KR20070115926A

KR20070115926A - ｍＲＮＡ와 단백질 사이의 상호작용을 조정하는 화합물의스크리닝 방법 및 이에 의해 수득가능한 화합물

Info

Publication number: KR20070115926A
Application number: KR1020077020006A
Authority: KR
Inventors: 만프레트 아우어; 니콜-클라우디아 마이스너; 마틴 힌터스타이너; 토르스텐 쉰들러; 후베르트 게스타흐
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-03-01
Publication date: 2007-12-06
Also published as: AU2006222249A1; BRPI0608255A2; JP2008535479A; CA2599506A1; EP1859278A1; WO2006094688A1; MX2007010670A; US20090005419A1

Abstract

본 발명은 mRNA와 표적 단백질, 예를 들어 HuR의 상호작용을 조정하는 약제를 확인하기 위한 분석법, 및 화학식 I의 유기 화합물 (식에서, R₁, R₂ 및 R₃는 상기 정의된 것과 같음), 및 예를 들어 ARE-함유 mRNA와 표적 단백질의 복합체-형성에 대한 억제제로서 이들의 용도에 관한 것이다.

표적 화합물, 상호작용, 복합체, 분석법

Description

ｍＲＮＡ와 단백질 사이의 상호작용을 조정하는 화합물의 스크리닝 방법 및 이에 의해 수득가능한 화합물 {Method for the Screening of Compounds that Modulate the Interaction between mRNA and Proteins and Compounds Obtainable Thereby}

본 발명은 유기 화합물, 및 표적 단백질, 예를 들어 ELAVL1 단백질과 mRNA의 상호작용을 조정하는 약제를 확인하기 위한 분석법에 관한 것이다.

많은 수의 유전자의 발현은 메신저 RNA의 수준에서 제어된다. 특히, 조기 반응 유전자, 및 따라서 특정한 자극에 대한 질병 관련성을 가진 다양한 표적의 급속한 반응은 후-전사 제어 메카니즘에 의해 종종 촉진된다. 이러한 과정은 메신저 RNA에 작용하는 조절 단백질 또는 인자에 의해 주로 매개된다. 이러한 조절 표적 mRNA-단백질 상호작용의 억제 또는 조정은 치료적 중재를 위해 매력적인 접근법이다.

mRNA 조절의 저 분자량 억제제를 찾아내기 위하여, 이상적으로 균질한 용액 중에서 표적화 mRNA-단백질 상호작용을 검사하기 위한 분석이 요구된다. 이 분석은 고 처리량 스크리닝(HTS) 환경에서 이행하기에 적절해야 하고, 오늘날 형광 검출을 기초로 하여 가장 빈번하다.

길이가 긴 mRNA 또는 소 단편 (281 내지 1643 뉴클레오티드, 100-500kD)에 비교적 작은 단백질, 예를 들어 mRNA 안정화 단백질 HuR (36kD)의 직접적인 결합을, 형광 표지화된 RNA가 복합체 형성 시에 침전되는 크기의 상대적 증가를 기초로 하여 검출하는 것은 불가능하다. 이러한 이유 때문에, 회전 또는 번역 확산 시간 검출을 기초로 한 분광분석 방법 (예를 들어, 형광 상관 분광분석 (FCS), 2D-FIDA-이방성 또는 기타 형광 편광 측정)이 쉽게 배제될 수 있다.

본 발명의 분석법은 진정한 평형상태 조건 하에서 균질한 용액 중에 mRNA - 단백질 상호작용을 검사하기 위한 신규 방법이다. 이것은, 예를 들어 고 민감성 단일 분자 검출을 적용하고, 따라서 에보텍 마크II/III(Evotec MarkII/III)와 같은 HTS 플랫폼에 즉시 적응할 수 있다. 고 민감성 및 검출, 예를 들어 공촛점 검출의 정확성에 기인하여, 본 발명의 분석법은 통상적인 전기영동 이동성 변경 분석법, 필터 결합 분석법 또는 뉴클레아제 보호 분석법에 대한 매력적인 대안이 된다. 또한, 통상적인 거시 형광 강도 검출 방법 (예, 형광 판 판독기)으로의 적응이 간단하고, 공촛점 장치의 이용을 반드시 필요로 하는 것은 아니다.

하나의 측면에서, 본 발명은

a) 임의로 균질한 용액으로서 100개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 가진 표지화 mRNA를 제공하고 (여기에서, 표지는 mRNA의 환경 변화에 민감한 물질임),

b) 충분한 기간 동안 mRNA와 표적 단백질, 예를 들어 HuR 단백질의 상호작용을 조정할 것으로 기대되는 후보 화합물의 부재 및 존재 하에서 표적 단백질, 예를 들어 HuR 단백질을 mRNA와 접촉시켜, 상기 mRNA와 상기 표적 단백질, 예를 들어 HuR 단백질 간의 복합체가 형성될 수 있도록 하고,

c) 단계 b)에서 형성된 복합체를 검출하고,

d) 후보 화합물이 단계 b)에서 부재하거나 존재하는 경우에 형성되는 복합체의 양의 차이가 존재하는지의 여부를 결정하고,

e) 단계 d)에서 차이가 결정되는 경우에 후보 화합물을 약제로서 선택하는 것

을 포함하는, mRNA와 표적 단백질의 상호작용을 조정하는 약제를 확인하기 위한 분석을 제공한다.

분석 원리는 다음과 같이 설명될 수도 있다 (예를 들어, 도 1에 주어짐): mRNA를 히드라진 알데히드 결합 화학에 의하여 3' 말단에서 예를 들어 Cy3에 의해 표지화한다. 표지화 mRNA에 대한 표적 단백질의 결합 시에, 표지, 예를 들어 Cy3의 양적 수율은 변화, 예를 들어 증가하고, 이러한 변화는 표적 단백질과 mRNA의 상호작용을 위한 정보를 제공한다. 이러한 효과는 단백질과 표지 사이에서 직접적인 접촉과 명백히 관련되지 않고, 심지어 3' 말단 표지로부터 멀리 있는 표적 단백질, 예를 들어 HuR 결합 부위를 가진 mRNA에 대해서도 재현가능하게 관찰된다. 현재, 본 발명자들은 이것이 표적 단백질과의 복합체 형성 시에 3-차원 RNA 형태 변화에 의해 유발되고, 긴 범위 효과를 통해 번역되고, 표지, 예를 들어 Cy3의 환경 민감성에 기인할 수 있다는 결론을 내렸다 (예를 들어, 문헌 [Mujumdar R.B. 등, Bioconj.Chem. 1993, 4(2) 105-11] 참조). 잠재적인 억제제에 기인한 단백질-mRNA 복합체 형성의 감소는, 정보, 예를 들어 전체 형광 강도의 저하 또는 더욱 높은 분자 휘도를 가진 종의 입자 수 감소로서 검출될 것이다.

바람직한 구현양태에서, 표적 단백질은 HuR 단백질이다.

mRNA는 ARE-함유 mRNA일 수도 있고, 예를 들어 TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-8, Cox-2, IL-4 또는 AT-R1으로부터의 ARE를 포함한 염증성 표적 뿐만 아니라 다른 ARE-조절 표적 계통을 포함한다. 예를 들어, c-myc, c-jun 또는 c-fos와 같은 원형-종양유전자가 포함된다.

본 발명의 다른 측면에서, mRNA는 IL-2, IL-1β 및 TNF-α를 코딩하는 서열, 또는 이러한 서열의 ARE-함유 단편으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 다른 측면에서, mRNA는 100 내지 500 뉴클레오티드, 바람직하게는 300 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.

