MX2007010670A - Metodo para el rastreo de compuestos que modulen la interaccion entre el arnm y las proteinas, y compuestos que se pueden obtener mediante el mismo. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un ensayo para identificar un agente que module, la interaccion del ARNm con una proteina objetivo, por ejemplo HuR, y a compuestos organicos de la Formula (I): (ver formula I) en donde R1, R2, y R3 son como se definen anteriormente, y a su uso, por ejemplo como un inhibidor de la formacion de complejo de un ARNm que contiene ARE y una proteina objetivo.

Description

MÉTODO PARA EL RASTREO DE COMPUESTOS QUE MODULEN LA INTERACCIÓN ENTRE EL ARNm Y LAS PROTEÍNAS. Y COMPUESTOS QUE SE PUEDEN OBTENER MEDIANTE EL MISMO La presente invención se refiere a compuestos orgánicos, y a un ensayo para identificar un agente que module la interacción de un ARNm con una proteína objetivo, por ejemplo una proteína ELAVL1.

La expresión de un gran número de genes es controlada al nivel del ARN mensajero. En particular, la rápida respuesta de los genes de respuesta temprana, y por consiguiente, la relevancia de los diferentes objetivos de la enfermedad a cierto estímulo, con frecuencia se promueve mediante mecanismos de control posteriores a la transcripción. Estos procesos son principalmente mediados por las proteínas reguladoras o los factores que actúan sobre el ARN mensajero. La inhibición o modulación de estas interacciones reguladoras del ARNm objetivo-proteína representa un planteamiento atractivo para la intervención terapéutica. Con el fin de buscar inhibidores de bajo peso molecular de la regulación del ARNm, se necesita un ensayo para monitorear la interacción objetivo del ARNm-proteína, idealmente en una solución homogénea. El ensayo debe ser además adecuado para implementarse en un medio ambiente de rastreo de alta producción (HTS), que en la actualidad se basa más frecuentemente en la detección de fluorescencia. El enlace directo de proteínas relativamente pequeñas, por ejemplo la proteína estabilizante del ARNm, HuR (36 kD), con ARNms largos, o sub-fragmentos (de 281 a 1,643 nucleótidos, de 100 a 500 kD) no se puede detectar basándose en el aumento relativo en el tamaño que persiste del ARN fluorescentemente marcado sobre la formación del complejo. Por esta razón, se pueden excluir fácilmente los métodos espectroscópicos que se basan en la detección del tiempo de difusión por rotación o traslación (tal como, por ejemplo, la Espectroscopia de Correlación de Fluorescencia (FCS), anisotropía 2D-FIDA, u otras mediciones de polarización de fluorescencia). El ensayo de la presente invención representa un método novedoso para monitorear las interacciones del ARNm-proteína en una solución homogénea bajo condiciones de verdadero equilibrio. Aplica, por ejemplo, una detección de una sola molécula altamente sensible, y por consiguiente, se adapta inmediatamente a las plataformas de HTS, tales como Evotec Markll/lll. Debido a la alta sensibilidad y precisión de la detección, por ejemplo, la detección confocal, el ensayo de la presente invención representa una alternativa atractiva para los ensayos convencionales de cambio de movilidad electroforética, enlace de filtro, o protección de nucleasa. También, será directa una adaptación a las metodologías de detección de intensidad de fluorescencia macroscópica convencionales (por ejemplo, lectores de placas de fluorescencia), y no necesariamente se requiere la disponibilidad de un instrumento confocal. En un aspecto, la presente invención proporciona un ensayo para identificar un agente que module la interacción de un ARNm con una proteína objetivo, el cual comprende: a) proporcionar un ARNm marcado que tenga una longitud de cuando menos 100 nucleótidos, opcionalmente como una solución homogénea, cuya marca sea una sustancia sensible a los cambios en el medio circundante del ARNm, b) poner en contacto una proteína objetivo, por ejemplo una proteína HuR, con el ARNm proporcionado en el paso a), en ausencia y en la presencia de un compuesto candidato que se espere que module la interacción del ARNm mencionado con la proteína objetivo, por ejemplo la proteína HuR, durante un período de tiempo suficiente para que se pueda formar un complejo este ARNm y la proteína objetivo, por ejemplo la proteína HuR, c) detectar el complejo formado en el paso b), d) determinar si hay una diferencia en la cantidad de complejo formado en el caso de que un compuesto candidato estuviera ausente o presente en el paso b), y e) seleccionar un compuesto candidato en donde se determine una diferencia en el paso d) como un agente. El principio de ensayo se puede describir como sigue (por ejemplo, como se da en la Figura 1): el ARNm se marca, por ejemplo, con Cy3 en el extremo 3' mediante la química de enlace de hidrazina-aldehído. Después del enlace de una proteína objetivo con el ARNm marcado, cambia la cantidad de rendimiento de la marca, por ejemplo Cy3, por ejemplo, aumenta, y este cambio proporciona una lectura para la interacción del ARNm con una proteína objetivo. Este efecto aparentemente no involucra contactos directos entre la proteína y la marca, y se observa reproduciblemente inclusive para los ARNms con proteína objetivo, por ejemplo HuR, que se enlazan con sitios distantes de la marca 3'-terminal. Actualmente concluimos que esto puede ser ocasionado por un cambio en la conformación tridimensional del ARN después de la formación del complejo con la proteína objetivo, traducido a través de los efectos de rango largo, y atribuido a la sensibilidad ambiental de una marca, por ejemplo Cy3 (véase, por ejemplo, Mujumdar R. B. y colaboradores, Bioconj. Chem. 1993, 4(2) 105-11). La formación de complejo de proteína-ARNm reducida atribuida a un inhibidor potencial se detectará como una disminución en la lectura, por ejemplo la intensidad de fluorescencia total, o un número de partículas reducido de las especies con más alta brillantez molecular. En una modalidad preferida, una proteína objetivo es una proteína HuR. El ARNm puede ser un ARNm que contenga ARE, e incluye, por ejemplo, objetivos inflamatorios, incluyendo AREs a partir de TNF-a, IL-1 ß, IL-2, IL-8, Cox-2, IL-4 ó AT-R1, pero también otras familias objetivo reguladas por ARE. Por ejemplo, los proto-oncogenes como c-myc, c-jun, ó c-fos. En otro aspecto de la presente invención, el ARNm se selecciona a partir del grupo que consiste en las secuencias que codifican I L-2, I L-1 ß, y TNF-a, o fragmentos que contengan un ARE de estas secuencias. En otro aspecto de la presente invención, el ARNm tiene una longitud de entre 100 y 500 nucleótidos, de preferencia de 300 nucleótidos. La marca puede ser una convencional, por ejemplo biotina, o una enzima tal como fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de radícula roja (HRP), o peroxidasa (POD), o una molécula fluorescente, por ejemplo un tinte fluorescente. De preferencia, la marca es un tinte fluorescente, tal como, por ejemplo, Cy3 ó Cy5, por ejemplo Cy3. En un aspecto preferido de la presente invención, la marca es una marca fluorescente, por ejemplo Cy3 ó Cy5. La proteína objetivo puede ser cualquier proteína conocida que se enlace con el ARNm, en donde este enlace provoque cambios en la conformación tridimensional del