CN105917001B - 用于评估醋酸格拉替雷制品的免疫学同一性的人类t细胞系试验 - Google Patents
用于评估醋酸格拉替雷制品的免疫学同一性的人类t细胞系试验 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医学领域。本发明提供了用于产生醋酸格拉替雷特异性人类T细胞系的方法，以及使用这些T细胞系来显示醋酸格拉替雷制品之间的免疫学同一性的试验。这些试验允许对醋酸格拉替雷制品进行灵敏且准确的比较，并具有作为批量签发试验的用途。
Description
交叉引用
本申请要求于2013年10月24日提交的美国临时专利申请号61/895,370的优先权；该临时专利申请通过引用全文并入本文。
背景技术
醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate)是被批准用于治疗多发性硬化症的合成肽药物。其由含有下列氨基酸的合成多肽的醋酸盐组成：L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸及L-赖氨酸。当前作为
销售的醋酸格拉替雷注射剂适用于降低复发缓解型多发性硬化症(RRMS)患者的复发频率，所述患者包括已经历首次临床发作(clinical episode)且具有符合多发性硬化症的MRI特征的患者。
据认为醋酸格拉替雷通过改变负责疾病发病机理的免疫过程而在多发性硬化症中起作用。尤其是，据认为
在多发性硬化症中的作用机理至少部分地由T细胞活性的免疫调节所介导。
在生产醋酸格拉替雷期间，为了保持用于药学用途的药物批次之间的一致性，需要可靠且具有成本效益的试验来探查醋酸格拉替雷制品，以显示其与醋酸格拉替雷参考标准批的免疫学同一性和/或可比的效力。
发明内容
本发明基于发现了用于产生和鉴别醋酸格拉替雷(GA)特异性人类T细胞系的方法，该T细胞系类似地响应于不同的GA制品，但对非规范(non-canonical)GA肽的响应性不同，具有不同的MHC限制元件，并且响应于GA刺激而产生不同的细胞因子。本发明涉及用于获得识别不同GA表位的GA特异性人类T细胞系的方法，以及使用这些GA特异性人类T细胞系来确定GA制品是否在免疫学上相同的方法。在一些实施方案中，本发明涉及通过采用利用所述方法产生的至少一种GA特异性人类T细胞系或GA特异性人类T细胞系组来确定GA测试制品与GA参考标准制品是否在免疫学上相同的方法。
本发明进一步涉及用于制备含有GA的药物产品或药物组合物的方法，该方法包括确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同，以及如果确定GA测试批与GA参考标准物在免疫学上相同，则将该GA测试批包含在药物产品中。本发明还涉及通过本发明方法制备的含有GA的药物产品。本发明进一步涉及适合用作本发明方法中的抗原呈递细胞的人类B细胞系。
本发明的试验可以证明GA产品制品的免疫学同一性或揭示其非同一性，其具有用现有的GA批量试验(batch assay)无法获得的准确度。本发明的试验不需要动物免疫，从而消除了试验与试验之间的可变性，并且其不需要处死动物。
特别地，本发明涉及一种采用至少一种GA特异性人类T细胞系来确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同的方法，该方法包括：a)将至少一种GA特异性人类T细胞系的细胞与合适的抗原呈递细胞(APC)一起温育；b)用一定量的GA测试制品刺激在步骤(a)中温育的合适的APC和GA特异性人类T细胞的至少一个样品，并且单独地用相同量的GA参考标准物刺激在步骤(a)中温育的合适的APC和GA特异性人类T细胞的至少一个样品；c)测量步骤(b)中用GA测试制品刺激的至少一个细胞样品的至少一种GA引起的响应，并测量步骤(b)中用GA参考标准物刺激的至少一个细胞样品的相同的至少一种GA引起的响应；以及d)比较步骤(c)中获得的测量结果；其中，当步骤(d)中进行的测量结果的比较落在可接受的范围内时，确定该GA测试制品与该GA参考标准物在免疫学上相同。
在一些实施方案中，本发明涉及一种确定醋酸格拉替雷(GA)测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同的方法，该方法包括：测量在合适的APC的存在下至少一种GA特异性人类T细胞系对用GA测试制品的刺激的至少一种GA引起的响应，以获得第一测量结果，以及测量在合适的APC的存在下至少一种GA特异性人类T细胞系对GA参考标准物的至少一种GA引起的响应，以获得第二测量结果；以及比较第一测量结果与第二测量结果；其中，当第一测量结果与第二测量结果的比较落入可接受的范围内时，确定该GA测试制品与该GA参考标准物在免疫学上相同。
在上述实施方案中，所述合适的APC可以包括选自下组的细胞：对于GA特异性人类T细胞而言为自体的EB病毒转化的(EBV转化的)人类B细胞；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的EBV转化的人类B细胞；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的PBMC；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的PBMC；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的纯化的单核细胞；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的纯化的单核细胞；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的纯化的树突细胞；以及具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的纯化的树突细胞。
本发明还涉及这样一种方法，其包括针对药学用途选择根据所述方法确定为与GA参考标准物具有免疫学同一性的GA测试制品。
本发明涉及上述方法，其中所述可接受的范围为约80％至约120％，或约90％至约110％。在上述方法的实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应选自增殖、响应生物标志物的产生、编码响应生物标志物的核酸的表达，及其组合。在一些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应为响应生物标志物的产生，并且该响应生物标志物为细胞因子、趋化因子或活化标志物。在某些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)及IL-1b。在一些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。在一些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。
本发明涉及上述方法，其中所述至少一种测量的GA引起的响应为编码响应生物标志物的核酸的表达，并且由该核酸编码的响应生物标志物为细胞因子、趋化因子或活化标志物。在一些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β及IL-1b。在某些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。在一些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。
本发明涉及上述方法，其中测量了用GA测试制品刺激的细胞的至少两种GA引起的响应，并且测量了用GA参考标准物刺激的细胞的相同的至少两种GA引起的响应。在这些实施方案中，所述至少两种GA引起的响应可以选自以下各项的表达：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β、IL-1b、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279、HLA-DR、IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、编码IL-2的核酸、编码IL-4的核酸、编码IL-5的核酸、编码IL-6的核酸、编码IL-10的核酸、编码IL-13的核酸，或编码IL-17的核酸、编码IL-22的核酸、编码IFN-γ的核酸、编码TNF-α(TNF)的核酸、编码TNF-β(LT)的核酸、编码TGF-β的核酸、编码IL-1b的核酸、编码CD69的核酸、编码CD25的核酸、编码CD71的核酸、编码CD137的核酸、编码CD154的核酸、编码CD278的核酸、编码CD279的核酸、编码HLA-DR的核酸、编码IL-8(CXCL8)的核酸、编码RANTES(CCL5)的核酸、编码CCL1的核酸、编码CXCL4的核酸以及编码CXCL7的核酸。
本发明涉及上述方法，其中所述GA参考标准物为克帕松(COP)或Mylan GA(GMA)。
本发明涉及上述方法，其中所述合适的APC具有至少一种能够呈递GA肽的HLA-DR限制元件。在某些实施方案中，所述至少一种能够呈递GA肽的HLA-DR限制元件选自：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15。
本发明涉及上述方法，其中在步骤(a)中温育的至少一种GA特异性人类T细胞系为长期T细胞系。在一些实施方案中，该GA特异性人类T细胞系是克隆的。在一些实施方案中，所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系在刺激之前已经被保持在培养物中至少约四周，事先再刺激至少四次，或者二者兼具。在一些实施方案中，所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系已经事先被再刺激至少八次。在一些实施方案中，将所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系保持在培养物中包括在不存在促分裂原的情况下用GA和自体APC反复再刺激。
本发明涉及上述方法，其中所述刺激包括用一系列量中的一个量的GA测试制品刺激与APC一起温育或在APC存在下温育的GA特异性人类T细胞的至少三个样品中的每一个，以及用相同系列量中的一个量的GA参考标准物刺激与APC一起温育或在APC存在下温育的GA特异性人类T细胞的至少三个样品中的每一个。在一些实施方案中，所述系列量的GA测试制品以及所述系列量的GA参考标准物包含约1ng/mL至约1mg/mL GA的上升剂量的GA。在一些实施方案中，所述系列量的GA测试制品以及所述系列量的GA参考标准物为约1μg/mL至约30μg/mL GA的上升剂量的GA。
在一些实施方案中，本发明涉及一种用于制备含有GA的药物产品或药物组合物的方法，该方法包括：1)使受保护的醋酸格拉替雷与氢溴酸反应以形成三氟乙酰基GA，用哌啶水溶液处理所述三氟乙酰基共聚物-1以形成GA测试制品，并纯化GA测试制品；2)通过以下步骤确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同：a)将至少一种GA特异性人类T细胞系的细胞与合适的抗原呈递细胞(APC)一起温育；b)用一定量的GA测试制品刺激在步骤(a)中温育的合适的APC和GA特异性人类T细胞的至少一个样品，并且单独地用相同量的GA参考标准物刺激在步骤(a)中温育的GA特异性人类T细胞和合适的APC的至少一个样品；c)测量在步骤(b)中用GA测试制品刺激的至少一个细胞样品的至少一种GA引起的响应，并测量在步骤(b)中用GA参考标准物刺激的至少一个细胞样品的相同的至少一种GA引起的响应；以及d)比较在步骤(c)中获得的测量结果；其中当步骤(d)中测量结果的比较落入可接受的范围内时，确定该GA测试制品与该GA参考标准物在免疫学上相同，并且其中如果确定该GA测试制品与该GA参考标准物在免疫学上相同，则将该GA测试制品混合在药物产品或药物组合物中。
在这些实施方案中，所述合适的APC可以包含选自下组的细胞：对于GA特异性人类T细胞而言为自体的EB病毒转化的(EBV转化的)人类B细胞；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的EBV转化的人类B细胞；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的PBMC；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的PBMC；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的纯化的单核细胞；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的纯化的单核细胞；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的纯化的树突细胞；以及具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的纯化的树突细胞。
在一些实施方案中，所述可接受的范围为约80％至约120％，或约90％至约110％。在上述方法的某些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应选自增殖、响应生物标志物的产生、编码响应生物标志物的核酸的表达，及其组合。在一些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应为响应生物标志物的产生，并且该响应生物标志物为细胞因子、趋化因子或活化标志物。在某些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)及IL-1b。在一些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。在一些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。
在一些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应为编码响应生物标志物的核酸的表达，并且由该核酸编码的响应生物标志物为细胞因子、趋化因子或活化标志物。在一些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β及IL-1b。在某些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。在一些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。
在一些实施方案中，其中测量了用GA测试制品刺激的细胞的至少两种GA引起的响应，并且测量了用GA参考标准物刺激的细胞的相同的至少两种GA引起的响应。在这些实施方案中，所述至少两种GA引起的响应可以选自以下各项的表达：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β、IL-1b、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279、HLA-DR、IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、编码IL-2的核酸、编码IL-4的核酸、编码IL-5的核酸、编码IL-6的核酸、编码IL-10的核酸、编码IL-13的核酸，或编码IL-17的核酸、编码IL-22的核酸、编码IFN-γ的核酸、编码TNF-α(TNF)的核酸、编码TNF-β(LT)的核酸、编码TGF-β的核酸、编码IL-1b的核酸、编码CD69的核酸、编码CD25的核酸、编码CD71的核酸、编码CD137的核酸、编码CD154的核酸、编码CD278的核酸、编码CD279的核酸、编码HLA-DR的核酸、编码IL-8(CXCL8)的核酸、编码RANTES(CCL5)的核酸、编码CCL1的核酸、编码CXCL4的核酸以及编码CXCL7的核酸。
在一些实施方案中，所述GA参考标准物为克帕松或GMA。
在一些实施方案中，所述合适的APC具有至少一种能够呈递GA肽的HLA-DR限制元件。在某些实施方案中，所述至少一种能够呈递GA肽的HLA-DR限制元件选自：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15。
在一些实施方案中，在步骤(a)中温育的至少一种GA特异性人类T细胞系为长期T细胞系。在一些实施方案中，所述至少一种GA特异性人类T细胞系是克隆的。在一些实施方案中，所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系在刺激之前已经被保持在培养物中至少约四周，事先再刺激至少四次，或者二者兼具。在一些实施方案中，所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系已经事先被再刺激至少八次。在一些实施方案中，将所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系保持在培养物中包括在不存在促分裂原的情况下用GA和自体APC反复再刺激。
在一些实施方案中，所述刺激包括用一系列量中的一个量的GA测试制品刺激与APC一起温育或在APC存在下温育的GA特异性人类T细胞的至少三个样品中的每一个，以及用相同系列量中的一个量的GA参考标准物刺激与APC一起温育或在APC存在下温育的GA特异性人类T细胞的至少三个样品中的每一个。在一些实施方案中，所述系列量的GA测试制品以及所述系列量的GA参考标准物包含约1ng/mL至约1mg/mL GA的上升剂量的GA。在一些实施方案中，所述系列量的GA测试制品以及所述系列量的GA参考标准物为约1μg/mL至约30μg/mL GA的上升剂量的GA。
本发明进一步涉及一种用于产生并鉴别GA特异性人类T细胞系的方法，该方法包括：a)获得细胞样品，其中该细胞样品包含来自人类供体的T细胞和合适的APC；b)由步骤(a)的细胞样品制备培养物，其中该培养物包含GA；c)将步骤(b)的培养物与IL-2一起温育；d)通过以下步骤测定步骤(c)的培养物：制备至少一个包含来自步骤(c)的培养物的细胞、合适的APC和GA测试制品的测试培养物，由步骤(c)的培养物制备至少一个对照培养物，以及(i)测量所述至少一个测试培养物的至少一种GA引起的响应；(ii)测量所述对照培养物的相同的至少一种GA引起的响应；以及e)比较步骤(d)(i)的测量结果与步骤(d)(ii)的测量结果；其中根据在步骤(d)(i)中测量的至少一种GA引起的响应相对于在步骤(d)(ii)中测量的至少一种GA引起的响应的增加来鉴别所产生的GA特异性人类T细胞系；以及f)任选地扩充所述培养物，并使用扩充的培养物重复步骤(d)和(e)，以进一步表征所鉴别的GA特异性人类T细胞系。
在这些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应可以选自增殖、响应生物标志物的产生、编码响应生物标志物的核酸的表达，及其组合。在相关的实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应为响应生物标志物的产生，并且该响应生物标志物为细胞因子、活化标志物或趋化因子。在某些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β及IL-1b。在一些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。在一些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。在相关的实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应为编码响应生物标志物的核酸的表达，并且所编码的响应生物标志物为细胞因子、活化标志物或趋化因子。在某些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β及IL-1b。在一些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。在一些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。
在本发明的实施方案中，步骤(e)包括测量培养的T细胞对GA的至少两种GA引起的响应，并且步骤(f)包括测量培养的T细胞对对照抗原的相同的至少两种GA引起的响应。在相关的实施方案中，所述至少两种GA引起的响应选自以下各项的表达：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β、IL-1b、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279、HLA-DR、IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、编码IL-2的核酸、编码IL-4的核酸、编码IL-5的核酸、编码IL-6的核酸、编码IL-10的核酸、编码IL-13的核酸，或编码IL-17的核酸、编码IL-21的核酸、编码IL-22的核酸、编码IFN-γ的核酸、编码TNF-α(TNF)的核酸、编码TNF-β(LT)的核酸、编码TGF-β的核酸、编码IL-1b的核酸、编码CD69的核酸、编码CD25的核酸、编码CD71的核酸、编码CD137的核酸、编码CD154的核酸、编码CD278的核酸、编码CD279的核酸、编码HLA-DR的核酸、编码IL-8(CXCL8)的核酸、编码RANTES(CCL5)的核酸、编码CCL1的核酸、编码CXCL4的核酸以及编码CXCL7的核酸。
在一些实施方案中，所述合适的APC为自体细胞。在一些实施方案中，所述合适的APC为自体PBMC。在一些实施方案中，所述合适的APC为用抗有丝分裂剂例如丝裂霉素C处理的自体PBMC。在一些实施方案中，所述合适的APC具有至少一种能够呈递GA肽的HLA-DR限制元件。在某些实施方案中，所述至少一种能够呈递GA肽的HLA-DR限制元件选自：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15。
本发明还涉及根据这些方法获得的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，所产生的GA特异性人类T细胞系是长期T细胞系。在一些实施方案中，所产生的GA特异性人类T细胞系是克隆的。
在本发明的实施方案中，不向步骤(b)或(c)的培养物中添加促分裂原。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括表征所鉴别的GA特异性人类T细胞系，其中所述表征包括以下一项或多项：a)确认或再确认所鉴别的GA特异性人类T细胞系的GA特异性；b)确定所鉴别的GA特异性人类T细胞系的MHC限制；c)确定所鉴别的GA特异性人类T细胞系的响应生物标志物谱；以及d)确定所鉴别的GA特异性人类T细胞系对至少一种非规范GA肽的反应性。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过以下步骤表征所鉴别的GA特异性人类T细胞系对非规范GA肽的响应：制备至少一个包含所鉴别的GA特异性人类T细胞系的细胞、合适的APC和非规范GA肽的测试培养物；制备至少一个包含所鉴别的GA特异性人类T细胞系的细胞的对照培养物；测量所述至少一个测试培养物的至少一种GA引起的响应；测量所述对照培养物的相同的至少一种GA引起的响应；以及比较所述测试培养物与所述对照培养物的GA引起的响应的测量结果；其中通过所述测试培养物相对于所述对照培养物的至少一种GA引起的响应的增加来鉴别响应于所述非规范GA肽的刺激的GA特异性人类T细胞系。
本发明还涉及一种长期GA特异性人类T细胞系，其中该长期GA特异性人类T细胞系能够产生针对GA测试制品的刺激的至少一种测量的响应，该响应相对于针对对照抗原的刺激的相同的至少一种测量的响应增加，所述至少一种测量的响应包括增殖、响应生物标志物的产生、编码响应生物标志物的核酸的表达或其组合。在一些实施方案中，所述GA特异性人类T细胞系是克隆的。
在一些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应选自增殖、响应生物标志物的产生、编码响应生物标志物的核酸的表达，及其组合。在一些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应是响应生物标志物的产生，并且该响应生物标志物为细胞因子、趋化因子或活化标志物。在某些实施方案中，该响应生物标志物是选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)及IL-1b。在一些实施方案中，该响应生物标志物是选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。在一些实施方案中，该响应生物标志物是选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。
在一些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应是编码响应生物标志物的核酸的表达，并且由该核酸编码的响应生物标志物是细胞因子、趋化因子或活化标志物。在一些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β及IL-1b。在某些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。在一些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。
在一些实施方案中，其中测量了用GA测试制品刺激的细胞的至少两种GA引起的响应，并且测量了用GA参考标准物刺激的细胞的相同的至少两种GA引起的响应。在这些实施方案中，所述至少两种GA引起的响应可以是选自以下各项的表达：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β、IL-1b、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279、HLA-DR、IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、编码IL-2的核酸、编码IL-4的核酸、编码IL-5的核酸、编码IL-6的核酸、编码IL-10的核酸、编码IL-13的核酸，或编码IL-17的核酸、编码IL-22的核酸、编码IFN-γ的核酸、编码TNF-α(TNF)的核酸、编码TNF-β(LT)的核酸、编码TGF-β的核酸、编码IL-1b的核酸、编码CD69的核酸、编码CD25的核酸、编码CD71的核酸、编码CD137的核酸、编码CD154的核酸、编码CD278的核酸、编码CD279的核酸、编码HLA-DR的核酸、编码IL-8(CXCL8)的核酸、编码RANTES(CCL5)的核酸、编码CCL1的核酸、编码CXCL4的核酸，以及编码CXCL7的核酸。包含抗原呈递细胞的APC系能够向权利要求90的长期GA特异性人类T细胞系呈递抗原。
在一些实施方案中，该APC系选自：对于GA特异性人类T细胞而言为自体的EB病毒转化的(EBV转化的)人类B细胞；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的EBV转化的人类B细胞；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的PBMC；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的PBMC；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的纯化的单核细胞；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的纯化的单核细胞；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的纯化的树突细胞；以及具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的纯化的树突细胞。
在一些实施方案中，所述长期GA特异性人类T细胞系通过培养至少约四周而产生。在一些实施方案中，该长期GA特异性人类T细胞系通过用GMA或COP制品刺激而产生。
本发明还涉及用于确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同的GA特异性人类T细胞系的测定组，其中该测定组包含下列GA特异性人类T细胞系：a)通过在第一GA制品的存在下培养人类T细胞而产生的GA特异性人类T细胞系；b)通过在第二GA制品的存在下培养人类T细胞而产生的GA特异性人类T细胞系；以及c)对至少一种非规范GA肽没有反应性的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，(a)或(b)的GA特异性人类T细胞系也是(c)的GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，(c)的非规范GA肽由摩尔比与
中的氨基酸酪氨酸(Y)、谷氨酸(E)、丙氨酸(A)和赖氨酸(K)的摩尔比不同的氨基酸酪氨酸(Y)、谷氨酸(E)、丙氨酸(A)和赖氨酸(K)组成。在一些实施方案中，权利要求105的测定组，其中(c)的非规范GA肽由氨基酸酪氨酸(Y)、谷氨酸(E)、丙氨酸(A)和赖氨酸(K)中的任意一种、两种或三种组成。在一些实施方案中，权利要求105的测定组，其进一步包含对至少一种非规范GA肽具有反应的GA特异性人类T细胞系。
在某些实施方案中，本发明涉及以上的测定组，其中(a)的GA特异性人类T细胞系选自222-AG12、222-BA11、222-BC11、165-B5G、165-C4G、165-C5G、165-C8G、165-D8G、165-E7G、165-E9G、165-F10G、165-F5G、165-F8G和165-H11G；(b)的GA特异性人类T细胞系选自222-1C5、222-1H12、222-2B11、222-2B8、222-2C1、222-2C3、222-2D2、222-2D8、222-2E1、222-1F8、222-2F12、222-2G4、222-1G8、222-2G12、165-B6C、165-B10C、165-C4C、165-C7C、165-D2C、165-D3C、165-D11C、165-E3C、165-F3C、165-F6C、205-1B4、205-1B7、205-1C4、205-1D1、205-1E1、205-1F2、205-1F4、205-1H1、205-1H3、205-1H5、205-1H7、205-1H9和205-1H11；并且(c)的GA特异性人类T细胞系选自222-AG12、165-B5G、165-D8G、165-E7G、165-E9G、165-F5G、165-F10G、222-1H12、222-2F12、165-B10C、165-C4C、165-C7C、165-D11C、165-E3C、165-F3C、165-F6C和205-1H7。
在一些实施方案中，(a)的GA特异性人类T细胞系选自222-AG12、222-AG12、222-BA11、222-BC11、165-B5G、165-C5G、165-C8G、165-D8G、165-E9G、165-F10G、165-F5G、165-F8G和165-H11G；(b)的GA特异性人类T细胞系选自222-1C5、222-1H12、222-2B8、222-2C3、222-2E1、222-1F8、222-2F12、222-2G4、222-1G8、165-C4C、165-C7C、165-D2C、165-D3C、205-1B4、205-1B7、205-1C4和205-1F4；并且(c)的GA特异性人类T细胞系选自222-AG12、165-B5G、165-D8G、165-E7G、165-E9G、165-F5G、165-F10G、222-1H12、222-2F12、165-B10C、165-C4C、165-C7C、165-D11C、165-E3C、165-F3C、165-F6C以及205-1H7。
在某些实施方案中，(a)的GA特异性人类T细胞系选自165-B5G或165-D8G；(b)的GA特异性人类T细胞系选自222-1H12或222-2E1；并且(c)的GA特异性人类T细胞系是222-AG12。
在一些实施方案中，所述测定组包含或进一步包含至少一种具有第一已知GA响应生物标志物谱的GA特异性人类T细胞系，并且包含或进一步包含至少一种具有不同于第一已知GA响应生物标志物谱的第二已知GA响应生物标志物谱的GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，所述测定组包含或进一步包含至少一种具有第一已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系，并且包含或进一步包含至少一种具有不同于第一已知MHC限制的第二已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，该测定组包含或进一步包含至少一种具有能够呈递GA肽的HLA-DR限制元件的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，第一HLA-DR限制元件选自：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15；并且其中第二HLA-DR限制元件选自：DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15。
