大約80%至大約97%、大約80%至大約95%、大約80%至大約92%、大約80%至大約90%、大約82%至大約120%、大約82%至大約
118%、大約82%至大約115%、大約82%至大約112%、大約82%至大約110%、大約82%至大約108%、大約82%至大約105%、大約82%至大約102%、大約82%至大約101%、大約82%至大約100%、大約82%至大約99%、大約82%至大約98%、大約82%至大約97%、大約82%至大約95%、大約82%至大約92%、大約82%至大約90%、大約84%至大約120%、大約84%至大約118%、大約84%至大約115%、大約84%至大約112%、大約84%至大約110%、大約84%至大約108%、大約84%至大約105%、大約84%至大約102%、大約84%至大約101%、大約84%至大約100%、大約84%至大約99%、大約84%至大約98%、大約84%至大約97%、大約84%至大約95%、大約84%至大約92%、大約84%至大約90%、大約86%至大約120%、大約86%至大約118%、大約86%至大約115%、大約86%至大約112%、大約86%至大約110%、大約86%至大約108%、大約86%至大約105%、大約86%至大約102%、大約86%至大約101%、大約86%至大約100%、大約86%至大約99%、大約86%至大約98%、大約86%至大約97%、大約86%至大約95%、大約86%至大約92%、大約88%至大約120%、大約88%至大約118%、大約88%至大約115%、大約88%至大約112%、大約88%至大約110%、大約88%至大約108%、大約88%至大約105%、大約88%至大約102%、大約88%至大約101%、大約88%至大約100%、大約88%至大約99%、大約88%至大約98%、大約88%至大約97%、大約88%至大約95%、大約90%至大約120%、大約90%
至大約118%、大約90%至大約115%、大約90%至大約112%、大約90%至大約110%、大約90%至大約108%、大約90%至大約105%、大約90%至大約102%、大約90%至大約101%、大約90%至大約100%、大約90%至大約99%、大約90%至大約98%、大約90%至大約97%、大約90%至大約95%、大約92%至大約120%、大約92%至大約118%、大約92%至大約115%、大約92%至大約112%、大約92%至大約110%、大約92%至大約108%、大約92%至大約105%、大約92%至大約102%、大約92%至大約101%、大約92%至大約100%、大約92%至大約99%、大約92%至大約98%、大約95%至大約120%、大約95%至大約118%、大約95%至大約115%、大約95%至大約112%、大約95%至大約110%、大約95%至大約108%、大約95%至大約105%、大約95%至大約102%、大約95%至大約101%、大約95%至大約100%、大約97%至大約120%、大約97%至大約118%、大約97%至大約115%、大約97%至大約112%、大約97%至大約110%、大約97%至大約108%、大約97%至大約105%、大約97%至大約102%、大約98%至大約120%、大約98%至大約118%、大約98%至大約115%、大約98%至大約112%、大約98%至大約110%、大約98%至大約108%、大約98%至大約105%、大約99%至大約120%、大約99%至大約118%、大約99%至大約115%、大約99%至大約112%、大約99%至大約110%、大約99%至大約108%、大約99%至大約105%、大約100%至大約120%、大約100%至大約118%、大約100%至大約115%、大
約100%至大約112%、大約100%至大約110%、大約100%至大約108%、大約100%至大約105%、大約101%至大約120%、大約101%至大約118%、大約101%至大約115%、大約101%至大約112%、大約101%至大約110%、大約101%至大約108%、大約102%至大約120%、大約102%至大約118%、大約102%至大約115%、大約102%至大約112%、大約102%至大約110%、大約102%至大約108%、大約105%至大約120%、大約105%至大約118%、大約105%至大約115%、大約105%至大約112%、大約105%至大約110%、大約110%至大約120%、大約110%至大約118%，或是大約110%至大約115%。
於具體例中，一種GA專一性T細胞株係根據GA刺激的該測試培養物所測得的至少2個、至少3個、至少4個或更多個不同的GA引出的反應，相對於負對照培養物之同樣的GA引出的反應，之增高來鑑別。
於具體例中，不同的GA劑量所測得的GA引出的反應係用來產生劑量反應曲線，以及藉由比較使用測試GA批獲得的劑量反應曲線及使用參考GA批獲得的劑量反應曲線，來鑑別出GA專一性。於此等具體例中，基於「單一參考批劑量反應曲線分析」來鑑別人類T細胞株之GA專一性。於此等具體例中，當依據本技藝已知的任何適合的統計方法來判定，落在線性的範圍內之測試GA批及參考GA批之劑量反應曲線的斜率，為統計上相似或同一的時候，可以鑑別出人類T細胞株之GA專一性。
於具體例中，為了達到GA專一性之判定，參考批之劑量反應曲線的斜率(β*)必須符合適當的驗收準則。熟悉此藝者可以預先決定適當的驗收準則。於某些具體例中，適當的驗收準則為：
‧相關係數(r)為0.9
‧斜率為0.60
‧GA標準品之反算濃度(back-calculated concentration)為標稱濃度的±30%
‧GA樣本之精確度變異係數(CV)之20%。
於具體例中，正對照樣本(例如用ConA刺激的細胞)之75%之GA引出的反應，必須高於用任何濃度的GA來刺激相同細胞引起之最高的反應。於具體例中，負對照樣本(例如用對照胜肽，例如髓磷脂鹼性蛋白，MBP處理的細胞)之75%之GA引出的反應，必須低於或是接近用任何濃度的GA引起之最低的反應。
GA參考批樣本集(sample set)可以執行線性迴歸，該處資料點係繪製於對數-對數單位(log-log scale)上。對數GA引出的反應值(透過增高分析物的濃度，以下顯示為IL-2)位於Y軸，以及對數GA參考批濃度(劑量)值位於X軸。
以上的資料集之最佳配適線性迴歸模式如下： Y=α+β．X (1)
該處Y=log10(mIL-2濃度)，以及X=log10(GA濃度)。用適當的表示法取代X及Y變數，以上的模式變成下列：log10(mIL-2濃度)=α+β．log10(GA-濃度) (2)
於具體例中，當測試批曲線的斜率落在可以接受的界線內時，GA專一性被確立。測試批曲線的斜率之可以接受的界線係根據使用下列連串的方程式之參考批曲線來判定：特定的對數(反應)之反算劑量值為：X反回=10(Y-α)/β該處Y=log10(mIL-2濃度) (3)
準確度可由下列算出：準確度可以計算如下：
Y低及Y高為±(平均值+2＊SD)允許的最高準確度之最低及最高的對數(反應)值，該處±(平均值+2＊SD)為大概95%的個別允差區域(individual tolerance region)之最高界線。
因而，接受的斜率的等式之假說的區域為：
β*係計算如下：
接著，將以上的區域簡化(reduced)成下列，用於判定可
以接受的β*界線：
該處β為GA參考批曲線之斜率。因而，方程式(6)所判定的GA測試批可以接受的範圍，β*，可以顯示為：
設若β*在以上可以接受的界線內，則可以得出平行性(parallelism)的結論。
於具體例中，相關係數為0.90至0.98。於具體例中，相關係數為超過或等於0.90、超過或等於0.91、超過或等於0.92、超過或等於0.93、超過或等於0.94、超過或等於0.95、超過或等於0.96、超過或等於0.97、超過或等於0.98、0.90至0.98、0.91至0.98、0.92至0.98、0.93至0.98、0.94至0.98、0.95至0.98、0.96至0.98、0.90至0.97、0.91至0.97、0.92至0.97、0.93至0.97、0.94至0.97、0.95至0.97，或是0.96至0.98。
於具體例中，相等的斜率使用真實假設檢定(true hypothesis test)。
於具體例中，該GA專一性人類T細胞株為長期的GA專一性人類T細胞株，也就是說，其等於持久的培養期間顯示出會維持GA專一性。於具體例中，本發明之長期的GA專一性人類T細胞株於培養至少大約4週到至少大約10週，或更久之後，舉例而言，經由再篩選以確認GA專一性，而顯示出會維持GA專一性。於具體例中，本發明之GA專一性人類T細胞株於培養至少大約4週到至少大約12週，或
更久之後，不含括冷凍儲存花費的任何時間，顯示出會維持GA專一性。於具體例中，本發明之GA專一性人類T細胞株於培養至少大約4週、至少大約5週、至少大約6週、至少大約7週、至少大約8週、至少大約9週、至少大約10週、至少大約11週、至少大約12週、大約4週到大約12週、大約4週到大約11週、大約4週到大約10週、大約4週到大約9週、大約4週到大約8週、大約4週到大約7週、大約4週到大約6週、大約5週到大約12週、大約5週到大約11週、大約5週到大約10週、大約5週到大約9週、大約5週到大約8週、大約5週到大約7週、大約6週到大約12週、大約6週到大約11週、大約6週到大約10週、大約6週到大約9週、大約6週到大約8週、大約7週到大約12週、大約7週到大約11週、大約7週到大約10週、大約7週到大約9週、大約8週到大約12週、大約8週到大約11週、大約8週到大約10週、大約9週到大約12週，或是大約9週到大約11週之後，不含括冷凍儲存花費的任何時間，顯示出會維持GA專一性。
於具體例中，本發明之長期的GA專一性人類T細胞株當如同本文中所述於適合的APC存在下生長時，於持久的培養期間顯示出會維持GA專一性。於具體例中，適合的APC為自體的APC。於特定的具體例中，本發明之長期的GA專一性人類T細胞株當在缺乏促分裂原(mitogen)的情況下生長時，顯示出會長期維持GA專一性。於具體例中，缺乏的促分裂原是，例如植物血球凝集素(PHA)、刀豆球蛋白A(ConA)、脂多醣，或是葡萄球菌腸毒素(SEB)。在
缺乏促分裂原的情況下，長期的生長且維持GA專一性，是本發明之GA專一性人類T細胞株值得注意的特徵。於特定的具體例中，本發明之長期的GA專一性人類T細胞株在於GA及適合的自體APC存在，未添加促分裂原的情況下生長時，於培養物內歷時至少大約4週的培養或是1到10回的再刺激及擴展之後，顯示出會維持GA專一性。於具體例中，一種經鑑別的GA專一性人類T細胞株於多回的再刺激及擴展之後，例如在至少1至10回或是更多回的再刺激及擴展之後，證明為GA專一性的。於具體例中，一種長期的GA專一性人類T細胞株於至少1回、至少2回、至少3回、至少4回、至少5回、至少6回、至少7回、至少8回、至少9回、至少10回、2至10回、3至10回、4至10回、5至10回、6至10回、7至10回、8至10回、9至10回、1至9回、2至9回、3至9回、4至9回、5至9回、6至9回、7至9回、1至8回、2至8回、3至8回、4至8回、5至8回、6至8回、1至7回、2至7回、3至7回、4至7回、5至7回、1至6回、2至6回、3至6回、4至6回、1至5回、2至5回、3至5回、1至4回、2至4回，或是1至3回的再刺激及擴展之後，證明為GA專一性的。
於具體例中，該GA專一性人類T細胞株於擴展期間係維持在大約1 x 105至大約1 x 106細胞/mL、大約1 x 105細胞/mL、大約1.5 x 105細胞/mL、大約2 x 105細胞/mL、大約2.5 x 105細胞/mL、大約3 x 105細胞/mL、大約3.5 x 105細胞/mL、大約4 x 105細胞/mL、大約4.5 x 105細胞/mL、大約5 x 105細胞/mL、大約6 x 105細胞/mL、大約7 x 105細胞
/mL、大約8 x 105細胞/mL、大約9 x 105細胞/mL，或是1 x 106細胞/mL，的細胞密度。
於具體例中，一種GA專一性人類T細胞株之GA專一性的判定係基於，用第一GA製備物刺激該T細胞株時，測量GA引出的反應所獲得的數值，與用第二GA製備物刺激該T細胞株時，測量同樣GA引出的反應所獲得的數值之比較，其中該第二GA製備物的反應值對該第一GA製備物的反應值之比較，係落在預定的可以接受的範圍內，以及其中該GA專一性人類T細胞株為一種長期的GA專一性人類T細胞株。
於具體例中，一種GA專一性人類T細胞株之GA專一性的判定係基於，用多重劑量的第一GA製備物刺激該GA專一性人類T細胞株時，測量GA引出的反應所獲得的劑量反應曲線，與用多重劑量的第二GA製備物刺激該GA專一性人類T細胞株時，測量同樣的GA引出的反應所獲得的劑量反應曲線之比較，其中該第二GA製備物的劑量反應曲線的斜率對該第一GA製備物的劑量反應曲線的斜率之比較，係落在可以接受的界線內，以及其中該GA專一性人類T細胞株為一種長期的GA專一性人類T細胞株。
於以上二個具體例的任何一者中，該第一GA製備物可以為用來產生該GA專一性人類T細胞株相同的製備物。於具體例中，該第一GA製備物為COP。於具體例中，該GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的。於具體例中，該GA專一性人類T細胞株具有已知的MHC限制性。於具體例
中，該GA專一性人類T細胞株具有選自於以下之已知的MHC限制性：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，以及DR-15。於具體例中，該GA專一性人類T細胞株包含至少98%的CD4+T細胞，以及不超過2%的CD8+T細胞。
於具體例中，該GA專一性人類T細胞株對一個非正則GA胜肽會反應。於具體例中，該GA專一性人類T細胞株對一個選自於以下之非正則GA胜肽會反應：胜肽026、GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA 41S、GA 64，以及GT 11。
於具體例中，該GA專一性人類T細胞株對一個非正則GA胜肽不會反應。於具體例中，該GA專一性人類T細胞株對一個選自於以下之非正則GA胜肽不會反應：胜肽026、GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA 41S、GA 64，以及GT 11。
於具體例中，本發明的方法中使用的細胞株，例如一種起始的人類T細胞株(未篩選的)、一種GA有反應的人類T細胞株(表示為GA有反應的)，或是一種經鑑別的GA專一性人類T細胞株(表示為GA專一性)，係在一個或更多個篩選階段之前或之後進行擴展。擴展會增加培養物的細胞數目，以及可以在所述之GA專一性人類T細胞株之鑑別和特徵化方法的期間，於任何時間進行及根據需要進行多次。典型地，人類T細胞株之擴展係在細胞株之GA專一性確立
之後或是細胞株之GA專一性確認之後才進行擴展。於具體例中，一種T細胞株係在冷凍供儲存之前擴展，或是在解凍之後擴展。於具體例中，一種人類T細胞株在如圖1中概括略述的方法的期間，予以擴展多次。於具體例中，一種經鑑別的GA專一性人類T細胞株，在擴展後及使用於判定其是否與另一個GA製備物具有免疫同一性的方法之前，予以再測試其之GA專一性。
T細胞株之擴展係透過用起始胜肽來再刺激該T細胞株來進行，如同以上起始刺激所述，於適合的APC存在下，以及設若需要，生長促進劑，例如IL-2。於具體例中，於再刺激後大約12至大約36小時添加IL-2，以及孵育培養物歷時大約6天至大約14天。於具體例中，重複此方法，以及按希望冷凍該培養物的部分。於具體例中，一種經確認的GA專一性人類T細胞株之擴展的進行係透過用最終濃度大約1μg/mL至大約100μg/mL的起始胜肽來再刺激該等細胞，添加的APC數目為大約等於所使用的T細胞數目至所使用的T細胞數目的大約二倍，以及大約12至大約36小時之後添加最終濃度大約10至大約25U/mL的IL-2。於具體例中，以以下的間隔重複此方法多次：大約6天、大約7天、大約8天、大約9天、大約10天、大約11天、大約12天、大約13天、大約14天、大約7至大約14天、大約7至大約13天、大約7至大約12天、大約7至大約11天、大約7至大約10天、大約7至大約9天、大約8至大約14天、大約8至大約13天、大約8至大約12天、大約8至大約11天、大約8至大約10
天、大約9至大約14天、大約9至大約13天、大約9至大約12天、大約9至大約11天、大約10至大約14天、大約10至大約13天、大約10至大約12天、大約10至大約11天、大約11至大約14天、大約11至大約13天，或大約12至大約14天。於某些具體例中，一種經確認的GA專一性人類T細胞株之擴展的進行係透過用最終濃度大約1μg/mL至大約100μg/mL的起始胜肽來再刺激該等細胞，添加的APC數目為大約等於所使用的T細胞數目至所使用的T細胞數目的大約二倍，及大約12至大約36小時之後添加最終濃度大約10至大約25U/mL的IL-2，以及進一步孵育該等細胞大約7至大約10天。
用於起始另一循環的擴展之再刺激之前的孵育時間，設若希望的話，可以藉由熟悉組織培養技藝者已知的任何方法來判定，諸如藉由評估培養基內pH指示劑染料的顏色，以及細胞的特徵。於具體例中，於孵育期間終止時，透過依據本技藝已知的方法拆分培養物來重複本擴展方法，以及再刺激以進一步擴展。於具體例中，將經擴展的細胞冷凍供儲存、再刺激以及測試GA專一性，或是用於如同本文中所述的特徵化測試。
可以使用本技藝已知的任何適合的T細胞擴展培養基(可以讓淋巴譜系(lymphoid lineage)發展)，依據本發明的方法來使T細胞株生長。於具體例中，使用一種無血清的培養基。於具體例中，使用的培養基是，諸如AIM V(Invitrogen)、X-VIVO 15® Medium(Lonza)、Stemline® T Cell Expansion Medium(Sigma-Aldrich)。於具體例中，該
培養基缺少動物血清、滋養細胞(feeder cell)，以及細胞為基的細胞外基質。含括無血清的培養基之合適的培養基調配物為本技藝已知的，以及已經說明於美國專利第6,733,746號，“Hematopoietic cell culture nutrient supplement”，和第8,481,315號，“Methods of expanding myeloid cell populations and uses thereof”內，二者均併入以作為參考資料。
本發明的GA專一性人類T細胞株可以如同本文中所述予以特徵化。基於各GA專一性人類T細胞株之特徵，諸如免疫特徵，將包含具有不同的MHC限制性、不同的生物標記的剖繪，以及對非正則GA胜肽不同的反應之細胞株的小組集合供用於平行分析的格式用於全面的詢問(comprehensive interrogation)GA製備物內之GA抗原決定位。此策略使得能夠得以比使用先前描述的分析方法所可能得到的準確度更大的準確度，來判定不同的GA製備物之間的免疫同一性。
如所述，GA係由合成性多肽之醋酸鹽組成，其含有四種天然存在的胺基酸：L-麩胺酸、L-丙胺酸、L-酪胺酸，及L-離胺酸。此等胺基酸分別具有0.141、0.427、0.095及0.338之平均莫耳分率，以隨機的序列(in random sequence)存在。毫無疑問地特定的GA分子上存在多個抗原決定位。供判定是否GA測試和參考標準品製備物具有免疫同一性的分析方法，詢問越多的GA抗原決定位，則該分析方法可
以越準確地鑑別與參考標準品，如FDA-許可的藥物Copaxone，具有可比較的臨床效應之GA測試製備物。然而，GA之抗原性抗原決定位的鑑別已經難倒研究者，主要因為具有許多不同的胺基酸序列之GA，不容易使用慣用的技術，例如X射線結晶學予以特徵化。
本發明藉由使用個別T細胞能區分不同但相似的抗原結構之獨特的能力，而克服此問題。本發明基於發現到能夠產生及鑑別GA專一性人類T細胞株，其能辨識GA製備物內不同的抗原決定位。使用本發明的方法，能獲得根據細胞株的辨識性質，而辨識不同的GA抗原決定位之GA專一性人類T細胞株。一種包含GA專一性人類T細胞株的小組(panel)，該等GA專一性人類T細胞株一起辨識許多不同的GA抗原決定位，能被集合且用於詢問GA製備物。
特徵化可以藉由本文所述的方法來進行，或是用本技藝已知的任何其他特徵化抗原專一性T細胞株的方法來進行，舉例而言，如同使用T細胞受體的譜型(receptor spectratyping)所說明的，如同Gorski等人，1994 May 15，(“Circulating T cell repertoire complexity in normal individuals and bone marrow recipients analyzed by CDR3 size spectratyping.Correlation with immune status,”J Immunol.152(10)：5109-19)中所述的，或者使用PCR來鑑別T細胞受體的Vβ鏈表現，如同Choi等人，1989Nov，“Interaction of Staphylococcus aureus toxin‘superantigens’with human T cells,”Proc Natl Acad Sci USA 86(22)：8941-5
中所述。
於本發明的具體例中，根據GA專一性人類T細胞株對非正則GA胜肽之刺激的反應性，來鑑別出會辨識GA不同的抗原決定位之GA專一性人類T細胞株。非正則GA胜肽係由四種GA胺基酸之任何子集，或是以不同於COP所述之平均莫耳分率(average molar fraction)的全部四種GA胺基酸所組成。非正則GA胜肽之實例為聚麩胺酸、聚丙胺酸、聚酪胺酸，及聚離胺酸，只包含四種GA胺基酸之二者或只有三者之胜肽，以及具有不同於Copaxone所述之平均莫耳分率的全部四種GA胺基酸。實施例內的表1提供某些非正則GA胜肽之非限制性清單，包括胜肽026，其含有全部四種GA胺基酸但是是藉由GA製造最早的5分鐘不給酪胺酸來合成。供合成本發明的方法中有用的非正則GA胜肽之方法係描述於文獻中。胜肽026含有的酪胺酸比GA少，以及於製備物各多肽物種的長度各處之胺基酸分布有變化。適合用於作為本發明的方法中之非正則GA胜肽的許多胜肽是商業上可得的，舉例而言來自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。
非正則GA胜肽上的GA抗原決定位預期是會存在於正則GA胜肽上的。一種含有少於組成GA的四種胺基酸之非正則GA胜肽，預期包含的不同抗原決定位數目會比GA更少。與GA(亦即，Copaxone所述之比率)相比，一種含有變化的莫耳比率之全部四種GA胺基酸之非正則GA胜
肽，預期包含的GA抗原決定位會與Copaxone內發現的相對比例不同。成功的鑑別出GA專一性人類T細胞株，其對一個含有全部四種GA胺基酸之非正則GA胜肽，例如胜肽026不會反應，以及對相同的非正則GA胜肽會反應之GA專一性人類T細胞株，證明能夠產生具有非常細微差異的專一性之GA專一性人類T細胞株。可以使用此等GA專一性人類T細胞株來偵測異常的GA製備物。因而，基於對不同的非正則GA胜肽之反應性而特徵化GA專一性人類T細胞株，允許鑑別出GA專一性人類T細胞株，當於分析方法組內平行地(in parallel)使用時，能夠準確地判定GA製備物是否具有免疫同一性。
一種T細胞株分析方法組，其包括各自辨識不同的GA抗原決定位之多個GA專一性T細胞株，在和只測量單一抗原決定位之反應性的測試作比較時，或是和無法區分不同的抗原決定位之反應性的測試作比較時，譬如使用得自於經GA免疫的動物之初級多株T細胞培養物的分析方法，能以更大的準確度來判定GA製備物之免疫同一性。於具體例中，本發明的GA專一性T細胞株係衍生自一個殖株且因而為無性繁殖的，亦即單株的。於具體例中，其等係衍生自多個殖株。於GA專一性人類T細胞株衍生自多個殖株的具體例中，其等係衍生自一些殖株且為寡殖株的(oligoclonal)。
一種對一個非正則GA胜肽會反應的GA專一性人類T細胞株比對相同的非正則GA胜肽不會起反應之GA
專一性人類T細胞株，預期會能辨識GA內不同的抗原決定位。因而，一種對第一個非正則GA胜肽起反應但對第二個非正則GA胜肽不會起反應的GA專一性人類T細胞株，一種對第一個非正則GA胜肽不會起反應但對第二個非正則GA胜肽起反應的GA專一性人類T細胞株，以及一種對第一個或第二個非正則GA胜肽兩者都不會起反應的GA專一性人類T細胞株，各者都推定為辨識不同的GA抗原決定位。舉例來說，一種第一個GA專一性人類T細胞株對GL 41，多(Glu-Tyr；4：1)會起反應，但對GL 14(Glu-Lys；1：4)不會起反應，一種第二個GA專一性人類T細胞株對GL 14會起反應但對GL 41不會起反應，以及一種第三個GA專一性人類T細胞株對GL 41或GL 14都不會起反應，各者都辨識不同的GA抗原決定位。於本發明的具體例中，各者對不同的非正則胜肽會起反應的二個或更多個GA專一性人類T細胞株之組合，係被鑑別出以及一起使用於分析方法組內以判定GA測試製備物是否包含該組內之GA專一性人類T細胞株所辨識的抗原決定位。於具體例中，該分析方法組包括經判定不會對非正則胜肽起反應之二個或更多個GA專一性人類T細胞株。