ARN. En otro aspecto de la presente invención, la proteína objetivo es ELAVL1 (=HuR), que se enlaza con el ARN que contiene ARE. Para detectar el complejo formado, se pueden emplear medios de detección. Estos medios de detección incluyen aquéllos convencionales en el campo de los ensayos, tales como, por ejemplo, mediciones de detección de fluorescencia. Los medios de detección utilizados en la presente invención comprenden moléculas que reconocen el ARNm marcado. Utilizando, por ejemplo, el método de detección de fluorescencia confocal dependiente de la intensidad unidimensional FIDA (Análisis de Distribución de Intensidad de Fluorescencia), se puede seguir directamente el enlace de una proteína objetivo, por ejemplo de HuR, con sus ARNms objetivo, y en solución homogénea de una manera independiente del tamaño. En otro aspecto de la presente invención, el complejo se detecta mediante la medición de la intensidad de fluorescencia. Opcionalmente, un complejo formado se puede separar de las fracciones que no formen complejo. La separación se puede llevar a cabo de acuerdo con, por ejemplo de una manera análoga a, los métodos convencionales, por ejemplo cromatográficamente, por ejemplo cromatografía por exclusión de tamaños. Un compuesto candidato incluye compuestos (bibliotecas) a partir de los cuales se pueda determinar su efecto modulador sobre la interacción de un ARNm con una proteína objetivo. Los compuestos (bibliotecas) incluyen, por ejemplo, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, anticuerpos, miméticos, moléculas pequeñas, por ejemplo compuestos de bajo peso molecular (LMWs). Un agente es un compuesto que tiene influencia (inhibe) sobre la interacción de un ARNm con una proteína objetivo, por ejemplo detectada, en el paso d), en un ensayo proporcionado por la presente invención. Un agente es uno de los compuestos candidatos seleccionados, y puede incluir oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, anticuerpos, miméticos, moléculas pequeñas, por ejemplo compuestos de bajo peso molecular (LMWs). Un agente incluye uno o más agentes, por ejemplo una combinación de agentes.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ensayo de la presente invención para el rastreo de alta producción. En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit, el cual comprende: un ARNm marcado, por ejemplo marcado con fluorescencia, una proteína objetivo, instrucciones para utilizar este kit, y opcionalmente un compuesto candidato. Este kit proporcionado por la presente invención puede comprender además un componente sustancial que incluya un medio ambiente apropiado de una muestra que se vaya a probar, y, por ejemplo, elementos apropiados para determinar el efecto de un compuesto candidato en una muestra que se vaya a probar. La presente invención se refiere además a compuestos orgánicos identificados mediante el ensayo de rastreo descrito anteriormente. En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula: en donde: Ri es alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono) sustituido por arilo (de 6 a 18 átomos de carbono) insustituido o sustituido, o heterociclilo que tiene 5 ó 6 miembros del anillo y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en N, O, y s, R2 es alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono) sustituido por hidroxilo, carbonilo, amino, o arílo (de 6 a 18 átomos de carbono) insustituido o sustituido, o arilo (de 6 a 18 átomos de carbono) insustituido o sustituido, y R3 es arilo (de 6 a 18 átomos de carbono) insustítuido o sustituido, o heterociclilo que tiene 5 ó 6 miembros del anillo y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en N, O, y S. En un aspecto preferido, en un compuesto de la Fórmula I, Rt es alquilo (de 1 a 3 átomos de carbono) sustituido por fenilo insustituido o sustituido o heterociclilo que tiene 5 miembros del anillo y N como un heteroátomo, R2 es alquilo (de 1 a 2 átomos de carbono) sustituido por hidroxilo, carboxilo, amino, o fenilo insustituido o sustituido, o fenilo insustituido o sustituido, y R3 es fenilo insustituido o sustituido o heterociclilo que tiene 5 ó 6 miembros del anillo y N como un heteroátomo. En otro aspecto preferido, en un compuesto de la Fórmula I, RT es metilo sustituido por p-metil-fenilo ó n-propilo sustituido por 1-pirrolidin-2-ona, R2 es metilo sustituido por carboxilo, metilo sustituido por p-metil-fenílo, metilo sustituido por 1 H-indol-3-ilo, etilo sustituido por hidroxilo, etilo sustituido por amino ó p-metil-fenilo, y R3 es un compuesto de la Fórmula: en donde: R4 es 1-piperidina ó 1-(p-amino-carbonil)-piperidina, R5 es metoxi-etilo, bencilo, o (p-metoxi-fenil)-etilo, o un compuesto de la Fórmula: en donde: R6 es p-fenilo ó m-piridina, y R7 es metilo sustituido por m-metoxi-fenilo ó 1-amino-carbonil-2-hidroxi-propilo. Si no se define de otra manera en la presente, alquilo incluye alquilo (de 1 a 8 átomos de carbono), por ejemplo alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono). Arilo incluye arilo (de 6 a 18 átomos de carbono), por ejemplo fenilo. Heterociclilo incluye un anillo de 5 ó 6 miembros que tiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir de S, O, y N; por ejemplo N; tal como, por ejemplo, piperidina, piridina, y pirrolidina, opcionalmente templado con un (sistema de) anillo adicional, por ejemplo templado con un anillo de fenilo; por ejemplo templado con un anillo de heterociclilo. Alquilo, arilo, y heterociclilo incluyen alquilo, arilo, o heterociclilo insustituidos o sustituidos, por ejemplo sustituidos por grupos que son convencionales en la química orgánica. Amino incluye amina insustituida y sustituida, por ejemplo alquil- y dialquil-amina. En un compuesto de la Fórmula I, cada sustituyente individual definido puede ser un sustituyente preferido, por ejemplo independientemente de cada otro sustituyente definido. En todavía otro aspecto, la presente ¡nvención proporciona un compuesto de la Fórmula I: en donde: a) Ri es N-propilo sustituido por 1-pirrolidin-2-ona, R2 es etilo sustituido por amino, y R3 es un compuesto de la Fórmula: b) Ri es metilo sustituido por p-metil-fenilo, R2 es etilo sustituido por amino, y R3 es un compuesto de la Fórmula: c) Ri es metilo sustituido por p-metil-fenilo, R2 es metilo sustituido por p-amino-metil-fenilo, y R3 es un compuesto como se define en b), d) Ri es N-propilo sustituido por 1-pirrolidin-2-ona, R2 es etilo sustituido por hidroxilo, y R3 es un compuesto de la Fórmula: e) RT es n-propilo sustituido por 1-pirrolidín-2-ona, R2 es metilo sustituido por carboxilo, y R3 es un compuesto de la Fórmula: f) Ri es n-propilo sustituido por 1-pirrolidin-2-ona, R2 es metilo sustituido por 1 H-indol-3-ilo, y R3 es un compuesto de la Fórmula: g) Ri es n-propilo sustituido por 1 -pirrolidin-2-ona, R2 es metilo sustituido por p-metil-fenilo, y R3 es un compuesto como se define en f) . Los compuestos proporcionados por la presente invención son designados posteriormente en la presente como los "compuestos de (de acuerdo con) la presente invención". Un compuesto de la presente invención incluye un compuesto en cualquier forma, por ejemplo, en forma libre, en la forma de una sal, en la forma de un solvato, y en la forma de una sal y un