在一些实施方案中，所述测定组包含或进一步包含至少一种具有第一已知GA生物标志物响应谱的GA特异性人类T细胞系，以及至少一种具有第二已知GA生物标志物响应谱的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，第一和第二已知GA生物标志物响应谱各自包含至少一种细胞因子、至少一种趋化因子、至少一种活化标志物、至少一种编码细胞因子的核酸、至少一种编码趋化因子的核酸，或者至少一种编码活化标志物的核酸。在一些实施方案中，第一和第二已知GA生物标志物响应谱各自包含至少一种选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β及IL-1b。在某些实施方案中，第一和第二已知GA生物标志物响应谱各自包含选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。在一些实施方案中，第一和第二已知GA生物标志物响应谱各自包含选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。在一些实施方案中，第一和第二已知GA生物标志物响应谱各自包含至少一种编码细胞因子的核酸，该细胞因子选自：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β及IL-1b。在一些实施方案中，第一和第二已知GA生物标志物响应谱各自包含至少一种编码活化标志物的核酸，该活化标志物选自：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279及HLA-DR。在一些实施方案中，第一和第二已知GA生物标志物响应谱各自包含至少一种编码趋化因子的核酸，该趋化因子选自：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4及CXCL7。
在一些实施方案中，所述测定组中的GA特异性人类T细胞系是长期T细胞系。在一些实施方案中，所述测定组中的GA特异性人类T细胞系是克隆的。在相关的实施方案中，该GA特异性人类T细胞系已经培养至少约四周和/或被再刺激至少四次。在一些实施方案中，该GA特异性人类T细胞系已经被再刺激至少八次。
在一些实施方案中，所述非规范GA肽选自肽026、GLT 631、GAT 631、GAT111、LT11、GT11、GT 41、GL14和GA 64。在一些实施方案中，该非规范肽是肽026。在一些实施方案中，所述测定组包含或进一步包含二至六种对非规范GA肽没有反应性的GA特异性人类T细胞系，其中每种GA特异性人类T细胞系对不同的非规范GA肽没有反应性。在一些实施方案中，所述测定组包含或进一步包含两种对非规范GA肽没有反应性的GA特异性人类T细胞系，其中这两种GA特异性人类T细胞系中的一种对选自肽026、GLT 631、GAT 631、GAT111、LT11、GT11、GT 41、GL 14、GT41S和GA64的非规范GA肽没有反应性，并且这两种GA特异性人类T细胞系中的第二种对选自肽026、GLT 631、GAT 631、GAT111、LT11、GT11、GT 41、GL 14、GT 41S和GA64的非规范GA肽没有反应性。在一些实施方案中，这两种GA特异性人类T细胞系中的一种对选自肽026、GLT 631、GAT 631、LT11和GL 14的非规范GA肽没有反应性，并且这两种GA特异性人类T细胞系中的第二种对选自肽026、GLT 631、GAT 631、LT11和GL 14的非规范GA肽没有反应性。在一些实施方案中，这两种GA特异性人类T细胞系中的一种对肽026没有反应性，并且这两种GA特异性人类T细胞系中的第二种对GLT 631、GAT 631、LT11或GL14没有反应性。
在某些实施方案中，(a)、(b)和(c)的每种GA特异性人类T细胞系均为CD4+。在相关的实施方案中，(a)、(b)和(c)的每种GA特异性人类T细胞系均包含超过98％的CD4+细胞。在一些实施方案中，(a)、(b)和(c)的每种GA特异性人类T细胞系均包含超过99％的CD4+细胞。在一些实施方案中，(a)、(b)和(c)的每种GA特异性人类T细胞系均不是CD8+。在相关的实施方案中，(a)、(b)和(c)的每种GA特异性人类T细胞系均包含少于2％的CD8+细胞。在某些实施方案中，(a)、(b)和(c)的每种GA特异性人类T细胞系均包含少于1％的CD8+细胞。
本发明还涉及一种使用测定组来确定醋酸格拉替雷(GA)测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同的方法，该方法包括：1)将该测定组中的每种GA特异性人类T细胞系的细胞与合适的APC一起温育；2)用一定量的GA测试制品刺激在步骤(1)中温育的每种GA特异性人类T细胞系的预定数目的细胞；3)用相同量的该GA参考标准物单独地刺激在步骤(1)中温育的每种GA特异性人类T细胞系的相同预定数目的细胞；4)测量在步骤(2)和(3)中刺激的每种GA特异性人类T细胞系的至少一种GA引起的响应；以及5)将针对用GA测试制品刺激的每种GA特异性人类T细胞系获得的至少一种GA引起的响应的测量结果，与针对用GA参考标准物刺激的相同GA特异性人类T细胞系获得的至少一种GA引起的响应的测量结果进行比较；其中当步骤(5)中的测量结果的比较在可接受的范围内时，确定该GA测试制品与该GA参考标准物在免疫学上相同。
在一些实施方案中，所述合适的APC可以包含选自下组的细胞：对于GA特异性人类T细胞而言为自体的EB病毒转化的(EBV转化的)人类B细胞；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的EBV转化的人类B细胞；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的PBMC；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的PBMC；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的纯化的单核细胞；具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的纯化的单核细胞；对于GA特异性人类T细胞而言为自体的纯化的树突细胞；以及具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的纯化的树突细胞。
在一些实施方案中，所述可接受的范围为约80％至约120％，或约90％至约110％。在上述方法的某些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应选自增殖、响应生物标志物的产生、编码响应生物标志物的核酸的表达，及其组合。在一些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应为响应生物标志物的产生，并且该响应生物标志物为细胞因子、趋化因子或活化标志物。在某些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)及IL-1b。在一些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。在一些实施方案中，该响应生物标志物为选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。
在一些实施方案中，所述至少一种测量的GA引起的响应为编码响应生物标志物的核酸的表达，并且由该核酸编码的响应生物标志物为细胞因子、趋化因子或活化标志物。在一些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β及IL-1b。在某些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的活化标志物：CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR。在一些实施方案中，所编码的响应生物标志物为选自下组的趋化因子：IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7。
在一些实施方案中，测量了用GA测试制品刺激的细胞的至少两种GA引起的响应，并且测量了用GA参考标准物刺激的细胞的相同的至少两种GA引起的响应。在这些实施方案中，所述至少两种GA引起的响应可以选自以下各项的表达：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β、IL-1b、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279、HLA-DR、IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、编码IL-2的核酸、编码IL-4的核酸、编码IL-5的核酸、编码IL-6的核酸、编码IL-10的核酸、编码IL-13的核酸，或编码IL-17的核酸、编码IL-22的核酸、编码IFN-γ的核酸、编码TNF-α(TNF)的核酸、编码TNF-β(LT)的核酸、编码TGF-β的核酸、编码IL-1b的核酸、编码CD69的核酸、编码CD25的核酸、编码CD71的核酸、编码CD137的核酸、编码CD154的核酸、编码CD278的核酸、编码CD279的核酸、编码HLA-DR的核酸、编码IL-8(CXCL8)的核酸、编码RANTES(CCL5)的核酸、编码CCL1的核酸、编码CXCL4的核酸以及编码CXCL7的核酸。
在一些实施方案中，所述GA参考标准物为克帕松或GMA。
在一些实施方案中，其中所述合适的APC具有至少一种能够呈递GA肽的HLA-DR限制元件。在某些实施方案中，所述至少一种能够呈现GA肽的HLA-DR限制元件选自：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15。
在一些实施方案中，其中在步骤(a)中温育的至少一种GA特异性人类T细胞系是长期T细胞系。在一些实施方案中，所述至少一种GA特异性人类T细胞系是克隆的。在一些实施方案中，所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系在刺激之前已经被保持在培养物中至少约四周，事先再刺激至少四次，或者二者兼具。在一些实施方案中，所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系已经事先被再刺激至少八次。在一些实施方案中，将所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系保持在培养物中包括在不存在促分裂原的情况下用GA和自体APC反复再刺激。
在一些实施方案中，所述刺激包括用一系列量中的一个量的GA测试制品刺激与APC一起温育或在APC存在下温育的GA特异性人类T细胞的至少三个样品中的每一个，以及用相同系列量中的一个量的GA参考标准物刺激与APC一起温育或在APC存在下温育的GA特异性人类T细胞的至少三个样品中的每一个。在一些实施方案中，所述系列量的GA测试制品以及所述系列量的GA参考标准物包含约1ng/mL至约1mg/mL GA的上升剂量的GA。在一些实施方案中，所述系列量的GA测试制品以及所述系列量的GA参考标准物为约1μg/mL至约30μg/mL GA的上升剂量的GA。
本发明还涉及通过一种方法制备的含有GA的药物产品或药物组合物，该方法包括：1)通过使受保护的醋酸格拉替雷与氢溴酸反应以形成三氟乙酰基GA，用哌啶水溶液处理所述三氟乙酰基共聚物-1以形成GA，并纯化所述GA，来制备GA测试制品；2)通过以下步骤确定该GA测试制品和GA参考标准物是否在免疫学上相同：a)将至少一种GA特异性人类T细胞系的细胞与合适的抗原呈递细胞(APC)一起温育；b)用一定量的GA测试制品刺激包含在(a)中温育的至少一种GA特异性人类T细胞的预定数目的细胞的至少一个样品，并且单独地用相同量的GA参考标准物刺激包含在步骤(a)中温育的至少一种GA特异性人类T细胞系的相同预定数目的细胞的至少一个样品；c)测量在步骤(b)中用GA测试制品刺激的至少一种GA特异性人类T细胞系的至少一种GA引起的响应，并且测量在步骤(b)中用GA参考标准物刺激的至少一种GA特异性人类T细胞系的相同的至少一种GA引起的响应；以及d)比较以下两种测量结果：在步骤(b)中用GA测试制品刺激的至少一种GA特异性人类T细胞系的细胞的至少一个样品的至少一种GA引起的响应的测量结果，与在步骤(b)中用GA参考标准物刺激的至少一种GA特异性人类T细胞系的细胞的至少一个样品的相同的至少一种GA引起的响应的测量结果；其中当步骤(d)中的测量结果的比较落入可接受的范围内时，确定该GA测试制品与该GA参考标准物在免疫学上相同，并且其中如果确定该GA测试制品与该GA参考标准物具有免疫学同一性，则将该GA测试制品混合在药物产品或药物组合物中。
本发明另外涉及通过一种方法制备的含有GA的药物产品或药物组合物，该方法包括：1)通过使受保护的醋酸格拉替雷与氢溴酸反应以形成三氟乙酰基GA，用哌啶水溶液处理所述三氟乙酰基共聚物-1以形成GA，并纯化所述GA，来制备GA测试制品；2)使用权利要求1-24、25-46或139-160的方法确定该GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同。
本发明进一步涉及一种试剂盒，其包含本发明的测定组、用于该测定组中各种GA特异性人类T细胞系的合适的APC以及GA参考标准物。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1.一种鉴别GA特异性人类T细胞系的方法。该图显示了能够用来根据本发明的方法鉴别GA特异性人类T细胞系的一系列步骤。
图2A和2B.供体1GMA扩充的T细胞系AG12、BC11、AG11和BA11响应于由自体APC呈递的GMA的增殖。该图示出了采用在自体APC的存在下与0、1、10或100μg/mL GMA(MylanPharmaceuticals，Inc.)一起温育的四种供体1GMA扩充的T细胞系进行的细胞增殖的ATP试验的结果。零对照样品与APC一起但在没有抗原的情况下温育。2A.供体1T细胞系AG12(深灰色条)和BC11(浅灰色条)在自体APC的存在下响应于浓度逐渐升高的GA的增殖。2B.供体1T细胞系AG11(深灰色条)和BA11(浅灰色条)在自体APC的存在下响应于浓度逐渐升高的GA的增殖。
图3A-3C.供体1GMA扩充的T细胞系响应于由自体APC呈递的GMA或COP的增殖。该图示出了采用与浓度逐渐升高的GA以及自体APC一起温育的三种供体1GMA T细胞系进行的ATP试验的结果。3A.与0、0.3、1、3、10或30μg/mL GMA(Mylan Pharmaceuticals,Inc.；深灰色条)或克帕松(Teva Pharmaceuticals USA,Inc.；浅灰色条)以及自体APC一起温育的供体1T细胞系BA11的增殖。3B.与0、1、3或10μg/mL GMA(深灰色条)或克帕松(浅灰色条)以及自体APC一起温育的供体1T细胞系BC11(浅灰色条)的增殖。3C.与0、3、10和30μg/mL GMA(深灰色条)或克帕松(浅灰色条)以及自体APC一起温育的供体1T细胞系AG12的增殖。
图4A和4B.供体1GMA扩充的T细胞系响应于由EBV转化的B-LCL呈递的GMA或COP的IFN-γ产生。该图示出了采用在自体的EBV转化的B-LCL存在下与GMA、COP或破伤风类毒素一起温育的两种供体1GMA扩充的T细胞系的上清液进行的IFN-γ测定的结果。4A.在自体的EBV转化的B-LCL(深灰色条)或来自在一个等位基因处匹配的供体的EBV转化的B-LCL(206B-LCL；浅灰色条)的存在下，由供体1T细胞系AG11产生的IFN-γ。4B.在自体的EBV转化的B-LCL(深灰色条)或来自在一个等位基因处匹配的供体的EBV转化的B-LCL(206B-LCL；浅灰色条)的存在下，由供体1T细胞系AG12产生的IFN-γ。
图5A-5G.七种供体1COP扩充的T细胞系响应于由自体APC呈递的GMA或COP的增殖。该图示出了采用与0、1、3或10μg/mL GMA(Mylan Pharmaceuticals,Inc.)以及自体APC一起温育的四种供体1COP T细胞系进行的增殖的ATP试验结果。零对照样品与自体APC一起但在没有抗原的情况下温育。5A.供体1T细胞系2D8响应于GMA(深灰色条)或COP(浅灰色条)的增殖。5B.供体1T细胞系1H12响应于GMA(深灰色条)或COP(浅灰色条)的增殖。5C.供体1T细胞系2F12响应于GMA(深灰色条)或COP(浅灰色条)的增殖。5D.供体1T细胞系2B8响应于GMA(深灰色条)或COP(浅灰色条)的增殖。5E.供体1T细胞系1C5响应于GMA(深灰色条)或COP(浅灰色条)的增殖。5F.供体1T细胞系2B11响应于GMA(深灰色条)或COP(浅灰色条)的增殖。5G.供体1T细胞系2E1响应于GMA(深灰色条)或COP(浅灰色条)的增殖。
图6A-6F.供体1COP扩充的T细胞系响应于由自体APC呈递的GMA或COP的细胞因子分泌。6A.供体1T细胞系2D8响应于三种浓度的GMA中的每一种的细胞因子分泌。6B.供体1T细胞系2D8响应于三种浓度的COP中的每一种的细胞因子分泌。6C.供体1T细胞系1H12响应于三种浓度的GMA中的每一种的细胞因子分泌。6D.供体1T细胞系1H12响应于三种浓度的COP中的每一种的细胞因子分泌。6E.供体1T细胞系2F12响应于三种浓度的GMA中的每一种的细胞因子分泌。6F.供体1T细胞系2F12响应于三种浓度的COP中的每一种的细胞因子分泌。箭头指示每个细胞因子数据集中对照样品分泌水平的位置，其中从左至右为用由自体APC呈递的1μg/mL GA、3μg/mL GA、10μg/mL GA和作为对照的MBP刺激的细胞的分泌水平。
图7A和7B.在自体APC的存在下响应于GMA或COP的供体2T细胞系1A7增殖和IFN-γ产生。7A.示出了供体2T细胞系1A7响应于0、0.1、0.3、1、3、10、30或100μg/mL GMA的刺激的增殖。7B.示出了供体2T细胞系1A7响应于0、0.1、0.3、1、3、10、30或100μg/mL GMA的刺激的IFN-γ分泌。在每个实验中，浅灰色0μg/mL的抗原条代表含有1μg/mL破伤风类毒素、自体APC且不含GA的对照样品，而深灰色0μg/mL的抗原条代表含有自体APC且不含GA的对照样品。
图8.响应于COP、肽026、GAT 631、GLT 631的供体4T细胞系205-1C4增殖。示出了供体4T细胞系205-1C4响应于0、1、10及30μg/mL COP、肽026、GAT 631和GLT 631的刺激的增殖。
图9A和9B.供体3T细胞系165-B5G和165-C4G的HLA-DR限制。9A.在与或未与COP一起温育的供体3、5或6丝裂霉素处理的APC的存在下，供体3T细胞系165-B5G的增殖。9B.在与或未与GMA一起温育的供体3、5或6丝裂霉素处理的APC的存在下，供体3T细胞系165-C4G的增殖。在两张图中：空心条＝无抗原；实心条＝20μg/mL GA。
图10A和10B.供体3T细胞系165-C5G和165-E9G的HLA-DR限制。10A.在与或未与COP一起温育的供体3、5或6丝裂霉素处理的APC的存在下，供体3T细胞系165-C5G的增殖。10B.在与或未与COP一起温育的供体3、5或6丝裂霉素处理的APC的存在下的供体3T细胞系165-E9G。在两张图中：空心条＝无抗原；实心条＝20μg/mL COP。
图11A和11B.供体3T细胞系165-F5G和165-F10G的HLA-DR限制。11A.在与或未与COP一起温育的供体3、5或6丝裂霉素处理的APC的存在下，供体3T细胞系165-F5G的增殖。11B.在与或未与GMA一起温育的供体3、5或7丝裂霉素处理的APC的存在下，供体3T细胞系165-F10G的增殖。在两张图中：空心条＝无抗原；实心条＝20μg/mL GA。
图12A和12B.供体3T细胞系165-B6C和165-C7C的HLA-DR限制。12A.在与或未与COP一起温育的丝裂霉素处理的供体3、5或6APC的存在下，供体3T细胞系165-B6C的增殖。12B.在与或未与COP一起温育的供体3、5或6APC的存在下，供体3T细胞系165-C7C的增殖。在两张图中：空心条＝无抗原；实心条＝20μg/mL COP。
图13A和13B.供体3T细胞系165-D3C和165-F3C的HLA-DR限制。13A.在与或未与GMA一起温育的丝裂霉素处理的供体3、5或7APC的存在下，供体3T细胞系165-D3C的增殖。13B.在与或未与COP一起温育的供体3、5或6APC的存在下，供体3T细胞系165-F3C的增殖。在两张图中：空心条＝无抗原；实心条＝20μg/mL GA。
图14A和14B.供体3T细胞系165-F6C和205-1H7的HLA-DR限制。14A.在与或未与COP一起温育的供体3、5或7丝裂霉素处理的APC的存在下进行刺激后，供体3T细胞系165-F6C的增殖。14B.在与或未与COP一起温育的供体3、5或6丝裂霉素处理的APC的存在下，供体4T细胞系205-1H7的增殖。在两张图中：每一对中的左侧条＝无抗原；每一对中的右侧条＝20μg/mL COP。
图15A和15B.通过流式细胞术表征CD4和CD8的GA特异性人类T细胞系165-E9G表达。15A.如所指示的，与用PE或FITC标记的非特异性对照小鼠抗-IgG1单克隆抗体的结合。15B.如所指示的，与用PE标记的抗-CD8单克隆抗体以及用FITC标记的抗-CD4单克隆抗体的结合。
图16A和16B.通过流式细胞术表征CD4和CD8的GA特异性人类T细胞系165-F5G表达。15A.如所指示的，与用PE或FITC标记的非特异性对照小鼠抗-IgG1单克隆抗体的结合。15B.如所指示的，与用PE标记的抗-CD8单克隆抗体以及用FITC标记的抗-CD4单克隆抗体的结合。
图17A和17B.响应于改变的GA批009的供体1T细胞系的增殖。17A.示出了供体1T细胞系222-2D8响应于0、1、2、2.5和5μg/mL COP以及改变的GA批009的刺激的增殖。17B.示出了供体1T细胞系222-2F12响应于0、1、2、2.5和5μg/mL COP以及改变的GA批009的刺激的增殖。
图18A和18B.响应于改变的GA批009的供体3T细胞系的增殖。18A.示出了供体3T细胞系165-F3C响应于0、1、2、2.5和5μg/mL COP以及改变的GA批009的刺激的增殖。18B.示出了供体1T细胞系165-F6C响应于0、1、2、2.5和5μg/mL COP以及改变的GA批009的刺激的增殖。
图19A和19B.响应于改变的GA批009的供体4T细胞系的增殖。19A.示出了供体4T细胞系205-1C4响应于0、1、2、2.5和5μg/mL COP以及改变的GA批009的刺激的增殖。19B.示出了供体1T细胞系205-1C4响应于0、1、2、2.5和5μg/mL COP以及改变的GA批009的刺激的增殖。
具体实施方式
醋酸格拉替雷
醋酸格拉替雷(GA)由合成多肽的醋酸盐组成，该合成多肽含有四种天然存在的氨基酸：L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸及L-赖氨酸，它们分别具有0.141、0.427、0.095及0.338的平均摩尔分数。GA的平均分子量为5,000-9,000道尔顿。在化学上，GA被命名为具有L-丙氨酸、L-赖氨酸及L-酪氨酸的L-谷氨酸聚合物，醋酸(盐)。GA的经验式为(C5H9NO4·C3H7NO2·C6H14N2O2·C9H11NO3)x·xC2H4O2(CAS-147245-92-9,Physician’s DeskReference)。
如本文所用的，“GA”是指醋酸格拉替雷，包括，例如由Mylan Pharmaceuticals,Inc.生产的醋酸格拉替雷，即“GMA”，以及由Teva Pharmaceuticals USA,Inc.生产并出售的醋酸格拉替雷，即“COP”或“克帕松”。FDA于1996年批准克帕松用于治疗复发-缓解型多发性硬化(RRMS)。其组合物在文献例如美国专利号3,849,550，“Therapeutic copolymer”和美国专利号5,800,808，“Copolymer-1improvements in compositions of copolymers”中，以及在
(Teva Pharmaceuticals USA，Inc.)的产品标签上描述，每一个均通过引用全文并入本文。
醋酸格拉替雷的生产
GA可以通过已知和公开的方法生产。生产克帕松的方法已经在例如美国专利号3,849,550，“Therapeutic copolymer”和美国专利号5,800,808，“Copolymer-1improvementsin compositions of copolymers”中描述。根据美国专利号5,800,808所述，共聚物-1可以通过本领域已知的方法制备，例如，通过美国专利号3,849,550中公开的方法制备，其中酪氨酸、丙氨酸、y-苄基谷氨酸和E-N-三氟-乙酰基赖氨酸的N-羧基酸酐在无水二氧杂环己烷中以二乙胺为引发剂在环境温度下聚合。通过在冰醋酸中的溴化氢实现谷氨酸的y-羧基基团的去封端，随后通过1M哌啶从赖氨酸残基中去除三氟乙酰基基团。
GA测试制品
在本发明方法的实施方案中，将GA特异性人类T细胞系对GA的测试或生产制品、批(lot)或批次(batch)的GA引起的响应与对GA参考标准制品的相同的GA引起的响应进行比较。在一些实施方案中，GA测试制品为需要测试的任何GA制品、批或批次。在一些实施方案中，GA测试制品为新生产的GA制品。在其他实施方案中，GA测试制品不是新生产的，但需要进行测试以便例如评估该制品的保质期。GA参考标准批或GA参考标准物根据需要也可以是任何GA制品、批或批次，例如GMA或COP。在一些实施方案中，根据需要，本发明的方法用于将两种或更多种测试或生产制品与GA、与彼此或与任何另一种GA制品进行比较。在一些实施方案中，GA测试制品为GMA制品。在一些实施方案中，GA测试制品与GA参考标准物为不同的GMA制品。在一些实施方案中，将多种GA测试制品与GA参考标准物进行比较。在一些实施方案中，所比较的GA制品为例如GMA制品和COP制品，两种GMA制品，或由另一个制造商生产的GA制品以及GMA或COP。
测试GA制品
本发明涉及对评估GA制品有用的GA特异性人类T细胞系试验。这些试验可以确保GA制品例如在生产期间或在生产过程改变后的一致性。在一些实施方案中，本发明的方法用来通过在用GA测试制品或GA参考标准物单独刺激细胞系后比较GA特异性人类T细胞系的至少一种GA引起的响应，来确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同。根据在此呈现的结果，可以产生并鉴别能够辨别GA刺激制品的组成上的细微差异的GA特异性人类T细胞系。当用来刺激GA特异性T细胞系时，刺激抗原的细微差异导致GA特异性人类T细胞系的GA引起的响应的可测量的差异。
本发明的试验还可用于确定GA测试制品的相对GA效力，例如GA测试制品与GA参考标准物相比的效力。这些方法对在生产药学用途可接受的醋酸格拉替雷的过程中确保药物制品之间一致的效力是有用的。
在本发明的实施方案中，至少一种GA引起的响应在GA测试制品的测定中进行测量，并与对GA参考标准物的相同的GA引起的响应进行比较，以得到期望的相对效力。期望的相对效力可以表示为例如对GA测试制品的响应与对GA参考标准物的响应之比，或表示为份数、分数或百分比，其中当测量结果相等时百分比为100。
在本发明的实施方案中，通过将表示GA特异性人类T细胞系对GA测试制品的免疫应答的值与表示相同细胞系对GA参考标准物的相同应答的值进行比较来确定生产或测试制品中的GA相对效力。该效力确定描述了GA测试制品的刺激能力。在一些实施方案中，本发明的效力测定用来确定GA制品是否具有期望的效力。
GA特异性人类T细胞系的产生和鉴别
图1示出了根据本发明的方法产生并鉴别COP或GMA特异性人类T细胞系的一般方案。
首先，从未曾接受过GA
的正常健康供体获得细胞样品。通过例如白细胞分离术或静脉穿刺采集供使用的供体PBMC。在第0天用一定量的起始肽(GA制品)刺激密度为约5x 105至约1x 106个细胞/mL的采集的细胞。在一些实施方案中，最初将采集的细胞在约5x 105个细胞/mL、约6x 105个细胞/mL、约7x 105个细胞/mL、约8x 105个细胞/mL、约9x 105个细胞/mL或约1x 106个细胞/mL、细胞/mL的密度下进行刺激。将经刺激的细胞进行培养，并在实施方案中周期性地用生长促进剂例如IL-2处理，然后针对与起始肽的反应性筛选一部分。用起始肽和合适的APC再刺激细胞系培养物中对起始肽具有反应性的剩余部分，并根据需要添加生长促进剂。然后，通过采用如本文所述的特异性试验，将在MHC匹配的APC的存在下细胞对起始肽刺激的响应，与在MHC匹配的APC的存在下对合适的对照例如其他GA制品以及其他(不相关的)抗原例如破伤风类毒素的响应进行比较，来针对抗原特异性筛选经再刺激的GA反应性细胞系培养物的一部分。响应于GA但不响应于不相关抗原的细胞系被鉴别为GA特异性人类T细胞系。将剩余的细胞系培养物像之前一样用起始肽和合适的APC进行再刺激，并根据需要添加生长促进剂，以用于例如细胞系扩充或为确认GA特异性或进一步表征该细胞系的试验作准备。表征试验进一步测试所鉴别的GA响应性人类T细胞系的例如MHC限制、响应于GA刺激的响应生物标志物产生或对非规范GA肽的反应性。
在某些实施方案中，针对GA反应性筛选T细胞系和针对GA特异性进行筛选在初始刺激之后一起进行。在这些实施方案中，预期分别在MHC匹配的APC的存在下使用无抗原对照和非相关抗原对照两者。在一些实施方案中，在细胞系的再刺激之后确认人类T细胞系的GA特异性的初始确定。在一些实施方案中，所鉴别的GA特异性人类T细胞系在多轮再刺激之后，例如在至少2至10轮或更多轮的再刺激之后被证明是GA特异性的。在一些实施方案中，所鉴别的GA特异性人类T细胞系在至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、3至10轮、4至10轮、5至10轮、6至10轮、7至10轮、8至10轮、9至10轮、2至9轮、2至8轮、2至7轮、2至6轮、2至5轮、2至4轮、3至9轮、3至8轮、3至7轮、3至6轮、3至5轮、4至9轮、4至8轮、4至7轮、4至6轮、5至9轮、5至8轮、5至7轮、6至9轮、6至8轮、7至9轮或8至10轮再刺激之后被证明是GA特异性的。
在一些实施方案中，将采集的细胞在约1x 105至约1x 106个细胞/mL、约1x 105个细胞/mL、约1.5x 105个细胞/mL、约2x 105个细胞/mL、约2.5x 105个细胞/mL、约3x 105个细胞/mL、约3.5x 105个细胞/mL、约4x 105个细胞/mL、约4.5x 105个细胞/mL、约5x 105个细胞/mL、约6x 105个细胞/mL、约7x 105个细胞/mL、约8x 105个细胞/mL、约9x 105个细胞/mL或约1x 106个细胞/mL的密度下进行再刺激。
在本发明的其他实施方案中，预期在本发明的方法中使用通过所描述的方法鉴别的GA特异性人类T细胞系，包括响应于非规范GA肽的GA特异性T细胞系，以用于确定GA制品的免疫学同一性。
用于初始刺激的起始肽可以是期望的任何GA制品，包括但不限于任何COP制品或任何GMA制品。在一些实施方案中，用于再刺激的肽是与起始肽相同的GA制品。在一些实施方案中，用于再刺激的肽浓度与用于初始刺激的肽浓度相同。在一些实施方案中，刺激肽(也被称为“起始肽”)或再刺激肽以约1ng/mL至约1mg/mL的浓度添加。在一些实施方案中，用于初始刺激或再刺激的肽的浓度为约1ng/mL至约1mg/mL、约1ng/mL至约500μg/mL、约1ng/mL至约100μg/mL、约1ng/mL至约50μg/mL、约1ng/mL至约10μg/mL、约1ng/mL至约1μg/mL、约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约1mg/mL、约100ng/mL至约500μg/mL、约100ng/mL至约100μg/mL、约100ng/mL至约10μg/mL、约100ng/mL至约1μg/mL、约100ng/mL至约500ng/mL、约500ng/mL至约1mg/mL、约500ng/mL至约500μg/mL、约500ng/mL至约100μg/mL、约500ng/mL至约10μg/mL、约500ng/mL至约1μg/mL、约1μg/mL至约1mg/mL、约1μg/mL至约900μg/mL、约1μg/mL至约800μg/mL、约1μg/mL至约700μg/mL、约1μg/mL至约600μg/mL、约1μg/mL至约500μg/mL、约1μg/mL至约400μg/mL、约1μg/mL至约300μg/mL、约1μg/mL至约200μg/mL、1μg/mL至约100μg/mL、1μg/mL至约90μg/mL、1μg/mL至约80μg/mL、1μg/mL至约70μg/mL、1μg/mL至约60μg/mL、1μg/mL至约50μg/mL、1μg/mL至约40μg/mL、1μg/mL至约30μg/mL、约10μg/mL至约1mg/mL、约10μg/mL至约900μg/mL、约10μg/mL至约800μg/mL、约10μg/mL至约700μg/mL、约10μg/mL至约600μg/mL、约10μg/mL至约500μg/mL、约10μg/mL至约400μg/mL、约10μg/mL至约300μg/mL、约10μg/mL至约200μg/mL、约10μg/mL至约100μg/mL、约10μg/mL至约90μg/mL、约10μg/mL至约80μg/mL、约10μg/mL至约70μg/mL、约10μg/mL至约60μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约30μg/mL、约50μg/mL至约1mg/mL、约50μg/mL至约900μg/mL、约50μg/mL至约800μg/mL、约50μg/mL至约700μg/mL、约50μg/mL至约600μg/mL、约50μg/mL至约500μg/mL、约50μg/mL至约400μg/mL、约50μg/mL至约300μg/mL、约50μg/mL至约200μg/mL、约50μg/mL至约500μg/mL、约50μg/mL至约90μg/mL、约50μg/mL至约80μg/mL、约50μg/mL至约70μg/mL、约100μg/mL至约1mg/mL、约100μg/mL至约900μg/mL、约100μg/mL至约800μg/mL、约100μg/mL至约700μg/mL、约100μg/mL至约600μg/mL、约100μg/mL至约500μg/mL、约100μg/mL至约400μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约200μg/mL、约100μg/mL至约150μg/mL、约200μg/mL至约1mg/mL、约200μg/mL至约900μg/mL、约200μg/mL至约800μg/mL、约200μg/mL至约700μg/mL、约200μg/mL至约600μg/mL、约200μg/mL至约500μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约200μg/mL至约300μg/mL、约200μg/mL至约250μg/mL、约300μg/mL至约1mg/mL、约300μg/mL至约900μg/mL、约300μg/mL至约800μg/mL、约300μg/mL至约700μg/mL、约300μg/mL至约600μg/mL、约300μg/mL至约500μg/mL、约300μg/mL至约400μg/mL、约400μg/mL至约1mg/mL、约400μg/mL至约900μg/mL、约400μg/mL至约800μg/mL、约400μg/mL至约700μg/mL、约400μg/mL至约600μg/mL、约400μg/mL至约500μg/mL、约500μg/mL至约1mg/mL、约500μg/mL至约900μg/mL、约500μg/mL至约800μg/mL、约500μg/mL至约700μg/mL、约500μg/mL至约600μg/mL、约750μg/mL至约1mg/mL、约750μg/mL至约900μg/mL、约750μg/mL至约800μg/mL或约800μg/mL至约1mg/mL。