於具體例中，該組之用途包括測試該組內之一個或更多個GA專一性人類T細胞株對一個非正則胜肽之反應性，其係藉由測量該T細胞株於用該非正則胜肽刺激後之反應。於具體例中，測量的反應為如同以上所述之GA引出的反應，例如增殖、反應之生物標記的產生，或是編碼反應
之生物標記的核酸之表現。於具體例中，一種GA專一性人類T細胞株對一個非正則胜肽之反應性，係藉由在刺激後多個時間點測量GA引出的反應，或者在用一系列不同GA濃度的刺激後測量GA引出的反應，來獲得如同以上所述的劑量反應剖繪，以進行測試。
對非正則胜肽之反應性可以使用判定GA反應性同樣的方法來判定，也就是說，藉由測量對一個非正則胜肽刺激之GA引出的反應，以及與負對照，譬如無抗原對照之量度(measurement)比較。
於具體例中，一種對非正則胜肽有反應的T細胞株係藉由以下方式來鑑別：用非正則胜肽予以刺激的T細胞株之測試培養物，所測得的至少一個GA引出的反應之增高，該增高係統計上大於無抗原對照培養物或不相關的抗原對照培養物，所測得的相同的至少一個GA引出的反應。於具體例中，一種對非正則胜肽有反應的T細胞株係藉由以下方式來鑑別：該測試培養物之GA引出的反應，相對於該對照，增高大約1.5倍至大約10倍(亦即，反應為高於大約50%至高於大約1000%)、大約1.5倍至大約2倍、大約1.5倍至大約3倍、大約1.5倍至大約4倍、大約1.5倍至大約5倍、大約1.5倍至大約6倍、大約1.5倍至大約7倍、大約1.5倍至大約8倍、大約1.5倍至大約9倍、大約2倍至大約10倍、大約2倍至大約3倍、大約2倍至大約4倍、大約2倍至大約5倍、大約2倍至大約6倍、大約2倍至大約7倍、大約2倍至大約8倍、大約2倍至大約9倍、大約3倍至大約10倍、大約3倍至
大約4倍、大約3倍至大約5倍、大約3倍至大約6倍、大約3倍至大約7倍、大約3倍至大約8倍、大約3倍至大約9倍、大約4倍至大約10倍、大約4倍至大約5倍、大約4倍至大約6倍、大約4倍至大約7倍、大約4倍至大約8倍、大約4倍至大約9倍、大約5倍至大約10倍、大約5倍至大約6倍、大約5倍至大約7倍、大約5倍至大約8倍、大約5倍至大約9倍、大約6倍至大約10倍、大約6倍至大約7倍、大約6倍至大約8倍、大約6倍至大約9倍、大約7倍至大約10倍、大約7倍至大約8倍、大約7倍至大約9倍、大約8倍至大約10倍、大約8倍至大約9倍、至少大約1.5倍、至少大約2倍、至少大約2.5倍、至少大約3倍、至少大約3.5倍、至少大約4倍、至少大約4.5倍、至少大約5倍、至少大約6倍、至少大約7倍、至少大約8倍、至少大約9倍，或至少大約10倍。
於本發明的具體例中，一種GA專一性人類T細胞株係予以特徵化，其係藉由測量該GA專一性人類T細胞株在用GA予以再刺激後，由其產生及/或表現之至少一個GA反應之生物標記。於具體例中，該GA專一性人類T細胞株係予以特徵化，其係藉由測量一套GA反應之生物標記之產生及/或表現，以產生反應之生物標記的剖繪。如同本文實施例中所示，不同的GA專一性人類T細胞株證明具有不同的GA反應之生物標記的剖繪，也就是說，不同的株在用GA予以再刺激後，產生不同量的GA反應之生物標記。此等差
異可以反映GA專一性人類T細胞株之結合專一性上隱微的差異，此使得使用此等細胞株特別有用於辨識出GA測試製備物和GA參考標準品之間的差異。於具體例中，如同本文中所述的，一個或更多個GA專一性人類T細胞株的GA反應之生物標記的剖繪係予以特徵化，以及使用該株於本發明的方法及/或分析方法組內，來判定GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的。一種GA專一性人類T細胞株的GA反應之生物標記的剖繪之生物標記的表現位準，和同樣的GA專一性人類T細胞株用GA參考標準品予以刺激之各自的生物標記的表現位準作比較。當該GA專一性人類T細胞株用GA測試製備物予以刺激後，各生物標記的表現位準，和該GA專一性人類T細胞株用GA參考標準品予以刺激之各個各自的生物標記的表現位準之比較數值落在可以接受的範圍內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品判定為免疫同一性的。於具體例中，該比較數值可以接受的範圍為大約75%至大約125%、大約80%至大約120%，或是大約90%至大約110%。於以上的具體例中，該可以接受的範圍為大約75%至大約120%、大約75%至大約115%、大約75%至大約110%、大約75%至大約105%、大約75%至大約100%、大約80%至大約125%、大約85%至大約125%、大約90%至大約125%、大約95%至大約125%、大約100%至大約125%、大約80%至大約118%、大約80%至大約115%、大約80%至大約112%、大約80%至大約110%、大約80%至大約108%、大約80%至大約105%、大約80%至大約102%、大約
80%至大約101%、大約80%至大約100%、大約80%至大約99%、大約80%至大約98%、大約80%至大約97%、大約80%至大約95%、大約80%至大約92%、大約80%至大約90%、大約82%至大約120%、大約82%至大約118%、大約82%至大約115%、大約82%至大約112%、大約82%至大約110%、大約82%至大約108%、大約82%至大約105%、大約82%至大約102%、大約82%至大約101%、大約82%至大約100%、大約82%至大約99%、大約82%至大約98%、大約82%至大約97%、大約82%至大約95%、大約82%至大約92%、大約82%至大約90%、大約84%至大約120%、大約84%至大約118%、大約84%至大約115%、大約84%至大約112%、大約84%至大約110%、大約84%至大約108%、大約84%至大約105%、大約84%至大約102%、大約84%至大約101%、大約84%至大約100%、大約84%至大約99%、大約84%至大約98%、大約84%至大約97%、大約84%至大約95%、大約84%至大約92%、大約84%至大約90%、大約86%至大約120%、大約86%至大約118%、大約86%至大約115%、大約86%至大約112%、大約86%至大約110%、大約86%至大約108%、大約86%至大約105%、大約86%至大約102%、大約86%至大約101%、大約86%至大約100%、大約86%至大約99%、大約86%至大約98%、大約86%至大約97%、大約86%至大約95%、大約86%至大約92%、大約88%至大約120%、大約88%至大約118%、大約88%至大約115%、大約88%至大約112%、大約88%至大約110%、大約88%至大約108%、大約
88%至大約105%、大約88%至大約102%、大約88%至大約101%、大約88%至大約100%、大約88%至大約99%、大約88%至大約98%、大約88%至大約97%、大約88%至大約95%、大約90%至大約120%、大約90%至大約118%、大約90%至大約115%、大約90%至大約112%、大約90%至大約110%、大約90%至大約108%、大約90%至大約105%、大約90%至大約102%、大約90%至大約101%、大約90%至大約100%、大約90%至大約99%、大約90%至大約98%、大約90%至大約97%、大約90%至大約95%、大約92%至大約120%、大約92%至大約118%、大約92%至大約115%、大約92%至大約112%、大約92%至大約110%、大約92%至大約108%、大約92%至大約105%、大約92%至大約102%、大約92%至大約101%、大約92%至大約100%、大約92%至大約99%、大約92%至大約98%、大約95%至大約120%、大約95%至大約118%、大約95%至大約115%、大約95%至大約112%、大約95%至大約110%、大約95%至大約108%、大約95%至大約105%、大約95%至大約102%、大約95%至大約101%、大約95%至大約100%、大約97%至大約120%、大約97%至大約118%、大約97%至大約115%、大約97%至大約112%、大約97%至大約110%、大約97%至大約108%、大約97%至大約105%、大約97%至大約102%、大約98%至大約120%、大約98%至大約118%、大約98%至大約115%、大約98%至大約112%、大約98%至大約110%、大約98%至大約108%、大約98%至大約105%、大約99%至大約120%、大約99%至大
約118%、大約99%至大約115%、大約99%至大約112%、大約99%至大約110%、大約99%至大約108%、大約99%至大約105%、大約100%至大約120%、大約100%至大約118%、大約100%至大約115%、大約100%至大約112%、大約100%至大約110%、大約100%至大約108%、大約100%至大約105%、大約101%至大約120%、大約101%至大約118%、大約101%至大約115%、大約101%至大約112%、大約101%至大約110%、大約101%至大約108%、大約102%至大約120%、大約102%至大約118%、大約102%至大約115%、大約102%至大約112%、大約102%至大約110%、大約102%至大約108%、大約105%至大約120%、大約105%至大約118%、大約105%至大約115%、大約105%至大約112%、大約105%至大約110%、大約110%至大約120%、大約110%至大約118%，或是大約110%至大約115%。
於具體例中，一個以上的GA專一性人類T細胞株，各者具有不同的GA反應之生物標記的剖繪，使用於GA專一性人類T細胞株的分析方法組內，來判定GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的。
一種GA專一性人類T細胞株之特徵化所測量的GA反應之生物標記為，例如細胞介素、細胞介素受體、趨化介素、T細胞活化標誌，或是編碼細胞介素、細胞介素受體、趨化介素或T細胞活化標誌之核酸。
於具體例中，一種GA專一性人類T細胞株之特徵化所測量的反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：例
如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，以及IL-1b。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。於具體例中，反應之生物標記為Th1關聯性細胞介素、Th2關聯性細胞介素、Th17關聯性細胞介素，或是ThFH關聯性細胞介素。於具體例中，反應之生物標記為Th1關聯性細胞介素且為IFN-γ。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的Th2關聯性細胞介素：IL-4、IL-5，及IL-13。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的Th17關聯性細胞介素：IL-17，及IL-22。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的ThFH關聯性細胞介素：IL-21，及TGF-β。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的關鍵調節關聯性細胞介素：IL-10及TGF-β。
於具體例中，一種GA專一性人類T細胞株之特徵化所測量的反應之生物標記為編碼選自於以下的細胞介素之核酸：例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，以及IL-1b。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的活化標誌之核酸：例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的趨化介素之核酸：例如
IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。於具體例中，反應之生物標記為編碼Th1關聯性細胞介素之核酸、編碼Th2關聯性細胞介素之核酸、編碼Th17關聯性細胞介素之核酸，或是編碼ThFH關聯性細胞介素之核酸。於具體例中，反應之生物標記為編碼Th1關聯性細胞介素且為IFN-γ之核酸。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的Th2關聯性細胞介素之核酸：IL-4、IL-5，及IL-13。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的Th17關聯性細胞介素之核酸：IL-17，及IL-22。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的ThFH關聯性細胞介素之核酸：IL-21，及TGF-β。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的關鍵調節關聯性細胞介素之核酸：IL-10及TGF-β。
於本發明的具體例中，一種GA專一性人類T細胞株係予以特徵化，其係藉由測試其之MHC限制性。經由不同的MHC限制性元素而和相同的抗原起反應之T細胞株，可以辨識不同的抗原決定位。MHC限制性因而提供另一種參數用於免疫上區分本發明的GA專一性人類T細胞株之抗原決定位專一性，以及藉此用於篩選供用於分析方法適合的GA專一性人類T細胞株組，來判定GA製備物是否為免疫同一性的。
MHC限制性可以使用本技藝已知的任何方法來測試，譬如由Oftung等人(Oftung F.等人，1994,“Mapping of
multiple HLA class II restricted T-cell epitopes of the mycobacterial 70-kilodalton heat shock protein,”Infect.Immun.62：5411-5418)所述的，或是如同本文實施例中所提出的。
於本發明的具體例中，一種GA專一性人類T細胞株係予以特徵化，其係藉由分析其之細胞表面標記的表現。於具體例中，本發明的方法中使用的一種GA專一性人類T細胞株為CD4+。可以使用本技藝已知的方法來分析CD4+的表現，以及鑑別出CD4+T細胞株。於具體例中，CD4係藉由流動式細胞測量術來分析，其使用具有CD4專一性之螢光染料(fluorochrome)標記的單株抗體。於具體例中，當測試的樣本內98%或更多的細胞為CD4+時，一種GA專一性人類T細胞株被判定為CD4+。於具體例中，當測試的樣本內99%或更多的細胞為CD8+時，一種GA專一性人類T細胞株被判定為CD4+。於具體例中，本發明的分析方法組內含括一種GA專一性人類T細胞株，其經判定為含有97%或更多、超過97%、97.5%或更多、超過97.5%、98%或更多、超過98%、98.5%或更多、超過98.5%、99%或更多，或是超過99%的CD4+細胞。
於具體例中，該GA專一性人類T細胞株為CD8-。如同CD4一樣，CD8標記可以使用本技藝已知的方法來分析，例如藉由使用具有CD8專一性之螢光染料標記的單株抗體之流動式細胞測量術。於具體例中，本發明的方法中
使用的一種GA專一性人類T細胞株為CD8-。於具體例中，CD8係藉由使用具有CD8反應性之螢光染料標記的單株抗體之流動式細胞測量術來分析。於具體例中，含括一種對照，其使用非專一性抗體，例如螢光染料標記的小鼠同型配對的對照單株抗體。於具體例中，本發明的方法中使用的一種GA專一性人類T細胞株為CD4+及CD8-。於具體例中，當測試的樣本內2%或更少的細胞為CD8+時，一種GA專一性人類T細胞株被判定為CD8-。於具體例中，當測試的樣本內1%或更少的細胞為CD8+時，一種GA專一性人類T細胞株被判定為CD8-。於具體例中，本發明的分析方法組內含括一種GA專一性人類T細胞株，其經判定為含有3%或是更少、少於3%、2,5%或更少、少於2.5%、2%或更少、少於2%、1.5%或更少、少於1.5%、1%或更少，或是少於1% CD8+細胞。
於具體例中，含括一種對照，其使用非專一性抗體，例如螢光染料標記的小鼠同型配對的對照單株抗體IgG1抗體，如同本文實施例中所述。
如同所述，本發明的方法中，於鑑別及特徵化GA專一性人類T細胞株的場合中，測量GA引出的反應。人類T細胞株之反應性及專一性的篩選之進行，係藉由測量一個人類T細胞株對GA刺激之至少一個GA引出的反應，與合適的對照，譬如缺少抗原，相同反應之量度(measurement)比較。同樣地，本發明的GA專一性人類T細胞株可以進一
步特徵化為對一個非正則GA胜肽會反應的，其係藉由測量一種GA專一性人類T細胞株在用非正則GA胜肽刺激後所引出的反應。當使用於本文中，“GA引出的反應”係提及一種GA專一性人類T細胞株在用GA或非正則GA胜肽刺激後所引出的反應。
於本發明上下文中，測量的GA引出的反應是在用刺激胜肽處理T細胞株(於適合的APC存在下)後，觀察到的一種反應，該反應在適合的對照內未觀察到，諸如用APC及無胜肽處理之相同的T細胞株，或是用APC及不相關的對照抗原處理之相同的T細胞株(負對照)。一種GA專一性T細胞株在用GA製備物刺激後，評估GA引出的反應能顯露出測試的GA製備物內存在之微小的差異。於本發明的某些方法中，測量一種經鑑別的GA專一性人類T細胞株對於GA測試製備物及GA參考標準品之GA引出的反應，以及將測量的GA引出的反應作比較。基於比較結果，來判定GA製備物是否為免疫同一性的。於相關的方法中，比較一種經鑑別的GA專一性人類T細胞株之GA引出的反應能允許判定第一GA製備物，例如GA測試製備物之效力，相對於第二GA製備物，例如GA參考標準品之效力。於本文所述另外的方法中，測量一種GA引出的反應以特徵化GA專一性人類T細胞株。
於本發明上下文中，一種GA引出的反應可以為測量例如T細胞增殖、反應之生物標記的產生，或是編碼反應之生物標記的核酸之表現。於具體例中，於再刺激後的
多個時間點測量GA引出的反應。於具體例中，在用一系列不同濃度的GA測試製備物及GA參考標準品再刺激T細胞株之後，測量GA引出的反應。於具體例中，使用此資料來繪製劑量反應曲線，以及比較各GA製備物得到的劑量反應曲線。於具體例中，當落在線性的範圍內之比較的GA製備物各自之劑量反應曲線的斜率，為統計上相似或同一的時候，可以判定GA測試製備物為免疫同一的。
T細胞株對抗原起反應之增殖作用可以使用本技藝已知的任何適合的方法來評估。舉例而言，增殖作用可以藉由測量含氚胸腺嘧啶(tritiated thymidine)之攝取、BrdU攝取(使用，例如Millipore cat.#2752)來評估，透過CFSE分析方法(使用，例如CellTraceTM CFSE Cell Proliferation Kit，Life Technologies，以及如同Quah等人，2007，“Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester”，Nature Protocols 2(9)：2049-2056)中所述，或是透過ATP定量化來判定活細胞數目(使用，例如CellTiter Glo® Luminescent Cell Viability Assay，Promega，目錄#G7571)。評估抗原專一性T細胞的方法係描述於文獻中，例如於“Techniques for Immune Function Analysis”內，Application Handbook第一版，2006，Becton，Dickinson and Company。
一種GA專一性T細胞株可以根據T細胞株用GA
及適合的APC刺激之後，當與無抗原或對照抗原及適合的APC刺激之後的位準作比較時，該T細胞株增殖作用之增高來鑑別。於具體例中，一種GA專一性T細胞株係基於增殖作用之增高來鑑別，該增高係由來表示細胞數目的增加、DNA合成(例如，於BrdU分析方法)，或是細胞內染料增加的稀釋度(例如，於CFSE分析方法)，其中該增高相對於該對照，為大約2倍至大約10倍。於具體例中，該增高為至少大約2倍、至少大約3倍、至少大約4倍、至少大約5倍、至少大約6倍、至少大約7倍、至少大約8倍、至少大約9倍、至少大約10倍、大約2倍至大約9倍、大約2倍至大約8倍、大約2倍至大約7倍、大約2倍至大約6倍、大約2倍至大約5倍、大約2倍至大約4倍、大約2倍至大約3倍、大約3倍至大約10倍、大約3倍至大約9倍、大約3倍至大約8倍、大約3倍至大約7倍、大約3倍至大約6倍、大約3倍至大約5倍、大約3倍至大約4倍、大約4倍至大約10倍、大約4倍至大約9倍、大約4倍至大約8倍、大約4倍至大約7倍、大約4倍至大約6倍、大約4倍至大約5倍、大約5倍至大約10倍、大約5倍至大約9倍、大約5倍至大約8倍、大約5倍至大約7倍、大約5倍至大約6倍、大約6倍至大約10倍、大約6倍至大約9倍、大約6倍至大約8倍、大約6倍至大約7倍、大約7倍至大約10倍、大約7倍至大約9倍、大約7倍至大約8倍、大約8倍至大約10倍、大約8倍至大約9倍，或大約9倍至大約10倍。
於具體例中，當用該GA測試製備物刺激的GA專一性T細胞樣本和用該GA參考標準品刺激的GA專一性T細
胞樣本，增殖作用的量度(表達為例如，比率、分率，或百分率)之比較落在可以接受的範圍內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品證明為免疫同一性的。
於本發明的具體例中，一種GA專一性人類T細胞株對GA測試製備物之GA引出的反應的量度，與該GA專一性人類T細胞株對GA參考標準品之相同的GA引出的反應之量度作比較。基於比較結果，來判定該GA測試製備物和GA參考標準品為免疫同一性的。於具體例中，當比較數值落在可以接受的範圍內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品判定為免疫同一性的。於具體例中，比較數值表達為百分率，當量度相等時百分率為100。於此等具體例中，該比較數值可以接受的範圍為大約75%至大約125%、大約80%至大約120%，或是大約90%至大約110%。於以上的具體例中，該可以接受的範圍為大約75%至大約120%、大約75%至大約115%、大約75%至大約110%、大約75%至大約105%、大約75%至大約100%、大約80%至大約125%、大約85%至大約125%、大約90%至大約125%、大約95%至大約125%、大約100%至大約125%、大約80%至大約118%、大約80%至大約115%、大約80%至大約112%、大約80%至大約110%、大約80%至大約108%、大約80%至大約105%、大約80%至大約102%、大約80%至大約101%、大約80%至大約100%、大約80%至大約99%、大約80%至大約98%、大約
80%至大約97%、大約80%至大約95%、大約80%至大約92%、大約80%至大約90%、大約82%至大約120%、大約82%至大約118%、大約82%至大約115%、大約82%至大約112%、大約82%至大約110%、大約82%至大約108%、大約82%至大約105%、大約82%至大約102%、大約82%至大約101%、大約82%至大約100%、大約82%至大約99%、大約82%至大約98%、大約82%至大約97%、大約82%至大約95%、大約82%至大約92%、大約82%至大約90%、大約84%至大約120%、大約84%至大約118%、大約84%至大約115%、大約84%至大約112%、大約84%至大約110%、大約84%至大約108%、大約84%至大約105%、大約84%至大約102%、大約84%至大約101%、大約84%至大約100%、大約84%至大約99%、大約84%至大約98%、大約84%至大約97%、大約84%至大約95%、大約84%至大約92%、大約84%至大約90%、大約86%至大約120%、大約86%至大約118%、大約86%至大約115%、大約86%至大約112%、大約86%至大約110%、大約86%至大約108%、大約86%至大約105%、大約86%至大約102%、大約86%至大約101%、大約86%至大約100%、大約86%至大約99%、大約86%至大約98%、大約86%至大約97%、大約86%至大約95%、大約86%至大約92%、大約88%至大約120%、大約88%至大約118%、大約88%至大約115%、大約88%至大約112%、大約88%至大約110%、大約88%至大約108%、大約88%至大約105%、大約88%至大約102%、大約88%至大約101%、大約88%至大約
