JP2016533728A

JP2016533728A - 酢酸グラチラマー製品の免疫学的同一性を評価するためのヒトｔ細胞株アッセイ

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Publication number: JP2016533728A
Application number: JP2016525919A
Authority: JP
Inventors: ジェフリー・ピー・スミス; ピーター・イー・リプスキー; アン・ロッジ
Original assignee: Mylan Inc
Current assignee: Mylan Inc
Priority date: 2013-10-24
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2016-11-04
Also published as: AU2014340010B2; AU2014340010A1; TW201606305A; CN105917001A; EP3060684A2; US10663457B2; CN105917001B; US20150141284A1; WO2015061610A3; EP3060684A4; JP2021019593A; AR098194A1; CA2928084A1; TWI717314B; US9995734B2; US20180202995A1; WO2015061610A2

Abstract

本発明は、医薬の分野に関する。本発明は、酢酸グラチマー特異的なヒトＴ細胞株を作製する方法および、これらのＴ細胞株を、酢酸グラチラマー製品間の免疫学的同一性を示すために用いるアッセイを提供する。これらのアッセイは、酢酸グラチラマー製品の高感度かつ正確な比較を可能にするものであり、ロットリリースアッセイとして有用であることが見出されている。

Description

相互引用
本出願は、２０１３年１０月２４に出願された米国仮特許出願第６１/８９５３７０号に対する優先権を主張し、該出願は、その全体が引用により本明細書に包含される。

酢酸グラチラマーは、多発性硬化症の処置について承認されている合成ペプチド薬である。酢酸グラチラマーは、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リジンのアミノ酸を含む合成ポリペプチドの酢酸塩からなる。現在Copaxone（登録商標）として販売されている酢酸グラチラマー注射剤は、最初の臨床エピソードを経験し、ＭＲＩの所見が多発性硬化症と一致する患者を含む、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）の患者における、再発の頻度を低下させることが示されている。

酢酸グラチラマーは、多発性硬化症の病態形成の原因となる免疫プロセスを調節することにより、該疾患において作用すると考えられている。具体的には、多発性硬化症におけるCopaxone（登録商標）の作用機序は、少なくとも部分的に、Ｔ細胞活性の免疫調節を介するものであると考えられている。

医薬として使用するための薬剤ロット間の一貫性を維持するために、酢酸グラチラマーの製造において、酢酸グラチマー製品と酢酸グラチラマーの標準品ロットとの免疫学的同一性および／または効力の同等性を証明するために試験する、信頼性の高い、対費用効果の高いアッセイが必要とされている。

本発明は、異なるＧＡ製品に対して同様に応答するが、非標準ＧＡペプチドに対する応答性が異なり、異なるＭＨＣ拘束エレメントを有し、ＧＡによる刺激に対して異なるサイトカインを産生する酢酸グラチラマー (ＧＡ) 特異的なヒトＴ細胞株を作製および特定する方法の発見に基づく。本発明は、異なるＧＡエピトープを認識するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を得る方法および、ＧＡ製品が免疫学的に同一であるかどうかを決定するために、これらのＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を使用する方法に関する。いくつかの態様において、本発明は、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株または、本明細書に記載の方法を用いて作製したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のパネルを用いて、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定する方法に関する。

本発明はさらに、ＧＡを含む医薬品または医薬組成物の製造方法であって、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定し、該ＧＡ標準品と免疫学的に同一であると決定された場合に、該ＧＡ試験ロットを医薬品に含むことを含む、方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により製造されるＧＡを含む、医薬品に関する。本発明はさらに、本発明の方法において抗原提示細胞として用いるのに適当な、ヒトＢ細胞株に関する。

本発明のアッセイは、従来のＧＡバッチアッセイでは利用可能でない正確性で、ＧＡ製品の免疫学的同一性を示すか、または非同一性を明らかにすることができる。本発明のアッセイは、動物の免疫化を必要としないため、アッセイ間の変動がなく、かつ、動物の犠牲を必要としない。

具体的に、本発明は、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を用いてＧＡの試験品とＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定する方法であって、
ａ) 少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞を、適当な抗原提示細胞(ＡＰＣ)とともにインキュベーションすること;
ｂ) 工程(ａ)でインキュベーションした、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞と、適当なＡＰＣの少なくとも１つの試料を、一定量のＧＡ試験品で刺激し、それとは別に、工程(ａ)でインキュベーションした、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞と適当なＡＰＣの少なくとも１つの試料を同量のＧＡ標準品で刺激すること;
ｃ) 工程(ｂ)で、ＧＡ試験品で刺激した細胞の少なくとも１つの試料の、少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定し、工程(ｂ)で、ＧＡ標準品で刺激した細胞の少なくとも１つの試料の少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答を測定すること; および
ｄ) 工程(ｃ)で得た両測定値を比較すること
を含む方法に関し、ここで、工程(ｄ)で行う測定値の比較が、許容される範囲に収まる場合に、ＧＡの試験品とＧＡ標準品は免疫学的に同一であると決定する。

いくつかの態様において、本発明は、酢酸グラチラマー (ＧＡ)の試験品とＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定する方法であって、
適当なＡＰＣの存在下で、試験品による刺激に対する、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定して第一測定値を得、適当なＡＰＣの存在下で、ＧＡ標準品に対する、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定して第二測定値を得ること; ならびに
第一および第二測定値を比較すること
を含む方法に関し、ここで、該第一および第二測定値の比較が許容される範囲に収まる場合に、該ＧＡ試験品および該ＧＡ標準品は免疫学的に同一であると決定する。

上述の態様において、適当なＡＰＣは、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性であるエプスタイン・バーウイルス形質転換（ＥＢＶ形質転換）ヒトＢ細胞; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する、ＥＢＶ−形質転換ヒトＢ細胞; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性であるＰＢＭＣ; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有するＰＢＭＣ; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性である精製単球; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する精製単球; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性である精製樹状細胞; および、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する精製樹状細胞からなる群から選択される細胞を含んでよい。

本発明はまた、医薬として用いるために、ここに記載する方法にしたがって、ＧＡ標準品と免疫学的に同一であると決定されるＧＡ試験品を選択することを含む方法に関する。

本発明は、許容される範囲が約８０％〜約１２０％または約９０％〜約１１０％である上述の方法に関する。上述の方法の態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は、増殖、応答バイオマーカーの産生、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現およびその組み合わせから選択される。いくつかの態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は、応答バイオマーカーの産生であり、該応答バイオマーカーは、サイトカイン、ケモカインまたは活性化マーカーである。特定の態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)およびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。

本発明は、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性の応答が、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現であり、該核酸にコードされる応答バイオマーカーがサイトカイン、ケモカインまたは活性マーカーである、上述の方法に関する。いくつかの態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。特定の態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。

本発明は、該ＧＡ試験品で刺激した細胞の少なくとも２種のＧＡ誘発性応答を測定し、ＧＡ標準品で刺激した細胞の少なくとも２種の同じＧＡ誘発性応答を測定する、上述の方法に関する。これらの態様において、少なくとも２種のＧＡ誘発性応答は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＩＬ−２をコードする核酸、ＩＬ−４をコードする核酸、ＩＬ−５をコードする核酸、ＩＬ−６をコードする核酸、ＩＬ−１０をコードする核酸、ＩＬ−１３をコードする核酸またはＩＬ−１７をコードする核酸、ＩＬ−２２をコードする核酸、ＩＦＮ−γをコードする核酸、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)をコードする核酸、ＴＮＦ−β (ＬＴ)をコードする核酸、ＴＧＦ−βをコードする核酸、ＩＬ−１ｂをコードする核酸、ＣＤ６９をコードする核酸、ＣＤ２５をコードする核酸、ＣＤ７１をコードする核酸、ＣＤ１３７をコードする核酸、ＣＤ１５４をコードする核酸、ＣＤ２７８をコードする核酸、ＣＤ２７９をコードする核酸、ＨＬＡ−ＤＲをコードする核酸、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８) をコードする核酸、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５) をコードする核酸、ＣＣＬ１をコードする核酸、ＣＸＣＬ４をコードする核酸およびＣＸＣＬ７をコードする核酸の発現から選択してよい。

本発明は、該ＧＡ標準品がCopaxone (ＣＯＰ)またはMylan GA (ＧＭＡ)である、上述の方法に関する。

本発明は、適当なＡＰＣが、ＧＡペプチドを提示することのできる少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントを有する、上述の方法に関する。特定の態様において、ＧＡペプチドを提示することのできる、少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントは、ＤＲ−１、ＤＲ−２、ＤＲ−３、ＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択される。

本発明は、工程(ａ)でインキュベーションした少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が長期性(long-term)Ｔ細胞株である、上述の方法に関する。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、クローナルである。いくつかの態様において、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、刺激より前に少なくとも４週間培養下(in culture)に維持するか、または事前に少なくとも４回再刺激したか、またはその両方である。いくつかの態様において、少なくとも１種の長期ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、事前に少なくとも８回再刺激した。いくつかの態様において、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を培養下に維持することは、分裂促進因子の非存在下で、ＧＡおよび自家性ＡＰＣを用いて反復的に再刺激することを含む。

本発明は、該刺激が、ＡＰＣとともに、またはＡＰＣの存在下でインキュベーションしたＧＡ特異的なヒトＴ細胞の少なくとも３つの試料をそれぞれ、１系列のうちの１つの量(one of a series of amounts)のＧＡ試験品で刺激すること、および、ＡＰＣとともに、またはＡＰＣの存在下でインキュベーションしたＧＡ特異的なヒトＴ細胞の少なくとも３つの試料をそれぞれ同量の１系列のうちの１つの量のＧＡ標準品で刺激することを含む、上述の方法に関する。いくつかの態様において、系列量のＧＡの試験品および系列量のＧＡ標準品は、次第に用量が上昇する、約１ng/mL〜約１mg/mLのＧＡを含む。いくつかの態様において、ＧＡの試験品の系列量およびＧＡ標準品の系列量は、約１μg/mL〜約３０μg/mLの、次第に上昇するＧＡの用量である。

いくつかの態様において、本発明は、ＧＡを含む医薬品または医薬組成物の製造方法であって、
１) 保護された酢酸グラチラマーを臭化水素酸と反応させてトリフルオロアセチルＧＡを形成させ、該トリフルオロアセチルコポリマー−１をピペリジン水溶液で処理してＧＡの試験品を形成させ、該ＧＡ試験品を精製すること;
２) ＧＡ試験品とＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを、
ａ）少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞を適当な抗原提示細胞 (ＡＰＣ)とともにインキュベーションすること;
ｂ）工程（ａ）でインキュベーションした該ＧＡ特異的なヒトＴ細胞と適当なＡＰＣの少なくとも１つの試料を、一定量のＧＡ試験品で刺激し、それとは別に、工程(ａ)でインキュベーションした該ＧＡ特異的なヒトＴ細胞と適当なＡＰＣの少なくとも１つの試料を、同量の該ＧＡ標準品で刺激すること;
ｃ）工程（ｂ）で、該ＧＡ試験品で刺激した細胞の少なくとも１つの試料の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定し、工程（ｂ）で、該ＧＡ標準品で刺激した細胞の少なくとも１つの試料の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定すること; および
ｄ）工程ｃ）で得た測定値を比較すること
によって決定する方法に関し、ここで、工程（ｄ）で行う測定値の比較が、許容される範囲に収まる場合に、ＧＡ試験品とＧＡ標準品は免疫学的に同一であると決定し、ＧＡ標準品と免疫学的に同一であると決定した場合に、該ＧＡ試験品を該医薬品または医薬組成物中に混合する、方法に関する。

これらの態様において、適当なＡＰＣは、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性であるエプスタイン・バーウイルス形質転換（ＥＢＶ形質転換）ヒトＢ細胞; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性であるＰＢＭＣ; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有するＰＢＭＣ; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性である精製単球; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する精製単球; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性である精製樹状細胞; および、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する精製樹状細胞からなる群から選択される細胞を含んでよい。

いくつかの態様において、許容される範囲は、約８０％〜約１２０％または約９０％〜約１１０％である。上述の方法の特定の態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性の応答は、増殖、応答バイオマーカーの産生、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現およびその組み合わせから選択される。いくつかの態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性の応答は、応答バイオマーカーの産生であり、該応答バイオマーカーは、サイトカイン、ケモカインまたは活性化マーカーである。特定の態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)およびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。

いくつかの態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性の応答は、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現であり、該核酸にコードされる該応答バイオマーカーは、サイトカイン、ケモカインまたは活性化マーカーである。いくつかの態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。特定の態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。

いくつかの態様において、該ＧＡ試験品で刺激した細胞の少なくとも２種のＧＡ誘発性応答を測定し、ＧＡ標準品で刺激した細胞の少なくとも２種の同じＧＡ誘発性応答を測定する。これらの態様において、少なくとも２種のＧＡ誘発性応答は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＩＬ−２をコードする核酸、ＩＬ−４をコードする核酸、ＩＬ−５をコードする核酸、ＩＬ−６をコードする核酸、ＩＬ−１０をコードする核酸、ＩＬ−１３をコードする核酸またはＩＬ−１７をコードする核酸、ＩＬ−２２をコードする核酸、ＩＦＮ−γをコードする核酸、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)をコードする核酸、ＴＮＦ−β (ＬＴ)をコードする核酸、ＴＧＦ−βをコードする核酸、ＩＬ−１ｂをコードする核酸、ＣＤ６９をコードする核酸、ＣＤ２５をコードする核酸、ＣＤ７１をコードする核酸、ＣＤ１３７をコードする核酸、ＣＤ１５４をコードする核酸、ＣＤ２７８をコードする核酸、ＣＤ２７９をコードする核酸、ＨＬＡ−ＤＲをコードする核酸、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８) をコードする核酸、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５) をコードする核酸、ＣＣＬ１をコードする核酸、ＣＸＣＬ４をコードする核酸、およびＣＸＣＬ７をコードする核酸の発現から選択してよい。

いくつかの態様において、該ＧＡ標準品はCopaxoneまたはＧＭＡである。

いくつかの態様において、適当なＡＰＣは、ＧＡペプチドを提示することのできる少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントを有する。特定の態様において、ＧＡペプチドを提示することのできる、少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントは、ＤＲ−１、ＤＲ−２、ＤＲ−３、ＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択される。

いくつかの態様において、工程（ａ）でインキュベーションした少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は長期性Ｔ細胞株である。いくつかの態様において、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はクローナルである。いくつかの態様において、少なくとも１種の長期性ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、刺激前に少なくとも４週間培養下に維持したか、または事前に少なくとも４回再刺激したか、またはその両方である。いくつかの態様において、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を事前に少なくとも８回再刺激した。いくつかの態様において、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の培養中の維持は、分裂促進因子の非存在下でＧＡおよび自家性ＡＰＣにより反復的に再刺激することを含む。

いくつかの態様において、該刺激は、ＡＰＣとともに、またはＡＰＣの存在下でインキュベーションしたＧＡ特異的なヒトＴ細胞の少なくとも３つの試料をそれぞれ、１系列のうちの１つの量のＧＡ試験品で刺激すること、および、ＡＰＣとともに、またはＡＰＣの存在下でインキュベーションしたＧＡ特異的なヒトＴ細胞の少なくとも３つの試料をそれぞれ同量の１系列のうちの１つの量のＧＡ標準品で刺激することを含む。いくつかの態様において、該系列量のＧＡ試験品および系列量のＧＡ標準品は、約１ng/mL〜約１mg/mLの、次第に上昇する用量のＧＡを含む。いくつかの態様において、ＧＡの試験品の系列量およびＧＡ標準品の系列量は、約１μg/mL〜約３０μg/mLの、次第に上昇するＧＡの用量である。

本発明はさらに、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を作製および特定する方法であって:
ａ) 細胞試料を得、ここで、該細胞試料は、ヒトドナー由来のＴ細胞および適当なＡＰＣを含み;
ｂ) 工程(ａ)の細胞試料から培養物を調製し、該培養物はＧＡを含み;
ｃ) 工程（ｂ）の培養物をＩＬ−２とともにインキュベーションし;
ｄ)工程(ｃ)の培養物由来の細胞、適当なＡＰＣおよびＧＡ試験品から少なくとも１種の試験培養物を調製し、工程（ｃ）の培養物から少なくとも１種の対照培養物を調製し、(ｉ)少なくとも１種の試験培養物の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定し; (ｉｉ)対照培養物の少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答を測定することによって工程（ｃ）の培養物をアッセイし; そして
ｅ) 工程（ｄ）（ｉ）の測定値を、工程(ｄ)(ｉｉ)の測定値と比較し、ここで、作製したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、工程(ｄ)(ｉｉ)で測定した少なくとも１種のＧＡ誘発性応答と比較した、工程(ｄ)(ｉ)で測定した少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の上昇に基づいて特定されることを含み; さらに
ｆ)該培養物を増殖させ、該増殖培養物を用いて工程（ｄ）および（ｅ）を繰り返し、特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株をさらに特性決定することを含んでいてよい、方法に関する。

これらの態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は、増殖、応答バイオマーカーの産生、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現およびその組み合わせから選択してよい。関連する態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は応答バイオマーカーの産生であり、該応答バイオマーカーは、サイトカイン、活性化マーカーまたはケモカインである。特定の態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。関連する態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は応答バイオマーカーをコードする核酸の発現であり、コードされる応答バイオマーカーは、サイトカイン、活性化マーカーまたはケモカインである。特定の態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。いくつかの態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。

本発明の態様において、工程（ｅ）は、培養Ｔ細胞のＧＡに対する少なくとも２種のＧＡ誘発性応答を測定することを含み、工程（ｆ）は、培養Ｔ細胞の対照抗原に対する、少なくとも２種の同じＧＡ誘発性応答を測定することを含む。関連する態様において、少なくとも２種のＧＡ誘発性応答は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＩＬ−２をコードする核酸、ＩＬ−４をコードする核酸、ＩＬ−５をコードする核酸、ＩＬ−６をコードする核酸、ＩＬ−１０をコードする核酸、ＩＬ−１３をコードする核酸またはＩＬ−１７をコードする核酸、ＩＬ−２１をコードする核酸、ＩＬ−２２をコードする核酸、ＩＦＮ−γをコードする核酸、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ) をコードする核酸、ＴＮＦ−β (ＬＴ) をコードする核酸、ＴＧＦ−βをコードする核酸、ＩＬ−１ｂをコードする核酸、ＣＤ６９をコードする核酸、ＣＤ２５をコードする核酸、ＣＤ７１をコードする核酸、ＣＤ１３７をコードする核酸、ＣＤ１５４をコードする核酸、ＣＤ２７８をコードする核酸、ＣＤ２７９をコードする核酸、ＨＬＡ−ＤＲをコードする核酸、ＩＬ−８(ＣＸＣＬ８) をコードする核酸、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５) をコードする核酸、ＣＣＬ１をコードする核酸、ＣＸＣＬ４をコードする核酸およびＣＸＣＬ７をコードする核酸の発現から選択される。

いくつかの態様において、適当なＡＰＣは自家性細胞である。いくつかの態様において、適当なＡＰＣは自家性ＰＢＭＣである。いくつかの態様において、適当なＡＰＣは、抗有糸分裂剤、例えばマイトマイシンＣで処理した自家性ＰＢＭＣである。いくつかの態様において、適当なＡＰＣは、ＧＡペプチドを提示することのできる少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントを有する。特定の態様において、ＧＡペプチドを提示することのできる、少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントは、ＤＲ−１、ＤＲ−２、ＤＲ−３、ＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択される。

本発明はまた、これらの方法により得られる、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株に関する。いくつかの態様において、作製したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、長期性のＴ細胞株である。いくつかの態様において、作製したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はクローナルである。

本発明のいくつかの態様において、工程（ｂ）または（ｃ）の培養物に、分裂促進因子を添加しない。

いくつかの態様において、該方法はさらに、該ＧＡ特異的と特定したヒトＴ細胞株を特性決定することを含み、ここで、該特性決定は、次の１つ以上を含む:
a) 特定した該ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ特異性の確認または再確認;
b) 特定した該ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＭＨＣ拘束の決定;
c) 特定した該ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の応答バイオマーカープロファイルの決定; および
d) 特定した該ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、少なくとも１種の非標準ＧＡペプチドに対する反応性の決定。

いくつかの態様において、該方法はさらに、非標準ＧＡペプチドに対する、ＧＡ特異的と特定したヒトＴ細胞株の応答を：特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞、適当なＡＰＣおよび非標準ＧＡペプチドを含む試験培養物を少なくとも１つ調製すること;特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む少なくとも１つの対照培養物を調製すること;少なくとも１つの試験培養物の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定すること;該対照培養物の少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答を測定すること; および該試験培養物および対照培養物の測定値を比較すること、によって特性決定することを含み、ここで、非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、試験培養物の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の、対照培養物に対する上昇により特定される。

本発明はまた、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株に関し、ここで、かかる長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、対照抗原による刺激に対して測定した少なくとも１種の応答と比較して上昇した、ＧＡ試験品による刺激に対して測定した少なくとも１種の同じ応答を起こすことができ、少なくとも１種の測定する応答は、増殖、応答バイオマーカーの産生、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現またはその組み合わせを含む。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はクローナルである。

いくつかの態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は、増殖、応答バイオマーカーの産生、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現およびその組み合わせから選択される。いくつかの態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は応答バイオマーカーの産生であり、該応答バイオマーカーはサイトカイン、ケモカインまたは活性化マーカーである。特定の態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)およびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。

いくつかの態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は応答バイオマーカーをコードする核酸の発現であり、該核酸にコードされる応答バイオマーカーは、サイトカイン、ケモカインまたは活性化マーカーである。いくつかの態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。特定の態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。

いくつかの態様において、ＧＡの試験品で刺激した細胞のＧＡ誘発性応答を少なくとも２種測定し、ＧＡ標準品で刺激した細胞の少なくとも２種の同じＧＡ誘発性応答を測定する。これらの態様において、少なくとも２種のＧＡ誘発性応答は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＩＬ−２をコードする核酸、ＩＬ−４をコードする核酸、ＩＬ−５をコードする核酸、ＩＬ−６をコードする核酸、ＩＬ−１０をコードする核酸、ＩＬ−１３をコードする核酸またはＩＬ−１７をコードする核酸、ＩＬ−２２をコードする核酸、ＩＦＮ−γをコードする核酸、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ) をコードする核酸、ＴＮＦ−β (ＬＴ) をコードする核酸、ＴＧＦ−βをコードする核酸、ＩＬ−１ｂをコードする核酸、ＣＤ６９をコードする核酸、ＣＤ２５をコードする核酸、ＣＤ７１をコードする核酸、ＣＤ１３７をコードする核酸、ＣＤ１５４をコードする核酸、ＣＤ２７８をコードする核酸、ＣＤ２７９をコードする核酸、ＨＬＡ−ＤＲをコードする核酸、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８) をコードする核酸、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５) をコードする核酸、ＣＣＬ１をコードする核酸、ＣＸＣＬ４をコードする核酸およびＣＸＣＬ７をコードする核酸の発現から選択してよい。抗原提示細胞を含むＡＰＣ株は、請求項９０記載の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞に、抗原を提示することができる。

いくつかの態様において、該ＡＰＣ株は、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換ヒトＢ細胞; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性のＰＢＭＣ; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有するＰＢＭＣ; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性の精製単球; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する精製単球; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性の精製樹状細胞; およびＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する精製樹状細胞から選択される。

いくつかの態様において、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、少なくとも約４週間培養することにより作製する。いくつかの態様において、かかる長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、ＧＭＡまたはＣＯＰ製品による刺激により作製される。

本発明はまた、ＧＡ試験品とＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかの決定に用いるための、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のアッセイパネルに関し、ここで、該アッセイパネルは、次のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む: ａ) 第一のＧＡ製品の存在下でヒトＴ細胞を培養することにより作製されるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株; ｂ) 第二のＧＡ製品の存在下でヒトＴ細胞を培養することにより作製されるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株; およびｃ) 少なくとも１種の非標準ＧＡペプチドに対して反応性でないＧＡ特異的なヒトＴ細胞株。いくつかの態様において、(ａ)または(ｂ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、(ｃ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株でもある。

いくつかの態様において、（ｃ）の非標準ＧＡペプチドは、Copaxone（登録商標）におけるチロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）およびリジン（Ｋ）のアミノ酸の比率とは異なるモル比の、チロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）およびリジン（Ｋ）のアミノ酸からなる。いくつかの態様において、請求項１０５に記載のアッセイパネルにおける、工程（ｃ）の非標準ＧＡペプチドは、チロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）およびリジン（Ｋ）のうちの任意の１種類、２種類または３種類のアミノ酸からなる。いくつかの態様において、請求項１０５に記載のアッセイパネルは、少なくとも１種の非標準ＧＡペプチドに反応性であるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株をさらに含む。

特定の態様において、本発明は、(ａ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、２２２−ＡＧ１２、２２２−ＢＡ１１、２２２−ＢＣ１１、１６５−Ｂ５Ｇ、１６５−Ｃ４Ｇ、１６５−Ｃ５Ｇ、１６５−Ｃ８Ｇ、１６５−Ｄ８Ｇ、１６５−Ｅ７Ｇ、１６５−Ｅ９Ｇ、１６５−Ｆ１０Ｇ、１６５−Ｆ５Ｇ、１６５−Ｆ８Ｇおよび１６５−Ｈ１１Ｇからなる群から選択され; (ｂ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が２２２−１Ｃ５、２２２−１Ｈ１２、２２２−２Ｂ１１、２２２−２Ｂ８、２２２−２Ｃ１、２２２−２Ｃ３、２２２−２Ｄ２、２２２−２Ｄ８、２２２−２Ｅ１、２２２−１Ｆ８、２２２−２Ｆ１２、２２２−２Ｇ４、２２２−１Ｇ８、２２２−２Ｇ１２、１６５−Ｂ６Ｃ、１６５−Ｂ１０Ｃ、１６５−Ｃ４Ｃ、１６５−Ｃ７Ｃ、１６５−Ｄ２Ｃ、１６５−Ｄ３Ｃ、１６５−Ｄ１１Ｃ、１６５−Ｅ３Ｃ、１６５−Ｆ３Ｃ、１６５−Ｆ６Ｃ、２０５−１Ｂ４、２０５−１Ｂ７、２０５−１Ｃ４、２０５−１Ｄ１、２０５−１Ｅ１、２０５−１Ｆ２、２０５−１Ｆ４、２０５−１Ｈ１、２０５−１Ｈ３、２０５−１Ｈ５、２０５−１Ｈ７、２０５−１Ｈ９および２０５−１Ｈ１１からなる群から選択され; (ｃ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が２２２−ＡＧ１２、１６５−Ｂ５Ｇ、１６５−Ｄ８Ｇ、１６５−Ｅ７Ｇ、１６５−Ｅ９Ｇ、１６５−Ｆ５Ｇ、１６５−Ｆ１０Ｇ、２２２−１Ｈ１２、２２２−２Ｆ１２、１６５−Ｂ１０Ｃ、１６５−Ｃ４Ｃ、１６５−Ｃ７Ｃ、１６５−Ｄ１１Ｃ、１６５−Ｅ３Ｃ、１６５−Ｆ３Ｃ、１６５−Ｆ６Ｃおよび２０５−１Ｈ７からなる群から選択される、上述のアッセイパネルに関する。

いくつかの態様において、(ａ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、２２２−ＡＧ１２、２２２−ＡＧ１２、２２２−ＢＡ１１、２２２−ＢＣ１１、１６５−Ｂ５Ｇ、１６５−Ｃ５Ｇ、１６５−Ｃ８Ｇ、１６５−Ｄ８Ｇ、１６５−Ｅ９Ｇ、１６５−Ｆ１０Ｇ、１６５−Ｆ５Ｇ、１６５−Ｆ８Ｇおよび１６５−Ｈ１１Ｇからなる群から選択され; (ｂ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、２２２−１Ｃ５、２２２−１Ｈ１２、２２２−２Ｂ８、２２２−２Ｃ３、２２２−２Ｅ１、２２２−１Ｆ８、２２２−２Ｆ１２、２２２−２Ｇ４、２２２−１Ｇ８、１６５−Ｃ４Ｃ、１６５−Ｃ７Ｃ、１６５−Ｄ２Ｃ、１６５−Ｄ３Ｃ、２０５−１Ｂ４、２０５−１Ｂ７、２０５−１Ｃ４および２０５−１Ｆ４からなる群から選択され; (ｃ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、２２２−ＡＧ１２、１６５−Ｂ５Ｇ、１６５−Ｄ８Ｇ、１６５−Ｅ７Ｇ、１６５−Ｅ９Ｇ、１６５−Ｆ５Ｇ、１６５−Ｆ１０Ｇ、２２２−１Ｈ１２、２２２−２Ｆ１２、１６５−Ｂ１０Ｃ、１６５−Ｃ４Ｃ、１６５−Ｃ７Ｃ、１６５−Ｄ１１Ｃ、１６５−Ｅ３Ｃ、１６５−Ｆ３Ｃ、１６５−Ｆ６Ｃおよび２０５−１Ｈ７からなる群から選択される。

特定の態様において、(ａ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、１６５−Ｂ５Ｇまたは１６５−Ｄ８Ｇからなる群から選択され; (ｂ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、２２２−１Ｈ１２または２２２−２Ｅ１からなる群から選択され; (ｃ)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は２２２−ＡＧ１２である。

いくつかの態様において、該アッセイパネルは、第一の公知の応答バイオマーカープロファイルを示す、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むかまたはさらに含み、該第一の公知のＧＡ応答バイオマーカープロファイルとは異なる、第二の公知のＧＡ応答バイオマーカープロファイルを示す、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むか、さらに含む。

いくつかの態様において、該アッセイパネルは、第一の公知のＭＨＣ拘束性(restriction)を示す少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むか、またはこれをさらに含み、第一の公知のＭＨＣ拘束性とは異なる第二の公知のＭＨＣ拘束性を示す少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むか、またはこれをさらに含む。実施態様において、該アッセイパネルは、ＧＡペプチドを提示することができるＨＬＡ−ＤＲ制限エレメントを有するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を少なくとも１種含むか、またはさらに含む。いくつかの態様において、第一のＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントは、ＤＲ−１、ＤＲ−２、ＤＲ−３、ＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択され; 第二のＨＬＡ−ＤＲ制限エレメントはＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択される。

いくつかの態様において、該アッセイパネルは、少なくとも１種の、第一の公知のＧＡバイオマーカー応答プロファイルを示すＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むか、またはさらに、少なくとも１種の第二の公知のバイオマーカー応答プロファイルを示すＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、該第一および第二の公知のバイオマーカー応答プロファイルは、それぞれ、少なくとも１種のサイトカイン、少なくとも１種のケモカイン、少なくとも１種の活性化マーカー、少なくとも１種の、サイトカインをコードする核酸、少なくとも１種の、ケモカインをコードする核酸または、少なくとも１種の、活性化マーカーをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、該第一および第二の公知のＧＡバイオマーカー応答プロファイルは、それぞれ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択される少なくとも１種のサイトカインを含む。特定の態様において、該第一および第二の公知のＧＡバイオマーカー応答プロファイルは、それぞれ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーを含む。いくつかの態様において、該第一および第二の公知のＧＡバイオマーカー応答プロファイルは、それぞれ、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインを含む。いくつかの態様において、該第一および第二の公知のＧＡバイオマーカー応答プロファイルはそれぞれ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂからなる群から選択されるサイトカインをコードする核酸を少なくとも１つ含む。いくつかの態様において、該第一および第二の公知のＧＡバイオマーカー応答プロファイルはそれぞれ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーをコードする核酸を少なくとも１つ含む。いくつかの態様において、該第一および第二の公知のＧＡバイオマーカー応答プロファイルはそれぞれ、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインをコードする核酸を少なくとも１つ含む。

いくつかの態様において、該アッセイパネルにおけるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は長期性のＴ細胞株である。いくつかの態様において、該アッセイパネルのＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はクローナルである。関連する態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、少なくとも約４週間培養、および/または少なくとも４回再刺激した。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を少なくとも８回再刺激した。

いくつかの態様において、該非標準ペプチドは、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＬＴ１１、ＧＴ１１、ＧＴ４１、ＧＬ１４およびＧＡ６４から選択される。いくつかの態様において、該非標準ペプチドはペプチド０２６である。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない２〜６種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むか、またはこれらをさらに含み、ここで、各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、異なる非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むかまたはこれらをさらに含み、ここで、２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の１種は、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＬＴ１１、ＧＴ１１、ＧＴ４１、ＧＬ１４、ＧＴ４１ＳおよびＧＡ６４から選択される非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さず、２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のうちの２番目は、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＬＴ１１、ＧＴ１１、ＧＴ４１、ＧＬ１４、ＧＴ４１ＳおよびＧＡ６４から選択される非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない。いくつかの態様において、２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の１種は、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＬＴ１１およびＧＬ１４から選択される非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さず、２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の２番目は、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＬＴ１１およびＧＬ１４から選択される非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない。いくつかの態様において、２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の１種は、ペプチド０２６に対して反応性を示さず、２種のＧＡ特異的なヒト細胞株の２番目は、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＬＴ１１またはＧＬ１４に対して反応性を示さない。

いくつかの態様において、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はＣＤ４^＋である。関連する態様において、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、９８％を超えるＣＤ４^＋細胞を含む。いくつかの態様において、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、９９％を超えるＣＤ４^＋細胞を含む。いくつかの態様において、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はＣＤ８^＋ではない。関連する態様において、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、２％未満のＣＤ８^＋細胞を含む。特定の態様において、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、１％未満のＣＤ８^＋細胞を含む。

本発明は、また、酢酸グラチラマー (ＧＡ)の試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを、アッセイパネルを用いて決定する方法に関し、該方法は、
１)該アッセイパネル中の、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のそれぞれの細胞を適当なＡＰＣとともにインキュベーションすること;
２) 工程（１）でインキュベーションした、事前に決定した数の各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞を一定量のＧＡの試験品で刺激すること;
３) 別に、工程（１）でインキュベーションした、事前に決定した数の各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞を同量のＧＡ標準品で刺激すること;
４)工程（２）および（３）で刺激した、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のそれぞれの少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定すること;および
５)ＧＡ試験品で刺激した各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株について得られた少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値を、ＧＡ標準品で刺激した同じＧＡ特異的なヒトＴ細胞株について得られた少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値と比較すること;
を含み、ここで、
工程（５）の測定値の比較が許容される範囲内に収まるとき、該ＧＡ試験品および該ＧＡ標準品は、免疫学的に同一であると決定する。

いくつかの態様において、適当なＡＰＣは、
ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換ヒトＢ細胞; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性のＰＢＭＣ; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有するＰＢＭＣ; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性の精製単球; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する精製単球; ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性の精製樹状細胞; およびＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する精製樹状細胞；
からなる群から選択される細胞を含んでよい。

いくつかの態様において、許容される範囲は、約８０％〜約１２０％または約９０％〜約１１０％である。上述の方法の態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は、増殖、応答バイオマーカーの産生、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現およびその組み合わせから選択される。いくつかの態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は応答バイオマーカーの産生であり、該応答バイオマーカーはサイトカイン、ケモカインまたは活性化マーカーである。特定の態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)およびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。

いくつかの態様において、測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答は、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現であり、該核酸にコードされる応答バイオマーカーは、サイトカイン、ケモカインまたは活性化マーカーである。いくつかの態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。特定の態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、コードされる応答バイオマーカーは、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。

いくつかの態様において、ＧＡ試験品で刺激した細胞のＧＡ誘発性応答を少なくとも２種測定し、ＧＡ標準品で刺激した細胞の少なくとも２種の同じＧＡ誘発性応答を測定する。これらの態様において、少なくとも２種のＧＡ誘発性応答は、
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＩＬ−２をコードする核酸、ＩＬ−４をコードする核酸、ＩＬ−５をコードする核酸、ＩＬ−６をコードする核酸、ＩＬ−１０をコードする核酸、ＩＬ−１３をコードする核酸またはＩＬ−１７をコードする核酸、ＩＬ−２２をコードする核酸、ＩＦＮ−γをコードする核酸、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ) をコードする核酸、ＴＮＦ−β (ＬＴ) をコードする核酸、ＴＧＦ−βをコードする核酸、ＩＬ−１ｂをコードする核酸、ＣＤ６９をコードする核酸、ＣＤ２５をコードする核酸、ＣＤ７１をコードする核酸、ＣＤ１３７をコードする核酸、ＣＤ１５４をコードする核酸、ＣＤ２７８をコードする核酸、ＣＤ２７９をコードする核酸、ＨＬＡ−ＤＲをコードする核酸、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８) をコードする核酸、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５) をコードする核酸、ＣＣＬ１をコードする核酸、ＣＸＣＬ４をコードする核酸およびＣＸＣＬ７をコードする核酸、
の発現から選択してよい。