在一些实施方案中，通过向含有约1x 105个细胞至约2x 105个细胞的细胞样品中添加所需浓度的起始肽来进行初始刺激。在一些实施方案中，细胞样品的体积为100至200μl，并且样品中的细胞密度为约5x 105个细胞/mL至约1x 106个细胞/mL。在一些实施方案中，起始肽以约1μg/mL至约100μg/mL的最终肽浓度添加至细胞样品中。
在一些实施方案中，在初始刺激或再刺激之后，向细胞培养物或样品一次或多次地添加一种或多种生长促进剂。在一些实施方案中，该生长促进剂为IL-2。可以根据例如细胞生长的速率，按需要在培养期间以规则或不规则的间隔，例如每2天至10天，添加生长促进剂。在一些实施方案中，每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每8天、每9天或每10天添加生长促进剂。如本领域技术人员已知的，可以根据培养物的生长特征，例如通过显微镜检查的细胞健康以及由pH指示剂染料所指示的培养基pH来确定待添加的生长促进剂的合适的量。在一些实施方案中，每mL细胞培养物中添加约5至约30个单位(U)的IL-2。在一些实施方案中，每mL细胞培养物中添加约10、约15、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约5至约30、约5至约25、约5至约20、约5至约15、约5至约10、约10至约30、约10至约25、约10至约20、约10至约15、约15至约30、约15至约25、约15至约20、约20至约30、约20至约25、约25至约30、约17至约23、约18至约22或约19至约21个单位的IL-2。在一些实施方案中，在初始刺激后的D3和D6向细胞培养物添加约20U/mL的IL-2。在一些实施方案中，在初始刺激后，每3天向细胞培养物中添加约15至约25U/mL的IL-2。在一些实施方案中，在再刺激后的18小时至2天向细胞培养物中添加约15至约25U/mL的IL-2。在一些实施方案中，在再刺激后的18小时至24小时向细胞培养物中添加约20U/mL的IL-2。在一些实施方案中，向含有约5x 105个细胞/mL至约1x 106个细胞/mL的细胞样品中添加起始肽。在一些实施方案中，起始肽以约1μg/mL至约100μg/mL的最终肽浓度添加至细胞样品中，并且IL-2以约15至约25U/mL的最终浓度添加至细胞样品中。在一些实施方案中，以约1μg/mL至约100μg/mL的最终浓度向含有约5x 105个细胞/mL至约1x 106个细胞/mL的细胞样品中添加起始肽，并在初始刺激之后并在筛选反应性之前，以约15至约25U/mL的最终浓度向该细胞样品中添加IL-2至少两次。在一些实施方案中，在初始刺激后D3和D6，以约1μg/mL至约100μg/mL的最终浓度向含有约5x105个细胞/mL至约1x 106个细胞/mL细胞的细胞样品中添加起始肽，并以约15至约25U/mL的最终浓度向细胞样品中添加IL-2。在一些实施方案中，以约1μg/mL至约100μg/mL的最终浓度向含有约5x 105个细胞/mL至约1x 106个细胞/mL的细胞样品中添加起始肽，并且在初始刺激之后，每3天以约15至约25U/mL的最终浓度向该细胞样品中添加IL-2。
如图1中所示，用起始肽刺激后至少约7天至约16天，针对与起始肽的反应性筛选细胞系。在一些实施方案中，在第0天用起始肽初始刺激后至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、约7至约16天、约8至约14天、约8至约12天、约8至约10天、约10至约16天、约10至约14天、约12至约16天或约12至约14天后，或者只要培养物在没有再刺激的情况下保持健康时，针对与起始肽的反应性筛选细胞系。在一些实施方案中，在用起始肽和合适的APC进行至少一次再刺激后，针对与起始肽的反应性筛选细胞系。在一些实施方案中，在第0天用起始肽初始刺激之后进行2至10轮再刺激之后，针对与起始肽的反应性筛选经刺激的细胞培养物。因此，只要在由本领域技术人员确定为必要时对经刺激的细胞培养物进行再刺激，可以在任何时间，例如在超过约14天后，针对与起始肽的反应性筛选经刺激的细胞培养物。
GA起始肽可以根据本领域已知的方法通过将肽稀释于溶液中，例如通过悬浮于水和约20mg/mL甘露糖醇中或培养基中来制备。用于生物测定的GA制品在例如美国专利号7,429,374，“Process for the measurement of the potency of glatiramer acetate”中描述，该专利通过引用并入本文。
针对与GA的反应性进行筛选
如图1中描述和描绘的，在初始刺激后针对GA反应性筛选T细胞培养物。通过制备含有GA和合适的APC的测试培养物，并测量T细胞培养物所产生的GA引起的响应来进行筛选。在其中使用供体PBMC的实施方案中，供体PBMC已含有自体APC。用于本发明方法的合适的APC是能够向T细胞呈递抗原的细胞，包括，例如，对于GA特异性人类T细胞而言为自体的EB病毒转化的(EBV转化的)人类B细胞、对于GA特异性人类T细胞而言为自体的纯化的单核细胞、对于GA特异性人类T细胞而言为自体的纯化的树突细胞、对于GA特异性人类T细胞而言为自体的PBMC、具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的EBV转化的人类B细胞、具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的纯化的单核细胞、具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的纯化的树突细胞，以及具有参与向GA特异性人类T细胞的抗原呈递的DR分子的PBMC。
在一些实施方案中，通过任何已知的方法，包括暴露于γ射线或抗有丝分裂剂例如丝裂霉素C，抑制APC在使用前的增殖。
在一些实施方案中，在约1x 105至约5x 105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL、约2x 105个细胞/mL、约2.5x 105个细胞/mL、约3x 105个细胞/mL、约3.5x 105个细胞/mL、约4x 105个细胞/mL、约4.5x 105个细胞/mL或约5x 105个细胞/mL的细胞密度下针对GA反应性筛选T细胞培养物。
在一些实施方案中，APC以等于所使用的T细胞数目或所使用的T细胞数目的两倍的数目存在。在一些实施方案中，自体的丝裂霉素处理的PBMC以约2.5x 105至约5x 106个细胞/mL存在。在一些实施方案中，自体的丝裂霉素处理的PBMC以1x 106-2x 106个细胞/mL存在。在一些实施方案中，自体的丝裂霉素处理的PBMC以2.5x106个细胞/mL存在。
在一些实施方案中，自体的丝裂霉素处理的B-LCL以约1x105-1x 106个细胞/mL存在。在一些实施方案中，自体的丝裂霉素处理的B-LCL以约1x 105-5x 105个细胞/mL存在。在一些实施方案中，自体的丝裂霉素处理的B-LCL以约1x 105个细胞/mL、约1.5x 105个细胞/mL、约2x 105个细胞/mL、约2.5x 105个细胞/mL或约5x 105个细胞/mL存在。在一些实施方案中，根据需要调节在本发明方法的筛选或表征试验中使用的APC的数目，以使GA引起的响应增加至例如相对于阴性对照的最低期望水平。在一些实施方案中，如下文所述，GA引起的响应的最低期望水平是相对于阴性对照1.5倍(即，响应提高约50％)至约1000倍。
将所测得的GA引起的响应与对照中所测得的相同的响应，例如在不存在抗原(GA)或存在适合充当阴性对照的不相关抗原下在含有合适的APC的培养物中相同T细胞系的响应进行比较。筛选读出结果可以来自针对优选的GA引起的响应的任何合适的测定，包括但不限于增殖测定，或其中测量培养物所产生的至少一种细胞因子、细胞因子受体、趋化因子或T细胞活化标志物的量的响应生物标志物测定。在一些实施方案中，GA引起的响应是编码响应生物标志物的核酸的表达。根据在用GA培养的T细胞系以及对照培养物中测得的GA引起的响应的比较来鉴别GA特异性T细胞系。
在一些实施方案中，根据在用GA刺激的测试培养物中测得的至少一种GA引起的响应的增加来鉴别GA反应性或响应性T细胞系，该响应在统计学上大于在无抗原对照培养物或非相关抗原对照培养物中测得的相同的至少一种GA引起的响应。在一些实施方案中，根据测试培养物的GA引起的响应相对于对照约1.5倍(即，响应提高约50％)至约1000倍、约1.5至约2倍、约1.5至约3倍、约1.5至约4倍、约1.5至约5倍、约1.5至约6倍、约1.5至约7倍、约1.5至约8倍、约1.5至约9倍、约2至约3倍、约2至约4倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约2至约10倍、约3至约4倍、约3至约5倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约3至约10倍、约4至约5倍、约4至约6倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、约4至约10倍、约5至约6倍、约5至约7倍、约5至约8倍、约5至约9倍、约5至约10倍、约6至约7倍、约6至约8倍、约6至约9倍、约6至约10倍、约7至约8倍、约7至约9倍、约7至约10倍、约8至约9倍、约8至约10倍、约1.5倍至约80倍、约1.5倍至约70倍、约1.5倍至约60倍、约1.5倍至约50倍、约1.5倍至约40倍、约1.5倍至约30倍、约1.5倍至约20倍、约2倍至约80倍、约1.5倍至约70倍、约1.5倍至约60倍、约1.5倍至约50倍、约1.5倍至约40倍、约1.5倍至约30倍、约1.5倍至约20倍、约2倍至约80倍、约2倍至约70倍、约2倍至约60倍、约2倍至约50倍、约2倍至约40倍、约2倍至约30倍、约2倍至约20倍、约3倍至约80倍、约3倍至约70倍、约3倍至约60倍、约3倍至约50倍、约3倍至约40倍、约3倍至约30倍、约3倍至约20倍、约5倍至约80倍、约5倍至约70倍、约5倍至约60倍、约5倍至约50倍、约5倍至约40倍、约5倍至约30倍、约3倍至约20倍、约10倍至约80倍、约10倍至约60倍、约10倍至约40倍、或约10倍至约20倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍的增加，来鉴别GA反应性或响应性T细胞系。
在某些实施方案中，根据用GA刺激的测试培养物的增殖相对于无抗原对照培养物或非相关抗原对照培养物的增殖至少50％的增加来鉴别GA反应性或响应性T细胞系。在一些实施方案中，根据在用GA刺激的测试培养物中测得的两种或更多种GA引起的响应相对于在无抗原对照培养物或非相关抗原对照培养物中测得的相同的两种或更多种GA引起的响应的增加来鉴别GA反应性或响应性T细胞系。在一些实施方案中，测量2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种GA引起的响应。
针对GA特异性筛选T细胞系
如图1中进一步示出的，针对GA特异性筛选GA反应性T细胞系。在一些实施方案中，通过另外筛选对合适的阴性对照抗原例如来自不相关蛋白质的肽不响应的T细胞系，GA特异性的测试与GA反应性测定一起进行。在一些实施方案中，通过将在用GA刺激的测试培养物中测得的至少一种GA引起的响应与在含有阴性对照抗原的培养物中测得的相同的至少一种GA引起的响应进行比较，来测试T细胞系的GA特异性。在一些实施方案中，阴性对照抗原培养物包含阴性对照抗原，例如破伤风类毒素、MBP、CMV、PPD或同种异体MHC。
对所鉴别的GA反应性T细胞系的GA特异性的测试可以充当GA反应性的确认测试。在一些实施方案中，在特异性测试之前确认GA反应性。在一些实施方案中，在培养期间的任何时间点，例如在将冷冻培养物解冻之后再次确认所鉴别的GA反应性或GA特异性人类T细胞系的GA反应性。在一些实施方案中，当T细胞系对GA参考标准物的反应性的确认测试为阴性时，该T细胞系不再被视为GA特异性或反应性的，并且可以被丢弃。
在一些实施方案中，通过响应于GA刺激所测得的(平均)GA引起的响应来鉴别GA特异性人类T细胞系，该GA引起的响应在统计学上大于(平均)阴性对照GA引起的响应。
在一些实施方案中，根据在用GA刺激的测试培养物中测得的至少一种GA引起的响应相对于在阴性对照培养物中测得的相同的至少一种GA引起的响应的增加来鉴别GA特异性T细胞系。在一些实施方案中，该增加为约1.5至约10倍(即，响应升高约50％至约1000％)、约1.5至约2倍、约1.5至约3倍、约1.5至约4倍、约1.5至约5倍、约1.5至约6倍、约1.5至约7倍、约1.5至约8倍、约1.5至约9倍、约2至约10倍、约2至约3倍、约2至约4倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约10倍、约3至约4倍、约3至约5倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约10倍、约4至约5倍、约4至约6倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、约5至约10倍、约5至约6倍、约5至约7倍、约5至约8倍、约5至约9倍、约6至约10倍、约6至约7倍、约6至约8倍、约6至约9倍、约7至约10倍、约7至约8倍、约7至约9倍、约8至约10倍、约8至约9倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。
在一些实施方案中，使用下式鉴别GA特异性人类T细胞系：
对测试抗原的GA引起的响应减去对对照的相同响应÷对参考抗原的GA引起的响应减去对对照的响应＝0.8至1.2，或80％至120％。因此该比较在可接受的范围或限度内。在这些实施方案中，根据“单一参考批、单剂量分析”来确定T细胞系是GA特异性的。在一些实施方案中，当在一种GA剂量、两种不同的GA剂量、三种或更多种不同的GA剂量下单一参考、单剂量分析比较的值在可接受的范围内时，鉴别出人类T细胞系的GA特异性。
在一些实施方案中，用于获得上式的分母值的参考抗原与用于引发并刺激T细胞系的抗原相同。在一些实施方案中，用测试抗原刺激后观察到的GA引起的响应不超过在用于获得细胞系的抗原刺激后观察到的值的20％以上或以下。在一些实施方案中，如果人类T细胞系在大多数测定运行中均符合这些标准，在任何测试的浓度下均没有显示出较大的偏差，并且对测试和参考抗原响应值具有相似的剂量响应曲线且曲线形状没有较大偏差，则将该人类T细胞系鉴别为GA特异性的。
在上述实施方案中可以采用任何合适的对照，例如无抗原对照或非相关抗原对照。
在上述实施方案中，所述可接受的范围为例如约80％至约120％、约75％至约120％、约75％至约115％、约75％至约110％、约75％至约105％、约75％至约100％、约80％至约125％、约85％至约125％、约90％至约125％、约95％至约125％、约100％至约125％、约80％至约118％、约80％至约115％、约80％至约112％、约80％至约110％、约80％至约108％、约80％至约105％、约80％至约102％、约80％至约101％、约80％至约100％、约80％至约99％、约80％至约98％、约80％至约97％、约80％至约95％、约80％至约92％、约80％至约90％、约82％至约120％、约82％至约118％、约82％至约115％、约82％至约112％、约82％至约110％、约82％至约108％、约82％至约105％、约82％至约102％、约82％至约101％、约82％至约100％、约82％至约99％、约82％至约98％、约82％至约97％、约82％至约95％、约82％至约92％、约82％至约90％、约84％至约120％、约84％至约118％、约84％至约115％、约84％至约112％、约84％至约110％、约84％至约108％、约84％至约105％、约84％至约102％、约84％至约101％、约84％至约100％、约84％至约99％、约84％至约98％、约84％至约97％、约84％至约95％、约84％至约92％、约84％至约90％、约86％至约120％、约86％至约118％、约86％至约115％、约86％至约112％、约86％至约110％、约86％至约108％、约86％至约105％、约86％至约102％、约86％至约101％、约86％至约100％、约86％至约99％、约86％至约98％、约86％至约97％、约86％至约95％、约86％至约92％、约88％至约120％、约88％至约118％、约88％至约115％、约88％至约112％、约88％至约110％、约88％至约108％、约88％至约105％、约88％至约102％、约88％至约101％、约88％至约100％、约88％至约99％、约88％至约98％、约88％至约97％、约88％至约95％、约90％至约120％、约90％至约118％、约90％至约115％、约90％至约112％、约90％至约110％、约90％至约108％、约90％至约105％、约90％至约102％、约90％至约101％、约90％至约100％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约95％、约92％至约120％、约92％至约118％、约92％至约115％、约92％至约112％、约92％至约110％、约92％至约108％、约92％至约105％、约92％至约102％、约92％至约101％、约92％至约100％、约92％至约99％、约92％至约98％、约95％至约120％、约95％至约118％、约95％至约115％、约95％至约112％、约95％至约110％、约95％至约108％、约95％至约105％、约95％至约102％、约95％至约101％、约95％至约100％、约97％至约120％、约97％至约118％、约97％至约115％、约97％至约112％、约97％至约110％、约97％至约108％、约97％至约105％、约97％至约102％、约98％至约120％、约98％至约118％、约98％至约115％、约98％至约112％、约98％至约110％、约98％至约108％、约98％至约105％、约99％至约120％、约99％至约118％、约99％至约115％、约99％至约112％、约99％至约110％、约99％至约108％、约99％至约105％、约100％至约120％、约100％至约118％、约100％至约115％、约100％至约112％、约100％至约110％、约100％至约108％、约100％至约105％、约101％至约120％、约101％至约118％、约101％至约115％、约101％至约112％、约101％至约110％、约101％至约108％、约102％至约120％、约102％至约118％、约102％至约115％、约102％至约112％、约102％至约110％、约102％至约108％、约105％至约120％、约105％至约118％、约105％至约115％、约105％至约112％、约105％至约110％、约110％至约120％、约110％至约118％或约110％至约115％。
在一些实施方案中，根据在用GA刺激的测试培养物中测得的至少2种、至少3种、至少4种或更多种不同的GA引起的响应相对于阴性对照培养物的相同的GA引起的响应的增加来鉴别GA特异性T细胞系。
在一些实施方案中，使用在不同GA剂量下测得的GA引起的响应生成剂量响应曲线，并通过将采用测试GA批获得的剂量响应曲线与采用参考GA批获得的剂量响应曲线进行比较来鉴别GA特异性。在这些实施方案中，根据“单一参考批剂量响应曲线分析”鉴别人类T细胞系的GA特异性。在这些实施方案中，当根据本领域已知的任何合适的统计方法确定测试GA批与参考GA批的剂量响应曲线在线性范围内的斜率在统计学上相似或相同时，可以鉴别人类T细胞系的GA特异性。
在一些实施方案中，为实现GA特异性的确定，参考批剂量响应曲线的斜率(β*)必须符合适当的接受标准。适当的接受标准可由本领域技术人员预先确定。在某些实施方案中，适当的接受标准为：
·相关系数(r)≥0.90
·斜率≥0.60
·GA标准物的反算浓度在标称浓度的±30％内
·GA样品的精确度≤变异系数(CV)的20％。
在一些实施方案中，75％的阳性对照样品(例如，用ConA刺激的细胞)的GA引起的响应必须高于在用任意浓度的GA刺激相同细胞时引起的最高响应。在一些实施方案中，75％的阴性对照样品(例如，用对照肽例如髓磷脂碱性蛋白MBP处理的细胞)的GA引起的响应必须低于或接近于用任何浓度的GA引起的最低响应。
可以对GA参考批样品集进行线性回归，其中将数据点以对数-对数尺度绘图。GA引起的响应值(通过增加分析物的浓度，下文中示为IL-2)的对数在Y轴上，而GA参考批的浓度(剂量)值的对数在X轴上。
用于上述数据集的最合适的线性回归模型如下：
Y＝α+β·X (1)其中Y＝log10(mIL-2浓度)并且X＝log10(GA浓度)。用适当的表示式取代X和Y变量，上述模型变成下式：
log10(mIL-2浓度)＝α+β·log10(GA-浓度) (2)
在一些实施方案中，当测试批曲线的斜率在可接受的限度内时，确立GA特异性。测试批曲线的斜率的可接受的限度采用以下的一系列等式根据参考批曲线来确定：
给定的log(响应)的反算剂量值为：
X反算＝10(Y-α)/β，其中Y＝log10(mIL-2浓度) (3)
准确率可以通过下式计算：
Y低和Y高是由±(平均值+2*SD)的最高容许准确率允许的最低和最高的log(响应)值，其中平均值+2*SD为约95％的个体容差区域的最高限度。
因此，斜率相等的假设将被接受的区域为：
如下计算：
随后，将上述区域简化成下式，以用于确定可接受的β*限度：
其中β为GA参考批曲线的斜率。因此，通过等式(6)确定的GA测试批斜率β*的可接受的范围可如下表示：
β·(下限)≤β*≤β·(上限) (9)
如果β*在上述可接受的限度内，则可以得出平行性的结论。
在一些实施方案中，相关系数为0.90至0.98。在一些实施方案中，相关系数大于或等于0.90、大于或等于0.91、大于或等于0.92、大于或等于0.93、大于或等于0.94、大于或等于0.95、大于或等于0.96、大于或等于0.97、大于或等于0.98、0.90至0.98、0.91至0.98、0.92至0.98、0.93至0.98、0.94至0.98、0.95至0.98、0.96至0.98、0.90至0.97、0.91至0.97、0.92至0.97、0.93至0.97、0.94至0.97、0.95至0.97，或0.96至0.98。
在一些实施方案中，使用针对相等斜率的真实假设检验。
在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系为长期GA特异性人类T细胞系，也就是说，其被证明在延长的培养期内保持GA特异性。在一些实施方案中，例如通过再筛选以确认GA特异性，证明了本发明的长期GA特异性人类T细胞系在培养至少约4周到至少约10周或更久之后仍保持GA特异性。在一些实施方案中，证明了本发明的GA特异性人类T细胞系在培养至少约4周到至少约12周或更久(不包括冷冻储存所耗费的任何时间)之后仍保持GA特异性。在一些实施方案中，证明了本发明的GA特异性人类T细胞系在培养至少约4周、至少约5周、至少约6周、至少约7周、至少约8周、至少约9周、至少约10周、至少约11周、至少约12周、约4周到约12周、约4周到约11周、约4周到约10周、约4周到约9周、约4周到约8周、约4周到约7周、约4周到约6周、约5周到约12周、约5周到约11周、约5周到约10周、约5周到约9周、约5周到约8周、约5周到约7周、约6周到约12周、约6周到约11周、约6周到约10周、约6周到约9周、约6周到约8周、约7周到约12周、约7周到约11周、约7周到约10周、约7周到约9周、约8周到约12周、约8周到约11周、约8周到约10周、约9周到约12周或约9周到约11周(不包括冷冻储存所耗费的任何时间)之后仍保持GA特异性。
在一些实施方案中，证明了本发明的长期GA特异性人类T细胞系如本文所述在合适的APC存在下生长时，在延长的培养期内保持GA特异性。在一些实施方案中，合适的APC为自体APC。在特定的实施方案中，证明了本发明的长期GA特异性人类T细胞系在不存在促分裂原的情况下生长时长期保持GA特异性。在一些实施方案中，缺乏的促分裂原是例如植物血凝素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)、脂多糖或葡萄球菌肠毒素B(SEB)。在不存在促分裂原的情况下长期生长且保持GA特异性是本发明的GA特异性人类T细胞系的显著特征。在特定的实施方案中，证明本发明的长期GA特异性人类T细胞系在存在GA和合适的自体APC、未添加促分裂原的情况下生长时，在培养物中培养至少约4周或至少1到10轮再刺激以及扩充之后，仍保持GA特异性。在一些实施方案中，证明所鉴别的GA特异性人类T细胞系在多轮的再刺激和扩充之后，例如在至少1至10轮或更多轮的再刺激及扩充之后是GA特异性的。在一些实施方案中，证明长期GA特异性人类T细胞系在至少1轮、至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、2至10轮、3至10轮、4至10轮、5至10轮、6至10轮、7至10轮、8至10轮、9至10轮、1至9轮、2至9轮、3至9轮、4至9轮、5至9轮、6至9轮、7至9轮、1至8轮、2至8轮、3至8轮、4至8轮、5至8轮、6至8轮、1至7轮、2至7轮、3至7轮、4至7轮、5至7轮、1至6轮、2至6轮、3至6轮、4至6轮、1至5轮、2至5轮、3至5轮、1至4轮、2至4轮或1至3轮再刺激和扩充之后是GA特异性的。
在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系在扩充期间保持约1x 105至约1x 106个细胞/mL、约1x 105个细胞/mL、约1.5x 105个细胞/mL、约2x 105个细胞/mL、约2.5x 105个细胞/mL、约3x 105个细胞/mL、约3.5x 105个细胞/mL、约4x 105个细胞/mL、约4.5x 105个细胞/mL、约5x 105个细胞/mL、约6x 105个细胞/mL、约7x 105个细胞/mL、约8x 105个细胞/mL、约9x 105个细胞/mL或约1x 106个细胞/mL的细胞密度。
在一些实施方案中，根据用第一GA制品刺激T细胞系时通过测量GA引起的响应所获得的值与用第二GA制品刺激T细胞系时通过测量相同的GA引起的响应所获得的值的比较确定GA特异性人类T细胞系是GA特异性的，其中第二GA制品的响应值与第一GA制品的响应值的比较在预定的可接受的范围内，并且其中该GA特异性人类T细胞系为长期GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，根据用第一GA制品以多个剂量刺激GA特异性人类T细胞系时通过测量GA引起的响应所获得的剂量响应曲线与用第二GA制品以多个剂量刺激GA特异性人类T细胞系时通过测量相同的GA引起的响应所获得的剂量响应曲线的比较确定GA特异性人类T细胞系是GA特异性的，其中第二GA制品的剂量响应曲线的斜率与第一GA制品的剂量响应曲线的斜率的比较在可接受的限度内，并且其中该GA特异性人类T细胞系为长期GA特异性人类T细胞系。
在上述两个实施方案的任一个中，第一GA制品可以与用于产生GA特异性人类T细胞系的制品相同。在一些实施方案中，第一GA制品为COP。在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系是克隆的。在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系具有已知的MHC限制。在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系具有选自DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15的已知MHC限制。在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系包含至少98％的CD4+T细胞，以及不超过2％的CD8+T细胞。
在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系对非规范GA肽是反应性的。在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系对选自肽026、GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA41S、GA 64和GT 11的非规范GA肽是反应性的。
在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系对非规范GA肽不是反应性的。在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系对选自肽026、GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA 41S、GA 64和GT 11的非规范GA肽不是反应性的。
GA特异性人类T细胞系的扩充
在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的细胞系，例如初始人类T细胞系(未筛选的)、GA反应性人类T细胞系(显示为GA反应性的)或经鉴别的GA特异性人类T细胞系(显示为GA特异性的)，在一个或多个筛选阶段之前或之后进行扩充。扩充增加了培养物中的细胞的数目，并可以根据需要在所描述的GA特异性T细胞系鉴别和表征过程期间的任何时间多次进行。通常，人类T细胞系的扩充在该细胞系的建立或GA特异性确认之后进行。在一些实施方案中，细胞系在冷冻以供储存之前，或在解冻之后进行扩充。在一些实施方案中，人类T细胞系在如图1中概括的过程期间扩充多次。在一些实施方案中，经鉴别的GA特异性人类T细胞系在扩充后并且在用于确定其与另一种GA制品是否具有免疫学同一性的方法中使用之前，再测试其GA特异性。
通过在合适的APC以及生长促进剂(如果需要)例如IL-2的存在下，用如上文针对初始刺激所描述的起始肽再刺激T细胞系来进行T细胞系的扩充。在一些实施方案中，在再刺激后约12至约36小时添加IL-2，并将培养物温育约6天至约14天。在一些实施方案中，重复该过程，并根据需要冷冻部分培养物。在一些实施方案中，通过用最终浓度为约1μg/mL至约100μg/mL的起始肽再刺激细胞，添加约等于所使用的T细胞数目至所使用的T细胞数目的约两倍的量的APC，并在约12至约36小时后添加最终浓度为约10至约25U/mL的IL-2，来进行经确认的GA特异性人类T细胞系的扩充。在一些实施方案中，该过程以以下的间隔重复多次：约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约7至约14天、约7至约13天、约7至约12天、约7至约11天、约7至约10天、约7至约9天、约8至约14天、约8至约13天、约8至约12天、约8至约11天、约8至约10天、约9至约14天、约9至约13天、约9至约12天、约9至约11天、约10至约14天、约10至约13天、约10至约12天、约10至约11天、约11至约14天、约11至约13天或约12至约14天。在某些实施方案中，通过用最终浓度为约1μg/mL至约100μg/mL的起始肽再刺激细胞，添加约等于所使用的T细胞数目至所使用的T细胞数目的约两倍的量的APC，并在约12至约36小时后添加最终浓度为约10至约25U/mL的IL-2，并进一步将细胞温育约7至约10天，来进行经确认的GA特异性人类T细胞系的扩充。如需要，在再刺激以开始另一扩充循环之前的温育时间可以通过组织培养领域的技术人员已知的任何方法来确定，例如通过评估培养基中的pH指示剂染料的颜色以及细胞特征。在一些实施方案中，在温育期结束时，通过根据本领域已知的方法分割培养物，并再刺激以进一步扩充来重复扩充过程。在一些实施方案中，将扩充的细胞冷冻以供储存、再刺激并测试GA特异性，或用于如本文所述的表征测试。