표지는 통상적인 것, 예를 들어 비오틴, 또는 알칼리 포스파타제(AP), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 또는 퍼옥시다제(POD)와 같은 효소, 또는 예를 들어 형광 염료와 같은 형광 분자일 수도 있다. 바람직하게는, 표지는 예를 들어 Cy3 또는 Cy5, 예를 들어 Cy3과 같은 형광 염료이다.

본 발명의 바람직한 측면에서, 표지는 형광 표지, 예를 들어 Cy3 또는 Cy5이다.

표적 단백질은 mRNA에 결합하는 것으로 알려진 단백질일 수도 있고, 여기에서 이러한 결합은 3-차원 RNA 형태에서의 변화를 유발한다. 본 발명의 다른 측면에서, 표적 단백질은 ARE-함유 mRNA에 결합하는 ELAVL1 (=HuR)이다.

형성된 복합체를 검출하기 위하여, 검출 수단이 사용될 수도 있다. 이러한 검출 수단은 예를 들어 형광 검출 측정과 같은 분석 분야에서 통상적인 것을 포함한다. 본 발명에서 사용된 검출 수단은 표지화 mRNA를 인식하는 분자를 포함한다.

예를 들어, 1-차원 강도 의존성 공촛점 형광 검출 방법 FIDA (형광 강도 분포 분석)을 사용하여, 표적 mRNA에 대한 표적 단백질, 예를 들어 HuR의 결합을 크기 비의존성 방식으로 균질한 용액 중에서 직접적으로 수행할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 형광 강도의 측정에 의하여 복합체를 검출한다.

임의로, 형성된 복합체는 비복합체화 분획으로부터 분리될 수 있다. 통상적인 방법에 따라, 예를 들어 통상적인 방법과 유사하게, 예를 들어 크로마토그래피, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리를 수행할 수 있다.

후보 화합물은 mRNA와 표적 단백질의 상호작용에 미치는 조절 효과가 결정될 수 있는 화합물(들) (라이브러리)을 포함한다. 화합물 (라이브러리)는 예를 들어 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 모방체, 소 분자, 예를 들어 저 분자량 화합물(LMW)을 포함한다.

약제는 본 발명에 의해 제공되는 분석에서 예를 들어 단계 d)에서 검출되는 표적 단백질과 mRNA의 상호작용에 영향을 미치는 (억제하는) 화합물이다.

약제는 선택된 후보 화합물의 하나이고 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 모방체, 소 분자, 예를 들어 저 분자량 화합물(LMW)을 포함할 수도 있다. 약제는 하나 이상의 약제, 예를 들어 이들의 조합을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 고 처리량 스크리닝을 위한 본 발명의 분석을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은

- 표지화 mRNA, 예를 들어 형광 표지화 mRNA,

- 표적 단백질,

- 키트를 사용하기 위한 지시, 및

- 임의로, 후보 화합물

을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명에 의해 제공되는 이러한 키트는 시험되어지는 샘플의 적절한 환경, 예를 들어 시험되어지는 샘플 중에서 후보 화합물의 효과를 결정하기 위해 적절한 수단을 포함하는 실질적인 성분을 더욱 포함할 수도 있다.

본 발명은 또한 상기 기재된 스크리닝 분석에 의해 확인되는 유기 화합물에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물을 제공한다.

상기 식에서,

R₁은 비치환되거나 치환된 (C₆ _-18)아릴 또는 5 또는 6원 고리를 갖고 N, O 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 1 내지 4개 헤테로원자를 가진 헤테로시클릴로 치환 된 (C₁ _-4)알킬이고,

R₂는 히드록실, 카르복실, 아미노, 또는 비치환되거나 치환된 (C₆ _-18)아릴로 치환된 (C₁ _-4)알킬, 또는 비치환되거나 치환된 (C₆ _-18)아릴이고,

R₃은 비치환되거나 치환된 (C₆ _-18)아릴, 또는 5 또는 6원 고리를 갖고 N, O 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 1 내지 4개 헤테로원자를 가진 헤테로시클릴이다.

바람직한 측면에서, 화학식 I의 화합물에서, R₁은 비치환되거나 치환된 페닐 또는 5원 고리 및 헤테로원자로서의 N을 가진 헤테로시클릴로 치환된 (C₁ _-3)알킬이고,

R₂는 히드록실, 카르복실, 아미노, 또는 비치환되거나 치환된 페닐로 치환된 (C_1-2)알킬, 또는 비치환되거나 치환된 페닐이고,

R₃은 비치환되거나 치환된 페닐, 또는 5 또는 6원 고리 및 헤테로원자로서의 N을 가진 헤테로시클릴이다.

다른 바람직한 측면에서, 화학식 I의 화합물에서, R₁은 p-메틸-페닐로 치환된 메틸 또는 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂은 카르복실로 치환된 메틸, p-메틸-페닐로 치환된 메틸, 1H-인돌-3-일로 치환된 메틸, 히드록실로 치환된 에틸, 아미노로 치환된 에틸 또는 p-메틸-페닐이고, R₃은 하기 화학식 II의 화합 물 또는 하기 화학식 III의 화합물이다.

상기 식에서,

R₄은 1-피페리딘 또는 1-(p-아미노카르보닐)피페리딘이고,

R₅는 메톡시에틸, 벤질 또는 (p-메톡시-페닐)에틸이다.

상기 식에서,

R₆은 p-페닐 또는 m-피리딘이고,

R₇은 m-메톡시페닐 또는 1-아미노카르보닐-2-히드록시-프로필로 치환된 메틸이다.

여기에서 달리 정의되지 않는다면, 알킬은 (C₁ _-8)알킬, 예를 들어 (C₁ _-4)알킬을 포함한다. 아릴은 (C₆ _-18)아릴, 예를 들어 페닐을 포함한다. 헤테로시클릴은 S, O 및 N으로부터 선택된 1 내지 4개 헤테로원자를 가진 5 또는 6원 고리; 예컨대 예 를 들어 임의로 추가의 고리(계)와 융합 고리화(annelated)되고, 예를 들어 페닐 고리와 융합 고리화되거나; 예를 들어 헤테로시클릴 고리와 융합 고리화된 피페리딘, 피리딘 및 피롤리딘을 포함한다. 알킬, 아릴 및 헤테로시클릴은 비치환되거나, 또는 예를 들어 유기 화학에서 통상적인 기로 치환되는 치환된 알킬, 아릴 또는 헤테로시클릴을 포함한다. 아미노는 비치환 및 치환 아민, 예를 들어 알킬- 및 디알킬아민을 포함한다.

화학식 I의 화합물에서, 각각의 단일 정의된 치환기가 바람직한 치환기, 예를 들어 서로 독립적으로 상기 정의된 치환기일 수도 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서,

a) R₁은 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂는 아미노로 치환된 에틸이고, R₃은 하기 화학식 IV의 화합물이다.

b) R₁은 p-메틸-페닐로 치환된 메틸이고, R₂은 아미노로 치환된 에틸이고, R₃은 하기 화학식 V의 화합물이다.

c) R₁은 p-메틸-페닐로 치환된 메틸이고, R₂는 p-아미노메틸-페닐로 치환된 메틸이고, R₃은 b)에서 정의된 화합물이다.

d) R₁는 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂는 히드록실로 치환된 에틸이고, R₃는 하기 화학식 VI의 화합물이다.

e) R₁은 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂은 카르복실로 치환된 메틸이고, R₃은 하기 화학식 VII의 화합물이다.

f) R₁은 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂은 1H-인돌-3-일로 치환된 메틸이고, R₃은 하기 화학식 VIII의 화합물이다.

g) R₁은 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂은 p-메틸-페닐로 치환된 메틸이고, R₃은 f)에서 정의된 화합물이다.