いくつかの態様において、適当なＡＰＣは、ＧＡペプチドを提示することができる、少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントを有する。特定の態様において、ＧＡペプチドを提示することのできる、少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントは、ＤＲ−１、ＤＲ−２、ＤＲ−３、ＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択される。

いくつかの態様において、工程（ａ）でインキュベーションする少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、長期性Ｔ細胞株である。いくつかの態様において、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はクローナルである。いくつかの態様において、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、刺激前に少なくとも４週間培養下に維持するか、事前に少なくとも４回再刺激するか、またはその両方を行う。いくつかの態様において、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、事前に、少なくとも８回再刺激する。いくつかの態様において、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の培養中の維持は、分裂促進因子の非存在下における、ＧＡおよび自家性ＡＰＣを用いた反復的な再刺激を含む。

いくつかの態様において、該刺激は、ＡＰＣとともに、またはＡＰＣの存在下でインキュベーションしたＧＡ特異的なヒトＴ細胞の少なくとも３つの試料をそれぞれ、１系列のうちの１つの量のＧＡ試験品で刺激すること、および、ＡＰＣとともに、またはＡＰＣの存在下でインキュベーションしたＧＡ特異的なヒトＴ細胞の少なくとも３つの試料をそれぞれ同量の１系列のうちの１つの量のＧＡ標準品で刺激することを含む。いくつかの態様において、該系列量のＧＡ試験品および系列量のＧＡ標準品は、約１ng/mL〜約１mg/mLの、次第に上昇する用量のＧＡを含む。いくつかの態様において、ＧＡ試験品の系列量およびＧＡ標準品の系列量は、約１μg/mL〜約３０μg/mLの、次第に上昇するＧＡの用量である。

本発明はまた、次の方法により製造した、ＧＡを含有する医薬品または医薬組成物に関する:
１）保護された酢酸グラチマーを臭化水素酸と反応させてトリフルオロアセチルＧＡを形成させ、該トリフルオロアセチルコポリマー-１をピペリジン水溶液で処理してＧＡを形成させ、該ＧＡを精製することによりＧＡ試験品を製造し;
２）ａ)少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞を、適当な抗原提示細胞 (ＡＰＣ)とともにインキュベーションし; ｂ）（ａ）でインキュベーションした少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、事前に決定した数の細胞を含む少なくとも１つの試料を、一定量のＧＡ試験品で刺激し、別に、工程（ａ）でインキュベーションした、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、予め決定した数の細胞を含む、少なくとも１つの試料を、同量のＧＡ標準品で刺激し; ｃ）工程（ｂ）で、ＧＡ試験品で刺激した少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定し、工程（ｂ）で、ＧＡ標準品で刺激した、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答を測定し; さらにｄ）工程（ｂ）でＧＡの試験品により刺激した少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞の少なくとも１つの試料の、少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値を、工程（ｂ）で、ＧＡ標準品で刺激した少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞の少なくとも１つの試料の、少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答の測定値を比較することにより、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定し、ここで、
工程(d)で行う測定値の比較が、許容される範囲に収まる場合に、ＧＡの試験品とＧＡ標準品は免疫学的に同一であると決定し、
該ＧＡ試験品は、ＧＡ標準品と免疫学的に同一であると決定した場合、該医薬品または医薬組成物に添加混合する。

本発明はさらに、
１) 保護された酢酸グラチラマーを臭化水素酸と反応させてトリフルオロアセチルＧＡを形成させ、該トリフルオロアセチルコポリマー−１をピペリジン水溶液で処理してＧＡを形成させ、該ＧＡを精製することにより、ＧＡ試験品を製造し;
２) 請求項１〜２４、２５〜４６または１３９〜１６０に記載の方法を用いて、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定する；
ことを含む方法で製造される医薬品または医薬組成物に関する。

本発明はさらに、本発明のアッセイパネル、該アッセイパネルにおける各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株に適当なＡＰＣおよびＧＡ標準品を含む、キットに関する。

引用による包含
本明細書中で言及する全ての出版物、特許および特許出願は、個々の出版物、特許または特許出願を具体的にかつ個々に引用により包含させるのと同程度に、引用により本明細書に包含させる。

本発明の新規の特徴は、末尾の特許請求の範囲に具体的に記載する通りである。本発明の特徴および利点は、本発明の原理を利用している例示的な態様を示す以下の記載および添付図面を参照することにより、より理解できる。

ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を特定する方法。この図は、本発明の方法にしたがってＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を特定するのに用い得る一連の工程を示す。図２Ａおよび２Ｂ．自家性ＡＰＣによって提示されるＧＭＡに応答した、ＧＭＡ増殖ドナー１Ｔ細胞株ＡＧ１２、ＢＣ１１、ＡＧ１１およびＢＡ１１の増殖。この図は、自家性ＡＰＣの存在下で、０、１、１０または１００μg/mL ＧＭＡ (Mylan Pharmaceuticals, Inc.)とともにインキュベーションした４種類の増殖させたドナー１ＧＭＡＴ細胞株を用いて行った細胞増殖のＡＴＰアッセイの結果を示す。ゼロ対照試料は、ＡＰＣとともに、抗原なしでインキュベーションした。図２Ａ. 自家性ＡＰＣの存在下における、濃度を次第に上昇させたＧＡに対する、ドナー１Ｔ細胞株ＡＧ１２ (濃灰色の棒グラフ)およびＢＣ１１ (薄灰色の棒グラフ)の増殖。図２Ｂ. 自家性ＡＰＣの存在下における、濃度を次第に上昇させたＧＡに対する、ドナー１Ｔ細胞株ＡＧ１１ (濃灰色の棒グラフ) およびＢＡ１１ (薄灰色の棒グラフ)の増殖。図３Ａ〜３Ｃ．自家性ＡＰＣによって提示されるＧＭＡまたはＣＯＰに応答した、ＧＭＡ増殖ドナー１Ｔ細胞株の増殖。この図は、濃度を上昇させたＧＡおよび自家性ＡＰＣとともにインキュベーションした、３種類のドナー１ＧＭＡＴ細胞株を用いて行ったＡＴＰアッセイの結果を示す。図３Ａ. ０、０.３、１、３、１０または３０μg/mL ＧＭＡ (Mylan Pharmaceuticals, Inc.; 濃灰色の棒グラフ)またはCopaxone (Teva Pharmaceuticals USA, Inc.; 薄灰色の棒グラフ)および自家性ＡＰＣとともにインキュベーションしたドナー１Ｔ細胞株ＢＡ１１の増殖。図３Ｂ．０、１、３、もしくは１０μg/mL ＧＭＡ (濃灰色の棒グラフ)またはCopaxone (薄灰色の棒グラフ)および自家性ＡＰＣとともにインキュベーションしたドナー１Ｔ細胞株ＢＣ１１ (薄灰色の棒グラフ)の増殖。図３Ｃ．０、３、１０および３０μg/mL ＧＭＡ (濃灰色の棒グラフ) またはCopaxone (薄灰色の棒グラフ)および、自家性ＡＰＣとともにインキュベーションしたドナー１Ｔ細胞株ＡＧ１２の増殖。図４Ａおよび４Ｂ。ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬによって提示されるＧＭＡまたはＣＯＰに対する、ＧＭＡ増殖ドナー１Ｔ細胞株によるＩＦＮ−γ産生。この図は、自家性ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬの存在下で、ＧＭＡ、ＣＯＰまたは破傷風トキソイドとともにインキュベーションした、２種類のドナー１ＧＭＡ増殖Ｔ細胞株の上清を用いて行ったＩＦＮ−γアッセイの結果を示す。図４Ａ. 自家性ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬ (濃灰色の棒グラフ)または１本のアレルが適合するドナー由来のＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬ (２０６Ｂ−ＬＣＬ; 薄灰色の棒グラフ)のいずれかの存在下で、ドナー１Ｔ細胞株ＡＧ１１より産生されたＩＦＮ−γ。図４Ｂ．自家性ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬ (濃灰色の棒グラフ)または１本のアレルが適合するドナー由来のＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬ (２０６Ｂ−ＬＣＬ; 薄灰色の棒グラフ)のいずれかの存在下で、ドナー１Ｔ細胞株ＡＧ１２より産生されたＩＦＮ−γ。図５Ａ〜５Ｇ．自家性ＡＰＣにより提示されるＧＭＡまたはＣＯＰに対する、７種類のドナー１ＣＯＰ増殖Ｔ細胞株の増殖。この図は、０、１、３または１０μg/mL ＧＭＡ (Mylan Pharmaceuticals, Inc.)および自家性ＡＰＣとともにインキュベーションした４種類のドナー１ＣＯＰＴ細胞株を用いて行ったＡＴＰ増殖アッセイの結果を示す。ゼロ対照試料は、自家性ＡＰＣとともに、抗原なしでインキュベーションした。図５Ａ. ドナー１Ｔ細胞株２Ｄ８の、ＧＭＡ (濃灰色の棒グラフ)またはＣＯＰ (薄灰色の棒グラフ)に応答した増殖。図５Ｂ．ドナー１Ｔ細胞株１Ｈ１２の、ＧＭＡ (濃灰色の棒グラフ)またはＣＯＰ (薄灰色の棒グラフ)に応答した増殖。図５Ｃ．ドナー１Ｔ細胞株２Ｆ１２のＧＭＡ (濃灰色の棒グラフ)またはＣＯＰ (薄灰色の棒グラフ)に応答した増殖。図５Ｄ．ドナー１Ｔ細胞株２Ｂ８のＧＭＡ (濃灰色の棒グラフ)またはＣＯＰ (薄灰色の棒グラフ)に応答した増殖。図５Ｅ．ドナー１Ｔ細胞株１Ｃ５のＧＭＡ (濃灰色の棒グラフ)またはＣＯＰ (薄灰色の棒グラフ)に応答した増殖。図５Ｆ．ドナー１Ｔ細胞株２Ｂ１１のＧＭＡ (濃灰色の棒グラフ)またはＣＯＰ (薄灰色の棒グラフ)に応答した増殖。図５Ｇ．ドナー１Ｔ細胞株２Ｅ１のＧＭＡ (濃灰色の棒グラフ) またはＣＯＰ (薄灰色の棒グラフ)に応答した増殖。図６Ａ〜Ｆ．ドナー１ＣＯＰ増殖T細胞株の、自家性ＡＰＣにより提示されたＧＭＡまたはＣＯＰに応答したサイトカイン分泌。図６Ａ.ドナー１Ｔ細胞株２Ｄ８による、３種類の濃度のＧＭＡのそれぞれに応答したサイトカイン分泌。図６Ｂ．ドナー１Ｔ細胞株２Ｄ８による、３種類の濃度のＧＭＡのそれぞれに応答したサイトカイン分泌。図６Ｃ．ドナー１Ｔ細胞株１Ｈ１２による、３種類の濃度のＧＭＡのそれぞれに応答したサイトカイン分泌。図６Ｄ．ドナー１Ｔ細胞株１Ｈ１２による、３種類の濃度のＣＯＰのそれぞれに応答したサイトカイン分泌。図６Ｅ．ドナー１Ｔ細胞株２Ｆ１２による、３種類の濃度のＧＭＡのそれぞれに応答したサイトカイン分泌。図６Ｆ．ドナー１Ｔ細胞株２Ｆ１２による、３種類の濃度のＣＯＰのそれぞれに応答したサイトカイン分泌。矢印は、各サイトカインデータセットの対照試料分泌レベルの位置を示し、そこから左から右へ向かった方向で自家性ＡＰＣにより提示された１μg/mL ＧＡ、３μg/mL ＧＡ、１０μg/mL ＧＡおよび、対照としてＭＢＰで刺激した細胞の分泌レベルを表す。図７Ａおよび７Ｂ．自家性ＡＰＣの存在下における、ＧＭＡまたはＣＯＰに応答した、ドナー２Ｔ細胞株１Ａ７の増殖およびＩＦＮ−γ産生。図７Ａ. ０、０.１、０.３、１、３、１０、３０または１００μg/mLのＧＭＡによる刺激に応答した、ドナー２Ｔ細胞株１Ａ７の増殖を示す。図７Ｂ．０、０.１、０.３、１、３、１０、３０または１００μg/mLのＧＭＡによる刺激に応答した、ドナー２Ｔ細胞株１Ａ７によるＩＦＮ−γ分泌を示す。各試験において、薄灰色の０μg/mL抗原のバーは、１μg/mL 破傷風トキソイド、自家性ＡＰＣを含み、ＧＡを含まない対照試料を示し、濃灰色の０μg/mL抗原のバーは、自家性ＡＰＣを含み、ＧＡを含まない対照試料を表す。ドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｃ４の、ＣＯＰ、ペプチド０２６、ＧＡＴ６３１、ＧＬＴ６３１に応答した増殖。ドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｃ４の、０、１、１０および３０μg/mLのＣＯＰ、ペプチド０２６、ＧＡＴ６３１およびＧＬＴ６３１に応答した増殖を示す。図９Ａおよび９Ｂ．ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｂ５Ｇおよび１６５−Ｃ４ＧのＨＬＡ−ＤＲ拘束性。図９Ａ. ＣＯＰとともに、または用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または６のマイトマイシン処理したＡＰＣの存在下における、ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｂ５Ｇの増殖。図９Ｂ．ＧＭＡとともにまたは用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または６のマイトマイシン処理したＡＰＣの存在下における、ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｃ４Ｇの増殖。いずれの図においても、白抜きの棒グラフ= 抗原なし; 黒塗りの棒グラフ= ２０μg/mL ＧＡである。図１０Ａおよび１０Ｂ．ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｃ５Ｇおよび１６５−Ｅ９ＧのＨＬＡ−ＤＲ拘束性。図１０Ａ. ＣＯＰとともに、または用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または６のマイトマイシン処理したＡＰＣの存在下における、ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｃ５Ｇの増殖。図１０Ｂ．ＣＯＰとともに、または用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または６のマイトマイシン処理したＡＰＣの存在下における、ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｅ９Ｇの増殖。いずれの図においても、白抜きの棒グラフ= 抗原なし; 黒塗りの棒グラフ= ２０μg/mL ＣＯＰである。図１１Ａおよび１１Ｂ．ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ５Ｇおよび１６５−Ｆ１０ＧのＨＬＡ−ＤＲ拘束性。図１１Ａ. ＣＯＰとともに、または用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または６のマイトマイシン処理したＡＰＣの存在下における、ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ５Ｇの増殖。図１１Ｂ．ＧＭＡとともに、または用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または７のマイトマイシン処理したＡＰＣの存在下における、ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ１０Ｇの増殖。いずれの図においても、白抜きの棒グラフ= 抗原なし; 黒塗りの棒グラフ= ２０μg/mL ＧＡである。図１２Ａおよび１２Ｂ．ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｂ６Ｃおよび１６５−Ｃ７ＣのＨＬＡ−ＤＲ拘束性。図１２Ａ. ＣＯＰとともに、または用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または６のマイトマイシン処理したＡＰＣの存在下における、ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｂ６Ｃの増殖。図１２Ｂ．ＣＯＰとともに、または用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または６のＡＰＣの存在下における、ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｃ７Ｃの増殖。いずれの図においても、白抜きの棒グラフ= 抗原なし; 黒塗りの棒グラフ= ２０μg/mL ＣＯＰである。図１３Ａおよび１３Ｂ．ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｄ３Ｃおよび１６５−Ｆ３ＣのＨＬＡ−ＤＲ拘束性。図１３Ａ. ＧＭＡとともに、または用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または７のマイトマイシン処理したＡＰＣの存在下における、ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｄ３Ｃの増殖。図１３Ｂ．ＣＯＰとともに、または用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または６のＡＰＣの存在下における、ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ３Ｃの増殖。いずれの図においても、白抜きの棒グラフ= 抗原なし; 黒塗りの棒グラフ= ２０μg/mL ＧＡである。図１４Ａおよび１４Ｂ．ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ６Ｃおよび２０５−１Ｈ７のＨＬＡ−ＤＲ拘束性。図１４Ａ. ＣＯＰとともに、またはＣＯＰを用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または７のマイトマイシン処理したＡＰＣの存在下における、刺激後のドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ６Ｃの増殖。図１４Ｂ．ＣＯＰとともに、またはＣＯＰを用いずにインキュベーションした、ドナー３、５または６のマイトマイシン処理したＡＰＣの存在下における、刺激後のドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｈ７の増殖。両方の図において、各対の左側のバー= 抗原なし; 右側のバー= ２０μg/mL ＣＯＰ。図１５Ａおよび１５Ｂ．ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株１６５−Ｅ９ＧのＣＤ４およびＣＤ８発現の、フローサイトメトリーによる特性決定。図１５Ａ. 記載するようにＰＥまたはＦＩＴＣで標識した非特異的対照マウス抗ＩｇＧ１モノクローナル抗体への結合。図１５Ｂ．記載するようにＰＥで標識した抗ＣＤ８モノクローナル抗体およびＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ４モノクローナル抗体への結合。図１６Ａおよび１６Ｂ．ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株１６５−Ｆ５Ｇの、ＣＤ４およびＣＤ８の発現の、フローサイトメトリーによる特性決定。図１６Ａ. 記載するようにＰＥまたはＦＩＴＣで標識した非特異的対照マウス抗ＩｇＧ１モノクローナル抗体への結合。図１６Ｂ．記載するようにＰＥで標識した抗ＣＤ８モノクローナル抗体およびＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ４モノクローナル抗体への結合。図１７Ａおよび１７Ｂ．改変ＧＡロット００９に応答したドナー１Ｔ細胞株の増殖。図１７Ａ.０、１、２、２.５および５μg/mLのＣＯＰおよび改変ＧＡロット００９による刺激に対するドナー１Ｔ細胞株２２２−２Ｄ８の増殖を示す。図１７Ｂ．０、１、２、２.５および５μg/mLのＣＯＰおよび改変ＧＡロット００９に応答したドナー１Ｔ細胞株２２２−２Ｆ１２の増殖。図１８Ａおよび１８Ｂ．改変ＧＡロット００９に対するドナー３Ｔ細胞株の増殖。図１８Ａ. ０、１、２、２.５および５μg/mL ＣＯＰおよび改変ＧＡロット００９による刺激に応答したドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ３Ｃの増殖を示す。図１８Ｂ．０、１、２、２.５および５μg/mLのＣＯＰおよび改変ＧＡロット００９による刺激に応答したドナー１Ｔ細胞株１６５−Ｆ６Ｃの増殖を示す。図１９Ａおよび１９Ｂ．改変ＧＡロット００９に応答したドナー４Ｔ細胞株の増殖。図１９Ａ.０、１、２、２.５および５μg/mLのＣＯＰおよび改変ＧＡロット００９による刺激に応答したドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｃの増殖を示す。図１９Ｂ．０、１、２、２.５および５μg/mLのＣＯＰおよび改変ＧＡロット００９による刺激に応答したドナー１Ｔ細胞株２０５−１Ｃ４の増殖を示す。

Copaxone（登録商標）の多発性硬化症における作用機序は、少なくとも一部には、Ｔ細胞活性の免疫調節を介しており、Ｔ細胞のＧＡに対する免疫学的応答は、ＧＡ製品に存在するエピトープの、特異的かつ高感度な尺度である。個々のＴ細胞は、異なりはするが非常に類似しているペプチドを区別できるという特有の性質を有するため、培養中のＧＡ特異的なヒトＴ細胞のＧＡ誘発性応答を解析することによって、ＧＡ製品間の免疫学的に関連のある差異を識別することができる。この点について、ＧＡ試験品に対するＧＡ特異的なＴ細胞株のＧＡ誘発性の応答が、ＧＡ標準品に対するＧＡ誘発性応答と同等であることは、ＧＡ標準品およびＧＡ試験品が、免疫学的に同一であることを示し得る。本発明は、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、作製、特定および異なるＧＡ製品の免疫学的同一性を試験するために使用し得ることが示されていることに基づく。さらに、ＧＡの異なるエピトープを認識するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を作製し得ることも示されている。結果として、全てではなくても、多数の異なるＧＡエピトープを認識するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を作製、特定し、比較したＧＡ製品が免疫学的に同一であることを高い信頼性で決定することができるアッセイパネルで並行して用いることができる。

酢酸グラチラマー
酢酸グラチラマー (ＧＡ) は、４つの天然起源のアミノ酸：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リジンをそれぞれ、平均モル分率０.１４１、０.４２７、０.０９５および０.３３８で含む、合成ポリペプチドの酢酸塩からなる。ＧＡの平均分子量は５,０００〜９,０００ダルトンである。化学的には、ＧＡは、Ｌ−アラニン、Ｌ−リジンおよびＬ−チロシンを含むＬ−グルタミン酸ポリマーの酢酸塩とされている。酢酸グラチラマーの実験式は、(C_５H_９NO_４・C_３H_７NO_２・C_６H_１４N_２O_２・C_９H_１１NO_３)_x・xC_２H_４O_２ (CAS-１４７２４５-９２-９、Physician’s Desk Reference)である。
本明細書において、「ＧＡ」は、例えば、Mylan Pharmaceuticals, Inc.製の酢酸グラチラマーである「ＧＭＡ」、およびTeva Pharmaceuticals USA, Incにより製造および販売されている酢酸グラチラマーである「ＣＯＰ」、または「Copaxone」を含む酢酸グラチマーを指す。Copaxoneは、再発寛解型多発性硬化症(ＲＲＭＳ)の処置に関して、１９９６年にＦＤＡにより承認された。その組成は、文献、例えば米国特許第３,８４９,５５０号明細書、“Therapeutic copolymer”および米国特許第５,８００,８０８号明細書、“Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers”ならびに、Copaxone（登録商標） (Teva Pharmaceuticals USA, Inc.)の商品ラベルに記載されており、これらはそれぞれ、引用によりその全体が本明細書に包含される。

酢酸グラチラマーの製造
ＧＡは、公知の、公開されている方法により製造し得る。Copaxoneの製造方法は、例えば米国特許第３,８４９,５５０号明細書、“Therapeutic copolymer”および米国特許第５,８００,８０８号明細書、“Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers”に記載されている。米国特許第５,８００,８０８号明細書によれば、子ポリマー-１は、当該分野で公知の方法、例えば米国特許第３,８４９,５５０号明細書に記載の方法により製造してよく、該方法では、チロシン、アラニン、ｙ−グルタミン酸ベンジルおよびＥ−Ｎ−トリフルオロアセチルリジンのＮ−カルボキシ無水物を環境温度、開始剤としてのジエチルアミンを含む無水ジオキサン中で、重合させる。グルタミン酸のｙ−カルボキシル基のデブロックは、氷酢酸中で臭化水素により行い、次いで、１Ｍピペリジンにより、リジン残基からトリフルオロアセチル基を除く。

ＧＡ試験品
本発明の方法の実施態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、ＧＡの試験品または生産製品、ロットまたはバッチに対するＧＡ誘発性の応答を、ＧＡの標準製品の同じＧＡ誘発性応答と比較する。いくつかの態様において、ＧＡの試験品は、試験する所望のＧＡの任意の製品、ロットまたはバッチであってよい。いくつかの態様において、ＧＡの試験品は、新しく製造されたＧＡの製品である。他の態様において、ＧＡの試験品は、新しく製造されたものではなく、例えば該製品の保存安定性の評価のために試験に使用することが予定されているものである。ＧＡ標準品ロットまたはＧＡ標準品は、所望する任意のＧＡの製品、ロットまたはバッチ、例えばＧＭＡまたはＣＯＰであってよい。いくつかの態様において、本発明の方法は、所望に応じて、２つ以上の、試験品または生産製品のＧＡとの比較、互いに対する比較または他の任意のＧＡ製品との比較に使用する。いくつかの態様において、ＧＡ試験品は、ＧＭＡ製品である。いくつかの態様において、該ＧＡ試験品およびＧＡ標準品は、異なるＧＭＡ製品である。いくつかの態様において、複数のＧＡ試験品を、ＧＡ標準品と比較する。いくつかの態様において、比較するＧＡ製品は、例えば、ＧＭＡの製品とＣＯＰの製品、２つのＧＭＡ製品または、他の製造者が製造したＧＡ製品と、ＧＭＡもしくはＣＯＰである。

ＧＡ製品の試験
本発明は、ＧＡ製品の評価に有用なＧＡ特異的なヒトＴ細胞株アッセイに関する。これらのアッセイにより、例えば製造の間、または製造過程におけるその後の変化におけるＧＡ製品の一貫性を保証し得る。いくつかの態様において、本発明の方法は、個別にＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、ＧＡの試験品またはＧＡ標準品で刺激した後、該細胞株の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を比較することによって、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定するのに用いる。本明細書に記載の結果に基づいて、ＧＡの刺激製品の組成の微小な差異を識別することのできるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、作製および特定し得る。ＧＡ特異的なＴ細胞株の刺激に用いるときは、刺激抗原の微小な差異が、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ誘発性応答の、測定できる程度の差異をもたらす。

本発明のアッセイはまた、ＧＡ試験品のＧＡ力価、例えば、ＧＡ標準品と比較したＧＡ試験品の力価を決定するのに有用である。これらの方法は、医薬用途に許容される酢酸グラチマーの製造において、薬物製品間の力価を確実に一致させるのに有用である。

本発明の態様において、少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を、ＧＡ試験品のアッセイで測定し、ＧＡ標準品に対する同一のＧＡ誘発性応答と比較し、所望の相対力価を得る。所望の相対力価は、例えば、ＧＡ試験品への応答の、ＧＡ標準品への応答に対する比率または、部、割合またはパーセンテージで表してよく、測定結果が同等であるとき、該パーセンテージは１００である。

本発明の態様において、製品または試験品におけるＧＡの相対力価は、ＧＡ試験品に対するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の免疫学的応答を表す値を、ＧＡ標準品に対する同じ細胞株の同じ応答を表す値と比較することによって決定する。この力価の決定は、ＧＡ試験品の刺激能を表す。いくつかの態様において、本発明の力価アッセイを、ＧＡ製品が所望の力価を有するかどうかを決定するのに用いる。

ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の作製および同定
図１は、本発明の方法による、ＣＯＰまたはＧＭＡ特異的なヒトＴ細胞株の作製および同定の一般的なスキームを示す。

最初に、細胞試料を正常かつ健常であってＧＡを投薬されていない(ナイーブな)ドナーより得る。ドナーＰＢＭＣを例えば、白血球除去または静脈穿刺により、使用のために採取する。採取した細胞を、０日目に、約５ｘ１０^５〜約１ｘ１０^６個/mLの細胞密度で、一定量の開始ペプチド（ＧＡ製品）で刺激する。いくつかの態様において、採取した細胞を、最初に、約５ｘ１０^５個/mL、約６ｘ１０^５個/mL、約７ｘ１０^５個/mL、約８ｘ１０^５個/mL、約９ｘ１０^５個/mLまたは約１ｘ１０^６個/mLの密度で刺激する。刺激した細胞を培養し、態様によっては、周期的に成長促進物質、例えばＩＬ−２で処理した後、開始ペプチドに対する反応性について一部をスクリーニングする。開始ペプチドに対して反応性を示す細胞株の培養物の残りの部分を、開始ペプチドおよび適当なＡＰＣで再刺激し、成長促進物質を必要に応じて添加する。次いで、ＭＨＣ適合性ＡＰＣの存在下における該細胞の開始ペプチドによる刺激に対する応答を、ＭＨＣ適合性ＡＰＣの存在下における適当な対照、例えば他のＧＡ製品および他の（非関連）抗原、例えば破傷風トキソイドと、本明細書に記載する特異性アッセイを用いて比較することによって、再刺激したＧＡ反応性の細胞株の一部を、抗原特異性についてスクリーニングする。ＧＡに応答するが、非関連抗原には応答しない株を、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株とする。残りの細胞株培養を、例えば細胞株の増殖またはＧＡ特異性の確認または該細胞株のさらなる特性決定のためのアッセイ用に調製するために、開始ペプチドおよび適当なＡＰＣで上述の通り刺激し、必要に応じて、成長促進物質を添加した。特性決定アッセイはさらに、特定したＧＡ応答性ヒトＴ細胞株を、例えばＭＨＣ拘束性、ＧＡ刺激に対する応答バイオマーカー産生または非標準ＧＡペプチドに対する反応性について試験する。

特定の態様において、ＧＡ反応性についてのＴ細胞株のスクリーニングおよびＧＡ特異性についてのスクリーニングを、初回刺激後に、共に行う。これらの態様において、それぞれＭＨＣ適合性のＡＰＣの存在下で、抗原なしの対照および非関連抗原対照の両方を用いることが考えられている。いくつかの態様において、ヒトＴ細胞株のＧＡ特異性についての最初の決定を、該細胞株を再刺激した後に確認する。いくつかの態様において、ＧＡ特異的であると特定したヒトＴ細胞株は、複数回の再刺激後、例えば少なくとも２〜１０回またはそれ以上の再刺激の後にＧＡ特異的であることが示される。いくつかの態様において、特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、再刺激を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、３〜１０回、４〜１０回、５〜１０回、６〜１０回、７〜１０回、８〜１０回、９〜１０回、２〜９回、２〜８回、２〜７回、２〜６回、２〜５回、２〜４回、３〜９回、３〜８回、３〜７回、３〜６回、３〜５回、４〜９回、４〜８回、４〜７回、４〜６回、５〜９回、５〜８回、５〜７回、６〜９回、６〜８回、７〜９回または８〜１０回行った後で、ＧＡ特異性であることが示される。

いくつかの態様において、採取した細胞を、次の細胞密度で再刺激する：１ｘ１０^５〜約１ｘ１０^６個/mL、約１ｘ１０^５個/mL、約１.５ｘ１０^５個/mL、約２ｘ１０^５個/mL、約２.５ｘ１０^５個/mL、約３ｘ１０^５個/mL、約３.５ｘ１０^５個/mL、約４ｘ１０^５個/mL、約４.５ｘ１０^５個/mL、約５ｘ１０^５個/mL、約６ｘ１０^５個/mL、約７ｘ１０^５個/mL、約８ｘ１０^５個/mL、約９ｘ１０^５個/mLまたは約１ｘ１０^６個/mL。

本発明の他の態様において、上述の方法により特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株、例えば非標準ＧＡペプチドに応答するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、ＧＡ製品の免疫学的同一性を決定するための本発明の方法への使用が考えられる。

初回刺激に用いる開始ペプチドは、所望する任意のＧＡ製品であってよく、例えば、ＣＯＰの任意の製品またはＧＭＡの任意の製品であってよく、これらに限定されない。いくつかの態様において、再刺激に用いられるペプチドは、開始ペチドと同じＧＡ製品である。いくつかの態様において、再刺激に用いるペプチドの濃度は、初回刺激に用いるものと同じである。いくつかの態様において、刺激ペプチド（「開始ペプチド」とも称する）または再刺激ペプチドは、約１ng/mL〜約１mg/mLの濃度で投与する。いくつかの態様において、初回刺激または再刺激に用いるペプチドの濃度は約１ng/mL〜約１mg/mL、約１ng/mL〜約５００μg/mL、約１ng/mL〜約１００μg/mL、約１ng/mL〜約５０μg/mL、約１ng/mL〜約１０μg/mL、約１ng/mL〜約１μg/mL、約１ng/mL〜約５００ng/mL、約１ng/mL〜約１００ng/mL、約１００ng/mL〜約１mg/mL、約１００ng/mL〜約５００μg/mL、約１００ng/mL〜約１００μg/mL、約１００ng/mL〜約１０μg/mL、約１００ng/mL〜約１μg/mL、約１００ng/mL〜約５００ng/mL、約５００ng/mL〜約１mg/mL、約５００ng/mL〜約５００μg/mL、約５００ng/mL〜約１００μg/mL、約５００ng/mL〜約１０μg/mL、約５００ng/mL〜約１μg/mL、約１μg/mL〜約１mg/mL、約１μg/mL〜約９００μg/mL、約１μg/mL〜約８００μg/mL、約１μg/mL〜約７００μg/mL、約１μg/mL〜約６００μg/mL、約１μg/mL〜約５００μg/mL、約１μg/mL〜約４００μg/mL、約１μg/mL〜約３００μg/mL、約１μg/mL〜約２００μg/mL、１μg/mL〜約１００μg/mL、１μg/mL〜約９０μg/mL、１μg/mL〜約８０μg/mL、１μg/mL〜約７０μg/mL、１μg/mL〜約６０μg/mL、１μg/mL〜約５０μg/mL、１μg/mL〜約４０μg/mL、１μg/mL〜約３０μg/mL、約１０μg/mL〜約１mg/mL、約１０μg/mL〜約９００μg/mL、約１０μg/mL〜約８００μg/mL、約１０μg/mL〜約７００μg/mL、約１０μg/mL〜約６００μg/mL、約１０μg/mL〜約５００μg/mL、約１０μg/mL〜約４００μg/mL、約１０μg/mL〜約３００μg/mL、約１０μg/mL〜約２００μg/mL、約１０μg/mL〜約１００μg/mL、約１０μg/mL〜約９０μg/mL、約１０μg/mL〜約８０μg/mL、約１０μg/mL〜約７０μg/mL、約１０μg/mL〜約６０μg/mL、約１０μg/mL〜約５０μg/mL、約１０μg/mL〜約４０μg/mL、約１０μg/mL〜約３０μg/mL、約５０μg/mL〜約１mg/mL、約５０μg/mL〜約９００μg/mL、約５０μg/mL〜約８００μg/mL、約５０μg/mL〜約７００μg/mL、約５０μg/mL〜約６００μg/mL、約５０μg/mL〜約５００μg/mL、約５０μg/mL〜約４００μg/mL、約５０μg/mL〜約３００μg/mL、約５０μg/mL〜約２００μg/mL、約５０μg/mL〜約５００μg/mL、約５０μg/mL〜約９０μg/mL、約５０μg/mL〜約８０μg/mL、約５０μg/mL〜約７０μg/mL、約１００μg/mL〜約１mg/mL、約１００μg/mL〜約９００μg/mL、約１００μg/mL〜約８００μg/mL、約１００μg/mL〜約７００μg/mL、約１００μg/mL〜約６００μg/mL、約１００μg/mL〜約５００μg/mL、約１００μg/mL〜約４００μg/mL、約１００μg/mL〜約３００μg/mL、約１００μg/mL〜約２００μg/mL、約１００μg/mL〜約１５０μg/mL、約２００μg/mL〜約１mg/mL、約２００μg/mL〜約９００μg/mL、約２００μg/mL〜約８００μg/mL、約２００μg/mL〜約７００μg/mL、約２００μg/mL〜約６００μg/mL、約２００μg/mL〜約５００μg/mL、約２００μg/mL〜約４００μg/mL、約２００μg/mL〜約３００μg/mL、約２００μg/mL〜約２５０μg/mL、約３００μg/mL〜約１mg/mL、約３００μg/mL〜約９００μg/mL、約３００μg/mL〜約８００μg/mL、約３００μg/mL〜約７００μg/mL、約３００μg/mL〜約６００μg/mL、約３００μg/mL〜約５００μg/mL、約３００μg/mL〜約４００μg/mL、約４００μg/mL〜約１mg/mL、約４００μg/mL〜約９００μg/mL、約４００μg/mL〜約８００μg/mL、約４００μg/mL〜約７００μg/mL、約４００μg/mL〜約６００μg/mL、約４００μg/mL〜約５００μg/mL、約５００μg/mL〜約１mg/mL、約５００μg/mL〜約９００μg/mL、約５００μg/mL〜約８００μg/mL、約５００μg/mL〜約７００μg/mL、約５００μg/mL〜約６００μg/mL、約７５０μg/mL〜約１mg/mL、約７５０μg/mL〜約９００μg/mL、約７５０μg/mL〜約８００μg/mLまたは約８００μg/mL〜約１mg/mLである。