100%、大約88%至大約99%、大約88%至大約98%、大約88%至大約97%、大約88%至大約95%、大約90%至大約120%、大約90%至大約118%、大約90%至大約115%、大約90%至大約112%、大約90%至大約110%、大約90%至大約108%、大約90%至大約105%、大約90%至大約102%、大約90%至大約101%、大約90%至大約100%、大約90%至大約99%、大約90%至大約98%、大約90%至大約97%、大約90%至大約95%、大約92%至大約120%、大約92%至大約118%、大約92%至大約115%、大約92%至大約112%、大約92%至大約110%、大約92%至大約108%、大約92%至大約105%、大約92%至大約102%、大約92%至大約101%、大約92%至大約100%、大約92%至大約99%、大約92%至大約98%、大約95%至大約120%、大約95%至大約118%、大約95%至大約115%、大約95%至大約112%、大約95%至大約110%、大約95%至大約108%、大約95%至大約105%、大約95%至大約102%、大約95%至大約101%、大約95%至大約100%、大約97%至大約120%、大約97%至大約118%、大約97%至大約115%、大約97%至大約112%、大約97%至大約110%、大約97%至大約108%、大約97%至大約105%、大約97%至大約102%、大約98%至大約120%、大約98%至大約118%、大約98%至大約115%、大約98%至大約112%、大約98%至大約110%、大約98%至大約108%、大約98%至大約105%、大約99%至大約120%、大約99%至大約118%、大約99%至大約115%、大約99%至大約112%、大約99%至大約110%、大約
99%至大約108%、大約99%至大約105%、大約100%至大約120%、大約100%至大約118%、大約100%至大約115%、大約100%至大約112%、大約100%至大約110%、大約100%至大約108%、大約100%至大約105%、大約101%至大約120%、大約101%至大約118%、大約101%至大約115%、大約101%至大約112%、大約101%至大約110%、大約101%至大約108%、大約102%至大約120%、大約102%至大約118%、大約102%至大約115%、大約102%至大約112%、大約102%至大約110%、大約102%至大約108%、大約105%至大約120%、大約105%至大約118%、大約105%至大約115%、大約105%至大約112%、大約105%至大約110%、大約110%至大約120%、大約110%至大約118%，或是大約110%至大約115%。
於相關的方法中，比較數值使用作為第一GA製備物例如GA測試製備物之效力，相對於第二GA製備物例如GA參考標準品之效力的一種測量法。
於具體例中，本發明的方法中所測量的GA引出的反應為反應之生物標記的產生。於具體例中，反應之生物標記為細胞介素、細胞介素受體、趨化介素、T細胞活化標誌，或是編碼細胞介素、細胞介素受體、趨化介素或T細胞活化標誌之核酸(其可以為細胞介素受體)。於具體例中，GA反應之生物標記為細胞介素、細胞介素受體、趨化介素、T細胞活化標誌，或是編碼細胞介素、細胞介素受體、
趨化介素或T細胞活化標誌之核酸。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，以及IL-1b。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的活化標誌：例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。於具體例中，反應之生物標記為Th1關聯性細胞介素、Th2關聯性細胞介素、Th17關聯性細胞介素，或是ThFH關聯性細胞介素。於具體例中，反應之生物標記為Th1關聯性細胞介素且為IFN-γ。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的Th2關聯性細胞介素：IL-4、IL-5，及IL-13。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的Th17關聯性細胞介素：IL-17，及IL-22。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的ThFH關聯性細胞介素：IL-21，及TGF-β。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的關鍵調節關聯性細胞介素：IL-10及TGF-β。
於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的細胞介素之核酸：例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，以及IL-1b。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的活化標誌之核酸：例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。
於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的趨化介素之核酸：例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。於具體例中，反應之生物標記為編碼Th1關聯性細胞介素之核酸、編碼Th2關聯性細胞介素之核酸、編碼Th17關聯性細胞介素之核酸，或是編碼ThFH關聯性細胞介素之核酸。於具體例中，反應之生物標記為編碼Th1關聯性細胞介素且為IFN-γ之核酸。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的Th2關聯性細胞介素之核酸：IL-4、IL-5，及IL-13。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的Th17關聯性細胞介素之核酸：IL-17，及IL-22。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的ThFH關聯性細胞介素之核酸：IL-21，及TGF-β。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的關鍵調節關聯性細胞介素之核酸：IL-10及TGF-β。
反應之生物標記蛋白質的產生可以依據本技藝已知的任何適合的方法或是文獻中公開的方法來測量，例如ELISA、西方印漬術(Western blotting)分析方法、流動式細胞測量術分析方法，或是任何適合的多重分析方法。可利用商業的分析方法用於測量如同本發明的方法中稱為細胞介素、趨化介素、細胞介素受體，以及活化標誌的產生。舉例而言，可以使用BDTM Cytometric Bead Array Flex Set system(BD Biosciences，San Jose，CA)來創造供偵測人類細胞介素及趨化介素之多重分析方法。
一種GA專一性人類T細胞株可以予以鑑別及特
徵化，其係透過於適合的APC存在下、用GA再刺激之後產生的反應之生物標記，和適合的負對照，譬如用無抗原或不相關的對照抗原(於適合的APC存在下)再刺激之後，產生的反應之生物標記的量作比較。於具體例中，一種GA專一性人類T細胞株係基於相對於該對照，反應之生物標記產生的增高來鑑別。於具體例中，該反應之生物標記產生，相對於該對照，觀察到增高大約1.5倍至大約1000倍。該測試培養物之反應，相對於該對照，為大約1.5倍(亦即，反應為高於大約50%)至大約1000倍、大約1.5倍至大約2倍、大約1.5倍至大約3倍、大約1.5倍至大約4倍、大約1.5倍至大約5倍、大約1.5倍至大約6倍、大約1.5倍至大約7倍、大約1.5倍至大約8倍、大約1.5倍至大約9倍、大約2倍至大約3倍、大約2倍至大約4倍、大約2倍至大約5倍、大約2倍至大約6倍、大約2倍至大約7倍、大約2倍至大約8倍、大約2倍至大約9倍、大約2倍至大約10倍、大約3倍至大約4倍、大約3倍至大約5倍、大約3倍至大約6倍、大約3倍至大約7倍、大約3倍至大約8倍、大約3倍至大約9倍、大約3倍至大約10倍、大約4倍至大約5倍、大約4倍至大約6倍、大約4倍至大約7倍、大約4倍至大約8倍、大約4倍至大約9倍、大約4倍至大約10倍、大約5倍至大約6倍、大約5倍至大約7倍、大約5倍至大約8倍、大約5倍至大約9倍、大約5倍至大約10倍、大約6倍至大約7倍、大約6倍至大約8倍、大約6倍至大約9倍、大約6倍至大約10倍、大約7倍至大約8倍、大約7倍至大約9倍、大約7倍至大約10倍、大約8倍至大約9倍、大約8倍至
大約10倍、大約1.5倍至大約80倍、大約1.5倍至大約70倍、大約1.5倍至大約60倍、大約1.5倍至大約50倍、大約1.5倍至大約40倍、大約1.5倍至大約30倍、大約1.5倍至大約20倍、大約2倍至大約80倍、大約1.5倍至大約70倍、大約1.5倍至大約60倍、大約1.5倍至大約50倍、大約1.5倍至大約40倍、大約1.5倍至大約30倍、大約1.5倍至大約20倍、大約2倍至大約80倍、大約2倍至大約70倍、大約2倍至大約60倍、大約2倍至大約50倍、大約2倍至大約40倍、大約2倍至大約30倍、大約2倍至大約20倍、大約3倍至大約80倍、大約3倍至大約70倍、大約3倍至大約60倍、大約3倍至大約50倍、大約3倍至大約40倍、大約3倍至大約30倍、大約3倍至大約20倍、大約5倍至大約80倍、大約5倍至大約70倍、大約5倍至大約60倍、大約5倍至大約50倍、大約5倍至大約40倍、大約5倍至大約30倍、大約3倍至大約20倍、大約10倍至大約80倍、大約10倍至大約60倍、大約10倍至大約40倍，或大約10倍至大約20倍、至少大約1.5倍、至少大約2倍、至少大約2.5倍、至少大約3倍、至少大約3.5倍、至少大約4倍、至少大約4.5倍、至少大約5倍、至少大約6倍、至少大約7倍、至少大約8倍、至少大約9倍，或至少大約10倍。
可以使用一些商業上可得的分析套組和系統之任一者，或者根據任何本技藝所述的任何方法來定量測量編碼反應之生物標記的核酸。於具體例中，反應之生物標記mRNA係透過即時PCR來測量。使用本技藝已知的任何合適的定量方法來測量mRNA表現位準是預期的。舉例而
言，可以使用反轉錄酶來複製mRNA以及使用合適的PCR方法來擴增，包括RT-PCR，和即時反轉錄PCR(qRT-PCR)。供定量基因表現的PCR方法描述於，例如，VanGuilder等人，2008，“Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis”，Biotechniques 44：619-626，以及Bustin等人，2005，“Quantitative real-time RT-PCR-a perspective”，Journal of Molecular Endocrinology，34：597-601，其之各者全體併入本文中以作為參考資料。小鼠細胞介素mRNA之定量PCR描述於例如，Overbergh等人，1999，“Quantification of murine cytokine mRNAs using real time quantitative reverse transcriptase PCR”，Cytokine 11(4)：305-312，其併入本文中以作為參考資料，其說明用於定量IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、p40、IL-13、IL-15、IFN-γ、TNF-α、TGF-β以及iNOS之探針及引子。供用於擬體內(ex vivo)GA刺激小鼠之淋巴結細胞後，測量反應之生物標記mRNA的方法描述於例如，美國專利申請公開案第2014/027298號，“Glatiramer Acetate Response Biomarker mRNA Potency Assay”內，其之整體係併入本文以作為參考資料。
一種GA專一性人類T細胞株可以予以鑑別及特徵化，其係透過於適合的APC存在下、用GA再刺激之後產生的編碼反應之生物標記的核酸，和適合的負對照，譬如用無抗原或不相關的對照抗原(於適合的APC存在下)再刺激之後，產生的該編碼反應之生物標記的核酸量作比較。
於具體例中，一種GA專一性人類T細胞株係基於相對於該對照，編碼反應之生物標記的核酸之產生的增高來鑑別。於具體例中，該編碼反應之生物標記的核酸之產生，相對於負對照，觀察到增高大約1.5倍至大約1000倍。於具體例中，該增高為大約1.5倍至大約100倍、大約1.5倍至大約50倍、大約1.5倍至大約45倍、大約1.5倍至大約40倍、大約1.5倍至大約35倍、大約1.5倍至大約30倍、大約1.5倍至大約25倍、大約1.5倍至大約22倍、大約1.5倍至大約20倍、大約1.5倍至大約15倍、大約1.5倍至大約12倍、大約1.5倍至大約10倍、大約1.5倍至大約9倍、大約1.5倍至大約8倍、大約1.5倍至大約7倍、大約1.5倍至大約6倍、大約1.5倍至大約5倍、大約1.5倍至大約4倍、大約1.5倍至大約3倍、大約2倍至大約100倍、大約2倍至大約50倍、大約2倍至大約45倍、大約2倍至大約40倍、大約2倍至大約35倍、大約2倍至大約30倍、大約2倍至大約25倍、大約2倍至大約22倍、大約2倍至大約20倍、大約2倍至大約15倍、大約2倍至大約12倍、大約2倍至大約10倍、大約2倍至大約9倍、大約2倍至大約8倍、大約2倍至大約7倍、大約2倍至大約6倍、大約2倍至大約5倍、大約2倍至大約4倍、大約3倍至大約100倍、大約3倍至大約50倍、大約3倍至大約45倍、大約3倍至大約40倍、大約3倍至大約35倍、大約3倍至大約30倍、大約3倍至大約25倍、大約3倍至大約22倍、大約3倍至大約20倍、大約3倍至大約15倍、大約3倍至大約12倍、大約3倍至大約10倍、大約3倍至大約9倍、大約3倍至大約8倍、大約3倍至大約7
倍、大約3倍至大約6倍、大約3倍至大約5倍、大約4倍至大約100倍、大約4倍至大約50倍、大約4倍至大約45倍、大約4倍至大約40倍、大約4倍至大約35倍、大約4倍至大約30倍、大約4倍至大約25倍、大約4倍至大約22倍、大約4倍至大約20倍、大約4倍至大約15倍、大約4倍至大約12倍、大約4倍至大約10倍、大約4倍至大約9倍、大約4倍至大約8倍、大約4倍至大約7倍、大約4倍至大約6倍、大約5倍至大約100倍、大約5倍至大約50倍、大約5倍至大約45倍、大約5倍至大約40倍、大約5倍至大約35倍、大約5倍至大約30倍、大約5倍至大約25倍、大約5倍至大約22倍、大約5倍至大約20倍、大約5倍至大約15倍、大約5倍至大約12倍、大約5倍至大約10倍、大約5倍至大約9倍、大約5倍至大約8倍、大約5倍至大約7倍、大約7倍至大約100倍、大約7倍至大約50倍、大約7倍至大約45倍、大約7倍至大約40倍、大約7倍至大約35倍、大約7倍至大約30倍、大約7倍至大約25倍、大約7倍至大約22倍、大約7倍至大約20倍、大約7倍至大約15倍、大約7倍至大約12倍、大約7倍至大約10倍、大約7倍至大約9倍、大約10倍至大約100倍、大約10倍至大約50倍、大約10倍至大約45倍、大約10倍至大約40倍、大約10倍至大約35倍、大約10倍至大約30倍、大約10倍至大約25倍、大約10倍至大約22倍、大約10倍至大約20倍、大約10倍至大約15倍、大約15倍至大約100倍、大約15倍至大約50倍、大約15倍至大約45倍、大約15倍至大約40倍、大約15倍至大約35倍、大約15倍至大約30倍、大約15倍至大約
25倍、大約15倍至大約22倍、大約15倍至大約20倍、大約20倍至大約100倍、大約20倍至大約50倍、大約20倍至大約45倍、大約20倍至大約40倍、大約20倍至大約35倍、大約20倍至大約30倍、大約20倍至大約25倍、大約25倍至大約100倍、大約25倍至大約50倍、大約25倍至大約45倍、大約25倍至大約40倍、大約25倍至大約35倍、大約25倍至大約30倍、大約30倍至大約100倍、大約30倍至大約50倍、大約40倍至大約100倍、大約50倍至大約100倍、大約60倍至大約100倍、大約70倍至大約100倍、至少大約2倍、至少大約3倍、至少大約4倍、至少大約5倍、至少大約6倍、至少大約7倍、至少大約8倍、至少大約9倍、至少大約10倍、至少大約11倍、至少大約12倍、至少大約13倍、至少大約14倍、至少大約15倍、至少大約20倍、至少大約25倍、至少大約30倍、至少大約35倍、至少大約40倍、至少大約50倍、至少大約60倍、至少大約70倍、至少大約80倍、至少大約90倍、至少大約100倍、至少大約250倍、至少大約500倍，或是至少大約1000倍。
本發明係有關於一種供製備包含GA的藥物產品或藥學組成物之方法。於本方法的具體例中，格拉默醋酸鹽係依據本技藝已知的標準方法和文獻中描述的方法來製備，例如美國專利第3,849,550號及美國專利第5,800,808號。於具體例中，一種包含GA的藥物產品或藥學組成物係藉由以下而製備：使經保護的格拉默醋酸鹽與氫溴酸反應
以形成三氟乙醯GA，用哌啶水溶液(aqueous piperidine solution)處理該三氟乙醯共聚物-1以形成該GA測試製備物，以及純化該GA測試製備物。使用如同本文中所述的方法及/或分析方法組，來判定該GA測試製備物和GA參考標準品為免疫同一性或者不是免疫同一性的。舉例而言，判定該GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性或者不是免疫同一性的，其係透過(a)用適合的抗原呈現細胞(APC)來孵育至少一個GA專一性人類T細胞株的細胞，(b)用一數量的該GA測試製備物來刺激步驟(a)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株及適合的APC之至少一個樣本，以及分別用相同數量的該GA參考標準品來刺激步驟(a)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株及適合的APC之至少一個樣本；(c)測量步驟(b)內用該GA測試製備物刺激的該至少一個樣本的細胞之至少一個GA引出的反應，及測量步驟(b)內用該GA參考標準品刺激的該至少一個樣本的細胞之相同的至少一個GA引出的反應，以及(d)比較步驟(c)內獲得的量度(measurements)，其中當步驟(d)內之量度比較落在可以接受的範圍內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品判定為免疫同一性的，以及其中設若判定其對該GA參考標準品有免疫同一性，則使該GA測試製備物混合於該藥物產品或藥學組成物內。於具體例中，該藥物產品或藥學組成物額外包含賦形劑及/或稀釋劑，舉例而言，如同Copaxone®包裝標示中所述。
於某些具體例中，本發明的方法係用來判定GA
測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的，或是具有可接受的相對效力，在可能添加GA測試製備物至該藥物產品或藥學組成物之前在添加之後(after addition of the GA preparation)，或是按希望在任何其他的時間。於具體例中，GA的測試製備物係添加至GA藥物產品或藥學組成物之其他組分，例如稀釋劑、賦形劑，或是另一種活性成分，只要當判定其對GA參考標準品有免疫同一性或是可比較的效力。效力的分析方法描述於文獻中，例如美國專利第7,429,374號內，“Process for the measurement of the potency of glatiramer acetate”，其之整體併入本文以作為參考資料。
額外的反應之生物標記可以予以鑑別，其係透過於適合的APC存在下、用GA刺激之GA專一性人類T細胞培養物內存在的可能反應之生物標記的量，和用適合的APC孵育但無抗原刺激之對照培養物，或是用對照抗原刺激的對照培養物內存在的反應之生物標記的量作比較。
一種適合供本發明的方法使用的GA反應之生物標記可以予以鑑別，其係透過於適合的APC存在下、用GA刺激之GA專一性人類T細胞株內存在的，可能的GA反應之生物標記蛋白質或編碼該蛋白質的核酸的量，和適合的負對照內相同可能的GA反應之生物標記蛋白質或編碼該蛋白質的核酸的量作比較。一種於適合的APC存在下、用GA刺激之GA專一性人類T細胞株，與負對照相比，其之適合的GA反應之生物標記顯著地被調節(增加或減少)。於具體
例中，一種GA專一性人類T細胞株之GA反應之生物標記係基於用於GA再刺激該GA專一性人類T細胞株之後，相對於負對照，其產生增高大約2倍至大約1000倍來鑑別。
如所述，本發明預期至少一種GA專一性人類T細胞株於判定GA製備物，例如GA測試製備物和GA參考標準品，之免疫同一性的方法之用途。因為GA含有一些抗原決定位，透過用GA來刺激及測試其等對GA的反應性，來產生及鑑別GA專一性人類T細胞株，不一定知道能獲得具有辨識不同的抗原決定位的能力之GA專一性人類T細胞株。基於發現到能夠獲得帶有可區別抗原決定位之結合專一性之GA專一性人類T細胞株，本發明提供分析方法，其使用多個GA專一性人類T細胞株，以更大的準確度來判定GA製備物之免疫同一性。
於本發明的具體例中，一種GA專一性人類T細胞株之分析方法組係使用來分析，譬如GA製備物以測試免疫同一性及/或判定其等之相似性或相異性程度。於具體例中，該分析方法組包含多個GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該分析方法組包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49，或是50個不同的GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該分析方法組包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、
至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個，或是至少100個不同的GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該分析方法組包含2至100個、2至50個、2至25個、2至10個、5至100個、5至50個、5至25個、5至10個、10至100個、10至50個、10至25個，或是50至100個不同的GA專一性人類T細胞株。
於本發明的具體例中，該分析方法組包含無性繁殖的GA專一性人類T細胞株，寡殖株的(oligoclonal)GA專一性人類T細胞株，或是二者之組合。於具體例中，該分析方法組包含無性繁殖及寡殖株的GA專一性人類T細胞株之組合，其中大多數(>50%)為無性繁殖的GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該分析方法組包含無性繁殖及寡殖株的GA專一性人類T細胞株之組合，其中該組由以下組成：大約20%或更大、大約25%或更大、大約30%或更大、大約35%或更大、大約40%或更大、大約45%或更大、大約50%或更大、大約55%或更大、大約60%或更大、大約65%或更大、大約70%或更大、大約75%或更大、大約80%或更大、大約85%或更大、大約90%或更大、大約95%或更大，或是大約100%的無性繁殖的GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該分析方法組包含無性繁殖及寡殖株的GA專一性人類T細胞株之組合，其中該組由以下組成：大約20%至大約100%、大約25%至大約100%、大約30%至大約100%、大約35%至
大約100%、大約40%至大約100%、大約45%至大約100%、大約50%至大約100%、大約55%至大約100%、大約60%至大約100%、大約65%至大約100%、大約70%至大約100%、大約75%至大約100%、大約80%至大約100%、大約85%至大約100%、大約90%至大約100%，或是大約95%至大約100%的無性繁殖的GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該分析方法組包含無性繁殖及寡殖株的GA專一性人類T細胞株之組合，其中該組係由以下組成：1/6或更大、1/3或更大、2/3或更大、3/4或更大，或是5/6或更大的無性繁殖的GA專一性人類T細胞株。