본 발명에 의해 제공된 화합물은 이하에서 "본 발명의 (본 발명에 따른) 화합물(들)"로서 명명된다. 본 발명의 화합물은 임의의 형태로, 예를 들어 유리 형태로, 염의 형태로, 용매화물의 형태로, 그리고 염 및 용매화물의 형태로 화합물을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 염의 형태로 본 발명의 화합물을 제공한다.

예를 들어 제조/단리/정제 목적을 위하여, 제약학적으로 허용불가능한 염이 포함되긴 하지만, 이러한 염은 바람직하게는 제약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물의 염은 금속 염 또는 산 부가염을 포함한다. 금속 염은 예를 들어 알칼리 또는 알칼리토류 금속을 포함하고; 산 부가염은 산, 예를 들어 수소 푸마르산, 푸마르산, 나프탈린-1,5-술폰산, 염산, 듀테로염소 산; 바람직하게는 염산과 화학식 I의 화합물의 염을 포함한다.

유리 형태에서 본 발명의 화합물은 염 형태의 상응하는 화합물로 전환될 수 있고; 그 역도 성립한다. 유리 형태 또는 염의 형태 및 용매화물의 형태에서 본 발명의 화합물은 유리 형태로 또는 비-용매화 형태의 염 형태로 상응하는 화합물로 전환될 수 있고; 그 역도 성립한다.

본 발명의 화합물은 순수한 이성질체의 형태로 또는 이들의 혼합물로 존재할 수도 있고; 예를 들어 광학 이성질체, 부분입체이성질체, 시스/트랜스 이성질체로 존재할 수도 있다. 본 발명의 화합물은 예를 들어 비대칭 탄소원자를 함유할 수도 있고, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체의 형태 및 이들의 혼합물, 예를 들어 라세미체의 형태로 존재할 수도 있다. 임의의 비대칭 탄소 원자가 (R)-, (S)- 또는 (R, S)-배치로, 바람직하게는 (R)- 또는 (S)-배치로 존재할 수도 있다.

순수한 이성질체를 얻기 위하여 이성질체 혼합물을 적절하게, 예를 들어 통상적인 방법에 따라, 예를 들어 유사하게 분리할 수도 있다. 본 발명은 본 발명의 화합물을 이성질체 형태로, 그리고 이성질체 혼합물로 포함한다.

본 발명은 또한, 토오토머가 존재할 수 있는 경우에 화학식 I의 화합물의 토오토머를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물의 제조 방법을 제공하며, 여기에서

- R₃은 하기 단계를 포함하는 화학식 III의 화합물이고,

(상기 식에서, R₁, R₂, R₆ 및 R₇은 화학식 I의 화합물을 수득하기 위해 상기 정의된 바와 같음), 반응 혼합물 OR로부터 수득된 화학식 I의 화합물을 단리한다.

- R₃은 하기 단계를 포함하는 화학식 II의 화합물이고,

(상기 식에서, R₁, R₂, R₄ 및 R₅은 화학식 I의 화합물을 수득하기 위해 상기 정의된 바와 같음), 반응 혼합물로부터 수득된 화학식 I의 화합물을 단리한다.

화학식 IIIa, IIIb, IIa, IIb 또는 IIc (출발 물질)의 중간체에서, 관능기가 존재한다면 이것은 임의로 보호된 형태이거나, 또는 염-형성 기가 존재한다면 이것은 염의 형태일 수 있다. 보호기는 임의로 존재한다면 적절한 단계에서 예를 들어 통상적인 방법에 따라, 예를 들어 유사하게 제거될 수도 있다.

이렇게 수득된 화학식 I의 화합물은 화학식 I의 다른 화합물로 전환될 수 있거나, 또는 유리 형태로 수득된 화학식 I의 화합물은 화학식 I의 화합물의 염으로 전환될 수 있고, 그 역도 성립한다.

화학식 IIIa, IIIb, IIa, IIb 또는 IIc의 중간체(출발 물질)가 공지되어 있거나, 예를 들어 통상적이거나 여기에 기재된 것과 같은 방법에 따라, 예를 들어 유사하게 제조될 수 있다.

여기에서 기재된 화합물, 예를 들어 본 발명의 화합물, 및 화학식 IIIa, IIIb, IIa, IIb 또는 IIc의 중간체가 예를 들어 여기에 기재된 바와 같이 통상적인 방법에 따라, 예를 들어 유사하게 적절히 제조될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 ARE-함유 mRNA 및 표적 단백질, 예를 들어 HuR 단백질의 복합체-형성 억제제로서 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.

바람직한 측면에서, ARE-함유 mRNA가 IL-2, IL-1β 및 TNF-α로 이루어진 군에서 선택된다.

예를 들어 화학식 I의 화합물을 포함하는 본 발명의 화합물은 약리학적 활성을 나타내고 따라서 제약으로서 유용하다.

다른 측면에서 본 발명은 제약으로서 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다.

제약학적 용도를 위하여 본 발명의 화합물은 하나 이상, 바람직하게는 하나의 본 발명의 화합물, 예를 들어 본 발명의 2 이상의 화합물의 조합을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 제약학적 부형제, 예를 들어 충진제, 결합제, 붕해제, 유동 조절제, 윤활제, 당류 및 감미제, 향료, 보존제, 안정화제, 습윤제 및/또는 유화제, 가용화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 포함하는 적절한 담체 및/또는 희석제와 함께 본 발명의 화합물을 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 다른 제약학적 활성 약제를 더욱 포함하는 본 발 명에 따른 제약학적 조성물을 제공한다.

이러한 조성물은 예를 들어 혼합, 입상화, 코팅, 용해 또는 동결 공정에 의해 통상적인 방법에 따라서, 예를 들어 통상적인 방법과 유사하게 제조될 수 있다. 단위 투여 형태는 예를 들어 약 0.5mg 내지 약 1000mg, 예컨대 1mg 내지 약 500mg을 함유할 수도 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 사이토카인, 성장 인자, 원형 종양유전자 또는 바이러스성 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 물질의 생성과 연관된 병인학을 가진 질병을 치료하기 위한 약제, 예를 들어 제약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도를 제공하며, 바람직하게는 약제는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-8, GM-CSF, TNF-α, VEGF, AT-R1, Cox-2, c-fos 및 c-myc으로 이루어진 군에서 선택된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 사이토카인, 성장 인자, 원형 종양유전자 또는 바이러스성 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 물질의 생성과 연관된 병인학을 가진 질병의 치료 방법을 제공하며, 바람직하게는 약제는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-8, GM-CSF, TNF-α, VEGF, AT-R1, Cox-2, c-fos 및 c-myc으로 이루어진 군에서 선택되고, 치료는 본 발명의 화합물의 유효량을 이러한 치료가 필요한 대상체에게 예를 들어 제약학적 조성물의 형태로 투여하는 것을 포함한다.

치료는 치료 및 예방을 포함한다. 이러한 치료를 위하여, 적절한 투여량은 예를 들어 사용되는 본 발명의 화합물의 화학적 성질 및 약동학적 데이타, 개별적인 숙주, 투여 방식, 치료되어지는 상태의 성질 및 심각성에 의존하여 변할 것이 다. 그러나, 일반적으로, 더욱 큰 포유동물, 예를 들어 인간에서 만족스런 결과를 위하여, 지시된 일일 투여량은 본 발명의 화합물 약 0.01g 내지 약 1.0g의 범위이고, 편리하게는 예를 들어 1일당 4회 이하의 분할 투여량으로 투여된다.