本领域已知的任何合适的T细胞扩充培养基(允许淋巴谱系发育的)可用于依据本发明的方法使T细胞系生长。在一些实施方案中，使用了无血清培养基。在一些实施方案中，使用的培养基为例如AIM V(Invitrogen)、X-VIVO 
培养基(Lonza)、
T细胞扩充培养基(Sigma-Aldrich)。在一些实施方案中，培养基缺少动物血清、饲养细胞以及基于细胞的细胞外基质。包括无血清培养基在内的合适的培养基的配制在本领域中已知并在例如美国专利号6,733,746，“Hematopoietic cell culture nutrient supplement”和8,481,315，“Methods of expanding myeloid cell populations and uses thereof”中描述，两者均通过引用并入本文。
GA特异性人类T细胞系的表征
本发明的GA特异性人类T细胞系可以如本文所述进行表征。根据每种GA特异性人类T细胞系的特征，例如免疫特征，组装了包含具有不同MHC限制、不同生物标志物谱和对非规范GA肽的不同响应的细胞系的组，以在用于GA制品中GA表位的全面探询(comprehensiveinterrogation)的平行测定形式中使用。该策略使得能够以比使用任何先前描述的测定可能得到的准确度更大的准确度，确定不同GA制品之间的免疫学同一性。
如所述的，GA由合成性多肽的乙酸盐组成，该合成多肽含有四种天然存在的氨基酸：L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-赖氨酸。这些氨基酸分别以0.141、0.427、0.095和0.338的平均摩尔分数存在于随机序列中。毫无疑问，在给定的GA分子上存在多个表位。在用于确定GA测试与参考标准制品是否在免疫学上相同的测定中询问的GA表位越多，该测定就可以越准确地鉴别与参考标准物例如FDA-批准的药物克帕松具有可比的临床效果的GA测试制品。然而，GA中抗原表位的鉴别一直困扰着研究者，这主要是因为GA作为具有许多不同氨基酸序列的肽的混合物，难以采用常规技术例如X射线结晶学进行表征。
本发明通过采用单独T细胞区分不同但相似抗原结构的独特能力，克服了这一问题。本发明基于下述发现：可以产生并鉴别识别GA制品中不同表位的GA特异性人类T细胞系。通过使用本发明的方法，获得了基于细胞系的抗原识别性质识别不同GA表位的GA特异性人类T细胞系。可以组装包含一起识别许多不同GA表位的GA特异性人类T细胞系的组，并将该组用于询问GA制品。
表征可以通过本文所述的方法，或通过本领域已知的用于表征抗原特异性T细胞系的任何其他方法来进行，该其他方法例如，如通过在Gorski等人,1994年5月15日,(“Circulating T cell repertoire complexity in normal individuals and bonemarrow recipients analyzed by CDR3size spectratyping.Correlation with immunestatus,”J Immunol.152(10):5109-19)中描述的使用T细胞受体谱型确定(spectratyping)，或者如在Choi等人,1989年11月,“Interaction of Staphylococcusaureus toxin‘superantigens’with human T cells,”Proc Natl Acad Sci USA 86(22):8941-5中描述的采用PCR来鉴别T细胞受体Vβ链表达所描述的。
对非规范GA肽具反应性的GA特异性人类T细胞系的表征
在本发明的实施方案中，根据GA特异性人类T细胞系对非规范GA肽的刺激的反应性来鉴别识别GA中不同表位的GA特异性人类T细胞系。非规范GA肽是由四种GA氨基酸的任何子集或全部四种GA氨基酸以不同于针对COP所述的平均摩尔分数的平均摩尔分数组成的肽。非规范GA肽的实例为聚谷氨酸、聚丙氨酸、聚酪氨酸和聚赖氨酸、仅包含四种GA氨基酸的两种或三种(以任意平均摩尔分数)的肽、以及具有不同于针对克帕松描述的平均摩尔分数的平均摩尔分数的全部四种GA氨基酸的肽。实施例中表1提供了某些非规范GA肽的非限制性列表，包括肽026，其含有全部四种GA氨基酸但通过在GA制备的前5分钟不给予酪氨酸而合成。用于合成在本发明的方法中有用的非规范GA肽的方法在文献中进行了描述。肽026含有比GA更少的酪氨酸，并且制品中沿每个多肽种类的长度的氨基酸分布被改变。适合用作本发明方法中的非规范GA肽的许多肽是可商购的，例如从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得的。
预期非规范GA肽上的表位存在于规范GA中。预期含有少于组成GA的四种氨基酸的非规范肽含有的不同表位数目比GA少。含有相对于GA(即，针对克帕松描述的比例)的改变的摩尔比的全部四种GA氨基酸的非规范肽预期含有与在克帕松中发现的相对比例不同比例的GA表位，该比例取决于改变。与含有全部四种GA氨基酸的非规范肽例如肽026不反应的GA特异性人类T细胞系，以及与相同的非规范肽反应的GA特异性人类T细胞系的成功鉴别，证明了可以产生特异性具有非常细微差异的GA特异性人类T细胞系。这些GA特异性人类T细胞系可以用于检测异常的GA制品。因此，根据对不同非规范GA肽的反应性表征GA特异性人类T细胞系使得能够鉴别GA特异性人类T细胞系，当所述GA特异性人类T细胞系在测定组中平行使用时，可以准确地确定GA制品是否在免疫学上相同。
与测量仅对单个表位的反应性的测试相比，或与无法区分对不同表位的反应性的测试例如采用从GA免疫的动物获得的初级多克隆T细胞培养物的测定相比，包含各自识别不同GA表位的多种GA特异性T细胞系的T细胞系测定组可以以更高的准确度确定GA制品的免疫学同一性。在一些实施方案中，本发明的GA特异性人类T细胞系衍生自一种克隆并因此是克隆的，即单克隆的。在一些实施方案中，它们衍生自多种克隆。在GA特异性人类T细胞系衍生自多种克隆的实施方案中，它们衍生自若干种克隆并且是寡克隆的。
对非规范GA肽具有反应性的GA特异性人类T细胞系预期识别与不与相同的非规范GA肽反应的GA特异性人类T细胞系相比GA内不同的表位。因此，与第一非规范GA肽反应但不与第二非规范肽反应的GA特异性人类T细胞系、不与第一非规范GA肽反应但与第二非规范肽反应的GA特异性人类T细胞系、以及与第一或第二非规范肽两者都不反应的GA特异性人类T细胞系可分别被假定为识别不同的GA表位。作为示例，与GL 41即聚(Glu-Tyr；4:1)反应但不与GL 14(Glu-Lys；1:4)反应的第一GA特异性人类T细胞系、与GL 14反应但不与GL 41反应的第二GA特异性人类T细胞系以及与GL 41或GL 14都不反应的第三GA特异性人类T细胞系各自识别不同的GA表位。在本发明的实施方案中，鉴别了分别与不同的非规范肽反应的两种或更多种GA特异性人类T细胞系的组合，并将其一起用于测定组中以确定GA测试制品是否含有由该组中的GA特异性人类T细胞系识别的表位。在一些实施方案中，该测定组包含被确定为不与非规范肽反应的两种或更多种GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，所述组的用途包括通过测量用非规范肽刺激后T细胞系的响应，来测试该组中一种或多种GA特异性人类T细胞系对非规范肽的反应性。在一些实施方案中，所测量的响应为如上所述的GA引起的响应，例如，增殖、响应生物标志物的产生或编码响应生物标志物的核酸的表达。在一些实施方案中，如上所述的，通过在刺激后的多个时间点测量GA引起的响应，或在用一系列不同的GA浓度刺激后测量GA引起的响应以获得剂量响应谱或曲线，来测试GA特异性人类T细胞系对非规范肽的反应性。
对非规范肽的反应性可以采用与用于确定对GA的反应性的方法相同的方法，即通过测量对非规范肽刺激的GA引起的响应并与阴性对照例如无抗原对照的测量结果进行比较来确定。
在一些实施方案中，通过在用非规范肽刺激的T细胞系测试培养物中测得的至少一种GA引起的响应的增加来鉴别与非规范肽反应的T细胞系，该响应在统计上大于在无抗原对照培养物或非相关抗原对照培养物中测得的相同的至少一种GA引起的响应。在一些实施方案中，通过测试培养物的GA引起的响应相对于对照约1.5至约10倍(即，响应增加约50％至约1000％)、约1.5至约2倍、约1.5至约3倍、约1.5至约4倍、约1.5至约5倍、约1.5至约6倍、约1.5至约7倍、约1.5至约8倍、约1.5至约9倍、约2至约10倍、约2至约3倍、约2至约4倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约10倍、约3至约4倍、约3至约5倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约10倍、约4至约5倍、约4至约6倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、约5至约10倍、约5至约6倍、约5至约7倍、约5至约8倍、约5至约9倍、约6至约10倍、约6至约7倍、约6至约8倍、约6至约9倍、约7至约10倍、约7至约8倍、约7至约9倍、约8至约10倍、约8至约9倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍的增加来鉴别与非规范肽反应的T细胞系。
基于响应生物标志物产生的GA特异性人类T细胞的表征
在本发明的实施方案中，通过在用GA再刺激GA特异性T细胞系后，测量由其产生和/或表达的至少一种GA响应生物标志物来表征GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，通过测量一组GA响应生物标志物的产生和/或表达，以产生响应生物标志物谱，来表征GA特异性人类T细胞系。如在本文实施例中所示的，证明不同的GA特异性人类T细胞系具有不同的GA响应生物标志物谱，即，不同的细胞系在GA再刺激后产生不同量的GA响应生物标志物。这些差异可以反映出GA特异性人类T细胞系的结合特异性的细微差异，这使得这些细胞系的使用对于识别GA测试制品与GA参考标准物之间的差异是特别有用的。在一些实施方案中，如本文所述的，表征了一种或多种GA特异性人类T细胞系的GA响应生物标志物谱，并将该细胞系用于本发明的方法和/或测定组中，以确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同。将用GA测试制品刺激的GA特异性人类T细胞系的GA响应生物标志物谱中的生物标志物表达水平，与用GA参考标准物刺激的相同GA特异性人类T细胞系的相应的生物标志物表达水平进行比较。当GA特异性人类T细胞系在GA测试制品刺激后的每种生物标志物的表达水平，与该GA特异性人类T细胞系在GA参考标准物刺激后的每种相应的生物标志物的表达水平的比较值落入可接受的范围内时，确定GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同。在一些实施方案中，比较值的可接受的范围为约75％至约125％、约80％至约120％、或约90％至约110％。在一些实施方案中，该可接受的范围为约75％至约120％、约75％至约115％、约75％至约110％、约75％至约105％、约75％至约100％、约80％至约125％、约85％至约125％、约90％至约125％、约95％至约125％、约100％至约125％、约80％至约118％、约80％至约115％、约80％至约112％、约80％至约110％、约80％至约108％、约80％至约105％、约80％至约102％、约80％至约101％、约80％至约100％、约80％至约99％、约80％至约98％、约80％至约97％、约80％至约95％、约80％至约92％、约80％至约90％、约82％至约120％、约82％至约118％、约82％至约115％、约82％至约112％、约82％至约110％、约82％至约108％、约82％至约105％、约82％至约102％、约82％至约101％、约82％至约100％、约82％至约99％、约82％至约98％、约82％至约97％、约82％至约95％、约82％至约92％、约82％至约90％、约84％至约120％、约84％至约118％、约84％至约115％、约84％至约112％、约84％至约110％、约84％至约108％、约84％至约105％、约84％至约102％、约84％至约101％、约84％至约100％、约84％至约99％、约84％至约98％、约84％至约97％、约84％至约95％、约84％至约92％、约84％至约90％、约86％至约120％、约86％至约118％、约86％至约115％、约86％至约112％、约86％至约110％、约86％至约108％、约86％至约105％、约86％至约102％、约86％至约101％、约86％至约100％、约86％至约99％、约86％至约98％、约86％至约97％、约86％至约95％、约86％至约92％、约88％至约120％、约88％至约118％、约88％至约115％、约88％至约112％、约88％至约110％、约88％至约108％、约88％至约105％、约88％至约102％、约88％至约101％、约88％至约100％、约88％至约99％、约88％至约98％、约88％至约97％、约88％至约95％、约90％至约120％、约90％至约118％、约90％至约115％、约90％至约112％、约90％至约110％、约90％至约108％、约90％至约105％、约90％至约102％、约90％至约101％、约90％至约100％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约95％、约92％至约120％、约92％至约118％、约92％至约115％、约92％至约112％、约92％至约110％、约92％至约108％、约92％至约105％、约92％至约102％、约92％至约101％、约92％至约100％、约92％至约99％、约92％至约98％、约95％至约120％、约95％至约118％、约95％至约115％、约95％至约112％、约95％至约110％、约95％至约108％、约95％至约105％、约95％至约102％、约95％至约101％、约95％至约100％、约97％至约120％、约97％至约118％、约97％至约115％、约97％至约112％、约97％至约110％、约97％至约108％、约97％至约105％、约97％至约102％、约98％至约120％、约98％至约118％、约98％至约115％、约98％至约112％、约98％至约110％、约98％至约108％、约98％至约105％、约99％至约120％、约99％至约118％、约99％至约115％、约99％至约112％、约99％至约110％、约99％至约108％、约99％至约105％、约100％至约120％、约100％至约118％、约100％至约115％、约100％至约112％、约100％至约110％、约100％至约108％、约100％至约105％、约101％至约120％、约101％至约118％、约101％至约115％、约101％至约112％、约101％至约110％、约101％至约108％、约102％至约120％、约102％至约118％、约102％至约115％、约102％至约112％、约102％至约110％、约102％至约108％、约105％至约120％、约105％至约118％、约105％至约115％、约105％至约112％、约105％至约110％、约110％至约120％、约110％至约118％或约110％至约115％。
在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系的测定组中使用了各自具有不同的GA响应生物标志物谱的多于一种GA特异性人类T细胞系，以确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同。
在GA特异性人类T细胞系的表征中测量的GA响应生物标志物为例如细胞因子，细胞因子受体，趋化因子，T细胞活化标志物，或编码细胞因子、细胞因子受体、趋化因子或T细胞活化标志物的核酸。
在一些实施方案中，在GA特异性人类T细胞系的表征中测量的响应生物标志物为选自例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β以及IL-1b的细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR的活化标志物。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7的趋化因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为Th1相关细胞因子、Th2相关细胞因子、Th17相关细胞因子或ThFH相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为Th1相关细胞因子并且为IFN-γ。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-4、IL-5和IL-13的Th2相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-17和IL-22的Th17相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-21和TGF-β的ThFH相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-10和TGF-β的关键调节相关细胞因子。
在一些实施方案中，在GA特异性人类T细胞系的表征中测量的响应生物标志物为编码选自例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β和IL-1b的细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR的活化标志物的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7的趋化因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码Th1相关细胞因子的核酸、编码Th2相关细胞因子的核酸、编码Th17相关细胞因子的核酸或编码ThFH相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码Th1相关细胞因子的核酸并且为IFN-γ。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-4、IL-5和IL-13的Th2相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-17和IL-22的Th17相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-21和TGF-β的ThFH相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-10和TGF-β的关键调节相关细胞因子的核酸。
基于MHC限制的GA特异性人类T细胞系的表征
在本发明的实施方案中，GA特异性人类T细胞系通过测试其MHC限制进行表征。通过不同的MHC限制元件与相同抗原反应的T细胞系可以识别不同的表位。因此，MHC限制提供了用于免疫区分本发明的GA特异性人类T细胞系的表位特异性，并因此用于选择用于确定GA制品是否在免疫学上相同的测定的合适的GA特异性人类T细胞系组的另一个参数。
可以使用本领域已知的任何方法来测试MHC限制，该方法例如，如由Oftung等人(Oftung F等人，1994,“Mapping of multiple HLA class II restricted T-cellepitopes of the mycobacterial 70-kilodalton heat shock protein,”Infect.Immun.62:5411-5418)所述或如本文实施例中所提出的。
基于表面标志物表达分析的GA特异性人类T细胞系的表征
在本发明的实施方案中，GA特异性人类T细胞系通过分析其细胞表面标志物的表达进行表征。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的GA特异性人类T细胞系为CD4+。可以使用本领域已知的方法来分析CD4表达并鉴别CD4+T细胞系。在一些实施方案中，通过采用对CD4具有特异性的荧光物标记的单克隆抗体的流式细胞术来分析CD4。在一些实施方案中，当测试的样品中98％或更多的细胞为CD4+时，确定GA特异性人类T细胞系为CD4+。在一些实施方案中，当测试的样品中99％或更多的细胞为CD8+时，确定GA特异性人类T细胞系为CD4+。在一些实施方案中，本发明的测定组中包括经确定含有97％或更多、超过97％、97.5％或更多、超过97.5％、98％或更多、超过98％、98.5％或更多、超过98.5％、99％或更多或超过99％的CD4+细胞的GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系为CD8-。与CD4一样，可以使用本领域已知的方法，例如通过采用对CD8具有反应性的荧光物标记的单克隆抗体的流式细胞术，来分析CD8标志物的存在。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的GA特异性人类T细胞系为CD8-。在一些实施方案中，通过采用对CD8具有特异性的荧光物标记的单克隆抗体的流式细胞术来分析CD8。在一些实施方案中，包括了采用非特异性抗体，例如，荧光物标记的小鼠同型匹配的对照单克隆抗体的对照。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的GA特异性人类T细胞系为CD4+和CD8-。在一些实施方案中，当测试的样品中2％或更少的细胞为CD8+时，确定GA特异性人类T细胞系为CD8-。在一些实施方案中，当测试的样品中1％或更少的细胞为CD8+时，确定GA特异性人类T细胞系为CD8-。在一些实施方案中，本发明的测定组中包括经确定含有3％或更少、少于3％、2,5％或更少、少于2.5％、2％或更少、少于2％、1.5％或更少、少于1.5％、1％或更少或少于1％的CD8+细胞的GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，如本文实施例中所述的，包括了使用非特异性抗体，例如，荧光物标记的小鼠同型匹配的对照单克隆抗体IgG1抗体的对照。
GA引起的响应
如所述的，在本发明的方法中，GA引起的响应在鉴别和表征GA特异性人类T细胞系的情况下进行测量。通过测量人类T细胞系对GA刺激的至少一种GA引起的响应，并与合适的对照(例如，在不存在抗原的情况下)的相同响应的测量结果相比较，来进行人类T细胞系的反应性和特异性的筛选。类似地，可以通过测量GA特异性人类T细胞系在非规范GA肽刺激后引起的响应，将本发明的GA特异性人类T细胞系进一步表征为对非规范GA肽具有反应性。如本文中使用的“GA引起的响应”是指由GA特异性人类T细胞系在GA或非规范GA肽刺激后所引起的反应。
在本发明上下文中测量的GA引起的响应是在用刺激肽(在合适的APC的存在下)处理T细胞系后观察到而在合适的对照中未观察到的反应，该合适的对照例如用APC而不用肽处理的相同的T细胞系，或用APC和非相关对照抗原处理的相同的T细胞系(阴性对照)。对GA特异性T细胞系在被GA制品刺激后的GA引起的响应的评估可以揭示测试的GA制品中存在的表位之间微小差异的存在。在本发明的某些方法中，测量了经鉴别的GA特异性人类T细胞系对于GA测试制品和GA参考标准物的GA引起的响应，并比较了所测量的GA引起的响应。根据比较，确定GA制品是否在免疫学上相同。在相关的方法中，比较经鉴别的GA特异性人类T细胞系的GA引起的响应使得能够确定第一GA制品例如GA测试制品的效力(相对于第二GA制品例如GA参考标准物的效力)。在本文所述的其他方法中，在GA特异性人类T细胞系的表征中测量GA引起的响应。
在本发明的上下文中，GA引起的响应可以是例如T细胞增殖、响应生物标志物的产生或编码响应生物标志物的核酸的表达的量度。在一些实施方案中，在再刺激后的多个时间点测量GA引起的响应。在一些实施方案中，在用一系列不同浓度的GA测试制品和GA参考标准物再刺激T细胞系之后测量GA引起的响应。在一些实施方案中，使用该数据来绘制剂量响应曲线，并比较针对每种GA制品获得的剂量响应曲线。在一些实施方案中，当所比较的GA制品各自的剂量响应曲线在线性范围内的斜率在统计学上相似或相同时，确定所比较的GA制品在免疫学上相同。
T细胞增殖
可以采用本领域已知的任何合适的方法来评估T细胞系响应于抗原的增殖。例如，可以通过测量含氚胸苷的摄取、BrdU摄取(使用例如Millipore目录号2752)，通过CFSE试验(使用例如CellTraceTM CFSE细胞增殖试剂盒，Life Technologies，并且如Quah等人,2007,“Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with theintracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidylester,”Nature Protocols 2(9):2049-2056中描述的)，或通过ATP定量以确定活细胞数目(使用例如CellTiter 
发光细胞活性测定，Promega，目录号G7571)来评估增殖。用于评估抗原特异性T细胞的方法在文献，例如“Techniques for Immune FunctionAnalysis”,Application Handbook第1版,2006,Becton,Dickinson and Company中进行了描述。
可以根据T细胞系在GA和合适的APC刺激之后的增殖相比于在无抗原或对照抗原以及合适的APC刺激之后的水平的增加来鉴别GA特异性T细胞系。在一些实施方案中，根据由细胞数目的增加、DNA合成(例如，在BrdU试验中)或细胞内染料的稀释增加(例如，在CFSE测定中)表示的增殖的增加来鉴别GA特异性T细胞系，其中该增加为相对于对照约2倍至约10倍。在一些实施方案中，该增加为至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍、约2倍至约5倍、约2倍至约4倍、约2倍至约3倍、约3倍至约10倍、约3倍至约9倍、约3倍至约8倍、约3倍至约7倍、约3倍至约6倍、约3倍至约5倍、约3倍至约4倍、约4倍至约10倍、约4倍至约9倍、约4倍至约8倍、约4倍至约7倍、约4倍至约6倍、约4倍至约5倍、约5倍至约10倍、约5倍至约9倍、约5倍至约8倍、约5倍至约7倍、约5倍至约6倍、约6倍至约10倍、约6倍至约9倍、约6倍至约8倍、约6倍至约7倍、约7倍至约10倍、约7倍至约9倍、约7倍至约8倍、约8倍至约10倍、约8倍至约9倍或约9倍至约10倍。
在一些实施方案中，当用GA测试制品刺激的GA特异性T细胞样品与用GA参考标准物刺激的GA特异性T细胞样品的增殖的测量结果(表示为例如，比率、分数或百分比)的比较落入可接受的范围内时，证明GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同。
GA特异性人类T细胞系对测试和参考标准GA制品的GA引起的响应的比较
在本发明的实施方案中，将GA特异性人类T细胞系对GA测试制品的GA引起的响应的测量结果与该GA特异性人类T细胞系对GA参考标准物的相同的GA引起的响应的测量结果进行比较。根据该比较，确定GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同。在一些实施方案中，当比较值落入可接受的范围内时，确定GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同。在一些实施方案中，将比较值表示为百分比，其中当测量结果相等时百分比为100。在这些实施方案中，比较值的可接受的范围为约75％至约125％、约80％至约120％、或约90％至约110％。在一些实施方案中，该可接受的范围为约75％至约120％、约75％至约115％、约75％至约110％、约75％至约105％、约75％至约100％、约80％至约125％、约85％至约125％、约90％至约125％、约95％至约125％、约100％至约125％、约80％至约118％、约80％至约115％、约80％至约112％、约80％至约110％、约80％至约108％、约80％至约105％、约80％至约102％、约80％至约101％、约80％至约100％、约80％至约99％、约80％至约98％、约80％至约97％、约80％至约95％、约80％至约92％、约80％至约90％、约82％至约120％、约82％至约118％、约82％至约115％、约82％至约112％、约82％至约110％、约82％至约108％、约82％至约105％、约82％至约102％、约82％至约101％、约82％至约100％、约82％至约99％、约82％至约98％、约82％至约97％、约82％至约95％、约82％至约92％、约82％至约90％、约84％至约120％、约84％至约118％、约84％至约115％、约84％至约112％、约84％至约110％、约84％至约108％、约84％至约105％、约84％至约102％、约84％至约101％、约84％至约100％、约84％至约99％、约84％至约98％、约84％至约97％、约84％至约95％、约84％至约92％、约84％至约90％、约86％至约120％、约86％至约118％、约86％至约115％、约86％至约112％、约86％至约110％、约86％至约108％、约86％至约105％、约86％至约102％、约86％至约101％、约86％至约100％、约86％至约99％、约86％至约98％、约86％至约97％、约86％至约95％、约86％至约92％、约88％至约120％、约88％至约118％、约88％至约115％、约88％至约112％、约88％至约110％、约88％至约108％、约88％至约105％、约88％至约102％、约88％至约101％、约88％至约100％、约88％至约99％、约88％至约98％、约88％至约97％、约88％至约95％、约90％至约120％、约90％至约118％、约90％至约115％、约90％至约112％、约90％至约110％、约90％至约108％、约90％至约105％、约90％至约102％、约90％至约101％、约90％至约100％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约95％、约92％至约120％、约92％至约118％、约92％至约115％、约92％至约112％、约92％至约110％、约92％至约108％、约92％至约105％、约92％至约102％、约92％至约101％、约92％至约100％、约92％至约99％、约92％至约98％、约95％至约120％、约95％至约118％、约95％至约115％、约95％至约112％、约95％至约110％、约95％至约108％、约95％至约105％、约95％至约102％、约95％至约101％、约95％至约100％、约97％至约120％、约97％至约118％、约97％至约115％、约97％至约112％、约97％至约110％、约97％至约108％、约97％至约105％、约97％至约102％、约98％至约120％、约98％至约118％、约98％至约115％、约98％至约112％、约98％至约110％、约98％至约108％、约98％至约105％、约99％至约120％、约99％至约118％、约99％至约115％、约99％至约112％、约99％至约110％、约99％至约108％、约99％至约105％、约100％至约120％、约100％至约118％、约100％至约115％、约100％至约112％、约100％至约110％、约100％至约108％、约100％至约105％、约101％至约120％、约101％至约118％、约101％至约115％、约101％至约112％、约101％至约110％、约101％至约108％、约102％至约120％、约102％至约118％、约102％至约115％、约102％至约112％、约102％至约110％、约102％至约108％、约105％至约120％、约105％至约118％、约105％至约115％、约105％至约112％、约105％至约110％、约110％至约120％、约110％至约118％或约110％至约115％。
在相关的方法中，将比较值用作第一GA制品例如GA测试制品的效力相对于第二GA制品例如GA参考标准物的效力的量度。
GA响应生物标志物产生
在一些实施方案中，在本发明的方法中测量的GA引起的响应为响应生物标志物的产生。在一些实施方案中，响应生物标志物为细胞因子，细胞因子受体，趋化因子，T细胞活化标志物，或编码细胞因子、细胞因子受体、趋化因子或T细胞活化标志物(其可以是细胞因子受体)的核酸。在一些实施方案中，GA响应生物标志物为细胞因子，细胞因子受体，趋化因子，T细胞活化标志物，或编码细胞因子、细胞因子受体、趋化因子或T细胞活化标志物的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β和IL-1b的细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR的活化标志物。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7的趋化因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为Th1相关细胞因子、Th2相关细胞因子、Th17相关细胞因子或ThFH相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为Th1相关细胞因子并且为IFN-γ。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-4、IL-5和IL-13的Th2相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-17和IL-22的Th17相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-21和TGF-β的ThFH相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-10和TGF-β的关键调节相关细胞因子。