於具體例中，分析方法組內所有的GA專一性人類T細胞株均為無性繁殖的。可以使用熟悉此藝者已知的以及文獻中所述之任何方法來從T細胞族群中選殖T細胞株，例如限制稀釋法選殖(limiting dilution cloning)。於限制稀釋法選殖方面，以限制稀釋法來培養候選細胞株於多個井內(例如，0.3個細胞/井或不超過一個細胞/井)，加上抗原及APC。形成的細胞係如同本文中所述予以再刺激。T細胞選殖的方法是廣為人知的且描述於文獻中，例如Mariotti,S.，及Nisini,R.,2009,“Generation of Human T Cell Clones”，T Cell Protocols內，Gennaro de Libero(ed.),Humana Press，第二版，vol.514，第65-93頁，其之整體併入本文以作為參考資料。於具體例中，該限制稀釋法選殖方法被重複一次或更多次以獲得一種無性繁殖的GA專一性人類T細胞株。亦可以使用流動式細胞測量術來選殖(cloned)T細胞株，例
如，如Lee，S-T等人，2008，“A Novel Strategy for Rapid and Efficient Isolation of Human Tumor-Specific CD4+ and CD8+ T-Cell Clones”，J.Imm.Meth.331(1-2)：13-26，中所描述，其之整體併入本文以作為參考資料。於具體例中，一種T細胞株之無性繁殖系的形成能力(clonality)係依據熟悉此藝者已知的方法以及文獻中公開的方法來、藉由T細胞受體的定序來確認。
於具體例中，一種分析方法組包含藉由在第一GA製備物存在下培養人類T細胞而產生的GA專一性人類T細胞株，以及藉由在於第二GA製備物存在下培養人類T細胞而產生的至少一個GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該第一GA製備物為COP，以及該第二GA製備物為GMA。於具體例中，該第一及該第二GA製備物為不同的COP製備物或是不同的GMA製備物。
於具體例中，一種GA專一性人類T細胞株之分析方法組包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其在用第一GA製備物刺激後，產生出如同其用第二GA製備物刺激後產生的GA引出的反應，相似或同一的GA引出的反應。於具體例中，該第一GA製備物為COP，以及該第二GA製備物為GMA。於具體例中，該第一及該第二GA製備物為不同的COP製備物或是不同的GMA製備物。
於具體例中，該組包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其對第一個非正則GA胜肽之刺激起反應。於具體例中，該組包含對第一個非正則GA胜肽之刺激起反應的至
少一個GA專一性人類T細胞株，以及對第二個非正則GA胜肽之刺激起反應的至少一個GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該組包含至少二個GA專一性人類T細胞株，其對GA刺激起反應而各自產生不同的反應之生物標記的剖繪。於具體例中，該分析方法組包含至少二個GA專一性人類T細胞株，其各自具有不同的MHC限制性。
於具體例中，該GA專一性人類T細胞株之分析方法組包含至少二個GA專一性人類T細胞株，其中該至少二個GA專一性人類T細胞株中至少一者為：a)一種GA專一性人類T細胞株，其對非正則GA胜肽之刺激不會反應；b)一種GA專一性人類T細胞株，其具有一個已知的生物標記反應的剖繪；以及c)一種GA專一性人類T細胞株，其具有一個已知的MHC限制性。
於具體例中，本發明之分析方法組包含藉由在第一GA製備物存在下培養人類T細胞而產生的至少一個GA專一性人類T細胞株，以及藉由在於第二GA製備物存在下培養人類T細胞而產生的至少一個GA專一性人類T細胞株。於具體例中，此分析方法組進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其對一個非正則GA胜肽不會起反應。於具體例中，該藉由在第一GA製備物存在下培養人類T細胞而產生的至少一個GA專一性人類T細胞株，係藉由在GMA存在下培養人類T細胞而產生的。
於具體例中，該分析方法組內的GA專一性人類T細胞株係選自於：
1)一種GA專一性人類T細胞株，其係藉由用第一GA製備物來培養而產生的
2)一種GA專一性人類T細胞株，其係藉由用第二GA製備物來培養而產生的
3)一種GA專一性人類T細胞株，其對第一個非正則GA胜肽之刺激不會反應；
4)一種GA專一性人類T細胞株，其對第一個非正則GA胜肽之刺激會反應；
5)一種GA專一性人類T細胞株，其對第二個非正則GA胜肽之刺激不會反應；
6)一種GA專一性人類T細胞株，其對第二個非正則GA胜肽之刺激會反應；
7)一種GA專一性人類T細胞株，其具有一個已知的生物標記反應的剖繪；
8)一種GA專一性人類T細胞株，其具有不同於(7)之GA專一性人類T細胞株的生物標記的剖繪之已知的生物標記反應的剖繪；
9)一種GA專一性人類T細胞株，其具有一個已知的MHC限制性；以及
10)一種GA專一性人類T細胞株，其具有不同於(9)之GA專一性人類T細胞株的MHC限制性之已知的MHC限制性。
於具體例中，該GA專一性人類T細胞株為長期的GA專一性T細胞株，及/或無性繁殖的GA專一性人類T細胞株，及/或CD4+ GA專一性人類T細胞株，及/或CD8- GA專一性人類T細胞株。
於具體例中，該分析方法組包括表A中列舉的一個或更多個T細胞株。
於具體例中，該分析方法組包括表B中列舉的一個或更多個T細胞株。
於具體例中，該分析方法組包括一個或更多個正對照或負對照。
於具體例中，當該分析方法組包括對一個非正則GA胜肽之刺激不會反應之一個或更多個GA專一性人類T細胞株時，其進一步包含對相同的非正則GA胜肽會起反應之一個或更多個GA專一性人類T細胞株。舉例而言，該分析方法組可包含一個第一經特徵化的GA專一性人類T細胞株，其被判定為對一個非正則GA胜肽之刺激不會反應，以及一個第二經特徵化的GA專一性人類T細胞株，其被判定為對一個非正則GA胜肽之刺激會反應。於具體例中，該第一及第二經特徵化的GA專一性人類T細胞株二者都對一個非正則GA胜肽之刺激會反應，但是各者反應不同(例如，其等各自產生不同的GA反應之生物標記的剖繪)。於相關具體例中，含括一個負對照用於經判定為對一個非正則GA胜肽之刺激會反應或不會反應的任何GA專一性人類T細胞株。於具體例中，負對照樣本含有細胞株、適合的APC，以及無抗原。
於具體例中，該分析方法組包括具有一個已知的
生物標記反應的剖繪之一個或更多個GA專一性人類T細胞株，以及具有一個不同的已知生物標記反應的剖繪之一個或更多個GA專一性人類T細胞株。舉例而言，該分析方法組包含一個經特徵化的GA專一性人類T細胞株，經判定為具有第一個已知的生物標記反應的剖繪，以及一個經特徵化的GA專一性人類T細胞株，經判定為具有不同於該第一個已知的生物標記反應的剖繪之第二個已知的生物標記反應的剖繪。於具體例中，該第一個及第二個已知的生物標記反應的剖繪，各者包含至少一個細胞介素、至少一個趨化介素、至少一個活化標誌、至少一個編碼細胞介素的核酸、至少一個編碼趨化介素的核酸，或是至少一個編碼活化標誌的核酸。
於相關具體例中，含括一個負對照用於具有已知的生物標記反應的剖繪的任何GA專一性人類T細胞株。於具體例中，負對照樣本含有細胞株、適合的APC，以及無抗原。
於具體例中，該分析方法組包括具有一個已知的MHC限制性之一個或更多個GA專一性人類T細胞株，以及具有一個不同的已知MHC限制性之一個或更多個GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該分析方法組包括一個已知的MHC限制性之一個或更多個GA專一性人類T細胞株，其中該HLA-DR限制性元素係選自於：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，和DR-15；以及具有一個不同的已知MHC限制性之一個或更多個GA專一性人類T細胞
株，其中該HLA-DR限制性元素係選自於：DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，和DR-15。舉例而言，該分析方法組包含一個經特徵化的GA專一性人類T細胞株，經判定為具有第一個已知的MHC限制性，以及一個經特徵化的GA專一性人類T細胞株，經判定為具有不同於該第一個已知的MHC限制性之第二個已知的MHC限制性。於相關具體例中，含括一個負對照用於經判定具有一個不同的已知MHC限制性之任何GA專一性人類T細胞株。於具體例中，負對照樣本含有細胞株、非配對的APC，以及GA。於具體例中，負對照樣本含有細胞株、適合的APC，以及無抗原。
於具體例中，一種分析方法組包含至少二個GA專一性人類T細胞株，其中該至少二個GA專一性人類T細胞株之各者之GA專一性的判定係根據，在用第一GA製備物刺激該T細胞株時，測量GA引出的反應所獲得的反應，與用第二GA製備物刺激該T細胞株時，測量同樣GA引出的反應所獲得的反應之比較，以及其中該第二GA製備物的反應對該第一GA製備物的反應之比較，係落在可以接受的範圍或界線內，以及其中該至少二個GA專一性人類T細胞株之各者為一種長期的GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該第一GA製備物係用來產生該GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該第一GA製備物為Copaxone。
於具體例中，一種分析方法組包含至少二個GA專一性人類T細胞株，其中該至少二個GA專一性人類T細胞株之各者之GA專一性的判定係根據，用多重劑量的至少第
一GA製備物刺激該GA專一性人類T細胞株時，測量GA引出的反應所獲得的劑量反應曲線，與用多重劑量的第二GA製備物刺激該GA專一性人類T細胞株時，測量同樣的GA引出的反應所獲得的劑量反應曲線之比較，其中該第二GA製備物的劑量反應曲線的斜率對該第一GA製備物的劑量反應曲線的斜率之比較，係落在可以接受的範圍或界線內，以及其中該至少二個GA專一性人類T細胞株之各者為一種長期的GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該第一GA製備物係用來產生該GA專一性人類T細胞株。於具體例中，該第一GA製備物為Copaxone。
於具體例中，該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株中的至少一者對一個非正則GA胜肽會反應。於具體例中，該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株中的至少一者對一個選自於以下之非正則GA胜肽會反應：胜肽026、GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA 41S、GA 64，及GT 11。
於具體例中，該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株中的至少一者對一個非正則GA胜肽不會反應。於具體例中，該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株中的至少一者對一個選自於以下之非正則GA胜肽不會反應：胜肽026、GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA 41S、GA 64，以及GT 11。
於具體例中，該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株中的至少一者對一個非正則GA胜肽會反
應，以及其中該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株中的至少一者對同樣的非正則GA胜肽不會反應。於具體例中，該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株中的至少一者對一個選自於以下之非正則GA胜肽會反應：胜肽026、GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA 41S、GA 64，及GT 11，以及其中該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株中的至少一者對同樣的非正則GA胜肽不會反應。
於具體例中，該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株中的至少一者為無性繁殖的。於具體例中，該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株的全體為無性繁殖的。於具體例中，該分析方法組之至少二個GA專一性人類T細胞株具有不同的MHC限制性。於具體例中，該分析方法組之至少二個GA專一性人類T細胞株包括具有已知的MHC限制性之一個或更多個GA專一性人類T細胞株，其中該HLA-DR限制性元素係選自於：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，和DR-15；以及具有不同的已知MHC限制性之一個或更多個GA專一性人類T細胞株，其中該HLA-DR限制性元素係選自於：DR-4、DR-7、DR-11、DR-13，和DR-15。於具體例中，該分析方法組內該至少二個GA專一性人類T細胞株包含至少98%的CD4+T細胞，以及不超過2%的CD8+T細胞。
於本發明的具體例中，本發明的分析方法組係使
用於一種方法內，以判定GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的。於此等具體例中，細胞樣本係使用該組內之各個GA專一性人類T細胞株之相同預定數目的細胞、適合的APC，以及一數量的該GA測試製備物來製備。細胞樣本也使用該組內之各個GA專一性人類T細胞株之相同預定數目的細胞、適合的APC，以及一數量的該GA參考標準品來製備。於具體例中，負對照係使用該組內之各個GA專一性人類T細胞株之相同預定數目的細胞、無APC，以及無抗原來製備。於具體例中，對照係使用該組內之各個GA專一性人類T細胞株之相同預定數目的細胞、適合的APC，以及不相關的抗原來製備。於具體例中，負對照係使用該組內之各個GA專一性人類T細胞株之相同預定數目的細胞，以及非配對的APC來製備。
於具體例中，各細胞樣本測量該相同的至少一個到至少25個GA引出的反應。於具體例中，各細胞樣本測量2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24，或是至少25個GA引出的反應。
利用本發明的分析方法組獲得的量度(measurements)可以使用來判定GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的，其係藉由比較用該GA測試製備
物刺激的T細胞株樣本內一個特定的GA引出的反應之量度，及用該GA參考標準品刺激的T細胞株樣本內相同的GA引出的反應之量度。於具體例中，在進行比較之前，將此等量度正規化(normalized)以把負對照樣本觀察到的任何背景考慮進去。
如同本文中所述，GA測試製備物和GA參考標準品之免疫同一性可以使用本發明的方法來判定，其係藉由比較用GA測試製備物刺激的GA專一性T細胞株之至少一個GA引出的反應的量度，以及用GA參考標準品刺激的GA專一性T細胞株之同樣的至少一個GA引出的反應的量度。
如同本文他處所述，該測量的GA引出的反應可以為增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，或是其等之組合。
於具體例中，其中本發明的方法中測量的GA引出的反應為反應之生物標記的產生，該反應之生物標記可以為，諸如細胞介素、細胞介素受體、趨化介素、T細胞活化標誌，或是編碼細胞介素、細胞介素受體、趨化介素或T細胞活化標誌之核酸。反應之生物標記可以依據本技藝已知及本文中別處描述的方法來測量。
於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的細胞介素：例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，以及IL-1b。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的
活化標誌：例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的趨化介素：例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。於具體例中，反應之生物標記為Th1關聯性細胞介素、Th2關聯性細胞介素、Th17關聯性細胞介素，或是ThFH關聯性細胞介素。於具體例中，反應之生物標記為Th1關聯性細胞介素且為IFN-γ。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的Th2關聯性細胞介素：IL-4、IL-5，及IL-13。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的Th17關聯性細胞介素：IL-17，及IL-22。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的ThFH關聯性細胞介素：IL-21，及TGF-β。於具體例中，反應之生物標記為選自於以下的關鍵調節關聯性細胞介素：IL-10及TGF-β。
於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的細胞介素之核酸：例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β，以及IL-1b。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的活化標誌之核酸：例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279，及HLA-DR。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的趨化介素之核酸：例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4，及CXCL7。於具體例中，反應之生物標記為編碼Th1關聯性細胞介素之核酸、編碼Th2關聯性細胞介素之核酸、編碼
Th17關聯性細胞介素之核酸，或是編碼ThFH關聯性細胞介素之核酸。於具體例中，反應之生物標記為編碼Th1關聯性細胞介素且為IFN-γ之核酸。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的Th2關聯性細胞介素之核酸：IL-4、IL-5，及IL-13。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的Th17關聯性細胞介素之核酸：IL-17，及IL-22。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的ThFH關聯性細胞介素之核酸：IL-21，及TGF-β。於具體例中，反應之生物標記為編碼選自於以下的關鍵調節關聯性細胞介素之核酸：IL-10及TGF-β。可以依據本文所述的方法來鑑別額外的反應之生物標記。
於具體例中，當分別成對的GA測試製備物和GA參考標準品的量度(例如，表達為分率、比率，或是百分率)之各自的比較落在可以接受的範圍或是可以接受的界線內的時候，判定該GA測試製備物和該GA參考標準品之免疫同一性。
於本發明的具體例中，GA製備物之間的免疫同一性係使用GA專一性人類T細胞株組來判定。於具體例中，用GA測試製備物刺激該組內之各個GA專一性人類T細胞株之至少一個GA引出的反應的量度，以及用GA參考標準品刺激的該組內各自的GA專一性人類T細胞株之同樣的至少一個GA引出的反應的量度，作比較。如同所述，於某些具體例中，在比較之前，將各GA引出的反應的量度予以正規化，以把合適的負對照樣本內觀察到的任何訊號考慮
進去。於具體例中，其中使用多個GA專一性T細胞株組來評估至少一個GA測試批，該組內用參考批來刺激的任何/全部的細胞株之劑量反應曲線必須符合預定的準則，例如如同以下所述，其中相關係數(r)為0.9，斜率為0.60，GA標準品之反算濃度為標稱濃度的±30%，以及GA樣本之精確度變異係數(CV)之20%。於具體例中，至少一個GA測試批之劑量反應曲線必須在預定可以接受的界線內，以被判定和該GA參考標準品為免疫同一性的。於具體例中，相關係數為0.90至0.98。於具體例中，相關係數為超過或等於0.90、超過或等於0.91、超過或等於0.92、超過或等於0.93、超過或等於0.94、超過或等於0.95、超過或等於0.96、超過或等於0.97、超過或等於0.98、0.90至0.98、0.91至0.98、0.92至0.98、0.93至0.98、0.94至0.98、0.95至0.98、0.96至0.98、0.90至0.97、0.91至0.97、0.92至0.97、0.93至0.97、0.94至0.97、0.95至0.97，或是0.96至0.98。
於具體例中，當比較(用GA測試製備物刺激的GA專一性T細胞株之GA引出的反應的量度，相對於用GA參考標準品刺激的GA專一性T細胞株之GA引出的反應的量度)為75%至125%時，作出免疫同一性的判定。於具體例中，在作比較之前，先從測試值減去合適的負對照值，譬如無抗原對照。於具體例中，在作比較之前，先從測試值減去無抗原對照值。於具體例中，直接比較該等數值。
於具體例中，該比較數值之可以接受的範圍或界線為大約80%至大約120%，或是大約90%至大約110%。於
以上的具體例中，該可以接受的範圍為大約75%至大約120%、大約75%至大約115%、大約75%至大約110%、大約75%至大約105%、大約75%至大約100%、大約80%至大約125%、大約85%至大約125%、大約90%至大約125%、大約95%至大約125%、大約100%至大約125%、大約80%至大約118%、大約80%至大約115%、大約80%至大約112%、大約80%至大約110%、大約80%至大約108%、大約80%至大約105%、大約80%至大約102%、大約80%至大約101%、大約80%至大約100%、大約80%至大約99%、大約80%至大約98%、大約80%至大約97%、大約80%至大約95%、大約80%至大約92%、大約80%至大約90%、大約82%至大約120%、大約82%至大約118%、大約82%至大約115%、大約82%至大約112%、大約82%至大約110%、大約82%至大約108%、大約82%至大約105%、大約82%至大約102%、大約82%至大約101%、大約82%至大約100%、大約82%至大約99%、大約82%至大約98%、大約82%至大約97%、大約82%至大約95%、大約82%至大約92%、大約82%至大約90%、大約84%至大約120%、大約84%至大約118%、大約84%至大約115%、大約84%至大約112%、大約84%至大約110%、大約84%至大約108%、大約84%至大約105%、大約84%至大約102%、大約84%至大約101%、大約84%至大約100%、大約84%至大約99%、大約84%至大約98%、大約84%至大約97%、大約84%至大約95%、大約84%至大約92%、大約84%至大約90%、大約86%至大約120%、大約86%至大約118%、