いくつかの態様において、初回刺激は、開始ペプチドを所望の濃度で、約１ｘ１０^５個〜約２ｘ１０^５個の細胞を含む細胞試料に添加することにより行う。いくつかの態様において、該細胞試料の体積は、１００〜２００μlであり、該試料中の細胞密度は約５ｘ１０^５個/mL〜約１ｘ１０^６個/mLである。いくつかの態様において、開始ペプチドを約１μg/mL〜約１００μg/mLの最終ペプチド濃度で、該細胞試料に添加する。

いくつかの態様において、１種以上の成長促進物質を、初回刺激または再刺激の後に、細胞培養または試料に１回以上添加する。いくつかの態様において、該成長促進物質はＩＬ−２である。該成長促進物質は、培養の間、規則的な間隔または不規則な間隔、例えば、細胞の増殖速度によって、必要に応じて、例えば２日〜１０日ごとに添加してよい。いくつかの態様において、成長促進物質を、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、７日ごと、８日ごと、９日ごとまたは１０日ごとに添加する。当業者には公知のことであるが、添加する成長促進物質の適当な量は、該培養物の成長特性、例えば顕微鏡で検査した細胞の健康状態およびｐＨ指示色素で示される培地ｐＨに基づいて決定し得る。いくつかの態様において、細胞培養物１mLあたり約５〜約３０ユニット(Ｕ)のＩＬ−２を添加する。いくつかの態様において、各細胞培養物１mLあたり、約１０、約１５、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約５〜約３０、約５〜約２５、約５〜約２０、約５〜約１５、約５〜約１０、約１０〜約３０、約１０〜約２５、約１０〜約２０、約１０〜約１５、約１５〜約３０、約１５〜約２５、約１５〜約２０、約２０〜約３０、約２０〜約２５、約２５〜約３０、約１７〜約２３、約１８〜約２２または約１９〜約２１ユニットのＩＬ−２を添加する。いくつかの態様において、約２０U/mLのＩＬ−２を、初回刺激の後、３日目および６日目に細胞培養物に添加する。いくつかの態様において、初回刺激の後、３日毎に、約１５〜約２５U/mLのＩＬ−２を細胞培養物に添加する。いくつかの態様において、再刺激の１８時間〜２日後に、該細胞培養物に、約１５〜約２５U/mLのＩＬ−２を添加する。いくつかの態様において、再刺激の１８〜２４時間後に、約２０U/mLのＩＬ−２を、該細胞培養物に添加する。いくつかの態様において、開始ペプチドを、約５ｘ１０^５個/mL〜約１ｘ１０^６個/mLの細胞を含む細胞試料に添加する。いくつかの態様において、開始ペプチドを、細胞試料に、最終ペプチド濃度約１μg/mL〜約１００μg/mLで添加し、ＩＬ−２を、細胞試料に、最終濃度約１５〜約２５U/mLで添加する。いくつかの態様において、開始ペプチドを、約５ｘ１０^５個/mL〜約１ｘ１０^６個/mLの細胞を含む細胞試料に、最終濃度約１μg/mL〜約１００μg/mLで添加し、ＩＬ−２を、該細胞試料に、最終濃度約１５〜約２５U/mLで、初回刺激後、反応性についてのスクリーニングの前に少なくとも２回添加する。いくつかの態様において、開始ペプチドを、約５ｘ１０^５個/mL〜約１ｘ１０^６個/mLの細胞を含む細胞試料に、最終濃度約１μg/mL〜約１００μg/mLで添加し、ＩＬ−２を、初回刺激後３日目および６日目に、最終濃度約１５〜約２５U/mLで添加する。いくつかの態様において、開始ペプチドを、約５ｘ１０^５個/mL〜約１ｘ１０^６個/mLの細胞を含む細胞試料に、最終濃度約１μg/mL〜約１００μg/mLで添加し、ＩＬ−２を、初回刺激後３日ごとに、最終濃度約１５〜約２５U/mLで添加する。

開始ペプチドによる刺激から少なくとも約７〜約１６日後、該細胞株を、開始ペプチドに対する反応性についてスクリーニングする。いくつかの態様において、該細胞株を、０日目に開始ペプチドで初回刺激を与えた後、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、約７日〜約１６日、約８日〜約１４日、約８日〜約１２日、約８日〜約１０日、約１０日〜約１６日、約１０日〜約１４日、約１２日〜約１６日、または約１２日〜約１４日後、または、該培養物が、再刺激なしで健康である限り、開始ペプチドに対する反応性についてスクリーニングを行う。いくつかの態様において、該細胞株を、開始ペプチドおよび適当なＡＰＣによる少なくとも１回の再刺激の後、開始ペプチドに対する反応性についてスクリーニングする。いくつかの態様において、刺激した細胞培養物を、０日目の、開始ペプチドによる最初の刺激の後、再刺激を２〜１０回行った後で、開始ペプチドに対する反応性についてスクリーニングする。したがって、刺激した細胞培養物は、任意のタイミング、例えば、約１４日後よりも後に、開始ペプチドに対する反応性についてスクリーニングしてよい。ただし、当業者が必要であると判断した場合は、該細胞培養物を再刺激する。

該ＧＡ開始ペプチドは、当該分野で公知の方法、例えば水および約２０mg/mL マンニトールまたは培養培地での懸濁によって、該ペプチドを溶液中に懸濁することにより調製し得る。生物アッセイ用のＧＡ製品については、例えば米国特許第７,４２９,３７４号明細書“Process for the measurement of the potency of glatiramer acetate”に記載されており、当該文献は引用により本明細書に包含される。

ＧＡに対する反応性についてのスクリーニング
本明細書中で上述し、図１に示すように、Ｔ細胞培養物を、初回刺激の後にＧＡ反応性についてスクリーニングする。スクリーニングは、ＧＡおよび適当なＡＰＣを含む試験培養物を調製し、該Ｔ細胞培養物の、得られたＧＡ誘発性応答を測定することにより行う。ドナーＰＢＭＣを用いる態様では、該ドナーＰＢＭＣは既に自家性ＡＰＣを含んでいる。本発明の方法に用いるのに適当なＡＰＣは、Ｔ細胞に抗原を提示することができる細胞、例えばＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換ヒトＢ細胞、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性の精製単球、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性の精製樹状細胞、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞に対して自家性のＰＢＭＣ、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する精製単球、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有する精製樹状細胞およびＧＡ特異的なヒトＴ細胞への抗原提示に関連するＤＲ分子を有するＰＢＭＣである。

いくつかの態様において、使用する前にＡＰＣの増殖を、任意の公知の方法、例えばγ照射への暴露または抗有糸分裂剤、例えばマイトマイシンＣへの暴露により阻害する。

いくつかの態様において、Ｔ細胞培養物を、細胞密度約１ｘ１０^５〜約５ｘ１０^５個/mL、約１ｘ１０^５個/mL、約１.５ｘ１０^５個/mL、約２ｘ１０^５個/mL、約２.５ｘ１０^５個/mL、約３ｘ１０^５個/mL、約３.５ｘ１０^５個/mL、約４ｘ１０^５個/mL、約４.５ｘ１０^５個/mLまたは約５ｘ１０^５個/mLで、ＧＡ反応性についてスクリーニングする。

いくつかの態様において、ＡＰＣは、用いるＴ細胞と同等の数〜用いるＴ細胞の２倍の数で存在する。いくつかの態様において、自家性のマイトマイシン処理ＰＢＭＣは、約２.５ｘ１０^５〜約５ｘ１０^６個/mLで存在する。いくつかの態様において、自家性のマイトマイシン処理ＰＢＭＣは、１ｘ１０^６個〜２ｘ１０^６個/mLで存在する。いくつかの態様において、自家性のマイトマイシン処理ＰＢＭＣは２.５ｘ１０^６個/mLで存在する。

いくつかの態様において、自家性のマイトマイシン処理したＢ−ＬＣＬは、約１ｘ１０^５〜１ｘ１０^６個/mLで存在する。いくつかの態様において、自家性マイトマイシン処理Ｂ−ＬＣＬは、約１ｘ１０^５〜５ｘ１０^５個/mLで存在する。いくつかの態様において、自家性マイトマイシン処理Ｂ−ＬＣＬは、約１ｘ１０^５個/mL、約１.５ｘ１０^５個/mL、約２ｘ１０^５個/mL、約２.５ｘ１０^５個/mLまたは約５ｘ１０^５個/mLで存在する。いくつかの態様において、本発明の方法において、スクリーニングまたは特性決定アッセイで用いるＡＰＣの数を、必要に応じて、例えば、陰性対照に対して所望する最低限のレベルにＧＡ誘発性応答を上昇させるように調整する。いくつかの態様において、陰性対照に対する、ＧＡ誘発性応答の所望する最低限のレベルは、下記で述べるように、１.５倍(すなわち、応答が約５０％高い)〜約１０００倍である。

測定したＧＡ誘発性応答を、対照で測定した同じ応答、例えば、抗原（ＧＡ）の非存在下、または陰性対照として用い得る非関連抗原の存在下または非存在下における、適当なＡＰＣを含む培養物中の同一のＴ細胞株の応答と比較する。該スクリーニングの測定値は、好ましいＧＡ誘発性応答についての任意の適当なアッセイ、例えば、非限定的な例としては、増殖アッセイ、該培養物が産生する少なくとも１種のサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカインまたはＴ細胞活性化マーカーの量を測定する応答バイオマーカーアッセイによるものであってよい。いくつかの態様において、ＧＡ誘発性応答は、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現である。ＧＡとともに培養しているＴ細胞で測定したＧＡ誘発性応答と対照培養の比較に基づいて、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を特定する。

いくつかの態様において、ＧＡ反応性または応答性のＴ細胞株を、ＧＡにより刺激した試験培養物中で測定した少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が、抗原なしの対照培養物または非関連抗原を用いた対照培養物において測定した少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答よりも統計学的に大きく上昇していることにより、特定する。いくつかの態様において、ＧＡ反応性または応答性のＴ細胞株は、対照と比較して、試験培養物のＧＡ誘発性応答が次の倍率で上昇することにより特定する：約１.５倍 (すなわち、該応答が約５０％高くなる)〜約１０００倍、約１.５〜約２倍、約１.５〜約３倍、約１.５〜約４倍、約１.５〜約５倍、約１.５〜約６倍、約１.５〜約７倍、約１.５〜約８倍、約１.５〜約９倍、約２〜約３倍、約２〜約４倍、約２〜約５倍、約２〜約６倍、約２〜約７倍、約２〜約８倍、約２〜約９倍、約２〜約１０倍、約３〜約４倍、約３〜約５倍、約３〜約６倍、約３〜約７倍、約３〜約８倍、約３〜約９倍、約３〜約１０倍、約４〜約５倍、約４〜約６倍、約４〜約７倍、約４〜約８倍、約４〜約９倍、約４〜約１０倍、約５〜約６倍、約５〜約７倍、約５〜約８倍、約５〜約９倍、約５〜約１０倍、約６〜約７倍、約６〜約８倍、約６〜約９倍、約６〜約１０倍、約７〜約８倍、約７〜約９倍、約７〜約１０倍、約８〜約９倍、約８〜約１０倍、約１.５倍〜約８０倍、約１.５倍〜約７０倍、約１.５倍〜約６０倍、約１.５倍〜約５０倍、約１.５倍〜約４０倍、約１.５倍〜約３０倍、約１.５倍〜約２０倍、約２倍〜約８０倍、約１.５倍〜約７０倍、約１.５倍〜約６０倍、約１.５倍〜約５０倍、約１.５倍〜約４０倍、約１.５倍〜約３０倍、約１.５倍〜約２０倍、約２倍〜約８０倍、約２倍〜約７０倍、約２倍〜約６０倍、約２倍〜約５０倍、約２倍〜約４０倍、約２倍〜約３０倍、約２倍〜約２０倍、約３倍〜約８０倍、約３倍〜約７０倍、約３倍〜約６０倍、約３倍〜約５０倍、約３倍〜約４０倍、約３倍〜約３０倍、約３倍〜約２０倍、約５倍〜約８０倍、約５倍〜約７０倍、約５倍〜約６０倍、約５倍〜約５０倍、約５倍〜約４０倍、約５倍〜約３０倍、約３倍〜約２０倍、約１０倍〜約８０倍、約１０倍〜約６０倍、約１０倍〜約４０倍または約１０倍〜約２０倍、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２.５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３.５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４.５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍または少なくとも約１０倍。

特定の態様において、Ｔ細胞株のＧＡ反応性または応答性は、ＧＡで刺激した試験培養物の増殖が、抗原なしの対照培養または非関連抗原を用いた対照の増殖に対して、少なくとも５０％上昇することによって特定される。いくつかの態様において、ＧＡ反応性または応答性Ｔ細胞株は、ＧＡにより刺激した試験培養物で測定した２種以上のＧＡ誘発性応答の、抗原を用いていない対照培養または非関連抗原を用いた対照培養で測定した、同じ２種以上のＧＡ誘発性応答と比較した上昇により特定される。いくつかの態様において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＧＡ誘発性応答を測定する。

ＧＡ特異性についてのＴ細胞株のスクリーニング
図１にさらに示すように、ＧＡ反応性のＴ細胞株を、ＧＡ特異性についてスクリーニングする。いくつかの態様において、適当な陰性対照抗原、例えば関連のないタンパク質由来のペプチドに応答しないＴ細胞株をさらにスクリーニングすることによって、ＧＡ特異性についての試験を、ＧＡ反応性アッセイと組み合わせて行う。いくつかの態様において、ＧＡで刺激した試験培養物で測定した少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を、陰性対照抗原を含む培養物で測定した少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答に対する比較により、Ｔ細胞株の特異性を試験する。いくつかの態様において、陰性対照抗原を用いた培養は、陰性対照抗原、例えば破傷風トキソイド、ＭＢＰ、ＣＭＶ、ＰＰＤまたは異質遺伝子型ＭＨＣを含む。

ＧＡ特異性についての、特定したＧＡ反応性Ｔ細胞株の試験は、ＧＡ反応性の確証試験として有用であり得る。いくつかの態様において、ＧＡ反応性を、特異性試験の前に確認する。いくつかの態様において、ＧＡ反応性またはＧＡ特異性を特定したヒトＴ細胞株のＧＡ反応性を、培養間の任意の時点、例えば凍結培養物の融解後に、再確認する。いくつかの態様において、Ｔ細胞株のＧＡ標準品に対する確証試験が陰性である場合、該Ｔ細胞株は、もはやＧＡ特異的または反応性とはみなさず、廃棄してよい。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、（平均）陰性対照ＧＡ誘発性応答よりも統計学的に大きい、ＧＡ刺激に対する応答時に測定した（平均）ＧＡ誘発性応答により特定する。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なＴ細胞株は、ＧＡで刺激した試験培養物で測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の、陰性対照培養物において測定する少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答に対する上昇により特定する。いくつかの態様において、該上昇は、次の通りである：約１.５〜約１０倍 (すなわち、該応答が約５０％高い〜約１０００％高い)、約１.５〜約２倍、約１.５〜約３倍、約１.５〜約４倍、約１.５〜約５倍、約１.５〜約６倍、約１.５〜約７倍、約１.５〜約８倍、約１.５〜約９倍、約２〜約１０倍、約２〜約３倍、約２〜約４倍、約２〜約５倍、約２〜約６倍、約２〜約７倍、約２〜約８倍、約２〜約９倍、約３〜約１０倍、約３〜約４倍、約３〜約５倍、約３〜約６倍、約３〜約７倍、約３〜約８倍、約３〜約９倍、約４〜約１０倍、約４〜約５倍、約４〜約６倍、約４〜約７倍、約４〜約８倍、約４〜約９倍、約５〜約１０倍、約５〜約６倍、約５〜約７倍、約５〜約８倍、約５〜約９倍、約６〜約１０倍、約６〜約７倍、約６〜約８倍、約６〜約９倍、約７〜約１０倍、約７〜約８倍、約７〜約９倍、約８〜約１０倍、約８〜約９倍、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２.５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３.５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４.５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍または少なくとも約１０倍。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、次の式を用いて特定される:

（試験抗原に対するＧＡ誘発性の応答−対照に対する同じ応答）÷（標準抗原に対するＧＡ誘発性応答−対照に対する応答）= ０.８または１.２すなわち、８０％〜１２０％
比較は、これにより、許容される範囲または限度内にある。これらの態様において、Ｔ細胞株は、「単一の標準ロット、単一の用量解析」に基づいてＧＡ特性が決定される。いくつかの態様において、該単一の標準、単一の用量解析の比較値が、１つのＧＡ用量、２つの異なるＧＡ用量、３つの異なるＧＡ用量またはそれ以上において許容される範囲内にあるとき、ヒトＴ細胞株は、ＧＡ特異的であると特定する。

いくつかの態様において、上記の式の分母の値を得るために用いる標準抗原は、Ｔ細胞株の惹起および刺激に用いたものと同じ抗原である。いくつかの態様において、試験抗原での刺激後に観察された、ＧＡ誘発性応答は、細胞株を得るのに用いた抗原での刺激後に観察された値の前後２０％を超えることはない。いくつかの態様において、ヒトＴ細胞株が、行ったアッセイの大多数においてこの基準に合致し、試験したいずれの濃度においても大きく逸脱することがなく、試験抗原および標準抗原の応答値が、曲線の形態において大きく逸脱することがない、類似の用量反応性の曲線を示す場合、該ヒトＴ細胞株はＧＡ特異的であると特定する。

上述の態様において、任意の適当な対照を用いてよく、例えば、抗原対照を用いないか、または非関連抗原対照を用いてよい。

上述の態様において、許容される範囲は、例えば次の通りである：約８０％〜約１２０％、約７５％〜約１２０％、約７５％〜約１１５％、約７５％〜約１１０％、約７５％〜約１０５％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１２５％、約８５％〜約１２５％、約９０％〜約１２５％、約９５％〜約１２５％、約１００％〜約１２５％、約８０％〜約１１８％、約８０％〜約１１５％、約８０％〜約１１２％、約８０％〜約１１０％、約８０％〜約１０８％、約８０％〜約１０５％、約８０％〜約１０２％、約８０％〜約１０１％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８０％〜約９７％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９２％、約８０％〜約９０％、約８２％〜約１２０％、約８２％〜約１１８％、約８２％〜約１１５％、約８２％〜約１１２％、約８２％〜約１１０％、約８２％〜約１０８％、約８２％〜約１０５％、約８２％〜約１０２％、約８２％〜約１０１％、約８２％〜約１００％、約８２％〜約９９％、約８２％〜約９８％、約８２％〜約９７％、約８２％〜約９５％、約８２％〜約９２％、約８２％〜約９０％、約８４％〜約１２０％、約８４％〜約１１８％、約８４％〜約１１５％、約８４％〜約１１２％、約８４％〜約１１０％、約８４％〜約１０８％、約８４％〜約１０５％、約８４％〜約１０２％、約８４％〜約１０１％、約８４％〜約１００％、約８４％〜約９９％、約８４％〜約９８％、約８４％〜約９７％、約８４％〜約９５％、約８４％〜約９２％、約８４％〜約９０％、約８６％〜約１２０％、約８６％〜約１１８％、約８６％〜約１１５％、約８６％〜約１１２％、約８６％〜約１１０％、約８６％〜約１０８％、約８６％〜約１０５％、約８６％〜約１０２％、約８６％〜約１０１％、約８６％〜約１００％、約８６％〜約９９％、約８６％〜約９８％、約８６％〜約９７％、約８６％〜約９５％、約８６％〜約９２％、約８８％〜約１２０％、約８８％〜約１１８％、約８８％〜約１１５％、約８８％〜約１１２％、約８８％〜約１１０％、約８８％〜約１０８％、約８８％〜約１０５％、約８８％〜約１０２％、約８８％〜約１０１％、約８８％〜約１００％、約８８％〜約９９％、約８８％〜約９８％、約８８％〜約９７％、約８８％〜約９５％、約９０％〜約１２０％、約９０％〜約１１８％、約９０％〜約１１５％、約９０％〜約１１２％、約９０％〜約１１０％、約９０％〜約１０８％、約９０％〜約１０５％、約９０％〜約１０２％、約９０％〜約１０１％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％、約９２％〜約１２０％、約９２％〜約１１８％、約９２％〜約１１５％、約９２％〜約１１２％、約９２％〜約１１０％、約９２％〜約１０８％、約９２％〜約１０５％、約９２％〜約１０２％、約９２％〜約１０１％、約９２％〜約１００％、約９２％〜約９９％、約９２％〜約９８％、約９５％〜約１２０％、約９５％〜約１１８％、約９５％〜約１１５％、約９５％〜約１１２％、約９５％〜約１１０％、約９５％〜約１０８％、約９５％〜約１０５％、約９５％〜約１０２％、約９５％〜約１０１％、約９５％〜約１００％、約９７％〜約１２０％、約９７％〜約１１８％、約９７％〜約１１５％、約９７％〜約１１２％、約９７％〜約１１０％、約９７％〜約１０８％、約９７％〜約１０５％、約９７％〜約１０２％、約９８％〜約１２０％、約９８％〜約１１８％、約９８％〜約１１５％、約９８％〜約１１２％、約９８％〜約１１０％、約９８％〜約１０８％、約９８％〜約１０５％、約９９％〜約１２０％、約９９％〜約１１８％、約９９％〜約１１５％、約９９％〜約１１２％、約９９％〜約１１０％、約９９％〜約１０８％、約９９％〜約１０５％、約１００％〜約１２０％、約１００％〜約１１８％、約１００％〜約１１５％、約１００％〜約１１２％、約１００％〜約１１０％、約１００％〜約１０８％、約１００％〜約１０５％、約１０１％〜約１２０％、約１０１％〜約１１８％、約１０１％〜約１１５％、約１０１％〜約１１２％、約１０１％〜約１１０％、約１０１％〜約１０８％、約１０２％〜約１２０％、約１０２％〜約１１８％、約１０２％〜約１１５％、約１０２％〜約１１２％、約１０２％〜約１１０％、約１０２％〜約１０８％、約１０５％〜約１２０％、約１０５％〜約１１８％、約１０５％〜約１１５％、約１０５％〜約１１２％、約１０５％〜約１１０％、約１１０％〜約１２０％、約１１０％〜約１１８％または約１１０％〜約１１５％。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なＴ細胞株を、ＧＡで刺激した試験培養物で測定する少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種またはそれ以上の、異なるＧＡ誘発性応答の、陰性対照培養における同じＧＡ誘発性応答に対する上昇によって特定する。

いくつかの態様において、異なるＧＡ用量で測定されるＧＡ誘発性応答を、用量反応曲線の作成に用い、試験ＧＡロットを用いて得た用量反応曲線と、標準ＧＡロットを用いて得た用量反応曲線の比較により、ＧＡ特異性を特定する。これらの態様において、ヒトＴ細胞株のＧＡ特異性を、「単一の参照ロットの用量曲線解析」に基づいて特定する。これらの態様において、試験ＧＡロットおよび標準ＧＡロットの用量反応曲線の線形領域の勾配が、当該分野で公知の、任意の適当な統計学的方法により、統計学的に類似または同一であるときに、ヒトＴ細胞株のＧＡ特異性を特定し得る。

いくつかの態様において、ＧＡ特異性を決定するためには、参照ロットの用量反応解析の勾配 (β^*)が適当な判定基準を満たしていなければならない。適当な判定基準は、当業者が事前に決定し得る。特定の態様において、適当な判定基準は次の通りである:
・相関係数 (r)が≧０.９０であること；
・勾配が≧０.６０であること；
・ＧＡ標準品の逆算した濃度が、名目上の濃度の±３０％の範囲内であること；
・ＧＡ試料の精度が、変動係数(ＣＶ)２０％以下であること。

いくつかの態様において、陽性対照試料（例えば、ConAで刺激した細胞）の７５％において、ＧＡ誘発性応答が、同じ細胞を、任意の濃度のＧＡで刺激したときに誘発される最も高い応答を上回っていなければならない。いくつかの態様において、陰性対照試料（例えば対照ペプチド、例えばミエリン塩基性タンパク質、ＭＢＰで処理した細胞）の７５％におけるＧＡ誘発性応答は、任意の濃度のＧＡにより誘発される最も低い応答を下回っているかまたは同程度でなければならない。

線形回帰を、ＧＡ標準品ロット試料セットについて行ってよく、ここで、データポイントは、対数目盛でプロットする。(以下でＩＬ−２として表す、分析物の濃度を上昇させることによる)対数のＧＡ誘発性応答値がＹ軸上にあり、対数ＧＡ参照ロット濃度 (用量) の値がX軸上にある。

上記のデータセットに対して用いる最適な線形回帰モデルは次の通りである：
［式中、
であり、
である］。変数ＸおよびＹに、適当な表現を代入することにより、上述のモデルは次のようになる:

いくつかの態様において、試験ロット曲線の勾配が許容される限度内にあるとき、ＧＡ特異性を確証する。試験ロット曲線の勾配の許容される限度は、次の一連の等式を用いた標準ロット曲線に基づいて決定する。

特定の対数（応答）について逆算した用量値は次の通りである:
正確度は次のように計算できる：
Y_lowおよびY_highは、±（平均＋２＊ＳＤ）の許容される最高の正確度により許容される、対数（応答）値の最低値および最高値であり、ここで、平均＋２＊ＳＤは、約９５％の個別許容域の最高限度である。
したがって、勾配が等しいという仮説が受け入れられる領域は次の通りである：
β^＊は次のように算出される：
次いで、上記の領域を、許容されるβ^＊の限度を決定するために、次の範囲まで縮小する:
［式中、βはＧＡ標準品ロット曲線の勾配である。］
したがって、等式（６）により決定される、ＧＡ試験ロット勾配であるβ^＊の許容される範囲は、次のように示すことができる：
β^＊が上述の許容される限度内にある場合、類似(parallelism)であると結論付けてよい。

いくつかの態様において、相関係数は０.９０〜０.９８である。いくつかの態様において、相関係数は、０.９０以上、０.９１以上、０.９２以上、０.９３以上、０.９４以上、０.９５以上、０.９６以上、０.９７以上、０.９８以上、０.９０〜０.９８、０.９１〜０.９８、０.９２〜０.９８、０.９３〜０.９８、０.９４〜０.９８、０.９５〜０.９８、０.９６〜０.９８、０.９０〜０.９７、０.９１〜０.９７、０.９２〜０.９７、０.９３〜０.９７、０.９４〜０.９７、０.９５〜０.９７または０.９６〜０.９８である。

いくつかの態様において、等しい勾配について、真検定試験（true hypothesis test）を用いる。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株である、すなわち、長期の培養期間にわたってＧＡ特異性を維持することが示されている。いくつかの態様において、本発明の長期性ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、少なくとも約４週間〜少なくとも約１０週間またはそれ以上培養した後、例えば、ＧＡ特異性を確認するための再スクリーニングによって、ＧＡ特異性を維持していることが示される。いくつかの態様において、本発明のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、凍結保存の期間を含まずに、少なくとも約４週間〜少なくとも約１２週間またはそれ以上、ＧＡ特異性を維持することが示されている。いくつかの態様において、本発明のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、凍結保存の期間を含まずに、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、約４〜約１２週間、約４〜約１１週間、約４〜約１０週間、約４〜約９週間、約４〜約８週間、約４〜約７週間、約４〜約６週間、約５〜約１２週間、約５〜約１１週間、約５〜約１０週間、約５〜約９週間、約５〜約８週間、約５〜約７週間、約６〜約１２週間、約６〜約１１週間、約６〜約１０週間、約６〜約９週間、約６〜約８週間、約７〜約１２週間、約７〜約１１週間、約７〜約１０週間、約７〜約９週間、約８〜約１２週間、約８〜約１１週間、約８〜約１０週間、約９〜約１２週間または、約９〜約１１週間培養した後に、ＧＡ特異性を維持することが示されている。

いくつかの態様において、本発明の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、本明細書に記載の適当なＡＰＣの存在下で増殖させたときに、長期の培養期間にわたってＧＡ特異性を維持することが示されている。いくつかの態様において、適当なＡＰＣは、自家性ＡＰＣである。特定の態様において、本発明の、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、分裂促進因子の非存在下で増殖させたとき、ＧＡ特異性を長期間維持することが示されている。いくつかの態様において、存在しない該分裂促進因子は、例えば、フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖またはブドウ球菌エンテロトキシンＢ (ＳＥＢ)である。分裂促進因子の非存在下でＧＡ特異性を維持しながら長期間増殖することは、本発明のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の注目すべき特徴である。特定の態様において、本発明の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、ＧＡおよび適当な自家性ＡＰＣの存在下で、分裂促進因子を添加することなく、少なくとも４週間の培養または、少なくとも１〜１０回の再刺激および増殖の間、ＧＡ特異性を維持することが示されている。いくつかの態様において、特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、複数回の再刺激および増殖の刺激後、例えば、再刺激および増殖を少なくとも１〜１０回またはそれ以上行った後に、ＧＡ特異性であることが示される。いくつかの態様において、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、２〜１０回、３〜１０回、４〜１０回、５〜１０回、６〜１０回、７〜１０回、８〜１０回、９〜１０回、１〜９回、２〜９回、３〜９回、４〜９回、５〜９回、６〜９回、７〜９回、１〜８回、２〜８回、３〜８回、４〜８回、５〜８回、６〜８回、１〜７回、２〜７回、３〜７回、４〜７回、５〜７回、１〜６回、２〜６回、３〜６回、４〜６回、１〜５回、２〜５回、３〜５回、１〜４回、２〜４回または１〜３回の再刺激および増殖の後、ＧＡ特異的であることが示される。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、増殖の間、約１ｘ１０^５〜約１ｘ１０^６個/mL、約１ｘ１０^５個/mL、約１.５ｘ１０^５個/mL、約２ｘ１０^５個/mL、約２.５ｘ１０^５個/mL、約３ｘ１０^５個/mL、約３.５ｘ１０^５個/mL、約４ｘ１０^５個/mL、約４.５ｘ１０^５個/mL、約５ｘ１０^５個/mL、約６ｘ１０^５個/mL、約７ｘ１０^５個/mL、約８ｘ１０^５個/mL、約９ｘ１０^５個/mLまたは約１ｘ１０^６個/mLの細胞密度で維持される。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、Ｔ細胞株を、第一ＧＡ製品で刺激したときにＧＡ誘発性応答を測定することによって得た値の第二のＧＡ製品でＴ細胞株を刺激したときに、同じＧＡ誘発性応答を測定することによって得た値との比較に基づいて、ＧＡ特異的であることを決定し、ここで、第二のＧＡ製品の応答値と、第一のＧＡ製品の応答値の比較は、事前に決定した許容される範囲内にあり、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株である。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、複数の用量の第一のＧＡ製品で刺激したときに、ＧＡ誘発性応答を測定することによって得た用量反応曲線の、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、複数の用量の第二のＧＡ製品で刺激したときに同じＧＡ誘発性応答を測定して得た用量反応曲線との比較に基づいて、ＧＡ特異的であることを決定し、ここで、第二のＧＡ製品の用量反応曲線の勾配の、第一のＧＡ製品の用量反応曲線の勾配との比較が許容される限度内にあり、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株である。

上述の２つの態様のいずれかにおいて、第一のＧＡ製品は、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の作製に用いる製品と同じであってよい。いくつかの態様において、第一のＧＡ製品はＣＯＰである。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はクローナルである。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、公知のＭＨＣ拘束性を有する。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、ＤＲ−１、ＤＲ−２、ＤＲ−３、ＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択される拘束のＭＨＣ拘束性を有する。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、少なくとも９８％のＣＤ４+ Ｔ細胞を含み、２％以下のＣＤ８+ Ｔ細胞を含む。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示す。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＧＬ１４、ＬＴ１１、ＧＡ４１Ｓ、ＧＡ６４およびＧＴ１１から選択される非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示す。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＧＬ１４、ＬＴ１１、ＧＡ４１Ｓ、ＧＡ６４およびＧＴ１１から選択される非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない。

ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の増殖
いくつかの態様において、本発明の方法で用いる細胞株、例えば、(スクリーニングしていない)最初のヒトＴ細胞株、(ＧＡ反応性であることが示されている)ＧＡ反応性ヒトＴ細胞株または(ＧＡ特異的であることが示されている)特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、１以上のスクリーニングステージの前または後に増殖させる。増殖により、培養中の細胞数が上昇し、増殖は、本明細書に記載のＧＡ特異的なＴ細胞株の特定および特性決定の過程における、任意の時点で、所望に応じて、多数回行ってよい。典型的には、ヒトＴ細胞株のＧＡ特異性の確立または確認の後に、該細胞株の増殖を行う。いくつかの態様において、細胞株を、凍結保存する前または融解した後に増殖させる。いくつかの態様において、図１に概略するように、１回の過程の間に複数回ヒトＴ細胞株を増殖させる。いくつかの態様において、特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ特異性を、増殖後、かつ、他のＧＡ製品との免疫学的同一性を決定する方法に使用する前に、再試験する。

Ｔ細胞株の増殖は、適当なＡＰＣおよび、必要であれば、成長促進物質、例えばＩＬ−２の存在下で、初回刺激を行うための上述の開始ペプチドを用いて該Ｔ細胞株を再刺激することにより行う。いくつかの態様において、ＩＬ−２を、再刺激の約１２〜約３６時間後に添加し、培養物を、約６〜約１４日間インキュベーションする。いくつかの態様において、この過程を繰り返し、所望により、一部を凍結培養物とする。いくつかの態様において、ＧＡ特異的であると確認したヒトＴ細胞株の増殖は、該細胞を、最終濃度約１μg/mL〜約１００μg/mLの開始ペプチドで再刺激し、用いたＴ細胞数と殆ど同数〜約２倍量のＡＰＣを添加し、約１２〜約３６時間後にＩＬ−２を最終濃度約１０〜約２５U/mLで添加することにより行う。いくつかの態様において、この過程を次の間隔で複数回繰り返す：約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約７〜約１４日間、約７〜約１３日間、約７〜約１２日間、約７〜約１１日間、約７〜約１０日間、約７〜約９日間、約８〜約１４日間、約８〜約１３日間、約８〜約１２日間、約８〜約１１日間、約８〜約１０日間、約９〜約１４日間、約９〜約１３日間、約９〜約１２日間、約９〜約１１日間、約１０〜約１４日間、約１０〜約１３日間、約１０〜約１２日間、約１０〜約１１日間、約１１〜約１４日間、約１１〜約１３日間、または約１２〜約１４日間。特定の態様において、ＧＡ特異的であると確認したヒトＴ細胞株の増殖は、該細胞を、最終濃度約１μg/mL〜約１００μg/mLの開始ペプチドで再刺激し、用いたＴ細胞数と殆ど同数〜約２倍量のＡＰＣを添加し、約１２〜約３６時間後に、ＩＬ−２を最終濃度約１０〜約２５U/mLで添加し、さらに、該細胞を約７〜約１０日間インキュベーションすることにより行う。増殖サイクルを開始するための再刺激前のインキュベーション時間は、組織培養の分野で公知の任意の方法、例えば、培地中のｐＨ指示薬の色素の色および細胞の特性を評価することによって決定し得る。いくつかの態様において、インキュベーション期間の最後に当該分野で公知の方法によって培養物を分割し、さらなる増殖のために再刺激することによって、増殖過程を繰り返す。いくつかの態様において、増殖させた細胞を保存用に凍結させ、再刺激し、ＧＡ特異性について試験するか、または上述の特性決定試験に用いる。

当該分野で公知の、(リンパ球系の開発のために許容できる)任意の適当なＴ細胞増殖培地を、本発明の方法にしたがって、Ｔ細胞を成長させるのに用いてよい。いくつかの態様において、血清不含培地を用いる。いくつかの態様において、該培地は、例えば、AIM V (Invitrogen)、X-VIVO 15^{（登録商標）} Medium (Lonza)、Stemline（登録商標）T Cell Expansion Medium (Sigma-Aldrich)である。いくつかの態様において、該培地は、動物血清、フィーダー細胞および細胞ベースの細胞外マトリクスを含まない。適当な培地、例えば血清不含培地の組成は、当該分野で公知であり、例えば米国特許第６,７３３,７４６号明細書“Hematopoietic cell culture nutrient supplement”および第８,４８１,３１５号明細書“Methods of expanding myeloid cell populations and uses thereof”に記載されており、これらの文献は、引用により本明細書に包含される。

ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定
本発明のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、本明細書に記載のように特性を決定することができる。各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性、例えば免疫学的特性に基づいて、異なるＭＨＣ拘束、異なるバイオマーカープロファイルおよび非標準ＧＡペプチドに対する異なる応答を有する細胞株を含むパネルを集め、ＧＡ製品中のＧＡエピトープを包括的に調べるためのパラレルアッセイフォーマットで用いる。この戦略によって、異なるＧＡ製品間の免疫学的同一性を、従来の公知のアッセイを用いた場合に可能であるいずれの場合よりも優れた正確性で決定することが可能になる。

上述のように、ＧＡは、４つの天然起源のアミノ酸：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リジンを含む合成ポリペプチドの酢酸塩からなる。これらのアミノ酸は、ランダム配列で、それぞれ、平均モル分率０.１４１、０.４２７、０.０９５、および０.３３８で存在する。特定のＧＡ分子上に、複数のエピトープが存在することは疑うまでもないことである。ＧＡ試験品および標準製品が免疫学的に同一であるかどうかを決定するためのアッセイで調べるＧＡエピトープが多いほど、該アッセイは、より正確に、標準、例えばＦＤＡに承認された薬剤である、Copaxoneに匹敵する、臨床効果を有するＧＡ試験品を特定することができる。しかし、ＧＡの抗原エピトープは、これまで、研究者によって特定されていない。これは、主に、多数の異なるアミノ酸配列を有するペプチドの混合物としてのＧＡは、Ｘ線結晶解析のような従来の技術で特性を決定することが困難であるためである。

本発明は、個々のＴ細胞の特有の、異なってはいるが、類似している抗原構造を区別することのできる性質を用いることによって、この問題を克服することができる。本発明は、ＧＡ製品中の異なるエピトープを認識するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の産生および特定ができるという発見に基づくものである。本発明の方法を用いて、細胞株の抗原認識の性質に基づいて、異なるＧＡエピトープを認識するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を得る。多くの異なるＧＡエピトープをともに認識する、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むパネルを集めて、ＧＡ製品を調べるのに用いることができる。

特性決定は、本明細書に記載の方法、または抗原特異的なＴ細胞株の特性決定について当該分野で公知の任意の他の方法、例えばGorski, et al., 1994 May 15, (“Circulating T cell repertoire complexity in normal individuals and bone marrow recipients analyzed by CDR3 size spectratyping. Correlation with immune status” J Immunol. 152(10):5109-19)に記載されているように、Ｔ細胞受容体のスペクトラタイピングによって、またはChoi, et al., 1989 Nov, “Interaction of Staphylococcus aureus toxin‘superantigens’with human T cells”Proc Natl Acad Sci USA 86(22):8941-5に記載されているように、ＰＣＲを用いてＴ細胞受容体Ｖβ鎖の発現を特定することによって行うことができる。

非標準ＧＡペプチドに反応性を示すＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定
本発明の態様において、ＧＡの異なるエピトープを認識するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、非標準ＧＡペプチドによる刺激に対する反応性に基づいて特定する。非標準ＧＡペプチドは、ＣＯＰについて記載されているのとは異なる平均モル分率で、４つのＧＡアミノ酸の任意のサブセットまたは４つのＧＡアミノ酸全てからなるペプチドである。非標準ＧＡペプチドの例としては、ポリグルタミン酸、ポリアラニン、ポリチロシンおよびポリリジン、（任意のモル分率で）４つのＧＡアミノ酸のうち２つか３つのみを含むペプチドおよび、Copaxoneについて記載されているのとは異なるモル分率でＧＡアミノ酸の４つ全てを有するペプチドが挙げられる。実施例の表１は、ペプチド０２６を含む、特定の非標準ＧＡペプチドの非限定的な一覧を記載したものであり、該ペプチド０２６は、ＧＡアミノ酸４つ全てを含むが、ＧＡ製造の最初の５分間はチロシンを加えずに合成した。本発明の方法に有用な非標準ＧＡペプチドの合成方法は、文献に記載されている。ペプチド０２６は、ＧＡよりもチロシンの含有量が少なく、製品中の各種ポリペプチド長に対するアミノ酸の分布が変化している。本発明の方法で非標準ＧＡペプチドとして用いるのに適当なペプチドは、多くが、例えば、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から市販されている。

非標準ＧＡペプチドのエピトープは、標準ＧＡに存在することが期待される。ＧＡを構成する４アミノ酸よりも少ないアミノ酸を含む非標準ＧＡペプチドは、ＧＡと異なるエピトープの数がより少ないことが予期される。４つのＧＡアミノ酸全てを、ＧＡ（すなわち、Copaxoneについて記載した比率）とは変化したモル比で含む非標準ＧＡペプチドは、該変化によって、Copaxoneで見られる相対的比率とは異なる相対的比率でＧＡエピトープを含むことが予測される。４つ全てのＧＡアミノ酸を含む非標準ペプチド、例えばペプチド０２６に対して反応性を示さないＧＡ特異的なヒトＴ細胞株ならびに、同じ非標準ペプチドに対して反応性を示すＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特定が成功することは、特異性において非常に微小な差異を有するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を作製することができることを示す。これらのＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、異常なＧＡ製品を検出するのに有用であり得る。したがって、異なる非標準ＧＡペプチドに対する反応性に基づいて、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を特性決定することにより、並行してアッセイパネルで用いたときに、ＧＡ製品が免疫学的同一性を有するかどうかを正確に決定することができるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を特定することが可能になる。

それぞれが異なるＧＡエピトープを認識する、複数のＧＡ特異的なＴ細胞株を含むＴ細胞株アッセイパネルは、単一のエピトープのみに対する反応性を測定する試験または、異なるエピトープに対する反応性を区別することができない試験、例えばＧＡで免疫化した動物より得た、初代培養ポリクローナルＴ細胞培養を用いたアッセイと比較して、ＧＡ製品の免疫学的同一性をより優れた正確性で決定することができる。いくつかの態様において、本発明のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、１つのクローン由来のクローン、すなわちモノクローナルである。いくつかの態様において、該細胞株は、複数のクローン由来である。ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が複数のクローン由来である態様において、該細胞株は、少数のクローン由来であり、オリゴクローナルである。

非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示すＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、同じ非標準ＧＡペプチドに対して反応しないＧＡ特異的なヒトＴ細胞株とは異なる、ＧＡ中のエピトープを認識することが予期される。したがって、第一の非標準ＧＡペプチドに対して反応するが、第二の非標準ＧＡペプチドに反応しないＧＡ特異的なヒトＴ細胞株、第一の非標準ＧＡペプチドには反応しないが、第二の非標準ＧＡペプチドに反応するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株、および、第一または第二の非標準ペプチドのいずれにも反応しないＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はそれぞれ、ＧＡの異なるエピトープを認識すると予測し得る。例えば、ＧＬ４１、ポリ(Glu-Tyr; ４:１)に反応するがＧＬ１４ (Glu-Lys; １:４)に反応しない第一のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株、ＧＬ１４に反応するが、ＧＬ４１に反応しない第二のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および、ＧＬ４１またはＧＬ１４のいずれにも反応しない第三のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、それぞれ、異なるＧＡエピトープを認識する。本発明の態様のいくつかにおいて、異なる非標準ペプチドにそれぞれ反応する２種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の組み合わせを特定し、ＧＡ試験品が、パネル中のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株によって認識されるエピトープを含むかどうかを決定するためのアッセイパネルにともに用いる。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、該非標準ペプチドに反応しないと決定されるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を２種以上含む。

いくつかの態様において、該パネルの使用は、該パネル中の１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、非標準ペプチドに対する反応性を、該非標準ペプチドによる刺激後の該Ｔ細胞株の応答を測定することにより、試験することを含む。いくつかの態様において、測定する応答は、上述のＧＡ誘発性応答、例えば、増殖、応答バイオマーカーの産生または応答バイオマーカーをコードする核酸の発現である。いくつかの態様において、刺激後の複数のタイムポイントで、または一連の異なるＧＡ濃度で刺激した後にＧＡ誘発性応答を測定することによって、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の非標準ペプチドに対する反応性を試験し、上述のように、用量反応プロファイルまたは曲線を得る。

非標準ペプチドに対する反応性は、ＧＡに対する反応性の決定のための方法と同じ方法を用いることによって、すなわち、該非標準ペプチドによる刺激に対するＧＡ誘発性応答を測定し、該測定結果を陰性対照、例えば抗原を用いない対照と比較することによって決定し得る。

いくつかの態様において、非標準ペプチドにより刺激したＴ細胞株の試験培養物で測定した少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が、抗原なしの対照培養物または非関連抗原の対照培養物で測定した、少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答よりも統計学的に大きいことにより、該非標準ペプチドに対して反応性を示すＴ細胞株を特定する。いくつかの態様において、非標準ペプチドに対して反応性を示すＴ細胞株を、試験培養物のＧＡ誘発性応答が、対照と比較して次のような上昇を示すことにより特定する：約１.５〜約１０倍 (すなわち、該応答が約５０％高い〜約１０００％高い)、約１.５〜約２倍、約１.５〜約３倍、約１.５〜約４倍、約１.５〜約５倍、約１.５〜約６倍、約１.５〜約７倍、約１.５〜約８倍、約１.５〜約９倍、約２〜約１０倍、約２〜約３倍、約２〜約４倍、約２〜約５倍、約２〜約６倍、約２〜約７倍、約２〜約８倍、約２〜約９倍、約３〜約１０倍、約３〜約４倍、約３〜約５倍、約３〜約６倍、約３〜約７倍、約３〜約８倍、約３〜約９倍、約４〜約１０倍、約４〜約５倍、約４〜約６倍、約４〜約７倍、約４〜約８倍、約４〜約９倍、約５〜約１０倍、約５〜約６倍、約５〜約７倍、約５〜約８倍、約５〜約９倍、約６〜約１０倍、約６〜約７倍、約６〜約８倍、約６〜約９倍、約７〜約１０倍、約７〜約８倍、約７〜約９倍、約８〜約１０倍、約８〜約９倍、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２.５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３.５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４.５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍または少なくとも約１０倍。

応答バイオマーカー産生に基づく、ＧＡ特異性ヒトＴ細胞の特性決定
本発明の態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、ＧＡで再刺激した後に、ＧＡ特異的なＴ細胞株による少なくとも１種のＧＡ応答バイオマーカーの産生および/または発現を測定することにより特性決定する。いくつかの態様において、ＧＡ応答バイオマーカーのセットの産生および/または発現を測定し、応答バイオマーカープロファイルを作成することにより、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を特性決定する。本明細書中の実施例に示すように、異なるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、異なるＧＡ-応答バイオマーカープロファイルを有する、すなわち、異なる細胞株は、ＧＡによる再刺激後、異なる量のＧＡ応答バイオマーカーを産生することが示された。該差異は、これらの細胞株の使用を、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品の間の差異を認識するのに特に有用なものにするＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の結合特異性の微小な差異を反映し得る。いくつかの態様において、上述のように、１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ応答バイオマーカープロファイルの特性決定を行い、該細胞株を、ＧＡ試験品とＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定するための、本発明の方法および/またはアッセイパネルで用いる。ＧＡ試験品で刺激したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ応答バイオマーカープロファイルにおける、バイオマーカーの発現レベルを、ＧＡ標準品で刺激した同じＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、それぞれのバイオマーカーの発現と比較する。ＧＡ試験品による刺激後の、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株による各バイオマーカーの発現レベルと、ＧＡ標準品による刺激後のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株による各バイオマーカーの発現レベルの比較が許容される範囲内に収まるとき、該ＧＡ試験品およびＧＡ標準品は、免疫学的に同一であると決定する。いくつかの態様において、比較値の許容される範囲は、約７５％〜約１２５％、約８０％〜約１２０％または約９０％〜約１１０％である。いくつかの態様において、許容される範囲は次の通りである：約７５％〜約１２０％、約７５％〜約１１５％、約７５％〜約１１０％、約７５％〜約１０５％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１２５％、約８５％〜約１２５％、約９０％〜約１２５％、約９５％〜約１２５％、約１００％〜約１２５％、約８０％〜約１１８％、約８０％〜約１１５％、約８０％〜約１１２％、約８０％〜約１１０％、約８０％〜約１０８％、約８０％〜約１０５％、約８０％〜約１０２％、約８０％〜約１０１％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８０％〜約９７％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９２％、約８０％〜約９０％、約８２％〜約１２０％、約８２％〜約１１８％、約８２％〜約１１５％、約８２％〜約１１２％、約８２％〜約１１０％、約８２％〜約１０８％、約８２％〜約１０５％、約８２％〜約１０２％、約８２％〜約１０１％、約８２％〜約１００％、約８２％〜約９９％、約８２％〜約９８％、約８２％〜約９７％、約８２％〜約９５％、約８２％〜約９２％、約８２％〜約９０％、約８４％〜約１２０％、約８４％〜約１１８％、約８４％〜約１１５％、約８４％〜約１１２％、約８４％〜約１１０％、約８４％〜約１０８％、約８４％〜約１０５％、約８４％〜約１０２％、約８４％〜約１０１％、約８４％〜約１００％、約８４％〜約９９％、約８４％〜約９８％、約８４％〜約９７％、約８４％〜約９５％、約８４％〜約９２％、約８４％〜約９０％、約８６％〜約１２０％、約８６％〜約１１８％、約８６％〜約１１５％、約８６％〜約１１２％、約８６％〜約１１０％、約８６％〜約１０８％、約８６％〜約１０５％、約８６％〜約１０２％、約８６％〜約１０１％、約８６％〜約１００％、約８６％〜約９９％、約８６％〜約９８％、約８６％〜約９７％、約８６％〜約９５％、約８６％〜約９２％、約８８％〜約１２０％、約８８％〜約１１８％、約８８％〜約１１５％、約８８％〜約１１２％、約８８％〜約１１０％、約８８％〜約１０８％、約８８％〜約１０５％、約８８％〜約１０２％、約８８％〜約１０１％、約８８％〜約１００％、約８８％〜約９９％、約８８％〜約９８％、約８８％〜約９７％、約８８％〜約９５％、約９０％〜約１２０％、約９０％〜約１１８％、約９０％〜約１１５％、約９０％〜約１１２％、約９０％〜約１１０％、約９０％〜約１０８％、約９０％〜約１０５％、約９０％〜約１０２％、約９０％〜約１０１％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％、約９２％〜約１２０％、約９２％〜約１１８％、約９２％〜約１１５％、約９２％〜約１１２％、約９２％〜約１１０％、約９２％〜約１０８％、約９２％〜約１０５％、約９２％〜約１０２％、約９２％〜約１０１％、約９２％〜約１００％、約９２％〜約９９％、約９２％〜約９８％、約９５％〜約１２０％、約９５％〜約１１８％、約９５％〜約１１５％、約９５％〜約１１２％、約９５％〜約１１０％、約９５％〜約１０８％、約９５％〜約１０５％、約９５％〜約１０２％、約９５％〜約１０１％、約９５％〜約１００％、約９７％〜約１２０％、約９７％〜約１１８％、約９７％〜約１１５％、約９７％〜約１１２％、約９７％〜約１１０％、約９７％〜約１０８％、約９７％〜約１０５％、約９７％〜約１０２％、約９８％〜約１２０％、約９８％〜約１１８％、約９８％〜約１１５％、約９８％〜約１１２％、約９８％〜約１１０％、約９８％〜約１０８％、約９８％〜約１０５％、約９９％〜約１２０％、約９９％〜約１１８％、約９９％〜約１１５％、約９９％〜約１１２％、約９９％〜約１１０％、約９９％〜約１０８％、約９９％〜約１０５％、約１００％〜約１２０％、約１００％〜約１１８％、約１００％〜約１１５％、約１００％〜約１１２％、約１００％〜約１１０％、約１００％〜約１０８％、約１００％〜約１０５％、約１０１％〜約１２０％、約１０１％〜約１１８％、約１０１％〜約１１５％、約１０１％〜約１１２％、約１０１％〜約１１０％、約１０１％〜約１０８％、約１０２％〜約１２０％、約１０２％〜約１１８％、約１０２％〜約１１５％、約１０２％〜約１１２％、約１０２％〜約１１０％、約１０２％〜約１０８％、約１０５％〜約１２０％、約１０５％〜約１１８％、約１０５％〜約１１５％、約１０５％〜約１１２％、約１０５％〜約１１０％、約１１０％〜約１２０％、約１１０％〜約１１８％、または約１１０％〜約１１５％。

いくつかの態様において、それぞれが異なるＧＡ応答バイオマーカープロファイルを有する２種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、ＧＡ試験品とＧＡ標準品が、免疫学的に同一であるかどうかを決定するためのＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のアッセイパネルに用いる。

ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定において測定するＧＡ応答バイオマーカーは、例えば、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、Ｔ細胞活性化マーカーまたは、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカインもしくはＴ細胞活性化マーカーをコードする核酸である。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定で測定する応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、例えばＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、Ｔｈ１関連サイトカイン、Ｔｈ２関連サイトカイン、Ｔｈ１７関連サイトカインまたはＴｈ_ＦＨ関連サイトカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーはＴｈ１関連サイトカインであり、ＩＦＮ−γである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３から選択されるＴｈ２関連サイトカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２から選択されるＴｈ１７関連サイトカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−２１およびＴＧＦ−βから選択されるＴｈ_ＦＨ関連サイトカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βから選択される主要調節関連サイトカインである。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定において測定する応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、Ｔｈ１関連サイトカインをコードする核酸、Ｔｈ２関連サイトカインをコードする核酸、Ｔｈ１７関連サイトカインをコードする核酸またはＴｈ_ＦＨ関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、Ｔｈ１関連サイトカインをコードする核酸であり、ＩＦＮ−γである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３から選択される、Ｔｈ２関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２から選択されるＴｈ１７関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−２１およびＴＧＦ−βから選択されるＴｈ_ＦＨ関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βから選択される主要調節関連サイトカインをコードする核酸である。

ＭＨＣ拘束性に基づくＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定
本発明の態様において、ＭＨＣ拘束性を試験することによって、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性を決定する。異なるＭＨＣ拘束エレメントを介して同じ抗原に反応するＴ細胞株は、異なるエピトープを認識し得る。したがって、ＭＨＣ拘束性は、本発明のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のエピトープ特異性を免疫学的に区別し、それにより、ＧＡ製品が免疫学的に同一であるかどうかを決定するためのアッセイに用いる、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の適当なパネルを選択するための、他のパラメーターを提供する。

ＭＨＣ拘束性は、当該分野で公知の任意の方法、例えばOftung, et. al. (Oftung F., et al., 1994, “Mapping of multiple HLA class II restricted T-cell epitopes of the mycobacterial 70-kilodalton heat shock protein”Infect. Immun. 62:5411-5418)に記載の方法、または本明細書の実施例に記載の方法により試験し得る。

表面マーカー発現に基づくＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定
本発明の態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、細胞表面マーカー発現の解析により特性決定する。いくつかの態様において、本発明の方法で用いる、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はＣＤ４^＋である。当該分野で公知の方法を用いて、ＣＤ４発現を解析し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞株を特定し得る。いくつかの態様において、ＣＤ４に対して特異性を有する蛍光色素標識モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＣＤ４を解析する。いくつかの態様において、試験した試料中の細胞の９８％以上がＣＤ４^＋であるとき、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はＣＤ４^＋であると決定する。いくつかの態様において、試験した試料中の細胞の９９％以上がＣＤ８^＋であるとき、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はＣＤ４^＋であると決定する。いくつかの態様において、９７％以上、９７％より多く、９７.５％以上、９７.５％より多く、９８％以上、９８％より多く、９８.５％以上、９８.５％より多く、９９％以上、または９９％より多くのＣＤ４^＋細胞を含むことが決定されたＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、本発明のアッセイパネルに含まれる。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はＣＤ８⁻である。ＣＤ４と同様に、ＣＤ８マーカーの存在は、当該分野で公知の方法、例えば、ＣＤ８に対する反応性を有する蛍光色素標識モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって解析し得る。いくつかの態様において、本発明の方法で用いるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はＣＤ８^-である。いくつかの態様において、ＣＤ８に対する特異性を有する蛍光色素標識モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＣＤ８を解析する。いくつかの態様において、非特異的な抗体、例えば蛍光色素標識マウスアイソタイプ適合性対照モノクローナル抗体を用いた対照を含む。いくつかの態様において、本発明の方法で用いるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はＣＤ４^＋かつＣＤ８⁻である。いくつかの態様において、試験した試料中の細胞の２％以下がＣＤ８^＋であるとき、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はＣＤ８⁻であると決定する。いくつかの態様において、試験した試料中の細胞の１％以下がＣＤ８^＋であるとき、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株がＣＤ８⁻であると決定する。いくつかの態様において、３％以下、３％未満、２.５％以下、２.５％未満、２％以下、２％未満、１.５％以下、１.５％未満、１％以下、または１％未満のＣＤ８^＋細胞を含むと決定されたＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、本発明のアッセイパネルに含まれる。

いくつかの態様において、実施例に記載のように、非特異的な抗体、例えば、蛍光色素標識したアイソタイプ適合対照モノクローナル抗体ＩｇＧ１抗体を用いた対照を含む。

ＧＡ誘発性応答
本発明の方法において、ＧＡ誘発性の応答を、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特定および特性決定において、本明細書に記載するように測定する。ヒトＴ細胞株の反応性および特異性のスクリーニングは、ヒトＴ細胞株の、ＧＡによる刺激に対する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定し、適当な対照、例えば抗体が存在しない対照の、同じ応答の測値と比較することによって行う。同様に、本発明のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、非標準ＧＡペプチドでの刺激後、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株によって引き出される応答を測定することによって、非標準ＧＡペプチドに対する反応性であると、さらに特性決定してよい。本明細書における、「ＧＡ誘発性応答」は、ＧＡまたは非標準ＧＡペプチドでの刺激後に、刺激により誘発されるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の応答を指す。

本発明で測定するＧＡ誘発性の応答は、（適当なＡＰＣの存在下で）刺激ペプチドによるＴ細胞株の処理後に観察される、適当な対照、例えば、ペプチドなしでＡＰＣにより処理した同じＴ細胞株、またはＡＰＣおよび非関連対照抗原で処理した同じＴ細胞株（陰性対照）では観察されない、応答である。ＧＡ製品での刺激後の、ＧＡ特異的なＴ細胞株のＧＡ誘発性応答の評価により、試験したＧＡ製品に存在するエピトープに微小な差異が存在することを明らかにすることができる。本発明の特定の方法において、特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ試験品およびＧＡ標準品に対するＧＡ誘発性応答を測定し、測定したＧＡ誘発性応答を比較する。該比較に基づいて、ＧＡ製品が免疫学的に同一であるかどうかを決定する。関連する方法において、ＧＡ特異的であると特定したヒトＴ細胞株のＧＡ誘発性応答を比較することによって、第一のＧＡ製品、例えばＧＡ試験品の、第二ＧＡ製品、例えばＧＡ標準品と比較した力価を決定することができる。本明細書に記載の他の方法において、ＧＡ誘発性応答を、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定において測定する。

本発明において、ＧＡ誘発性応答は、例えば、Ｔ細胞増殖、応答バイオマーカーの産生または応答バイオマーカーをコードする核酸の発現であってよい。いくつかの態様において、ＧＡ誘発性応答を、再刺激後の複数のタイムポイントにおいて測定する。いくつかの態様において、ＧＡ誘発性応答を、一連の異なる濃度のＧＡ試験品およびＧＡ標準品でＴ細胞株を再刺激した後に測定する。いくつかの態様において、このデータを用いて用量反応曲線をプロットし、各ＧＡ製品について得られた用量反応曲線を比較する。いくつかの態様において、それぞれの用量反応曲線の線形領域の勾配が統計学的に類似しているかまたは同一であるとき、比較しているＧＡ製品を、免疫学的に同一であると決定する。

Ｔ細胞増殖
抗原に応答した、Ｔ細胞株の増殖は、当該分野で公知の任意の適当な方法を用いて評価し得る。例えば、増殖は、トリチウム標識チミジンの取り込み、ＢｒｄＵ取り込み(例えばMillipore カタログ番号2752を用いる)、ＣＦＳＥアッセイ (例えばCellTrace^ＴＭCFSE Cell Proliferation Kit, Life Technologiesを使用し、Quah, et al., 2007, “Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester”Nature Protocols 2(9): 2049-2056に記載されているように行う)、または、生細胞数を決定するためのＡＴＰ定量 (例えば、CellTiter Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay, Promega, カタログ番号G7571を使用)によって評価し得る。抗原特異的なＴ細胞の評価方法は、文献、例えば“Techniques for Immune Function Analysis”Application Handbook 1st Edition, 2006, Becton, Dickinson and Companyに記載されている。

抗原なしまたは対照抗原および適当なＡＰＣによる刺激後のレベルと比較したときの、ＧＡおよび適当なＡＰＣによる刺激後のＴ細胞株増殖の上昇に基づいて、ＧＡ特異的なＴ細胞株を特定することができる。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なＴ細胞株は、細胞数の増加、（例えばＢｒｄＵアッセイにおける）ＤＮＡ合成の上昇、(例えばＣＦＳＥアッセイにおける)細胞内色素の希釈率の上昇により表される増殖の上昇に基づいて特定し、ここで、該上昇は対照に対して約２倍〜約１０倍である。いくつかの態様において、該上昇は次の通りである：少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、約２倍〜約９倍、約２倍〜約８倍、約２倍〜約７倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約４倍、約２倍〜約３倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約９倍、約３倍〜約８倍、約３倍〜約７倍、約３倍〜約６倍、約３倍〜約５倍、約３倍〜約４倍、約４倍〜約１０倍、約４倍〜約９倍、約４倍〜約８倍、約４倍〜約７倍、約４倍〜約６倍、約４倍〜約５倍、約５倍〜約１０倍、約５倍〜約９倍、約５倍〜約８倍、約５倍〜約７倍、約５倍〜約６倍、約６倍〜約１０倍、約６倍〜約９倍、約６倍〜約８倍、約６倍〜約７倍、約７倍〜約１０倍、約７倍〜約９倍、約７倍〜約８倍、約８倍〜約１０倍、約８倍〜約９倍または約９倍〜約１０倍。

いくつかの態様において、ＧＡの試験品で刺激したＧＡ特異性Ｔ細胞の試料および、ＧＡ標準品で刺激したＧＡ特異的Ｔ細胞の試料の増殖の測定値の比較（例えば、比、分数またはパーセンテージで表される）が、許容される範囲内にあるとき、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品は、免疫学的に同一であると示される。

試験ＧＡ製品および標準ＧＡ製品に対する、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ誘発性応答の比較
本発明のいくつかの態様において、ＧＡ試験品に対するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ誘発性応答の測定値および、ＧＡ標準品に対するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ誘発性応答の測定値を比較する。該比較に基づいて、ＧＡの試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であることを決定する。いくつかの態様において、該比較が許容される範囲内にあるとき、ＧＡの試験品およびＧＡ標準品が、免疫学的に同一であると決定する。いくつかの態様において、該比較値は、パーセンテージで表され、ここで、測定値が等しい場合のパーセンテージが１００である。これらの態様において、比較値についての許容される範囲は、約７５％〜約１２５％、約８０％〜約１２０％または約９０％〜約１１０％である。いくつかの態様において、許容される範囲は、次の通りである：約７５％〜約１２０％、約７５％〜約１１５％、約７５％〜約１１０％、約７５％〜約１０５％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１２５％、約８５％〜約１２５％、約９０％〜約１２５％、約９５％〜約１２５％、約１００％〜約１２５％、約８０％〜約１１８％、約８０％〜約１１５％、約８０％〜約１１２％、約８０％〜約１１０％、約８０％〜約１０８％、約８０％〜約１０５％、約８０％〜約１０２％、約８０％〜約１０１％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８０％〜約９７％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９２％、約８０％〜約９０％、約８２％〜約１２０％、約８２％〜約１１８％、約８２％〜約１１５％、約８２％〜約１１２％、約８２％〜約１１０％、約８２％〜約１０８％、約８２％〜約１０５％、約８２％〜約１０２％、約８２％〜約１０１％、約８２％〜約１００％、約８２％〜約９９％、約８２％〜約９８％、約８２％〜約９７％、約８２％〜約９５％、約８２％〜約９２％、約８２％〜約９０％、約８４％〜約１２０％、約８４％〜約１１８％、約８４％〜約１１５％、約８４％〜約１１２％、約８４％〜約１１０％、約８４％〜約１０８％、約８４％〜約１０５％、約８４％〜約１０２％、約８４％〜約１０１％、約８４％〜約１００％、約８４％〜約９９％、約８４％〜約９８％、約８４％〜約９７％、約８４％〜約９５％、約８４％〜約９２％、約８４％〜約９０％、約８６％〜約１２０％、約８６％〜約１１８％、約８６％〜約１１５％、約８６％〜約１１２％、約８６％〜約１１０％、約８６％〜約１０８％、約８６％〜約１０５％、約８６％〜約１０２％、約８６％〜約１０１％、約８６％〜約１００％、約８６％〜約９９％、約８６％〜約９８％、約８６％〜約９７％、約８６％〜約９５％、約８６％〜約９２％、約８８％〜約１２０％、約８８％〜約１１８％、約８８％〜約１１５％、約８８％〜約１１２％、約８８％〜約１１０％、約８８％〜約１０８％、約８８％〜約１０５％、約８８％〜約１０２％、約８８％〜約１０１％、約８８％〜約１００％、約８８％〜約９９％、約８８％〜約９８％、約８８％〜約９７％、約８８％〜約９５％、約９０％〜約１２０％、約９０％〜約１１８％、約９０％〜約１１５％、約９０％〜約１１２％、約９０％〜約１１０％、約９０％〜約１０８％、約９０％〜約１０５％、約９０％〜約１０２％、約９０％〜約１０１％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％、約９２％〜約１２０％、約９２％〜約１１８％、約９２％〜約１１５％、約９２％〜約１１２％、約９２％〜約１１０％、約９２％〜約１０８％、約９２％〜約１０５％、約９２％〜約１０２％、約９２％〜約１０１％、約９２％〜約１００％、約９２％〜約９９％、約９２％〜約９８％、約９５％〜約１２０％、約９５％〜約１１８％、約９５％〜約１１５％、約９５％〜約１１２％、約９５％〜約１１０％、約９５％〜約１０８％、約９５％〜約１０５％、約９５％〜約１０２％、約９５％〜約１０１％、約９５％〜約１００％、約９７％〜約１２０％、約９７％〜約１１８％、約９７％〜約１１５％、約９７％〜約１１２％、約９７％〜約１１０％、約９７％〜約１０８％、約９７％〜約１０５％、約９７％〜約１０２％、約９８％〜約１２０％、約９８％〜約１１８％、約９８％〜約１１５％、約９８％〜約１１２％、約９８％〜約１１０％、約９８％〜約１０８％、約９８％〜約１０５％、約９９％〜約１２０％、約９９％〜約１１８％、約９９％〜約１１５％、約９９％〜約１１２％、約９９％〜約１１０％、約９９％〜約１０８％、約９９％〜約１０５％、約１００％〜約１２０％、約１００％〜約１１８％、約１００％〜約１１５％、約１００％〜約１１２％、約１００％〜約１１０％、約１００％〜約１０８％、約１００％〜約１０５％、約１０１％〜約１２０％、約１０１％〜約１１８％、約１０１％〜約１１５％、約１０１％〜約１１２％、約１０１％〜約１１０％、約１０１％〜約１０８％、約１０２％〜約１２０％、約１０２％〜約１１８％、約１０２％〜約１１５％、約１０２％〜約１１２％、約１０２％〜約１１０％、約１０２％〜約１０８％、約１０５％〜約１２０％、約１０５％〜約１１８％、約１０５％〜約１１５％、約１０５％〜約１１２％、約１０５％〜約１１０％、約１１０％〜約１２０％、約１１０％〜約１１８％または約１１０％〜約１１５％。

関連する方法において、該比較値を、第一のＧＡ製品、例えばＧＡ試験品の、第二ＧＡ製品、例えばＧＡ標準品と比較した、力価の尺度として用いる。

ＧＡ応答バイオマーカー産生
いくつかの態様において、本発明の方法で測定するＧＡ誘発性応答は、応答バイオマーカーの産生である。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、Ｔ細胞活性化マーカー、または、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカインもしくはＴ細胞活性化マーカー(サイトカイン受容体であってよい)をコードする核酸である。いくつかの態様において、ＧＡ応答バイオマーカーはサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、Ｔ細胞活性化マーカー、または、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカインもしくはＴ細胞活性化マーカーをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、Ｔｈ１関連サイトカイン、Ｔｈ２関連サイトカイン、Ｔｈ１７関連サイトカインまたはＴｈ_ＦＨ関連サイトカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーはＴｈ１関連サイトカインであり、ＩＦＮ−γである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３から選択されるＴｈ２関連サイトカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２から選択されるＴｈ１７関連サイトカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−２１およびＴＧＦ−βから選択されるＴｈ_ＦＨ関連サイトカインである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βから選択される主要調節関連サイトカインである。

いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、Ｔｈ１関連サイトカインをコードする核酸、Ｔｈ２関連サイトカインをコードする核酸、Ｔｈ１７関連サイトカインをコードする核酸またはＴｈ_ＦＨ関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、Ｔｈ１関連サイトカインをコードする核酸であり、ＩＦＮ−γである。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３から選択されるＴｈ２関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２から選択される、Ｔｈ１７関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−２１およびＴＧＦ−βから選択されるＴｈ_ＦＨ関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、応答バイオマーカーは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βから選択される主要調節関連サイトカインをコードする核酸である。

応答バイオマーカータンパク質の産生は、当該分野で公知の方法および文献に公開されている方法の任意の適当な方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットアッセイ、フローサイトメトリーアッセイまたは任意の適当なマルチプレックスアッセイにより測定し得る。本発明の方法で求める、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体および活性化マーカーの産生の測定には、市販のアッセイが利用可能である。例えば、ヒトサイトカインおよびケモカインの検出のためのマルチプレックスアッセイは、例えば、BD^ＴＭ Cytometric Bead Array Flex Set system (BD Biosciences, San Jose, CA)を用いて、作製し得る。

ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、適当なＡＰＣの存在下において、ＧＡで再刺激した後の応答バイオマーカーの産生を、適当な陰性対照、例えば（適当なＡＰＣの存在下で）抗原なしまたは非関連対照抗原による再刺激の後に産生された応答バイオマーカーの量と比較することにより、特定または特性決定し得る。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、対照と比較した、応答バイオマーカー産生の上昇に基づいて特定する。いくつかの態様において、陰性対照に対する、応答バイオマーカー産生において観察される上昇は、約１.５倍〜約１０００倍である。対照と比較した試験培養物の応答は次の通りである：約１.５倍 (すなわち、応答が約５０％高い)〜約１０００倍、約１.５〜約２倍、約１.５〜約３倍、約１.５〜約４倍、約１.５〜約５倍、約１.５〜約６倍、約１.５〜約７倍、約１.５〜約８倍、約１.５〜約９倍、約２〜約３倍、約２〜約４倍、約２〜約５倍、約２〜約６倍、約２〜約７倍、約２〜約８倍、約２〜約９倍、約２〜約１０倍、約３〜約４倍、約３〜約５倍、約３〜約６倍、約３〜約７倍、約３〜約８倍、約３〜約９倍、約３〜約１０倍、約４〜約５倍、約４〜約６倍、約４〜約７倍、約４〜約８倍、約４〜約９倍、約４〜約１０倍、約５〜約６倍、約５〜約７倍、約５〜約８倍、約５〜約９倍、約５〜約１０倍、約６〜約７倍、約６〜約８倍、約６〜約９倍、約６〜約１０倍、約７〜約８倍、約７〜約９倍、約７〜約１０倍、約８〜約９倍、約８〜約１０倍、約１.５倍〜約８０倍、約１.５倍〜約７０倍、約１.５倍〜約６０倍、約１.５倍〜約５０倍、約１.５倍〜約４０倍、約１.５倍〜約３０倍、約１.５倍〜約２０倍、約２倍〜約８０倍、約１.５倍〜約７０倍、約１.５倍〜約６０倍、約１.５倍〜約５０倍、約１.５倍〜約４０倍、約１.５倍〜約３０倍、約１.５倍〜約２０倍、約２倍〜約８０倍、約２倍〜約７０倍、約２倍〜約６０倍、約２倍〜約５０倍、約２倍〜約４０倍、約２倍〜約３０倍、約２倍〜約２０倍、約３倍〜約８０倍、約３倍〜約７０倍、約３倍〜約６０倍、約３倍〜約５０倍、約３倍〜約４０倍、約３倍〜約３０倍、約３倍〜約２０倍、約５倍〜約８０倍、約５倍〜約７０倍、約５倍〜約６０倍、約５倍〜約５０倍、約５倍〜約４０倍、約５倍〜約３０倍、約３倍〜約２０倍、約１０倍〜約８０倍、約１０倍〜約６０倍、約１０倍〜約４０倍、または約１０倍〜約２０倍、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２.５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３.５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４.５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍または少なくとも約１０倍。