solvato. En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención en la forma de una sal. Estas sales incluyen de preferencia las sales farmacéuticamente aceptables, aunque se incluyen las sales farmacéuticamente inaceptables, por ejemplo para propósitos de preparación/aislamíento/purificación. Una sal de un compuesto de la presente invención incluye una sal de metal o una sal de adición de ácido. Las sales de metales incluyen, por ejemplo, las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos; las sales de adición de ácido incluyen las sales de un compuesto de la Fórmula I con un ácido, por ejemplo ácido fumárico de hidrógeno, ácido fumárico, ácido naftalin-1 ,5-sulfónico, ácido clorh ídrico, ácido deuteroclórico; de preferencia ácido clorh ídrico. Un compuesto de la presente invención en forma libre se puede convertir a un compuesto correspondiente en la forma de una sal; y viceversa. Un compuesto de la presente invención en forma libre o en la forma de una sal y en la forma de un solvato, se puede convertir hasta un compuesto correspondiente en forma libre o en la forma de una sal en una forma no solvatada; y viceversa. Un compuesto de la presente invención puede existir en la forma de isómeros puros o mezclas de los mismos; por ejemplo isómeros ópticos, diaestereoísómeros, isómeros cis/trans. Un compuesto de la presente invención, por ejemplo, puede contener átomos de carbono asimétricos, y por lo tanto, puede existir en la forma de enantiómeros o diaestereoisómeros y mezclas de los mismos, por ejemplo racematos. Cualquier átomo de carbono asimétrico puede estar presente en la configuración (R), (S), ó (R,S), de preferencia en la configuración (R) ó (S). Las mezclas isoméricas se pueden separar como sea apropiado, por ejemplo de acuerdo con, por ejemplo de una manera análoga a, un método convencional, para obtener los isómeros puros. La presente invención incluye un compuesto de la presente invención en cualquier forma isomérica y en cualquier mezcla isomérica. La presente invención también incluye tautómeros de un compuesto de la Fórmula I, en donde puedan existir tautómeros. En otro aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la producción de un compuesto de la Fórmula I, en donde: R3 es un compuesto de la Fórmula lll, el cual comprende los pasos de: lllb en donde R1t R2l R6, y R7 son como se definen anteriormente, para obtener un compuesto de la Fórmula I, y aislar un compuesto de la Fórmula I obtenido a partir de la mezcla de reacción, o R3 es un compuesto de la Fórmula II, el cual comprende los pasos de: Illa lia Rf Resina- enlazador He en donde R^ R2, R4, y R5 son como se definen anteriormente, para obtener un compuesto de la Fórmula I, y aislar un compuesto de la Fórmula I obtenido a partir de la mezcla de reacción. En un intermediario de la Fórmula Illa, lllb, lia, llb, ó Me (materiales de partida), los grupos funcionales, si están presentes, opcionalmente pueden estar en una forma protegida o en la forma de una sal, si está presente un grupo formador de sal. Los grupos protectores, opcionalmente presentes, se pueden remover en una etapa apropiada, por ejemplo de acuerdo con, por ejemplo de una manera análoga a, un método convencional. Por lo tanto, un compuesto de la Fórmula I obtenido se puede convertir en otro compuesto de la Fórmula I, por ejemplo, o un compuesto de la Fórmula I obtenido en forma libre se puede convertir en una sal de un compuesto de la Fórmula I, y viceversa. Los intermediarios (materiales de partida) de la Fórmula Illa, lllb, lia, llb, ó Me, son conocidos o se pueden preparar de acuerdo con, por ejemplo de una manera análoga a, un método convencional, o como se describe en la presente. Cualquier compuesto descrito en la presente, por ejemplo un compuesto de la presente invención, y los intermediarios de la Fórmula Illa, lllb, lia, llb, ó Me, se pueden preparar como sea apropiado, por ejemplo de acuerdo con, por ejemplo de una manera análoga a, un método convencional, por ejemplo, o como se especifica en la presente. En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la presente invención como un inhibidor de la formación de complejo de un ARNm que contiene ARE y una proteína objetivo, por ejem plo una proteína HuR. En un aspecto preferido, el ARN m que contiene ARE se selecciona a partir del g rupo que consiste en I L-2 , I L-1 ß, y TNF-a. Los compuestos de la presente invención, por ejemplo incluyendo un compuesto de la Fórmula I , exhiben una actividad farmacológica, y por consiguiente, son útiles como productos farmacéuticos. En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención para utilizarse como un producto farmacéutico. Para uso farmacéutico, un compuesto de la presente invención incluye uno o más, de preferencia un compuesto de la presente invención , por ejemplo una combinación de dos o más compuestos de la presente invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente invención en asociación con cuando menos un excipiente farmacéutico, por ejemplo un veh ículo y/o diluyente apropiado, por ejemplo incluyendo rellenos, aglutinantes, desintegrantes, acondicionadores de flujo, lubricantes, azúcares, y edulcorantes, fragancias, conservadores, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica, y/o reguladores del pH . En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, la cual comprende además otro agente farmacéuticamente activo. Estas composiciones se pueden fabricar de acuerdo con, por ejemplo de una manera análoga a, un método convencional, por ejemplo, mediante procesos de mezcla, granulación, recubrimiento, disolución, o liofilización. Las formas de dosificación unitaria pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 0.5 miligramos a aproximadamente 1,000 miligramos, tal como de 1 miligramo a aproximadamente 500 miligramos. En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la presente invención para la fabricación de un medicamento, por ejemplo una composición farmacéutica, para el tratamiento de un trastorno que tenga una etiología asociada con la producción de una sustancia seleccionada a partir del grupo que consiste en citoquina, factor de crecimiento, proto-oncogén, o una proteína viral, de preferencia el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-8, GM-CSF, TNF-a, VEGF, AT-R1, Cox-2, c-fos, y c-myc. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de tratamiento de un trastorno que tenga una etiología asociada con la producción de una sustancia seleccionada a partir del grupo que consiste en citoquina, factor de crecimiento, proto-oncogén, o una proteína viral, de preferencia el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en IL-1, IL-2, I L-3, IL-4, IL-8, GM-CSF, TNF-a, VEGF, AT-R1, Cox-2, c-fos, y c-myc, cuyo tratamiento comprende administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención; por ejemplo en la forma de una composición farmacéutica. El tratamiento incluye el tratamiento y la profilaxis. Para este tratamiento, la dosificación apropiada, desde luego, variará dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza química y de los datos farmacocinéticos de un compuesto de la presente invención empleado, del huésped individual, del modo de administración, y de la naturaleza y severidad de las condiciones que se estén tratando.