大約86%至大約115%、大約86%至大約112%、大約86%至大約110%、大約86%至大約108%、大約86%至大約105%、大約86%至大約102%、大約86%至大約101%、大約86%至大約100%、大約86%至大約99%、大約86%至大約98%、大約86%至大約97%、大約86%至大約95%、大約86%至大約92%、大約88%至大約120%、大約88%至大約118%、大約88%至大約115%、大約88%至大約112%、大約88%至大約110%、大約88%至大約108%、大約88%至大約105%、大約88%至大約102%、大約88%至大約101%、大約88%至大約100%、大約88%至大約99%、大約88%至大約98%、大約88%至大約97%、大約88%至大約95%、大約90%至大約120%、大約90%至大約118%、大約90%至大約115%、大約90%至大約112%、大約90%至大約110%、大約90%至大約108%、大約90%至大約105%、大約90%至大約102%、大約90%至大約101%、大約90%至大約100%、大約90%至大約99%、大約90%至大約98%、大約90%至大約97%、大約90%至大約95%、大約92%至大約120%、大約92%至大約118%、大約92%至大約115%、大約92%至大約112%、大約92%至大約110%、大約92%至大約108%、大約92%至大約105%、大約92%至大約102%、大約92%至大約101%、大約92%至大約100%、大約92%至大約99%、大約92%至大約98%、大約95%至大約120%、大約95%至大約118%、大約95%至大約115%、大約95%至大約112%、大約95%至大約110%、大約95%至大約108%、大約95%至大約105%、大約95%至大約
102%、大約95%至大約101%、大約95%至大約100%、大約97%至大約120%、大約97%至大約118%、大約97%至大約115%、大約97%至大約112%、大約97%至大約110%、大約97%至大約108%、大約97%至大約105%、大約97%至大約102%、大約98%至大約120%、大約98%至大約118%、大約98%至大約115%、大約98%至大約112%、大約98%至大約110%、大約98%至大約108%、大約98%至大約105%、大約99%至大約120%、大約99%至大約118%、大約99%至大約115%、大約99%至大約112%、大約99%至大約110%、大約99%至大約108%、大約99%至大約105%、大約100%至大約120%、大約100%至大約118%、大約100%至大約115%、大約100%至大約112%、大約100%至大約110%、大約100%至大約108%、大約100%至大約105%、大約101%至大約120%、大約101%至大約118%、大約101%至大約115%、大約101%至大約112%、大約101%至大約110%、大約101%至大約108%、大約102%至大約120%、大約102%至大約118%、大約102%至大約115%、大約102%至大約112%、大約102%至大約110%、大約102%至大約108%、大約105%至大約120%、大約105%至大約118%、大約105%至大約115%、大約105%至大約112%、大約105%至大約110%、大約110%至大約120%、大約110%至大約118%，或是大約110%至大約115%。
於具體例中，一種使用GA專一性T細胞株的分析方法組進行的GA測試製備物和該GA參考標準品之免疫同
一性之判定，可以透過用GA測試和GA參考標準品製備物予以刺激後，測量的至少2個、至少3個、至少4個或更多個不同的GA引出的反應，作比較來鑑別。
於具體例中，當分析方法組內各個分別成對的量度之比較落在預定可以接受的範圍內時，判定使用GA專一性T細胞株的分析方法組進行的GA測試製備物和該GA參考標準品之免疫同一性。於具體例中，當分析方法組內分別成對的量度之比較80至100%、85至100%、90至100%，或95至100%、80%、85%、90%、95%，或是100%，落在預定可以接受的範圍內時，判定使用GA專一性T細胞株的分析方法組進行的GA測試製備物和該GA參考標準品之免疫同一性。
於具體例中，其中根據使用單一參考批且比較單一劑量的GA引出的反應，而判定測試及參考標準品GA製備物為免疫同一性的，該免疫同一性係基於「單一參考批，單一劑量分析」作判定。於具體例中，當一個GA劑量、二個不同的GA劑量、三個不同的GA劑量，或是更多個不同的GA劑量，各者之單一參考品，單一劑量分析比較數值落在預定可以接受的範圍內時，判定二種GA製備物之免疫同一性。
於具體例中，以一系列漸增的GA劑量來測量對各GA批之GA引出的反應，以及使用形成的反應值來產生各批的劑量反應曲線。於具體例中，透過比較參考標準品批劑量反應曲線的斜率(β*)，及測試批劑量反應曲線的斜
率，來判定該等批為免疫同一性(或者不是免疫同一性的)。於此等具體例中，基於「單一參考批劑量反應曲線分析」來鑑別人類T細胞株之GA專一性。於具體例中，當在線性的範圍內之GA測試製備物及GA參考標準品各自之劑量反應曲線的斜率，為統計上相似或同一的時候，可以確認GA測試製備物及GA參考標準品為免疫同一的。
於具體例中，當依據熟悉此藝者已知的任何適合的統計方法來判定，落在線性的範圍內之測試GA批及參考GA批之劑量反應曲線的斜率為統計上相似或同一的時候，可以判定二種GA製備物之免疫同一性。於具體例中，GA測試製備物和該GA參考標準品之免疫同一性係使用EC50比較及/或迴歸分析，或是本技藝已知或文獻中描述的另一種適合的方法來判定。
於具體例中，為了要透過比較劑量反應曲線來達到免疫同一性之判定，參考批之劑量反應曲線的斜率(β*)必須符合適當的驗收準則。熟悉此藝者可以預先決定適當的驗收準則。於某些具體例中，適當的驗收準則為：
‧相關係數(r)為0.9
‧斜率為0.60
‧GA標準品之反算濃度(back-calculated concentration)為標稱濃度的±30%
‧GA樣本之精確度變異係數(CV)之20%。
於具體例中，正對照樣本(例如用ConA刺激的細胞)之75%之GA引出的反應，必須高於用任何濃度的GA來
刺激相同細胞引起之最高的反應。於具體例中，負對照樣本(例如用對照胜肽，例如髓磷脂鹼性蛋白，MBP處理的細胞)之75%之GA引出的反應，必須低於或是接近用任何濃度的GA引起之最低的反應。
GA參考批樣本集(sample set)可以執行線性迴歸，資料點係繪製於對數-對數單位(log-log scale)上。對數GA引出的反應值(透過增高分析物的濃度，以下顯示為IL-2)位於Y軸，以及對數GA參考批濃度(劑量)值位於X軸。
以上的資料集之最佳配適線性迴歸模式如下： Y=α+β．X (1)
該處Y=log10(mIL-2濃度)，以及X=log10(GA濃度)。用適當的表示法取代X及Y變數，以上的模式變成下列：log10(mIL-2濃度)=α+β．log10(GA-濃度) (2)
於具體例中，當測試批曲線的斜率落在可以接受的界線內時，免疫同一性被確立。測試批曲線的斜率之可以接受的範圍係根據使用下列連串的方程式之參考批曲線來判定：特定的對數(反應)之反算劑量值為：X反回=10(Y-α)/β該處Y=log10(mIL-2濃度) (3)
準確度可以計算如下：
Y低及Y高為±(平均值+2＊SD)允許的最高準確度之最低及最高的對數(反應)值，該處±(平均值+2＊SD)為大概95%
的個別允差區域(individual tolerance region)之最高界線。
因而，接受的斜率的等式之假說的該區域為：
β*係計算如下：
接著，將以上的區域簡化(reduced)成下列以用於判定可以接受的β*界線：
該處β為GA-RS曲線之斜率。因而，方程式(6)所判定的GA批(GA-Batch)斜率可以接受的範圍，β*，可以顯示為：
設若β*在以上可以接受的界線內，則可以得出平行性(parallelism)的結論。
於具體例中，相等的斜率使用真實假設檢定(true hypothesis test)。
於具體例中，使用參考批之多重分析方法(以說明分析方法變異)，或是多個參考批的分析方法(以說明參考批間的變異，例如商業上可得的多重批的COP)來產生校正
曲線。於具體例中，其中分析方法內含括多個COP參考批，以提供多個資料集，例如來說明批對批的變異，由多個參考批而來的資料係用來決定參考斜率可以接受的變異。於此等具體例中，基於「多個參考劑量反應曲線分析」來判定測試及參考GA批為免疫同一性的。
於具體例中，其中分析方法內含括相同的Copaxone參考批之多個樣本，以提供重複的資料，舉例來說來說明分析方法變異，參考批重複的資料係用來決定參考斜率可以接受的變異。於此等具體例中，基於「重複的參考劑量反應曲線分析」來判定測試及參考GA批為免疫同一性的。
於具體例中，小組內使用具有已知特徵的多個GA專一性人類T細胞株，例如MHC限制性及對非正則胜肽之反應性。於此等具體例中，該組內之各個GA專一性人類T細胞株可以用一個參考GA批或多個參考GA批，以及一個或多個GA測試批來刺激。為了建立GA參考批和測試批之間的免疫同一性，參考批之劑量反應曲線必須符合適當的驗收準則，例如以上討論者，以及GA測試批之劑量反應曲線必須如所述的落在可以接受的界線內。
於具體例中，單一GA專一性人類T細胞株或多個GA專一性人類T細胞株係用一個參考GA批，即如同本文中其他處所述用改變原始胺基酸組成的方式所合成的非正則GA胜肽，以及一個GA測試批來刺激。使用以上所述的方法，可以決定參考胜肽β*可接受的界線，以及非正則GA胜
肽之劑量反應曲線所產生的斜率。測試胜肽之斜率和標準品及非正則GA胜肽二者之劑量反應曲線的斜率，同時進行相似性或是相異性之統計比較能對測試胜肽之相似性或相異性程度提供判定。GA測試批之免疫同一性或非同一性可以使用此比較來判定。
美國專利申請公開案第2014/027298號，標題為“Glatiramer Acetate Response Biomarker mRNA Potency Assay”內業已描述用於評估比較GA製備物之資料的方法，其之整體併入本文以作為參考資料。
於本發明的方法中測量GA引出的反應的上下文中，產生的GA反應之生物標記可以鑑別，其係透過於適合的APC存在下、用GA刺激之GA專一性T細胞培養物所產生的候選GA反應之生物標記的量，和用適合的APC孵育但未用抗原刺激之對照培養物，或是用負對照抗原刺激的對照培養物內，所產生的相同生物標記的量作比較。於具體例中，一種GA反應之生物標記之鑑別係基於GA刺激後，相對於對照，增高大約1.5倍(亦即，反應為高於大約50%)至大約1000倍、大約1.5倍至大約2倍、大約1.5倍至大約3倍、大約1.5倍至大約4倍、大約1.5倍至大約5倍、大約1.5倍至大約6倍、大約1.5倍至大約7倍、大約1.5倍至大約8倍、大約1.5倍至大約9倍、大約2倍至大約3倍、大約2倍至大約4倍、大約2倍至大約5倍、大約2倍至大約6倍、大約2倍至大約7倍、大約2倍至大約8倍、大約2倍至大約9倍、大約2倍至大約10
倍、大約3倍至大約4倍、大約3倍至大約5倍、大約3倍至大約6倍、大約3倍至大約7倍、大約3倍至大約8倍、大約3倍至大約9倍、大約3倍至大約10倍、大約4倍至大約5倍、大約4倍至大約6倍、大約4倍至大約7倍、大約4倍至大約8倍、大約4倍至大約9倍、大約4倍至大約10倍、大約5倍至大約6倍、大約5倍至大約7倍、大約5倍至大約8倍、大約5倍至大約9倍、大約5倍至大約10倍、大約6倍至大約7倍、大約6倍至大約8倍、大約6倍至大約9倍、大約6倍至大約10倍、大約7倍至大約8倍、大約7倍至大約9倍、大約7倍至大約10倍、大約8倍至大約9倍、大約8倍至大約10倍、大約1.5倍至大約80倍、大約1.5倍至大約70倍、大約1.5倍至大約60倍、大約1.5倍至大約50倍、大約1.5倍至大約40倍、大約1.5倍至大約30倍、大約1.5倍至大約20倍、大約2倍至大約80倍、大約1.5倍至大約70倍、大約1.5倍至大約60倍、大約1.5倍至大約50倍、大約1.5倍至大約40倍、大約1.5倍至大約30倍、大約1.5倍至大約20倍、大約2倍至大約80倍、大約2倍至大約70倍、大約2倍至大約60倍、大約2倍至大約50倍、大約2倍至大約40倍、大約2倍至大約30倍、大約2倍至大約20倍、大約3倍至大約80倍、大約3倍至大約70倍、大約3倍至大約60倍、大約3倍至大約50倍、大約3倍至大約40倍、大約3倍至大約30倍、大約3倍至大約20倍、大約5倍至大約80倍、大約5倍至大約70倍、大約5倍至大約60倍、大約5倍至大約50倍、大約5倍至大約40倍、大約5倍至大約30倍、大約3倍至大約20倍、大約10倍至大約80倍、大約10倍至大
約60倍、大約10倍至大約40倍，或大約10倍至大約20倍、至少大約1.5倍、至少大約2倍、至少大約2.5倍、至少大約3倍、至少大約3.5倍、至少大約4倍、至少大約4.5倍、至少大約5倍、至少大約6倍、至少大約7倍、至少大約8倍、至少大約9倍，或至少大約10倍。
縱然本文中已經顯示及說明本發明的較佳具體例，但是明顯地對熟悉此藝者而言提供此等具體例僅作為舉例。熟悉此藝者會想到很多的變異、變化，以及取代，且不背離本發明。應該瞭解到可以使用本文中所說明的具體例之各種替代方案來實施本發明。下列申請專利範圍意欲定義本發明的範疇，以及在此等申請專利範圍內之方法及結構和由此涵蓋之其等均等物。
除非另有指明，本文之實施例使用下列方法。分析方法的樣本係以三重複(triplicate)進行。
T細胞株係使用Good等人及Ota等人(Good等人，1987；Ota等人，1990)所描述的方法來單離。PBMC之採集係經由白血球分離術(leukapheresis)、使用酸性檸檬酸右旋糖(acid citrate dextrose)(ACD)作為抗凝血劑、藉由Ficoll-Paque梯度離心、根據製造商的協定(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)來分離，以及冷凍保存(cryopreserved)於含2%人類血清白蛋白及10% DMSO的
PBS內。PBMC培養物係以AIM V®培養基(Invitrogen)或是X-VIVO 15®培養基(Lonza)來製備。於第1天添加10μg/mL的抗原(GMA，Mylan Pharmaceuticals，Inc.，或是Copaxone，Teva Pharmaceuticals USA，Inc.)至含有5 x 105至2 x 106個細胞/mL(1-4 x 105個細胞每200μl井)之U底的96井平盤。平盤在37℃、6% CO2下孵育。於第3天或第4天，添加10U/mL IL-2(2U/井，eBioscience cat#14-8029-63或是R&D Systems cat#202-IL-010/CF)。IL-2係藉由以培養基來稀釋存料IL-2至40U/mL來製備，以及添加50μl經稀釋的存料IL-2(2U)至各井。於第6天及第7天再次添加相同量的IL-2，以及基於細胞生長的評估設若需要的話，可能於第10天或將近第10天再次添加。
於第12-14天，細胞株經歷對GA再刺激的反應性之起始的篩選，其係藉由分析APC存在下之增殖作用來進行。確認的分析方法在至少總計3回的再刺激之後(至少大約31天或更久)進行。
增殖作用之評估係藉由使用發光方法、測量ATP含量(CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay，Promega，Madison，WI，cat.#G7571)，或是藉由ELISA(Millipore cat.#2752)來測量BrdU攝取，於二種情況中均遵循套組的操作指南。使用拆分井格式(split well format)。使各井的細胞再懸浮，以及移轉至二個新的U底的96井平盤的各井，以產生複製的平盤。在起始的篩選方面，
原始的96井平盤接受絲裂黴素處理的自體PBMC作為APC，還有10μg/mL抗原(GA)。第一個複製的平盤僅接受100μL絲裂黴素處理的PBMC(2 x 105)，且無抗原，以及第二個複製的平盤接受100μL絲裂黴素處理的PBMC，還有最終濃度大約10μg/mL的GA。因而，所有的三個平盤均接受絲裂黴素C處理的自體APC(PBMC)以預防細胞分裂。各井的總體積為200μL。後面二個平盤於37℃、6% CO2下孵育3天，然後添加CellTiterGlo或BrdU，以及測量訊號。於第17天添加10U/mL的IL-2至原始的96井平盤供擴展。在後續的篩選方面，使用絲裂黴素處理的EBV轉形的自體B-LCL(2 x 105至5 x 105個細胞/mL)作為APC。
潛在的抗原有反應的井係根據相對於對照(添加APC，無抗原)平盤之對應井，反應之增高來鑑別。鑑別為抗原有反應的原始井典型在篩選之後7-10天，移轉至24井平盤，以及於絲裂黴素處理的自體PBMC存在下，用GA予以再刺激/擴展，如同以下所述的。
在起始篩選GA反應性的時候，含有由原始的刺激而來之三分之一的細胞之原始複製平盤，進行再刺激/擴展。原始的平盤內之細胞株於大約第12-14天用10μg/mL GA及絲裂黴素C處理的PBMC予以再刺激(起始刺激使用之相同的製備物)，當再刺激分析方法平盤時。於大約第17天添加10U/mL的IL-2。在起始的篩選大約7-12天之後(大約第19天至第26天)，原始平盤內對應於陽性井(positive wells)
的井予以再次擴展/再刺激。收集可據以推定的陽性井內的細胞，以及於添加起始的刺激濃度(10μg/mL)的GA及絲裂黴素處理的APC之24井平盤內培養。將APC調整至2.5 x 106每mL(若是PBMC)或5 x 105每mL(若是B-LCL)。每井添加1mL APC至含有T細胞之24井平盤，以及該等平盤在37℃、6% CO2下孵育24小時。各井添加最終IL-2濃度10U/mL的IL-2或是如同另外指明的。培養物繼續6-13天，以及重複刺激。T細胞於擴展期間每7至14天進行刺激。
本文所述的培養容器內所使用的體積：96井平盤為200μL/井；24井平盤為2mL/井；12井平盤為4mL/井；T-25燒瓶為10mL；以及T-75燒瓶為20mL。
從製備作為增殖分析方法之培養物移除培養基，以及用於測量細胞介素的產生。於多數情況中，在T細胞、APC，及刺激抗原混合之後18-24小時收集培養基。細胞介素的產生增係藉由ELISA或小珠(bead)分析方法來測量。在測量細胞介素的產生方面，由各井移除100-150μL的培養基(如果培養要繼續則為100μL，否則為150μL)。於一些情況中，培養繼續48小時，總計培養72小時，以及測量增殖反應。
培養物上清液內的IFN-γ濃度係藉由使用二個抗IFN-γ單株抗體之三明治ELISA來測量。使用殖株2G1來捕獲，以及殖株B133.5之生物素化的抗體用於供偵測(二者均
來自於Endogen)。使用重組型IFN-γ來建構範圍由1000至15pg/mL之標準的曲線。
ELISA平盤係塗覆捕獲抗體，其係藉由以PBS稀釋抗體至1μg/mL，以及每井添加100μl的稀釋抗體。平盤在4℃下孵育過夜。移除塗覆的抗體，以及所有的井均添加100μl的PBS-BSA。平盤於室溫下孵育一小時。製作標準的曲線。標準品製作係使用配於1mL的PBS-BSA(最終濃度100ng/mL)之1μl的存料IFN-γ(100μg/mL)，以PBS-BSA(1g BSA/100mL PBS)稀釋如下：
a.取10μl的100ng/mL IFN-γ，以及稀釋於1mL的PBS-BSA內.=1000pg/mL
b.混合500μl的1000pg/mL及500ul的PBS-BSA.=500pg/mL
c.混合500μl的500pg/mL及500ul的PBS-BSA.=250pg/mL
d.混合500μl的250pg/mL及500ul的PBS-BSA.=125pg/mL
e混合500μl的125pg/mL及500ul的PBS-BSA.=62.5pg/mL
f.混合500μl的62.5pg/mL及500ul的PBS-BSA.=31.25pg/mL
g.混合500μl的31.25pg/mL及500ul的PBS-BSA.=15.625pg/mL。
使生物素化的抗體稀釋至0.5μg/mL於PBS-BSA
內。各平盤5μl的抗體稀釋於5mL的PBS-BSA內。在用PBS-BSA孵育之後，使用平盤洗滌機及PBS 0.05%妥文(Tween)20作為清洗溶液來清洗平盤四次。所有的井均添加50μl生物素化的抗體。添加50μl的樣本或標準品至合適的井。標準品及樣本係以二重複或三重複(triplicate)進行。平盤於室溫下孵育90分鐘。鏈黴抗生物素蛋白-過氧化酶(streptavidin-peroxidase)係以PBS-妥文(Tween)稀釋1：10,000。各平盤使用配於10mL PBS-妥文(Tween)之1μl的鏈黴抗生物素蛋白-過氧化酶。清洗平盤四次，添加100μl的鏈黴抗生物素蛋白-過氧化酶至各井，以及平盤於室溫下孵育30分鐘。用PBS-妥文(Tween)來清洗平盤四次。添加100μl的TMB(3,3',5,5"-四甲基聯苯胺)至各井，以及平盤於室溫下孵育15-30分鐘。藉由每井添加100μl的0.2N NH2SO4來停止反應，以及平盤以450nm來讀取，加上630nm的參考基準。
使用的捕獲抗體為單株抗人類IFN-γ(Endogen目錄編號M-700A)。生物素化的抗IFN-γ為Endogen目錄編號M-701B。鏈黴抗生物素蛋白過氧化酶為Zymed目錄編號43-4323。使用的TMB為Ultra TMB，Thermo Scientific cat編號34028。亦可以使用標準調配物TMB。
多個細胞介素的濃度係使用FlowCytoMixTM套組(eBioscience，San Diego CA)來同時測量。此等為螢光小珠為基的(bead based)分析方法，由接合(conjugated)至細胞介
素抗體的小珠所組成。對各細胞介素專一的小珠可由大小及670nm處的螢光來區分。使用藻紅素(phycoerythrin)接合的抗體來偵測與各小珠結合的細胞介素，因此585nm處的螢光反映樣本內的細胞介素濃度。使用測量不同的細胞介素組(cytokine panels)之二種套組。TH1/TH2套組測量IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、TNF-α(TNF)及TNF-β(LT)。TH1/TH2/TH9/TH17/TH22套組測量IFN-β、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17、IL-22，以及TNF-α(TNF)。二種套組都遵循製造商的操作指南來使用。
供使用作為APC的PBMC之製備係藉由解凍冷凍的PBMC，以及將細胞濃度調整至PBS內每mL 5 x 106個細胞。添加絲裂黴素C(Sigma-Aldrich cat#M4287或EMD Millipore cat#475820-10MG)達最終濃度25μg/mL。平盤在37℃下孵育30-45分鐘，用PBS來清洗細胞3次以移除絲裂黴素C。PBMC濃度調整至每mL 1-1.5 x 106個細胞。
人類B細胞係利用艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein Barr Virus)予以永生化(immortalized)供使用作為APC。根據標準的協定來解凍PBMC，以及以每mL 107個細胞的濃度將細胞予以懸浮。用艾司坦氏-巴爾氏病毒(ATCC VR-1492)來感染PBMC的等分試樣供使用作為永生化的B淋巴母細胞系細胞株(lymphoblastoid cell lines)(B-LCL)。藉由用PBMC及病毒於含有10%胎牛血清與1μg/mL環孢素
A(cyclosporin A)(環孢靈(cyclosporine))之RPMI 1640培養基，以預防T細胞活化與增殖，來培養T細胞以進行感染。將2mL的艾司坦氏-巴爾氏病毒(ATCC VR-1492)添加至15mL離心管內2mL的細胞內、充分混合，以及於37℃水浴內孵育歷時一小時。將8mL的培養基(RPMI 1640培養基與10%胎牛血清)及10μg環孢靈(cyclosporine)(藉由使1mg的環孢靈溶解於1mL的100%乙醇與100uL的妥文(Tween)80內，及用PBS使體積來到10mL而製備)添加至細胞內，以及將混合物移轉至25cm2燒瓶。在具有5-10% CO2之37℃的孵化器內豎立地孵育該燒瓶，以及使該燒瓶處於不干擾的狀態歷時2至6週。
當用顯微鏡觀察到大的淋巴母細胞叢(cluster)時，在2-6週的培養之後明顯可見成功的轉形。在此時維持該培養物以及藉由保持細胞濃度於每mL2 x 105至1 x 106個細胞之間來擴展。此典型係透過每3至5天稀釋細胞1：4-1：5來完成。於再刺激方面，添加5 x 105個絲裂黴素處理的B-LCL或絲裂黴素處理的自體PBMC至各井。
當使用B-LCL作為APC時，添加50μg/mL的絲裂黴素C至每mL 2 x 106個細胞的細胞懸浮液內。用絲裂黴素C來孵育45分鐘，然後清洗平盤3次以移除過量的絲裂黴素C。在清洗移除絲裂黴素C之後，將細胞調整至每mL 2-5 x 105個。
如同以上所述，轉形的B細胞係於實驗室內藉由
病毒來感染末梢血液單核細胞(PBMC)，以及添加環孢靈(cyclosporine)至培養基(RPMI 1640 10%胎牛血清)，以預防T細胞活化與增殖。用自體EBV-B細胞來刺激PBMC可能會導致任何EBV專一性T細胞產生(resulting in)病毒專一性T細胞株。因而，初級培養物或是早期繼代培養(early passage)T細胞株不使用EBV-B細胞，除非另外指明。已經繼代培養的(passage)幾次的T細胞株可以使用EBV-B細胞予以再刺激。