在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β和IL-1b的细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR的活化标志物的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7的趋化因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码Th1相关细胞因子的核酸、编码Th2相关细胞因子的核酸、编码Th17相关细胞因子的核酸或编码ThFH相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码Th1相关细胞因子的核酸并且为IFN-γ。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-4、IL-5和IL-13的Th2相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-17和IL-22的Th17相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-21和TGF-β的ThFH相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-10和TGF-β的关键调节相关细胞因子的核酸。
可以根据本领域已知的任何合适的方法或在文献中公开的方法，例如，通过ELISA、蛋白质印迹分析、流式细胞术测定或任何合适的多重测定来测量响应生物标志物蛋白质的产生。商业测定可用于测量细胞因子、趋化因子、细胞因子受体以及活化标志物的产生(如本发明的方法中要求的)。例如，可以采用BDTM Cytometric Bead Array Flex Setsystem(BD Biosciences,San Jose,CA)来创建用于检测人类细胞因子和趋化因子的多重测定。
可以通过将在合适的APC的存在下、用GA再刺激后响应生物标志物的产生量，与在合适的阴性对照中例如在没有用抗原或用非相关对照抗原(在合适的APC的存在下)再刺激后产生的响应生物标志物的量进行比较，来鉴别或表征GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，根据响应生物标志物产生量相对于对照的增加来鉴别GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，所观察到的响应生物标志物产生量相对于阴性对照的增加为约1.5倍至约1000倍。测试培养物的响应相对于对照为约1.5倍(即，响应升高约50％)至约1000倍、约1.5至约2倍、约1.5至约3倍、约1.5至约4倍、约1.5至约5倍、约1.5至约6倍、约1.5至约7倍、约1.5至约8倍、约1.5至约9倍、约2至约3倍、约2至约4倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约2至约10倍、约3至约4倍、约3至约5倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约3至约10倍、约4至约5倍、约4至约6倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、约4至约10倍、约5至约6倍、约5至约7倍、约5至约8倍、约5至约9倍、约5至约10倍、约6至约7倍、约6至约8倍、约6至约9倍、约6至约10倍、约7至约8倍、约7至约9倍、约7至约10倍、约8至约9倍、约8至约10倍、约1.5倍至约80倍、约1.5倍至约70倍、约1.5倍至约60倍、约1.5倍至约50倍、约1.5倍至约40倍、约1.5倍至约30倍、约1.5倍至约20倍、约2倍至约80倍、约1.5倍至约70倍、约1.5倍至约60倍、约1.5倍至约50倍、约1.5倍至约40倍、约1.5倍至约30倍、约1.5倍至约20倍、约2倍至约80倍、约2倍至约70倍、约2倍至约60倍、约2倍至约50倍、约2倍至约40倍、约2倍至约30倍、约2倍至约20倍、约3倍至约80倍、约3倍至约70倍、约3倍至约60倍、约3倍至约50倍、约3倍至约40倍、约3倍至约30倍、约3倍至约20倍、约5倍至约80倍、约5倍至约70倍、约5倍至约60倍、约5倍至约50倍、约5倍至约40倍、约5倍至约30倍、约3倍至约20倍、约10倍至约80倍、约10倍至约60倍、约10倍至约40倍、或约10倍至约20倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。
可以采用多种可商购的测定试剂盒和系统中的任一种，或根据本领域中所述的任何方法来定量测量编码响应生物标志物的核酸。在一些实施方案中，通过实时PCR测量响应生物标志物mRNA。考虑使用本领域中已知的用于测量mRNA表达水平的任何合适的定量方法。例如，mRNA可以通过逆转录酶复制，并采用合适的PCR方法包括RT-PCR和实时逆转录PCR(qRT-PCR)进行扩增。用于定量基因表达的PCR方法在例如VanGuilder等人,2008,“Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis,”Biotechniques44:619-626，以及Bustin等人2005,“Quantitative real-time RT-PCR–a perspective,”Journal of Molecular Endocrinology,34:597-601中进行了描述，每一个文献均通过引用全文并入本文。小鼠细胞因子mRNA的定量PCR在例如Overbergh等人,1999,“Quantification of murine cytokine mRNAs using real time quantitative reversetranscriptase PCR,”Cytokine 11(4):305-312中进行了描述，该文献通过引用并入本文，描述了用于定量IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、p40、IL-13、IL-15、IFN-γ、TNF-α、TGF-β和iNOS的探针和引物。用于在离体(ex vivo)GA刺激小鼠淋巴结细胞后测量响应生物标志物mRNA的方法在例如美国专利申请公开号2014/0272987，“GlatiramerAcetate Response Biomarker mRNA Potency Assay”中进行了描述，该专利申请通过引用全文并入本文。
可以通过将在合适的APC的存在下、用GA再刺激后编码响应生物标志物的核酸的产生量，与在合适的阴性对照中例如在没有用抗原或用非相关对照抗原(在合适的APC的存在下)再刺激后产生的编码响应生物标志物的核酸的量进行比较，来鉴别或表征GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，根据编码响应生物标志物的核酸的产生量相对于对照的增加来鉴别GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，所观察到的编码响应生物标志物的核酸的产生量相对于阴性对照的增加为约1.5倍至约1000倍。在一些实施方案中，该增加为约1.5倍至约100倍、约1.5倍至约50倍、约1.5倍至约45倍、约1.5倍至约40倍、约1.5倍至约35倍、约1.5倍至约30倍、约1.5倍至约25倍、约1.5倍至约22倍、约1.5倍至约20倍、约1.5倍至约15倍、约1.5倍至约12倍、约1.5倍至约10倍、约1.5倍至约9倍、约1.5倍至约8倍、约1.5倍至约7倍、约1.5倍至约6倍、约1.5倍至约5倍、约1.5倍至约4倍、约1.5倍至约3倍、约2倍至约100倍、约2倍至约50倍、约2倍至约45倍、约2倍至约40倍、约2倍至约35倍、约2倍至约30倍、约2倍至约25倍、约2倍至约22倍、约2倍至约20倍、约2倍至约15倍、约2倍至约12倍、约2倍至约10倍、约2倍至约9倍、约2倍至约8倍、约2倍至约7倍、约2倍至约6倍、约2倍至约5倍、约2倍至约4倍、约3倍至约100倍、约3倍至约50倍、约3倍至约45倍、约3倍至约40倍、约3倍至约35倍、约3倍至约30倍、约3倍至约25倍、约3倍至约22倍、约3倍至约20倍、约3倍至约15倍、约3倍至约12倍、约3倍至约10倍、约3倍至约9倍、约3倍至约8倍、约3倍至约7倍、约3倍至约6倍、约3倍至约5倍、约4倍至约100倍、约4倍至约50倍、约4倍至约45倍、约4倍至约40倍、约4倍至约35倍、约4倍至约30倍、约4倍至约25倍、约4倍至约22倍、约4倍至约20倍、约4倍至约15倍、约4倍至约12倍、约4倍至约10倍、约4倍至约9倍、约4倍至约8倍、约4倍至约7倍、约4倍至约6倍、约5倍至约100倍、约5倍至约50倍、约5倍至约45倍、约5倍至约40倍、约5倍至约35倍、约5倍至约30倍、约5倍至约25倍、约5倍至约22倍、约5倍至约20倍、约5倍至约15倍、约5倍至约12倍、约5倍至约10倍、约5倍至约9倍、约5倍至约8倍、约5倍至约7倍、约7倍至约100倍、约7倍至约50倍、约7倍至约45倍、约7倍至约40倍、约7倍至约35倍、约7倍至约30倍、约7倍至约25倍、约7倍至约22倍、约7倍至约20倍、约7倍至约15倍、约7倍至约12倍、约7倍至约10倍、约7倍至约9倍、约10倍至约100倍、约10倍至约50倍、约10倍至约45倍、约10倍至约40倍、约10倍至约35倍、约10倍至约30倍、约10倍至约25倍、约10倍至约22倍、约10倍至约20倍、约10倍至约15倍、约15倍至约100倍、约15倍至约50倍、约15倍至约45倍、约15倍至约40倍、约15倍至约35倍、约15倍至约30倍、约15倍至约25倍、约15倍至约22倍、约15倍至约20倍、约20倍至约100倍、约20倍至约50倍、约20倍至约45倍、约20倍至约40倍、约20倍至约35倍、约20倍至约30倍、约20倍至约25倍、约25倍至约100倍、约25倍至约50倍、约25倍至约45倍、约25倍至约40倍、约25倍至约35倍、约25倍至约30倍、约30倍至约100倍、约30倍至约50倍、约40倍至约100倍、约50倍至约100倍、约60倍至约100倍、约70倍至约100倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约250倍、至少约500倍或至少约1000倍。
GA药物产品的制备
本发明涉及一种制备含有GA的药物产品或药物组合物的方法。在该方法的实施方案中，根据本领域已知以及在文献例如美国专利号3,849,550和5,800,808中描述的标准方法来制备醋酸格拉替雷。在一些实施方案中，通过以下步骤制备含有GA的药物产品或药物组合物：使受保护的醋酸格拉替雷与氢溴酸反应以形成三氟乙酰基GA，用哌啶水溶液处理所述三氟乙酰基共聚物-1以形成GA测试制品，并纯化该GA测试制品。采用如本文所述的方法和/或测定组确定GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同或在免疫学上不相同。例如，通过以下步骤确定GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同或者在免疫学上不相同：(a)将至少一种GA特异性人类T细胞系的细胞与合适的抗原呈递细胞(APC)一起温育，(b)用一定量的GA测试制品刺激在步骤(a)中温育的合适的APC和GA特异性人类T细胞的至少一个样品，并单独用相同量的GA参考标准物刺激在步骤(a)中温育的合适的APC和GA特异性人类T细胞的至少一个样品，(c)测量在步骤(b)中用GA测试制品刺激的至少一个细胞样品的至少一种GA引起的响应，并测量在步骤(b)中用GA参考标准物刺激的至少一个细胞样品的相同的至少一种GA引起的响应，以及(d)比较在步骤(c)中获得的测量结果，其中当步骤(d)中测量结果的比较落入可接受的范围内时，确定GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同，并且其中如果确定GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同，则将GA测试制品混合至药物产品或药物组合物中。在一些实施方案中，药物产品或药物组合物另外含有赋形剂和/或稀释剂，例如，如在
的包装标签中描述的。
在某些实施方案中，本发明的方法用于在GA制品可能添加至药物产品或药物组合物之前，在GA制品添加之后，或在期望的任何其他时间，确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同，或者是否具有可接受的相对效力。在一些实施方案中，只有在确定GA测试制品与GA参考标准物具有免疫学同一性或相当的效力时，才将该GA测试制品添加至GA药物产品或药物组合物的其他组分，例如稀释剂、赋形剂或另一种活性成分中。包括用于评估 比较GA制品的数据的方法的效力测定在文献中，例如在美国专利号7,429,374，“Processfor the measurement of the potency of glatiramer acetate”中进行了描述，该专利通过引用全文并入本文。
新生物标志物的鉴别
可以通过将在合适的APC的存在下、在用GA刺激的GA特异性T细胞培养物中存在的潜在响应生物标志物的量，与在与合适的APC一起温育但没有抗原刺激的对照培养物或用对照抗原刺激的对照培养物中存在的响应生物标志物的量进行比较，来鉴别其他响应生物标志物。
可以通过将在合适的APC的存在下、在用GA刺激的GA特异性人类T细胞系中存在的潜在GA响应生物标志物蛋白质或编码该蛋白质的核酸的量，与在合适的阴性对照中相同的潜在GA响应生物标志物蛋白质或编码该蛋白质的核酸的量进行比较，来鉴别本发明方法中使用的合适的GA响应生物标志物。相对于阴性对照，在合适的APC存在下、用GA刺激的GA特异性人类T细胞系中合适的GA响应生物标志物得到显著调节(增加或减少)。在一些实施方案中，根据在用GA再刺激GA特异性人类T细胞系后GA响应生物标志物的产生量相对于阴性对照约2倍至约1000倍的增加，来鉴别该GA特异性人类T细胞系的GA响应生物标志物。
GA特异性人类T细胞系的测定组
如所述的，本发明设想在确定GA制品例如GA测试制品和GA参考标准物的免疫学同一性的方法中使用至少一种GA特异性人类T细胞系。因为GA含有大量表位，所以通过用GA刺激并测试GA特异性人类T细胞系对GA的响应性来产生和鉴别GA特异性人类T细胞系，不一定知道可以获得具有识别不同表位的能力的GA特异性人类T细胞系。基于可以获得具有可区别的表位结合特异性的GA特异性人类T细胞系的发现，本发明提供了使用多种GA特异性人类T细胞系以更高的准确度确定GA制品的免疫学同一性的试验。
在本发明的实施方案中，使用GA特异性人类T细胞系的测定组来分析GA制品，以便例如测试免疫学同一性和/或确定其相似度或相异度。在一些实施方案中，该测定组包含多种GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，该测定组包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49种或50种不同的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，该测定组包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90种或至少100种不同的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，该测定组包含2至100、2至50、2至25、2至10、5至100、5至50、5至25、5至10、10至100、10至50、10至25种或50至100种不同的GA特异性人类T细胞系。
在本发明的实施方案中，所述测定组包含克隆GA特异性人类T细胞系、寡克隆GA特异性人类T细胞系或两者的组合。在一些实施方案中，所述测定组包含克隆和寡克隆GA特异性人类T细胞系的组合，其中大多数(>50％)为克隆GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，所述测定组包含克隆和寡克隆GA特异性人类T细胞系的组合，其中该组包含约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约35％或更多、约40％或更多、约45％或更多、约50％或更多、约55％或更多、约60％或更多、约65％或更多、约70％或更多、约75％或更多、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多或约100％的克隆GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，所述测定组包含克隆和寡克隆GA特异性人类T细胞系的组合，其中该组包含约20％至约100％、约25％至约100％、约30％至约100％、约35％至约100％、约40％至约100％、约45％至约100％、约50％至约100％、约55％至约100％、约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％或约95％至约100％的克隆GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，所述测定组包含克隆和寡克隆GA特异性人类T细胞系的组合，其中该组包含1/6或更多、1/3或更多、2/3或更多、3/4或更多、或5/6或更多的克隆GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，测定组中所有的GA特异性人类T细胞系均是克隆的。可以使用本领域技术人员已知以及文献中描述的任何方法，例如有限稀释克隆，从T细胞群体克隆T细胞系。在有限稀释克隆中，将候选细胞系在有限稀释(例如，0.3个细胞/孔，或不超过一个细胞/孔)下与抗原和APC一起在多个孔中进行培养。将所得细胞如本文所述进行再刺激。T细胞克隆方法是广为人知的且在文献中，例如在Mariotti,S.和Nisini,R.,2009,“Generation of Human T Cell Clones,”(T Cell Protocols),Gennaro de Libero(编著),Humana Press,第二版,vol.514,第65-93页中进行了描述，该文献通过引用全文并入本文。在一些实施方案中，将有限稀释克隆过程重复一次或多次，以获得克隆GA特异性人类T细胞系。还可以使用流式细胞术法，例如，如Lee,S-T等人,2008,“A Novel Strategy forRapid and Efficient Isolation of Human Tumor-Specific CD4+and CD8+T-CellClones,”J.Imm.Meth.331(1-2):13-26中所述克隆T细胞系，该文献通过引用全文并入本文。在一些实施方案中，根据本领域技术人员已知以及在文献中公开的方法通过T细胞受体测序来确认T细胞系的克隆性。
在一些实施方案中，测定组包含通过在第一GA制品的存在下培养人类T细胞产生的GA特异性人类T细胞系，以及通过在第二GA制品的存在下培养人类T细胞产生的至少一种GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，第一GA制品为COP，而第二GA制品为GMA。在一些实施方案中，第一和第二GA制品为不同的COP制品或不同的GMA制品。
在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系的测定组包含至少一种GA特异性人类T细胞系，该GA特异性人类T细胞系在被第一GA制品刺激后产生的GA引起的响应与被第二GA制品刺激后产生的GA引起的响应相似或相同。在一些实施方案中，第一GA制品为COP，而第二GA制品为GMA。在一些实施方案中，第一和第二GA制品为不同的COP制品或不同的GMA制品。
在一些实施方案中，所述组包含至少一种响应于第一非规范GA肽刺激的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，所述组包含至少一种响应于用第一非规范GA肽刺激的GA特异性人类T细胞系，以及至少一种响应于用第二非规范GA肽刺激的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，所述组包含至少两种响应于GA刺激各自产生不同的响应生物标志物谱的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，所述测定组包含至少两种各自具有不同的MHC限制的GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，GA特异性人类T细胞系的测定组包含至少两种GA特异性人类T细胞系，其中该至少两种GA特异性细胞系中的至少一种为：
a)不响应非规范GA肽刺激的GA特异性人类T细胞系；
b)具有已知生物标志物响应谱的GA特异性人类T细胞系；
c)具有已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，本发明的测定组包含通过在第一GA制品的存在下培养人类T细胞产生的至少一种GA特异性人类T细胞系，以及通过在第二GA制品的存在下培养人类T细胞产生的至少一种GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，该测定组进一步包含至少一种不与非规范GA肽反应的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，通过在第一GA制品的存在下培养人类T细胞产生的至少一种GA特异性人类T细胞系通过在GMA的存在下培养人类T细胞而产生。
在一些实施方案中，测定组中的GA特异性人类T细胞系选自：
1)通过与第一GA制品一起培养而产生的GA特异性人类T细胞系；
2)通过与第二GA制品一起培养而产生的GA特异性人类T细胞系；
3)不响应第一非规范GA肽刺激的GA特异性人类T细胞系；
4)响应第一非规范GA肽刺激的GA特异性人类T细胞系；
5)不响应第二非规范GA肽刺激的GA特异性人类T细胞系；
6)响应第二非规范GA肽刺激的GA特异性人类T细胞系；
7)具有已知的生物标志物响应谱的GA特异性人类T细胞系；
8)具有与(7)的GA特异性人类T细胞系的生物标志物反应谱不同的已知生物标志物响应谱的GA特异性人类T细胞系；
9)具有已知的MHC限制的GA特异性人类T细胞系；以及
10)具有与(9)的GA特异性人类T细胞系的MHC限制不同的已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，所述GA特异性人类T细胞系为长期GA特异性人类T细胞系，和/或克隆GA特异性人类T细胞系，和/或CD4+GA特异性人类T细胞系，和/或CD8-GA特异性人类T细胞系。
在一些实施方案中，所述测定组包含表A中列出的一种或多种T细胞系。
表A.COP和GMA反应性T细胞系
在一些实施方案中，所述测定组包含表B中列出的一种或多种T细胞系。
表B.GMA和克帕松特异性*T细胞系
*使用下列等式根据增殖响应进行鉴别：
(对测试抗原的增殖响应-对对照的增殖响应)÷(对参考抗原的增殖响应-对对照的增殖响应)＝0.8至1.2。
**无抗原对照的增殖百分比；根据至少一个大于或等于无抗原对照值的2倍的增殖值鉴别的细胞系。
***该列中的全部细胞系均根据小于无抗原对照值的2倍的增殖值进行鉴别。
在一些实施方案中，测定组包含一个或多个阳性或阴性对照。
在一些实施方案中，当测定组包含一种或多种不响应非规范GA肽刺激的GA特异性人类T细胞系时，该测定组进一步包含一种或多种响应相同的非规范GA肽刺激的GA特异性人类T细胞系。例如，测定组可以包含被确定为不响应非规范GA肽刺激的第一表征的GA特异性人类T细胞系，以及被确定为响应非规范GA肽刺激的第二表征的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，第一和第二表征的GA特异性人类T细胞系都响应非规范GA肽刺激，但各自不同地响应(例如，它们各自产生不同的GA响应生物标志物谱)。在相关的实施方案中，对于被确定为响应或不响应非规范GA肽刺激的任何GA特异性人类T细胞系均包含阴性对照。在一些实施方案中，阴性对照样品含有细胞系、合适的APC，并且不含抗原。
在一些实施方案中，测定组包含一种或多种具有已知生物标志物响应谱的GA特异性人类T细胞系，以及一种或多种具有不同的已知生物标志物响应谱的GA特异性人类T细胞系。例如，测定组包含经确定具有第一已知生物标志物响应谱的表征的GA特异性人类T细胞系，以及经确定具有不同于第一已知生物标志物响应谱的第二已知生物标志物响应谱的表征的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，第一和第二已知生物标志物响应谱各自包含至少一种细胞因子、至少一种趋化因子、至少一种活化标志物、至少一种编码细胞因子的核酸、至少一种编码趋化因子的核酸或至少一种编码活化标志物的核酸。
在相关的实施方案中，对于具有已知生物标志物响应谱的任何GA特异性人类T细胞系均包含阴性对照。在一些实施方案中，阴性对照样品含有细胞系、合适的APC，并且不含抗原。
在一些实施方案中，测定组包含一种或多种具有已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系，以及一种或多种具有不同的已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，测定组包含一种或多种具有已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系，其中HLA-DR限制元件选自：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15；以及一种或多种具有不同的已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系，其中HLA-DR限制元件选自：DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15。例如，测定组包含经确定具有第一已知MHC限制的表征的GA特异性人类T细胞系，以及经确定具有不同于第一已知MHC限制的第二已知MHC限制的表征的GA特异性人类T细胞系。在相关的实施方案中，对于经确定具有不同的已知MHC限制的任何GA特异性人类T细胞系均包含阴性对照。在一些实施方案中，阴性对照样品含有细胞系、非匹配的APC和GA。在一些实施方案中，阴性对照样品含有细胞系、合适的APC，并且不含抗原。
在一些实施方案中，测定组包含至少两种GA特异性人类T细胞系，其中根据通过在用第一GA制品刺激T细胞系时测量GA引起的响应所获得的响应，与通过在用第二GA制品刺激该T细胞系时测量相同的GA引起的响应所获得的响应的比较，确定所述至少两种GA特异性人类T细胞系中的每一种均是GA特异性的，并且其中第二GA制品的响应与第一GA制品的响应的比较在可接受的范围或限度内，并且其中所述至少两种GA特异性人类T细胞系中的每一种均为长期GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，使用第一GA制品产生GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，第一GA制品为克帕松。
在一些实施方案中，测定组包含至少两种GA特异性人类T细胞系，其中根据通过在用至少第一GA制品以多剂量刺激GA特异性人类T细胞系时测量GA引起的响应所获得的剂量响应曲线，与通过在用第二GA制品以多剂量刺激该GA特异性人类T细胞系时测量相同的GA引起的响应所获得的剂量响应曲线的比较，确定所述至少两种GA特异性人类T细胞系中的每一种均为GA特异性的，其中第二GA制品的剂量响应曲线的斜率与第一GA制品的剂量响应曲线的斜率的比较在可接受的范围或限度内，并且其中所述至少两种GA特异性人类T细胞系中的每一种均为长期GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，使用第一GA制品产生GA特异性人类T细胞系。在一些实施方案中，第一GA制品为克帕松。
在一些实施方案中，测定组中至少两种GA特异性人类T细胞系中的至少一种对非规范GA肽是反应性的。在一些实施方案中，测定组中至少两种GA特异性人类T细胞系中的至少一种对选自肽026、GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA 41S、GA 64和GT 11的非规范GA肽是反应性的。
在一些实施方案中，测定组中至少两种GA特异性人类T细胞系中的至少一种对非规范GA肽不是反应性的。在一些实施方案中，测定组中至少两种GA特异性人类T细胞系中的至少一种对选自肽026、GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA 41S、GA 64和GT 11的非规范GA肽不是反应性的。
在一些实施方案中，测定组中至少两种GA特异性人类T细胞系中的至少一种对非规范GA肽是反应性的，并且其中该测定组中至少两种GA特异性人类T细胞系中的至少一种对相同的非规范GA肽不是反应性的。在一些实施方案中，测定组中至少两种GA特异性人类T细胞系中的至少一种对选自肽026、GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA 41S、GA64和GT 11的非规范GA肽是反应性的，并且其中该测定组中至少两种GA特异性人类T细胞系中的至少一种对相同的非规范GA肽不是反应性的。
在一些实施方案中，测定组中至少两种GA特异性人类T细胞系中的至少一种是克隆的。在一些实施方案中，测定组中的至少两种GA特异性人类T细胞系全部为克隆的。在一些实施方案中，测定组中的至少两种GA特异性人类T细胞系具有不同的MHC限制。在一些实施方案中，测定组中的至少两种GA特异性人类T细胞系包括一种或多种具有已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系，其中HLA-DR限制元件选自：DR-1、DR-2、DR-3、DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15；以及一种或多种具有不同的已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系，其中HLA-DR限制元件选自：DR-4、DR-7、DR-11、DR-13和DR-15。在一些实施方案中，测定组中的至少两种GA特异性人类T细胞系包含至少98％的CD4+T细胞和不超过2％的CD8+T细胞。
GA特异性人类T细胞系的测定组的用途
在本发明的实施方案中，在确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同的方法中使用本发明的测定组。在这些实施方案中，采用该组中每种GA特异性人类T细胞系的预定数目的细胞、合适的APC以及一定量的GA测试制品来制备细胞样品。还采用该组中每种GA特异性人类T细胞系的相同预定数目的细胞、合适的APC以及一定量的GA参考标准物来制备细胞样品。在一些实施方案中，制备了对照样品。在一些实施方案中，采用该组中每种GA特异性人类T细胞系的相同预定数目的细胞，在没有APC且没有抗原的情况下制备阴性对照。在一些实施方案中，采用该组中每种GA特异性人类T细胞系的相同预定数目的细胞、合适的APC以及非相关抗原来制备对照。在一些实施方案中，采用该组中每种GA特异性人类T细胞系的相同预定数目的细胞以及非匹配的APC来制备阴性对照。
在一些实施方案中，在每个细胞样品中测量相同的至少1种到至少25种GA引起的响应。在一些实施方案中，在每个细胞样品中测量2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24种或至少25种GA引起的响应。
采用本发明的测定组获得的测量结果可用来通过将用GA测试制品刺激的T细胞系样品中给定的GA引起的响应的测量结果与用GA参考标准物刺激的T细胞系样品中相同的GA引起的响应的测量结果进行比较，确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同。在一些实施方案中，在进行比较之前，将这些测量结果归一化，以考虑在阴性对照样品中观察到的任何背景。
确定免疫学同一性
如本文所述，可以使用本发明的方法，通过将用GA测试制品刺激的GA特异性T细胞系中至少一种GA引起的响应的测量结果与用GA参考标准物刺激的GA特异性T细胞系中相同的至少一种GA引起的响应的测量结果进行比较，来确定GA测试制品与GA参考标准物的免疫学同一性。
如本文其他各处所述，所测量的GA引起的响应可以为增殖、响应生物标志物的产生、编码响应生物标志物的核酸的表达或其组合。
在其中在本发明的方法中测量的GA引起的响应为响应生物标志物的产生的实施方案中，该响应生物标志物可以是例如细胞因子，细胞因子受体，趋化因子，T细胞活化标志物，或编码细胞因子、细胞因子受体、趋化因子或T细胞活化标志物的核酸。响应生物标志物可以根据本领域已知以及本文其他各处描述的方法进行测量。