Sin embargo, en general, para tener resultados satisfactorios en los mamíferos superiores, por ejemplo en los seres humanos, una dosificación diaria indicada está en el intervalo de aproximadamente 0.01 gramos a aproximadamente 1.0 gramos de un compuesto de la presente invención; convenientemente administrados, por ejemplo, en dosis divididas hasta cuatro veces al día. Un compuesto de la presente invención se puede administrar por cualquier vía convencional, por ejemplo enteralmente, por ejemplo incluyendo la administración nasal, bucal, rectal, u oral; parenteralmente, por ejemplo incluyendo la administración intravenosa, intramuscular, o subcutánea; o tópicamente; por ejemplo incluyendo la administración epicutánea, intranasal, e intratraqueal; por ejemplo en la forma de tabletas recubiertas o no recubiertas, cápsulas, soluciones o suspensiones inyectables, por ejemplo en la forma de ampolletas, frascos, en la forma de cremas, geles, pastas, polvo para inhalador, espumas, tinturas, barras labiales, gotas, aerosoles, o en la forma de supositorios.

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo una sal de adición de ácido o una sal de metal; o en forma libre; opcionalmente en la forma de un solvato. Los compuestos de la presente invención en la forma de una sal exhiben el mismo orden de actividad que los compuestos de la presente invención en forma libre; opcionalmente en la forma de un solvato. Un compuesto de la presente invención se puede utilizar para el tratamiento farmacéutico de acuerdo con la presente invención, solo o en combinación con uno o más agentes farmacéuticamente activos diferentes. Las combinaciones incluyen combinaciones fijas, en donde dos o más agentes farmacéuticamente activos están en la misma formulación; kits, en donde dos o más agentes farmacéuticamente activos en formulaciones separadas se venden en el mismo paquete, por ejemplo con instrucciones para su co-administración; y combinaciones libres, en donde los agentes farmacéuticamente activos se empacan por separado, pero se dan instrucciones para su administración simultánea o en secuencia. Descripción de las Figuras Figura 1: Principio de ensayo (esquemáticamente). Después del enlace de la proteína con el ARNm marcado, por ejemplo marcado con Cy3 (aquí: marca 3'-terminal), aumenta el rendimiento de quantum de la marca sensible al medio ambiente, por ejemplo Cy3. Este aumento es detectable como un incremento en la lectura apropiada, tal como, por ejemplo, la brillantez molecular, mediante el algoritmo FIDA, o, por ejemplo, como un aumento de intensidad de fluorescencia total, utilizando una lectura de promedio de ensamble. Este efecto se observa igualmente para los sitios de enlace de proteínas proximales (A) o distantes (B) a la marca, por ejemplo la marca Cy3, con la secuencia de ARNm. Figura 2: Curvas de enlace de ARNm-proteína del ensayo FIDA de Cy3 de ejemplo. Se muestran curvas de enlace de ejemplo para la interacción de HuRp con las 3'UTRs (= regiones no traducidas) 3'-terminalmente marcadas con Cy3 de IL-2(A), IL-ß(B), y TNF-a(C). Las constantes de disociación (Kd) se determinan de acuerdo con la ecuación 1, como se da más adelante en los Ejemplos. Para excluir la interacción no específica de HuR con Cy3, se lleva a cabo un control negativo con el tinte libre (D). La brillantez molecular de Cy3 permanece también sin cambios después de la titulación de la 3'UTR de I L-2 con BSA (= albúmina de suero bovino) como la proteína de control (E). La concentración del ARN 3'-termínalmente marcado con Cy3 es de 0.5 nM en todos los experimentos. El ARN 5S, que no contiene ningún sitio de enlace de HuR, está presente en 100 nM en todas las muestras, como el ARN competidor no específico. Sin embargo, se registran curvas de enlace casi idénticas en ausencia de cualquier ARN competidor (mostradas para la 3'UTR de TNF-a, (F)). Figura 3: Transcripciones de ARN para los experimentos de enlace mostrados en la Figura 2.

Las transcripciones in vitro de las 3'UTRs de I L-2, IL-1ß, y TNF-a humanos (GenBank, Números de Acceso NM_000589, NM_000576 Y NM_000594; posiciones 707-1035, 897-1490, y 872- 1568, respectivamente) están 3'-terminalmente marcadas con Cy3.

Aunque los sitios de enlace de HuR (mostrados en azul) son de una proximidad diferente (secuencia) a la marca 3'-terminal, se observa consistentemente el aumento de rendimiento de quantum de Cy3 después del enlace de la proteína. En los siguientes Ejemplos, todas las temperaturas están en grados centígrados, y no están corregidas. Se utilizan las siguientes abreviaturas: BSA Albúmina de suero bovino. Cy3 Tinte de fluorescencia. FCS Espectroscopia de correlación de fluorescencia. FIDA Análisis de distribución de intensidad de fluorescencia.

HuRfi Proteína HuR de longitud completa. HuR?,2 Variante acortada de HuRf|. OD Densidad óptica. PBS Suero regulado con fosfato. RP-HPLC Cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa. rt Temperatura ambiente. CONA Nano-exploración confocal. DMF Dimetil-formamida. HuR12 Una variante acortada de HuR.

TMR 5'-carb oxi -tetra metil- rodamina. rt Temperatura ambiente. EJEMPLOS: A/ Ensayo de rastreo: Los ARNms transcritos in vitro se marcan 3'-terminalmente con Cy3 activada por hidrazida (Amersham Biosciences) siguiendo los protocolos convencionales (por ejemplo, Qin P. Z. y colaboradores, Methods 1999; 18(1):60-70). El ARN marcado se purifica mediante RP-HPLC. Una estequiometría de 1:1 se controla mediante espectroscopia UV/VIS. El ARNm marcado con Cy3 se desnaturaliza térmicamente durante 2 minutos a 80°C en regulador de ensayo (suero regulado con fosfato, 0.1 por ciento (peso/volumen) Pluronic F-127, MgCI25 mM), y se repliega enfriando a temperatura ambiente a un gradiente de -0.13° s"1. La concentración final del ARN marcado en cada muestra es de 0.5 nM, lo cual asegura un promedio de <1 partículas fluorescentes en el volumen confocal en el establecimiento descrito más adelante. La concentración precisa de cada muestra se determina basándose en el número de partículas derivado a partir de una evaluación de FCS paralela y el tamaño del volumen confocal, como se da por los parámetros de ajuste para la función de extensión de puntos. El ARN fluorescentemente marcado se titula contra concentraciones crecientes de HuRf, recombinante o HuR1 2. La formación de complejo de HuR-ARNm se monitorea bajo condiciones de verdadero equilibrio mediante la determinación de la brillantez molecular con 1D-FIDA (por ejemplo, Kask P. y colaboradores, Introduction to the theory of fluorescence intensity distribution analysis. FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY: THEORY AND APPLICATIONS 65 PG. 396-409. 2001 [Figuras]-409; Kask P. y colaboradores, Fluorescence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96[24], 13756-13761. 23-11-1999). De una manera alternativa, la intensidad de fluorescencia de Cy3 se puede medir empleando los métodos convencionales de detección de promedio de ensamble, por ejemplo, lectores de placas de fluorescencia. Las mediciones FIDA se llevan a cabo en placas de microtitulación de fondo de vidrio de 96 ó de 384 pozos (Whatman) en un instrumento EvotecOAl PickoScreen 3 a temperatura ambiente (constante a 23.5°C). El instrumento basado en microscopio IX70 invertido Olympus está equipado con dos detectores de fluorescencia, un espejo dicroico en la senda de excitación de fluorescencia. Se utiliza un dispositivo de láser de HeNe (? = 543 nanómetros, potencia de láser = 478 µW) para la excitación de fluorescencia. La luz de láser de excitación se bloquea de la trayectoria de detección óptica mediante un filtro de barrera de interferencia con una OD = 5. Se utiliza Cy3 ó TMR en regulador de ensayo (c = 0.5 nM) para el ajuste del orificio confocal (70 mieras). La señal 1D-FIDA se promedia a partir de 20 mediciones consecutivas (de 10 segundos cada una). Sigue el análisis de los datos brutos con el algoritmo FIDA para extraer: (a) la brillantez molecular promedio equivalente a una medición de promedio de ensamble convencional, o (b) las concentraciones en equilibrio de los componentes individuales (ARNm libre contra el complejo) con su brillantez molecular respectiva. Los datos de brillantez molecular se ajustan mediante regresión de mínimos cuadrados no lineal (GraFit 5.0.3, software Erithacus, Londres), para extraer la constante de disociación en equilibrio Kd, utilizando la solución algebraica exacta de la ecuación de enlace derivada a partir de la ley de la acción de masa, que describe: (a) la señal en estado continuo promedio q dependiendo del grado de formación de complejo (1:1), determinada por la constante de disociación Kd.