因為EBV-B細胞生長於懸浮液內，以及傾向形成細胞團塊，所以細胞濃度要保持在2 x 105/mL至1 x 106/mL之間。每3至5天透過用移液管向上及向下移動細胞(pipetting cells up and down)來使細胞團塊分散，以及移除80%的懸浮液，以1：4-1：5拆分培養物。添加等體積的新鮮的培養基，以及孵育該培養物。
細胞株之MHC DR限制性測試係如同以上所述，藉由供用於測試的細胞株之原始的供給者PBMC之已知的HLA-DR基因座為基礎來選擇的APC陣列，包括自體的APC(B-LCL)之存在下，測量細胞株之增殖反應而進行。表2說明所使用的供給者。
為了界定用於呈現抗原給GA專一性人類T細胞株的MHC分子，在自體APC存在下以及於T細胞供給者HLA-DR對偶基因匹配的APC存在下，測量GA專一性反應。因而，於各實驗中使用至少3種APC：自體APC、與DR
對偶基因1匹配但與對偶基因2不匹配的APC，以及與對偶基因2匹配但與對偶基因1不匹配的第三種APC。於一些實驗中，使用第四種APC B-LCL。使用一種無抗原負對照。藉由用50ug/mL的絲裂黴素C來孵育以使APC不活性化。不活性化以後，細胞清洗3次以移除絲裂黴素C，以及以每mL 106個細胞懸浮於X-VIVO 15培養基內。添加至GA細胞懸浮液內達最終濃度20-60μg/mL。於37℃下用抗原來孵育細胞歷時一小時以允許抗原攝取及結合。細胞懸浮液繼而離心使細胞成丸狀，以及用培養基來清洗細胞沈澱物(pellet)一次。將APC調整成X-VIVO 15培養基內每mL 2 x 105個細胞，以及每井添加100μL至不透明的96井平盤內。將每mL 2-4 x 105個細胞之T細胞懸浮液以每井100μL(除非另有指明)添加至96井平盤內，以及孵育該培養物4天然後使用CellTiter Glo®來測量細胞數目(以評估增殖作用)。
任擇地，APC不是脈衝的(pulsed)。反之，各井含有10ug/mL抗原、50μl APC以及100μL的T細胞。
在37℃(5% CO2)孵育4天之後，由各井移除100μL，組合以100μL CellTiterGlo試劑，以及使用Packard Fusion來測量發光。結果表達為相對光單位(relative light unit)(RLU)。
表2顯示的供給者HLA分型係由Puget Sound Blood Center(Seattle，WA)、遵循由美國組織相容免疫基因學會(American Society for Histocompatibility and
Immunogenetics)(ASHI)以及臨床實驗室改進法案(Clinical Laboratory Improvement Act)(CLIA)規定之標準來進行。使用聚合酶連鎖擴增為基的測試來分派HLA第I型及第II型對偶基因。
使小玻璃瓶浸沒於37℃水浴內，以及攪拌2-3分鐘來使冷凍保存的細胞解凍。細胞懸浮液一旦完全為液態便立即移轉至含有10mL溫的X-VIVO 15培養基之15mL離心管內。將管子輕輕地倒轉二次至三次來混合。移除50μL等分試樣的懸浮液以獲得細胞計數，以及剩餘的懸浮液係以200 x g離心10分鐘，以使細胞成丸狀。將培養基輕輕倒出，以及將細胞沈澱物(pellet)以所欲的細胞濃度再懸浮於X-VIVO 15培養基內。
GA製備物為Copaxone(COP，Teva Pharmaceuticals USA，Inc.)或是GMA(Mylan Pharmaceuticals，Inc.)，各自於甘露糖醇(40mg/mL)內稀釋至20mg/mL。藉由合成的最早的5分鐘不給酪胺酸來製備胜肽026。破傷風類毒素由Astarte Biologics供應。斯特恩胜肽(Stern peptide)係由Stern等人描述於下文中，2005，“Peptide 15-mers of defined sequence that substitute for random amino acid copolymers in amelioration of experimental autoimmune encephalomyelitis”，Proc.Nat.Acad.Sci.102：1620-1625)。
人類T細胞株係如同以上所述的，從先前沒有接觸過GA，且顯示為對GA反應專一的幾個不同供給者之各者獲得的PBMC來製備。本文所述的研究所用的供給者之特徵概述於表2中。
依據以上所述的方法於GMA或是Copaxone存在下，培養來自此等供給者之PBMC產生了超過六十個GA有反應的T細胞株。表3中依照供給者和使用的刺激抗原所列舉的此等細胞株，根據增殖分析方法而證明具有對GA的反應性，根據增殖或細胞介素產生的分析方法而證明具有GA專一性，或是二者都有。
GMA-反應性細胞株係如同以上所述從供給者1 PBMC獲得(2 x 105個細胞/井，亦即，1 x106個細胞/井，用10μg/mL GMA予以平盤培養；於第3天及第7天添加IL-2)。於第12天開始拆分井格式分析方法，用10μg/mL GMA及1 x 105絲裂黴素處理的自體PBMC作為APC來刺激細胞。於第3
天添加BrdU，細胞孵育4.5小時及固定，以及測量攝取。表4顯示選擇從供給者1 PBMC獲得的八個推定的GA專一性人類T細胞株，測得的增殖反應。相對於(無抗原)對照，此等細胞株各自產生至少增高50%的訊號。
於第24天，表4中列舉之對應於八個推定的GA專一性人類T細胞株的井的細胞，移轉至一個24井平盤，以及藉由10μg/mL GMA及絲裂黴素處理的自體PBMC作為APC(每井3 x 106，亦即，1.5 x 106/mL)來刺激予以擴展。於第32天，八株中的四株，222-BA11、222-BC11、222-AG11，及222-AG12，係於96井平盤內用0、1、10及100μg/mL GMA來刺激，以及測試對GMA之增殖反應，使用ATP分析方法，再次使用自體PBMC作為APC(每井2 x 105，亦即，1 x 106/mL)。相對於對照，用10μg/mL GMA來刺激的細胞觀察到最佳的增殖反應。圖2A及B顯示於第35天使用222-AG12、222-BC11、222-AG11，及222-BA11進行的ATP增殖分析方法的結果(對照=無抗原)，圖3A-C比較在使用如所示變化濃度的GMA或Copaxone，來刺激細胞株
222-BA11、222-BC11，及222-AG12之後，進行的ATP增殖分析方法的結果。
於第32天冷凍的222-AG11及222-AG12小玻璃瓶予以解凍，以及測試細胞產生的細胞介素。該等株係在自體的EBV轉形的B-LCL或來自一個對偶基因匹配的供給者之EBV轉形的B-LCL(供給者2 B-LCL)存在下，用0μg/mL GMA、10μg/mL Copaxone或1μg/mL破傷風類毒素(對照抗原)來刺激。添加APC但無抗原之對照樣本被含括。在24小時之後收集培養基，以及如同以上所述用ELISA來分析IFN-γ。圖4A及B顯示株222-AG11及222-AG12產生的IFN-γ。
從供給者1獲得COP反應性T細胞株。於起始刺激方面，每井1 x 105個細胞(5 x 105個細胞/mL)經單離的PBMC用10μg/mL Copaxone予以平盤培養，以及如同以上所述予以培養。於培養的第4天及第7天添加IL-2至所有的井，以及於第14天使用拆分井格式之發光增殖分析方法來篩選該等井之反應性。再刺激原始的平盤以及於再刺激之後4天添加IL-2。表5顯示15個供給者1 COP T細胞株增殖分析方法的結果(產生對照至少二倍的訊號)。
藉由COP起始刺激供給者1所產生的T細胞株222-2D8，於GMA及COP予以再刺激後，在至少2個實驗中顯示出同等地增殖作用。表6顯示用3或10μg/mL的GMA或COP刺激之後培養的第56天，進行的ATP增殖分析方法的結果。於刺激之後48小時測量ATP的位準。GMA系列的對照為無抗原，以及COP系列的對照為MBP。此分析方法中10μg/mL劑量GMA的反應，與COP相比為103.4%。
於1、3或是10μg/mL的GMA或COP刺激之後培養的第56天進行的第二個ATP增殖分析方法中，與COP相比之下，10μg/mL劑量GMA的反應為107.1%。結果顯示於表7內。
藉由COP起始刺激供給者1所產生的T細胞株222-2D8，於GMA及COP予以再刺激後，在至少2個實驗中顯示出同等地增殖作用。表8顯示用3或10μg/mL的GMA或COP刺激之後培養的第56天，進行的ATP增殖分析方法的結果。於刺激之後48小時測量ATP的位準。GMA系列的對照為無抗原，以及COP系列的對照為MBP。此分析方法中10μg/mL劑量GMA的反應，與COP相比為85.1%。
於培養的第56天，於總共6回的刺激之後，分析細胞株222-2F12對GA及一系列非正則胜肽的刺激起反應之增殖作用。關於該分析方法，於絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，將0、3、10或30μg/mL之胜肽GL 14、GLT 631、GAT 111及GAT 631、COP，及GMA之各者添加至1 x 105個細胞/mL的T細胞株。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。細胞株222-2F12對3μg/mL之GL 14會起反應，以及對測試的其他非正則GA胜肽不會起反應。此分析方法中10μg/mL劑量GMA的反應，與COP相比為99.4%。資料顯示於表9中。
根據觀察到的ATP位準(亦即，二個或更多個有抗原的井對於沒有抗原的對照井之相對發光比率)，於第26天將原始平盤內的15個推定的GA專一性人類T細胞株移動至24井平盤內，以及在自體的EBV轉形的B-LCL存在下(每井5 x 105，亦即，2.5 x 105/mL)，用10μg/mL Copaxone予以再
刺激。於第27天添加IL-2。於第34天，15個推定的株用10μg/mL GMA或10μg/mL COP予以再刺激，於絲裂黴素處理的自體B-LCL(每井4 x 104；每mL 2 x 105)存在下，或是用絲裂黴素處理的自體B-LCL以及無抗原予以孵育。於第35天添加IL-2至延續的培養物。於第36天，從測試培養物收集培養物上清液，以及藉由ELISA來測量IFN-γ產生(於再刺激48小時之後)。結果顯示於表10內。IFN-γ蛋白質濃度係使用TMB標準的曲線來判定。
至少7個供給者1 COP T細胞株，222-2D8、222-2E1、222-2B11、222-2C3、222-2B8、222-2G12，及222-2F12，對GA起反應而產生IFN-γ，以及細胞株對Copaxone及GMA二者都起反應。
222-2D8、222-1H12、222-1C5，及222-2D2第34天的上清液亦藉由免疫螢光的小珠(bead)分析方法(FlowCytoMixTM套組)，以三重複來測試對GMA、COP，或無抗原(作為對照)對照起反應之IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-8、IL-5、IL-1β、TNF-α，及TNF-β分泌作用。偵測到很少或沒有IL-4、IL-6，或IL-12。表11顯示株222-2D8及222-1H12導致的細胞介素的分泌剖繪。表12顯示株222-1C5及222-2D2導致的細胞介素的分泌剖繪。重要的是注意到表12內，T細胞株1H12的上清液予以滴定，證明此細胞株對GMA與COP二者都起反應而產生干擾素。
培養物於第46天、56、67及第75天予以再刺激。於第56天，細胞株222-2D8、222-1H12、222-2F12、222-2B8、222-1C5、222-2B11及222-2E1再次以增殖分析方法來測試1、3或10μg/mL的GMA或COP刺激之反應性。於刺激之後48小時測量七個細胞株的ATP位準(結果於圖5A-G內)。GMA系列的對照為無抗原，以及COP系列的對照為MBP。
於第56天再刺激之後24小時，取得的4種培養物上清液(來自222-2B8、222-1C5、222-2B11及222-2E1)，使用小珠為基的(bead-based)多重分析方法來分析細胞介素(結果於表13-16內)。所有的細胞介素值表示以pg/mL計之三重複值的平均值。在增殖分析方法與細胞介素分析方法二者內，該等株都顯示出對GMA及COP刺激二者之反應性。先前鑑別為對GA刺激反應不製造IFN-γ的株1C5，發現於適當的稀釋上清液之後，對GMA與COP二者都起反應而產生
IFN-γ，以及為可比較的量(見表14)。
於48小時之後(於第56天，第6次刺激後)，藉由免疫螢光的小珠(bead)分析方法來進一步分析細胞株222-2D8、222-1H12及222-2F12細胞介素的分泌(結果於圖6A-F內)。測量在自體的EBV轉形的B-LCL存在下，對1、3或10μg/mL GMA，或是1、3或10μg/mL COP，以及無抗原對照和MBP對照，的刺激起反應之IL-12p70、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-8、IL-6、IL-5、IL-4、IL-1β、TNF-α(TNF)及TNF-β(LT)分泌作用。圖6A、C及E顯示三個供給者1細胞株對三個濃度的GMA起反應之細胞介素的分泌作用，以及圖6B、D及F
顯示其等對三個濃度的COP起反應之細胞介素的分泌作用。箭頭指示各細胞介素資料集之第一個長條，亦即，對照樣本的位置，接著往右以該順序為用1μg/mL GA、3μg/mL GA、10μg/mL GA，及MBP處理的細胞之分泌位準。三個細胞株各者提供不同的細胞介素的分泌剖繪。用10μg/mL GA處理的細胞株產生最高位準的細胞介素(各集(set)從左邊的第四個長條)。
從具有第二型MHC HLA-DRβ1 04：01，04：04之正常、健康、63歲大的女性供給者(供給者2)獲得PBMC。經單離的PBMC於第0天以配於AIM V培養基內、每井2 x 105個細胞(1 x 106個細胞/mL)、加上100μg/mL GMA來培養，以及如同方法中所述予以培養。於第13天篩選培養物之增殖作用，其係使用絲裂黴素處理的自體PBMC作為APC、用100μg/mL GMA刺激之後，使用BrdU攝取分析方法來進行。以GA刺激的測試樣本之OD相對於未刺激的對照樣本，至少增高50%為基礎，來選擇九個推定的GA專一性人類T細胞株供擴展以及進一步分析。表17顯示選擇從供給者2 PBMC獲得的九個推定的GA專一性人類T細胞株之BrdU增殖資料。值得注意的是此等T細胞株全體的BrdU攝取與對照之差異為大於二倍。
此等推定的供給者2T細胞株之擴展係藉由10μg/mL GMA及絲裂黴素處理的自體PBMC，以及後來用自體的EBV轉形的B-LCL來刺激而進行。將株206-1A7轉換到X-VIVO 15培養基。於第88天用B-LCL及10μg/mL GMA或是1μg/mL破傷風類毒素(TT)來刺激株206-1A7。於4天之後，培養物係藉由ATP分析方法以測試增殖作用，以及藉由ELISA來測試上清液的IFN-γ及TNF-α的分泌作用。圖7A顯示T細胞株206-1A7對濃度範圍如所示由0至100μg/mL之GMA的刺激起反應之增殖作用。圖7B顯示株206-1A7之IFN-γ分泌作用。於二種實驗中，0濃度對照不含任何GMA。圖7A及B內的淺灰色0濃度長條代表以1μg/mL TT處理的樣本。偵測不到TNF-α。此細胞株受細菌汚染而失去。
從具有第二型MHC HLA-DRβ1*15，*11之正常、健康、52歲大的男性供給者(供給者3)獲得PBMC。培
養物係以每井1 x 105個細胞(1 x 106個細胞/mL)培養於U底的96井平盤內，加上10μg/mL GMA。於第3天及第7天添加IL-2，以及在第14天於每井2 x 104自體的B-LCL存在下，用10μg/mL GMA予以再刺激培養物，以及藉由ATP增殖分析方法來篩選。根據分析方法資料(表18)，選擇14個推定的GA專一性人類T細胞株，以及在第24天擴展至24井平盤。於第25天添加IL-2。
關於此等細胞株，對GMA：對照(只有APC)起反應之增殖作用的比率是大於3.0。於第32天，此等細胞株以1-2.5 x 105個細胞/mL、於2.5 x 105自體的B-LCL存在下，用10μg/mL GMA予以再刺激，以及藉由增殖分析方法來再篩
選。關於該分析方法，測試用10μg/mL GMA、10μg/mL COP，或1μg/mL破傷風類毒素(作為對照)進行之刺激。測試的所有8個細胞株對GMA和COP有反應性(表19)。
測試該等細胞株中之六者的培養基之細胞介素多重分析方法，確認反應性及揭露IL-13、IL-22、IL-5以及IFN-γ(表20)的產生。
於第33天，將細胞株擴展至T-25燒瓶內(10mL體積加上每mL 10U IL-2)。於第40天，細胞株使用1、3或10μg/mL GMA或COP，或是10μg/mL MBP作為對照，以再次
測試反應性。12細胞株中之11者(F2G以外的全體)對二種抗原製備物都有反應性。結果顯示於表21內。
於起始刺激方面，經單離的PBMC於第0天以配於AIM V培養基內、每井2x 105個細胞(1 x 106個細胞/mL)，加上100μg/mL COP予以平盤培養，以及如同以上所述方法中予以培養。同樣地，PBMC於第0天以配於AIM V培養基內、每井2x 105個細胞，加上100μg/mL GMA用予以平盤培養。培養物係於絲裂黴素處理的自體APC存在下，用各自的抗原(COP或GMA)來刺激，以及於第13天使用BrdU攝取分析方法來篩選增殖作用。測試的該等株中無一者顯示GA專一性之反應性。於添加GA後觀察到細胞顯著地減少，暗示使用較低濃度的GA。GA滴定研究顯示於10及30μg/mL GA的增殖反應及細胞介素反應比100μg/mL GA為更佳。
將第0天配於X VIVO-15培養基內每井1 x 105個細胞，加上10μg/mL COP所平盤培養之PBMC，予以平盤來產生第二集(set)推定的COP-反應性T細胞株。於第3天及第7天每井添加2U的IL-2，以及培養物於第14天藉由拆分井分析方法來篩選增殖作用。該等株用10μg/mL COP、於2x 104個自體的B-LCL作為APC存在下予以再刺激(於第一
次再刺激期間)，以及使用發光ATP分析方法來測量增殖作用。設若於COP刺激之後的增殖作用，對APC對照起反應之增殖作用的比率是大於3.0，則選擇14個井用於擴展(表22)。
於第24天，表22中列舉的該等株中延續的培養物擴展至24井平盤內(2mL/井)，以及於第二次再刺激期間用10μg/mL COP、於5 x 104個自體的B-LCL存在下予以再刺激。於第25天，添加10U/mL的IL-2。於第32天，六個細胞株各者之2-5 x 105個T細胞係用10μg/mL COP或破傷風類
毒素、於5 x 104個自體的B-LCL存在下予以再刺激，用於發光ATP增殖分析方法之確認增殖測試。全體六株都顯示出對COP及GMA二者之反應性(表23)。
於第32天，對應於分析的培養物之延續的培養物進行再刺激，以及於第33天將七個細胞株(165-B6C、165-B10C、165-D11C、165-F6C、165-D3C、165-E3C，及165-F3C)擴展至T-25燒瓶內(總體積10mL，10U/mL IL-2)。其餘的七株留在24井平盤內額外的2天然後擴展至燒瓶內。24井平盤內失去了四個細胞株(165-F4C、165-C9C、165-E9C，及165-F9C)。於第39天，藉由TP增殖分析方法再次測試24井平盤內的三個細胞株(165-D2C、165-C7C，及165-C4C)對三個濃度的COP及GMA之反應性，包括無抗原
及MBP對照(全體均於5 x 104個自體的絲裂黴素處理的B-LCL作為APC的存在下)。所有的三個細胞株對COP及GMA同等地反應(表25)。在第39天第四次再刺激之後，於第40天對應於分析的細胞株之延續的培養物如同以上所述，用IL-2而從24井平盤擴展至T-25燒瓶內。
於培養的第46天測試七個供給者3 COP株。使用3個濃度的COP及GMA來再刺激細胞株，包括如前之無抗原及MBP對照(全體均於5 x 104個自體的B-LCL的存在下)。於3天之後，藉由ATP分析方法來測量增殖作用。結果顯示於以下的表26內。
延續的細胞株於第46天予以再刺激(於細胞株第五次再刺激期間)，以4mL/井的體積(各井含有1 x 106個T細胞，1 x 106個APC、加上10μg/mL COP)擴展至12井平盤。冷凍保存剩餘的細胞。於第47天，使來自12井平盤的各井之細胞培養物擴展至T-75燒瓶內(20mL，10U/mL IL-2)。於第53天藉由擴展至24井平盤內(各井含有5 x 105個T細胞及5 x 105個APC，加上10μg/mL COP)進行第六次再刺激，以及冷凍保存剩餘的細胞。於第54天使來自24井平盤的各井之細胞培養物如前一般擴展至T-75燒瓶內。於第60天藉由擴展至24井平盤內(各井含有5 x 105個T細胞、5 x 105個APC，加上10μg/mL COP)進行第七次再刺激，以及冷凍保
存剩餘的細胞。於第61天，使來自24井平盤的各井之細胞培養物擴展至T-25燒瓶內。在總共7回的再刺激/擴展之後，於第67天收穫此等細胞且冷凍保存。
從具有第二型MHC DRβ1*07，13之正常、健康、21歲大的男性供給者(供給者4)獲得PBMC。PBMC之採集係經由白血球分離術(leukapheresis)、使用ACD作為抗凝血劑，以及藉由Ficoll-Paque梯度離心來分離。
培養物係以配於X-VIVO 15培養基內、每井1 x 105個細胞(每mL 5 x 105個細胞)、加上10μg/mL COP於96井平盤內起始，以及如同方法中所述予以培養。於培養的第3天及第6天添加10U/mL的IL-2。於第13天篩選培養物之增殖作用，其係在使用每井5 x 105個絲裂黴素處理的自體PBMC(每mL為1 x 106個細胞)存在下、用10μg/mL COP再刺激之後，藉由發光ATP分析方法來進行。15個井係根據ATP比率(COP刺激：未刺激的對照)為2或是更大(表27)，而評分為推定反應性的。
由COP起始刺激供給者205所產生的T細胞株205-1F4，於GMA及COP予以再刺激後，在至少2個實驗中顯示出同等地增殖作用。
表28顯示出，於4次再刺激之後，在培養的第50天分析得到的205-1F4對GMA和COP之反應性。該細胞株於自體的B-LCL存在下，使用三個濃度的COP及GMA，包括無抗原對照來再刺激。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。此分析方法中10μg/mL劑量GMA的反應，與COP相比為102.7%。
表29顯示出，於4次再刺激之後，在培養的第58天分析得到的205-1F4對GMA和COP之反應性。該細胞株於自體的B-LCL存在下，使用四個濃度的COP及GMA，包括
無抗原對照來再刺激。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。此分析方法中10μg/mL劑量GMA的反應，與COP相比為98.5%。
細胞株205-1H7及205-1H11於總共6回的刺激(5次再刺激)之後，在培養的第59天進行刺激。株205-1H7及205-1H11對一系列抗原濃度起反應之增殖反應，係藉由發光ATP分析方法來測量。由各培養收集T細胞、清洗，以及以配於100uL體積、每井20,000個細胞添加至平盤內。所有的條件以三重複進行測試。在37℃、6% CO2下孵育4天之後，由各井移除100μL的培養基，以及添加100μL的CellTiterGlo®至各井。結果顯示於表30及31內。
於第23天將陽性井(表27中列舉的細胞株)移轉至24井平盤，以及在絲裂黴素處理的自體PBMC存在下、用10μg/mL COP予以再刺激。第24天添加IL-2。於第31天(於4回再刺激之後)，10株用10μg/mL COP予以再刺激，以由細胞介素的分泌分析方法確認抗原反應性。將配於X-VIVO 15培養基內、2 x 104個細胞/井的T細胞添加於96井平盤內。各株於(2 x 105個細胞/井，亦即，1 x 106個細胞/井)絲裂黴素處理的自體PBMC存在下、分別用10μg/mL GMA及10μg/mL COP予以刺激。於20-24小時之後，收集培養基供細胞介素的分析方法(FlowCytomix多重小珠(bead)分析方法)。上清液係以三重複來測試IL-12 p70、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6、IL-4、IL-5、TNF-α，及TNF-β分泌作用。表32及33顯示導致的細胞介素的分泌剖繪。多數測試的細胞株對GMA與COP二者都起反應而分泌IFN-γ、IL-5，及TNF-α。該等株之間的IL-2、IL-10，及IL-4分泌是多變的。所有的樣本也都分泌IL-8(資料未顯示)。