본 발명의 화합물은 통상적인 경로, 예를 들어 코, 구강, 직장, 경구 투여를 비롯한 소화관내 투여에 의해; 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하 투여를 비롯한 비경구적으로; 또는 예를 들어 경피, 비내, 기관내 투여를 비롯한 국소 투여에 의해; 예를 들어 코팅되거나 코팅되지 않은 정제, 캡슐, 주사 용액 또는 현탁액의 형태, 예를 들어 앰풀, 바이알의 형태로, 크림, 겔, 페이스트, 흡입 분말, 발포체, 팅크제, 립스틱, 점적, 분무의 형태, 또는 좌약의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물은 제약학적으로 허용가능한 염의 형태, 예를 들어 산 부가염 또는 금속 염; 또는 유리 형태; 임의로 용매화물의 형태로 투여될 수도 있다. 염 형태의 본 발명의 화합물은 유리 형태에서, 임의로 용매화물의 형태에서 본 발명의 화합물로서 동일한 정도의 활성을 나타낸다.

본 발명의 화합물은 본 발명에 따른 제약학적 치료를 위해 단독으로 또는 하나 이상의 다른 제약학적 활성 약제와 조합하여 사용될 수 있다.

조합물은 2 이상의 제약학적 활성 약제가 동일한 제형으로 존재하는 고정된 조합물; 별개의 제형의 2 이상의 제약학적 활성 약제가 예를 들어 공동-투여를 위한 지시와 함께 동일한 포장으로 판매되는 키트; 및 제약학적 활성 약제가 별개로 포장되지만 동시 또는 연속 투여를 위한 지시가 제공되는 유리 조합물을 포함한다.

도 1: 분석 원리 (개략적)

표지화, 예를 들어 Cy3-표지화 mRNA (여기에서, 3'-말단 표지)에 단백질 결합 시에, 환경 민감성 표지, 예를 들어 Cy3의 양적 수율이 증가한다. 이러한 증가는 적절한 정보, 예를 들어 FIDA 연산방식에 의한 분자 휘도에서의 증가로서, 또는 예를 들어 총체적 평균 정보를 사용한 전체 형광 강도 증가로서 검출될 수 있다. 이러한 효과는 mRNA 서열 내에서 표지, 예를 들어 Cy3 표지에 근접하거나(A) 또는 멀리 있는(B) 단백질 결합 부위에서 동일하게 관찰된다.

도 2: 일례의 Cy3 FIDA 분석 mRNA -단백질 결합 곡선

HuR_fl와 IL-2(A), IL-1β (B) 및 TNF-α (C)의 3'말단 Cy3 표지화 3'UTR (=비번역 영역)의 상호작용에 관한 일례의 결합 곡선을 나타낸다. 실시예에 주어진 바와 같이 수학식 1에 따라 용해 상수(Kd)를 결정한다. Cy3과 비특이적 HuR 상호작용을 배제하기 위하여, 자유 염료(D)를 사용하여 네가티브 대조를 수행한다. 대조 단백질(E)로서 BSA (=소 혈청 알부민)에 의한 IL-2 3'UTR의 적정시에 Cy3 분자 휘도가 변화없이 유지된다. 3'말단 Cy3 표지화 RNA의 농도는 모든 실험에서 0.5nM이다. 어떠한 HuR 결합 부위를 함유하지 않는 5S RNA가 비특이적 경쟁인자 RNA로서 모든 샘플에서 100nM로 존재한다. 그러나, 경쟁인자 RNA의 부재하에서도 거의 동일한 결합 곡선이 기록된다 (TNF-α 3'UTR,(F)에 관해 나타냄).

도 3: 도 2에 나타낸 결합 실험을 위한 RNA 전사물

인간 IL-2, IL-1β 및 TNF-α (진뱅크 수탁번호 NM_000589, NM_000576 및 NM_000594; 각각 위치 707-1035, 897-1490 및 872-1568)의 3'UTR의 시험관내 전사물을 Cy3으로 3' 말단 표지화한다. HuR 결합 부위 (청색으로 나타냄)가 3'말단 표지에 대해 상이한 (서열) 근접성을 갖고 있긴 하지만, 단백질 결합 시에 Cy3 양적 수율 증가가 일정하게 관찰된다.

하기 실시예에서 모든 온도는 섭씨 온도이고 보정되지 않는다.

하기 약어들이 사용된다.

BSA 소 혈청 알부민

Cy3 형광 염료

FCS 형광 상관 분광분석법

FIDA 형광 강도 분포 분석

HuR_fl 전체 길이 HuR 단백질

HuR₁ _,2 HuR_fl의 단축된 변형체

OD 광학 밀도

PBS 인산염 완충 염수

RP-HPLC 역상 고 성능 액체 크로마토그래피

rt 실온

CONA 공초점 나노스캐닝

DMF 디메틸포름아미드

HuR₁₂ HuR의 단축된 변형체

TMR 5'카르복시테트라메틸로다민

rt 실온

A/스크리닝 분석:

시험관내 전사된 mRNA를, 표준 프로토콜 (예를 들어, 문헌 [Qin PZ 등, Methods 1999; 18(1): 60-70])에 따라서 히드라지드-활성화 Cy3 (아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences))로 3'-말단 표지화하였다. 표지화된 RNA를 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 1:1 화학양론을 UV/VIS 분광분석법에 의해 조절하였다. Cy3-표지화 mRNA를 분석 완충액 (PBS, 0.1％ (w/v) 플루로닉 F-127, 5mM MgCl₂) 중에서 80℃에서 2분 동안 열적으로 변성시키고, -0.13°s^-1의 구배에서 실온으로 냉각시킴으로써 리폴딩(refold)하였다. 각각의 샘플 중에서 표지화된 RNA의 최종 농도는 0.5nM이고, 이것은 하기 기재된 설정에서 공촛점 부피 중에 평균 1 미만의 형광 입자를 보장하였다. 각각의 샘플 중에서 정확한 농도는, 점 분포 함수를 위한 조절 매개변수에 의해 주어진 바와 같이, 병렬 FCS 평가 및 공촛점 부피의 크기로부터 유래된 입자 수를 기초로 하여 결정되었다. 형광 표지화 RNA를 재조합체 HuR_fl 또는 HuR₁ _,2의 증가하는 농도에 대해 적정하였다. 1D-FIDA에 의해 분자 휘도를 결정함으로써 진정한 평형상태 조건 하에서 HuR-mRNA 복합체 형성을 검사하였다 (예를 들어, Kask P. 등, Introduction to the theory of fluorescence intensity distribution analysis, FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY: THEORY AND APPLICATIONS 65 PG. 396-409. 2001 (도면)-409; Kask P. 등, Fluoresence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96[24], 13756-13761. 23-11-1999). 대안적으로, 통상적인 총체적 평균 검출 방법, 예를 들어 형광 판 판독기를 사용하여 Cy3 형광 강도를 측정할 수 있다.

주변 온도 (23.5℃에서 일정함)에서 에보텍OAI 픽코스크린 3 기구 위에서 96- 또는 384-웰 유리 바닥 마이크로적정 판 (와트만(Whatman))에서 FIDA 측정을 수행하였다. 올림푸스 역 현미경 IX70 기초 장치에 형광 여기 경로에서 2개 형광 검출기, 이색 거울을 장착하였다. 형광 여기를 위하여 HeNe 레이저 (λ=543nm, 레이저 전력=478 μW)를 사용하였다. OD=5를 가진 간섭 장벽 필터에 의해 여기 레이저 광을 광학 검출 경로로부터 차단하였다. 공촛점 핀홀(70μm)의 조절을 위하여 분석 완충액(c=0.5nM)에서 Cy3 또는 TMR을 사용하였다. 20회 연속 측정으로부터 1D-FIDA 시그날을 평균화하였다 (각각 10초). (a) 통상적인 총체적 평균 측정에 균등한 평균 분자 휘도, 또는 (b) 각각의 분자 휘도를 가진 개별 성분의 평형상태 농도 (자유 mRNA 대 복합체)을 도출하기 위하여 FIDA 연산방식에 의한 미가공 데이터의 분석을 수행하였다.