Ecuación 1 en donde [mRNA0]: concentración total de ARN, [HuRp]: concentración total de HuR, qmin: brillantez molecular del ARN libre; qma?: brillantez molecular del complejo de ARN-HuR; q: brillantez molecular promedio para el equilibrio en estado continuo en las concentraciones dadas de HuR0 y ARN0; (b) concentraciones en equilibrio del ARNm libre y enlazado con proteína ([mRNA|ibre] y [mRNA-HuR], respectivamente, directamente suministradas por el análisis FIDA) determinadas mediante la constante de disociación Kd. 4 ~ [m NA-HuR] Ecuación 2 Las curvas de enlace de ejemplo para la interacción entre HuR y los ARNms objetivo marcados con Cy3 individuales se ilustran en la Figura 2 (todos los datos presentados son promedios de 20 mediciones de FIDA individuales, y son representativos para cuando menos tres experimentos independientes). Para resumir, el presente ensayo proporciona un planteamiento novedoso para monitorear las interacciones de ARNm-proteína (reguladoras) en solución homogénea. El ensayo combina las ventajas de las condiciones de verdadero equilibrio con la alta sensibilidad de detección y precisión , y es adecuado para rastrear los inhibidores potenciales o los moduladores de la interacción en un rastreo de alta producción . Con el gran número de objetivos relevantes para la enfermedad post-transcripcionalmente regulados, el ensayo descrito servirá como una base para la intervención terapéutica en cáncer, enfermedad inflamatoria, viral o alérgica, basándose en un planteamiento novedoso de dirección al ARN. B) Métodos analíticos: a) HPLC: Para las separaciones analíticas, se utiliza un sistema de HPLC Abimed (D-langenfeld) consistente en dos unidades de bomba 306, un módulo de cámara de mezcla dinámica 81 1 C, un módulo de presión manométrica 805, un detector de UV, UV/VIS 155, y un auto-inyector 234. La separación se lleva a cabo en una columna analítica GromSil150 ODS-5 ST (3 mieras, 120 x 2 milímetros), fabricada por Grom (D-Herrenberg). Se utiliza un gradiente de H2O/ácido trifluoro-acético al 0.1 por ciento (volumen/volumen) (eluyente A) y acetonitrilo/ácido trifluoro-acético al 0.1 por ciento (volumen/volumen) (eluyente B) con una velocidad de flujo de 0.4 mililitros/minuto. Se miden las trazas de UV a ? = 214 y ? = 305 nanómetros, respectivamente. La pureza de los productos se asigna con base en las áreas pico determinadas en ? = 214 nanómetros. b) ES-MS: El análisis ES-MS se lleva a cabo en un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple Micromass (Altrinchan/UK) Quattro II, con una bomba de relleno Waters (D-Eschborn) 515 (flujo isocrático de 60 microlítros/minuto de acetonitrilo/agua, 1:1, conteniendo ácido fórmico al 0.1 por ciento), y un auto-muestreador Abimed (D- Langenfeld) Gilson 232X. c) LC-MS: El análisis LC-MS se lleva a cabo en un espectrómetro de masas Waters-Micromass (D-Eschborn) ZQ con un módulo de separación de sistema de HPLC 2790 Alliance HT, y un Detector de Arreglo de Diodo 996. Se utiliza una columna analítica GromSil120 ODS-5 ST (3 mieras, 60 x 2 milímetros) fabricada por Grom (D-Herrenberg). Se utiliza un gradiente de H2O/ácido trifluoroacético al 0.1 por ciento (volumen/volumen) (eluyente A) y acetonitrilo/ácido trifluoro-acético al 0.1 por ciento (volumen/volumen) (eluyente B) con una velocidad de flujo de 0.6 mililitros/minuto. d) HPLC de preparación: Para las separaciones de preparación, se utiliza un sistema de HPLC Abimed (D-Langenfeld) 1014, consistente en una unidad de bomba 322, un detector de UV, UV/VIS 151 (? = 305 nanómetros), y un Manejador de Líquidos Gilson 215. La separación se lleva a cabo en una columna de preparación Purospher RP18 (5 mieras, 125 x 25 milímetros) fabricada por Merck (D-Darmstadt). Se utiliza un gradiente de H2O/ácido trifluoro-acético al 0.1 por ciento (volumen/volumen) (eluyente A) y acetonitrilo/ácido trifluoro-acético al 0.1 por ciento (volumen/volumen) (eluyente B) con una velocidad de flujo de 30 mililitros/minuto. Ejemplos 1 a 3: La síntesis de los compuestos 1 a 3 se lleva a cabo de acuerdo con el Esquema 1. ESQUEMA 1 Ba.ß 7a-a, e»b R r rX? i 1) Desprotección j| 2) Foto-disociación y A?' v* r" R4 t366""1' -?vv 1*« a) Carga de soporte sólido con enlazador. 4.2 gramos de TentaGelMR S NH2-resina 1 (capacidad de carga = 0.25 milimoles/gramo) se lavan previamente con dimetil-formamida (20 mililitros, cuatro veces). Se disuelven 0.82 gramos de ácido 4-bromo-metíl-3-nitro-benzoico 2 y 0.482 gramos de HOBt*H2O en 60 mililitros de dimetil-formamida al 8 por ciento en dicloro-metano (volumen/volumen). Se agregan 487 microlitros de DIC. Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, la solución obtenida se transfiere a la TentaGelMR S H2O-resina 1 previamente lavada. La mezcla obtenida se agita a temperatura ambiente durante 19 horas. La resina 3 obtenida se filtra, se lava con dimetilformamida (50 mililitros, seis veces), dicloro-metano (50 mililitros, seis veces), y MeOH (50 mililitros, seis veces), y se seca bajo presión reducida. La terminación de la reacción se verifica mediante una prueba de ninhidrína-Kaiser negativa. b) Reacciones de la resina 3 con las aminas primarias 4a, 4b. A 3.18 gramos de la resina 3 en 20 mililitros de sulfóxido de dimetilo, se les agregan 2.133 gramos de 1-(3-amino-propil)-pirrolidin-2-ona (4a). A 1.27 gramos de la resina 3 en 10 mililitros de sulfóxido de dimetilo, se les agregan 0.73 gramos de 4-metil-bencil-amina (4b). Las mezclas obtenidas se agitan durante 3 horas a temperatura ambiente. Las resinas 5a y 5b obtenidas se filtran, se lavan con sulfóxido de dimetilo (6 mililitros, tres veces), dimetilformamida (6 mililitros, seis veces), dicloro-metano (6 mililitros, seis veces), MeOH (6 mililitros, seis veces), y se secan bajo presión reducida. Las pruebas de cloranil son positivas. c) Acoplamiento de los aminoácidos protegidos 6a-f sobre las resinas 5a-b y disociación del grupo protector de N(a) (Fmoc). 0.65 gramos de la resina 5a se dividen en 5 alícuotas. 0.65 gramos de la resina 5b se dividen en dos porciones iguales. 0.45 milimoies de cada uno de los aminoácidos N-protegidos 6a-f (6a: ácido N(a)-Fmoc-N(?)-Boc-1-2,4-diamino-butírico, dos veces; 6b: Fmoc-(OTrt)-L-homoserina; 6c: Fmoc-Asp(OtBu)-OH; 6d: Fmoc-Trp(Boc)-OH; 6e: Fmoc-L-4-MePhe-OH; 6f: Fmoc-L-(4-Boc-amino-metil)Phe-OH, se disuelven cada uno en soluciones de 5 mililitros de dimetil-formamída, 93 microlitros de DIC, y 92 miligramos de HOBt*H2O. Las soluciones obtenidas se agitan durante 30 minutos a temperatura ambiente. La solución del 6a activado obtenida se divide en dos porciones iguales. Las porciones se transfieren a una alícuota de la resina 5a y la resina 5b, para dar las resinas protegidas por cadenas laterales 7a y 8a, respectivamente. Las soluciones de los 6b-e activados obtenidas se transfieren a las alícuotas restantes de la resina 5a, para dar las resinas protegidas 7b-e. La solución que contiene el 6f se transfiere a la segunda alícuota de la resina 5b, para dar la resina protegida 8b. Después de agitar durante 16.5 horas a temperatura ambiente, las resinas obtenidas se filtran y se lavan con dimetil-formamida (10 mililitros, nueve veces), dicloro-metano ( 10 mililitros, seis veces), y MeOH (10 mililitros, seis veces). Las resinas completamente protegidas 7a-e y 8a-b obtenidas se secan bajo presión reducida. Todas las pruebas de cloranil son negativas. Se agrega una alícuota (5 mililitros) de una solución de suministro de piperidina en dimetil-formamida (400 mililitros, 1 /1 , volumen/volumen) a cada 0.66 gramos de las resinas protegidas 7a-e y 8a-b para la disociación del grupo protector de N(a)-Fmoc. Las mezclas obtenidas se agitan durante 30 minutos. Las resinas desprotegidas 7a-e, 8a-b obtenidas se filtran y se someten a lavados repetidos con dimetil-formamida (25 mililitros, nueve veces), diclorometano (25 mililitros, seis veces), y MeOH (25 mililitros, seis veces). Las resinas obtenidas se secan bajo presión reducida. Las pruebas de ninhidrina-Kaiser son positivas. d) Síntesis de los compuestos 14a-c que contienen sub-estructuras de ácido dicarboxílico simétrico.