分析來自二個供給者4細胞株各者的培養基延伸的細胞介素組，其顯示IL-13及IL-22的產生(表33)。
從具有第二型MHC HLA-DRβ1*13，*15：01之正常、健康、49歲大的女性供給者(供給者6)獲得PBMC。PBMC之採集係經由白血球分離術(leukapheresis)、使用ACD作為抗凝血劑，以及藉由Ficoll-Paque梯度離心來分離。
培養物係以配於X-VIVO 15培養基內、每井1 x 105個細胞(每mL 5 x 105個細胞)、加上10μg/mL GMA/001/014(批001)，藉由標準方法來製備的一批GA，於96井平盤內起始。細胞係如同方法中所述予以培養。於培養的第3天及第8天添加10U/mL的IL-2。於第16天藉由發光ATP分析方法來篩選培養物之增殖作用，以及在每井2 x 104個絲裂黴素處理的自體B-LCL(每mL為1 x 105個細胞)存在下、用10μg/mL GMA/001/014(批001)予以再刺激。14個井係根據ATP比率(COP刺激：未刺激的對照)為2或是更大，而評分為推定反應性的。
14個T細胞培養物係於第26天予以再刺激(第二次再刺激)，以及於第28天用10U/ml IL-2予以擴展。於第35天，所有的14個培養物進行再刺激(第三次再刺激)，以及於存在GMA批001、COP、破傷風類毒素，或無抗原對照之下，分析13個培養物之增殖作用。
表34顯示增殖分析方法的結果。
如同以上所述鑑別為GA專一性人類T細胞株，對一系列非正則GA胜肽(表1中列舉的)的反應性進行測試。鑑
別為對非正則GA胜肽會反應的GA專一性T細胞株顯示於以下的表35內。此等細胞株之鑑別係根據，於至少5回GA再刺激/擴展之後，以非正則GA胜肽刺激之後，增殖作用相對於對照至少增高50%。各細胞株先前已經進行測試對GA的反應性至少2次，以及於許多情況中為更多的一者。某些細胞株如所示對GA和非正則胜肽同等地反應。
胜肽026為一種含有酪胺酸、麩胺酸、丙胺酸及離胺酸之變化的GA胜肽，其係藉由GA合成最早的5分鐘期間不給酪胺酸來製造。
測試來自供給者3相供給者4的T細胞株對胜肽026之反應性。如同表35中概述的，至少四個供給者3和二個供給者4的T細胞株顯示出對胜肽026之反應性。一個供給者4的T細胞株對胜肽026顯示出可與用GA刺激之後觀察到的反應性相媲美的反應性。
於培養的第54天，測試七個供給者3 COP T細胞株對胜肽026(溶解於含有20mg/mL甘露糖醇的水中)之反應性。測試的細胞株中之三者(165-B6C、165-D3C、165-F3C，及165-F6C)對026/11抗原有低位準的反應性。剩餘的細胞株對胜肽026沒有顯著的反應性；所有的細胞株對GMA與COP二者都反應良好。表36內顯示以RLU計的資料。
亦測試供給者3 GMA T細胞株165-B5G、165-D8G、165-E7G及165-F5G對胜肽026之反應性，具有陰性結果。於培養的第56天(實施例I中所述)，用各自為0、1、5、10及100μg/mL之COP、GMA及胜肽026來刺激細胞株。
所有的供給者3的細胞株對GMA與COP二者都反應良好，以及GMA與COP的反應是可相媲美的。
測試供給者4 COP T細胞株205-1B4、205-1C4及205-1H5對胜肽026之反應性。亦測試1、5、10及30μg/mL之胜肽GAT 631、GLT及COP。細胞株205-1C4顯示出對胜肽026之反應性，與其對GA的反應性可相媲美的，然而205-1H5顯示最小的反應性，以及205-1B4未顯示反應性(表37)。圖8顯示圖形式的以RLU計之細胞株205-1C4的結果。
供給者4COP細胞株205-1H11對胜肽026、GLT 631、LT 11、GL 14、GT 41S、GAT 631以及GAT 111之反應性。此實驗是在實施例I中所述COP劑量反應實驗同時間，使用相同的細胞和方法來執行。細胞株205-1H11顯示出對30μg/mL抗原之胜肽026的反應性(表38)。
測試供給者4 COP細胞株205-1H3對胜肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA 64，以及GT 41S之反應性。細胞株205-1H3顯示出對1μg/mL抗原之GL 14的反應性(表39)。
測試供給者1、3和4的GA專一性T細胞株對胜肽GLT 631(GLT)，多(Glu-Lys-Tyr；6：3：1)的刺激起反應之增殖作用。一個供給者1的細胞株、三個供給者3的T細胞株和一個供給者4的T細胞株顯示出對GLT的一些反應性。供給者3的T細胞株中的二者對GLT顯示出可與用GA刺激之後觀察到的反應性相媲美的反應性。三個供給者3的T細胞株顯示出對GAT的反應性。
於培養的第56天(實施例I中所述)，於5回刺激之後(包括起始刺激及四回再刺激)，在添加0、3、10及30μg/mL之胜肽GL 14、GLT 631、GAT 111及GAT 631、COP，及GMA之各者之後，於絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，以1 x 105個細胞/mL的T細胞濃度，來分析供給者1 COP T細胞株222-1H12之增殖作用。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。細胞株222-1H12對GLT 631會起反應，以及對其他測試的非正則GA胜肽不會起反應。表40內顯示以RLU計的資料。
於培養的第81天(實施例I中所述)，於總共9回的刺激(包括起始刺激及八回的再刺激)之後，分析供給者3 GMA T細胞株165-B5G及165-E7G之增殖作用。關於該分析方法，於絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，以1 x 105個細胞/mL的T細胞濃度，添加0、1、3、10及30μg/mL之胜肽GAT 631、GLT 631及COP各者。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。二株都對GLT 631反應良好。165-B5G及165-E7G亦對GAT 631起反應。表41-42內顯示以RLU計的資料。
於培養的第50天(實施例I中所述)，於總共6回的刺激之後，分析供給者3 GMA T細胞株165-H11G、165-C5G、165-E9G，及165-F10G之增殖作用。於絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，以1 x 105個細胞/mL的T細胞濃度，用0、1、3、10及30μg/mL之胜肽GAT 631、GLT 631、GAT 111、GMA、COP及STERN之各者(165-F10G是用MBP來刺激而不是STERN)來孵育細胞株。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。細胞株165-H11G對GLT 631及GAT 631會起反應。表43-46內顯示以RLU計的資料。
以下的表47顯示用0、1.25、2.5、5，及10μg/mL的胜肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、GT 11、GL 14、GT 41S，及GMA中各者進行刺激之後，165-F6C的反應性，如同由發光ATP增殖分析方法所證明的。於8回再刺激之後，在絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，以1 x 105個細胞/mL的T細胞濃度，在培養的第76天進行該分析方法。株165-F6C對GL 14會起反應，以及對其他測試的非正則GA胜肽不會起反應。2.5μg/mL抗原之劑量對於GL 14的反應，相對於無抗原對照，達到4.4倍。
供給者3的細胞株165-E3C於個別的實驗中，對GAT 631、GLT 631、GAT 111，或STERN胜肽不會起反應。
供給者4 COP T細胞株205-1H7亦顯示出對胜肽GLT 631具有反應性，以及對GAT 631及GAT 611不具有反
應性。於7次刺激之後分析細胞株之增殖作用。分析方法係藉由在絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，添加0、1、10或30μg/mL之胜肽GLT 631至1 x 105個細胞/mL之T細胞株來進行。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。表48內顯示以RLU計的資料。
測試來自供給者1和供給者3的GA專一性人類T細胞株對胜肽GL 14，多(Glu-Lys 1：4)之反應性。至少一個供給者1的T細胞株和八個供給者3的T細胞株顯示出對低濃度的GL之反應性。供給者3的T細胞株中的二者顯示出可與用低濃度的GA刺激之後觀察到的反應性相媲美的反應性。個別的實驗指示出濃度接近及超過10μg/mL之GL-14會造成細胞死亡(資料未顯示)。
於培養的第56天(實施例I中所述)，於總共6回的刺激之後，分析供給者1 COP T細胞株222-2F12之增殖作用。關於該分析方法，於絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，將0、3、10或30μg/mL之胜肽GL 14、GLT 631、GAT 111
及GAT 631、COP，及GMA之各者添加至1 x 105個細胞/mL的T細胞株。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。細胞株222-2F12對3μg/mL之GL 14會起反應，以及對其他測試的非正則GA胜肽不會起反應。資料顯示於表49中。
供給者3 COP T細胞株165-F3C和165-C4C，在絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，以1 x 105個細胞/mL的T細胞濃度，用0、1、3，及10μg/mL的胜肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、GT 11、GL 14、GT 41S、GA 64、COP，及GMA中各者進行刺激之後，來分析增殖作用。株165-F3C於9次刺激之後，在培養的第77天進行分析。株165-C4C於7次刺激之後，於培養的第66天進行分析。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。此等株對GL 14及LT 11反應良好，以及對測試的其他非正則GA胜肽不會起反應。資料顯示於表50中。
於培養的第55天，於5回再刺激(不包括起始刺激)之後，分析供給者3 GMA T細胞株165-B5G與165-E7G之增殖作用。於絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，將0、1、3，或10μg/mL的胜肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、
GT 11、GL 14、MBP、COP，及GMA添加至2 x 106個細胞/mL濃度的T細胞。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。此等株對GL 14反應良好，以及對測試的其他非正則GA胜肽不會起反應。表51及52內顯示以RLU計的資料。
供給者3 GMA及COP T細胞株165-F10G、165-C5G、165-H11G、165-C7C、165-E9G，及165-F5G係於絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，以1-2 x 105個細胞的T細胞濃度，用0、1、3，及10μg/mL的胜肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、GT 11、GL 14、MBP、COP，及GMA中各者進行刺激之後，分析增殖作用。於至少6次刺激後，最少培養55天後，分析各細胞株的增殖作用。使用發光ATP分析方法。此等株對GL 14反應良好，以及對測試的其他非正則GA胜肽不會起反應，除了165-C5G之外，165-C5G亦對LT11起反應。表53-58內顯示以RLU計的資料。
表59顯示用1、2、5，及10μg/mL的胜肽LT 11及GMA中各者進行刺激之後205-1F4的反應性，如同由發光ATP增殖分析方法所證明的。於7次再刺激之後，於絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，以1 x 105個細胞/mL的T細胞濃度，在培養的第80天進行分析方法。株65-1F4顯示對LT 11的反應性。10μg/mL抗原之劑量對於LT 11的反應，相對於無抗原對照，達到17.3倍。
表60顯示在用0、1、3，及10μg/mL的胜肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、GL 14、GT 41S、GA 64、COP，及GMA中各者進行刺激之後，205-1F4的反應性，如同由發光ATP增殖分析方法所證明的。此分析方法中，對10μg/mL劑量GMA的反應，與COP相比為101.3%。於絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，以1 x 105個細胞/mL的T細胞濃度，於6次再刺激之後，在培養的第71天進行分析方法。株165-1F4顯示出對LT 11的反應，以及對測試的其他非正則GA胜肽不會起反應。10μg/mL抗原之劑量對於LT 11的反應，相對於無抗原對照，達到13.8倍。
供給者1 GMA T細胞株222-AG12於絲裂黴素C處理的自體B-LCL存在下，以2 x 105個細胞的T細胞濃度，用0、1、10，及30μg/mL的胜肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、GT 11、GL 14、COP，及GMA中各者進行刺激之後，分析增殖作用。株222-AG12於3回再刺激之後(總共4回刺激)予以分析。增殖作用係藉由發光ATP分析方法來測量。此株對任一個測試的非正則GA胜肽不會起反應。資料顯示於表61中。
如同方法中所述，在用APC來孵育後，藉由測量增殖作用來測試T細胞株之MHC限制性。使用絲裂黴素處理的自體APC，以及測試APC，例如來自具有與原始的PBMC供給者匹配的至少一個HLA-DR之供給者。結果概述於表62中。以下資料表格內的數值係以RLU計。
供給者3 T細胞株165-B5G之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及6之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL GMA下進行孵育。T細胞株165-B5G已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激六次(不包括起始刺激)。表63和圖9A內顯示的資料指示出，165-B5G受HLA-DRβ1*11限制。
供給者3 T細胞株165-C4G之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及7之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL GMA下進行孵育。T細胞株165-C4G已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激五次(不包括起始刺激)。表64和圖9B內顯示的
資料指示出，165-C4G受HLA-DRβ1*11的限制。
供給者3 T細胞株165-C5G之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及6之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL GMA下進行孵育。T細胞株165-C5G已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激四次(不包括起始刺激)。表65和圖10A內顯示的資料指示出，165-C5G受HLA-DRβ1*1501的限制。
供給者3 T細胞株165-E9G之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及6之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL GMA下進行孵育。T細胞株165-E9G已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激四次(不包括起始刺激)。表66和圖10B內顯示的
資料指示出，165-E9G受HLA-DRβ1*11的限制。
供給者3 T細胞株165-F5G之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及6之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL GMA下進行孵育。T細胞株165-F5G已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激七次(不包括起始刺激)。表67和圖11A內顯示的資料指示出，165-F5G受HLA-DRβ1*11的限制。
供給者3 T細胞株165-F10G之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及7之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL GMA下進行孵育。T細胞株165-F10G已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激五次(不包括起始刺激)。表68和圖11B內顯示的
資料指示出，165-F10G受HLA-DRβ1*1501的限制。
供給者3 T細胞株165-B6C之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及6之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL GMA COP下進行孵育。T細胞株165-B6C已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激六次(不包括起始刺激)。表69和圖12A內顯示的資料指示出，165-E9G受HLA-DRβ1*11的限制。
供給者3 T細胞株165-C7C之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及6之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL COP下進行孵育。T細胞株165-C7C已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激五次(不包括起始刺激)。表70和圖12B內顯示的
資料指示出，165-E9G受HLA-DRβ1*11的限制。
供給者3 T細胞株165-D3C之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及7之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL COP下進行孵育。T細胞株165-D3C已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激六次(不包括起始刺激)。表71和圖13A內顯示的資料指示出，165-D3C受HLA-DRβ1*1501的限制。
供給者3 T細胞株165-F3C之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及7之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL COP下進行孵育。T細胞株165-F3C已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激八次(不包括起始刺激)。表72和圖13B內顯示的資
料指示出，165-F3C受HLA-DRβ1*1的限制。
供給者3 T細胞株165-F6C之增殖作用進行分析，其係使用來自供給者3、5及6之絲裂黴素處理的APC，該APC已經於存在或不存在20μg/mL COP下進行孵育。T細胞株165-F6C已經在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激八次(不包括起始刺激)。表73和圖14A內顯示的資料指示出，165-F6C受HLA-DRβ1*1501的限制。
供給者4 T細胞株205-1D1之增殖作用進行分析，其係使用自體B-LCL，及來自供給者1、2及6之自體B-LCL，其等已經於存在或不存在60μg/mL COP下進行孵育。T細胞株205-1D1在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激5次(不包括起始刺激)。表74內顯示的結果指示
出，205-1D1受HLA-DRβ1*13的限制。
供給者4 T細胞株205-1H7之增殖作用進行分析，其係使用自體B-LCL，及來自供給者1、2及6之自體B-LCL，其等已經於存在或不存在40μg/mL COP下進行孵育。T細胞株205-1H7在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激5次(不包括起始刺激)。表75及圖14B內顯示的結果指示出，205-1H7受HLA-DRβ1*13的限制。
供給者4 T細胞株205-1F4及205-1C4之增殖作用進行分析，其係使用自體B-LCL，及來自供給者1、2及6之自體B-LCL，其等已經於存在或不存在40μg/mL COP下進行孵育。T細胞株205-1F4在進行MHC限制性分析方法之
前，用抗原再刺激7次(不包括起始刺激)。T細胞株205-1F4在進行MHC限制性分析方法之前，用抗原再刺激7次(不包括起始刺激)。表76內顯示的結果指示出，205-1F4受HLA-DRβ1*13的限制。
分析GA專一性T細胞株之CD4和CD8的表面表現。使用一種PE標記的CD8單株抗體及一種FITC標記的CD4單株抗體來偵測。標記一種PE標記的小鼠同型配對的對照IgG1單株抗體及FITC標記的小鼠IgG1單株抗體之細胞，係作為非專一性對照。
在免疫螢光染色方面，T細胞係以每mL 1至5 x 106的細胞濃度，再懸浮於含有2%胎牛血清PBS內。將細胞以每管100uL分布於12 x 75mm聚苯乙烯管中。同型配對的對照單株抗體為標記螢光黃(fluorescein)(FITC)或藻紅素
(phycoerythrin)(PE)之非專一性小鼠IgG1。FITC標記的抗CD4及PE標記的抗CD8係如雞尾酒(cocktail)購自於eBioscience，Inc.(San Diego，CA)。依照製造商建議的體積每管5uL來添加螢光染料標記的單株抗體。用單株抗體來孵育細胞於2-8℃歷時15-30分鐘。每管添加2mL PBS來清洗細胞一次，以及以大約200 x g離心5分鐘。將緩衝液輕輕倒出，以及添加0.5mL的PBS至各管。使用FACScan流式細胞儀及CellQuest軟體來評估染色。根據前方散射光及側向散射光特徵，而從分析排除死細胞。
在GA專一性T細胞株方面165-E9G，99.76%偵測到的細胞觀察為CD4+，以及沒有任何CD8+。在GA專一性T細胞株165-F5G方面，97.46%偵測到的細胞觀察為CD4+，以及1.50%為CD8+。165-E9G及165-F5G之對照的流動圖(flow plot)分別顯示於圖15A及圖16A中，以及165-E9G及165-F5G之CD4/CD8分析分別顯示於圖15B及圖16B中。表77中概述所產生的GA有反應的T細胞株之表面標記表現的結果。
使用表78中列舉的六個GA專一性長期的人類T細胞株組來進行增殖分析方法，以比較使用標準方法來製造的九個GA測試批，GMA/009/14(009)、GMA/010/14(010)、GMA/011/14(011)、GMA/012/14(012)、GMA/013/14(013)、GMA/014/14(014)、GMA/017/14(017)、GMA/018/14