在一些实施方案中，响应生物标志物为选自例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β和IL-1b的细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR的活化标志物。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7的趋化因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为Th1相关细胞因子、Th2相关细胞因子、Th17相关细胞因子或ThFH相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为Th1相关细胞因子并且为IFN-γ。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-4、IL-5和IL-13的Th2相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-17和IL-22的Th17相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-21和TGF-β的ThFH相关细胞因子。在一些实施方案中，响应生物标志物为选自IL-10和TGF-β的关键调节相关细胞因子。
在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13或IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α(TNF)、TNF-β(LT)、TGF-β和IL-1b的细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自例如CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279和HLA-DR的活化标志物的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自例如IL-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4和CXCL7的趋化因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码Th1相关细胞因子的核酸、编码Th2相关细胞因子的核酸、编码Th17相关细胞因子的核酸或编码ThFH相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码Th1相关细胞因子的核酸并且为IFN-γ。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-4、IL-5和IL-13的Th2相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-17和IL-22的Th17相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-21和TGF-β的ThFH相关细胞因子的核酸。在一些实施方案中，响应生物标志物为编码选自IL-10和TGF-β的关键调节相关细胞因子的核酸。可以根据本文所述的方法鉴别其他的响应生物标志物。
在一些实施方案中，当相应的一对GA测试制品和GA参考标准物的测量结果(例如，表示为分数、比率或百分比)的各个比较均落入可接受的范围或可接受的限度内时，作出该GA测试制品与该GA参考标准物的免疫学同一性的确定。
在本发明的实施方案中，使用一组GA特异性人类T细胞系来确定GA制品之间的免疫学同一性。在一些实施方案中，将该组中用GA测试制品刺激的每种GA特异性人类T细胞系的至少一种GA引起的响应的测量结果，与该组中用GA参考标准物刺激的相应GA特异性人类T细胞系的相同的至少一种GA引起的响应的测量结果进行比较。如所述的，在某些实施方案中，在比较之前，将每种GA引起的响应的测量结果归一化，以考虑在合适的阴性对照样品中观察到的任何信号。在其中使用一组多种GA特异性T细胞系来评估至少一个GA测试批的实施方案中，该组中用参考批刺激的任何/全部细胞系的剂量响应曲线必须符合例如如下所述的预定标准，其中相关系数(r)≥0.90，斜率≥0.60，GA标准物的反算浓度在标称浓度的±30％以内，并且GA样品的精确度≤变异系数(CV)的20％。在一些实施方案中，该至少一个GA测试批的剂量响应曲线必须在预定可接受的限度内，以确定其与GA参考批在免疫学上相同。在一些实施方案中，相关系数为0.90至0.98。在一些实施方案中，相关系数大于或等于0.90、大于或等于0.91、大于或等于0.92、大于或等于0.93、大于或等于0.94、大于或等于0.95、大于或等于0.96、大于或等于0.97、大于或等于0.98，为0.90至0.98、0.91至0.98、0.92至0.98、0.93至0.98、0.94至0.98、0.95至0.98、0.96至0.98、0.90至0.97、0.91至0.97、0.92至0.97、0.93至0.97、0.94至0.97、0.95至0.97，或0.96至0.98。
在一些实施方案中，当比较(用GA测试制品刺激的GA特异性人类T细胞系中GA引起的响应的测量结果，相对于用GA参考标准物刺激的GA特异性人类T细胞系中GA引起的响应的测量结果)为75％至125％时，确定具有免疫学同一性。在一些实施方案中，在进行比较之前，从测试值中减去合适的阴性对照值，例如无抗原对照。在一些实施方案中，在进行比较之前，不从测试值中减去无抗原对照值。在一些实施方案中，直接比较这些值。
在一些实施方案中，比较值的可接受的范围或限度为约80％至约120％，或约90％至约110％。在一些实施方案中，该可接受的范围为约75％至约120％、约75％至约115％、约75％至约110％、约75％至约105％、约75％至约100％、约80％至约125％、约85％至约125％、约90％至约125％、约95％至约125％、约100％至约125％、约80％至约118％、约80％至约115％、约80％至约112％、约80％至约110％、约80％至约108％、约80％至约105％、约80％至约102％、约80％至约101％、约80％至约100％、约80％至约99％、约80％至约98％、约80％至约97％、约80％至约95％、约80％至约92％、约80％至约90％、约82％至约120％、约82％至约118％、约82％至约115％、约82％至约112％、约82％至约110％、约82％至约108％、约82％至约105％、约82％至约102％、约82％至约101％、约82％至约100％、约82％至约99％、约82％至约98％、约82％至约97％、约82％至约95％、约82％至约92％、约82％至约90％、约84％至约120％、约84％至约118％、约84％至约115％、约84％至约112％、约84％至约110％、约84％至约108％、约84％至约105％、约84％至约102％、约84％至约101％、约84％至约100％、约84％至约99％、约84％至约98％、约84％至约97％、约84％至约95％、约84％至约92％、约84％至约90％、约86％至约120％、约86％至约118％、约86％至约115％、约86％至约112％、约86％至约110％、约86％至约108％、约86％至约105％、约86％至约102％、约86％至约101％、约86％至约100％、约86％至约99％、约86％至约98％、约86％至约97％、约86％至约95％、约86％至约92％、约88％至约120％、约88％至约118％、约88％至约115％、约88％至约112％、约88％至约110％、约88％至约108％、约88％至约105％、约88％至约102％、约88％至约101％、约88％至约100％、约88％至约99％、约88％至约98％、约88％至约97％、约88％至约95％、约90％至约120％、约90％至约118％、约90％至约115％、约90％至约112％、约90％至约110％、约90％至约108％、约90％至约105％、约90％至约102％、约90％至约101％、约90％至约100％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约95％、约92％至约120％、约92％至约118％、约92％至约115％、约92％至约112％、约92％至约110％、约92％至约108％、约92％至约105％、约92％至约102％、约92％至约101％、约92％至约100％、约92％至约99％、约92％至约98％、约95％至约120％、约95％至约118％、约95％至约115％、约95％至约112％、约95％至约110％、约95％至约108％、约95％至约105％、约95％至约102％、约95％至约101％、约95％至约100％、约97％至约120％、约97％至约118％、约97％至约115％、约97％至约112％、约97％至约110％、约97％至约108％、约97％至约105％、约97％至约102％、约98％至约120％、约98％至约118％、约98％至约115％、约98％至约112％、约98％至约110％、约98％至约108％、约98％至约105％、约99％至约120％、约99％至约118％、约99％至约115％、约99％至约112％、约99％至约110％、约99％至约108％、约99％至约105％、约100％至约120％、约100％至约118％、约100％至约115％、约100％至约112％、约100％至约110％、约100％至约108％、约100％至约105％、约101％至约120％、约101％至约118％、约101％至约115％、约101％至约112％、约101％至约110％、约101％至约108％、约102％至约120％、约102％至约118％、约102％至约115％、约102％至约112％、约102％至约110％、约102％至约108％、约105％至约120％、约105％至约118％、约105％至约115％、约105％至约112％、约105％至约110％、约110％至约120％、约110％至约118％，或约110％至约115％。
在一些实施方案中，使用GA特异性T细胞系的测定组进行的GA测试制品与GA参考标准物的免疫学同一性的确定通过将在用GA测试制品和GA参考标准制品刺激后测量的至少2种、至少3种、至少4种或更多种不同的GA引起的响应进行比较来鉴别。
在一些实施方案中，当测定组中每一对相应的测量结果的比较均在预定的可接受的范围内时，作出使用GA特异性T细胞系的测定组对GA测试制品与GA参考标准物的免疫学同一性的确定。在一些实施方案中，当测定组中相应对的测量结果中80％至100％、85％至100％、90％至100％、或95％至100％、80％、85％、90％、95％或100％的比较在可接受的范围内时，作出GA测试制品与GA参考标准物的免疫学同一性的确定。
在其中根据单一参考批的使用和单剂量下GA引起的响应的比较确定测试与参考标准GA制品在免疫学上相同的实施方案中，基于“单一参考批、单剂量分析”作出免疫学同一性的确定。在一些实施方案中，当在一种GA剂量、两种不同的GA剂量、三种或更多种不同的GA剂量的每一种情况下单一参考、单剂量分析比较值落入预定的可接受的范围内时，确定两种GA制品的免疫学同一性。
在一些实施方案中，在一系列逐渐增加的GA剂量下测量了对每个GA批的GA引起的响应，并使用所得的响应值产生了每批的剂量-响应曲线。在一些实施方案中，通过将参考批剂量响应曲线的斜率(β*)与测试批剂量响应曲线的斜率进行比较，来确定这些批在免疫学上相同(或在免疫学上不相同)。在这些实施方案中，基于“单一参考批剂量响应曲线分析”鉴别人类T细胞系的GA特异性。在一些实施方案中，当GA测试制品和GA参考标准物各自的剂量-响应曲线在线性范围内的斜率在统计学上相似或相同时，确认该GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同。
在一些实施方案中，当根据本领域技术人员已知的任何合适的统计方法确定测试GA批与参考GA批剂量-响应曲线在线性范围内的斜率在统计学上相似或相同时，可以确定两种GA制品的免疫学同一性。在一些实施方案中，采用EC50比较和/或回归分析，或本领域已知或文献中描述的另一种合适的方法来确定GA测试制品与GA参考标准物的免疫学同一性。
在一些实施方案中，为了通过比较剂量响应曲线来实现免疫学同一性的确定，参考批剂量响应曲线的斜率(β*)必须符合适当的接受标准。适当的接受标准可由本领域技术人员预先确定。在某些实施方案中，适当的接受标准为：
·相关系数(r)≥0.90
·斜率≥0.60
·GA标准物的反算浓度在标称浓度的±30％内
·GA样品的精确度≤变异系数(CV)的20％。
在一些实施方案中，75％的阳性对照样品(例如，用ConA刺激的细胞)中的GA引起的响应必须高于在用任意浓度的GA刺激相同细胞时引起的最高响应。在一些实施方案中，75％的阴性对照样品(例如，用对照肽如髓磷脂碱性蛋白MBP处理的细胞)中的GA引起的响应必须低于或接近于用任何浓度的GA引起的最低响应。
可以对GA参考批样品集进行线性回归，其中将数据点以对数-对数尺度绘图。GA引起的响应值(通过增加分析物的浓度，下文中示为IL-2)的对数在Y轴上，而GA参考批的浓度(剂量)值的对数在X轴上。
用于上述数据集的最合适的线性回归模型如下：
Y＝α+β·X (1)其中Y＝log10(mIL-2浓度)并且X＝log10(GA浓度)。用适当的表示式取代X和Y变量，上述模型变成下式：
log10(mIL-2浓度)＝α+β·log10(GA-浓度) (2)
在一些实施方案中，当测试批曲线的斜率在可接受的限度内时，确立免疫学同一性。测试批曲线的斜率的可接受的范围采用以下的一系列等式根据参考批曲线来确定：
给定的log(响应)的反算剂量值为：
X反算＝10(Y-α)/β，其中Y＝log10(mIL-2浓度) (3)
准确率可以通过下式计算：
Y低和Y高是由±(平均值+2*SD)的最高容许准确率允许的最低和最高的log(响应)值，其中平均值+2*SD为约95％的个体容差区域的最高限度。
因此，斜率相等的假设将被接受的区域为：
β*如下计算：
随后，将上述区域简化成下式，以用于确定可接受的β*限度：
其中β为GA-RS曲线的斜率。因此，通过等式(6)确定的GA批次斜率β*的可接受的范围可以表示为：
β·(下限)≤β*≤β·(上限) (9)
如果β*在上述可接受的限度内，则可以得出平行性的结论。
在一些实施方案中，使用相等斜率的真实假设检验。
在一些实施方案中，使用参考批的多个测定(以解释测定变异)，或多个参考批的测定(以解释参考批例如多个可商购的COP批之间的变异)来产生校准曲线。在其中测定中包括多个COP参考批以提供多个数据集从而例如解释批间变异的实施方案中，使用来自多个参考批的数据由参考斜率确定可接受的变异。在这些实施方案中，根据“多参考剂量响应曲线分析”确定测试与参考GA批在免疫学上相同。
在其中测定中包括相同克帕松参考批的多个样品以提供重复数据，从而例如解释测定变异的实施方案中，使用参考批重复数据由参考斜率确定可接受的变异。在这些实施方案中，根据“重复参考剂量响应曲线分析”确定测试与参考GA批在免疫学上相同。
在一些实施方案中，在组中采用具有已知特征例如MHC限制和对非规范肽的反应性的多种GA特异性人类T细胞系。在这些实施方案中，可以用一个参考GA批或多个参考GA批以及一个或多个GA测试批刺激该组中的每种GA特异性T细胞系。为了确立GA参考批与测试批之间的免疫学同一性，参考批的剂量响应曲线必须符合例如上文讨论的适当的接受标准，并且GA测试批的剂量响应曲线必须在所述的可接受的限度内。
在一些实施方案中，用参考GA批、如本文其他各处所述以改变一级氨基酸组成的方式合成的非规范GA肽、以及GA测试批刺激单一GA特异性T细胞系或多种GA特异性T细胞系。采用以上所述的方法，可以确定参考肽的β*的可接受的限度，以及由非规范肽的剂量响应曲线所产生的斜率。测试肽的斜率与标准肽和非规范肽两者的剂量响应曲线的斜率之间的相似性或相异性的统计比较可以同时确定测试肽的相似度或相异度。采用该比较，可以确定GA测试批的免疫学同一性或非同一性。
GA响应生物标志物的鉴别
在本发明方法中测量的GA引起的响应的情况下产生的GA响应生物标志物可以如下鉴别：将在合适的APC存在下用GA刺激的GA特异性T细胞培养物中产生的候选GA响应生物标志物的量，与在与合适的APC一起温育但未用抗原刺激的对照培养物中或在用阴性对照抗原刺激的对照培养物中产生的相同生物标志物的量进行比较。在一些实施方案中，根据在GA刺激后相对于对照的增加来鉴别GA响应生物标志物，该增加为约1.5倍(即，响应升高约50％)至约1000倍、约1.5至约2倍、约1.5至约3倍、约1.5至约4倍、约1.5至约5倍、约1.5至约6倍、约1.5至约7倍、约1.5至约8倍、约1.5至约9倍、约2至约3倍、约2至约4倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约2至约10倍、约3至约4倍、约3至约5倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约3至约10倍、约4至约5倍、约4至约6倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、约4至约10倍、约5至约6倍、约5至约7倍、约5至约8倍、约5至约9倍、约5至约10倍、约6至约7倍、约6至约8倍、约6至约9倍、约6至约10倍、约7至约8倍、约7至约9倍、约7至约10倍、约8至约9倍、约8至约10倍、约1.5倍至约80倍、约1.5倍至约70倍、约1.5倍至约60倍、约1.5倍至约50倍、约1.5倍至约40倍、约1.5倍至约30倍、约1.5倍至约20倍、约2倍至约80倍、约1.5倍至约70倍、约1.5倍至约60倍、约1.5倍至约50倍、约1.5倍至约40倍、约1.5倍至约30倍、约1.5倍至约20倍、约2倍至约80倍、约2倍至约70倍、约2倍至约60倍、约2倍至约50倍、约2倍至约40倍、约2倍至约30倍、约2倍至约20倍、约3倍至约80倍、约3倍至约70倍、约3倍至约60倍、约3倍至约50倍、约3倍至约40倍、约3倍至约30倍、约3倍至约20倍、约5倍至约80倍、约5倍至约70倍、约5倍至约60倍、约5倍至约50倍、约5倍至约40倍、约5倍至约30倍、约3倍至约20倍、约10倍至约80倍、约10倍至约60倍、约10倍至约40倍、或约10倍至约20倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
实施例
方法
除非另有说明，本文的实施例中使用下列方法。测定样品以一式三份运行。
1.人类T细胞系的制备和初始刺激
使用Good等人和Ota等人(Good等人，1987；Ota等人，1990)描述的方法来分离T细胞系。采用柠檬酸葡萄糖(ACD)作为抗凝血剂通过白细胞分离术收集PBMC，根据制造商的方案(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)通过Ficoll-Paque梯度离心进行分离，并冷冻保存在含2％人血清白蛋白和10％DMSO的PBS中。在AIM 
培养基(Invitrogen)或X-VIVO 
培养基(Lonza)中制备PBMC培养物。在第1天，将10μg/mL的抗原(GMA，MylanPharmaceuticals,Inc.，或克帕松，Teva Pharmaceuticals USA,Inc.)添加至含有5x 105至2x 106个细胞/mL(每个200μl孔中1-4x 105个细胞)的U形底96孔板中。将板在37℃、6％CO2下温育。在第3天或第4天，添加10U/mL IL-2(2U/孔，eBioscience目录号14-8029-63或R&D Systems目录号202-IL-010/CF)。通过将储备IL-2在培养基中稀释至40U/mL来制备IL-2，并将50μl稀释的储备IL-2(2U)添加至各个孔中。在第6天或第7天再次添加相同量的IL-2，并且根据对细胞生长的评估，如果需要的话可能在第10天或其左右再次添加。
2.通过增殖试验针对GA反应性筛选人类T细胞系
在第12-14天，通过分析在APC存在下的增殖，使细胞系经历对于对GA再刺激的反应性的初始筛选。确证试验在至少总计3轮的再刺激之后(至少约31天或更长)进行。
通过采用发光方法(CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay,Promega,Madison,WI,目录号G7571)测量ATP含量，或通过经由ELISA(Millipore目录号2752)测量BrdU摄取来评估增殖，这两种情况下均按照试剂盒的说明进行。使用了拆分孔(split well)形式。将每个孔中的细胞重悬，并将65μl转移至两个新的U形底96孔板的每一个的孔中，以产生复制板。对于初始筛选，原始的96孔板接受了丝裂霉素处理的自体PBMC(作为APC)加10μg/mL抗原(GA)。第一复制板接受了100μL丝裂霉素处理的PBMC(2x 105)，并且无抗原，而第二复制板接受了100μL丝裂霉素处理的PBMC加最终浓度为10μg/mL的GA。因此，全部三个板均接受了丝裂霉素C处理的自体APC(PBMC)以防止细胞分裂。每个孔具有200μL的总体积。将后面两个板在37℃、6％CO2下温育3天，然后添加CellTiterGlo或BrdU并测量信号。在第17天向原始的96孔板中添加10U/mL的IL-2以用于扩充。对于后续的筛选，使用丝裂霉素处理的EBV转化的自体B-LCL(2x 105至5x 105个细胞/mL)作为APC。
根据相对于对照(添加APC，没有抗原)板中的对应孔的响应增加来鉴别潜在的抗原反应性孔。通常，将鉴别为抗原反应性的原始孔在筛选后7-10天移转至24孔板，并如下文所述在丝裂霉素处理的自体PBMC的存在下用GA再刺激/扩充。
3.GA特异性T细胞的扩充/再刺激
在针对GA反应性的初始筛选时，对含有三分之一的来自最初刺激的细胞的原始复制板进行再刺激/扩充。当对测定板进行再刺激时，在约第12-14天用10μg/mL GA(与用于初始刺激的制品相同)和丝裂霉素C处理的PBMC再刺激原始板中的细胞系。在约第17天以10U/mL添加IL-2。在初始筛选后约7-12天(约第19至26天)，再次对原始板中对应于阳性孔的孔进行扩充/再刺激。收集假定的阳性孔中的细胞，并将该细胞在具有以初始刺激浓度(10μg/mL)添加的GA和丝裂霉素处理的APC的24孔板中培养。将APC调整至2.5x 106个/mL(如果是PBMC)或5x 105个/mL(如果是B-LCL)。向含有T细胞的24孔板的每个孔中添加1mL APC，并将该板在37℃、6％CO2下温育24小时。以10U/mL或另外说明的最终IL-2浓度向每个孔中添加IL-2。继续培养6-13天，并重复刺激。在扩充期间每7至14天刺激T细胞。
对于本文所述的程序，培养容器所使用的体积：96孔板为200μL/孔；24孔板为2mL/孔；12孔板为4mL/孔；T-25烧瓶为10mL；T-75烧瓶为20mL。
4.针对GA特异性筛选T细胞系
将培养基从针对增殖试验制备的培养物中取出，并用于测量细胞因子产生。在多数情况下，在混合T细胞、APC和刺激抗原后18-24小时收集培养基。通过ELISA或珠测定来测量细胞因子产生。为了测量细胞因子产生，从每个孔中移取100-150μL培养基(如果将要继续培养则为100μL，否则为150μL)。在一些情况下，继续培养48小时，总计培养72小时，并且测量增殖响应。
IFN-γELISA
培养物上清液中的IFN-γ浓度通过采用两种抗IFN-γ单克隆抗体的夹心ELISA来测量。克隆2G1用于捕获，并且来自克隆B133.5的生物素化的抗体用于检测(两者均来自Endogen)。使用重组IFN-γ构建范围在1000至15pg/mL的标准曲线。
通过将抗体在PBS中稀释至1μg/mL并且每孔添加100μl的稀释抗体而用捕获抗体包被ELISA板。将板在4℃下温育过夜。去除包被抗体并向所有孔中添加100μl的PBS-BSA。将板在室温下温育一小时。制作标准曲线。采用在1mL的PBS-BSA中的1μl储备IFN-γ(100μg/mL)(最终浓度为100ng/mL)制备标准物，如下所述在PBS-BSA(1g BSA/100mL PBS)中稀释：
a.取10μl的100ng/mL IFN-γ并稀释于1mL的PBS-BSA中。＝1000pg/mL
b.将500μl的1000pg/mL溶液与500ul的PBS-BSA混合。＝500pg/mL
c.将500μl的500pg/mL溶液与500ul的PBS-BSA混合。＝250pg/mL
d.将500μl的250pg/mL溶液与500ul的PBS-BSA混合。＝125pg/mL
e.将500μl的125pg/mL溶液与500ul的PBS-BSA混合。＝62.5pg/mL
f.将500μl的62.5pg/mL溶液与500ul的PBS-BSA混合。＝31.25pg/mL
g.将500μl的31.25pg/mL溶液与500ul的PBS-BSA混合。＝15.625pg/mL。
将生物素化的抗体在PBS-BSA中稀释至0.5μg/mL。对于每个板，将5μl的抗体稀释于5mL的PBS-BSA中。在用PBS-BSA温育后，使用洗板机以及作为洗涤溶液的PBS 0.05％吐温20洗板四次。向全部的孔中添加50μl生物素化的抗体。向合适的孔中添加50μl样品或标准物。标准物和样品以一式两份或一式三份运行。将板在室温下温育90分钟。将链霉亲和素-过氧化物酶以1：10,000稀释于PBS-吐温中。每个板使用在10mL PBS-吐温中的1μl链霉亲和素-过氧化物酶。洗板四次，向每个孔中添加100μl链霉亲和素-过氧化物酶，并将板在室温下温育30分钟。用PBS-吐温洗板四次。向每个孔中添加100μl的TMB(3,3',5,5"-四甲基联苯胺)，并将板在室温下温育15-30分钟。通过每孔添加100μl的0.2N NH2SO4来停止反应，并在450nm处读板，以630nm作为参考。
使用的捕获抗体为单克隆抗人IFN-γ(Endogen目录号M-700A)。生物素化的抗IFN-γ为Endogen目录号M-701B。链霉亲和素过氧化物酶为Zymed目录号43-4323。使用的TMB为Ultra TMB，Thermo Scientific目录号34028。也可以使用标准制剂TMB。
多重测定
使用FlowCytoMixTM试剂盒(eBioscience,San Diego CA)同时测量多种细胞因子的浓度。这些是基于荧光珠子的测定，其由与抗细胞因子抗体缀合的珠子组成。对每种细胞因子具有特异性的珠子通过大小和670nm处的荧光来区分。使用藻红蛋白缀合的抗体来检测与每个珠子结合的细胞因子，使得585nm处的荧光反映样品中细胞因子的浓度。使用测量不同的细胞因子组的两种试剂盒。TH1/TH2试剂盒测量IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、TNF-α(TNF)和TNF-β(LT)。TH1/TH2/TH9/TH17/TH22试剂盒测量IFN-β、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17、IL-22和TNF-α(TNF)。这两种试剂盒均按照制造商的说明使用。
5.抗原呈递细胞的制备
通过将冷冻的PBMC解冻并将细胞浓度在PBS中调整至每mL5x 106个细胞来制备用作APC的PBMC。添加丝裂霉素C(Sigma-Aldrich目录号M4287或EMD Millipore目录号475820-10MG)至最终浓度为25μg/mL。将板在37℃下温育30-45分钟，随后用PBS洗涤细胞3次以去除丝裂霉素C。将PBMC浓度调整至1-1.5x 106个细胞/mL。
采用EB病毒将人类B细胞永生化，以用作APC。根据标准方案将PBMC解冻，并使细胞以107个细胞/mL的浓度悬浮。用EB病毒(ATCC VR-1492)感染PBMC的等份，以用作永生化的B淋巴母细胞样细胞系(B-LCL)。通过将PBMC与病毒一起在含有10％胎牛血清和1μg/mL环孢菌素A(环孢菌素)的RPMI 1640培养基中培养来进行感染，以防止T细胞的活化及增殖。将2mL的EB病毒(ATCC VR-1492)添加至在15mL离心管中的2mL细胞中，充分混合，并在水浴中在37℃下温育一小时。将8mL的培养基(含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基)和10μg环孢菌素(通过将1mg环孢菌素溶解于1mL的100％乙醇和100uL的吐温80中，并用PBS使体积达到10mL而制备)添加至细胞，并将混合物移转至25cm2烧瓶中。将该烧瓶在5-10％CO2下在37℃的培养箱中竖立地温育，并使该烧瓶处于不受干扰的状态持续2至6周。
在2-6周的培养之后，当用显微镜观察到大的淋巴母细胞簇时，成功转化是明显的。此时，维持该培养物，并通过将细胞浓度保持在2x 105至1x 106个细胞/mL之间使培养物扩充。这通常通过每3至5天以1:4-1:5的比例稀释细胞来实现。对于再刺激，向每个孔中添加5x 105个丝裂霉素处理的B-LCL或丝裂霉素处理的自体PBMC。
当使用B-LCL作为APC时，将50μg/mL的丝裂霉素C添加至2x 106个细胞/mL的细胞悬浮液中。将细胞与丝裂霉素C一起温育45分钟，随后洗涤3次以去除过量的丝裂霉素C。在洗涤以去除丝裂霉素C之后，将细胞调整至2-5x 105个/mL。
6.EBV转化的B细胞(B-LCL)的维持
如以上所述，通过用病毒感染外周血单核细胞(PBMC)并向培养基(含10％胎牛血清的RPMI 1640)中添加环孢菌素以防止T细胞的活化和增殖，在实验室中构建了转化的B细胞。用自体EBV-B细胞刺激PBMC可能导致任何EBV特异性T细胞的刺激，从而产生病毒特异性T细胞系。因此，除非另外指明，EBV-B细胞不与初级培养物或早期传代T细胞系一起使用。可以用EBV-B细胞再刺激已经传代若干次的T细胞系。
因为EBV-B细胞悬浮生长，并且倾向于形成细胞团块，所以将细胞浓度保持在2x105个/mL至106个/mL之间。通过用移液管上下吸移细胞破坏细胞团块并移除80％的悬浮液，每3至5天以1:4-1:5的比例分割培养物。添加等体积的新鲜培养基，并温育培养物。
7.MHC DR限制测试
通过针对所测试的细胞系，在基于原始PBMC供体的已知HLA-DR基因座而选择的APC阵列(包括自体APC(B-LCL))的存在下，测量如上所述的细胞系的增殖响应，从而进行细胞系的MHC DR限制测试。表2中描述了所使用的供体。
为了确定用于向GA特异性T细胞系呈递抗原的MHC分子，在自体APC的存在下以及在匹配T细胞供体的HLA-DR等位基因之一的APC的存在下测量GA特异性响应。因此，在每个实验中使用至少3种APC：自体APC，与DR等位基因1匹配但与等位基因2不匹配的APC，以及与等位基因2匹配但与等位基因1不匹配的第三种APC。在一些实验中，使用第四种APC B-LCL。使用无抗原阴性对照。通过与50ug/mL的丝裂霉素C一起温育使APC灭活。灭活后，将细胞洗涤3次以去除丝裂霉素C，并以1x 106个细胞/mL悬浮于X-VIVO 15培养基中。将GA添加至细胞悬浮液中至最终浓度为20-60μg/mL。将细胞在37℃下与抗原一起温育一小时以允许抗原摄取和结合。然后将细胞悬浮液离心以使细胞沉淀，并用培养基洗涤细胞沉淀物一次。将APC在X-VIVO 15培养基中调节至2x 105个细胞/mL，并以每孔100μL添加至不透明的96孔板。将2-4x 105个细胞/mL(除非另有说明)的T细胞悬浮液以每孔100μL添加至96孔板，并将培养物温育4天，然后用CellTiter 
测量细胞数目(以评估增殖)。
或者，APC不是脉冲式的(pulsed)。相反，每个孔含有10ug/mL抗原、50μl APC以及100μL的T细胞。
在37℃(5％CO2)下温育4天后，从每个孔中移取100μL，与100μL CellTiterGlo试剂合并，并使用Packard Fusion测量发光。结果以相对光单位(RLU)表示。
8.供体HLA分型
表2中示出的供体HLA分型由Puget Sound Blood Center(Seattle，WA)依照由美国组织相容性及免疫遗传学协会(American Society for Histocompatibility andImmunogenetics)(ASHI)以及临床实验室改进法案(Clinical Laboratory ImprovementAct)(CLIA)设定的标准进行。使用基于聚合酶链扩增的测试来指定HLA I类和II类等位基因。
9.冷冻保存的细胞的解冻
通过将小瓶浸没于37℃水浴中并搅动2-3分钟来使冷冻保存的细胞解冻。细胞悬浮液一旦完全变为液态，立即将其移转至含有10mL温热的X-VIVO 15培养基的15mL离心管中。将该管轻轻倒转两至三次以进行混合。移取50μL的悬浮液等份以获得细胞计数，并将剩余的悬浮液以200x g离心10分钟，以使细胞沉淀。将培养基倒出，并将细胞沉淀物以所需的细胞浓度重悬于X-VIVO 15培养基中。
10.试剂
GA制品为克帕松(COP,Teva Pharmaceuticals USA,Inc..)或GMA(MylanPharmaceuticals,Inc.)，均在甘露糖醇(40mg/mL)中稀释至20mg/mL。通过在合成的前5分钟不给予酪氨酸来制备肽026。破伤风类毒素由Astarte Biologics供应。Stern肽在Stern等人,2005,“Peptide 15-mers of defined sequence that substitute for randomamino acid copolymers in amelioration of experimental autoimmuneencephalomyelitis,”Proc.Nat.Acad.Sci.102:1620-1625)中描述。
表1.肽
实施例I.GA特异性人类T细胞系的产生
使用如上所述从先前没有暴露于GA的若干种不同供体中的每一种获得的、显示出对GA有特异性响应的PBMC制备人类T细胞系。表2中总结了用于本文所述的研究的供体的特征。
表2.供体HLA-DR基因座
| 供体 | 年龄 | 性别 | 种族 | MHC II类HLA-DRβ1 |
| 供体1(222) | 25 | 女性 | 高加索人种 | *04:01,*07:01 |
| 供体2(206) | 63 | 女性 | 高加索人种 | *04:01,*04:04 |
| 供体3(165) | 51 | 男性 | 高加索人种 | *15,*11 |
| 供体4(205) | 21 | 男性 | 高加索人种 | *07,*13 |
| 供体5(213) | 23 | 女性 | 高加索人种 | *11,*1 |
| 供体6(224) | 49 | 女性 | 高加索人种 | *13,*15:01 |
| 供体7(228) | 30 | 男性 | 高加索人种 | *15,*03 |