Acoplamiento de los ácidos dicarboxílicos simétricos 9a y 9b sobre las resinas desprotegidas con Fmoc 7a y 8a-b. El ácido dicarboxílico simétrico 9 (9a: ácido piridin-2,6-dicarboxílico; 9b: ácido tereftálico, dos veces; 1.5 milimoies, cada uno) se disuelve en una solución de 115 miligramos de HOBt*H2O, 485 miligramos de DIEA, y 95 miligramos de DIC en 5 mililitros de dimetil-formamida. La solución del 9a obtenida se agrega a la resina 7a, para dar la resina 10a. Las soluciones de las dos alícuotas del 9b obtenidas se agregan a las resinas 8a y 8b, para dar las resinas 10b y 10c, respectivamente. Después de agitar durante 20 horas a temperatura ambiente, las resinas 10a-c obtenidas, se filtran, se lavan con dimetil-formamida (20 mililitros, nueve veces), diclorometano (10 mililitros, seis veces), dietil-éter (10 mililitros, seis veces), y se secan bajo presión reducida. Las pruebas de ninhidrina-Kaiser de todas las muestras de resina son negativas. e) Acoplamiento de las mono-amidas de ácido dicarboxílico enlazadas con resina 10a-c con la amida de aminoácido 11 y la amina primaria 12. Una solución de 339 miligramos de trifluoro-acetato de pentafluoro-fenilo, y 242 microlitros de piridina en 5 mililitros de NMP, se agrega a cada 650 miligramos de las resinas 10a-c. Las mezclas obtenidas se agitan durante 2.5 horas a temperatura ambiente. Las resinas obtenidas se filtran y se lavan con NMP (5 mililitros, diez veces). Se disuelven 298 miligramos de la amida de L-treonina (O-Trt)-protegida (11), en una solución de 20.3 miligramos de HOBt anhidro y 3 milimoies de DIEA en 3.0 mililitros de NMP, y se agregan a 650 miligramos de la resina previamente activada 10a, para dar la resina 13a. 182 miligramos de la 3-metoxi-bencil-amina (12) se disuelven en una solución de 40.6 miligramos de HOBt anhidro y 1.5 milimoies de DIEA, en 6.0 miligramos de NMP. La solución obtenida se divide en dos alícuotas, las cuales se agregan a las resinas previamente activadas 10b y 10c para dar las resinas 13b y 13c, respectivamente. Las mezclas obtenidas se agitan durante 14.5 horas a temperatura ambiente. Las resinas obtenidas se filtran, se lavan con NMP (10 mililitros, seis veces), dimetil-formamida (10 mililitros, seis veces), dicloro-metano (10 mililitros, seis veces), y MeOH (10 mililitros, seis veces), y se secan bajo presión reducida. f) Disociación del grupo protector de Boc a partir de las cadenas laterales de los aminoácidos 6. 5 mililitros de una solución de ácido trifluoro-acétíco al 50 por ciento en dicloro-metano (volumen/volumen) se agregan a 650 miligramos de cada una de las resinas 13a-c. Las mezclas obtenidas se agitan durante 2 horas a temperatura ambiente. Las resinas obtenidas se filtran, se lavan con ácido trifluoro-acético al 20 por ciento en dicloro-metano (volumen/volumen, 5 mililitros, tres veces), dimetil-formamida (10 mililitros, seis veces), dicloro-metano (10 mililitros, seis veces), y EtOH absoluto (10 mililitros, seis veces), y se secan bajo presión reducida. g) Disociación de los compuestos finales 14a-c a partir de las resinas 13a-c. 5 mililitros de MeOH + ácido trifluoro-acético al 1 por ciento (volumen/volumen) se agregan a cada una de las resinas desprotegidas 13a-c. Los frascos de vidrio que contienen la resina se colocan en un portador de plástico para la fotolisis. La fotolisis se lleva a cabo a 366 nanómetros durante 90 minutos con agitación en un Stratagene, UV StratalinerMR 1800 equipado con una lámpara de 8W NEC Blacklight T5, FL8BI. La cámara se enfría durante la foto-disociación con una corriente de aire comprimido. Los materiales de resina obtenidos se filtran y se lavan con dicloro-metano (5 mililitros, dos veces). El solvente de los filtrados obtenidos se evapora. Los materiales crudos se pueden someter adicionalmente a purificación mediante HPLC de preparación. Ejemplo 1 : Se obtiene la 6-[(1-carbamoil-2-hidroxi-propil)-amida] de 2-({3-amino-1-[3-(2-oxo-pirrolidin-1-il)-propil-carbamoil]-propil-amida) del ácido piridin-2,6-dicarboxílico. Peso molecular = 491.5552 Tiempo de retención: 3.8 minutos. LC-MS [M + H] + : 492. Ejemplo 2: Se obtiene la N-[3-amino-1 -(4-metil-bencil-carbamoil)-propil]-N'-(3-metoxi-bencil)-tereftalamida. Peso molecular = 488.592 Tiempo de retención: 8.29 minutos. LC-MS [M + H] + : 489.