応答バイオマーカーをコードする核酸は、多数の市販されているアッセイキットおよびシステムの任意のものを用いるか、または、当該分野で記載されている任意の方法を用いて定量的に測定し得る。いくつかの態様において、応答バイオマーカーのｍＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって測定する。ｍＲＮＡの発現レベルの測定には、当該分野で公知の、任意の適当な定量的方法の使用が考えられる。例えば、ｍＲＮＡを逆転写酵素によって複製し、適当なＰＣＲ法、例えばＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム逆転写ＰＣＲ (ｑＲＴ−ＰＣＲ)によって増幅させてよい。遺伝子発現を定量するためのＰＣＲ法は、例えばVanGuilder, et al., 2008, “Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis”Biotechniques 44: 619-626およびBustin, et al., 2005, “Quantitative real-time RT-PCR-a perspective”Journal of Molecular Endocrinology, 34:597-601に記載されており、これらの文献はそれぞれ、引用によりその全体が本明細書に包含される。マウスサイトカインｍＲＮＡの定量的ＰＣＲは、例えばOverbergh, et al., 1999,“Quantification of murine cytokine mRNAs using real time quantitative reverse transcriptase PCR,”Cytokine 11(4): 305-312に記載されており、当該文献は引用により本明細書に包含され、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ４０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βおよびｉＮＯＳの定量のためのプローブおよびプライマーを記載している。生体外での、マウスリンパ節細胞のＧＡ刺激の後に応答バイオマーカーのｍＲＮＡを測定する方法は、例えば米国特許出願公開第２０１４/０２７２９８７号明細書“Glatiramer Acetate Response Biomarker mRNA Potency Assay”に記載されており、当該文献は引用によりその全体が本明細書に包含される。

適当なＡＰＣの存在下でＧＡにより再刺激した後の、応答バイオマーカーをコードする核酸の産生を、適当な陰性対照において、例えば（適当なＡＰＣの存在下で）抗原なし、または非関連対照抗原で再刺激した後に産生される、応答バイオマーカーをコードする核酸の量と比較することによって、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を特定または特性決定し得る。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、応答バイオマーカーをコードする核酸の産生の、対照に対する上昇に基づいて特定する。いくつかの態様において応答バイオマーカーをコードする核酸において観察される、陰性対照に対する上昇は、約１.５倍〜約１０００倍である。いくつかの態様において、該上昇は次の通りである：約１.５倍〜約１００倍、約１.５倍〜約５０倍、約１.５倍〜約４５倍、約１.５倍〜約４０倍、約１.５倍〜約３５倍、約１.５倍〜約３０倍、約１.５倍〜約２５倍、約１.５倍〜約２２倍、約１.５倍〜約２０倍、約１.５倍〜約１５倍、約１.５倍〜約１２倍、約１.５倍〜約１０倍、約１.５倍〜約９倍、約１.５倍〜約８倍、約１.５倍〜約７倍、約１.５倍〜約６倍、約１.５倍〜約５倍、約１.５倍〜約４倍、約１.５倍〜約３倍、約２倍〜約１００倍、約２倍〜約５０倍、約２倍〜約４５倍、約２倍〜約４０倍、約２倍〜約３５倍、約２倍〜約３０倍、約２倍〜約２５倍、約２倍〜約２２倍、約２倍〜約２０倍、約２倍〜約１５倍、約２倍〜約１２倍、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約９倍、約２倍〜約８倍、約２倍〜約７倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約４倍、約３倍〜約１００倍、約３倍〜約５０倍、約３倍〜約４５倍、約３倍〜約４０倍、約３倍〜約３５倍、約３倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、約３倍〜約２２倍、約３倍〜約２０倍、約３倍〜約１５倍、約３倍〜約１２倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約９倍、約３倍〜約８倍、約３倍〜約７倍、約３倍〜約６倍、約３倍〜約５倍、約４倍〜約１００倍、約４倍〜約５０倍、約４倍〜約４５倍、約４倍〜約４０倍、約４倍〜約３５倍、約４倍〜約３０倍、約４倍〜約２５倍、約４倍〜約２２倍、約４倍〜約２０倍、約４倍〜約１５倍、約４倍〜約１２倍、約４倍〜約１０倍、約４倍〜約９倍、約４倍〜約８倍、約４倍〜約７倍、約４倍〜約６倍、約５倍〜約１００倍、約５倍〜約５０倍、約５倍〜約４５倍、約５倍〜約４０倍、約５倍〜約３５倍、約５倍〜約３０倍、約５倍〜約２５倍、約５倍〜約２２倍、約５倍〜約２０倍、約５倍〜約１５倍、約５倍〜約１２倍、約５倍〜約１０倍、約５倍〜約９倍、約５倍〜約８倍、約５倍〜約７倍、約７倍〜約１００倍、約７倍〜約５０倍、約７倍〜約４５倍、約７倍〜約４０倍、約７倍〜約３５倍、約７倍〜約３０倍、約７倍〜約２５倍、約７倍〜約２２倍、約７倍〜約２０倍、約７倍〜約１５倍、約７倍〜約１２倍、約７倍〜約１０倍、約７倍〜約９倍、約１０倍〜約１００倍、約１０倍〜約５０倍、約１０倍〜約４５倍、約１０倍〜約４０倍、約１０倍〜約３５倍、約１０倍〜約３０倍、約１０倍〜約２５倍、約１０倍〜約２２倍、約１０倍〜約２０倍、約１０倍〜約１５倍、約１５倍〜約１００倍、約１５倍〜約５０倍、約１５倍〜約４５倍、約１５倍〜約４０倍、約１５倍〜約３５倍、約１５倍〜約３０倍、約１５倍〜約２５倍、約１５倍〜約２２倍、約１５倍〜約２０倍、約２０倍〜約１００倍、約２０倍〜約５０倍、約２０倍〜約４５倍、約２０倍〜約４０倍、約２０倍〜約３５倍、約２０倍〜約３０倍、約２０倍〜約２５倍、約２５倍〜約１００倍、約２５倍〜約５０倍、約２５倍〜約４５倍、約２５倍〜約４０倍、約２５倍〜約３５倍、約２５倍〜約３０倍、約３０倍〜約１００倍、約３０倍〜約５０倍、約４０倍〜約１００倍、約５０倍〜約１００倍、約６０倍〜約１００倍、約７０倍〜約１００倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍または少なくとも約１０００倍。

ＧＡ医薬品の製造
本発明は、ＧＡを含む医薬品または医薬組成物の製造方法に関する。この方法の態様において、酢酸グラチラマーを、当該分野で公知である方法、および、文献、例えば米国特許第３,８４９,５５０号および第５,８００,８０８号明細書に記載の標準的な方法にしたがって製造する。いくつかの態様において、ＧＡを含有する医薬品または医薬組成物を、保護された酢酸グラチラマーを臭化水素酸と反応させて、トリフルオロアセチルＧＡを形成すること、該トリフルオロアセチルコポリマー-１をピペリジン水溶液で処理して、ＧＡ試験品を形成し、該ＧＡ試験品を精製することにより製造する。本明細書中で上述した方法および/またはアッセイパネルを用いて、該ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定する。例えば、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が、免疫学的に同一であるかどうかは、（ａ）少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を適当な抗原提示細胞 (ＡＰＣ)とともにインキュベーションし、（ｂ）工程（ａ）でインキュベーションした、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞および適当なＡＰＣの少なくとも１つの試料を一定量のＧＡの試験品で刺激し、それとは別に、工程（ａ）でインキュベーションしたＧＡ特異的なヒトＴ細胞および適当なＡＰＣの少なくとも１つの試料を、同量のＧＡ標準品で刺激し、（ｃ）工程（ｂ）において、ＧＡの試験品で刺激した細胞の少なくとも１つの試料の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定し、工程（ｂ）においてＧＡ標準品で刺激した少なくとも１つの細胞試料の少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答を測定し、（ｄ）工程（ｃ）で得た測定値を比較することにより決定し、ここで、工程（ｄ）で行う測定値の比較が、許容される範囲に収まる場合に、ＧＡの試験品とＧＡ標準品は免疫学的に同一であると決定し、ＧＡの試験品は、免疫学的にＧＡ標準品と同一であると決定された場合に、医薬品または医薬組成物に混合する。いくつかの態様において、該医薬品または医薬組成物は、さらに、賦形剤および/または希釈剤、例えばCopaxone（登録商標）のパッケージ表示に記載されているものを含む。

特定の態様において、ＧＡ製品を医薬品または医薬製品に添加する意図がある場合において、その添加前、ＧＡ製品の添加後、または他の所望の任意のタイミングにおいて、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうか、または許容される相対力価を有するかどうかを決定するのに、本発明の方法を用いる。いくつかの態様において、ＧＡ試験品を、ＧＡ医薬品または医薬組成物の他の成分、例えば希釈剤、賦形剤または他の活性成分に添加するが、これは、ＧＡ試験品がＧＡ標準品と免疫学的に同一であるか、または匹敵する力価を有すると決定された場合のみである。ＧＡ製品を比較するデータを評価する方法を含む力価アッセイは、文献、例えば米国特許第７,４２９,３７４号明細書、“Process for the measurement of the potency of glatiramer acetate”に記載されており、当該文献は引用によりその全体が本明細書に包含される。

新規バイオマーカーの特定
適当なＡＰＣの存在下においてＧＡで刺激した、ＧＡ特異的Ｔ細胞培養物に存在する潜在的な応答バイオマーカーの量を、適当なＡＰＣとともにインキュベーションしたが抗原刺激を行っていない対照培養物、または対照抗原で刺激した対照培養物に存在する応答バイオマーカーの量と比較することにより、さらなる応答バイオマーカーを特定し得る。

適当なＡＰＣの存在下でＧＡにより刺激した、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株に存在する潜在的なＧＡ応答バイオマーカータンパク質または該タンパク質をコードする核酸の量を、適当な陰性対照中の同じ潜在的なＧＡ応答バイオマーカータンパク質または該タンパク質をコードする核酸の量と比較することによって、本発明の方法で用いるのに適当なＧＡ応答バイオマーカーを特定し得る。適当なＧＡ応答バイオマーカーは、適当なＡＰＣの存在下でＧＡにより刺激したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株において、陰性対照と比較して優位に調節（上昇または低下）される。いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株についてのＧＡ応答バイオマーカーを、陰性対照に対して約２倍〜約１０００倍の、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ再刺激後の産生の上昇に基づいて特定する。

ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のアッセイパネル
上述のように、本発明は、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、ＧＡ製品間、例えばＧＡ試験品およびＧＡ標準品間の免疫学的同一性を決定する方法における使用を考慮している。ＧＡは複数のエピトープを含むため、ＧＡで刺激することによりＧＡ特異的なヒトＴ細胞を作製および特定し、ＧＡに対する応答性を試験する際に、異なるエピトープを認識することができるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を得ることができることは、必ずしも知られていなかった。区別可能なエピトープ結合特性を有するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を得ることができるという知見に基づき、本発明は、複数のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を用いて、ＧＡ製品の免疫学的同一性をより正確に決定するためのアッセイを提供する。

本発明の態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のアッセイパネルを、ＧＡ製品の解析、例えば免疫学的同一性についての試験および/または類似または相違の程度を決定するのに用いる。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、複数のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０種の異なるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００種の異なるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、２〜１００、２〜５０、２〜２５、２〜１０、５〜１００、５〜５０、５〜２５、５〜１０、１０〜１００、１０〜５０、１０〜２５または５０〜１００種の異なるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。

本発明の態様において、該アッセイパネルは、クローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株、オリゴクローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株またはその両方の組み合わせを含む。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、クローナルおよびオリゴクローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の組み合わせを含み、ここで大部分 (＞５０％) はクローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株である。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、クローナルおよびオリゴクローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の組み合わせを含み、ここで、該パネルは、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％がクローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株から構成される。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、クローナルおよびオリゴクローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の組み合わせを含み、ここで、該パネルは、約２０％〜約１００％、約２５％〜約１００％、約３０％〜約１００％、約３５％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約４５％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約５５％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約６５％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％または約９５％〜約１００％が、クローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株により構成される。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、クローナルおよびオリゴクローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の組み合わせを含み、ここで、該パネルは、１/６以上、１/３以上、２/３以上、３/４以上または５/６以上が、クローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株から構成される。

いくつかの態様において、アッセイパネル中の全てのＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はクローナルである。Ｔ細胞株は、当業者に公知である方法および、文献に記載されている方法の任意の方法、例えば限界希釈クローニングによって、Ｔ細胞集団からクローニングし得る。限界希釈クローニングでは、候補細胞株を、限界希釈濃度(例えば０.３個/ウェルまたは１個/ウェル以下)で、抗原およびＡＰＣとともに、複数のウェル中で培養する。得られた細胞を本明細書で記載するように再刺激する。Ｔ細胞クローニングの方法は広く知られており、文献、例えばMariotti, S., and Nisini, R., 2009”Generation of Human T Cell Clones”in T Cell Protocols, Gennaro de Libero (ed.), Humana Press, Second edition, vol. 514, pages 65-93に記載されており、当該文献は、引用により全体が本明細書に包含される。いくつかの態様において、クローナルなＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を得るために限界希釈クローニングを、１回以上繰り返す。Ｔ細胞株を、例えば、Lee, S-T, et al., 2008“A Novel Strategy for Rapid and Efficient Isolation of Human Tumor-Specific CD4+ and CD8+ T-Cell Clones”J. Imm. Meth. 331(1-2): 13-26（引用により全体が本明細書に包含される）に記載のように、フローサイトメトリー法を用いてクローニングしてもよい。いくつかの態様において、Ｔ細胞株がクローナルであることは、当業者に公知の方法および文献に記載されている方法にしたがって、Ｔ細胞受容体の配列決定により確認される。

いくつかの態様において、アッセイパネルは、第一のＧＡ製品の存在下でヒトＴ細胞株を培養することによって作製したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および、第二のＧＡ製品の存在下でヒトＴ細胞株を培養することによって作製した少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、第一のＧＡ製品はＣＯＰであり、第二のＧＡ製品はＧＭＡである。いくつかの態様において、該第一および第二のＧＡ製品は、異なるＣＯＰ製品または異なるＧＭＡ製品である。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のアッセイパネルは、第一のＧＡ製品による刺激後に、第二ＧＡ製品による刺激後と類似または同一のＧＡ誘発性応答を示す、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、該第一のＧＡ製品はＣＯＰであり、第二のＧＡ製品はＧＭＡである。いくつかの態様において、該第一および第二のＧＡ製品は、異なるＣＯＰ製品または異なるＧＭＡ製品である。

いくつかの態様において、該パネルは、第一の非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答する、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、該パネルは、第一の非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答する、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株ならびに、第二の非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答する、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、該パネルは、ＧＡによる刺激に応答してそれぞれ異なる応答バイオマーカープロファイルを産生する、少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、それぞれ異なるＭＨＣ拘束性を有する少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のアッセイパネルは、少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含み、ここで、かかる少なくとも２種のＧＡ特異的な細胞株の少なくとも１種は:
a) 非標準ＧＡペプチド刺激に応答しないＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;
b) 公知のバイオマーカー応答プロファイルを示すＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;および
c) 公知のＭＨＣ拘束性を有するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株
である。

いくつかの態様において、本発明のアッセイパネルは、第一のＧＡ製品の存在下でヒトＴ細胞を培養することによって作製される少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および、第二のＧＡ製品の存在下でヒトＴ細胞を培養することによって作製される少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、このアッセイパネルはさらに、非標準ＧＡペプチドには反応しないＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を少なくとも１種含む。いくつかの態様において、第一のＧＡ製品の存在下でヒトＴ細胞を培養することによって作製される、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、ＧＭＡの存在下でヒトＴ細胞を培養することによって作製される。

いくつかの態様において、アッセイパネル中のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、次から選択される:
１) 第一のＧＡ製品とともに培養することにより作製される、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;
２) 第二のＧＡ製品とともに培養することにより作製される、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;
３) 第一の非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答しない、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;
４) 第一の非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答する、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;
５) 第二の非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答しない、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;
６) 第二の非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答する、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;
７) 公知のバイオマーカー応答プロファイルを有する、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;
８) (７)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株とは異なる公知のバイオマーカー応答プロファイルを有する、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;
９) 公知のＭＨＣ拘束性を有する、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株; および
１０) (９)のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株とは異なる公知のＭＨＣ拘束性を有する、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および/またはクローナルＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および/またはＣＤ４^＋ＧＡ特異的ヒトＴ細胞株および/またはＣＤ８⁻ ＧＡ特異的ヒトＴ細胞株である。

いくつかの態様において、該アッセイパネルは、表Ａに記載のＴ細胞株を１種以上含む。

いくつかの態様において、該アッセイパネルは、表Ｂに記載のＴ細胞株を１種以上含む。

いくつかの態様において、該アッセイパネルは、１種以上の陽性または陰性対照を含む。

いくつかの態様において、該アッセイパネルが、非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答しない、１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むとき、該アッセイパネルはさらに、同じ非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答する１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。例えば、該アッセイパネルは、非標準ペプチドによる刺激に応答しないと決定した、第一の特性決定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および、非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答すると決定した、第二の特性決定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含んでいてよい。いくつかの態様において、第一および第二の特性決定されたＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、ともに、非標準ＧＡペプチドによる刺激に対して応答するが、その応答は異なっている (例えば、それぞれが異なるＧＡ応答バイオマーカープロファイルを示す)。関連する態様において、非標準ＧＡペプチドによる刺激に応答するかどうかが決定されている任意のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株については、陰性対照が含まれる。いくつかの態様において、陰性対照試料は、該細胞株および適当なＡＰＣを含み、抗原を含まない。

いくつかの態様において、該アッセイパネルは、公知のバイオマーカー応答プロファイルを有する１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および、異なる公知のバイオマーカー応答プロファイルを有する１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。例えば、該アッセイパネルは、第一の公知のバイオマーカー応答プロファイルを有することが決定されている、特性決定されたＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および、第一の公知のバイオマーカー応答プロファイルとは異なる、第二の公知のバイオマーカー応答プロファイルを有することが決定されている、特性決定されたＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、第一および第二の公知のバイオマーカー応答プロファイルは、それぞれ、少なくとも１種のサイトカイン、少なくとも１種のケモカイン、少なくとも１種の活性化マーカー、サイトカインをコードする少なくとも１種の核酸、ケモカインをコードする少なくとも１種の核酸、または活性化マーカーをコードする少なくとも１種の核酸を含む。

関連する態様において、公知のバイオマーカー応答プロファイルを有する任意のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株について、陰性対照が含まれる。いくつかの態様において、該陰性対照は、該細胞株および適当なＡＰＣを含み、抗原を含まない。

いくつかの態様において、該アッセイパネルは、公知のＭＨＣ拘束性を有する、１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および、異なる公知のＭＨＣ拘束性を有する１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、該アッセイパネルは、ＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントがＤＲ−１、ＤＲ−２、ＤＲ−３、ＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択される、公知のＭＨＣ拘束性を有する１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および; ＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントがＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択される、異なる公知のＭＨＣ拘束性を有する１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。例えば、該アッセイパネルは、第一の公知のＭＨＣ拘束性を有することが決定されている、特性決定されたＧＡ特異的なヒトＴ細胞株および、第一の公知のＭＨＣ拘束性と異なる第二の公知のＭＨＣ拘束性を有することが決定されている、特性決定されたＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。関連する態様において、異なる公知のＭＨＣ拘束性を有することが決定されている任意のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株について陰性対照が含まれる。いくつかの態様において、該陰性対照試料は、該細胞株、非適合性ＡＰＣおよびＧＡを含む。いくつかの態様において、該陰性対照試料は、該細胞株および適当なＡＰＣを含み、抗原を含まない。

いくつかの態様において、アッセイパネルは、少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含み、ここで、少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はそれぞれ、Ｔ細胞株をＧＡの第一製品で刺激したときのＧＡ誘発性応答を測定することによって得た応答値の、Ｔ細胞株を第二のＧＡ製品で刺激したときの同じＧＡ誘発性応答を測定することによって得た応答値との比較に基づいて、ＧＡ特異的であると決定されており、ここで、該第二ＧＡ製品への応答の、第一ＧＡ製品に対する応答との比較は、許容される範囲または限度内にあり、少なくとも２種類のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、それぞれ、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株である。いくつかの態様において、該第一ＧＡ製品を、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の作製に用いた。いくつかの態様において、該第一ＧＡ製品はCopaxoneである。

いくつかの態様において、アッセイパネルは、少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含み、ここで、少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はそれぞれ、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、複数の用量の少なくとも第一のＧＡ製品で刺激したときのＧＡ誘発性応答を測定することにより得られる用量反応曲線の、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を複数の用量の第二のＧＡ製品で刺激したときの同じＧＡ誘発性応答を測定することにより得られる用量反応曲線との比較に基づいて、ＧＡ特異的であると決定されおり、ここで、第二のＧＡ製品の用量反応曲線の勾配の、第一のＧＡ製品の用量反応曲線の勾配に対する比較は、許容される範囲または限度内にあり、少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株はそれぞれ、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株である。いくつかの態様において、第一のＧＡ製品を、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の作製に用いた。いくつかの態様において、該第一ＧＡ製品はCopaxoneである。

いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種は、非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示す。いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種は、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＧＬ１４、ＬＴ１１、ＧＡ４１Ｓ、ＧＡ６４およびＧＴ１１から選択される非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示す。

いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種は、非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない。いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種は、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＧＬ１４、ＬＴ１１、ＧＡ４１Ｓ、ＧＡ６４およびＧＴ１１から選択される非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない。

いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種は非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示し、ここで、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種は、同じ非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない。いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種は、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＧＬ１４、ＬＴ１１、ＧＡ４１Ｓ、ＧＡ、６４およびＧＴ１１から選択される非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示し、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種は同じ非標準ＧＡペプチドに対して反応性を示さない。

いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種はクローナルである。いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は全てクローナルである。いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は異なるＭＨＣ拘束性を有する。いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントがＤＲ−１、ＤＲ−２、ＤＲ−３、ＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択される公知のＭＨＣ拘束性を有する、１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株; および、ＨＬＡ−ＤＲ拘束エレメントがＤＲ−４、ＤＲ−７、ＤＲ−１１、ＤＲ−１３およびＤＲ−１５から選択される、異なる公知のＭＨＣ拘束性を有する１種以上のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含む。いくつかの態様において、該アッセイパネル中の少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株は、少なくとも９８％のＣＤ４^＋Ｔ細胞および２％以下のＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む。

ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のアッセイパネルの使用
本発明の態様において、本発明のアッセイパネルを、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定する方法に用いる。これらの態様において、細胞試料は、事前に決定した数の該パネル中のＧＡ特異的な各ヒトＴ細胞株の細胞、適当なＡＰＣおよび一定量のＧＡの試験品を用いて調製する。細胞試料はまた、事前に決定した同じ数の該パネル中のＧＡ特異的な各ヒトＴ細胞株の細胞、適当なＡＰＣおよび一定量のＧＡ標準品を用いて調製する。いくつかの態様において、対照試料を調製する。いくつかの態様において、事前に決定した同じ数の該パネル中のＧＡ特異的な各ヒトＴ細胞株の細胞を用いて、ＡＰＣおよび抗原を用いずに、陰性対照を調製する。いくつかの態様において、事前に決定した同じ数の該パネル中のＧＡ特異的な各ヒトＴ細胞株の細胞、適当なＡＰＣおよび非関連抗原を用いて対照を調製する。いくつかの態様において、事前に決定した同じ数の該パネル中のＧＡ特異的な各ヒトＴ細胞株の細胞および非適合性ＡＰＣを用いて陰性対照を調製する。

いくつかの態様において、少なくとも１種〜少なくとも２５種の同じＧＡ誘発性応答を、各細胞試料において測定する。いくつかの態様において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４または少なくとも２５種のＧＡ誘発性応答を各細胞試料において測定する。

ＧＡ試験品で刺激したＴ細胞株試料における特定のＧＡ誘発性応答の測定値を、ＧＡ標準品で刺激したＴ細胞株試料における同じＧＡ誘発性応答と比較することによって、本発明のアッセイパネルを用いて得られる測定値を、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定するのに使用し得る。いくつかの態様において、陰性対照試料で観察される任意のバックグラウンドを考慮するために、比較を行う前にこれらの測定値を規準化する。

免疫学的同一性の決定
本明細書に記載するように、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかは、ＧＡ試験品で刺激したＧＡ特異的なＴ細胞株における少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値を、ＧＡ標準品で刺激したＧＡ特異的なＴ細胞株における少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答と比較することによって、本発明の方法を用いて決定し得る。

本明細書の他の箇所に記載するように、測定するＧＡ誘発性応答は、増殖、応答バイオマーカーの産生、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現またはその組み合わせであってよい。

本発明の方法で測定するＧＡ誘発性応答が、応答バイオマーカーの産生である態様において、該応答バイオマーカーは、例えばサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、Ｔ細胞活性化マーカー、または、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカインもしくはＴ細胞活性化マーカーをコードする核酸であってよい。応答バイオマーカーは、当該分野で公知の方法および本明細書の他の箇所に記載の方法にしたがって測定し得る。

いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、Ｔｈ１関連サイトカイン、Ｔｈ２関連サイトカイン、Ｔｈ１７関連サイトカインまたはＴｈ_ＦＨ関連サイトカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、Ｔｈ１関連サイトカインであり、ＩＦＮ−γである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３から選択されるＴｈ２関連サイトカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２から選択されるＴｈ１７関連サイトカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−２１およびＴＧＦ−βから選択されるＴｈ_ＦＨ関連サイトカインである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βから選択される主要調節関連サイトカインである。
いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)、ＴＮＦ−β (ＬＴ)、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーをコードする核酸である。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、例えば、ＩＬ−８ (ＣＸＣＬ８)、ＲＡＮＴＥＳ (ＣＣＬ５)、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、Ｔｈ１関連サイトカインをコードする核酸、Ｔｈ２関連サイトカインをコードする核酸、Ｔｈ１７関連サイトカインをコードする核酸またはＴｈ_ＦＨ関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、Ｔｈ１関連サイトカインをコードする核酸であり、ＩＦＮ−γである。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３から選択されるＴｈ２関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２から選択されるＴｈ１７関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−２１およびＴＧＦ−βから選択されるＴｈ_ＦＨ関連サイトカインをコードする核酸である。いくつかの態様において、該応答バイオマーカーは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βから選択される主要調節関連サイトカインをコードする核酸である。本明細書に記載の方法にしたがって、さらなる応答バイオマーカーを特定してよい。

いくつかの態様において、それぞれの、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品の測定値の各組み合わせの比較（例えば、分数、比率またはパーセンテージで表される）が許容される範囲または許容される限度内にあるときに、試験品およびＧＡ標準品は免疫学的に同一であると決定する。

本発明の態様において、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のパネルを用いて、ＧＡ製品間の免疫学的同一性を決定する。いくつかの態様において、ＧＡ試験品で刺激したパネルにおける、それぞれのＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答および、ＧＡ標準品で刺激したパネルにおけるＧＡ特異的な各ヒトＴ細胞株の少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答の測定値を比較する。本明細書に記載するように、特定の態様において、比較の前に、適当な陰性対照試料で観察される任意のシグナルを考慮に入れるために、各ＧＡ誘発性応答の測定値を規準化する。複数のＧＡ特異的なＴ細胞株のパネルを、少なくとも１種のＧＡ試験ロットの評価に用いる態様において、標準ロットで刺激したパネル中の任意/全ての細胞株の用量反応曲線が事前に定めた基準、例えば下記のように、相関係数 (r)が≧０.９０であること、勾配が≧０.６０であること、ＧＡ標準品の逆算した濃度が名目上の濃度の±３０％の範囲内にあること；およびＧＡ試料の精度が、変動係数 (ＣＶ) ２０％以下であること、という基準を満たさなければならない。いくつかの態様において、ＧＡ標準品ロットと免疫学的に同一であると決定されるためには、少なくとも１種のＧＡ試験ロットについての用量反応曲線は、事前に定めた許容される限度内になければならない。いくつかの態様において、相関係数は、０.９０〜０.９８である。いくつかの態様において、該相関係数は、０.９０以上、０.９１以上、０.９２以上、０.９３以上、０.９４以上、０.９５以上、０.９６以上、０.９７以上、０.９８以上、０.９０〜０.９８、０.９１〜０.９８、０.９２〜０.９８、０.９３〜０.９８、０.９４〜０.９８、０.９５〜０.９８、０.９６〜０.９８、０.９０〜０.９７、０.９１〜０.９７、０.９２〜０.９７、０.９３〜０.９７、０.９４〜０.９７、０.９５〜０.９７または０.９６〜０.９８である。

いくつかの態様において、(ＧＡ試験品で刺激したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株におけるＧＡ誘発性応答測定値のＧＡ標準品で刺激したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株における測定値に対する)比較値が７５％〜１２５％であるとき、免疫学的に同一であると決定する。いくつかの態様において、比較を行う前に、適当な陰性対照値、例えば、抗原なしの陰性対照の値を、試験値から引く。いくつかの態様において、抗原なしの対照の測定値を、比較前に試験値から引かない。いくつかの態様において、値を直接比較する。

いくつかの態様において、比較値についての許容される範囲または限度は、約８０％〜約１２０％または約９０％〜約１１０％である。いくつかの態様において、許容される範囲は、次の通りである：約７５％〜約１２０％、約７５％〜約１１５％、約７５％〜約１１０％、約７５％〜約１０５％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１２５％、約８５％〜約１２５％、約９０％〜約１２５％、約９５％〜約１２５％、約１００％〜約１２５％、約８０％〜約１１８％、約８０％〜約１１５％、約８０％〜約１１２％、約８０％〜約１１０％、約８０％〜約１０８％、約８０％〜約１０５％、約８０％〜約１０２％、約８０％〜約１０１％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８０％〜約９７％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９２％、約８０％〜約９０％、約８２％〜約１２０％、約８２％〜約１１８％、約８２％〜約１１５％、約８２％〜約１１２％、約８２％〜約１１０％、約８２％〜約１０８％、約８２％〜約１０５％、約８２％〜約１０２％、約８２％〜約１０１％、約８２％〜約１００％、約８２％〜約９９％、約８２％〜約９８％、約８２％〜約９７％、約８２％〜約９５％、約８２％〜約９２％、約８２％〜約９０％、約８４％〜約１２０％、約８４％〜約１１８％、約８４％〜約１１５％、約８４％〜約１１２％、約８４％〜約１１０％、約８４％〜約１０８％、約８４％〜約１０５％、約８４％〜約１０２％、約８４％〜約１０１％、約８４％〜約１００％、約８４％〜約９９％、約８４％〜約９８％、約８４％〜約９７％、約８４％〜約９５％、約８４％〜約９２％、約８４％〜約９０％、約８６％〜約１２０％、約８６％〜約１１８％、約８６％〜約１１５％、約８６％〜約１１２％、約８６％〜約１１０％、約８６％〜約１０８％、約８６％〜約１０５％、約８６％〜約１０２％、約８６％〜約１０１％、約８６％〜約１００％、約８６％〜約９９％、約８６％〜約９８％、約８６％〜約９７％、約８６％〜約９５％、約８６％〜約９２％、約８８％〜約１２０％、約８８％〜約１１８％、約８８％〜約１１５％、約８８％〜約１１２％、約８８％〜約１１０％、約８８％〜約１０８％、約８８％〜約１０５％、約８８％〜約１０２％、約８８％〜約１０１％、約８８％〜約１００％、約８８％〜約９９％、約８８％〜約９８％、約８８％〜約９７％、約８８％〜約９５％、約９０％〜約１２０％、約９０％〜約１１８％、約９０％〜約１１５％、約９０％〜約１１２％、約９０％〜約１１０％、約９０％〜約１０８％、約９０％〜約１０５％、約９０％〜約１０２％、約９０％〜約１０１％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９９％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９０％〜約９５％、約９２％〜約１２０％、約９２％〜約１１８％、約９２％〜約１１５％、約９２％〜約１１２％、約９２％〜約１１０％、約９２％〜約１０８％、約９２％〜約１０５％、約９２％〜約１０２％、約９２％〜約１０１％、約９２％〜約１００％、約９２％〜約９９％、約９２％〜約９８％、約９５％〜約１２０％、約９５％〜約１１８％、約９５％〜約１１５％、約９５％〜約１１２％、約９５％〜約１１０％、約９５％〜約１０８％、約９５％〜約１０５％、約９５％〜約１０２％、約９５％〜約１０１％、約９５％〜約１００％、約９７％〜約１２０％、約９７％〜約１１８％、約９７％〜約１１５％、約９７％〜約１１２％、約９７％〜約１１０％、約９７％〜約１０８％、約９７％〜約１０５％、約９７％〜約１０２％、約９８％〜約１２０％、約９８％〜約１１８％、約９８％〜約１１５％、約９８％〜約１１２％、約９８％〜約１１０％、約９８％〜約１０８％、約９８％〜約１０５％、約９９％〜約１２０％、約９９％〜約１１８％、約９９％〜約１１５％、約９９％〜約１１２％、約９９％〜約１１０％、約９９％〜約１０８％、約９９％〜約１０５％、約１００％〜約１２０％、約１００％〜約１１８％、約１００％〜約１１５％、約１００％〜約１１２％、約１００％〜約１１０％、約１００％〜約１０８％、約１００％〜約１０５％、約１０１％〜約１２０％、約１０１％〜約１１８％、約１０１％〜約１１５％、約１０１％〜約１１２％、約１０１％〜約１１０％、約１０１％〜約１０８％、約１０２％〜約１２０％、約１０２％〜約１１８％、約１０２％〜約１１５％、約１０２％〜約１１２％、約１０２％〜約１１０％、約１０２％〜約１０８％、約１０５％〜約１２０％、約１０５％〜約１１８％、約１０５％〜約１１５％、約１０５％〜約１１２％、約１０５％〜約１１０％、約１１０％〜約１２０％、約１１０％〜約１１８％または約１１０％〜約１１５％。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なＴ細胞株のアッセイパネルを用いて、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品の免疫学的な同一性を、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品製品による刺激後に測定する、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種またはそれ以上の、異なるＧＡ誘発性応答を比較することにより特定する。

いくつかの態様において、ＧＡ特異的なＴ細胞株のアッセイパネルを用いて、該アッセイパネルの測定値のそれぞれの組み合わせの比較が、事前に決定した許容される範囲にあるときに、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品の免疫学的同一性を決定する。いくつかの態様において、８０〜１００％、８５〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の、アッセイパネル中の測定値のそれぞれの組み合わせの比較が許容される範囲内にあるとき、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品は免疫学的に同一であると決定する。