(018)，以及GMA/070/14(070)，與Copaxone參考批。
各個T細胞株係利用以上所述的方法來再刺激，其使用五個濃度的參考抗原(0.5、1、2、2.5及5μg/ml的Copaxone)，相同五個濃度的測試抗原(九個GA測試批)，以及無抗原對照，於5 x 104個絲裂黴素處理的自體B-LCL存在下。於抗原孵育4天之後，使用前述的方法，藉由ATP分析方法來測量增殖作用。結果顯示於表79-88內。
各表的最後一行之百分率係計算如下：
對於測試抗原之增殖反應減去對於對照(無抗原)之增殖反應÷對於參考抗原之增殖反應減去對於對照(無抗原)之增殖反應
GA批009之劑量反應曲線係顯示於圖17A、圖17B、圖18A、圖18B、圖19A，及圖19B內。因而，使用各種具有不同特質的T細胞株，COP及GMA009可引出相媲美的反應，以及從而被認為是免疫同一性的。
使用以上的表78列舉的六個GA專一性長期的人類T細胞株組測試變化的GA批對Copaxone之免疫同一性。
變化的GA批之製造
九個變化的GA批中的各者之製造，係使用變化的莫耳分率之一個或更多個N-羧酸酐(N-carboxy anhydrides)(NCAs)來負責聚合作用，以及加上變化濃度的DEA(範圍由0.01%至0.1%)用來起始聚合反應。在其它方面，所有的批係使用標準方法來製備。表89內提供製備此等批的條件之摘要。
負對照批之分子量和胺基酸比率及各參數規格範圍顯示於表90內。含有粗體的文字之陰影單元格表示數值落在GA規格範圍之外，GA規格範圍顯示於各行的頂端。
起始劑濃度及NCA莫耳分率的條件會影響聚合作用的起始及鏈增長(chain propagation)。負的批及對照之間顯著的差異係以總DEA分析、DEA/COOH分析、加成物分析(adduct analysis)、肽製圖(peptide mapping)、NTS(Edman)，以及完整的HPLC(資料未顯示)來顯示。
Copaxone及負GA批使用GA專一性T細胞株組作比較
使用六個GA專一性T細胞株組(表78)來進行增殖分析方法，以比較負GA批051F、054F、055F、057F、058F、059F及060F(測試批)，與Copaxone(參考批)。利用5個濃度的參考抗原(Copaxone)及測試抗原(負GA批)，包括無抗原對照(於5 x 104絲裂黴素處理的自體B-LCL存在下)來再刺激各個T細胞株。於抗原孵育4天之後，使用前述的方法藉由ATP分析方法來測量增殖作用。結果顯示於表91至107內。
各表的最後一行之百分率係計算如下：對測試抗原之增殖反應減去對於對照(無抗原)之增殖反應÷對參考抗原之增殖反應減去對於對照(無抗原)之增殖反應
一種無性繁殖的GA專一性人類T細胞株分析方法組，代表一系列的MHC限制性及非正則GA胜肽之反應性，被選擇且使用來判定GA製備物之免疫同一性。所有的細胞株係藉由ATP增殖分析方法，以三重複樣本來測試對於1、3，及10μg/mL的GA測試製備物及Copaxone(作為參考標準品)各者之反應性，包括無抗原對照及MBP對照(全部於2 x 105個絲裂黴素處理的自體B-LCL/mL存在下)。關於各細胞株，使用下列公式來計算各濃度的GA測試製備物之平均值RLU，以及與各濃度的GA參考標準品對應的平均值RLU作比較：(對於測試抗原之GA引出的反應減去對於對照相同的反應)÷(對於參考抗原之GA引出的反應減去對於對照的反應)
當此公式於特定的GA濃度產生0.80至1.20(80%至120%)的相對值時，GA測試製備物及GA參考標準品判定
為免疫同一的。因而，該測試及參考標準品GA製備物係基於單一參考品，單一劑量分析，而判定為免疫同一性的。
進一步按GA濃度來繪製平均值RLU的圖，以得到劑量反應曲線及比較的GA測試及參考標準品曲線的斜率。基於單一參考批劑量反應曲線分析，確認GA測試製備物及GA參考標準品為免疫同一性的。
一種無性繁殖的GA專一性人類T細胞株分析方法組，代表一系列的MHC限制性及非正則GA胜肽之反應性，被選擇且使用來判定GA製備物之免疫同一性。所有的細胞株係藉由ATP增殖分析方法，以三重複樣本來測試對於1、3，及10μg/mL的GA測試製備物及多個Copaxone批(作為參考標準品)各者之反應性，包括無抗原對照及MBP對照(全部於2 x 105個絲裂黴素處理的自體B-LCL/mL存在下)。分析方法內含括多個Copaxone參考批，以提供多個資料集，例如來說明批對批的變異。關於各細胞株，計算各濃度的GA測試製備物之平均值RLU，以及與各濃度的GA參考標準品對應的平均值RLU作比較。
按GA濃度來繪製平均值RLU的圖，以得到劑量反應曲線及比較的曲線之斜率。使用多個參考批的資料，來決定參考斜率可以接受的變異。
基於多個參考劑量-反應曲線分析，而確認GA測試製備物及GA參考標準品為免疫同一性的。
一種無性繁殖的GA專一性人類T細胞株分析方法組，代表一系列的MHC限制性及非正則GA胜肽之反應性，被選擇且使用來判定GA製備物之免疫同一性。所有的細胞株係藉由ATP增殖分析方法，以三重複樣本來測試對於1、3，及10μg/mL的GA測試製備物及Copaxone批(作為參考標準品)各者之反應性，包括無抗原對照及MBP對照(全部於2 x 105個絲裂黴素處理的自體B-LCL/mL存在下)。分析方法內含括相同的Copaxone參考批之多個樣本，以提供重複的資料，例如來說明分析方法變異。關於各細胞株，計算各濃度的GA測試製備物之平均值RLU，以及與各濃度的GA參考標準品對應的平均值RLU作比較。
按GA濃度來繪製平均值RLU的圖，以得到劑量反應曲線及比較的曲線之斜率。參考批重複的資料係用來決定參考斜率可以接受的變異。
基於重複的參考劑量反應曲線分析，確認測試GA製備物及GA參考標準品為免疫同一性的。
Claims (60)
- 一種判定格拉默醋酸鹽(GA)測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的方法，該方法包含：比較於適合的APC(抗原呈現細胞)存在下，用至少一數量的該GA測試製備物來刺激至少一個GA專一性人類T細胞株之至少一個GA引出的反應之量度(measurements)，以及於適合的APC存在下，用至少一數量的一個GA參考標準品來刺激該至少一個GA專一性人類T細胞株之至少一個GA引出的反應之量度(measurements)；其中當用至少一數量的該GA測試製備物刺激的至少一個GA專一性人類T細胞株之至少一個GA引出的反應之量度，與用至少一數量的一個GA參考標準品刺激之該至少一個GA專一性人類T細胞株之該至少一個GA引出的反應之量度的比較係落在可以接受的界線內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品係被判定為免疫同一性的。
- 一種包含選擇GA測試製備物的藥學用途之方法，該GA測試製備物依據請求項1之方法被判定與一個GA參考標準品為免疫同一的。
- 如請求項1之方法，其中該至少一個測量的GA引出的反應係選自於增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及其等之組合。
- 如請求項3之方法，其中該至少一個測量的GA引出的反應係反應之生物標記的產生，以及其中該反應之生物標記為細胞介素、趨化介素(chemokine)，或是活化標誌。
- 如請求項3之方法，其中該至少一個測量的GA引出的反應係編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及其中該核酸所編碼的該反應之生物標記為細胞介素、趨化介素，或是活化標誌。
- 如請求項1之方法，其中該GA參考標準品為Copaxone或GMA製備物。
- 如請求項1之方法，其中該至少一個GA專一性人類T細胞株為長期的GA專一性T細胞株。
- 如請求項7之方法，其中該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的(clonal)長期的GA專一性T細胞株。
- 如請求項7之方法，其中該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於判定該GA測試製備物及該GA參考標準品是否為免疫同一性之前，已經維持於培養物內歷時至少大約四週。
- 如請求項9之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株於培養物內之維持，包含在缺乏促分裂原(mitogen)的情況下，用GA和自體的APC反復的再刺激。
- 如請求項10之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於步驟(a)之前，已 經接受至少4次的再刺激。
- 如請求項11之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於步驟(a)之前，已經接受至少8次的再刺激。
- 如請求項1之方法，其包含比較於適合的APC存在下，用一系列至少三個上升量的該GA測試製備物來刺激至少一個GA專一性人類T細胞株之至少一個GA引出的反應之量度(measurements)，及於適合的APC存在下，用一系列至少三個上升量的一個GA參考標準品來刺激該至少一個GA專一性人類T細胞株之至少一個GA引出的反應之量度(measurements)，以及產生該GA測試和該GA參考製備物之劑量反應曲線，其中當該等劑量反應曲線的比較係落在可以接受的界線內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品被判定為免疫同一性的。
- 一種供製備包含GA的藥物產品或藥學組成物之方法，其包含：GA測試製備物係藉由以下方式產生：使經保護的GA與氫溴酸反應以形成三氟乙醯GA，用哌啶水溶液(aqueous piperidine solution)處理該三氟乙醯共聚物-1以形成該GA測試製備物，判定該GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的，其係藉由：a)用適合的抗原呈現細胞(APC)來孵育至少一個GA專一性人類T細胞株的細胞； b)用一數量的該GA測試製備物來刺激步驟(a)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株及該適合的APC之至少一個樣本，以及分別用相同數量的該GA參考標準品來刺激步驟(a)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株及該適合的APC之至少一個樣本；c)測量步驟(b)內用該GA測試製備物刺激的該至少一個樣本的細胞之至少一個GA引出的反應，及測量步驟(b)內用該GA參考標準品刺激的該至少一個樣本的細胞之相同的該至少一個GA引出的反應；以及d)當步驟(c)內獲得的量度比較係落在可以接受的界線內時，判定該GA測試製備物和該GA參考標準品為免疫同一性的；其中設若判定該GA測試製備物對該GA參考標準品有免疫同一性，則使該GA測試製備物混合於該藥物產品或藥學組成物內。
- 如請求項14之方法，其中該至少一個GA專一性人類T細胞株為長期的GA專一性T細胞株。
- 如請求項15之方法，其中該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的(clonal)長期的GA專一性T細胞株。
- 如請求項14之方法，其中該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於判定該GA測試製備物及該GA參考標準品是否為免疫同一性之前，已經維持於培養物內歷時至少大約四週。
- 如請求項17之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株於培養物內之維持，包含在缺乏促分裂原(mitogen)的情況下，用GA和自體的APC反復的再刺激。
- 如請求項15之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於步驟(a)之前，已經接受至少4次的再刺激。
- 如請求項19之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於步驟(a)之前，已經接受至少8次的再刺激。
- 一種供產生及鑑別GA專一性人類T細胞株的方法，該方法包含：a)獲得一個細胞樣本，其中該細胞樣本包含來自人類供給者之T細胞及適合的APC；b)由步驟(a)之該細胞樣本製備培養物，其中該培養物包含GA；c)用IL-2孵育步驟(b)之該培養物；d)分析步驟(c)之該培養物，其係藉由製備至少一個測試培養物，其包含來自步驟(c)之該培養物的細胞、適合的APC，及一數量的GA測試製備物，製備來自步驟(c)之該培養物之至少一個對照培養物，以及(i)測量該至少一個測試培養物之至少一個GA引出的反應；(ii)測量該對照培養物相同的該至少一個GA引出的反應；以及e)比較步驟(d)(i)的量度和步驟(d)(ii)的量度； 其中該產生的GA專一性人類T細胞株係基於步驟(d)(i)內測量的該至少一個GA引出的反應，相對於步驟(d)(ii)內測量的該至少一個GA引出的反應，之增高落在可以接受的界線內來鑑別；以及f)選擇性地擴展該培養物，以及使用該擴展的培養物來重複步驟(d)及(e)，以進一步特徵化該經鑑別的GA專一性人類T細胞株。
- 如請求項21之方法，其中該至少一個測量的GA引出的反應係選自於增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及其等之組合。
- 如請求項22之方法，其中該至少一個測量的GA引出的反應為反應之生物標記的產生，以及其中該反應之生物標記為細胞介素、活化標誌，或是趨化介素。
- 一種長期的GA專一性人類T細胞株，其係依據請求項21之方法而獲得。
- 如請求項21之方法，其中步驟(b)或(c)的該培養物沒有添加促分裂原(mitogen)。
- 如請求項21之方法，其進一步包含特徵化該經鑑別的GA專一性人類T細胞株，其中該特徵化包含下列中的一者或多者：a)確認或再確認該經鑑別的GA專一性人類T細胞株之GA專一性；b)判定該經鑑別的GA專一性人類T細胞株之MHC限制性； c)判定該經鑑別的GA專一性人類T細胞株之反應之生物標記的剖繪(profile)；以及d)判定該經鑑別的GA專一性人類T細胞株對至少一個非正則(non-canonical)GA胜肽的反應性。
- 如請求項21之方法，其進一步包含特徵化該經鑑別的GA專一性人類T細胞株對非正則GA胜肽的反應，其中該特徵化包含：製備至少一個測試培養物，其包含該經鑑別的GA專一性人類T細胞株的細胞、適合的APC，及非正則GA胜肽；製備至少一個對照培養物，其包含該經鑑別的GA專一性人類T細胞株的細胞；測量該至少一個測試培養物之至少一個GA引出的反應；測量該對照培養物相同的該至少一個GA引出的反應；以及比較該測試培養物和該對照培養物之該GA引出的反應的量度；其中根據該測試培養物相對於該對照培養物之該至少一個GA引出的反應之增高是在可以接受的界線內，則鑑別出對該非正則GA胜肽的刺激會起反應之該GA專一性人類T細胞株。
- 如請求項21之方法，其進一步包含選殖(cloning)該經鑑別的GA專一性T細胞株。
- 一種長期的GA專一性人類T細胞株，其中該長期的GA專一性人類T細胞株對於GA測試製備物之刺激能夠產生的至少一個測量的反應，相對於對於對照抗原之刺激相同的該至少一個測量的反應而言是增高的，該至少一個測量的反應包含增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，或是其等之組合。
- 如請求項28之長期的GA專一性人類T細胞株，其中該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的(clonal)長期的GA專一性T細胞株。
- 一種至少二個GA專一性人類T細胞株之分析方法組(assay panel)，供用於判定GA測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的，其中該分析方法組包含下列GA專一性人類T細胞株：a)一GA專一性人類T細胞株，其係藉由在第一GA製備物存在下，培養人類T細胞而產生；b)一GA專一性人類T細胞株，其係藉由在第二GA製備物存在下，培養人類T細胞而產生。
- 如請求項31之分析方法組，其包含或進一步包含下列之一者或多者：c)對至少一個非正則GA胜肽不會反應的GA專一性人類T細胞株；以及d)對至少一個非正則GA胜肽會反應的GA專一性人類T細胞株，其中(c)之該非正則GA胜肽與(d)之該非正則GA胜 肽是相同的或相異的。
- 如請求項32之分析方法組，其中(c)之該非正則GA胜肽係由和Copaxone®內之胺基酸酪胺酸(Y)、麩胺酸(E)、丙胺酸(A)，及離胺酸(K)的比率，不相同的莫耳比率(molar ratio)之胺基酸酪胺酸(Y)、麩胺酸(E)、丙胺酸(A)，及離胺酸(K)所組成。
- 如請求項33之分析方法組，其中(c)之該非正則GA胜肽係由胺基酸酪胺酸(Y)、麩胺酸(E)、丙胺酸(A)，及離胺酸(K)中的任何一者、二者或三者所組成。
- 如請求項34之分析方法組，其包含或進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有第一個已知的GA反應之生物標記的剖繪，以及包含或進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有不同於該第一個已知的GA反應之生物標記的剖繪之第二個已知的GA反應之生物標記的剖繪。
- 如請求項35之分析方法組，其包含或進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有第一個已知的MHC限制性，以及包含或進一步包含至少一個GA專一性人類T細胞株，其具有不同於該第一個已知的MHC限制性之第二個已知的MHC限制性。
- 如請求項31之分析方法組，其包含選自於下列群組之各者的至少一個GA專一性人類T細胞株係：a)222-AG11、222-AG12、222-BA11、222-BC11、165-B2G、165-B5G、165-C4G、165-C5G、165-C8G、 165-D8G、165-E7G、165-E9G、165-F10G、165-F5G、165-F8G、165-H11G、222-1C5；以及b)222-1H12、222-2B8、222-2C3、222-2D8、222-2E1、222-2F12、222-1G8、222-2G12、165-B6C、165-B10C、165-C4C、165-C7C、165-D2C、165-D3C、165-D11C、165-E3C、165-F3C、165-F6C、165-F9C、205-1B4、205-1B7、205-1C4、205-1D1、205-1E1、205-1F2、205-1F4、205-1H3、205-1H5、205-1H7、205-1H9、205-1H11。
- 如請求項31之分析方法組，其包含GA專一性人類T細胞株222-2D8、222-2F12、165-F3C、165-F6C、205-1C4，以及205-1F4。
- 如請求項31之方法，其中該至少一個GA專一性人類T細胞株為長期的T細胞株。
- 如請求項32之方法，其中該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的(clonal)長期的GA專一性T細胞株。
- 如請求項31之方法，其中該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於判定該GA測試製備物及該GA參考標準品是否為免疫同一性之前，已經維持於培養物內歷時至少大約四週。
- 如請求項41之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株於培養物內之維持，包含在缺乏促分裂原(mitogen)的情況下，用GA和自體的 APC反復的再刺激。
- 如請求項42之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於步驟(a)之前，已經接受至少4次的再刺激。
- 如請求項43之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於步驟(a)之前，已經接受至少8次的再刺激。
- 如請求項31之分析方法組，其中(a)及(b)之各個GA專一性人類T細胞株包含超過98%的CD4+細胞。
- 如請求項31之分析方法組，其中(a)及(b)之各個GA專一性人類T細胞株包含少於2%的CD8+細胞。
- 一種使用請求項105之分析方法組來判定格拉默醋酸鹽(GA)測試製備物和GA參考標準品是否為免疫同一性的方法，該方法包含：1)用適合的APC來孵育該分析方法組內各個GA專一性人類T細胞株的細胞；2)用一數量的該GA測試製備物，來刺激步驟(1)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株之各者預定數目的細胞；3)用相同數量的該GA參考標準品，來分別刺激步驟(1)內經孵育的該GA專一性人類T細胞株之各者相同預定數目的細胞；4)測量步驟(2)和(3)內經刺激的該GA專一性人類T細胞株之各者的至少一個GA引出的反應；以及 5)比較用該GA測試製備物刺激的各個該GA專一性人類T細胞株獲得的該至少一個GA引出的反應之量度(measurement)，及用該GA參考標準品刺激之相同的該GA專一性人類T細胞株獲得的該至少一個GA引出的反應之量度；其中當步驟(5)內的量度比較落在可以接受的界線內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品被判定為免疫同一性的。
- 一種包含選擇GA測試製備物的藥學用途之方法，該GA測試製備物與GA參考標準品具有免疫同一性，其中該免疫同一性係依據請求項47之方法來判定。
- 如請求項48之方法，其中該至少一個測量的GA引出的反應係選自於增殖、反應之生物標記的產生、編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及其等之組合。
- 如請求項49之方法，其中該至少一個測量的GA引出的反應為反應之生物標記的產生，以及其中該反應之生物標記為細胞介素、活化標誌，或是趨化介素。
- 如請求項49之方法，其中該至少一個測量的GA引出的反應係編碼反應之生物標記的核酸之表現，以及其中該核酸所編碼的該反應之生物標記為細胞介素、活化標誌，或是趨化介素。
- 如請求項47之方法，其中該GA參考標準品為Copaxone或GMA製備物。
- 如請求項47之方法，其中該至少一個GA專一性人類T細 胞株為長期的T細胞株。
- 如請求項53之方法，其中該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株為無性繁殖的(clonal)長期的T細胞株。
- 如請求項53之方法，其中該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於判定該GA測試製備物及該GA參考標準品是否為免疫同一性之前，已經維持於培養物內歷時至少大約四週。
- 如請求項55之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株於培養物內之維持，包含在缺乏促分裂原(mitogen)的情況下，用GA和自體的APC反復的再刺激。
- 如請求項56之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於步驟(a)之前，已經接受至少4次的再刺激。
- 如請求項57之方法，其中步驟(a)內經孵育的該至少一個長期的GA專一性人類T細胞株在其用於步驟(a)之前，已經接受至少8次的再刺激。
- 如請求項47之方法，其中步驟(2)包含用一系列上升數量的(an escalating series of amounts)該GA測試製備物中的一者來刺激至少三個樣本之各者，該至少三個樣本包含該至少一個GA專一性人類T細胞株預定數目的細胞，以及用相同該系列上升數量的該GA參考標準品中的一者來刺激至少三個樣本之各者，該至少三個樣本包含該至少一個GA專一性人類T細胞株預定數目的細胞。
- 如請求項59之方法，其中步驟5)進一步包含產生該GA測試和該GA參考製備物之劑量反應曲線，以及其中當該等劑量反應曲線的比較落在可以接受的界線內時，該GA測試製備物和該GA參考標準品被判定為免疫同一性的。
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