通过在GMA或克帕松的存在下，根据上述方法培养来自这些供体的PBMC，产生了超过六十种GA反应性T细胞系。证明了在表3中按所用的供体和刺激抗原列出的这些细胞系对GA具有反应性(基于增殖试验)，具有GA特异性(基于增殖或细胞因子产生试验)，或二者兼具。
表3.获得的T细胞系
供体1：用GMA初始刺激的细胞系
如上所述从供体1PBMC获得GMA响应性细胞系(2x 105个细胞/孔，即，1x106个细胞/孔，与10μg/mL GMA一起接种；在第3天和第7天添加IL-2)。在第12天开始的拆分孔试验中，用10μg/mL GMA和1x 105个丝裂霉素处理的自体PBMC(作为APC)刺激细胞。在第3天添加BrdU，将细胞温育4.5小时并固定，并测量摄取。表4示出了针对所选择的从供体1PBMC获得的八种假定GA特异性人类T细胞系测量的增殖响应。相对于(无抗原)对照，这些细胞系各自产生了至少50％的信号增加。
表4.用GMA刺激后八种供体1人类T细胞系的BrdU摄取
| 供体1细胞系 | 对照(OD<sub>450</sub>) | GMA(OD<sub>450</sub>) |
| 222-AF2 | 0.454 | 1.119 |
| 222-AF5 | 0.606 | 1.133 |
| 222-AC11 | 0.680 | 1.244 |
| 222-BA4 | 0.370 | 0.603 |
| 222-AG11 | 0.359 | 0.875 |
| 222-BA11 | 0.255 | 0.783 |
| 222-AG12 | 0.448 | 0.949 |
| 222-BC11 | 0.499 | 0.921 |
在第24天，将来自与表4中列出的八种假定GA特异性人类T细胞系相对应的孔的细胞移转至24孔板，并通过用10μg/mL GMA和丝裂霉素处理的自体PBMC(作为APC)(3x 106个/孔，即，1.5x 106个/mL)刺激进行扩充。在第32天，再次用自体PBMC作为APC(2x 105个/孔，即，1x 106个/mL)，将八种细胞系中的四种，即222-BA11、222-BC11、222-AG11和222-AG12，用0、1、10及100μg/mL GMA刺激，并采用ATP试验在96孔板中测试其对GMA的增殖响应。在用10μg/mL GMA刺激的细胞中观察到相对于对照最佳的增殖响应。图2A和2B示出了在第35天用222-AG12、222-BC11、222-AG11及222-BA11进行的ATP增殖试验的结果(对照＝无抗原)。图3A-C比较了采用细胞系222-BA11、222-BC11及222-AG12，在使用如指示的变化浓度的GMA或克帕松刺激后进行的ATP增殖试验的结果。用GMA刺激的供体1人类T细胞系的细胞因子产生
将在第32天冷冻的222-AG11和222-AG12小瓶解冻，并测试细胞的细胞因子产生。在自体的EBV转化的B-LCL或来自在一个等位基因处匹配的供体的EBV转化的B-LCL(供体2B-LCL)的存在下，用10μg/mL GMA、10μg/mL克帕松或1μg/mL破伤风类毒素(对照抗原)刺激细胞系。包括添加APC但不加抗原的对照样品。在24小时后收集培养基，并如上所述通过ELISA测定IFN-γ。图4A和4B示出了由细胞系222-AG11和222-AG12产生的IFN-γ。
供体1：用克帕松初始刺激的细胞系
从供体1获得COP响应性T细胞系。在初始刺激中，将分离的PBMC以每孔1x 105个细胞(5x 105个细胞/mL)与10μg/mL克帕松一起接种，并如上所述进行培养。在培养的第4天和第7天向所有的孔中添加IL-2，并在第14天使用拆分孔形式的发光增殖试验针对反应性筛选各孔。将原始的板再刺激，并在再刺激后4天添加IL-2。表5示出了15种供体1COP T细胞系的增殖试验结果(产生至少两倍于对照的信号)。
表5.供体1假定COP T细胞系-ATP增殖试验
| 供体1细胞系 | 对照 | COP 10μg/mL |
| 222-1C5 | 7087 | 14906 |
| 222-1F8 | 2308 | 6519 |
| 222-1G8 | 4030 | 8308 |
| 222-1H12 | 8141 | 23836 |
| 222-2B8 | 5543 | 13600 |
| 222-2B11 | 6340 | 16460 |
| 222-2C1 | 8350 | 20166 |
| 222-2C3 | 6839 | 14045 |
| 222-2C5 | 4695 | 9577 |
| 222-2D2 | 7135 | 16271 |
| 222-2D8 | 13024 | 26495 |
| 222-2E1 | 8035 | 17064 |
| 222-2F12 | 9703 | 28022 |
| 222-2G4 | 2566 | 6812 |
| 222-2G12 | 3913 | 9899 |
(数据以RLU计。)
通过用COP初始刺激从供体1产生的T细胞系222-2D8，在至少2个实验中显示在用GMA和COP再刺激后增殖相当。表6显示了用3或10μg/mL的GMA或COP刺激后在培养的第56天进行的ATP增殖试验的结果。在刺激后48小时测量ATP水平。GMA系列中的对照为无抗原，而COP系列中的对照为MBP。该试验中在10μg/mL剂量下对GMA的响应相比于对COP的响应为103.4％。
表6.细胞系222-2D8的抗原反应性(数据来自图5A)
| GMA | COP | ||
| 无抗原 | 2290 | 1999 | |
| 1μg/mL | 4369 | 4888 | |
| 3μg/mL | 7480 | 6392 | |
| 10μg/mL | 12793 | 12161 |
在用1、3或10μg/mL的GMA或COP刺激后在培养的第56天进行的第二个ATP增殖试验中，在10μg/mL剂量下，对GMA的响应相比于对COP的响应为107.1％。结果示于表7中。
表7.细胞系222-2D8的抗原反应性(第56天)
通过用COP初始刺激从供体222产生的T细胞系222-2D8，在至少2个实验中显示在用GMA和COP再刺激后增殖相当。表8显示了用3或10μg/mL的GMA或COP刺激后在培养的第56天进行的ATP增殖试验的结果。在刺激后48小时测量ATP水平。GMA系列中的对照为无抗原，而COP系列中的对照为MBP。该试验中在10μg/mL剂量下对GMA的响应相比于对COP的响应为85.1％。
表8.细胞系222-2F12的抗原反应性(数据来自图5C)
| GMA | COP | ||
| 无抗原 | 4442 | 2417 | |
| 1μg/mL | 6500 | 5281 | |
| 3μg/mL | 8520 | 8684 | |
| 10μg/mL | 12382 | 11747 |
在培养的第56天，在总共6轮刺激之后，测定了细胞系222-2F12响应于GA以及一系列非规范肽的刺激的增殖。对于该测定，在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，将0、3、10或30μg/mL的肽GL 14、GLT 631、GAT 111和GAT 631、COP以及GMA中的每一种添加至1x 105个细胞/mL的T细胞系。通过发光ATP试验来测量增殖。细胞系222-2F12响应3μg/mL的GL 14，但不响应所测试的其他非规范GA肽。该试验中在10μg/mL剂量下对GMA的响应相比于对COP的响应为99.4％。数据示于表9中。
表9.供体1COP T细胞系222-2F12对非规范肽的反应性(第56天)
用克帕松刺激的供体1人类T细胞系的细胞因子产生
根据观察到的ATP水平的增加(即，有抗原的孔相对于没有抗原的对照孔的相对发光比为2或更大)，在第26天将原始板中的15种假定的GA特异性T细胞系移至24孔板中，并在自体的EBV转化的B-LCL的存在下(每孔5x 105个，即，2.5x 105个/mL)，用10μg/mL克帕松进行再刺激。在第27天添加IL-2。在第34天，将15种假定的细胞系在丝裂霉素处理的自体B-LCL(每孔4x 104个；每mL 2x 105个)的存在下用10μg/mL GMA或10μg/mL COP再刺激，或与丝裂霉素处理的自体B-LCL一起并在没有抗原的情况下进行温育。在第35天向持续的培养物中添加IL-2。在第36天，从测试培养物中收集培养上清液，并通过ELISA测量IFN-γ产生(在再刺激后48小时)。结果示于表10中。采用TMB标准曲线确定IFN-γ蛋白质浓度。
表10.供体1COP T细胞系响应于GMA或COP刺激而产生的IFN-γ
(数据以一式三份培养物的平均值pg/mL示出。)
至少7种供体1COP T细胞系——222-2D8、222-2E1、222-2B11、222-2C3、222-2B8、222-2G12和222-2F12响应于GA而产生IFN-γ，并且这些细胞系与克帕松和GMA均反应。
还通过免疫荧光珠试验(FlowCytoMixTM试剂盒)一式三份测试了222-2D8、222-1H12、222-1C5和222-2D2的第34天上清液响应于GMA、COP或无抗原(作为对照)的IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-8、IL-5、IL-1β、TNF-α及TNF-β分泌。没有或几乎没有检测到IL-4、IL-6或IL-12。表11示出了细胞系222-2D8和222-1H12的所得到的细胞因子分泌谱。表12示出了细胞系222-1C5和222-2D2的所得到的细胞因子分泌谱。重要的是注意到，在表12中，滴定了T细胞系1H12的上清液，证明该细胞系还响应于GMA和COP两者而产生干扰素。表11.供体1COPT细胞系222-2D8、222-1H12的细胞因子产生
表12.供体1COP T细胞系222-1C5和222-2D2的细胞因子产生
在第46、56、67和75天再刺激培养物。在第56天，在增殖试验中再次测试了细胞系222-2D8、222-1H12、222-2F12、222-2B8、222-1C5、222-2B11和222-2E1对1、3或10μg/mL的GMA或COP刺激的反应性。在刺激后48小时测量了全部七种细胞系的ATP水平(结果在图5A-G中)。GMA系列中的对照为无抗原，而COP系列中的对照为MBP。
采用基于珠子的多重测定，测定了在第56天再刺激后24小时取得的四种培养上清液(来自222-2B8、222-1C5、222-2B11和222-2E1)的细胞因子(结果在表13-16中)。所有的细胞因子值均代表按pg/mL计的一式三份值的平均值。在增殖和细胞因子试验中，这些细胞系均显示出对GMA和COP刺激的反应性。发现先前鉴别为不响应于GA刺激产生IFN-γ的细胞系1C5，在上清液适当稀释后响应于GMA和COP两者而产生IFN-γ，并且所产生的量相当(见表14)。
表13.供体1COP T细胞系222-2B8的细胞因子产生
表14.供体1COP T细胞系1C5的细胞因子产生
表15.供体1COP T细胞系2B11的细胞因子产生
表16.供体1COP T细胞系2E1的细胞因子产生
在48小时后(在第56天，在第6次刺激后)，通过免疫荧光珠试验进一步测定了细胞系222-2D8、222-1H12和222-2F12的细胞因子分泌(结果在图6A-F中)。测量了在自体的EBV转化的B-LCL存在下，响应于1、3或10μg/mL GMA，或1、3或10μg/mL COP，以及无抗原对照和MBP对照的刺激的IL-12p70、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-8、IL-6、IL-5、IL-4、IL-1β、TNF-α(TNF)和TNF-β(LT)分泌。图6A、6C和6E示出了三种供体1细胞系响应于三个浓度的GMA的细胞因子分泌，而图6B、6D和6F示出了其响应于三个浓度的COP的细胞因子分泌。箭头指示以下位置：每个细胞因子数据集的第一个条，即，对照样品，接着向右按顺序为用1μg/mL GA、3μg/mL GA、10μg/mL GA以及MBP处理的细胞的分泌水平。三种细胞系中的每一种均给出了不同的细胞因子分泌谱。用10μg/mL GA处理的细胞系产生了最高的细胞因子水平(每个数据集中从左侧起第四个条)。
供体2：用GMA刺激的细胞系
从具有MHC II类HLA-DRβ1 04:01，04:04的63岁正常健康女性供体(供体2)中获得PBMC。在第0天将分离的PBMC在AIM V培养基中以每孔2x 105个细胞(1x 106个细胞/mL)与100μg/mL GMA一起培养，并如“方法”中所述进行培养。在采用丝裂霉素处理的自体PBMC作为APC，用100μg/mL GMA刺激后，在第13天采用BrdU摄取试验针对增殖筛选培养物。根据GA刺激的测试样品的OD相对于未刺激的对照样品的至少50％的增加，选择了九种假定的GA特异性人类T细胞系用于扩充和进一步分析。表17示出了从供体2PBMC获得的九种假定的GA特异性人类T细胞系的BrdU增殖数据。值得注意的是，对于所有这些T细胞系，BrdU摄取相对于对照的差异超过两倍。
表17.在GMA刺激后供体2人类T细胞系的BrdU摄取
通过用10μg/mL GMA和丝裂霉素处理的自体PBMC刺激，并随后用自体的EBV转化的B-LCL刺激，来扩充这些假定的供体2T细胞系。将细胞系206-1A7转换到X-VIVO 15培养基。在第88天用B-LCL以及10μg/mL GMA或1μg/mL破伤风类毒素(TT)刺激细胞系206-1A7。4天后，通过ATP试验测试了培养物的增殖，并通过ELISA测试了上清液的IFN-γ和TNF-α分泌。图7A示出了T细胞系206-1A7响应于示出的0至100μg/mL浓度的GMA刺激的增殖。图7B示出了细胞系206-1A7的IFN-γ分泌。在这两个实验中，0浓度对照不含GMA。图7A和7B中的浅灰色0浓度条代表用1μg/mL TT处理的样品。检测不到TNF-α。该细胞系由于细菌污染而损失。
供体3：用GMA刺激的细胞系
从具有MHC II类HLA-DRβ1*15，*11的52岁正常健康男性供体——供体3中获得PBMC。将培养物在U形底96孔板中以每孔1x105个细胞(1x 106个细胞/mL)用10μg/mL GMA刺激。在第3天和第7天添加IL-2，并在第14天在每孔2x 104个自体B-LCL的存在下用10μg/mLGMA再刺激培养物，并通过ATP增殖试验进行筛选。根据试验数据(表18)，选择了14种假定的GA特异性T细胞系，并将其在第24天扩充至24孔板。在第25天添加IL-2。
表18.供体3假定的GMA细胞系-ATP增殖试验
| 供体3细胞系 | 对照 | GMA 10μg/mL |
| 165-B2G | 9692 | 28770 |
| 165-B5G | 15423 | 63023 |
| 165-B11G | 18412 | 56588 |
| 165-C4G | 14869 | 62306 |
| 165-C5G | 14240 | 76296 |
| 165-C8G | 18205 | 79281 |
| 165-D8G | 30331 | 136938 |
| 165-E7G | 18215 | 66364 |
| 165-E9G | 17059 | 52948 |
| 165-F2G | 14734 | 44951 |
| 165-F5G | 16943 | 100677 |
| 165-F8G | 17986 | 72716 |
| 165-F10G | 13314 | 42447 |
| 165-H11G | 17149 | 52850 |
(数据以RLU计。)
对于这些细胞系，响应于GMA：对照(仅APC)的增殖的比率大于3.0。在第32天，在2.5x 105个自体B-LCL的存在下，用10μg/mL GMA再刺激1-2.5x 105个细胞/mL的这些细胞系，并通过增殖试验进行再筛选。对于该试验，测试了用10μg/mL GMA、10μg/mL COP或1μg/mL破伤风类毒素(作为对照)进行的刺激。测试的所有8种细胞系均对GMA和COP具有响应性(表19)。
表19.通过ATP增殖试验确认供体3GMA培养物的抗原反应性
(数据以RLU计。)
用不同浓度GMA刺激的供体3人类T细胞系的细胞因子产生
在细胞因子多重测定中测试了来自六种细胞系的培养基，从而确认了反应性并揭示了IL-13、IL-22、IL-5和IFN-γ的产生(表20)。表20.供体3GMA响应性T细胞的细胞因子产生
在第33天，将细胞系扩充至T-25烧瓶中(10mL体积，每mL含有10U IL-2)。在第40天，使用1、3或10μg/mL GMA或COP，或使用10μg/mL MBP作为对照，再次测试了12种细胞系的反应性。12种细胞系中的11种(除F2G以外的所有)均对两种抗原制品具有响应性。结果示于表21中。
表21.通过ATP增殖试验对GMA细胞系抗原反应性的供体3确认
*孔含有3μg/mL COP。**孔含有10μg/mL COP。
供体3：用COP刺激的细胞系
在初始刺激中，在第0天将分离的PBMC以每孔2x 105个细胞(1x 106个细胞/mL)与100μg/mL COP一起接种到AIM V培养基中，并如上文“方法”中所述进行培养。类似地，在第0天将PBMC以每孔2x 105个细胞与100μg/mL GMA一起接种到AIM V培养基中。将培养物在丝裂霉素处理的自体APC的存在下用100μg/mL的相应抗原(COP或GMA)刺激，并在第13天采用BrdU摄取试验针对增殖进行筛选。测试的细胞系均没有显示出GA特异性反应性。添加GA后观察到细胞的显著损失，从而建议使用较低浓度的GA。GA滴定研究显示，在10和30μg/mL GA下的增殖和细胞因子响应比在100μg/mL GA下的响应更好。
通过将第0天接种的PMBC以每孔1x 105个细胞与10μg/mL COP一起接种到X VIVO-15培养基中而产生第二组假定COP响应性T细胞系。在第3天和第7天以每孔2U添加IL-2，并在第14天通过拆分孔试验针对增殖筛选培养物。在2x 104个自体B-LCL作为APC的存在下用10μg/mL COP再刺激(第一次再刺激)细胞系，并用发光ATP试验来测量增殖。如果在COP刺激后的增殖与响应于APC对照的增殖之比大于3.0，则选择14个孔用于扩充(表22)。
表22.供体3假定COP响应性T细胞系-ATP增殖试验
| 供体3细胞系 | 对照 | COP 10μg/mL |
| 165-B6C | 14966 | 77564 |
| 165-B10C | 10604 | 54779 |
| 165-C4C | 23510 | 108089 |
| 165-C7C | 12707 | 63491 |
| 165-C9C | 22840 | 113199 |
| 165-D2C | 12767 | 54895 |
| 165-D3C | 18380 | 119241 |
| 165-D11C | 13302 | 82759 |
| 165-E3C | 12219 | 69893 |
| 165-E9C | 22512 | 98168 |
| 165-F3C | 13157 | 93437 |
| 165-F4C | 13598 | 96289 |
| 165-F6C | 23457 | 135516 |
| 165-F9C | 19736 | 145768 |
(数据以RLU计。)
在第24天，将表22中列出的细胞系的持续培养物扩充至24孔板(2mL/孔)中，并在第二次再刺激中在5x 104个自体B-LCL的存在下用10μg/mL COP进行再刺激。在第25天，添加10U/mL的IL-2。在第32天，将来自六种细胞系中的每一种的2-5x 105个T细胞在5x104个自体B-LCL的存在下用10μg/mL COP或破伤风类毒素再刺激，以通过发光ATP增殖试验进行确认增殖测试。全部六种细胞系均显示出对COP和GMA两者的反应性(表23)。
表24.通过ATP增殖试验确认六种供体3COP细胞系的抗原反应性
(数据以RLU计。)
在第32天，还将对应于测定的培养物的持续培养物再刺激，并在第33天将七种细胞系(165-B6C、165-B10C、165-D11C、165-F6C、165-D3C、165-E3C和165-F3C)扩充至T-25烧瓶中(总体积10mL，10U/mL IL-2)。其余七种在扩充至烧瓶之前留在24孔板中额外2天。24孔板中的四种细胞系(165-F4C、165-C9C、165-E9C和165-F9C)损失。在第39天，通过ATP增殖试验再次测试了24孔板中的三种细胞系(165-D2C、165-C7C和165-C4C)对三个浓度的COP和GMA(包括无抗原和MBP对照)的反应性(全部都在5x 104个自体的丝裂霉素处理的B-LCL作为APC的存在下)。全部三种细胞系对COP和GMA的响应相当(表25)。在第40天，在第39天第四次再刺激之后，将对应于测定的细胞系的持续培养物如上所述从24孔板扩充至含有IL-2的T-25烧瓶中。
表25.通过ATP增殖试验确认三种供体3COP细胞系的抗原反应性
在培养的第46天测试了七种供体3COP细胞系。使用3个浓度的COP和GMA，包括如前所述的无抗原和MBP对照(全部都在5x104个自体B-LCL的存在下)，再刺激细胞系。3天后通过ATP试验测量增殖。结果示于以下的表26中。
表26.供体3COP响应性T细胞系-不同抗原剂量下的ATP增殖试验
(数据以RLU计。)
在第46天将持续细胞系培养物通过以4mL/孔体积扩充至12孔板(每个孔含有1x106个T细胞、1x 106个APC以及10μg/mL COP)而进行再刺激(细胞系的第五次再刺激)。将剩余的细胞冷冻保存。在第47天，将来自12孔板的每个孔的细胞培养物扩充至T-75烧瓶(20mL，10U/mL IL-2)中。在第53天通过扩充至24孔板(每个孔含有5x 105个T细胞和5x 105个APC，以及10μg/mL COP)进行第六次再刺激，并将剩余的细胞冷冻保存。在第54天将来自24孔板的每个孔的细胞培养物如之前一样扩充至T-75烧瓶中。在第60天通过扩充至24孔板(每个孔含有5x 105个T细胞、5x 105个APC，以及10μg/mL COP)进行第七次再刺激，并将剩余的细胞冷冻保存。在第61天，将来自24孔板的每个孔的细胞培养物扩充至T-25烧瓶中。在总共7轮的再刺激/扩充之后，在第67天收获这些细胞并将其冷冻保存。
供体4：用克帕松刺激的细胞系
从具有MHC II类DRβ1*07，13的21岁正常健康男性供体(供体4)中获得PBMC。通过白细胞分离术使用ACD作为抗凝血剂收集PBMC，并通过Ficoll-Paque梯度离心来分离PBMC。
培养物在96孔板中的含有10μg/mL COP的X-VIVO 15培养基中以每孔1x 105个细胞(每mL 5x 105个细胞)开始，并如“方法”中所述进行培养。在培养的第3天和第6天以10U/mL添加IL-2。在每孔2x 105个丝裂霉素处理的自体PBMC(1x 106个细胞/mL)的存在下用10μg/mL COP再刺激之后，通过发光ATP试验在第13天针对增殖筛选培养物。根据ATP比(COP刺激的：未刺激的对照)为2或更大，将15个孔评为假定响应性的(表27)。
表27.供体4假定COP响应性T细胞系-ATP增殖试验
(数据以RLU计。)
通过用COP初始刺激从供体205产生的T细胞系205-1F4在至少2个实验中显示在GMA和COP再刺激后增殖相当。
表28示出了在4次再刺激之后，在培养的第50天测定的205-1F4对GMA和COP的反应性。在自体B-LCL的存在下，采用三个浓度的COP和GMA，包括无抗原对照，来再刺激细胞系。通过发光ATP试验来测量增殖。该试验中在10μg/mL剂量下对GMA的响应相比于对COP的响应为102.7％。
表28.细胞系205-1F4的抗原反应性(第50天)
表29示出了在4次再刺激后，在培养的第58天测定的205-1F4对GMA和COP的反应性。在自体B-LCL的存在下，采用四个浓度的COP和GMA，包括无抗原对照，来再刺激细胞系。通过发光ATP试验来测量增殖。该试验中在10μg/mL剂量下对GMA的响应相比于对COP的响应为98.5％。
表29.细胞系205-1F4的抗原反应性(第58天)
在总共6次刺激(5次再刺激)后，在培养的第59天刺激细胞系205-1H7和205-1H11。通过发光ATP试验测量细胞系205-1H7和205-1H11响应于一系列抗原浓度的增殖响应。将T细胞从每个培养物中收集、洗涤，并以100uL的体积以每孔20,000个细胞添加至板中。所有条件均一式三份进行测试。在37℃、6％CO2下温育4天之后，从每个孔中移取100μL培养基，并向每个孔中添加100μL的
结果示于表30和31中。
表30.供体4T细胞系205-1H7剂量响应
表31.供体4T细胞系205-1H11剂量响应
用COP刺激的供体4人类T细胞系的细胞因子产生
在第23天，将阳性孔(表27中列出的细胞系)转移至24孔板，并在丝裂霉素处理的自体PBMC的存在下用10μg/mL COP再刺激。在第24天添加IL-2。在第31天(4轮再刺激之后)，用10μg/mL COP再刺激10种细胞系，以通过细胞因子分泌试验确认抗原反应性。将T细胞以2x 104个细胞/孔添加至含X-VIVO 15培养基的96孔板中。在(2x 105个细胞/孔，即，1x 106个细胞/mL)丝裂霉素处理的自体PBMC的存在下，分别用10μg/mL GMA和10μg/mL COP刺激每种细胞系。在20-24小时后，收集培养基用于细胞因子测定(FlowCytomix多重珠测定)。一式三份测试上清液的IL-12p70、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6、IL-4、IL-5、TNF-α和TNF-β分泌。表32和33示出了所得到的细胞因子分泌谱。大多数测试的细胞系响应于GMA和COP两者而分泌IFN-γ、IL-5和TNF-α。IL-2、IL-10和IL-4的分泌在细胞系之间变化。所有的样品还分泌IL-8(数据未显示)。
表32.供体4COP响应性T细胞系的细胞因子产生
测定了来自两种供体4细胞系中的每一种的培养基的一组扩充
的细胞因子，显示了IL-13和IL-22的产生(表33)。
表33.供体4假定COP响应性T细胞系-扩充的细胞因子多重测定
供体6：用GMA刺激的细胞系
从具有MHC II类HLA-DRβ1*13，*15：01的49岁正常健康女性供体(供体6)中获得PBMC。通过白细胞分离术使用ACD作为抗凝血剂收集PBMC，并通过Ficoll-Paque梯度离心来分离PBMC。
在96孔板中，在含有10μg/mL GMA/001/014(批001)—通过标准方法制备的一批GA—的X-VIVO 15培养基中以每孔1x 105个细胞(5x 105个细胞/mL)开始培养。将细胞如“方法”中所述进行培养。在培养的第3天和第8天以10U/mL添加IL-2。在第16天通过发光ATP试验针对增殖筛选培养物，并在每孔2x 104个丝裂霉素处理的自体B-LCL(1x 105个细胞/mL)的存在下用10μg/mL GMA/001/014(001批)再刺激。根据ATP比(COP刺激的：未刺激的对照)为2或更大，将14个孔评为假定响应性的。
将14种T细胞培养物在第26天再刺激(第二次再刺激)，并在第28天在10U/ml IL-2中扩充。在第35天，对全部14种培养物进行再刺激(第三次再刺激)，并在GMA批001、COP、破伤风类毒素或无抗原对照的存在下针对增殖测定13种培养物。
表34示出了增殖试验的结果。
表34.供体6GMA反应性T细胞系-ATP增殖试验
(数据以RLU计。)
实施例II.基于对非规范GA肽的反应性表征GA特异性人类T细胞系
测试了如上所述鉴别的GA特异性人类T细胞系对一系列非规范GA肽(表1中列出的)的反应性。被鉴别为对非规范GA肽具有反应性的GA特异性T细胞系示于以下表35中。根据在至少5轮GA再刺激/扩充之后，用非规范GA肽刺激后的增殖相对于对照增加至少50％来鉴别这些细胞系。先前已经测试了每种细胞系对GA的反应性至少2次，并且在许多情况下测试更多次。如所示的，某些细胞系对GA和非规范肽的响应相当。
表35.与非规范GA肽反应的GA反应性人类T细胞系的实例
GA特异性人类T细胞系对肽026的反应性
肽026是一种通过在GA合成的前5分钟期间不给予酪氨酸而制备的改变的GA肽，其由氨基酸酪氨酸、谷氨酸、丙氨酸及赖氨酸组成。
测试了来自供体3和供体4的T细胞系对肽026的反应性。如表35中总结的，至少四种供体3T细胞系和两种供体4T细胞系显示出对肽026的反应性。一种供体4T细胞系对肽026显示出的反应性与用GA刺激后观察到的反应性相当。
供体3GA特异性T细胞系：肽026
在培养的第54天，测试了七种供体3COP T细胞系对肽026(溶解于含有20mg/mL甘露糖醇的水中)的反应性。测试的细胞系(165-B6C、165-D3C、165-F3C和165-F6C)中的三种对026/11抗原具有低水平的反应性。剩余的细胞系对肽026没有显著的反应性；所有细胞系都对GMA和COP两者响应良好。表36中示出了以RLU计的数据。
表36.供体3COP T细胞系对肽026的反应性
还测试了供体3GMA T细胞系165-B5G、165-D8G、165-E7G及165-F5G对肽026的反应性，具有阴性结果。在(实施例I中所述的)培养的第56天，用各自为0、1、5、10和100μg/mL的COP、GMA和肽026刺激细胞系。所有的供体3细胞系均对GMA和COP响应良好，并且GMA与COP的响应相当。
供体4GA特异性T细胞系：肽026
测试了供体4COP T细胞系205-1B4、205-1C4和205-1H5对肽026的反应性。还测试了1、5、10和30μg/mL的肽GAT 631、GLT和COP。细胞系205-1C4对肽026显示出的反应性与其对GA的反应性相当，而205-1H5显示出最低的反应性，205-1B4未显示出反应性(表37)。图8以图表形式示出了以RLU计的细胞系205-1C4的结果。
表37.供体4COP T细胞系205-1B4、205-1C4和205-1H5对非规范GA肽的反应性
测试了供体4COP细胞系205-1H11对肽026、GLT 631、LT 11、GL 14、GT 41S、GAT631和GAT 111的反应性。该实验与实施例I中描述的COP剂量响应实验同时，使用相同的细胞和方法进行。细胞系205-1H11在30μg/mL的抗原下显示出对肽026的反应性(表38)。
表38.供体4COP T细胞系205-1H11对非规范GA肽的反应性
(数据以RLU计。)
测试了供体4COP细胞系205-1H3对肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、GL 14、LT 11、GA64和GT 41S的反应性。细胞系205-1H3在1μg/mL的抗原下显示出对肽GL 14的反应性(表39)。
表39.供体4COP T细胞系205-1H3对非规范GA肽的反应性
(数据以RLU计。)
GA特异性人类T细胞系对肽GLT 631和GAT 631的反应性
测试了供体1、3和4的GA特异性T细胞系响应于肽GLT 631(GLT)——聚(Glu-Lys-Tyr；6:3:1)刺激的增殖。一种供体1细胞系、三种供体3T细胞系和一种供体4T细胞系对GLT显示出一定的反应性。供体3T细胞系中的两种对GLT显示出的反应性与用GA刺激后观察到的反应性相当。三种供体3T细胞系对GAT显示出反应性。
供体1GA特异性T细胞系222-1H12：肽GLT 631和GAT
在(实施例I中所述的)培养的第56天，在5轮刺激(包括初始刺激和四轮再刺激)之后，在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，在1x 105个细胞/mL的T细胞浓度下添加0、3、10和30μg/mL的肽GL 14、GLT 631、GAT 111和GAT 631、COP以及GMA中的每一种后，测定供体1COP T细胞系222-1H12的增殖。通过发光ATP试验来测量增殖。细胞系222-1H12响应GLT631，而不响应所测试的其他非规范GA肽。表40中示出了以RLU计的数据。
表40.供体1COP T细胞系222-1H12对非规范肽的反应性
供体3GA特异性T细胞系：GLT和GAT
在(实施例I中所述的)培养的第81天，在总共9轮刺激(包括初始刺激和八轮再刺激)之后，测定了供体3GMA T细胞系165-B5G和165-E7G的增殖。对于该测定，在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，在1x 105个细胞/mL的T细胞浓度下添加0、1、3、10和30μg/mL的肽GAT 631、GLT 631和COP中的每一种。通过发光ATP试验来测量增殖。这两种细胞系均对GLT631响应良好。165-B5G和165-E7G还响应GAT 631。表41-42中示出了以RLU计的数据。
表41.供体3GMA T细胞系165-B5G对肽GLT 631和GAT 631的反应性
无抗原值：2432+/-243
表42.供体3GMA T细胞系165-E7G对肽GLT 631和GAT 631的反应性
无抗原值：2145+/-1180
在(实施例I中所述的)培养的第50天，在总共6轮刺激后，测定了供体3GMA T细胞系165-H11G、165-C5G、165-E9G和165-F10G的增殖。在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，在1x 105个细胞/mL的T细胞浓度下，将细胞系与0、1、3、10和30μg/mL的肽GAT 631、GLT631、GAT 111、GMA、COP和STERN中的每一种(用MBP而非STERN刺激165-F10G)一起温育。通过发光ATP试验来测量增殖。细胞系165-H11G响应GLT 631和GAT 631。表43-46中示出了以RLU计的数据。
表43.供体3GMA T细胞系165-H11G对肽GLT 631和GAT 631的反应性
无抗原值：1485+/-208
表44.供体3GMA T细胞系165-C5G对肽GLT 631和GAT 631的反应性
无抗原值：2149+/-361
表45.供体3GMA T细胞系165-E9G对肽GLT 631和GAT 631的反应性
无抗原值：1742+/-146
表46.供体3GMA T细胞系165-F10G对肽GLT 631和GAT 631的反应性