単一の標準ロットの使用および単一の用量でのＧＡ誘発性応答の比較に基づいて、試験ＧＡ製品および標準ＧＡ製品が免疫学的に同一であると決定する態様において、免疫学的同一性の決定は、「単一の標準ロット、単一用量解析」に基づく。いくつかの態様において、単一標準、単一用量解析比較値が、１つのＧＡ用量、２つの異なるＧＡ用量、３つの異なるＧＡ用量またはそれ以上のそれぞれで、事前に決定した許容される範囲にあるときに、２種のＧＡ製品は免疫学的に同一であると決定する。

いくつかの態様において、各ＧＡロットに対するＧＡ誘発性応答を、次第に上昇させる一連のＧＡ用量で測定し、得られた応答値を用いて各ロットについての用量反応曲線を作成する。いくつかの態様において、該標準ロットの用量反応曲線の勾配(β^*)を、試験用量反応曲線の勾配と比較することによって、該ロットが、免疫学的に同一であるか（または同一でないか）を決定する。これらの態様において、ヒトＴ細胞株のＧＡ特異性を、「単一標準ロット用量反応曲線解析」に基づいて特定する。いくつかの態様において、各用量反応曲線の線形範囲の勾配が、統計学的に類似しているかまたは同一であるときに、ＧＡの試験品およびＧＡ標準品は免疫学的に同一であると確認する。

いくつかの態様において、試験ＧＡロットおよび標準ＧＡロットの用量反応解析の勾配が、当業者に公知の任意の適当な統計学的な方法にしたがって、統計学的に類似しているかまたは同一であると決定される場合、２つのＧＡ製品は免疫学的に同一であると決定してよい。いくつかの態様において、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品の免疫学的同一性は、ＥＣ_５０比較および/または回帰解析または、当該分野で公知であるかまたは文献に記載されている他の適当な方法を用いて決定する。

いくつかの態様において、用量反応曲線の比較により免疫学的同一性を決定するためには、標準ロット用量反応曲線の勾配 (β^＊)が、適当な判定基準を満たしていなければならない。適当な判定基準は、当業者が事前に決定してよい。特定の態様において、適当な判定基準は次の通りである:
・相関係数 (r)が≧０.９０であること；
・勾配が≧０.６０であること；
・逆算したＧＡ標準品の濃度が名目上の濃度の±３０％の範囲内にあること；
・ＧＡ試料の精度が変動係数（ＣＶ）２０％以下であること。

いくつかの態様において、陽性対照試料（例えば、ConAで刺激した細胞）の７５％において、ＧＡ誘発性応答が、同じ細胞を任意の濃度のＧＡで刺激したときに誘発される応答の最高値を超えていなければならない。いくつかの態様において、陰性対照試料（例えば対照ペプチド、例えばミエリン塩基性タンパク質、ＭＢＰで処理した細胞）の７５％におけるＧＡ誘発性応答が、任意の濃度のＧＡにより誘発される最も低い応答を下回っているか、それと同等でなければならない。

ＧＡ標準品ロット試料セットについて、線形回帰を行ってよく、ここで、データポイントを両対数目盛でプロットする。(後述ではＩＬ−２で示す、分析物の濃度を上昇させることによる)ＧＡ誘発性応答の対数値をＹ軸上に、ＧＡ標準品ロットの濃度（用量）の対数値をＸ軸上に示す。

上記のデータセットに対して用いる最適な線形回帰は次の通りである：
［式中、
であり、
である］。変数ＸおよびＹに、適当な表現を代入することにより、上述のモデルは次のようになる:

いくつかの態様において、試験ロット曲線の勾配が許容される限度内にあるとき、免疫学的同一性を確証する。試験ロット曲線の勾配の許容される限度は、次の一連の等式を用いた標準ロット曲線に基づいて決定する。

特定の対数（応答）について逆算した用量値は次の通りである:
正確度は次のように計算できる：
Y_lowおよびY_highは、±（平均＋２＊ＳＤ）の許容される最高の正確度により許容される、対数（応答）値の最低値および最高値であり、ここで、平均＋２＊ＳＤは、約９５％の個別許容域の最高限度である。
したがって、勾配が等しいという仮説が受け入れられる範囲は次の通りである：
β^＊は次のように算出される：
次いで、上記の領域を、許容されるβ^＊の限度を決定するために、次の範囲まで縮小する:
［式中、βはＧＡ−ＲＳ曲線の勾配である。］
したがって、ＧＡバッチの勾配であるβ^＊の許容される範囲は、次に示すように等式（６）により決定される：
β^＊が上述の許容される限度内にある場合、類似(parallelism)であると結論付けてよい。

いくつかの態様において、(アッセイ間の変動を説明するために)標準ロットの複数のアッセイを用いて、または(標準ロット間、例えば市販ＣＯＰの複数のロット間の変動を説明するために)複数の標準ロットのアッセイを用いて、較正曲線を作成する。例えばロット間の変動を説明するために、複数のデータセットを提供するために複数のＣＯＰ標準ロットがアッセイに含まれる態様において、標準勾配からの許容される変動の決定に、複数の標準ロットから得られるデータを用いる。これらの態様において、「複数用量反応曲線解析」に基づいて、試験ＧＡロットおよび標準ＧＡロットが免疫学的に同一であることを決定する。

例えば、アッセイ間の変動を説明するために、反復データを得るため、同じCopaxone標準ロットの複数の試料が該アッセイ中に含まれる態様において、標準勾配から許容される変動を決定するのに標準ロットの反復データを用いる。これらの態様において、試験ＧＡロットおよび標準ＧＡロットは、「反復標準用量反応曲線解析」に基づいて、免疫学的に同一であることを決定する。

いくつかの態様において、公知の特性、例えばＭＨＣ拘束性および非標準ペプチドに対する反応性を有する複数のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株をパネルに用いる。これらの態様において、該パネル中の各ＧＡ特異的なＴ細胞株を、１つの参照ＧＡロットまたは複数の参照ＧＡロット、および１種以上の試験ＧＡロットで刺激してよい。標準ＧＡロットと試験ＧＡロット間の免疫学的同一性を証明するためには、標準ロットについての用量反応曲線は、適当な判定基準、例えば上述したような基準を満たしていなければならず、ＧＡ試験ロットについての用量反応曲線は、本明細書に記載の許容される限度内でなければならない。

いくつかの態様において、単一のＧＡ特異的なＴ細胞株または複数のＧＡ特異的なＴ細胞株を、標準ＧＡロット、本明細書の他の箇所に記載するようにアミノ酸の一次組成を変化させる方法で合成した非標準ＧＡペプチドおよびＧＡの試験ロットにより刺激する。上述の方法を用いて、標準ペプチドについてのβ*に関する許容される限度ならびに非標準ペプチドの用量反応曲線により作成される勾配を決定してすることができる。試験ペプチドの勾配と、標準および非標準ペプチド両方の用量反応曲線の勾配が類似しているかどうかの統計学的な比較により、同時に、該試験ペプチドが類似しているかどうかの程度を決定することができる。この比較を用いて、ＧＡ試験ロットが免疫学的に同一であるかどうかを決定することができる。

ＧＡ応答バイオマーカーの特定
本発明の方法で測定するＧＡ誘発性応答で産生されるＧＡ応答バイオマーカーは、適当なＡＰＣの存在下においてＧＡで刺激した、ＧＡ特異的なＴ細胞培養物中で産生された、候補ＧＡ応答バイオマーカーの量を、適当なＡＰＣとともにインキュベーションしたが、抗原で刺激していない対照培養物または、陰性対照抗原で刺激した対照培養物で産生された同じバイオマーカーの量と比較することによって特定し得る。いくつかの態様において、ＧＡ応答バイオマーカーを、ＧＡ刺激後の対照に対する以下の倍率の上昇によって特定する：約１.５倍 (すなわち、応答が約５０％高い)〜約１０００倍、約１.５〜約２倍、約１.５〜約３倍、約１.５〜約４倍、約１.５〜約５倍、約１.５〜約６倍、約１.５〜約７倍、約１.５〜約８倍、約１.５〜約９倍、約２〜約３倍、約２〜約４倍、約２〜約５倍、約２〜約６倍、約２〜約７倍、約２〜約８倍、約２〜約９倍、約２〜約１０倍、約３〜約４倍、約３〜約５倍、約３〜約６倍、約３〜約７倍、約３〜約８倍、約３〜約９倍、約３〜約１０倍、約４〜約５倍、約４〜約６倍、約４〜約７倍、約４〜約８倍、約４〜約９倍、約４〜約１０倍、約５〜約６倍、約５〜約７倍、約５〜約８倍、約５〜約９倍、約５〜約１０倍、約６〜約７倍、約６〜約８倍、約６〜約９倍、約６〜約１０倍、約７〜約８倍、約７〜約９倍、約７〜約１０倍、約８〜約９倍、約８〜約１０倍、約１.５倍〜約８０倍、約１.５倍〜約７０倍、約１.５倍〜約６０倍、約１.５倍〜約５０倍、約１.５倍〜約４０倍、約１.５倍〜約３０倍、約１.５倍〜約２０倍、約２倍〜約８０倍、約１.５倍〜約７０倍、約１.５倍〜約６０倍、約１.５倍〜約５０倍、約１.５倍〜約４０倍、約１.５倍〜約３０倍、約１.５倍〜約２０倍、約２倍〜約８０倍、約２倍〜約７０倍、約２倍〜約６０倍、約２倍〜約５０倍、約２倍〜約４０倍、約２倍〜約３０倍、約２倍〜約２０倍、約３倍〜約８０倍、約３倍〜約７０倍、約３倍〜約６０倍、約３倍〜約５０倍、約３倍〜約４０倍、約３倍〜約３０倍、約３倍〜約２０倍、約５倍〜約８０倍、約５倍〜約７０倍、約５倍〜約６０倍、約５倍〜約５０倍、約５倍〜約４０倍、約５倍〜約３０倍、約３倍〜約２０倍、約１０倍〜約８０倍、約１０倍〜約６０倍、約１０倍〜約４０倍または約１０倍〜約２０倍、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２.５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３.５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４.５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍。

本明細書中に本発明の好ましい態様を示し、記載するが、該態様は例示のためにのみ記載するものであることは、当業者には明らかなことである。本発明から離れない限り、多数の変動、変化および置換が考えられる。本発明の実施の際に、本明細書に記載する本発明の態様に、種々の変更を加えてよいことは、理解されるべきことである。末尾の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、請求項の範囲内の方法および構造ならびにその等価物を網羅することを意図するものである。

方法
本明細書中の実施例において、とくにことわらない限り、次の方法を用いた。アッセイ試料は、３回重複して試験した。

１. ヒトＴ細胞株の調製および初回刺激
Good et al, およびOta, et al. (Good, et al., 1987; Ota, et al., 1990)に記載の方法を用いてＴ細胞株を単離した。ＰＢＭＣは、抗凝固剤としてクエン酸デキストロース（ＡＣＤ）を用いた白血球除去によって採取し、製造者(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)の指示書にしたがってFicoll-Paque勾配遠心分離により分離し、２％ヒト血清アルブミンおよび１０％ DMSOを含有するＰＢＳ中で凍結保存した。ＰＢＭＣ培養物をAIM V^{（登録商標）}培地(Invitrogen)またはX-VIVO 15^{（登録商標）}培地(Lonza)中で調製した。１日目に、抗原(ＧＭＡ, Mylan Pharmaceuticals, Inc.またはCopaxone, Teva Pharmaceuticals USA, Inc.)１０μg/mLを、５ｘ１０^５〜２ｘ１０^６個/mL (１ウェル２００μｌあたり１〜４ｘ１０^５個)の細胞を含むＵ字底９６ウェルプレートに添加した。該プレートを３７℃、６％ＣＯ_２下でインキュベーションした。３日目または４日目に、１０U/mL ＩＬ−２ (２U/ウェル、eBioscienceカタログ番号14-8029-63またはR&D Systems カタログ番号202-IL−010/CF) を添加した。ストックのＩＬ−２を培地中で４０U/mLに希釈し、希釈したストックＩＬ−２ (２U)を各ウェルに添加することによってＩＬ−２を調製した。ＩＬ−２を同量で６日目または７日目に再び添加し、細胞増殖の評価に基づいて、必要であれば１０日目またはその前後に再び添加した。

２. 増殖アッセイによる、ＧＡに対する反応性についてのヒトＴ細胞のスクリーニング
１２日〜１４日目に、ＡＰＣの存在下における増殖をアッセイすることによって、該細胞株を、ＧＡ刺激に対する反応性についての初回スクリーニングに付した。少なくとも全部で３回の再刺激（少なくとも約３１日以上）の後、確認アッセイを行った。

増殖は、発光方法(CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega, Madison, WI, カタログ番号G7571)を用いてＡＴＰ含量を測定すること、または、ＥＬＩＳＡ(Milliporeカタログ番号2752)によりＢｒｄＵ取り込みを測定することにより評価し、いずれの場合もキットの指示書にしたがった。分割されたウェルフォーマットを用いた。各ウェル中の細胞を再懸濁し、６５μlを２枚の新しいＵ字底９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに移し、複製プレートを作製した。初回スクリーニングのために、元の９６ウェルプレートにＡＰＣとして、マイトマイシン処理した自家性ＰＢＭＣおよび、１０μg/mL の抗原 (ＧＡ)を添加した。第一の複製プレートは、１００μL マイトマイシン処理ＰＢＭＣ (２ｘ１０^５)のみを加え、抗原は添加せず、第二の複製プレートには、１００μL マイトマイシン処理ＰＢＭＣおよび最終濃度１０μg/mLのＧＡを添加した。したがって、３つのプレートは全てに、細胞分裂を防ぐために、マイトマイシンＣで処理した自家性ＡＰＣ (ＰＢＭＣ)を加えた。各ウェル中の全体積は２００μLであった。後の２つのプレートを３日間、３７℃、６％ＣＯ_２下でインキュベーションした後、CellTiterGloまたはＢｒｄＵを添加し、シグナルを測定した。元の９６ウェルプレートには、増殖のために、１７日目にＩＬ−２を１０U/mL添加した。続くスクリーニングのために、マイトマイシン処理したＥＢＶ形質転換自家性Ｂ−ＬＣＬ (２ｘ１０^５〜５ｘ１０^５個/mL)をＡＰＣとして用いた。

対照（ＡＰＣ添加、抗原なし）プレートにおける相当するウェルと比較した、応答の上昇により、潜在的に抗原反応性であるウェルを特定した。抗原反応性であると特定した元のウェルは、典型的には、スクリーニングの７〜１０日後に２４ウェルに移し、下記のように、マイトマイシン処理自家性ＰＢＭＣの存在下で、ＧＡによって再刺激／増殖させた。

３. ＧＡ特異的なＴ細胞の増殖／再刺激
ＧＡ反応性についての初回スクリーニング時に、最初の刺激の細胞の１／３を含む、最初の複製プレートを再刺激／増殖させた。アッセイプレートを再刺激した約１２〜１４日目に、元プレート中の細胞株を１０μg/mL ＧＡ (初回刺激に用いたものと同じ製品) およびマイトマイシンＣ処理ＰＢＭＣで再刺激した。１０U/mLのＩＬ−２を約１７日目に添加した。初回スクリーニングの約７〜１２日後(約１９〜２６日目)に、陽性対照のウェルに相当する、元プレートのウェルを再度増殖／再刺激した。陽性と推定されるウェルの細胞を採取し、２４ウェル中で、初回刺激濃度 (１０μg/mL)のＧＡおよびマイトマイシン処理したＡＰＣを添加して培養した。ＡＰＣを２.５ｘ１０^６個／mL (ＰＢＭＣの場合)または５ｘ１０^５個／mL (Ｂ−ＬＣＬの場合)に調整した。Ｔ細胞を含む２４ウェルに、ＡＰＣ１ウェルあたり１mLを添加し、該プレートを２４時間、３７℃、６％ＣＯ_２下でインキュベーションした。特にことわらない限り、最終濃度１０U/mLのＩＬ−２を各ウェルに添加した。該培養を６〜１３日間続け、刺激を繰り返した。増殖させる間、Ｔ細胞を７〜１４日毎に刺激した。

本明細書に記載の手法で用いる培養容器の体積は次の通りである: ９６ウェルプレート１ウェルあたり２００μL;２４ウェルプレート１ウェルあたり２mL; １２ウェルプレート１ウェルあたり４mL; Ｔ−２５フラスコ１０mL; およびＴ−７５フラスコ２０mL。

４. ＧＡ特異性についてのＴ細胞株のスクリーニング
増殖アッセイ用に調製した培養物から培養培地を除き、サイトカイン産生の測定に用いた。殆どの場合、培養培地を、Ｔ細胞、ＡＰＣおよび刺激抗原を混合してから１８〜２４時間後に採取した。サイトカイン産生は、ＥＬＩＳＡまたはビーズアッセイにより測定した。サイトカイン産生の測定のために、培養培地１００〜１５０μL (培養を続ける場合は１００μL 、それ以外は１５０μL)を各ウェルからとった。場合によっては、該培養を４８時間継続して、全部で７２時間培養し、増殖応答を測定した。

ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ
培養上清中のＩＦＮ−γ濃度を、２つの抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。クローン２Ｇ１を捕捉に用い、クローンＢ１３３.５由来のビオチン化抗体を検出に用いた (ともにEndogenより入手)。組換えＩＦＮ−γを用いて、１０００〜１５pg/mLまでの標準曲線を作成した。

抗体をＰＢＳ中で１μg/mLに希釈し、希釈した抗体を１ウェルあたり１００μl添加することによって、ＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体でコートした。プレートを一晩４℃でインキュベーションした。被覆抗体を除き、ＰＢＳ−ＢＳＡ１００μlを全てのウェルに添加した。該プレートを１時間室温でインキュベーションした。標準曲線を作成した。ＰＢＳ−ＢＳＡ (１g ＢＳＡ/１００mL ＰＢＳ) で以下のように希釈した、ＰＢＳ−ＢＳＡ１mL中のストックＩＦＮ−γ (１００μg/mL；最終濃度１００ng/mL) １μlを用いて標準を調製した：
ａ. １００ng/mL ＩＦＮ−γを１０μl取り、ＰＢＳ−ＢＳＡ１mLに希釈する = １０００ pg/mL
ｂ. １０００pg/mL ５００μlを、ＰＢＳ−ＢＳＡ５００μlと混合する = ５００pg/mL
ｃ. ５００pg/mL ５００μlを、ＰＢＳ−ＢＳＡ５００μlと混合する= ２５０pg/mL
ｄ. ２５０pg/mL ５００μlを、ＰＢＳ−ＢＳＡ５００μlと混合する = １２５pg/mL
ｅ. １２５pg/mL ５００μlを、ＰＢＳ−ＢＳＡ５００μlと混合する= ６２.５pg/mL
ｆ. ６２.５pg/mL ５００μlを、ＰＢＳ−ＢＳＡ５００μlと混合する= ３１.２５pg/mL
ｇ. ３１.２５pg/mL ５００μlを、ＰＢＳ−ＢＳＡ５００μlと混合する = １５.６２５pg/mL。

ビオチン化抗体をＰＢＳ−ＢＳＡ中で０.５μg/mLに希釈した。各ウェルについて、抗体５μlをＰＢＳ−ＢＳＡ５mLに希釈した。ＰＢＳ−ＢＳＡとともにインキュベーションした後、該プレートをプレート洗浄液およびＰＢＳ０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を洗浄液として用いて４回洗浄した。ビオチン化抗体５０μlを、全てのウェルに添加した。試料および標準５０μlを、適当なウェルに添加した。標準および試料を、２組または３組重複して試験した。プレートを室温で９０分間インキュベーションした。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で１:１０,０００に希釈した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ１０mL中のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ１μlを各プレートについて用いた。該プレートを４回洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ１００μlを各ウェルに添加し、該プレートを室温で３０分間インキュベーションした。該プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。ＴＭＢ (３，３’，５，５”−テトラメチルベンジジン) １００μlを各ウェルに添加し、該プレートを室温で１５〜３０分間インキュベーションした。該反応を、ウェルごとに０.２ＮＮＨ_２ＳＯ_４１００μlを添加することにより停止し、６３０nmを標準として、該プレートを４５０で測定した。

用いた捕捉抗体は、モノクローナル抗ヒトＩＦＮ−γ (Endogenカタログ番号M-700A)であった。ビオチン化抗ＩＦＮ−γはEndogenカタログ番号M-701Bであった。ストレプトアビジンペルオキシダーゼは、Zymedカタログ番号43-4323であった。用いたＴＭＢはUltra TMB, Thermo Scientificカタログ番号34028であった。標準処方のＴＭＢを使用してもよい。

マルチプレックスアッセイ
複数のサイトカインの濃度をFlowCytoMix^TM kits (eBioscience, San Diego CA)を用いて同時に測定した。これは、抗サイトカイン抗体に結合したビーズからなる蛍光ビーズベースのアッセイである。各サイトカインに特異的なビーズは、サイズおよび６７０nmにおける蛍光によって区別する。各ビーズに結合したサイトカインは、５８５nmでの蛍光が試料中のサイトカイン濃度を反映するように抗体に結合した、フィコエリトリンを用いて検出する。２つのキットを用いて、異なるサイトカインパネルを測定した。該ＴＨ１/ＴＨ２キットは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)およびＴＮＦ−β (ＬＴ)を測定する。該ＴＨ１/ＴＨ２/ＴＨ９/ＴＨ１７/ＴＨ２２キットは、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２およびＴＮＦ−α (ＴＮＦ)を測定する。該キットはともに、製造者の指示書に従って用いた。

５. 抗原提示細胞の調製
凍結ＰＢＭＣを融解し、細胞濃度を、ＰＢＳ１mLあたり５ｘ１０^６個に調整することによりＡＰＣとして用いるＰＢＭＣを調製した。マイトマイシンＣ (Sigma-Aldrichカタログ番号M4287またはEMD Milliporeカタログ番号475820-10MG)を、最終濃度２５μg/mLで添加した。プレートを、３７℃で３０〜４５分間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、該マイトマイシンＣを除いた。該ＰＢＭＣ濃度を１〜１.５ｘ１０^６個/mLに調整した。

ヒトＢ細胞をＡＰＣとして用いるために、エプスタイン・バーウイルスを用いて不死化した。ＰＢＭＣを標準的な手法にしたがって融解し、細胞を１mLあたり１０^７個の濃度で懸濁した。不死化Ｂリンパ芽球様細胞株(Ｂ−ＬＣＬ)として用いるために、ＰＢＭＣのアリコートをエプスタイン・バーウイルス (ATCC VR-1492)に感染させた。感染は、Ｔ細胞の活性化および増殖を防ぐために、１０％ウシ胎仔血清および１μg/mL シクロスポリンＡ（シクロスポリン）を含有するRPMI 1640培地中で、ＰＢＭＣを、ウイルスとともに培養することにより行った。エプスタイン・バーウイルス (ATCC VR-1492) ２mlを、１５ml遠心管中の細胞２mLに添加し、水浴中で１時間、３７℃でインキュベーションした。培養培地 (１０％ウシ胎仔血清を含むRPMI 1640培地) ８mLおよびシクロスポリン (シクロスポリン１mgを１００％エタノール１mLおよびＴｗｅｅｎ８０１００μLに溶解し、ＰＢＳで体積を１０mLにすることにより調製した) １０μgを該細胞に添加し、混合物を２５cm^２フラスコに移した。該フラスコを直立状態で、３７℃インキュベーターで、５〜１０％ＣＯ_２下でインキュベーションし、該フラスコをで２〜６週間静置した。

培養２〜６週後に大きなリンパ芽球群が顕微鏡観察されると、形質転換が成功していると考えられた。この時点で、細胞濃度を約２ｘ１０^５〜１ｘ１０^６個／mLに維持することにより、該培養物を維持および増殖させた。これは、典型的には、細胞を３〜５日毎に１:４〜１:５に希釈することにより達成した。再刺激には、５ｘ１０^５個のマイトマイシン処理Ｂ−ＬＣＬまたはマイトマイシン処理自家性ＰＢＭＣを各ウェルに添加した。

Ｂ−ＬＣＬをＡＰＣとして用いたとき、マイトマイシンＣ５０μg/mLを２ｘ１０^６個／mLの細胞懸濁液に添加した。細胞をマイトマイシンＣとともに４５分間インキュベーションした後、過剰なマイトマイシンＣを除くために３回洗浄した。マイトマイシンＣを除くための洗浄後、細胞を２〜５ｘ１０^５個／mLに調整した。

６. ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞 (Ｂ−ＬＣＬ)の維持
上述のように、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をウイルスに感染させ、Ｔ細胞の活性化および増殖を防ぐために培地（RPMI 1640 １０％ウシ胎仔血清）にシクロスポリンを添加することにより、形質転換したＢ細胞を実験室内で樹立した。ＰＢＭＣの自家性ＥＢＶ-Ｂ細胞による刺激により、潜在的に、ウイルス特異的なＴ細胞株を生じさせる任意のＥＢＶ特異的Ｔ細胞が刺激される。そのため、ＥＢＶ−Ｂ細胞は、特にことわらない限り、初代培養または初期継代Ｔ細胞株とともに使用しなかった。ＥＢＶ−Ｂ細胞は、複数回継代したＴ細胞株の再刺激に使用し得る。

ＥＢＶ-Ｂ細胞は懸濁液中で増殖し、細胞の凝集塊を形成する傾向があるため、細胞濃度は２ｘ１０^５個/mL〜１０^６個/mLに維持された。３〜５日ごとに、細胞をピペッティングして細胞凝集塊を崩壊させ、該懸濁液の８０％を除くことにより、培養物を１:４〜１:５に分割した。同体積の新鮮な培地を加え、培養物をインキュベーションした。

７. ＭＨＣＤＲ拘束性試験
細胞株のＭＨＣＤＲ拘束性試験は、自家性ＡＰＣ(Ｂ−ＬＣＬ)を含む、試験した細胞株の元のＰＢＭＣドナーの、公知のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座に基づいて選択したＡＰＣアレイの存在下で、上述のように、細胞株の増殖応答を測定することにより行った。用いたドナーを表２に記載する。

ＧＡ特異的Ｔ細胞株への抗原提示に用いるＭＨＣ分子を規定するために、ＧＡ特異的応答を、自家性ＡＰＣの存在下および、Ｔ細胞ドナーのＨＬＡ−ＤＲアレルの１つに適合するＡＰＣの存在下で測定した。したがって、少なくとも３種のＡＰＣを各試験で用いた: 自家性ＡＰＣ；ＤＲアレル１に適合するがアレル２に適合しないＡＰＣ；およびアレル２に適合するがアレル１に適合しない第三のＡＰＣ。いくつかの試験において、第４のＡＰＣＢ−ＬＣＬを用いた。抗原なしの陰性対照を用いた。ＡＰＣは、５０μg/mLマイトマイシンＣとともにインキュベーションすることにより不活化した。不活化の後、細胞を３回洗浄してマイトマイシンＣを除き、細胞数１ｘ１０^６個/mLでX-VIVO 15培地中に懸濁した。該細胞懸濁液に、ＧＡを最終濃度２０〜６０μg/mLで添加した。抗原の取り込みおよび結合を可能にするために、該細胞を抗原とともに１時間３７℃でインキュベーションした。該細胞懸濁液を、遠心分離して細胞を沈殿化させ、該細胞ペレットを培地で１回洗浄した。ＡＰＣをX-VIVO 15培地１mLあたり２ｘ１０^５個に調整し、不透明な９６ウェルプレートに、各ウェルあたり１００μL添加した。（特にことわらない限り）１ウェルあたり２〜４ｘ１０^５個/mLのＴ細胞懸濁液１００μLを９６ウェルプレートに添加し、該培養物を４日間培養した後、CellTiter Glo（登録商標）を用いて (増殖を評価するために)細胞数を測定した。

あるいは、ＡＰＣをパルスしなかった。その代わりに、各ウェルは、１０μg/mL 抗原、ＡＰＣ５０μlおよびＴ細胞１００μLを含んでいた。

４日間３７℃(５％ＣＯ_２)でインキュベーションした後、１００μLを各ウェルからとり、１００μL CellTiterGlo反応剤と合わせ、発光をPackard Fusionを用いて測定した。結果は相対発光量(ＲＬＵ)で表される。

８. ドナーＨＬＡ分類
表２に示す、ドナーＨＬＡ分類を、米国組織適合性・免疫遺伝学会議(ＡＳＨＩ)および臨床検査改善修正法案(ＣＬＩＡ)の定める基準にしたがって、Puget Sound Blood Center (Seattle, WA)が行った。ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩアレルの割当てには、ポリメラーゼ連鎖増幅ベースの試験を用いた。

９. 凍結保存細胞の融解
バイアルを３７℃水浴に浸し、２〜３分間振盪することによって、凍結保存細胞を融解した。細胞懸濁液が完全に液体になると、すぐに、温かいX-VIVO 15培地１０mLを含む１５mL遠心管に移した。該遠心管を優しく２〜３回反転して混合した。該懸濁液のアリコート５０μLを取って細胞数を数え、残りの懸濁液を２００ｘgで１０分間遠心分離し、細胞を沈殿化させた。培地をデカンテーションによって除き、該細胞ペレットを所望の細胞濃度でX-VIVO 15培地に再懸濁した。

１０. 試薬
ＧＡ製品は、それぞれ、マンニトール(４０mg/mL)で２０mg/mLに希釈したCopaxone (ＣＯＰ, Teva Pharmaceuticals USA, Inc.)またはＧＭＡ (Mylan Pharmaceuticals, Inc.) であった。ペプチド０２６を、合成の最初の５分間チロシンを保留することによって製造した。破傷風トキソイドはAstarte Biologicsより供給された。SternペプチドはStern, et al., 2005“Peptide 15-mers of defined sequence that substitute for random amino acid copolymers in amelioration of experimental autoimmune encephalomyelitis”Proc. Nat. Acad. Sci. 102:1620-1625)に記載されている。

実施例Ｉ. ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の作製
ヒトＴ細胞株を、ＧＡに暴露されたことがない複数の異なるドナーからそれぞれ上述のように得られ、ＧＡに特異的に応答することが示されているＰＢＭＣから作製した。,本明細書に記載の試験に用いたドナーの特性を表２にまとめる。

本明細書に記載の方法にしたがって、これらのドナー由来のＰＢＭＣを、ＧＭＡまたはCopaxoneの存在下で培養することによって、６０を超えるＧＡ反応性のＴ細胞株を作製した。表３にこれらの細胞株のドナーおよび用いた刺激抗原を記載しており、該細胞株は、増殖アッセイに基づいてＧＡ反応性を有することが示されており、増殖またはサイトカイン産生アッセイまたはその両方に基づいてＧＡ特異性を有することが示されている。

ドナー１: ＧＭＡで最初に刺激した細胞株
ＧＭＡ応答性の細胞株を上述のように、ドナー１ＰＢＭＣより得た(２ｘ１０^５個/ウェル、すなわち、１ｘ１０⁶個/mL；１０μg/mL ＧＭＡとともに播種; ３日目および7日目にＩＬ−２添加)。１２日目に開始したスプリットウェルアッセイでは、１０μg/mL ＧＭＡおよびＡＰＣとしての１ｘ１０^５個のマイトマイシン処理ＰＢＭＣで細胞を刺激した。ＢｒｄＵを３日目に添加し、細胞を４.５時間インキュベーションして固定し、取り込みを測定した。表４は、ドナー１ＰＢＭＣから得た８種のＧＡ特異的と推定されるヒトＴ細胞株について測定した増殖性応答を示す。これらの細胞株はそれぞれ、対照（抗原なし）と比較して、シグナルが少なくとも５０％上昇した。

２４日目に、表４に記載の、８種のＧＡ特異的と推定されるヒトＴ細胞株に相当するウェルから、細胞を２４ウェルプレートに移し、１０μg/mL ＧＭＡおよび、ＡＰＣとしてマイトマイシン処理自家性ＰＢＭＣ (３ｘ１０^６個/ウェル、すなわち１.５ｘ１０^６個/mL)で刺激することにより増殖させた。３２日目に、８種の細胞株のうちの４種、２２２−ＢＡ１１、２２２−ＢＣ１１、２２２−ＡＧ１１および２２２−ＡＧ１２を、０、１、１０および１００μg/mL ＧＭＡで刺激し、再び自家性ＰＢＭＣをＡＰＣとして用いた(２ｘ１０^５個/ウェル、すなわち、１ｘ１０^６個/mL)ＡＴＰアッセイを用いて、ＧＭＡに対する増殖応答について９６ウェルプレートで試験した。１０μg/mL ＧＭＡで刺激した細胞では、対照と比較して最も増殖性の高い応答が観察された。図２ＡおよびＢは、３５日目に、２２２−ＡＧ１２、２２２−ＢＣ１１、２２２−ＡＧ１１および２２２−ＢＡ１１を用いて行ったＡＴＰ増殖アッセイの結果を示す (対照= 抗原なし)。図３Ａ〜Ｃは、種々の濃度のＧＭＡまたはCopaxoneで刺激した後に、細胞株２２２−ＢＡ１１、２２２−ＢＣ１１および２２２−ＡＧ１２を用いて行ったＡＴＰ増殖アッセイの結果を比較している。

ＧＭＡで刺激したドナー１ヒトＴ細胞株によるサイトカイン産生
３２日目で凍結させた２２２−ＡＧ１１および２２２−ＡＧ１２のバイアルを融解し、該細胞をサイトカイン産生について試験した。該細胞株を、自家性ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬまたは１つのアレルが適合するドナー由来のＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬ (ドナー２Ｂ−ＬＣＬ)のいずれかの存在下で、１０μg/mL ＧＭＡ、１０μg/mL Copaxoneまたは１μg/mL 破傷風トキソイド (対照抗原)で刺激した。ＡＰＣを添加したが、抗体を添加していない対照試料を含んでいた。培養培地を２４時間後に採取し、ＩＦＮ−γについて上述のようにＥＬＩＳＡによりアッセイを行った。図４ＡおよびＢは、細胞株２２２−ＡＧ１１および２２２−ＡＧ１２によって産生されたＩＦＮ−γを表す。

ドナー１: Copaxoneで最初に刺激した細胞株
ＣＯＰ応答性のＴ細胞株をドナー１より得た。初回刺激時に、単離ＰＢＭＣを、１ウェルあたり１ｘ１０^５個(５ｘ１０^５個/mL) で、１０μg/mL Copaxoneとともに播種し、上述のように培養した。培養４日目および７日目に、ＩＬ−２を全てのウェルに添加し、１４日目に、スプリットウェルフォーマットで発光性増殖アッセイを用いて、該ウェルを反応性についてスクリーニングした。元プレートを再刺激し、再刺激の４日後にＩＬ−２を添加した。表５は、１５種類のドナー１ＣＯＰＴ細胞株についての増殖アッセイの結果を示す（対照の少なくとも２倍のシグナルを産生）。

ＣＯＰによる初回刺激によってドナー１から作製したＴ細胞株２２２−２Ｄ８は、少なくとも２回の試験において、ＧＭＡおよびＣＯＰによる再刺激後、同程度に増殖することが示されている。表６は、３または１０μg/mLのＧＭＡまたはＣＯＰで刺激した後、培養５６日目に行ったＡＴＰ増殖アッセイの結果を示す。ＡＴＰレベルを、刺激の４８時間後に測定した。ＧＭＡシリーズにおける対照は抗原なしの対照であり、ＣＯＰシリーズにおける対照はＭＢＰであった。このアッセイにおいて、用量１０μg/mLにおいて、ＧＭＡに対する応答は、ＣＯＰと比較して１０３.４％であった。

培養５６日目に、１、３または１０μg/mLのＧＭＡまたはＣＯＰによる刺激後行った、２回目のＡＴＰ増殖アッセイにおいて、１０μg/mLの用量のＧＭＡに対する応答は、ＣＯＰと比較して１０７.１％であった。結果を表７に示す。

ドナー２２２から、ＣＯＰによる初回刺激により作製したＴ細胞株２２２−２Ｄ８は、少なくとも２つの試験において、ＧＭＡおよびＣＯＰによる再刺激の後、同程度に増殖することが示された。表８は、培養５６日目に、３または１０μg/mLのＧＭＡまたはＣＯＰにより刺激した後、行ったＡＴＰ増殖アッセイの結果を示す。ＧＭＡシリーズの対照は、抗原なしの対照であり、ＣＯＰシリーズにおける対照はＭＢＰであった。１０μg/mLの用量における、ＧＭＡに対する応答は、ＣＯＰに対して８５.１％であった。