(a) 해리 상수 K_d에 의해 결정되는 바와 같이 (1:1) 복합체 형성 정도의 의존성에서 평균 정상-상태 시그날 q

상기 식에서, [mRNA₀]: RNA의 전체 농도, [HuR₀]: HuR의 전체 농도, q_min: 자유 RNA의 분자 휘도, q_max: RNA-HuR 복합체의 분자 휘도, q: 주어진 HuR₀ 및 RNA₀ 농도에서 정상 상태 평형상태를 위한 평균 분자 휘도;

(b) 해리 상수 K_d에 의해 결정되는 바와 같이 자유 및 단백질 결합된 mRNA의 평형상태 농도 (FIDA 분석에 의해 직접 전달되는 [mRNA_유리] 및 [mRNA·HuR])의 평형상태 농도

를 설명하는 질량 작용 법칙으로부터 유래된 결합 방정식의 실제 대수 해법을 사용하여 평형상태 해리상수 K_d를 도출하기 위하여, 분자 휘도 데이타를 비선형 최소 제곱 회귀(GraFit 5.0.3, 런던 에리투쿠스 소프트웨어 (Erithacus software))에 의하여 합치시켰다.

HuR과 각각의 Cy3 표지화 표적 mRNA 간의 상호작용을 위한 일례의 결합 곡선을 도 2에 나타냈다 (모든 표시된 데이타는 20회 개별 FIDA 측정의 평균이고 적어도 3개 독립적 실험을 표시함).

다시 시작하기 위하여, 본 발명의 분석은 균질한 용액 중에서 (조절) mRNA 단백질 상호작용을 검사하기 위해 신규의 접근법을 제공한다. 분석은 고 검출 민감성 및 정확성을 가진 평형상태 조건의 장점을 조합하고, 고 처리량 스크리닝에서 상호작용의 잠재적 억제제 또는 조절제를 스크리닝하기 위해 적절하다. 방대한 수의 후-전사 조절된 질병 관련 표적을 사용하여, 상기 기재된 분석은 신규의 RNA-표적 접근법을 근거로 하여 암, 염증, 바이러스성 또는 알러지성 질병에서의 치료적 중재를 위한 기초로서 역할을 할 것이다.

B) 분석 방법

a) HPLC: 분리 분석을 위하여, 2개의 펌프 장치(306), 동적 혼합기 모듈(811c), 압력표시 가압 모듈(805), UV-검출기 UV/VIS(155) 및 자동시료주입기(234)로 구성된 애비메드(Abimed, D-랑겐펠트(Langenfeld)) HPLC 시스템을 사용하였다. 그롬(Grom, D-헤렌베르그(Herrenberg))에서 제조한 그롬실(GromSil) 150 ODS-5 ST(3㎛, 120 x 2mm) 분석용 컬럼 상에서 분리를 수행하였다. 0.4mL/분의 유속으로 H₂O/0.1％ TFA(v/v)(용리제 A) 그리고 아세토니트릴/0.1％ TFA(v/v)(용리제 B)의 구배용출을 사용하였다. λ= 214 그리고 λ= 305nm 각각에서 UV-경향을 측정하였다. 생성물의 순도는 λ= 214nm에서 피크의 면적을 기초로 정하였다.

b) ES-MS: 워터스(Waters) (D-에쉬본(Eschborn)) 515 메이크-업 펌프 (0.1％ 포름산을 함유한 아세토니트릴/물 1:1, 등용매용리 유속 60㎕/분) 그리고 애비메드(D-랑겐펠트) 길손 232X 자동시료주입기를 장착한 마이크로메스(Micromass) (영국 앨트리챈 (Altrinchan/UK)) 쿼트로(Quattro) II 삼중 사중극자 질량분석계 상에서 ES-MS 분석을 수행하였다.

c) LC-MS: HPLC-시스템 2790 알리안스(Alliance) HT 분리 모듈과 996 다이오드 배열 검출기를 장착한 워터스-마이크로메스(D-에쉬본) ZQ 질량분석계 상에서 LC-MS 분석을 수행하였다. 그롬(D-헤렌베르그)에서 제조한 그롬실 120 ODS-5 ST(3㎛, 60 x 2mm) 분석용 컬럼을 사용하였다. 0.6mL/분의 유속으로 H₂O/0.1％ TFA(v/v)(용리제 A) 그리고 아세토니트릴/0.1％ TFA(v/v)(용리제 B)의 구배용출을 이용하였다.

d) 제조용 HPLC: 제조용 분리를 위하여 펌프 장치(322), UV-검출기 UV/VIS (151) (λ=305nm) 그리고 길손(Gilson) 215 자동분주 시스템으로 구성된 애비메드(D-랑겐펠트) HPLC 시스템 1014를 사용하였다. 머어크(Merck, D-다름스타트)에서 제조한 푸로스퍼(Purospher) RP18(5㎛, 125 x 25mm) 제조용 컬럼 상에서 분리를 수행하였다. 30mL/분의 유속으로 H₂O/0.1％ TFA(v/v)(용리제 A) 그리고 아세토니트릴/0.1％ TFA(v/v)(용리제 B)의 구배용출을 사용하였다.

실시예 1 내지 3:

화합물 1 내지 3의 합성을 하기 반응식 1에 따라 수행한다.

a) 고체 지지체에 링커의 부하

4.2g의 텐타겔(TentaGel)^TM S NH₂-수지 1 (부하 용량 = 0.25밀리몰/g)을 DMF (4×20mL)로 예비 세척하였다. 0.82g의 4-브로모메틸-3-니트로벤조산 2 및 0.482g의 HOBt*H₂O를 DCM 중의 8％ DMF (v/v) 60mL에 용해시켰다. 487㎕의 DIC를 첨가하 였다. 실온에서 30분 동안 교반한 후에, 수득된 용액을 미리 세척된 텐타겔^TM S NH₂-수지 1로 옮겼다. 수득된 혼합물을 실온에서 19시간 동안 진탕하였다. 수득된 수지 3을 여과 제거하고, DMF (6× 50mL), DCM (6× 50mL) 및 MeOH (6× 50mL)로 세척하고, 감압 하에 건조시켰다. 네가티브 카이저-닌히드린 시험에 의하여 반응의 완결을 입증하였다.

b) 일차 아민 4a, 4b와 수지 3의 반응

20ml DMSO 중의 3.18g의 수지 3에, 2.133g의 1-(3-아미노프로필)-피롤리딘-2-온(4a)를 첨가하였다. 10mL DMSO 중의 1.27g의 수지 3에, 0.73g의 4-메틸벤질아민(4b)을 첨가하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 진탕하였다. 수지 5a 및 5b를 여과해 내고, DMSO (3×6ml), DMF (6×6ml), DCM (6×6ml), MeOH (6×6ml)으로 세척하고 감압하에 건조시켰다. 클로라닐 시험은 포지티브였다.