无抗原值：3752+/-233
以下表47示出了如通过发光ATP增殖试验显示的，在用0、1.25、2.5、5和10μg/mL的肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、GT 11、GL 14、GT 41S和GMA中的每一种刺激后165-F6C的反应性。在8次再刺激后，在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，在1x 105个细胞/mL的T细胞浓度下，在培养的第76天进行该测定。细胞系165-F6C与GL 14反应，而不与测试的其他非规范GA肽反应。在2.5μg/mL抗原剂量下对GL 14的响应相对于无抗原对照达到4.4倍。
表47. 165-F6C对GA和非规范GA肽的反应性(第76天)
无抗原值：517+/-51。
供体3细胞系165-E3C在单独的实验中不与GAT 631、GLT 631、GAT 111或STERN肽反应。
供体4GA特异性T细胞系205-1H7：GLT 631、GAT 631和GAT 611
供体4COP T细胞系205-1H7也显示出对肽GLT 631具有反应性，但对GAT 631和GAT611不具有反应性。在7次刺激后测定了细胞系的增殖。通过在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，将0、1、10或30μg/mL的肽GLT 631添加至1x 105个细胞/mL的T细胞系来进行该测定。通过发光ATP试验来测量增殖。表48中示出了以RLU计的数据。
表48.供体4COP T细胞系205-1H7对肽GLT 631的反应性
GA特异性人类T细胞系对GL 14和LT11的反应性
测试了来自供体1和3的GA特异性T细胞系响应于肽GL14——聚(Glu-Lys 1:4)刺激的增殖。至少一种供体1T细胞系和八种供体3T细胞系显示出对低浓度GL的反应性。两种供体3T细胞系显示出的反应性与用低浓度GA刺激后观察到的反应性相当。单独的实验表明，浓度接近和超过10μg/mL时GL-14导致细胞死亡(数据未示出)。
供体1GA特异性T细胞系：GL 14
在(实施例I中所述的)培养的第56天，在总共6轮刺激后，测定了供体1COP T细胞系222-2F12的增殖。对于该测定，在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，将0、3、10或30μg/mL的肽GL14、GLT 631、GAT 111和GAT 631、COP以及GMA中的每一种添加至1x 105个细胞/mL的T细胞系。通过发光ATP试验来测量增殖。细胞系222-2F12响应3μg/mL的GL 14，但不响应所测试的其他非规范GA肽。数据示于表49中。
表49.供体1COP T细胞系222-2F12对非规范肽的反应性
供体3GA特异性T细胞系
在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，在1x 105个细胞/mL的T细胞浓度下，用0、1、3和10μg/mL的肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、GT 11、GL 14、GT 41S、GA 64、COP和GMA中的每一种刺激后，测定了供体3COP T细胞系165-F3C和165-C4C的增殖。在9次刺激后，在培养的第77天测定细胞系165-F3C。在7次刺激后，在培养的第66天测定细胞系165-C4C。通过发光ATP试验来测量增殖。这些细胞系对GL 14和LT 11响应良好，但对测试的其他非规范GA肽不响应。数据示于表50中。
表50.供体3COP T细胞系165-F3C和164-C4C对非规范肽的反应性
在5轮再刺激(不包括初始刺激)之后，在培养的第55天测定了供体3GMA T细胞系165-B5G和165-E7G的增殖。在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，将0、1、3或10μg/mL的肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、GT 11、GL 14、MBP、COP和GMA添加至浓度为2x 106个细胞/mL的T细胞。通过发光ATP试验来测量增殖。这些细胞系对GL 14响应良好，但对测试的其他非规范GA肽不响应。表51和52中示出了以RLU计的数据。
表51.供体3GMA T细胞系165-B5G对非规范肽的反应性
无抗原值：846+/-71
表52.供体3GMA T细胞系165-E7G对非规范肽的反应性
无抗原值：2777+/-398
在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，在1-2x 105个细胞/mL的T细胞浓度下，在用0、1、3和10μg/mL的肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、GT 11、GL 14、MBP、COP和GMA中的每一种刺激后，测定了供体3GMA和COP T细胞系165-F10G、165-C5G、165-H11G、165-C7C、165-E9G和165-F5G的增殖。在至少6次刺激、最少培养55天后，测定每种细胞系的增殖。使用了发光ATP试验。这些细胞系对GL 14响应良好，但对测试的其他非规范GA肽不响应，除了对LT11响应的165-C5G外。表53-58中示出了以RLU计的数据。
表53.供体3GMA T细胞系165-F10G对非规范肽的反应性
无抗原值：1004+/-207
表54.供体3GMA T细胞系165-C5G对非规范肽的反应性
无抗原值：450+/-92
表55.供体3GMA T细胞系165-H11G对非规范肽的反应性
无抗原值：245+/-32
表56.供体3COP T细胞系165-C7C对非规范肽的反应性
无抗原值：188+/-21
表57.供体3GMA T细胞系165-E9G对非规范肽的反应性
无抗原值：125+/-30
表58.供体3GMA T细胞系165-F5G对非规范肽的反应性
无抗原值：136+/-29
供体4GA特异性T细胞系205-1F4
表59示出了如通过发光ATP增殖试验显示的，在用1、2、5和10μg/mL的肽LT 11和GMA刺激后205-1F4的反应性。在7次再刺激后，在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，在1x 105个细胞/mL的T细胞浓度下，在培养的第80天进行该测定。细胞系165-1F4显示出对LT11的反应性。在10μg/mL抗原剂量下，对LT 11的响应相对于无抗原对照达到17.3倍。
表59.供体4COP T细胞系205-1F4对非规范GA肽LT11的反应性(第80天)
GMA无抗原＝812(SD 71)；LT 11无抗原＝850(SD85)
表60示出了如通过发光ATP增殖试验显示的，在用0、1、3和10μg/mL的肽GLT 631、GAT 631、GAT 111、LT 11、GL 14、GT41S、GA 64、COP和GMA中的每一种刺激后205-1F4的反应性。在该试验中，在10μg/mL剂量下对GMA的响应相比于对COP的响应为101.3％。在6次再刺激之后，在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，在1x 105个细胞/mL的T细胞浓度下，在培养的第71天进行该测定。细胞系165-1F4显示出对LT 11的反应性，但与测试的其他非规范GA肽不反应。在10μg/mL抗原剂量下对LT 11的响应相对于无抗原对照达到13.8倍。
表60.供体4COP T细胞系205-1F4对非规范GA肽的反应性(第71天)
供体1GA特异性T细胞系222-AG12：缺少对非规范肽的反应性
在丝裂霉素C处理的自体B-LCL的存在下，在2x 105个细胞/mL的T细胞浓度下，用0、1、10和30μg/mL的肽GLT 631、GAT631、GAT 111、LT 11、GT 11、GL 14、COP和GMA中的每一种刺激后，测定了供体1GMA T细胞系222-AG12的增殖。在3轮再刺激(总共4轮刺激)之后测定细胞系222-AG12。通过发光ATP试验来测量增殖。该细胞系对测试的任何非规范GA肽都不响应。数据示于表61中。
表61.供体1GMA T细胞系222-AG12对非规范肽的反应性
数据以RLU计。
实施例III.基于MHC限制对GA特异性人类T细胞系的表征
如在“方法”中所述，通过在与APC一起温育后测量增殖，来测试T细胞系的MHC限制。采用了丝裂霉素处理的自体APC以及测试APC，例如来自具有至少一种与原始PBMC供体匹配的HLA-DR的供体。结果总结在表62中。以下数据表格中的数值以RLU计。
表62.T细胞系的MHC限制
供体3T细胞系165-B5G
采用来自供体3、5和6的、已经在存在或不存在20μg/mL GMA的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-B5G的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-B5G已经用抗原再刺激了六次(不包括初始刺激)。表63和图9A中显示的数据表明，165-B5G受到HLA-DRβ1*11的限制。
表63. 165-B5G的MHC限制
供体3T细胞系165-C4G
采用来自供体3、5和7的、已经在存在或不存在20μg/mL GMA的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-C4G的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-C4G已经用抗原再刺激了五次(不包括初始刺激)。表64和图9B中显示的数据表明，165-C4G受到HLA-DRβ1*11的限制。
表64. 165-C4G的MHC限制
供体3T细胞系165-C5G
采用来自供体3、5和6的、已经在存在或不存在20μg/mL GMA的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-C5G的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-C5G已经用抗原再刺激了四次(不包括初始刺激)。表65和图10A中显示的数据表明，165-C5G受到HLA-DRβ1*1501的限制。
表65. 165-C5G的MHC限制
供体3T细胞系165-E9G
采用来自供体3、5和6的、已经在存在或不存在20μg/mL GMA的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-E9G的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-E9G已经用抗原再刺激了四次(不包括初始刺激)。表66和图10B中显示的数据表明，165-E9G受到HLA-DRβ1*11的限制。
表66. 165-E9G的MHC限制
供体3T细胞系165-F5G
采用来自供体3、5和6的、已经在存在或不存在20μg/mL GMA的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-F5G的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-F5G已经用抗原再刺激了七次(不包括初始刺激)。表67和图11A中显示的数据表明，165-F5G受到HLA-DRβ1*11的限制。
表67. 165-F5G的MHC限制
供体3T细胞系165-F10G
采用来自供体3、5和7的、已经在存在或不存在20μg/mL GMA的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-F10G的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-F10G已经用抗原再刺激了五次(不包括初始刺激)。表68和图11B中显示的数据表明，165-F10G受到HLA-DRβ1*1501的限制。
表68. 165-F10G的MHC限制
供体3T细胞系165-B6C
采用来自供体3、5和6的、已经在存在或不存在20μg/mL COP的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-B6C的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-B6C已经用抗原再刺激了六次(不包括初始刺激)。表69和图12A中显示的数据表明，165-B6C受到HLA-DRβ1*11的限制。
表69. 165-B6C的MHC限制
供体3T细胞系165-C7C
采用来自供体3、5和6的、已经在存在或不存在20μg/mL COP的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-C7C的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-C7C已经用抗原再刺激了五次(不包括初始刺激)。表70和图12B中显示的数据表明，165-C7C受到HLA-DRβ1*11的限制。
表70. 165-C7C的MHC限制
供体3T细胞系165-D3C
采用来自供体3、5和7的、已经在存在或不存在20μg/mL COP的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-D3C的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-D3C已经用抗原再刺激了六次(不包括初始刺激)。表71和图13A中显示的数据表明，165-D3C受到HLA-DRβ1*1501的限制。
表71. 165-D3C的MHC限制
供体3T细胞系165-F3C
采用来自供体3、5和7的、已经在存在或不存在20μg/mL COP的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-F3C的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-F3C已经用抗原再刺激了八次(不包括初始刺激)。表72和图13B中显示的数据表明，165-F3C受到HLA-DRβ1*11的限制。
表72. 165-F3C的MHC限制
供体3T细胞系165-F6C
采用来自供体3、5和6的、已经在存在或不存在20μg/mL COP的情况下温育的丝裂霉素处理的APC，测定了供体3T细胞系165-F6C的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系165-F6C已经用抗原再刺激了八次(不包括初始刺激)。表73和图14A中显示的数据表明，165-F6C受到HLA-DRβ1*1501的限制。
表73. 165-F6C的MHC限制
供体4T细胞系205-1D1
采用已经在存在或不存在60μg/mL COP的情况下温育的自体B-LCL和来自供体1、2和6的B-LCL，测定了供体4T细胞系205-1D1的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系205-1D1用抗原再刺激了5次(不包括初始刺激)。表74中显示的结果表明，205-1D1受到HLA-DRβ1*13的限制。
表74. 205-1D1的MHC限制
供体4T细胞系205-1H7
采用已经在存在或不存在40μg/mL COP的情况下温育的自体B-LCL和来自供体1、2和6的B-LCL，测定了供体4T细胞系205-1H7的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系205-1H7用抗原再刺激了5次(不包括初始刺激)。表75和图14B中显示的结果表明，205-1H7受到HLA-DRβ1*13的限制。
表75. 205-1H7的MHC限制
| B-LCL供体 | 等位基因1 | 等位基因2 | 无Ag | SD | COP | SD | |
| 4(自体的) | DRβ1*07 | DRβ1*13 | 1956 | 464 | 32418 | 2996 | |
| 1 | DRβ1*04:01 | DRβ1*07:01 | 2748 | 784 | 8430 | 2540 | |
| 6 | DRβ1*15:01 | DRβ1*13 | 2729 | 300 | 30583 | 174 | |
| 2 | DRβ1*04:01 | DRβ1*04:04 | 2471 | 217 | 2065 | 250 |
供体4T细胞系205-1F4
采用已经在存在或不存在40μg/mL COP的情况下温育的自体B-LCL和来自供体1、2和6的B-LCL，测定了供体4T细胞系205-1F4和205-1C4的增殖。在进行MHC限制分析之前，T细胞系205-1F4用抗原再刺激了7次(不包括初始刺激)。在进行MHC限制分析之前，T细胞系205-1F4用抗原再刺激了7次(不包括初始刺激)。表76中显示的结果表明，205-1F4受到HLA-DRβ1*13的限制。
表76.205-1F4的MHC限制
实施例IV.基于表面标志物表达分析对GA特异性人类T细胞系的表征
分析了GA特异性T细胞系的CD4和CD8的表面表达。使用PE标记的CD8单克隆抗体和FITC标记的CD4单克隆抗体进行检测。将细胞用PE标记的小鼠同种型匹配的对照IgG1单克隆抗体和FITC标记的小鼠IgG1单克隆抗体标记，作为非特异性对照。
对于免疫荧光染色，将T细胞以1至5x 106/mL的细胞浓度悬浮于含有2％胎牛血清的PBS中。将细胞以每管100uL分配于12x 75mm聚苯乙烯管中。同种型匹配的对照单克隆抗体是用荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)标记的非特异性小鼠IgG1。FITC标记的抗CD4和PE标记的抗CD8作为混合物购自eBioscience,Inc.(San Diego，CA)。依照制造商推荐的每管5uL体积来添加荧光染料标记的单克隆抗体。将细胞与单克隆抗体在2-8℃下温育15-30分钟。通过每管添加2mL PBS并以200x g离心5分钟来洗涤细胞一次。倾出缓冲液，并向每管中添加0.5mL的PBS。使用FACScan流式细胞仪和CellQuest软件来评估染色。根据前向和侧向散射特征，从分析中排除死细胞。
对于GA特异性T细胞系165-E9G，观察到99.76％的检测到的细胞为CD4+，并且均不是CD8+。对于GA特异性T细胞系165-F5G，观察到97.46％的检测到的细胞为CD4+，并且1.50％为CD8+。图15A和图16A中分别示出了165-E9G和165-F5G的对照流图(control flow plot)，而图15B和图16B中分别示出了165-E9G和165-F5G的CD4/CD8分析。表77中总结了所产生的GA反应性T细胞系的表面标志物表达结果。
表77.GMA和克帕松引发的T细胞系-CD4+和CD8+表达
实施例V.GA特异性人类T细胞系组测定-九个GA测试批与克帕松的比较
使用表78中列出的一组六种GA特异性长期人类T细胞系进行了增殖试验，以将采用标准方法制备的九个GA测试批——GMA/009/14(009)、GMA/010/14(010)、GMA/011/14(011)、
GMA/012/14(012)、GMA/013/14(013)、GMA/014/14(014)、
GMA/017/14(017)、GMA/018/14(018)和GMA/070/14(070)与克帕松参考批进行比较。
表78.测定组GA特异性人类T细胞系
采用上述方法，在5x 104个丝裂霉素处理的自体B-LCL的存在下，使用五种浓度的参考抗原(0.5、1、2、2.5和5μg/ml的克帕松)、相同的五种浓度的测试抗原(九个GA测试批)以及无抗原对照来再刺激每种T细胞系。采用先前描述的方法，在与抗原一起温育4天之后通过ATP试验测量增殖。结果在表79-88中示出。
每个表格的最后一列的百分比如下计算：对测试抗原的增殖响应减去对对照(无抗原)的增殖响应÷对参考抗原的增殖响应减去对对照(无抗原)的增殖响应
表79.用GA批009刺激测定组T细胞系-ATP增殖试验
GA批009的剂量响应曲线在图17A、图17B、图18A、图18B、图19A和图19B中示出。因此，使用多种具有不同特性的T细胞系，COP和GMA009均引起了相当的响应，因此被认为在免疫学上相同。表80.用GA批010刺激测定组T细胞系-ATP增殖试验
表81.用GA批011刺激测定组T细胞系-ATP增殖试验
表82.用GA批012刺激测定组T细胞系-ATP增殖试验
表83.用GA批013刺激测定组T细胞系-ATP增殖试验
表84.用GA批014刺激测定组T细胞系-ATP增殖试验
表85.用GA批016刺激测定组T细胞系-ATP增殖试验
表86.用GA批017刺激测定组T细胞系-ATP增殖试验
表87.用GA批018刺激测定组T细胞系-ATP增殖试验
表88.用GA批070刺激测定组T细胞系-ATP增殖试验
实施例VI.GA特异性人类T细胞系组测定-改变的GA批与克帕松的比较
使用以上表78中列出的一组六种GA特异性人类T细胞系测试改变的GA批与克帕松的免疫学同一性。
改变的GA批的制备
通过改变用来供给(charge)聚合的一种或多种N-羧酸酐(NCA)的摩尔分数，并改变用来引发聚合反应的DEA浓度(范围从0.01％至0.1％)，制备了九种改变的GA批中的每一种。在其他方面，所有批均使用标准过程制备。表89中提供了用于制备这些批的条件的总结。
表89.引发剂浓度/N-羧酸酐(NCA)摩尔分数改变的阴性对照批；制备过程条件的总结
(+)表示NCA摩尔数相对于对照增加20％；(-)表示NCA摩尔数相对于对照减少20％。
阴性对照批的分子量和氨基酸比率以及各参数的规格范围在表90中示出。含有加粗文字的阴影单元格表示在GA规格范围之外的数值，GA规格范围示于每列的顶部。
表90.引发剂浓度/NCA摩尔分数改变的阴性对照批；分子量和氨基酸组成数据
引发剂浓度和NCA摩尔分数条件可以影响聚合的引发以及链增长。通过总DEA分析、DEA/COOH分析、加合物分析、肽图谱分析、NTS(Edman)以及完整HPLC(数据未示出)显示了阴性批与对照之间的显著差异。
使用一组GA特异性T细胞系对克帕松与阴性GA批的比较
使用一组六种GA特异性T细胞系(表78)进行了增殖试验，以将阴性GA批051F、054F、055F、057F、058F、059F和060F(测试批)与克帕松(参考批)进行比较。用5种浓度的参考抗原(克帕松)和测试抗原(阴性GA批)，包括无抗原对照，(在5x 104个丝裂霉素处理的自体B-LCL的存在下)再刺激每种细胞系。使用先前描述的方法，在与抗原一起温育4天之后通过ATP试验测量增殖。结果在表91至107中示出。
每个表格的最后一列的百分比如下计算：对测试抗原的增殖响应减去对对照(无抗原)的增殖响应÷对参考抗原的增殖响应减去对对照(无抗原)的增殖响应
表91.用改变的GA批NC-2(051F)刺激的测定组T细胞系的增殖
表92.用改变的GA批NC-4(054F)刺激的测定组T细胞系的增殖
表93.用改变的GA批NC-5(055F)刺激的测定组T细胞系的增殖
表94.用改变的GA批NC-6(057F)刺激的测定组T细胞系的增殖
表95.用改变的GA批NC-7(058F)刺激的测定组T细胞系的增殖
表96.用改变的GA批NC-8(059F)刺激的测定组T细胞系的增殖
表97.用改变的GA批NC-9(060F)刺激的测定组T细胞系的增殖
实施例VII.采用一组GA特异性人类T细胞系的免疫学同一性确定
选择了代表一系列MHC限制和非规范肽反应性的克隆GA特异性人类T细胞系的测定组，并用其确定GA制品的免疫学同一性。通过ATP增殖试验，以一式三份样品测试了所有细胞系对1、3和10μg/mL的每种GA测试制品以及克帕松(作为参考标准物)(包括无抗原对照和MBP对照)的反应性(全部在2x 105个丝裂霉素处理的自体B-LCL/mL的存在下)。对于每种细胞系，均采用下式计算在各个浓度的GA测试制品下的平均RLU并与各个浓度的GA参考标准物下的相应平均RLU进行比较：
(对测试抗原的GA引起的响应减去对对照的相同响应)÷(对参考抗原的GA引起的响应减去对对照的响应)
当此式在给定GA浓度下得到0.80至1.20(80％至120％)的相对值时，确定GA测试制品与GA参考标准物的免疫学同一性。因此，根据单一参考、单剂量分析确定该测试与参考标准物GA制品在免疫学上相同。
进一步将平均RLU对GA浓度作图，以获得剂量-响应曲线，并比较了GA测试与参考标准物曲线的斜率。根据单一参考批剂量响应曲线分析，确认GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同。
实施例VIII.采用一组GA特异性人类T细胞系的免疫学同一性确定：多重参考剂量-响应曲线分析
选择了代表一系列MHC限制和非规范肽反应性的克隆GA特异性人类T细胞系的测定组，并用其确定GA制品的免疫学同一性。通过ATP增殖试验，以一式三份样品测试了所有细胞系对1、3和10μg/mL的每种GA测试制品以及多个克帕松批(作为参考标准物)(包括无抗原对照和MBP对照)的反应性(全部在2x 105个丝裂霉素处理的自体B-LCL/mL的存在下)。该试验中包括多个克帕松参考批，以提供多个数据集，例如以解释批间变异。对于每种细胞系，计算在各个浓度的GA测试制品下的平均RLU并与各个浓度的GA参考标准物下的相应平均RLU进行比较。
将平均RLU对GA浓度作图，以获得剂量-响应曲线，并比较曲线的斜率。使用来自多个参考批的数据确定相对于参考斜率的可接受的变异。
根据多重参考剂量-响应曲线分析，确认GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同。
实施例IX.采用一组GA特异性人类T细胞系的免疫学同一性确定：参考重复剂量-响应曲线分析
选择了代表一系列MHC限制和非规范肽反应性的克隆GA特异性人类T细胞系的测定组，并用其确定GA制品的免疫学同一性。通过ATP增殖试验，以一式三份样品测试了所有细胞系对1、3和10μg/mL的每种GA测试制品以及克帕松批(作为参考标准物)(包括无抗原对照和MBP对照)的反应性(全部在2x 105个丝裂霉素处理的自体B-LCL/mL的存在下)。该试验中包括同一克帕松参考批的多个样品，以提供重复数据，从而例如解释测定变异。对于每种细胞系，计算在各个浓度的GA测试制品下的平均RLU并与各个浓度的GA参考标准物下的相应平均RLU进行比较。
将平均RLU对GA浓度作图，以获得剂量-响应曲线，并比较曲线的斜率。使用参考批重复数据确定相对于参考斜率的可接受的变异。
根据重复参考剂量-响应曲线分析，确认GA测试制品与GA参考标准物在免疫学上相同。
Claims (27)
1.至少四种GA特异性人类T细胞系的测定组，其用于确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同，其中所述测定组包含以下GA特异性人类T细胞系：
a)第一GA特异性人类T细胞系，其中所述第一GA特异性人类T细胞系对第一种非规范GA肽没有反应性；
b)第二GA特异性人类T细胞系，其中所述第二GA特异性人类T细胞系对所述第一种非规范GA肽具有反应性；
c)第三GA特异性人类T细胞系，其中所述第三GA特异性人类T细胞系对第二种非规范GA肽没有反应性；以及
d)第四GA特异性人类T细胞系，其中所述第四GA特异性人类T细胞系对所述第二种非规范GA肽具有反应性。
2.根据权利要求1所述的测定组，其中(c)的非规范GA肽由摩尔比与
中的氨基酸酪氨酸(Y)、谷氨酸(E)、丙氨酸(A)和赖氨酸(K)的摩尔比不同的氨基酸酪氨酸(Y)、谷氨酸(E)、丙氨酸(A)和赖氨酸(K)组成。
3.根据权利要求2所述的测定组，其中(c)的非规范GA肽由氨基酸酪氨酸(Y)、谷氨酸(E)、丙氨酸(A)和赖氨酸(K)中的任意一种、两种或三种组成。
4.根据权利要求1-3之一所述的测定组，其包含或进一步包含至少一种具有第一已知GA响应生物标志物谱的GA特异性人类T细胞系，并且包含或进一步包含至少一种具有不同于第一已知GA响应生物标志物谱的第二已知GA响应生物标志物谱的GA特异性人类T细胞系。
5.根据权利要求1-3之一所述的测定组，其包含或进一步包含至少一种具有第一已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系，并且包含或进一步包含至少一种具有不同于第一已知MHC限制的第二已知MHC限制的GA特异性人类T细胞系。
6.根据权利要求1所述的测试组，其中所述至少一种GA特异性人类T细胞系为长期T细胞系。
7.根据权利要求6所述的测定组，其中所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系为克隆长期GA特异性T细胞系。
8.根据权利要求6所述的测定组，其中所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系在其用于确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同之前已被保持在培养物中至少约四周。
9.根据权利要求8所述的测定组，其中将所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系保持在培养物中包括在不存在促分裂原的情况下用GA和自体APC反复再刺激。
10.根据权利要求1-3之一所述的测定组，其中(a)和(b)的每种GA特异性人类T细胞系均包含超过98％的CD4+细胞。
11.根据权利要求1-3之一所述的测定组，其中(a)和(b)的每种GA特异性人类T细胞系均包含少于2％的CD8+细胞。
12.根据权利要求1所述的测定组，其中所述第一种非规范GA肽、所述第二种非规范GA肽、或两者由L-酪氨酸(Y)、L-谷氨酸(E)、L-丙氨酸(A)、以及L-赖氨酸(K)构成，并且其中所述非规范GA肽是由四种GA氨基酸的任何子集或全部四种GA氨基酸以不同于针对COP的平均摩尔分数的平均摩尔分数组成的肽。
13.根据权利要求1所述的测定组，其中所述第一种非规范GA肽、所述第二种非规范GA肽、或两者由L-酪氨酸(Y)、L-谷氨酸(E)、L-丙氨酸(A)、以及L-赖氨酸(K)中的一种、两种或者三种构成。
14.一种采用权利要求1-13之一所述的测定组来确定醋酸格拉替雷(GA)测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同的方法，该方法包括：
1)将所述测定组中的每种GA特异性人类T细胞系的细胞与合适的APC一起温育；
2)用一定量的GA测试制品刺激在步骤(1)中温育的每种GA特异性人类T细胞系的预定数目的细胞；
3)用相同量的GA参考标准物单独地刺激在步骤(1)中温育的每种GA特异性人类T细胞系的相同预定数目的细胞；
4)测量在步骤(2)和(3)中刺激的每种GA特异性人类T细胞系的至少一种GA引起的响应；以及
5)将针对用GA测试制品刺激的每种GA特异性人类T细胞系获得的至少一种GA引起的响应的测量结果，与针对用GA参考标准物刺激的相同GA特异性人类T细胞系获得的至少一种GA引起的响应的测量结果进行比较；
其中，当步骤(5)中的测量结果的比较在可接受的限度内时，确定所述GA测试制品与所述GA参考标准物在免疫学上相同。
15.一种方法，其包括针对药学用途选择与GA参考标准物在免疫学上相同的GA测试制品，其中免疫学同一性根据权利要求14的方法确定。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种测量的GA引起的响应选自增殖、响应生物标志物的产生、编码响应生物标志物的核酸的表达，及其组合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种测量的GA引起的响应为响应生物标志物的产生，并且其中所述响应生物标志物为细胞因子、活化标志物或趋化因子。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种测量的GA引起的响应为编码响应生物标志物的核酸的表达，并且其中由所述核酸编码的响应生物标志物为细胞因子、活化标志物或趋化因子。
19.根据权利要求14-18之一所述的方法，其中所述GA参考标准物为克帕松或GMA制品。
20.根据权利要求14-18之一所述的方法，其中所述至少一种GA特异性人类T细胞系为长期T细胞系。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系为克隆长期T细胞系。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述至少一种长期GA特异性人类T细胞系在其用于确定GA测试制品与GA参考标准物是否在免疫学上相同之前已被保持在培养物中至少约四周。
23.根据权利要求20所述的方法，其中将在步骤(1)中温育的至少一种长期GA特异性人类T细胞系保持在培养物中包括在不存在促分裂原的情况下用GA和自体APC反复再刺激。
24.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(1)中温育的至少一种长期GA特异性人类T细胞系在其用于步骤(1)之前已经经历了至少4次再刺激。
25.根据权利要求24所述的方法，其中在步骤(1)中温育的至少一种长期GA特异性人类T细胞系在其用于步骤(1)之前已经经历了至少8次再刺激。
26.根据权利要求14-18任一项所述的方法，其中步骤(2)包括用上升系列量中的一个量的GA测试制品刺激包含至少一种GA特异性人类T细胞系的预定数目的细胞的至少三个样品中的每一个，并用相同上升系列量中的一个量的GA参考标准物刺激包含至少一种GA特异性人类T细胞系的预定数目的细胞的至少三个样品中的每一个。
27.根据权利要求26所述的方法，其中步骤5)进一步包括生成GA测试制品和GA参考制品的剂量响应曲线，并且其中，当所述剂量响应曲线的比较在可接受的限度内时，确定所述GA测试制品与所述GA参考标准物在免疫学上相同。
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