培養５６日目に、全部で６回の刺激の後、細胞株２２２−２Ｆ１２を、ＧＡおよび一連の非標準ペプチドによる刺激に応答した増殖についてアッセイした。該アッセイのために、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、０、３、１０または３０μg/mLの、ＧＬ１４、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ１１１およびＧＡＴ６３１、ＣＯＰおよびＧＭＡの各ペプチドを、１ｘ１０^５個/mLのＴ細胞株に添加した。増殖を発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。細胞株２２２−２Ｆ１２は、３μg/mLのＧＬ１４には応答したが、試験した他の非標準ＧＡペプチドには応答しなかった。このアッセイにおいて、１０μg/mLの用量における、ＧＭＡに対する応答は、ＣＯＰと比較して９９.４％であった。データは表９に示す。

Copaxoneで刺激したドナー１ヒト細胞株によるサイトカイン産生
観察されたＡＴＰレベルの上昇（すなわち、抗原を含むウェルにおける相対的な発光の、２つ以上の、抗原を含まない対照ウェルに対する比率）に基づいて、２６日目に、元プレートの１５種類のＧＡ特異的と推定されるＴ細胞株を２４ウェルに移し、自家性ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬ (５ｘ１０^５個/ウェル、すなわち２.５ｘ１０^５個/mL)の存在下で、１０μg/mL Copaxoneにより再刺激した。２７日目にＩＬ−２を添加した。３４日目に、推定される１５種類の細胞株を、マイトマイシン処理した自家性Ｂ−ＬＣＬ (４ｘ１０^４個/ウェル; ２ｘ１０^５個/mL)の存在下で１０μg/mL ＧＭＡまたは１０μg/mL ＣＯＰで再刺激するか、または、抗原なしで、マイトマイシン処理した自家性Ｂ−ＬＣＬとともにインキュベーションした。３５日目に、培養を継続している培養物にＩＬ−２を添加した。３６日目に、培養上清を試験培養物から採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ産生を測定した(再刺激の４８時間後)。結果を表１０に示す。ＩＦＮ−γタンパク質濃度を、ＴＭＢ標準曲線を用いて決定した。

少なくとも７種類のドナー１ＣＯＰＴ細胞株２２２−２Ｄ８、２２２−２Ｅ１、２２２−２Ｂ１１、２２２−２Ｃ３、２２２−２Ｂ８、２２２−２Ｇ１２および２２２−２Ｆ１２は、ＧＡに応答してＩＦＮ−γを産生し、該細胞株はCopaxoneおよびＧＭＡの両方に反応した。

２２２−２Ｄ８、２２２−１Ｈ１２、２２２−１Ｃ５および２２２−２Ｄ２の３４日目の上清をまた、３回重複して、ＧＭＡ、ＣＯＰまたは抗原なし (対照として)に対するＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β分泌について、免疫蛍光ビーズアッセイ(FlowCytoMix^TM kit)によって試験した。ＩＬ−４、ＩＬ−６またはＩＬ−１２は、殆どまたは全く検出されなかった。表１１は、細胞株２２２−２Ｄ８および２２２−１Ｈ１２について得られたサイトカイン分泌プロファイルを示す。表１２は、細胞株２２２−１Ｃ５および２２２−２Ｄ２について得られたサイトカイン分泌プロファイルを示す。表１２において、Ｔ細胞株１Ｈ１２の上清の用量設定により、この細胞株がＧＭＡおよびＣＯＰの両方に応答して、インターフェロンも産生することが示されたことは、重要なことである。

該培養物を、４６、５６、６７および７５日目に再刺激した。５６日目に、細胞株２２２−２Ｄ８、２２２−１Ｈ１２、２２２−２Ｆ１２、２２２−２Ｂ８、２２２−１Ｃ５、２２２−２Ｂ１１および２２２−２Ｅ１を再び、増殖アッセイによって、１、３または１０μg/mLのＧＭＡまたはＣＯＰによる刺激に対する反応性について試験した。刺激の４８時間後に、７種類全ての細胞株においてＡＴＰレベルを測定した(結果は５Ａ〜Ｇに示す)。ＧＭＡシリーズにおける対照は、抗体なしの対照であり、ＣＯＰシリーズにおける対照は、ＭＢＰであった。

５６日目の再刺激の２４時間後に採取した４つの培養上清 (２２２−２Ｂ８、２２２−１Ｃ５、２２２−２Ｂ１１および２２２−２Ｅ１由来) を、ビーズベースのマルチプレックスアッセイを用いてサイトカインについてアッセイした(結果は表１３〜１６に示す)。全てのサイトカイン値は、３回重複して得た値の平均値（pg/mL）を示す。増殖アッセイおよびサイトカインアッセイの両方において、該細胞株は、ＧＭＡおよびＣＯＰ刺激の両方に対する反応性を示した。以前に、ＧＡに対する刺激に応答してＩＦＮ−γを産生しないことが特定されていた細胞株１Ｃ５は、ＩＦＮ−γを産生するための上清を適当に希釈した後では、ＧＭＡおよびＣＯＰの両方に応答して、同等の量のＩＦＮ−γを産生することが見出された (表１４参照)。

細胞株２２２−２Ｄ８、２２２−１Ｈ１２および２２２−２Ｆ１２を、４８時間後（５６日目、６回目の刺激後）に、免疫蛍光ビーズアッセイによって、サイトカイン分泌についてさらにアッセイした (結果は図６Ａ〜Ｆに示す)。自家性ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬの存在下で、１、３または１０μg/mLのＧＭＡまたは１、３もしくは１０μg/mLのＣＯＰならびに抗原なしの対照およびＭＢＰ対照による刺激に対する、ＩＬ−１２p７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α (ＴＮＦ)およびＴＮＦ−β (ＬＴ) の分泌を測定した。図６Ａ、ＣおよびＥは、３種類の濃度のＧＭＡに応答した３種類のドナー１Ｔ細胞株によるサイトカイン分泌を示し、図６Ｂ、ＤおよびＦは、３種類の濃度のＣＯＰに対するサイトカイン分泌を示す。矢印は、各サイトカインデータセットの最初の棒グラフ、即ち対照試料の位置を示し、右側に向かって、順番に１μg/mL ＧＡ、３μg/mL ＧＡ、１０μg/mL ＧＡおよびＭＢＰで処理した細胞における分泌レベルを示す。３種類の細胞株は、それぞれ、異なるサイトカイン分泌プロファイルを示した。１０μg/mL ＧＡで処理した細胞株（各セットの左から４番目の棒グラフ）が最も高いサイトカインレベルを産生した。

ドナー２: ＧＭＡで刺激した細胞株
ＰＢＭＣを、ＭＨＣクラスＩＩＨＬＡ−ＤＲβ１０４:０１、０４:０４を有する、正常かつ健常な６３歳の女性ドナーより得た(ドナー２)。単離したＰＢＭＣを０日目に、AIM V培地中で、２ｘ１０^５個/ウェル(１ｘ１０^６個/mL)で１００μg/mL ＧＭＡとともに培養し、方法の欄に記載したように培養した。１３日目に、マイトマイシン処理した自家性ＰＢＭＣをＡＰＣとして用いて、１００μg/mL ＧＭＡで刺激した後に、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを用いて該培養物を増殖についてスクリーニングした。ＧＡ刺激試験試料ののＯＤの、刺激しない対照試料と比較した、少なくとも５０％上昇に基づいて、９種類のＧＡ特異的と推定されるヒトＴ細胞株を、増殖およびさらなる解析用に選択した。表１７は、ドナー２ＰＢＭＣより得られた９種類のＧＡ特異的と推定されるヒトＴ細胞株のＢｒｄＵ増殖データを示す。これらのＴ細胞株全てについて、ＢｒｄＵ取り込みの対照との差が２倍を超えていたことは特記すべきことである。

これらの推定されるドナー２Ｔ細胞株を、１０μg/mL ＧＭＡおよびマイトマイシン処理した自家性ＰＢＭＣによる刺激、およびそれより後で、自家性ＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬによる刺激により増殖させた。細胞株２０６−１Ａ７をX-VIVO 15培地に移し替えた。８８日目に、細胞株２０６−１Ａ７を、Ｂ−ＬＣＬおよび、１０μg/mL ＧＭＡまたは１μg/mL 破傷風トキソイド (ＴＴ)により刺激した。４日後に、該培養物をＡＴＰアッセイにより増殖について試験し、ＥＬＩＳＡにより上清を、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α分泌について試験した。図７Ａは、記載するように、０〜１００μg/mLの範囲の濃度のＧＭＡによる刺激に対する、Ｔ細胞株２０６−１Ａ７の増殖を示す。図７Ｂは、細胞株２０６−１Ａ７によるＩＦＮ−γ分泌を示す。両方の試験において、該濃度０の対照は、ＧＭＡを含まない。図７ＡおよびＢにおける、薄灰色の濃度０の棒グラフは、１μg/mL ＴＴで処理した試料を示す。ＴＮＦ−αは検出されなかった。この細胞株は、細菌汚染の影響を受けていなかった。

ドナー３: ＧＭＡで刺激した細胞株
ＭＨＣクラスＩＩＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１５、^＊１１を有する、正常かつ健常な５２歳の男性ドナーであるドナー３よりＰＢＭＣを得た。培養物を、Ｕ字底９６ウェルプレート中、１ｘ１０^５個/ウェル(１ｘ１０^６個/mL)で、１０μg/mL ＧＭＡにより刺激した。３日目および７日目にＩＬ−２を添加し、培養物を２ｘ１０^４個/ウェルの自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、１０μg/mL ＧＭＡにより再刺激し、ＡＴＰ増殖アッセイによりスクリーニングした。アッセイデータ(表１８)に基づいて、１４種類のＧＡ特異的と推定されるＴ細胞株を選択して、２４日目に２４ウェルプレートで増殖させた。２５日目にＩＬ−２を添加した。

これらの細胞株について、ＧＭＡ:対照(ＡＰＣのみ)に対する増殖の比率が、３.０を上回っていた。３２日目に、これらの細胞株を、１〜２.５ｘ１０^５個/mLで、２.５ｘ１０^５個の自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、１０μg/mL ＧＭＡにより再刺激し、増殖アッセイにより再スクリーニングした。該アッセイのために、１０μg/mL ＧＭＡ、１０μg/mL ＣＯＰ、または１μg/mL 破傷風トキソイド (対照として) による刺激を試験した。試験した８種類の細胞株は全て、ＧＭＡおよびＣＯＰに対して応答性であった (表１９)。

異なる濃度のＧＭＡで刺激したドナー３ヒトＴ細胞株によるサイトカイン産生
該細胞株のうち６種類の培養培地をサイトカインマルチプレックスアッセイで試験し、反応性を確認し、ＩＬ−１３、ＩＬ−２２、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γが産生されていることを明らかにした (表２０)。

３３日目に、該細胞株をＴ-２５フラスコに加えて増殖させた(体積１０mL、１０U ＩＬ−２/mLを含む)。４０日目に、１、３もしくは１０μg/mLのＧＭＡまたはＣＯＰ、または対照として１０μg/mLのＭＢＰを用いて、１２種類の細胞株を、反応性について再び試験した。１２種の細胞株のうち１１種類 (Ｆ２Ｇ以外全て) は両方の抗原製品に対して応答性であった。結果を表２１に示す。

ドナー３: ＣＯＰで刺激した細胞株
初回刺激時、０日目に、単離されたＰＢＭＣを、細胞数２ｘ１０^５個/ウェル(１ｘ１０^６個/mL)で、AIM V培地中に１００μg/mL ＣＯＰとともに播種し、方法の欄に上述するとおりに培養した。同様に、０日目に、ＰＢＭＣを、細胞数２ｘ１０^５個/ウェルで、AIM V培地中に１００μg/mL ＧＭＡとともに播種した。該培養物を、マイトマイシン処理した自家性ＡＰＣの存在下で、１００μg/mLのそれぞれの抗原(ＣＯＰまたはＧＭＡ) で刺激し、１３日目に、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを用いて増殖についてスクリーニングした。試験した細胞株のうち、ＧＡ特異的な反応性を示すものはなかった。ＧＡの添加後、有意な細胞損失が観察され、このことは、ＧＡ濃度をより低くして用いることを示唆するものである。ＧＡ用量設定試験により、１００μg/mLのＧＡよりも、１０および３０μg/mLのＧＡにおいて、増殖およびサイトカイン応答が上昇することが示された。

０日目に、X VIVO-15培地中に、細胞数１ｘ１０^５個/ウェルで、１０μg/mL ＣＯＰとともにＰＢＭＣを播種することにより、ＣＯＰ応答性であると推測されたＴ細胞株の第二のセットを作製した。３日目および７日目に、ＩＬ−２を２U/ウェル添加し、１４日目に、スプリットウェルアッセイにより、培養物を増殖についてスクリーニングした。ＡＰＣとして、２ｘ１０^４個の自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、該細胞株を１０μg/mL ＣＯＰにより再刺激し（１回目の再刺激）、発光性ＡＴＰアッセイを用いて増殖を測定した。ＣＯＰによる刺激後の増殖の、ＡＰＣ対照に対する増殖に対する比率が３.０を上回っていた場合、１４個のウェルを、増殖させるために選択した (表２２)。

２４日目に、表２２に記載の細胞株の、継続していた培養物を２４ウェルプレートに加えて増殖させ (２ mL/ウェル)、２回目の再刺激時に、５ｘ１０^４個の自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、１０μg/mL ＣＯＰにより再刺激した。２５日目に、１０U/mLのＩＬ−２を添加した。３２日目に、発光性ＡＴＰ増殖アッセイによる、確認のための増殖試験のために、該細胞株のうちの６種類のそれぞれ由来の２〜５x１０^５個のＴ細胞株を、１０μg/mL ＣＯＰまたは破傷風トキソイドにより再刺激した。６種類の細胞株は全て、ＣＯＰおよびＧＭＡの両方に対する反応性を示した (表２３)。

３２日目に、アッセイした培養物に対応する、継続していた培養物も再刺激し、３３日目に、７種類の細胞株(１６５−Ｂ６Ｃ、１６５−Ｂ１０Ｃ、１６５−Ｄ１１Ｃ、１６５−Ｆ６Ｃ、１６５−Ｄ３Ｃ、１６５−Ｅ３Ｃおよび１６５−Ｆ３Ｃ)を、Ｔ−２５フラスコに移して増殖させた (全体積１０mL、１０U/mL ＩＬ−２)。残り７種類は、さらに２日間２４ウェルプレート中で静置した後に、フラスコに移して増殖させた。２４ウェルプレート中の細胞株のうちの４種類 (１６５−Ｆ４Ｃ、１６５−Ｃ９Ｃ、１６５−Ｅ９Ｃおよび１６５−Ｆ９Ｃ) を失った。３９日目に、２４ウェルプレート中の細胞株の３種類 (１６５−Ｄ２Ｃ、１６５−Ｃ７Ｃおよび１６５−Ｃ４Ｃ) を、再び、ＡＴＰ増殖アッセイにより、(全て、ＡＰＣとして５ｘ１０^４個の自家性のマイトマイシン処理Ｂ−ＬＣＬの存在下で)３種類の濃度のＣＯＰおよびＧＭＡに対する反応性について試験し、抗原なしの対照およびＭＢＰ対照を含んでいた。３種類全ての細胞株が、ＣＯＰおよびＧＭＡに対して同程度に応答した (表２５)。４０日目に、３９日目に４回目の再刺激を行った後に、アッセイした細胞株に相当する継続していた培養物を、上述のように２４ウェルからＴ-２５フラスコに移して、ＩＬ−２とともに増殖させた。

７種類のドナー３ＣＯＰ細胞株を、培養４６日目に試験した。該細胞株を、（全て、５ｘ１０^４個の自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で）３種類の濃度のＣＯＰおよびＧＭＡを用いて再刺激し、上述のように、抗原なしの対照およびＭＢＰ対照を含んでいた。ＡＴＰアッセイにより増殖を３日後に測定した。結果を次の表２６に示す。

４６日目に、継続していた細胞株培養物を１２ウェルプレートに、体積４mL/ウェルで移して(各ウェルは１ｘ１０^６個のT細胞、１ｘ１０^６個のＡＰＣを、１０μg/mL ＣＯＰとともに含む)、増殖させることにより再刺激した（該細胞株の５回目の再刺激）。残りの細胞を凍結保存した。４７日目に、該１２ウェルプレートの各ウェルより採取した細胞培養物をT-７５フラスコに移して増殖させた(２０mL、１０U/mL ＩＬ−２)。５３日目に、２４ウェルプレート（各ウェルは５ｘ１０^５個のＴ細胞および５ｘ１０^５個のＡＰＣを、１０μg/mL ＣＯＰとともに含む）に移して増殖させることにより６回目の再刺激を行い、残りの細胞を凍結保存させた。５４日目に、２４ウェルプレートの各ウェルから採取した細胞培養物を、上述のようにT-７５フラスコに移して増殖させた。６０日目に、２４ウェルプレート (各ウェルは、５ｘ１０^５個のＴ細胞、５ｘ１０^５個のＡＰＣを１０μg/mL ＣＯＰとともに含む)に移して増殖させることにより７回目の再刺激を行い、残りの細胞を凍結保存した。６１日目に、該２４ウェルプレートの各ウェルから得た細胞培養物をT-２５フラスコに移して増殖させた。全部で７回の再刺激/増殖の後、６７日目に、これらの細胞を採取して凍結保存した。

ドナー４: Copaxoneで刺激した細胞株
ＰＢＭＣを、ＭＨＣクラスＩＩＤＲβ１^＊０７、１３を有する、正常で健常な２１歳の男性ドナーより得た(ドナー４)。抗凝固剤としてＡＣＤを用いた白血球除去によりＰＢＭＣを採取し、Ficoll-Paque勾配遠心分離により分離した。

１０μg/mL ＣＯＰを含むX-VIVO 15培地中で、９６ウェル中、細胞数１ｘ１０^５個/ウェル (５ｘ１０^５個/mL)で培養を開始し、方法の欄に記載する通りに培養した。培養３日目および６日目に、１０U/mLのＩＬ−２を添加した。２ｘ１０^５個/ウェル(１ｘ１０^６個/mL)のマイトマイシン処理した自家性ＰＢＭＣの存在下における、１０μg/mL ＣＯＰによる再刺激後、１３日目に、発光性ＡＴＰアッセイにより増殖について該培養物をスクリーニングした。２以上のＡＴＰ比率（ＣＯＰ刺激：刺激なしの対照）に基づいて、１５ウェルについて、応答性と推定されるスコアを得た (表２７)。

ＣＯＰによる初回刺激によりドナー２０５から作製したＴ細胞株２０５−１Ｆ４は、少なくとも２つの試験において、ＧＭＡおよびＣＯＰによる再刺激後、同様に増殖することが示された。

表２８は、培養５０日目、４回の刺激後にアッセイした、２０５−１Ｆ４のＧＭＡおよびＣＯＰに対する反応性を示す。該細胞株を、自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、３種類の濃度のＣＯＰおよびＧＭＡを用いて再刺激し、抗原なしの対照も含んでいた。増殖を発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。このアッセイにおいて、１０μg/mLの用量におけるＣＯＰと比較したＧＭＡに対する応答は１０２.７％であった。

表２９は、４回の再刺激後、培養５８日目にアッセイした、２０５−１Ｆ４のＧＭＡおよびＣＯＰに対する反応性を示す。自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下、４種類の濃度のＣＯＰおよびＧＭＡを用いて該細胞株を再刺激し、抗原なしの対照を含んでいた。増殖は、発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。このアッセイにおいて、用量１０μg/mLにおける、ＧＭＡに対する応答は、ＣＯＰと比較して９８.５％であった。

全部で６回の刺激（５回の再刺激）の後、培養５９日目に、細胞株２０５−１Ｈ７および２０５−１Ｈ１１を再刺激した。細胞株２０５−１Ｈ７および２０５−１Ｈ１１の、広範囲の抗原濃度に対する増殖応答を、発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。各培養物からＴ細胞を採取し、洗浄して、プレートに、体積１００μLで、細胞数２０,０００個/ウェルで添加した。全ての条件を３つ重複して試験した。４日間３７℃、６％ＣＯ_２下でインキュベーションした後、各ウェルから培地１００μLをとり、各ウェルにCellTiterGlo（登録商標）１００μLを添加した。結果を表３０および３１に示す。

ＣＯＰで再刺激したドナー４ヒトＴ細胞株によるサイトカイン産生
２３日目に、陽性の細胞(表２７記載の細胞株)を２４ウェルプレートに移し、マイトマイシン処理した自家性ＰＢＭＣの存在下で１０μg/mL ＣＯＰで再刺激した。ＩＬ−２を２４日目に添加した。３１日目 (４回の再刺激後)に、１０種類の細胞株を、１０μg/mL ＣＯＰにより再刺激し、サイトカイン分泌アッセイにより、抗原反応性を確認した。Ｔ細胞を、X-VIVO 15培地中、細胞数２ｘ１０^４個/ウェルで９６ウェルプレートに添加した。マイトマイシン処理した自家性ＰＢＭＣ (２ｘ１０^５個/ウェル、すなわち１ｘ１０^６個/mL)の存在下で、各細胞株を個別に１０μg/mL ＧＭＡおよび１０μg/mL ＣＯＰで刺激した。２０〜２４時間のサイトカインアッセイ(FlowCytomixマルチプレックスビーズアッセイ)の後、培養培地を採取した。３回重複して、該上清を、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの分泌について試験した。表３２および３３は、得られたサイトカイン分泌プロファイルを示す。試験した細胞株は殆どが、ＧＭＡおよびＣＯＰの両方に応答して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５およびＴＮＦ−αを分泌した。ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＬ−４の分泌は、細胞によって異なった。また、全ての試料がＩＬ−８を分泌した (データは示さない)。

２種類のドナー４細胞株のそれぞれ由来の培養培地を、サイトカインの拡張パネルについてもアッセイし、それによりＩＬ−１３およびＩＬ−２２を分泌することが示された (

ドナー６: ＧＭＡで刺激した細胞株
ＰＢＭＣを、ＭＨＣクラスＩＩＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１３、^＊１５:０１を有する、正常かつ健常な４９歳の女性ドナーより得た(ドナー６)。抗凝固剤としてＡＣＤを用いた白血球除去によりＰＢＭＣを採取し、Ficoll-Paque勾配遠心分離により分離した。

標準的な方法により調整したＧＡのロットである、ＧＭＡ/００１/０１４ (ロット００１) １０μg/mLを含むX-VIVO 15培地中で、９６ウェルプレート中、細胞数１ｘ１０^５個/ウェル (５ｘ１０^５個/mL)で培養を開始した。細胞を、方法の欄に記載した通りに培養した。培養３日目および８日目にＩＬ−２を１０U/mLで添加した。１６日目に、発光性ＡＴＰアッセイにより、該培養物を増殖についてスクリーニングし、２ｘ１０^４個/ウェル(１ｘ１０^５個/mL)のマイトマイシン処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、１０μg/mL ＧＭＡ/００１/０１４ (ロット００１)により再刺激した。２以上のＡＴＰ比率(ＣＯＰ刺激:刺激なしの対照)に基づいて、１４個のウェルにおいて、応答性と推定されるスコアを得た。

２６日目に、１４種類のＴ細胞培養物を再刺激し（２回目の再刺激）、２８日目に１０U/ml ＩＬ−２中で増殖させた。３５日目に、１４種類の培養物全てを再刺激し (３回目の再刺激)、１３種類を、ＧＭＡロット００１、ＣＯＰ、破傷風トキソイドの存在下、または抗原を加えない対照で、増殖についてアッセイした。

表３４は、該増殖アッセイの結果を示す。

実施例ＩＩ. 非標準ＧＡペプチドに対する反応性に基づく、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定
上述の通りに特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、一連の非標準ＧＡペプチド（表１に記載）に対する反応性を試験した。非標準ＧＡペプチドに対して反応性であると特定されたＧＡ特異的なＴ細胞株を次の表３５に示す。これらの細胞株は、少なくとも５回のＧＡ再刺激/増殖後に、非標準ペプチドで刺激した後に、対照に対して、増殖が少なくとも５０％上昇することに基づいて特定を行った。各細胞株は、以前に、少なくとも２回およびそれ以上、ＧＡに対する反応性について試験されている。記載するように、特定の細胞株はＧＡおよび非標準ペプチドに同程度に応答した。

ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のペプチド０２６に対する反応性
ペプチド０２６は、チロシン、グルタミン酸、アラニンおよびリジンからなり、ＧＡ合成の最初の５分間チロシンを保留することにより作製される、改変ＧＡペプチドである。

ドナー３および４由来のＴ細胞株を、ペプチド０２６に対する反応性について試験した。表３５にまとめるように、少なくとも４種類のドナー３および２種類のドナー４Ｔ細胞株は、ペプチド０２６に対する反応性を示した。１種類のドナー４Ｔ細胞株は、ＧＡによる刺激後に観察されるのと同程度の反応性をペプチド０２６に対して示した。

ドナー３ＧＡ特異的なＴ細胞株: ペプチド０２６
培養５４日目に、７種類のドナー３ＣＯＰＴ細胞株を、ペプチド０２６ (２０mg/mLマンニトールを含有する水中に溶解)に対する反応性について試験した。試験した細胞株のうち３種類 (１６５−Ｂ６Ｃ、１６５−Ｄ３Ｃ、１６５−Ｆ３Ｃおよび１６５−Ｆ６Ｃ)が、０２６/１１抗原に対して低いレベルの反応性を示した。残りの細胞株は、ペプチド０２６に対して有意な反応性を示さず; 全ての細胞株が、ＧＭＡおよびＣＯＰの両方に対してよく応答した。データはＲＬＵで、表３６に示す。

ドナー３ＧＭＡＴ細胞株である１６５−Ｂ５Ｇ、１６５−Ｄ８Ｇ、１６５−Ｅ７Ｇおよび１６５−Ｆ５Ｇをまた、ペプチド０２６に対する反応性について試験したが、結果は陰性であった。(実施例Ｉに記載の通りに)培養して５６日目に、該細胞株を、０、１、５、１０および１００μg/mLのそれぞれの用量の、ＣＯＰ、ＧＭＡおよびペプチド０２６で刺激した。ドナー３細胞株は全て、ＧＭＡおよびＣＯＰによく応答し、ＧＭＡおよびＣＯＰ応答は同程度であった。

ドナー４ＧＡ特異的なＴ細胞株: ペプチド０２６
ドナー４ＣＯＰＴ細胞株２０５−１Ｂ４、２０５−１Ｃ４および２０５−１Ｈ５を、ペプチド０２６に対する反応性について試験した。ペプチドＧＡＴ６３１、ＧＬＴおよびＣＯＰもまた、１、５、１０および３０μg/mLで試験した。細胞株２０５−１Ｃ４は、ＧＡに対する反応性と同等の反応性をペプチド０２６に対して示したが、２０５−１Ｈ５の反応性は最小であり、２０５−１Ｂ４は反応性を示さなかった(表３７)。図８は、細胞株２０５−１Ｃ４についての結果をＲＬＵで、グラフ形態で示す。

ドナー４ＣＯＰ細胞株２０５−１Ｈ１１を、ペプチド０２６、ＧＬＴ６３１、ＬＴ１１、ＧＬ１４、ＧＴ４１Ｓ、ＧＡＴ６３１およびＧＡＴ１１１に対する反応性について試験した。この試験は、実施例Ｉに記載のＣＯＰ用量反応試験と同時に、同じ細胞および方法を用いて行った。細胞株２０５−１Ｈ１１は、抗原３０μg/mLにおいてペプチド０２６に対する反応性を示した(表３８)。

ドナー４ＣＯＰ細胞株２０５−１Ｈ３を、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＧＬ１４、ＬＴ１１、ＧＡ６４およびＧＴ４１Ｓペプチドに対する反応性について試験した。細胞株２０５−１Ｈ３は、抗原１μg/mLにおいて、ペプチドＧＬ１４に対する反応性を示した(表３９)。

ペプチドＧＬＴ６３１およびＧＡＴ６３１に対するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の反応性
ドナー１、３および４のＧＡ特異的なＴ細胞株の、ペプチドＧＬＴ６３１ (ＧＬＴ)、ポリ(Glu-Lys-Tyr; ６:３:１)による刺激に応答した増殖について試験した。１種類のドナー１細胞株、３種類のドナー３Ｔ細胞株および１種類のドナー４Ｔ細胞株が、ＧＬＴに対していくらかの反応性を示した。ドナー３Ｔ細胞株のうちの２種類は、ＧＡでの刺激後に観察されるのと同程度の、ＧＬＴ反応性を示した。３種類のドナー３Ｔ細胞株は、ＧＡＴに対する反応性を示した。

ドナー１ＧＡ特異的なＴ細胞株２２２−１Ｈ１２: ペプチドＧＬＴ６３１およびＧＡＴ
５回の刺激 (初回刺激および４回の再刺激を含む)後、(実施例Ｉに記載の通り)培養して５６日目に、ドナー１ＣＯＰＴ細胞株２２２−１Ｈ１２を、Ｔ細胞濃度１ｘ１０^５個/mLで、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、０、３、１０、および３０μg/mLのペプチドＧＬ１４、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ１１１およびＧＡＴ６３１、ＣＯＰおよびＧＭＡをそれぞれ添加した後の増殖についてアッセイした。増殖は、発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。細胞株２２２−１Ｈ１２はＧＬＴ６３１に応答したが、試験した他の非標準ＧＡペプチドには応答しなかった。データはＲＬＵで、表４０に示す。

ドナー３ＧＡ特異的なＴ細胞株: ＧＬＴおよびＧＡＴ
全部で９回の刺激（初回刺激および８回の再刺激を含む）後、(実施例Ｉに記載の通り)培養して８１日目に、ドナー３ＧＭＡＴ細胞株１６５−Ｂ５Ｇおよび１６５−Ｅ７Ｇを、増殖についてアッセイした。該アッセイのために、Ｔ細胞濃度１ｘ１０^５個/mLで、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、０、１、３、１０および３０μg/mLのペプチドＧＡＴ６３１、ＧＬＴ６３１およびＣＯＰをそれぞれ添加した。増殖を発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。いずれの細胞株もＧＬＴ６３１によく応答した。１６５−Ｂ５Ｇおよび１６５−Ｅ７Ｇはまた、ＧＡＴ６３１に対しても応答した。データを、ＲＬＵで表４１〜４２に示す。

全部で６回の刺激後、(実施例Ｉに記載の通り)培養して５０日目に、ドナー３ＧＭＡＴ細胞株１６５−Ｈ１１Ｇ、１６５−Ｃ５Ｇ、１６５−Ｅ９Ｇおよび１６５−Ｆ１０Ｇを増殖についてアッセイした。Ｔ細胞濃度１ｘ１０^５個/mL、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、細胞株を０、１、３、１０および３０μg/mLの、ＧＡＴ６３１、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＧＭＡ、ＣＯＰおよびＳＴＥＲＮ (１６５−Ｆ１０Ｇは、ＳＴＥＲＮではなくＭＢＰにより刺激した)の各ペプチドとともにインキュベーションした。増殖を発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。細胞株１６５−Ｈ１１Ｇは、ＧＬＴ６３１およびＧＡＴ６３１に対して応答した。データをＲＬＵで、表４３〜４６に示す。

次の表４７は、発光性ＡＴＰ増殖アッセイにより示す、０、１.２５、２.５、５および１０μg/mLのＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＬＴ１１、ＧＴ１１、ＧＬ１４、ＧＴ４１ＳおよびＧＭＡの各ペプチドによる刺激後の、１６５−Ｆ６Ｃの反応性を示す。該アッセイは、培養７６日目、８回の再刺激後に、Ｔ細胞濃度１ｘ１０^５個/mL、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で行った。細胞株１６５−Ｆ６ＣはＧＬ１４に応答したが、試験した他の非標準ＧＡペプチドには応答しなかった。抗原２.５μg/mLの用量において、ＧＬ１４への応答は、抗原なしの対照と比較して４.４倍に達した。

別の試験において、ドナー３細胞株１６５−Ｅ３Ｃは、ＧＡＴ６３１、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ１１１またはＳＴＥＲＮペプチドに対する応答を示さなかった。

ＧＡ特異的なドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｈ７: ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１およびＧＡＴ６１１
ドナー４ＣＯＰＴ細胞株２０５−１Ｈ７はまた、ペプチドＧＬＴ６３１に対して反応性を示すが、ＧＡＴ６３１およびＧＡＴ６１１に対する反応性を示さないことが示されている。該細胞株を、７回の刺激後に増殖についてアッセイした。該アッセイは、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、０、１、１０または３０μg/mLのペプチドＧＬＴ６３１を、１ｘ１０^５個/mLのＴ細胞に添加することにより行った。増殖を発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。データは、ＲＬＵで表４８に示す。

ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＬ１４およびＬＴ１１に対する反応性
ドナー１および３由来のＧＡ特異的なＴ細胞株を、ペプチドＧＬ１４、ポリ(Glu-Lys １:４)による刺激に応答した増殖について試験した。少なくとも１種類のドナー１Ｔ細胞株および８種類のドナー３Ｔ細胞株が、低い濃度のＧＬに対する反応性を示した。該ドナー３Ｔ細胞の２種類は、低濃度のＧＡで刺激した後に観察されるのと同程度の反応性を示した。別の試験により、ＧＬ−１４は、１０μg/mLに近い濃度およびそれを超える濃度では細胞死を引き起こすことが示された (データは示さない)。

ドナー１ＧＡ特異的なＴ細胞株: ＧＬ１４
全部で６回の刺激の後、(実施例Ｉに記載の通り)培養して５６日目に、ドナー１ＣＯＰＴ細胞株２２２−２Ｆ１２を増殖についてアッセイした。該アッセイのために、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、０、３、１０または３０μg/mLの、ペプチドＧＬ１４、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ１１１およびＧＡＴ６３１、ＣＯＰおよびＧＭＡをそれぞれ、１ｘ１０^５個/mLのＴ細胞株に添加した。増殖を発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。細胞株２２２−２Ｆ１２は、３μg/mLのＧＬ１４に応答したが、試験した他の非標準ＧＡペプチドには応答しなかった。データを表４９に示す。

ドナー３ＧＡ特異的なＴ細胞株
ドナー３ＣＯＰＴ細胞株１６５−Ｆ３Ｃおよび１６５−Ｃ４Ｃを、Ｔ細胞濃度１ｘ１０^５個/mLで、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、０、１、３および１０μg/mLの、ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＬＴ１１、ＧＴ１１、ＧＬ１４、ＧＴ４１Ｓ、ＧＡ６４、ＣＯＰおよびＧＭＡの各ペプチドによる刺激後の増殖についてアッセイした。細胞株１６５−Ｆ３Ｃを培養７７日目、９回の刺激の後にアッセイした。細胞株１６５−Ｃ４Ｃは、培養６６日目、７回の刺激後にアッセイした。増殖は、発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。これらの細胞株は、ＧＬ１４およびＬＴ１１にはよく応答したが、試験した他の非標準ＧＡペプチドには応答しなかった。データを表５０に示す。

ドナー３ＧＭＡＴ細胞株１６５−Ｂ５Ｇおよび１６５−Ｅ７Ｇを、５回の再刺激（初回刺激を含まない）の後、培養５５日目に、増殖についてアッセイした。０、１、３または１０μg/mLの、ペプチドＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＬＴ１１、ＧＴ１１、ＧＬ１４、ＭＢＰ、ＣＯＰおよびＧＭＡを、２ｘ１０^６個/mLの濃度のＴ細胞に、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で添加した。増殖は、発光性ＡＴＰアッセイにより測定した。これらの細胞株は、ＧＬ１４によく応答したが、試験した他の非標準ＧＡペプチドには応答しなかった。データは、ＲＬＵで表５１および５２に示す。