Ejemplo 3: Se obtiene la N-[2-(4-amino-metil-fenil)-1-(4-metil-bencil-carbamoil)-etil]-N'-(3-metoxi-bencil)- tereftalamida. Peso molecular = 564.69 Tiempo de retención: 8.46 minutos. LC-MS [M + H] + : 565. Ejemplos 4 a 7: La síntesis de los compuestos 4 a 7 se lleva a cabo de acuerdo con el Esquema 2. ESQUEMA 2 22a-d 23B-Ú a) Acetoacetilación de las resinas 7b-e. Las resinas N(a)-desprotegidas 7b-e se colocan en jeringas de 5 mililitros. 359 miligramos de acetoacetato de N-hidroxi-succinimídilo 15 se disuelven en 17.0 mililitros de dicloro-metano. Se agregan 310 miligramos de DIEA, y se transfieren alícuotas de 4 mililitros de la solución de suministro a cada jeringa de 650 miligramos de cada una de las resinas 7b-e. Después de agitar durante 5 horas a temperatura ambiente, las resinas acetoacetiladas 16a-d obtenidas se filtran, se lavan con dicloro-metano (5 mililitros, tres veces), dimetil-formamida (5 mililitros, seis veces), diclorometano (5 mililitros, seis veces), y MeOH (5 mililitros, seis veces), y se secan. Las pruebas de ninhidrina-Kaiser son negativas. b) Reacción de las resinas 16a-d con las aminas primarias 17a-c (formación de enaminona). 5 mililitros de una solución de suministro de tetrahidrofurano y TMOF (1/1, volumen/volumen) se agregan a 650 miligramos de cada una de las resinas 16a-d. Se agregan 1.5 milimoies de cada una de las aminas primarias 17a-c (17a: 2-metoxi-etil-amina para reaccionar con la resina 16a; 17b: 2-(3-metoxi-fenil)-etil-amina para reaccionar con la resina 16b, dos veces; 17c: bencil-amina para reaccionar con las resinas 16c y 16d, respectivamente, y las mezclas obtenidas se agitan durante 18 horas a temperatura ambiente. Las resinas 18a-d obtenidas se filtran, se lavan con THF/TMOF (1/1, volumen/volumen) (6 mililitros, tres veces), dimetil-formamida (6 mililitros, seis veces), dicloro-metano (6 mililitros, seis veces), y MeOH (6 mililitros, seis veces), y se secan. c) Síntesis de pirrol a partir de las enaminonas enlazadas con resina 18a-d, con 1 ,4-dibromo-2,3-butanodiona 19. 230 miligramos de 2,6-diterbutil-piridina, y 292 miligramos de 1 ,4-dibromo-2,3-butanodiona 19, se disuelven en 24 mililitros de dioxano, para dar una solución de suministro. Se agregan alícuotas de la solución de suministro obtenida (6 mililitros/resina) a 650 miligramos de cada una de las resinas 18a-d. Las mezclas obtenidas se agitan durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Las resinas 20a-d obtenidas se filtran, se lavan con dioxano (6 mililitros, seis veces), dimetil-formamida (6 mililitros, seis veces), tetrahidrofurano (6 mililitros, seis veces), y dicloro-metano (6 mililitros, seis veces). d) Sustitución de los bromo-acetil-pirroles enlazados con resina 20a-d con las aminas secundarias 21a y 21b. Se agregan 192 miligramos de cada una de las aminas secundarias 21 (21a: piperidina-4-carboxamida para reaccionar con 128 miligramos de la resina 20a, 21b: piperidina para reaccionar con 128 gramos de las resinas 20b-d), y sulfóxido de dimetilo (6 mililitros, cuatro veces), a 650 miligramos de cada una de las resinas 20a-d. Las mezclas obtenidas se agitan durante 15.5 horas a temperatura ambiente. Las resinas 22a-d obtenidas se filtran, se lavan con sulfóxido de dimetilo (1 mililitro, tres veces), dimetilformamida (1 mililitro, seis veces), dicloro-metano (1 mililitro, seis veces), y MeOH (1 mililitro, seis veces), y se secan. e) Disociación de los grupos protectores a partir de las cadenas laterales de los aminoácidos 6 (resinas 22a-c). Se agregan 5 mililitros de una solución de ácido trifluoroacético al 20 por ciento en dicloro-metano (volumen/volumen) a cada una de las resinas 22a-c, para remover los grupos protectores de la cadena lateral sobre R2 (Trt, t-Bu, Boc). Las mezclas obtenidas se agitan durante 1 hora a temperatura ambiente. Las resinas desprotegidas 22a-c obtenidas se filtran, se lavan con ácido trifluoroacético al 20 por ciento en dicloro-metano (volumen/volumen, 1 mililitro, tres veces), dimetil-formamida (2 mililitros, seis veces), dicloro-metano (2 mililitros, seis veces), EtOH (2 mililitros, seis veces), y éter (2 mililitros, tres veces), y se secan, f) Disociación de los compuestos finales 26a-d a partir de las resinas 22a-d. Se agregan 5 mililitros de metanol ácido, y ácido trifluoroacético al 1 por ciento por volumen/volumen, a cada una de las resinas desprotegidas 22a-c y la resina no tratada con ácido trifluoro-acético 22d. Los frascos de vidrio se colocan en un portador de plástico. La fotolisis se lleva a cabo bajo agitación e irradiación a 366 nanómetros durante 90 minutos en un Stratagene® UV Strataliner™ 1800 equipado con una lámpara de 8W NEC Blacklight T5, FL8BI. La cámara se enfría durante la foto-disociación con una corriente de aire comprimido. Los materiales de resina obtenidos se filtran y se lavan con dicloro-metano (5 mililitros, dos veces). El solvente de los filtrados combinados obtenidos se evapora. Los materiales crudos de los compuestos se pueden someter adicionalmente a purificación mediante HPLC de preparación. Ejemplo 4: Se obtiene la amida del ácido 1-{2-[4-{3-hidroxi-1-[3-(2-oxo-pirrolidin-1-il)-propil-carbamoil]-propil-carbamoil}-1-(2-mettoxi- etil)-5-metil-1H-pirrol-2-il]-2-oxo-etil}-piperidin-4-carboxílóco. Peso molecular = 576.699. Tiempo de retención: 2.24 minutos. LC-MS [M + H]+: 577. Ejemplo 5: Se obtiene el ácido 3-{[1-[2-(3-metoxi-fenil)-etil]-2-metil-5-(2-piperidin-1-il-acetil)-1H-pirrol-3-carbonil]-amino}-N-[3-(2-oxo-pirrolidin-1 -il)-propil]-succinámico. Peso molecular = 623.756. Tiempo de retención: 7.59 minutos. LC-MS [M + H]+: 624. Ejemplo 6: Se obtiene la {2-(1 H-¡ndol-3-il)-1-[3-(2-oxo-pirrolid¡n-1-il)-propil-carbamoil]-etil}-amida del ácido 1-bencil-2-metil-5-(2-pipe?ridin-1 -il-acetil)-1H-pirrol-3-carboxílico. Peso molecular = 650.828. Tiempo de retención: 8.248 minutos. LC-MS [M + H] + : 651. Ejemplo 7: Se obtiene la {1 -[3-(2-oxo-pirrolidin-1 -il)-propil-carbamoil]-2-p-tolil-etil}-amida del ácido 1-bencil-2-metil-5-(2-piper«d??p-1-il-acetil)-1H-pirrol-3-carboxílico. Peso molecular = 625.818. Tiempo de retención: 8.44 minutos. LC-MS [M + H] + : 626.