c) 보호된 아미노산 6a-f의 수지 5a-b로의 결합 및 N(α) 보호기( Fmoc )의 절단

0.65g의 수지 5a를 5개 분취량으로 나누었다. 0.65g의 수지 5b를 2개의 동일 분량으로 나누었다. 0.45밀리몰의 각각의 N-보호된 아미노산 6a-f (6a: N(α)-Fmoc-N(γ)-Boc-L-2,4-디아미노부티르산, 2회; 6b; Fmoc-(OTrt)-L-호모세린; 6c: Fmoc-Asp(OtBu)-OH; 6d; Fmoc-Trp(Boc)-OH; 6e: Fmoc-L-4-MePhe-OH; 6f; Fmoc-L-(4-Boc-아미노메틸)Phe-OH를 각각 5mL의 DMF, 93㎕의 DIC 및 92mg의 HOBt*H₂O 용액에 용해시켰다. 수득된 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 수득된 활성화된 6a의 용액을 동일한 2개 분량으로 나누었다. 분량을 수지 5a 및 수지 5b의 분취량 으로 옮겨서 각각 측쇄 보호된 수지 7a 및 8a를 수득하였다. 수득된 활성화된 6b-e의 용액을 수지 5a의 나머지 분취량으로 옮겨서 보호된 수지 7b-e를 수득하였다. 6f를 함유하는 용액을 수지 5b의 두번째 분취량으로 옮겨서 보호된 수지 8b를 수득하였다. 실온에서 16.5시간 동안 진탕한 후에, 수득된 수지를 여과해 내고 DMF (9×10mL), DCM (6×10mL) 및 MeOH (6×10mL)로 세척하였다. 수득된 충분히 보호된 수지 7a-e 및 8a-b를 감압 하에 건조시켰다. 모든 클로라닐 시험은 네가티브이다.

N(α)-Fmoc 보호 기의 절단을 위하여, DMF (400mL, 1/1, v/v) 중의 피페리딘 원액의 분취량(5mL)을 보호된 수지 7a-e 및 8a-b의 0.66g 각각에 첨가하였다. 수득된 혼합물을 30분간 진탕하였다. 수득된 탈보호된 수지 7a-e, 8a-b를 여과해 내고, DMF (9×25mL), DCM (6×25mL) 및 MeOH (6×25mL)로 반복하여 세척하였다. 수득된 수지를 감압 하에 건조하였다. 카이저-닌히드린 시험은 포지티브이다.

d) 대칭 디카르복실산 소구조물을 함유하는 화합물 14a-c의 합성

Fmoc-탈보호된 수지 7a 및 8a-b 상에 대칭 디카르복실산 9a 및 9b의 결합

DMF 5mL 중에 115mg의 HOBt*H₂O, 485mg의 DIEA 및 95mg의 DIC의 용액에 대칭 디카르복실산 9 (9a: 피리딘-2,6-디카르복실산; 9b: 테레프탈산, 2회; 1.5밀리몰, 각각)을 용해시켰다. 수득된 9a의 용액을 수지 7a에 첨가하여 수지 10a를 수득하였다. 수득된 9b의 2개 분취량 용액을 수지 8a 및 8b에 첨가하여 수지 10b 및 10c를 수득하였다. 실온에서 20시간 동안 진탕한 후에, 수득된 수지 10a-c를 여과해 내고 DMF (9×20mL), DCM (6×10mL), 디에틸에테르 (6×10mL)로 세척하고, 감압 하 에 건조시켰다. 모든 수지 샘플의 카이저-닌히드린 시험은 네가티브이다.

e) 수지 결합 디카르복실산 모노-아미드 10a-c와 아미노산 아미드 11 및 1차 아민 12의 결합

5mL의 NMP 중에 339mg의 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 및 242㎕의 피리딘의 용액을 수지 10a-c의 650mg 각각에 첨가하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 진탕하였다. 수득된 수지를 여과해 내고, NMP (10×5mL)로 세척하였다. 298mg의 (O-Trt)-보호된 L-트레오닌 아미드 히드로클로라이드(11)를 3.0mL의 NMP 중에 20.3mg의 무수 HOBt 및 3밀리몰의 DIEA의 용액에 용해시키고, 650mg의 예비-활성화 수지 10a에 첨가하여 수지 13a를 수득하였다. 182mg의 3-메톡시벤질아민(12)을 NMP 6.0mg 중의 40.6mg의 무수 HOBt 및 1.5밀리몰의 DIEA의 용액에 용해시켰다. 수득된 용액을 2개 분취량으로 나누고, 이것을 예비-활성화 수지 10b 및 10c에 첨가하여 각각 수지 13b 및 13c를 수득하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 14.5시간동안 진탕하였다. 수득된 수지를 여과해 내고, NMP (6×10mL), DMF (6×10mL), DCM (6×10mL) 및 MeOH (6×10mL)로 세척하고 감압 하에 건조시켰다.

f) 아미노산 6의 측쇄로부터 Boc - 보호 기의 절단

수지 13a-c의 650mg 각각에 DCM (v/v) 중의 50％ TFA의 용액 5mL를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 진탕하였다. 수득된 수지를 여과해 내고, DCM (v/v, 3×5mL), DMF (6×10mL), DCM (6×10mL) 및 EtOH abs (6×10mL) 중의 20％ TFA로 세척하고 감압 하에 건조시켰다.

g) 수지 13a-c로부터 최종 화합물 14a-c의 절단

5mL의 MeOH + 1％ TFA (v/v)을 탈보호된 수지 13a-c의 각각에 첨가하였다. 수지 함유 유리 바이알을 광분해를 위해 플라스틱 운반설비에 놓았다. NEC 블랙라이트 T5, FL8BI, 8W-램프가 장착된 스트라타진, UV 스트라탈리너(Strataliner)^TM 1800에서 교반하면서 90분 동안 366nm에서 광분해를 수행하였다. 압축 공기의 흐름과 함께 광-절단되는 동안에 챔버를 냉각하였다. 수득된 수지 물질을 여과해 내고 DCM (2×5mL)로 세척하였다. 수득된 여액으로부터의 용매를 증발시켰다. 조 물질을 조제 HPLC에 의해 더욱 정제하였다.

실시예 1:

피리딘-2,6-디카르복실산 2-({3-아미노-1-[3-(2-옥소-피롤리딘-1-일)-프로필카르바모일]-1-프로필}-아미드-6-[(1-카르바모일-2-히드록시-프로필)-아미드]가 수득된다.

MW = 491.5552 체류 시간: 3.8분 LC-MS[M⁺H]⁺:492

실시예 2:

N-[3-아미노-1-(4-메틸-벤질카르바모일)프로필]-N'-(3-메톡시-벤질)테레프탈아미드가 수득된다.

MW = 488.592 체류 시간: 8.29분 LC-MS[M⁺H]⁺:489

실시예 3:

N-[2-(4-아미노메틸-페닐)-1-(4-메틸-벤질카르바모일)에틸]-N'-(3-메톡시벤 질)-테레프탈아미드가 수득된다.