ドナー３ＧＭＡおよびＣＯＰＴ細胞株１６５−Ｆ１０Ｇ、１６５−Ｃ５Ｇ、１６５−Ｈ１１Ｇ、１６５−Ｃ７Ｃ、１６５−Ｅ９Ｇおよび１６５−Ｆ５Ｇを、Ｔ細胞濃度１〜２ｘ１０^５個/mLで、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、０、１、３、および１０μg/mLの各ペプチドＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＬＴ１１、ＧＴ１１、ＧＬ１４、ＭＢＰ、ＣＯＰおよびＧＭＡによる刺激後の増殖についてアッセイした。各細胞株を、少なくとも６回刺激した後、最短で５５日間培養した後に増殖についてアッセイした。発光性ＡＴＰアッセイを用いた。これらの細胞株は、ＧＬ１４にはよく応答したが、１６５−Ｃ５Ｇ以外は他の試験した非標準ＧＡペプチドには応答せず、１６５−Ｃ５Ｇは、ＬＴ１１にも応答した。データは、ＲＬＵで、表５３〜５８に示す。

ドナー４ＧＡ特異的なＴ細胞株２０５−１Ｆ４
表５９は、発光性ＡＴＰ増殖アッセイによって示す、１、２、５および１０μg/mLのペプチドＬＴ１１およびＧＭＡで刺激した後の２０５−１Ｆ４の反応性を示す。該アッセイは、７回の再刺激の後、培養８０日目に、Ｔ細胞濃度１ｘ１０^５個/mLで、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で行った。細胞株１６５−１Ｆ４は、ＬＴ１１に対して反応性を示した。抗原なしの対照に対して、ＬＴ１１に対する応答性は、抗原の用量１０μg/mLでは、１７.３倍に達した。

表６０は、発光性ＡＴＰ増殖アッセイにより示す、０、１、３および１０μg/mLの各ペプチド：ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＬＴ１１、ＧＬ１４、ＧＴ４１Ｓ、ＧＡ６４、ＣＯＰおよびＧＭＡで刺激した後の２０５−１Ｆ４の反応性を示す。このアッセイにおける、用量１０μg/mLでの、ＧＭＡに対する応答は、ＣＯＰと比較して１０１.３％であった。該アッセイは、６回の再刺激の後、培養７１日目に、Ｔ細胞濃度１ｘ１０^５個/mLで、マイトマイシンＣ処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で行った。細胞株１６５−１Ｆ４は、ＬＴ１１に対する反応性を示したが、試験した他の非標準ＧＡペプチドには反応性を示さなかった。抗原なしの対照と比較して、ＬＴ１１に対する応答は、抗原の用量１０μg/mLで１３.８倍に達した。

ＧＡ特異的なドナー１Ｔ細胞株２２２−ＡＧ１２: 非標準ペプチドに対する反応性の欠如
ドナー１ＧＭＡＴ細胞株２２２−ＡＧ１２を、０、１、１０および３０μg/mLの各ペプチド：ＧＬＴ６３１、ＧＡＴ６３１、ＧＡＴ１１１、ＬＴ１１、ＧＴ１１、ＧＬ１４、ＣＯＰおよびＧＭＡで刺激した後、Ｔ細胞濃度２ｘ１０^５個/mLで、マイトマイシンＣ処理自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、増殖についてアッセイした。細胞株２２２−ＡＧ１２は、３回の再刺激（全部で４回の刺激）の後にアッセイした。発光性ＡＴＰアッセイにより増殖を測定した。この細胞株は、試験した非標準ＧＡペプチドのいずれにも応答しなかった。データは図６１に示す。

実施例ＩＩＩ. ＭＨＣ拘束性に基づく、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定
方法の欄に記載したように、Ｔ細胞株を、ＡＰＣとともにインキュベーションした後に増殖を測定することによって、ＭＨＣ拘束性について試験した。マイトマイシンＣ処理した自家性ＡＰＣおよび試験ＡＰＣ、例えば元のＰＢＭＣドナーと適合性の少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲを有するドナー由来のＡＰＣを用いた。結果を表６２にまとめる。次の表中のデータの値はＲＬＵで表す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｂ５Ｇ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｂ５Ｇを、２０μg/mL ＧＭＡの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー３、５および６由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株１６５−Ｂ５Ｇを、抗原で６回（初回刺激を含まない）再刺激した後、ＭＨＣ拘束アッセイを行った。表６３および図９Ａに示すデータは、１６５−Ｂ５ＧがＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１１によって拘束されることを示す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｃ４Ｇ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｃ４Ｇを、２０μg/mL ＧＭＡの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー３、５、および７由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株１６５−Ｃ４Ｇは、抗原で５回 (初回刺激を含まない) 再刺激した後、ＭＨＣ拘束アッセイを行った。表および図９Ｂに示すデータは、１６５−Ｃ４ＧがＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１１により拘束されることを示す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｃ５Ｇ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｃ５Ｇを、２０μg/mL ＧＭＡの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー３、５および６由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株１６５−Ｃ５Ｇを抗原で４回 (初回刺激を含まない) 再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表６５および１０Ａに示すデータは、１６５−Ｃ５ＧがＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１５０１により拘束されることを示す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｅ９Ｇ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｅ９Ｇを、２０μg/mL ＧＭＡの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー３、５および６由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株１６５−Ｅ９Ｇを、抗原で４回（初回刺激を含まない）再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表６６および図１０Ｂに示すデータは、１６５−Ｅ９ＧがＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１１により拘束されることを示す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ５Ｇ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ５Ｇを、２０μg/mL ＧＭＡの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー３、５および６由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株１６５−Ｆ５Ｇを、抗原で７回（初回刺激を含まない）再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表６７および図１１Ａに示すデータは、１６５−Ｆ５ＧがＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１１により拘束されることを示す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ１０Ｇ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ１０Ｇを、２０μg/mL ＧＭＡの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー３、５および７由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株１６５−Ｆ１０Ｇを、抗原で５回 (初回刺激を含まない) 再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表６８および図１１Ｂに示すデータは、１６５−Ｆ１０ＧがＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１５０１により拘束されることを示す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｂ６Ｃ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｂ６Ｃを、２０μg/mL ＣＯＰの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー３、５および６由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株１６５−Ｂ６Ｃを、抗原で６回 (初回刺激を含まない) 再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表６９および図１２Ａに示すデータは、１６５−Ｅ９ＧがＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１１により拘束されることを示す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｃ７Ｃ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｃ７Ｃを、２０μg/mL ＣＯＰの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー３、５および６由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株１６５−Ｃ７Ｃを抗原で５回 (初回刺激を含まない)再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表７０および図１２Ｂに示すデータは、１６５−Ｅ９ＧがＨＬＡ−ＤＲβ１*１１に拘束されることを示す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｄ３Ｃ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｄ３Ｃを、２０μg/mL ＣＯＰの存在下または非存在下でインキュベーションしたドナー３、５および７由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株１６５−Ｄ３Ｃを、抗原で６回 (初回刺激を含まない) 再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表７１および図１３Ａに示すデータは、１６５−Ｄ３ＣがＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１５０１により拘束されることを示す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ３Ｃ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ３Ｃを、２０μg/mL ＣＯＰの存在下または非存在下でインキュベーションしたドナー３、５および７由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて、増殖についてアッセイした。細胞株１６５−Ｆ３Ｃを抗原で８回 (初回刺激を含まない)再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表７２および１３Ｂに示すデータは、１６５−Ｆ３ＣがＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１１により拘束されることを示す。

ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ６Ｃ
ドナー３Ｔ細胞株１６５−Ｆ６Ｃを、２０μg/mL ＣＯＰの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー３、５および６由来の、マイトマイシン処理したＡＰＣを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株１６５−Ｆ６Ｃを抗原で８回 (初回刺激を含まない) 再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表７３および図１４Ａに示すデータは、１６５−Ｆ６ＣがＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１５０１によって拘束されることを示す。

ドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｄ１
ドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｄ１を、自家性Ｂ−ＬＣＬおよび６０μg/mL ＣＯＰの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー１、２および６由来のＢ−ＬＣＬを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株２０５−１Ｄ１を抗原で５回(初回刺激を含まない) 再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表７４に示す結果は、２０５−１Ｄ１がＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１３により拘束されることを示す。

ドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｈ７
ドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｈ７を、自家性Ｂ−ＬＣＬおよび、４０μg/mL ＣＯＰの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー１、２および６由来のＢ−ＬＣＬを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株２０５−１Ｈ７を抗原で５回(初回刺激を含まない) 再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表７５および図１４Ｂに示す結果は、２０５−１Ｈ７がＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１３によって拘束されることを示す。

ドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｆ４
ドナー４Ｔ細胞株２０５−１Ｆ４および２０５−１Ｃ４を、自家性Ｂ−ＬＣＬおよび４０μg/mL ＣＯＰの存在下または非存在下でインキュベーションした、ドナー１、２および６由来のＢ−ＬＣＬを用いて、増殖についてアッセイした。Ｔ細胞株２０５−１Ｆ４を抗原で７回 (初回刺激を含まない) 再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。Ｔ細胞株２０５−１Ｆ４を抗原で７回 (初回刺激を含まない) 再刺激した後、ＭＨＣ拘束性アッセイを行った。表７６に示す結果は、２０５−１Ｆ４がＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１３によって拘束されることを示す。

実施例ＩＶ. 表面マーカー発現に基づく、ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の特性決定
ＧＡ特異的なＴ細胞株を、ＣＤ４およびＣＤ８の表面発現について解析した。ＰＥ標識ＣＤ８モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識ＣＤ４モノクローナル抗体を検出に用いた。非特異的な対照として、細胞をＰＥ標識マウスアイソタイプ適合対照ＩｇＧ１モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体で標識した。

免疫蛍光染色のために、Ｔ細胞を１〜５ｘ１０^６個/mLの細胞濃度で、２％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳで懸濁した。細胞をチューブ１本あたり１００μLで、１２ｘ７５mmポリスチレンチューブに分注した。アイソタイプ適合対照モノクローナル抗体は、フルオロセイン(ＦＩＴＣ)またはフィコエリトリン(ＰＥ)で標識した非特異的マウスＩｇＧ１であった。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４およびＰＥ標識抗ＣＤ８は、eBioscience, Inc. (San Diego, CA)から反応混液として購入した。蛍光色素標識したモノクローナル抗体を、製造者の推奨する体積である、チューブ１本あたり５μLで添加した。細胞を２〜８℃で１５〜３０分間、モノクローナル抗体とともにインキュベーションした。チューブ１本あたりＰＢＳを２mL添加し、２００ｘgで５分間遠心分離することにより、細胞を１回洗浄した。緩衝液をデカントし、各チューブにＰＢＳ０.５mLを添加した。FACScanフローサイトメーターおよびCellQuest softwareを用いて染色を評価した。前方散乱光および側方散乱光に基づいて、死細胞を解析から除いた。

ＧＡ特異的なＴ細胞株１６５−Ｅ９Ｇについて、検出した細胞の９９.７６％がＣＤ４^＋である様子が観察され、ＣＤ８^＋の細胞は観察されなかった。ＧＡ特異的なＴ細胞株１６５−Ｆ５Ｇについては、検出した細胞の９７.４６％がＣＤ４^＋であり、１.５０％がＣＤ８^＋である様子が観察された。１６５−Ｅ９Ｇおよび１６５−Ｆ５Ｇについての対照フロープロットを、それぞれ図１５Ａおよび１６Ａに示し、１６５−Ｅ９Ｇおよび１６５−Ｆ５ＧについてのＣＤ４/ＣＤ８解析をそれぞれ図１５Ｂおよび１６Ｂに示す。表７７に、作製したＧＡ反応性ヒトＴ細胞株の表面マーカー発現の結果をまとめる。

実施例Ｖ. ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株パネルアッセイ-９つのＧＡ試験ロットとCopaxoneの比較
表７８に記載の、６種のＧＡ特異的な長期性ヒトT細胞株のパネルを用いた増殖アッセイを行い、標準的な方法を用いて作製した９種のＧＡ試験ロット、ＧＭＡ/００９/１４ (００９)、ＧＭＡ/０１０/１４ (０１０)、ＧＭＡ/０１１/１４ (０１１)、ＧＭＡ/０１２/１４ (０１２)、ＧＭＡ/０１３/１４ (０１３)、ＧＭＡ/０１４/１４ (０１４)、ＧＭＡ/０１７/１４ (０１７)、ＧＭＡ/０１８/１４ (０１８)およびＧＭＡ/０７０/１４ (０７０)をCopaxone標準ロットと比較した。

上述の方法を用いて、５ｘ１０^４個のマイトマイシン処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で、５つの濃度の標準抗原(０.５、１、２、２.５および５μg/ml Copaxone)、同じ５つの濃度の試験抗原（９種類のＧＡ試験ロット）および、抗原を用いない対照を用いて、各Ｔ細胞株を再刺激した。抗原で４日間インキュベーションした後、上述の方法を用いたＡＴＰアッセイにより増殖を測定した。結果を表７９〜８８に示す。

各表の最終行のパーセンテージは次のように算出した:
（試験抗原に対する増殖応答−対照（抗原なし）に対する増殖応答）÷（標準抗原に対する増殖応答−対照（抗原なし）に対する増殖応答）

ＧＡロット００９についての用量反応曲線を図１７Ａ、１７Ｂ、１８Ａ、１８Ｂ、１９Ａおよび１９Ｂに示す。すなわち、異なる特性を有する種々のＴ細胞株を用いて、ＣＯＰおよびＧＭＡ００９は同等の応答を誘発するため、免疫学的に同一であるとみなした。

実施例ＶＩ. ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株パネルアッセイ- 改変ＧＡロットのCopaxoneとの比較
上記表７８に記載の６種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のパネルを、改変ＧＡロットのCopaxoneに対する免疫学的同一性を試験するために用いた。

改変ＧＡロットの製造
９種類の改変ＧＡロットはそれぞれ、モル分率を改変した、重合をすすめるのに用いるＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）および濃度を改変した、重合反応の開始に用いるＤＥＡ (０.０１％〜０.１％の範囲)を用いて製造した。他の局面において、全てのロットを、標準的な方法を用いて製造した。これらのロットの製造に用いた条件を表８９にまとめる。

陰性対照ロットについての分子量およびアミノ酸の比率および、各パラメーターについての特定の範囲を表９０に示す。太字で示す、影を付けたセルは、各列の一番上に示す、ＧＡ規定範囲を超えた値を示す。

開始剤の濃度およびNCAモル分率の条件は、重合化の開始および連鎖成長に影響を及ぼし得る。陰性ロットと対照間の有意な差異は、全体的なＤＥＡ解析、ＤＥＡ/ＣＯＯＨ解析、付加物解析、ペプチドマッピング、ＮＴＳ(Edman)およびインタクトなＨＰＬＣにより示した (データは示さない)。

ＧＡ特異的なＴ細胞株のパネルを用いた、Copaxoneと陰性ＧＡロットの比較
６種類のＧＡ特異的なＴ細胞株 (表７８) のパネルを用いた増殖アッセイを行い、陰性ＧＡロットである０５１Ｆ、０５４Ｆ、０５５Ｆ、０５７Ｆ、０５８Ｆ、０５９Ｆおよび０６０Ｆ (試験ロット)をCopaxone (標準ロット)と比較した。各細胞株を、（５ｘ１０^４個のマイトマイシン処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下で）５種類の濃度の標準抗原(Copaxone)および試験抗原（陰性ＧＡロット）を用いて再刺激し、抗原なしの対照を含んでいた。抗原とともにインキュベーションした４日後に、増殖を上述の方法を用いてＡＴＰアッセイにより測定した。結果は表９１〜１０７に示す。

各表の最後の行に示すパーセンテージは次のように計算した：
（試験抗原に応答した増殖−対照（抗原なし）に応答した増殖）÷（標準抗原に応答した増殖−対照（抗原なし）に応答した増殖）

実施例ＶＩＩ.ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のパネルを用いた免疫学的同一性の決定
一定の範囲のＭＨＣ拘束性および非標準ペプチド反応性を示すクローナルなＧＡ特異的ヒトＴ細胞株のアッセイパネルを選択し、ＧＡ製品の免疫学的同一性の決定に用いる。(全て２ｘ１０^５個/mLのマイトマイシン処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下において)１、３および１０μg/mLの各ＧＡ試験品および（標準としての）Copaxoneに対する反応性について、全ての細胞株を３つの重複した試料でＡＴＰ増殖アッセイによって試験し、抗原を含まない対照およびＭＢＰ対照を含む。各細胞株について、ＧＡの試験品の各濃度における平均ＲＬＵを算出し、ＧＡ標準品の各濃度における相当する平均ＲＬＵと、次の式を用いて比較する:
(試験抗原に対するＧＡ誘発性応答−対照に対する同じ応答) ÷ (標準抗原に対するＧＡ誘発性応答−対照に対する応答)。

この式により得られる相対値が、特定のＧＡ濃度において、０.８０〜１.２０ (８０％〜１２０％)であるとき、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品は免疫学的に同一であると決定する。したがって、試験ＧＡ製品および標準ＧＡ製品は、単一の参照、単一の用量解析に基づいて免疫学的に同一であると決定する。

平均ＲＬＵをさらに、ＧＡ濃度に対してプロットし、用量反応曲線を得、標準曲線と比較する。該ＧＡ試験品およびＧＡ標準品は、単一標準ロット用量反応曲線解析に基づいて免疫学的に同一であることを確認する。

実施例ＶＩＩＩ. ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のパネルを用いた免疫学的同一性の決定: 複数標準用量反応曲線解析
一定範囲のＭＨＣ拘束性および非標準ペプチド反応性を示すクローナルなＧＡ特異的ヒトＴ細胞株のアッセイパネルを選択し、ＧＡ製品の免疫学的同一性の決定に用いる。(全て２ｘ１０^５個/mLのマイトマイシン処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下において)１、３および１０μg/mLの各ＧＡ試験品および（標準としての）複数ロットのCopaxoneに対する反応性について、全ての細胞株を３つの重複した試料でＡＴＰ増殖アッセイによって試験し、抗原を含まない対照およびＭＢＰ対照を含む。複数のCopaxone標準ロットは、例えば、ロット間の変動を説明するために、複数のデータセットを得るために該アッセイに含まれる。各細胞株について、各濃度におけるＧＡの試験品の平均ＲＬＵを算出し、ＧＡ標準品の各濃度における相当する平均ＲＬＵと比較する。

平均ＲＬＵをＧＡ濃度に対してプロットし、用量反応曲線を得、該曲線の勾配を比較する。複数の標準ロットより得たデータを用いて、標準勾配からの、許容される変動を決定する。

該ＧＡ試験品およびＧＡ標準品は、複数用量反応曲線解析に基づいて免疫学的に同一であることを確認する。

実施例ＩＸ.ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のパネルを用いた免疫学的同一性の決定: 標準反復用量反応曲線解析
一定範囲のＭＨＣ拘束性および非標準ペプチド反応性を示すクローナルなＧＡ特異的ヒトＴ細胞株のアッセイパネルを選択し、ＧＡ製品の免疫学的同一性の決定に用いる。(全て２ｘ１０^５個/mLのマイトマイシン処理した自家性Ｂ−ＬＣＬの存在下において)１、３および１０μg/mLの各ＧＡ試験品および（標準として）１つのCopaxoneロットに対する反応性について、全ての細胞株を３つの重複した試料でＡＴＰ増殖アッセイによって試験し、抗原を含まない対照およびＭＢＰ対照を含む。同じCopaxone標準ロットの複数の試料を、例えば、アッセイ間の変動を説明するために、反復データを得るために該アッセイに含める。各細胞株について、各濃度におけるＧＡの試験品の平均ＲＬＵを算出し、ＧＡ標準品の各濃度における相当する平均ＲＬＵと比較する。

平均ＲＬＵをＧＡ濃度に対してプロットし、用量反応曲線を得、該曲線の勾配を比較する。標準ロットの反復データを用いて、標準勾配からの許容される変動を決定する。

該ＧＡ試験品およびＧＡ標準品は、反復性の標準用量応答曲線解析に基づいて免疫学的に同一であることを確認する。

Claims

酢酸グラチラマー (ＧＡ)の試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定する方法であって：
少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、適当なＡＰＣの存在下における、少なくとも１つの量のＧＡ試験品による刺激に対する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値を、適当なＡＰＣの存在下における、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、少なくとも１つの量のＧＡ標準品に対する、少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値を比較することを含み、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、少なくとも１つの量のＧＡ試験品による刺激に対する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値と、少なくとも１つの量のＧＡ標準品に対する少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値の比較が、許容される限度内にあるときに、該ＧＡ試験品および該ＧＡ標準品が免疫学的に同一であると決定される、方法。
請求項１記載の方法にしたがって、ＧＡ標準品と免疫学的に同一であるＧＡ試験品を医薬的に使用するために選択することを含む、方法。
測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が、増殖、応答バイオマーカーの産生, 応答バイオマーカーをコードする核酸の発現およびその組み合わせから選択される、請求項１記載の方法。
測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が応答バイオマーカーの産生であり、応答バイオマーカーがサイトカイン、ケモカインまたは活性化マーカーである、請求項３記載の方法。
測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が応答バイオマーカーをコードする核酸の発現であり、該核酸にコードされる応答バイオマーカーが、サイトカイン、ケモカインまたは活性化マーカーである、請求項３記載の方法。
ＧＡ標準品がCopaxoneまたはＧＭＡ製品である、請求項１記載の方法。
少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が長期性のＧＡ特異的Ｔ細胞株である、請求項１記載の方法。
少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株がクローナルな長期性のＧＡ特異的Ｔ細胞株である、請求項７記載の方法。
少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、ＧＡの試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定するのに用いるより前に、少なくとも約４週間の間、培養下に維持されている、請求項７記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の培養物の維持が、分裂促進因子の非存在下で、ＧＡおよび自家性ＡＰＣによって反復的に再刺激することを含む、請求項９記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、工程（ａ）で使用されるより前に、少なくとも４回の再刺激を受けている、請求項１０記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、工程（ａ）で使用される前に、少なくとも８回の再刺激を受けている、請求項１１記載の方法。
少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、適当なＡＰＣの存在下における、一連の、上昇させた少なくとも３つの量のＧＡ試験品に応答した少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値を、適当なＡＰＣの存在下における、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、一連の、上昇させた少なくとも３つの量のＧＡ標準品に応答した、少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値を比較すること；および
ＧＡの試験品および標準製品の用量反応曲線を作成することを含み、ここで、該用量反応曲線の比較が許容される限度内にあるとき、ＧＡの試験品およびＧＡ標準品が、免疫学的に同一であると決定する、請求項１記載の方法。
ＧＡを含有する医薬品または医薬組成物の製造方法であって：
a) 少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を適当な抗原提示細胞(ＡＰＣ)とともにインキュベーションすること;
b) 工程（ａ）でインキュベーションしたＧＡ特異的なヒトＴ細胞および適当なＡＰＣの少なくとも１つの試料を、一定量のＧＡ試験品で刺激し、それとは別に、工程（ａ）でインキュベーションしたＧＡ特異的なヒトＴ細胞および適当なＡＰＣの少なくとも１つの試料を、同量のＧＡ標準品で刺激すること;
c) 工程（ｂ）において、ＧＡ試験品で刺激した細胞の少なくとも１つの試料の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定し、工程（ｂ）においてＧＡ標準品で刺激した細胞の少なくとも１つの試料の、少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答を測定すること；および
d) 工程（ｃ）で得た測定値の比較が、許容される限度内であるときに、該ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であると決定すること;
により、
保護されたＧＡを臭化水素酸と反応させてトリフルオロアセチルＧＡを形成し、該トリフルオロアセチルコポリマー−１をピペリジン水溶液で処理して、ＧＡ試験品を形成することにより製造したＧＡ試験品と、ＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定することを含み、該ＧＡ試験品は、ＧＡ標準品と免疫学的に同一であると決定した場合、該医薬品または医薬組成物に混合される、方法。
少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、長期性のＧＡ特異的Ｔ細胞株である、請求項１４記載の方法。
少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、クローナルな長期性のＧＡ特異的Ｔ細胞株である、請求項１５記載の方法。
少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が、免疫学的に同一であるかどうかを決定するのに用いるより前に少なくとも約４週間培養下に維持されている、請求項１４記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の培養下にの維持が、分裂促進因子の非存在下で、ＧＡおよび自家性ＡＰＣで反復的に再刺激することを含む、請求項１７記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、工程（ａ）で使用されるよりも前に、少なくとも４回の再刺激を受けている、請求項１５記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる、少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、工程（ａ）で使用されるより前に、少なくとも８回の再刺激を受けている、請求項１９記載の方法。
ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の作製および特定の方法であって:
a) 細胞の試料を得、該細胞試料が、ヒトドナー由来のＴ細胞および適当なＡＰＣを含むこと;
b) 工程（ａ）の細胞試料から培養物を調製し、該培養物がＧＡを含むこと;
c) 工程（ｂ）の培養物をＩＬ−２とともにインキュベーションすること;
d) 工程（ｃ）の培養物由来の細胞、適当なＡＰＣおよび一定量のＧＡ試験品を含む少なくとも１つの試験培養物を調製し、工程（ｃ）の培養物から少なくとも１種の対照培養物を調製し、(i)少なくとも１種の試験培養物の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定し; (ii) 対照培養物の、少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答を測定することによって、工程（ｃ）の培養物をアッセイすること; および
e) 工程（ｄ）（ｉ）の測定値を工程（ｄ）（ｉｉ）の測定値と比較すること
を含み;
工程（ｄ）（ｉ）において測定した少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が、工程（ｄ）（ｉｉ）で測定した少なくとも１種のＧＡ誘発性応答と比較して、許容される限度内で上昇していることに基づいて、作製したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を特定し; かつ
f) 培養物を増殖させ、該増殖培養物を用いて工程（ｄ）および（ｅ）を繰り返し、特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株をさらに特性決定することを含んでいてよい、
方法。
測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が、増殖、応答バイオマーカーの産生、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現およびその組み合わせから選択される、請求項２１記載の方法。
測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が、応答バイオマーカーの産生であり、該応答バイオマーカーが、サイトカイン、活性化マーカーまたはケモカインである、請求項２２記載の方法。
請求項２１記載の方法により得られる、長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株。
工程（ｂ）または（ｃ）の培養物に分裂促進因子を添加しない、請求項２１記載の方法。
特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を特性決定することをさらに含む、請求項２１記載の方法であって、
該特性決定が、以下：
a) 特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＧＡ特異性を確認または再確認すること;
b) 特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のＭＨＣ拘束性を決定すること;
c) 特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の応答バイオマーカープロファイルを決定すること; および
d) 特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、少なくとも１種の非標準ＧＡペプチドに対する反応性を決定すること
の１つ以上を含む、方法。
特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、非標準ＧＡペプチドに対する応答を特性決定することをさらに含む、請求項２１記載の方法であって、該特性決定が:
特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞、適当なＡＰＣおよび非標準ＧＡペプチドを含む、少なくとも１種の試験培養物を調製すること;
特定したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞を含む少なくとも１種の対照培養物を調製すること;
少なくとも１種の試験培養物の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定すること;
対照培養物の、少なくとも１種の同じＧＡ誘発性応答を測定すること; および
試験培養物および対照培養物のＧＡ誘発性応答の測定値を比較すること;
を含み、
試験培養物の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が、対照培養物と比較して、許容される限度内で上昇していることにより、非標準ペプチドによる刺激に応答するＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を特定する、方法。
特定したＧＡ特異的なＴ細胞株をクローニングすることをさらに含む、請求項２１記載の方法。
長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株であって、ＧＡ試験品による刺激に対して、対照抗原による刺激に対して測定される少なくとも１種の同じ応答と比較して上昇している、少なくとも１種の応答を引き起こすことができ、少なくとも１種の測定される応答が、増殖、応答バイオマーカーの産生、応答バイオマーカーをコードする核酸の発現またはその組み合わせを含む、ヒトＴ細胞株。
少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、クローナルな長期性のＧＡ特異的Ｔ細胞株である、請求項２８記載の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株。
ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定するために用いる、少なくとも２種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株のアッセイパネルであって、次のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株:
a) 第一のＧＡ製品の存在下でヒトＴ細胞を培養することにより作製したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株;
b) 第二のＧＡ製品の存在下でヒトＴ細胞を培養することにより作製したＧＡ特異的なヒトＴ細胞株
を含む、アッセイパネル。
c) 少なくとも１種の非標準ＧＡペプチドに対して反応性でないＧＡ特異的なヒトＴ細胞株; および
d) 少なくとも１種の非標準ＧＡペプチドに対して反応性であるＧＡ特異的なヒトＴ細胞株
の１つ以上を含むか、またはさらに含む、請求項３１記載のアッセイパネルであって、
（ｃ）の非標準ＧＡペプチドが、（ｄ）の非標準ＧＡペプチドと同じであるか、または異なる、アッセイパネル。
(ｃ)の非標準ＧＡペプチドが、Copaxone（登録商標）中のアミノ酸である、チロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）およびリジン（Ｋ）のモル分率とは異なるモル分率のアミノ酸、チロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）およびリジン（Ｋ）からなる、請求項３２記載のアッセイパネル。
（ｃ）の非標準ＧＡペプチドが、チロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）およびリジン（Ｋ）のアミノ酸の任意の１種、２種または３種からなる、請求項３３記載のアッセイパネル。
第一の公知の応答バイオマーカープロファイルを示す、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むか、またはさらに含み、第一の公知の応答バイオマーカープロファイルとは異なる、第二の公知の応答バイオマーカープロファイルを示す、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むか、またはさらに含む、請求項３４記載のアッセイパネル。
第一の公知のＭＨＣ拘束性を有する少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むか、またはさらに含み、第一の公知のＭＨＣ拘束性とは異なる、第二の公知のＭＨＣ拘束性を有する少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を含むか、またはさらに含む、請求項３５記載のアッセイパネル。
次の各群:
a) ２２２−ＡＧ１１、２２２−ＡＧ１２、２２２−ＢＡ１１、２２２−ＢＣ１１、１６５−Ｂ２Ｇ、１６５−Ｂ５Ｇ、１６５−Ｃ４Ｇ、１６５−Ｃ５Ｇ、１６５−Ｃ８Ｇ、１６５−Ｄ８Ｇ、１６５−Ｅ７Ｇ、１６５−Ｅ９Ｇ、１６５−Ｆ１０Ｇ、１６５−Ｆ５Ｇ、１６５−Ｆ８Ｇ、１６５−Ｈ１１Ｇ、２２２−１Ｃ５; および
b) ２２２−１Ｈ１２、２２２−２Ｂ８、２２２−２Ｃ３、２２２−２Ｄ８、２２２−２Ｅ１、２２２−２Ｆ１２、２２２−１Ｇ８、２２２−２Ｇ１２、１６５−Ｂ６Ｃ、１６５−Ｂ１０Ｃ、１６５−Ｃ４Ｃ、１６５−Ｃ７Ｃ、１６５−Ｄ２Ｃ、１６５−Ｄ３Ｃ、１６５−Ｄ１１Ｃ、１６５−Ｅ３Ｃ、１６５−Ｆ３Ｃ、１６５−Ｆ６Ｃ、１６５−Ｆ９Ｃ、２０５−１Ｂ４、２０５−１Ｂ７、２０５−１Ｃ４、２０５−１Ｄ１、２０５−１Ｅ１、２０５−１Ｆ２、２０５−１Ｆ４、２０５−１Ｈ３、２０５−１Ｈ５、２０５−１Ｈ７、２０５−１Ｈ９、２０５−１Ｈ１１
のそれぞれから選択される、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞を含む、請求項３１記載のアッセイパネル。
ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株である、２２２−２Ｄ８、２２２−２Ｆ１２、１６５−Ｆ３Ｃ、１６５−Ｆ６Ｃ、２０５−１Ｃ４および２０５−１Ｆ４を含む、請求項３１記載のアッセイパネル。
少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、長期性Ｔ細胞株である、請求項３１記載の方法。
少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、クローナルな長期性のＧＡ特異的Ｔ細胞株である、請求項３２記載の方法。
少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であると決定するために用いるよりも前に、少なくとも約４週間培養下に維持されている、請求項３１記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の培養下の維持が、分裂促進因子の非存在下における、ＧＡおよび自家性ＡＰＣによる反復的な再刺激を含む、請求項４１記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、工程（ａ）で使用されるより前に、少なくとも４回の再刺激を受けている、請求項４２記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、工程（ａ）で使用されるより前に、少なくとも８回の再刺激を受けている、請求項４３記載の方法。
（ａ）および（ｂ）のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株がそれぞれ、９８％より多くのＣＤ４^＋細胞を含む、請求項３１記載のアッセイパネル。
（ａ）および（ｂ）のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株がそれぞれ、２％未満のＣＤ８^＋細胞を含む、請求項３１記載のアッセイパネル。
請求項１０５記載のアッセイパネルを用いて酢酸グラチラマー (ＧＡ)試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定する方法であって:
１) 該アッセイパネル中の各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株を、適当なＡＰＣとともにインキュベーションすること;
２)工程（１）でインキュベーションした、事前に決定していた数のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株をそれぞれ、一定量のＧＡ試験品で刺激すること;
３) 上とは別に、工程（１）でインキュベーションした、予め決定した同じ数のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の細胞を、それぞれ、同じ量のＧＡ標準品で刺激すること;
４) 工程（２）および（３）で刺激した各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の少なくとも１種のＧＡ誘発性応答を測定すること; および
５)ＧＡの試験品により刺激された各ＧＡ特異的なヒトＴ細胞株について得られる少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値を、ＧＡ標準品により刺激した同じＧＡ特異的なヒトＴ細胞株について得られる少なくとも１種のＧＡ誘発性応答の測定値と比較すること;
を含み、工程（５）の測定値の比較が、許容される限度内にあるときに、該ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であると決定される、方法。
医薬として使用するために、ＧＡ標準品と免疫学的に同一であるＧＡ試験品を選択することを含む方法であって、該免疫学的同一性が、請求項４７記載の方法にしたがって決定される、方法。
測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が、増殖、応答バイオマーカーの産生, 応答バイオマーカーをコードする核酸の発現およびその組み合わせから選択される、請求項４８記載の方法。
測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が、応答バイオマーカーの産生であり、該応答バイオマーカーが、サイトカイン、活性化マーカーまたはケモカインである、請求項４９記載の方法。
測定する少なくとも１種のＧＡ誘発性応答が応答バイオマーカーをコードする核酸の発現であり、該核酸にコードされる応答バイオマーカーが、サイトカイン、活性化マーカーまたはケモカインである、請求項４９記載の方法。
ＧＡ標準品がCopaxoneまたはＧＭＡ製品である、請求項４７記載の方法。
少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が長期性Ｔ細胞株である、請求項４７記載の方法。
少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、クローナルな長期性のＴ細胞株である、請求項５３記載の方法。
少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、ＧＡ試験品およびＧＡ標準品が免疫学的に同一であるかどうかを決定するのに用いるよりも前に、少なくとも約４週間、培養下に維持されている、請求項５３記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、培養下にの維持が、分裂促進因子の非存在下における、ＧＡおよび自家性ＡＰＣによる反復的な再刺激を含む、請求項５５記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、工程（ａ）で使用されるより前に、少なくとも４回の再刺激を受けている、請求項５６記載の方法。
工程（ａ）でインキュベーションされる少なくとも１種の長期性のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株が、工程（ａ）で使用されるより前に、少なくとも８回の再刺激を受けている、請求項５７記載の方法。
工程(２)が、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、事前に決定した数の細胞を含む少なくとも３つの試料を、それぞれ、上昇させる一連の量のうちの１つの量のＧＡ試験品で刺激すること、および、少なくとも１種のＧＡ特異的なヒトＴ細胞株の、事前に決定した数の細胞を含む少なくとも３つの試料をそれぞれ、上昇させる一連の量の同じ量のＧＡ標準品で刺激することを含む、請求項４７記載の方法。
工程５)が、さらに、ＧＡの試験品および標準製品についての用量反応曲線を作成することを含み、該用量反応曲線の比較が許容される限度内であるときに、該ＧＡ試験品およびＧＡ標準品は、免疫学的に同一であると決定される、請求項５９記載の方法。