Ejemplo 8: Identificación de inhibidores moleculares pequeños de la regulación de la estabilidad del ARNm asociada con HuR. Con el fin de identificar los inhibidores moleculares pequeños de la regulación de la estabilidad del ARNm asociada con HuR, se llevan a cabo tres rastreos de HT de complemento diferentes: (1) Un ensayo de gen reportero celular con luciferasa de luciérnaga bajo el control del elemento de I L-2 ó TNF-a, rico en AU. Este ensayo se diseña para identificar los inhibidores no tóxicos celularmente activos de la estabilización del ARNm mediada por ARE. Los impactos confirmados se prueban en un ensayo de control con la SDS de luciferasa bajo el promotor de IL-2 ó TNF-a para excluir los compuestos que actúen al nivel de la transcripción. Por definición, los compuestos de impacto identificados interfieren con la estabilización posterior a la transcripción de los ARNms de ARE de vida corta hasta algún nivel a lo largo de la senda de ARE. (2) Rastreo in vitro para los inhibidores de HuR-ARE utilizando espectroscopia de fluctuación confocal. Este ensayo utiliza 2D-FIDA para monitorear el enlace de HuR12, una variante acortada de HuR, con un ARN de ARE marcado con TMR en solución. Se supone que los compuestos identificados en este rastreo interfieren con el reconocimiento de HuR-ARE por el enlace ya sea con ARE o bien con HuR?2. (3) CONA con HuR. Se rastrean bibliotecas de combinación sobre perlas para determinar los enlazadores de HuR de alta afinidad con CONA. Después de recoger las perlas de impacto, y de disociar los enlazadores sobre las perlas del soporte sólido, se descodifican las estructuras de los compuestos mediante µHPLC-MS. El enlace de los compuestos de impacto re-sintetizados para HuR se prueba en solución. Como el resultado primario, los compuestos identificados representan los enlazadores de HuR de alta afinidad. Funcionalmente, éstos pueden ser inhibidores de cualquier actividad de HuR, incluyendo el reconocimiento de ARE, el lanzamiento nucleocitoplásmico, y la protección del ARNm de la degradación dependiente de ARE. La fracción de ARN enlazada y se calcula a partir de los datos de anisotropía basados en y = (r-rm?n)J((r-rm?n)+0(rmax-r)) con r = anisotropía medida, rm?n, rmax = anisotropía del ARN libre y enlazado con HuR, respectivamente, Q = apagado. Las constantes de disociación Kd se determinan mediante ajuste de curva no lineal con KMat en Mathematica 5.0.0, asumiendo una inhibición competitiva estequiométrica de 1:1:1. Tabla 1. Inhibidores de HuR Las constantes de disociación para los compuestos se determ inan basándose en los experimentos de competición con el ARN de ARE enlazándose a Hu Rf|.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un ensayo para identificar un agente que module la interacción de un ARNm con una proteína objetivo, el cual comprende: a) proporcionar un ARNm marcado que tenga una longitud de cuando menos 100 nucleótidos, opcionalmente como una solución homogénea, cuya marca sea una sustancia sensible a los cambios en el medio circundante del ARNm, b) poner en contacto una proteína objetivo con el ARNm proporcionado en el paso a) en ausencia y en la presencia de un compuesto candidato que se espere que module la interacción de este ARNm con la proteína objetivo durante un período de tiempo suficiente para que se pueda formar un complejo entre dicho ARNm y la proteína objetivo, c) detectar el complejo formado en el paso b), d) determinar si hay una diferencia en la cantidad de complejo formado en el caso de que un compuesto candidato estuviera ausente o presente en el paso b), y e) seleccionar un compuesto candidato en donde se determine una diferencia en el paso d) como un agente.

2. El ensayo de la reivindicación 1, en donde la marca es un tinte de fluorescencia, por ejemplo Cy3 ó Cy5.

3. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el complejo se detecta mediante la medición de la intensidad de fluorescencia.

4. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína objetivo es la proteína HuR.

5. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ARNm se selecciona a partir del grupo que consiste en IL-2, IL-ß, y TNF-a.

6. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ARNm tiene una longitud de entre 100 y 500 nucleótidos, de preferencia de 300 nucleótidos.

7. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para el rastreo de alta producción.

8. Un kit, el cual comprende: un ARNm marcado, por ejemplo marcado con fluorescencia, una proteína objetivo, instrucciones para utilizar este kit, y opcionalmente un compuesto candidato.

9. Un compuesto de la Fórmula: en donde: R es alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono) sustituido por arilo (de 6 a 18 átomos de carbono) insustituido o sustituido, o heterociclilo que tiene 5 ó 6 miembros del anillo y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en N, O, y s, R2 es alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono) sustituido por hidroxilo, carbonilo, amino, o arilo (de 6 a 18 átomos de carbono) insustituido o sustituido, o arilo (de 6 a 18 átomos de carbono) insustituido o sustituido, y R3 es arilo (de 6 a 18 átomos de carbono) insustituido o sustituido, o heterociclilo que tiene 5 ó 6 miembros del anillo y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en N, O, y S.

10. Un compuesto de la reivindicación 9, en donde: R es alquilo (de 1 a 3 átomos de carbono) sustituido por fenilo insustituido o sustituido o heterociclilo que tiene 5 miembros del anillo y N como un heteroátomo, R2 es alquilo (de 1 a 2 átomos de carbono) sustituido por hidroxilo, carboxilo, amino, o fenilo insustituido o sustituido, o fenilo insustituido o sustituido, y R3 es fenilo insustituido o sustituido o heterociclilo que tiene 5 ó 6 miembros del anillo y N como un heteroátomo.

11. Un compuesto de la Fórmula I, de cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en donde: Rt es metilo sustituido por p-metil-fenilo ó n-propilo sustituido por 1-pirrolidin-2-ona, R2 es metilo sustituido por carboxilo, metilo sustituido por p-metil-fenilo, metilo sustituido por 1 H-indol-3-ilo, etilo sustituido por hidroxilo, etilo sustituido por amino ó p-metil-fenilo, y R3 es un compuesto de la Fórmula: en donde: R4 es 1-piperidina ó 1-(p-amino-carbonil)-piperidina, R5 es metoxi-etilo, bencilo, o (p-metoxi-fenil)-etilo, o un compuesto de la Fórmula: en donde: R6 es p-fenilo ó m-piridina, y R7 es metilo sustituido por m-metoxi-fenilo ó 1-amino-carbonil-2-hidroxi-propilo.

12. Un compuesto de la Fórmula: en donde: a) RT es N-propilo sustituido por 1-pirrolidin-2-ona, R2 es etilo sustituido por amino, y R3 es un compuesto de la Fórmula: b) Ri es metilo sustituido por p-metil-fenilo, R2 es etilo sustituido por amino, y R3 es un compuesto de la Fórmula: c) RT es metilo sustituido por p-metil-fenilo, R2 es metilo sustituido por p-amino-metil-fenilo, y R3 es un compuesto como se define en b), d) Ri es N-propilo sustituido por 1-pirrolidin-2-ona, R2 es etilo sustituido por hidroxilo, y R3 es un compuesto de la Fórmula: e) R? es n-propilo sustituido por 1-pirrolidin-2-ona, R2 es metilo sustituido por carboxilo, y R3 es un compuesto de la Fórmula: f) RT es n-propilo sustituido por 1-pirrolidin-2-ona, R2 es metilo sustituido por 1 H-indol-3-ilo, y R3 es un compuesto de la Fórmula: g) Ri es n-propilo sustituido por 1-pirrolidin-2-ona, R2 es metilo sustituido por p-metil-fenilo, y R3 es un compuesto como se define en f).

13. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la forma de una sal.

14. El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, como un inhibidor de la formación de complejo de un ARNm que contiene ARE y una proteína objetivo.

15. El uso de la reivindicación 14, en donde la proteína objetivo es HuR.

16. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para utilizarse como un producto farmacéutico.

17. El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno que tenga una etiología asociada con la producción de una sustancia seleccionada a partir del grupo que consiste en citoquina, factor de crecimiento, proto-oncogén, o una proteína viral, de preferencia el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-8, GM-CSF, TNF-a, VEGF, AT-R1, Cox-2, c-fos, y c-myc.

18. Una composición farmacéutica, la cual comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en asociación con cuando menos un excipiente farmacéutico.

19. Una composición farmacéutica de la reivindicación 18, la cual comprende además otro agente farmacéuticamente activo.

20. Un método de tratamiento de un trastorno que tenga una etiología asociada con la producción de una sustancia seleccionada a partir del grupo que consiste en citoquina, factor de crecimiento, proto-oncogén, o una proteína viral, de preferencia el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en IL-1, I L-2, I L-3, I L-4, IL-8, GM-CSF, TNF-a, VEGF, AT-R1, Cox-2, c-fos, y c-myc, cuyo tratamiento comprende administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13.

21. Un método de la reivindicación 20, en donde se administra un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en combinación con otro agente farmacéuticamente activo, ya sea de una manera simultánea o en secuencia.