MW = 564.69 체류 시간: 8.46분 LC-MS[M⁺H]⁺:565

실시예 4 내지 7:

반응식 2에 따라 화합물 4 내지 7의 합성을 수행하였다.

a) 수지 7b-e의 아세토아세틸화

N(α)-탈보호 수지 7b-e를 5mL 주사기에 넣었다. 359mg의 N-히드록시숙신이미딜 아세토아세테이트 15를 17.0mL의 DCM에 용해시켰다. 310mg의 DIEA를 첨가하고 원액의 4mL 분취량을 각각의 수지 7b-e의 650mg의 주사기에 옮겼다. 실온에서 5시간동안 진탕한 후에, 수득된 아세토아세틸화 수지 16a-d를 여과해 내고, DCM (3×5mL), DMF (6×5mL), DCM (6×5mL) 및 MeOH (6×5mL)로 세척하고 건조시켰다. 카이저-닌히드린 시험은 네가티브이다.

b) 수지 16a-d와 일차 아민 17a-c의 반응 ( 에나미논 형성)

THF 및 TMOF의 원액 (1/1, v/v) 5mL를 수지 16a-d의 각각의 650mg에 첨가하였다. 1.5밀리몰의 각각의 일차 아민 17a-c (17a: 수지 16a와의 반응을 위한 2-메톡시에틸아민; 17b: 수지 16b와의 반응을 위한 2-(3-메톡시페닐)-에틸아민; 2회, 17c: 각각 수지 16c 및 16d와의 반응을 위한 벤질아민)을 첨가하고, 수득된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 진탕하였다. 수득된 수지 18a-d를 여과해 내고, THF/TMOF (1/1, v/v) (3×6mL), DMF (6×6mL), DCM (6×6mL) 및 MeOH (6×6mL)로 세척하고 건조하였다.

c) 수지 결합 에나미논 18a-d와 1,4- 디브로모 -2,3- 부탄디온 19로부터의 피롤 합성

230mg의 2,6-디-tert-부틸피리딘 및 292mg의 1,4-디브로모-2,3-부탄디온 19를 24mL의 디옥산에 용해시켜 원액을 수득하였다. 수득된 원액의 분취량 (6mL/수지)을 수지 18a-d의 각각의 650mg에 첨가하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 1.5시간동안 진탕하였다. 수득된 수지 20a-d를 여과해 내고, 디옥산 (6×6mL), DMF (6×6mL), THF (6×6mL) 및 DCM (6×6mL)로 세척하였다.

d) 이차 아민 21a 및 21b로 수지 결합 브로모아세틸 -피롤 20a-d의 치환

192mg의 각각의 2차 아민 21 (21a: 128mg의 수지 20a와의 반응을 위한 피페리딘-4-카르복사미드; 21b: 128g의 20b-d와의 반응을 위한 피페리딘) 및 DMSO (4×6mL)을 650mg의 각각의 수지 20-d에 첨가하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 15.5시간 동안 진탕하였다. 수득된 수지 22a-d를 여과해 내고, DMSO (3×1mL), DMF (6 ×1mL), DCM (6×1mL) 및 MeOH (6×1mL)으로 세척하고 건조시켰다.

e) 아미노산 6의 측쇄로부터 보호기의 절단 (수지 22a-c)

DCM (v/v) 중의 20％ TFA의 용액 5mL를 각각의 수지 22a-c에 첨가하여 R² 위의 측쇄 보호기를 제거하였다 (Trt, t-Bu, Boc). 수득된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 진탕하였다. 수득된 탈보호된 수지 22a-c를 여과해 내고, DCM (v/v, 3×1mL), DMF (6×2mL), DCM (6×2mL), EtOH (6×2mL) 및 에테르 (3×2mL) 중의 20％ TFA로 세척하고 건조시켰다.

f) 수지 22a-d로부터 최종 화합물 23a-d의 절단

각각의 탈보호된 수지 22a-c 및 비-TFA 처리된 수지 22d에 5mL의 산성 메탄올 및 1％ v/v TFA를 첨가하였다. 유리 바이알을 플라스틱 운반설비에 놓았다. NEC 블랙라이트 T5, FL8BI, 8W-램프가 장착된 스트라타진^(R) UV 스트라타리너^TM 1800에서 교반하에 366nm에서 90분 동안 조사하면서 광분해를 수행하였다. 압축 공기의 흐름과 함께 광-절단 되는 동안에 챔버를 냉각하였다. 수득된 수지 물질을 여과해 내고 DCM (2×5ml)로 세척하였다. 수득된 합한 여액의 용매를 증발시켰다. 화합물의 조 물질을 조제 HPLC에 의해 더욱 정제할 수 있다.

실시예 4:

1-{2-[4-{3-히드록시-1-[3-(2-옥소-피롤리딘-1-일)-프로필카르바모일]-프로필카르바모일}-1-(2-메톡시-에틸)-5-메틸-1H-피롤-2-일]-2-옥소-에틸}-피페리딘-4-카르복실산 아미드가 수득된다.

MW = 576.699 체류 시간: 2.24분 LC-MS[M⁺H]⁺:577

실시예 5:

3-{[1-[2-(3-메톡시-페닐)-에틸]-2-메틸-5-(2-피페리딘-1-일-아세틸)-1H-피롤-3-카르보닐]-아미노}-N-[3-(2-옥소-피롤리딘-1-일)프로필]-숙신아민산이 수득된다.

MW=623.756 체류 시간: 7.59분 LC-MS [M⁺H]⁺:624

실시예 6:

1-벤질-2-메틸-5-(2-피페리딘-1-일-아세틸)-1H-피롤-3-카르복실산 {2-(1H-인돌-3-일)-1-[3-(2-옥소-피롤리딘-1-일)-프로필카르바모일]-에틸}-아미드가 수득된다.

MW=650.828 체류 시간: 8.248분 LC-MS [M⁺H]⁺:651

실시예 7:

1-벤질-2-메틸-5-(2-피페리딘-1-일-아세틸)-1H-피롤-3-카르복실산 {1-[3-(2-옥소-피롤리딘-1-일)-프로필카르바모일]-2-p-톨릴-에틸}-아미드가 수득된다.

MW=625.818 체류 시간: 8.44분 LC-MS [M⁺H]⁺:626

실시예 8: HuR -결합 mRNA 안정성 조절의 소 분자 억제제의 확인

HuR-결합 mRNA 안정성 조절의 소 분자 억제제를 확인하기 위하여, 3개의 상이한 보충 HT 스크리닝을 수행하였다.

(1) IL-2 또는 TNF-α AU-풍부 요소의 제어 하에서 화이어플라이 루시퍼라제를 사용한 세포 리포터 유전자 분석

ARE-매개 mRNA 안정화의 세포내 활성, 비-독성 억제제를 확인하기 위하여 이러한 분석을 설계하였다. 전사 수준에서 작용하는 화합물을 제외하기 위해 IL-2 또는 TNF-α 프로모터 하에서 루시퍼라제 CDS로의 대조 분석에서 확증된 유효성을 시험하였다. 명백하게, 확인된 유효 화합물은 ARE 경로를 따라 단-수명 ARE mRNA의 전사후 안정화를 어느 정도로 방해한다.

(2) 공촛점 파동 분광분석법을 사용하여 HuR-ARE 억제제의 시험관내 스크리닝.

이 분석은, 용액 중에서 TMR 표지화 ARE RNA에 대해 HuR의 단축 변형체인 HuR₁₂의 결합을 검사하기 위하여 2D-FIDA를 사용한다. 이 스크리닝에서 확인된 화합물은 ARE 또는 HuR₁₂에 결합함으로써 HuR-ARE 인식을 방해하는 것으로 추측된다.

(3) HuR을 가진 CONA.

CONA와의 고 친화성 HuR 결합제에 대하여 조합 비드-상 라이브러리를 스크리닝하였다. 고체 지지체로부터 유효 비드를 골라내고 비드-상 결합제를 절단한 다음, 화합물 구조를 μHPLC-MS에 의해 해독하였다. 재합성된 유효 화합물의 HuR에 대한 결합을 용액 중에서 시험하였다. 주요 결과로서, 확인된 화합물은 고 친화성 HuR 결합제를 나타낸다. 기능적으로, 이들은 ARE 인식, 핵-세포질간 셔틀링, 및 ARE-의존성 분해로부터 mRNA의 보호를 포함하는 HuR 활성의 억제제일 수도 있다.

y=(r-r_min)/((r-r_min)+Q(r_max-r))을 기초로 한 이방성 데이타로부터 RNA 분획 결합 y를 계산한다 (식에서, r ≡ 측정된 이방성, r_min, r_max ≡ 각각, 자유 및 HuR 결합된 RNA의 이방성, Q ≡ 소광). 해리 상수 Kd는 매쓰매티카(Mathematica) 5.0.0에서 KMath와 일치하는 비선형 곡선에 의하여 결정되며, 1:1:1 화학양론적 경쟁 억제로 추측된다.

HuR 억제제
화합물	Kd (HuR_fl)
실시예 3	0.092 ± 0.022 μM
실시예 4	0.103 ± 0.020 μM
실시예 5	0.104 ± 0.014 μM
실시예 6	0.143 ± 0.027 μM
HuR_fl에 대한 ARE RNA 결합에서의 경쟁 실험을 기초로 하여 화합물의 해리 상수를 결정한다.

Claims

a) 임의로 균질한 용액으로서 100개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 가진 표지화 mRNA를 제공하고 (여기에서, 표지는 mRNA의 환경 변화에 민감한 물질임),

b) 충분한 기간 동안 mRNA와 표적 단백질의 상호작용을 조정할 것으로 기대되는 후보 화합물의 부재 및 존재 하에서 표적 단백질을 상기 단계 a)에서 제공된 mRNA와 접촉시켜, 상기 mRNA와 상기 표적 단백질 간의 복합체가 형성될 수 있도록 하고,

c) 단계 b)에서 형성된 복합체를 검출하고,

d) 후보 화합물이 단계 b)에서 부재하거나 존재하는 경우에 형성되는 복합체 의 양의 차이가 존재하는지의 여부를 결정하고,

e) 단계 d)에서 차이가 결정되는 경우에 후보 화합물을 약제로서 선택하는 것

을 포함하는, mRNA와 표적 화합물의 상호작용을 조정하는 약제를 확인하기 위한 분석법.
제1항에 있어서, 표지가 형광 염료, 예를 들어 Cy3 또는 Cy5인 분석법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 복합체가 형광 강도의 측정에 의해 검출되는 것인 분석법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질이 HuR 단백질인 분석법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA가 IL-2, IL-1β 및 TNF-α로 이루어진 군에서 선택되는 것인 분석법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA가 100 내지 500개 뉴클레오티드, 바람직하게는 300개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 분석법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 고 처리량 스크리닝을 위한 분석법.
- 표지화 mRNA, 예를 들어 형광 표지화 mRNA,

- 표적 단백질,

- 키트를 사용하기 위한 지시, 및

- 임의로, 후보 화합물

을 포함하는 키트.
하기 화학식 I의 화합물.

<화학식 I>

상기 식에서,

R₁은 비치환되거나 치환된 (C₆ _-18)아릴 또는 5 또는 6원 고리를 갖고 N, O 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 1 내지 4개 헤테로원자를 가진 헤테로시클릴로 치환된 (C₁ _-4)알킬이고,

R₂는 히드록실, 카르복실, 아미노, 또는 비치환되거나 치환된 (C₆ _-18)아릴로 치환된 (C₁ _-4)알킬, 또는 비치환되거나 치환된 (C₆ _-18)아릴이고,

R₃은 비치환되거나 치환된 (C₆ _-18)아릴, 또는 5 또는 6원 고리를 갖고 N, O 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 1 내지 4개 헤테로원자를 가진 헤테로시클릴이다.
제9항에 있어서,

R₁이 비치환되거나 치환된 페닐 또는 5원 고리 및 헤테로원자로서의 N을 가진 헤테로시클릴로 치환된 (C₁ _-3)알킬이고,

R₂가 히드록실, 카르복실, 아미노, 또는 비치환되거나 치환된 페닐로 치환된 (C_1-2)알킬, 또는 비치환되거나 치환된 페닐이고,

R₃이 비치환되거나 치환된 페닐, 또는 5 또는 6원 고리 및 헤테로원자로서의 N을 가진 헤테로시클릴인

화합물.
제9항 또는 제10항에 있어서,

R₁이 p-메틸-페닐로 치환된 메틸, 또는 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂가 카르복실로 치환된 메틸, p-메틸-페닐로 치환된 메틸, 1H-인돌-3-일로 치환된 메틸, 히드록실로 치환된 에틸, 아미노로 치환된 에틸 또는 p-메틸-페닐이고, R₃이 하기 화학식 II의 화합물 또는 하기 화학식 III의 화합물인 화학식 I의 화합물.

<화학식 II>

(상기 식에서,

R₄은 1-피페리딘 또는 1-(p-아미노카르보닐)피페리딘이고,

R₅는 메톡시에틸, 벤질 또는 (p-메톡시-페닐)에틸임)

<화학식 III>

(상기 식에서,

R₆은 p-페닐 또는 m-피리딘이고,

R₇은 m-메톡시페닐 또는 1-아미노카르보닐-2-히드록시-프로필로 치환된 메틸임)
a) R₁이 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂가 아미노로 치환된 에틸이고, R₃이 하기 화학식의 화합물이거나;

b) R₁이 p-메틸-페닐로 치환된 메틸이고, R₂가 아미노로 치환된 에틸이고, R₃이 하기 화학식의 화합물이거나;

c) R₁이 p-메틸-페닐로 치환된 메틸이고, R₂가 p-아미노메틸-페닐로 치환된 메틸이고, R₃이 b)에서 정의된 화합물이거나;

d) R₁이 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂가 히드록실로 치환된 에틸이고, R₃이 하기 화학식의 화합물이거나;

e) R₁이 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂가 카르복실로 치환된 메틸이고, R₃이 하기 화학식의 화합물이거나;

f) R₁이 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂가 1H-인돌-3-일로 치환된 메틸이고, R₃이 하기 화학식의 화합물이거나; 또는

g) R₁이 1-피롤리딘-2-온으로 치환된 n-프로필이고, R₂가 p-메틸-페닐로 치환된 메틸이고, R₃이 f)에서 정의된 화합물인,

하기 화학식 I의 화합물.

<화학식 I>
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 염의 형태인 화합물.
ARE-함유 mRNA 및 표적 단백질의 복합체-형성에 대한 억제제로서 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
제14항에 있어서, 표적 단백질이 HuR인 용도.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제약으로서 사용하기 위한 화합 물.
사이토카인, 성장 인자, 원형 종양유전자 또는 바이러스성 단백질로 이루어진 군, 바람직하게는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-8, GM-CSF, TNF-α, VEGF, AT-R1, Cox-2, c-fos 및 c-myc으로 이루어진 군에서 선택되는 물질의 생성과 연관된 병인학을 가진 질병의 치료용 약제를 제조하기 위한 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
하나 이상의 제약학적 부형제와 함께 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 제약학적 조성물.
제18항에 있어서, 다른 제약학적 활성 약제를 추가로 포함하는 제약학적 조성물.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 화합물의 유효량을 사이토카인, 성장 인자, 원형 종양유전자 또는 바이러스성 단백질로 이루어진 군, 바람직하게는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-8, GM-CSF, TNF-α, VEGF, AT-R1, Cox-2, c-fos 및 c-myc으로 이루어진 군에서 선택되는 물질의 생성과 연관된 병인학을 가진 질병의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병의 치료 방법.
제20항에 있어서, 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 화합물을 다른 제약학적 활성 약제와 조합하여 동시에 또는 연속적으로 투여하는 방법.