JP2005529590A - ARE含有mRNAとHuRタンパク質の結合のインヒビターの同定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)HuRタンパク質の可溶性形を用意すること(ただし、全長HuR・グルタチオンSトランスフェラーゼ融合タンパク質は除外される)、
(b)ARE含有mRNAを用意すること、
(c)候補化合物を用意すること、
(ここで、(a)、(b)、および(c)の少なくとも1つが、標識されている)、
(d)(a)および(b)を、(c)の存在下および(c)の非存在下で、(a)および(b)が複合体を形成するのに十分な時間、混合すること、
(e)段階(d)で形成された複合体の量を検出すること、および/または非複合体形成mRNA/タンパク質種を検出すること、
(f)形成された複合体の量および/または見出された非複合体形成mRNA/タンパク質種を、(c)の存在下と非存在下で比較すること、および
(g)段階(f)で検出された複合体形成に影響する薬物を選択すること、
を含む。
溶媒は、水性溶媒、例えば、緩衝溶液、例えば、水性生理緩衝溶液を含む。
ARE含有mRNA、またはmRNAフラグメントは、合成方法、または試験管内転写により製造される。mRNAフラグメントの合成製造のため、オリゴヌクレオチドが、例えば、通常の補法に従い(例えば、類似して)(例えば、(保護)ホスホラミダイト、および適当な溶媒中の結合試薬の使用により)、合成される。より長いフラグメントは、好ましくは、試験管内転写により、製造される。好ましくは、ARE含有mRNAフラグメントは、5から80ヌクレオチド長を有する。
別の態様において、従って、本発明は、HuRの結合部位である単離RNA配列モティーフを提供する。
薬物は、複合体形成に対する影響が証明されたため、選択された候補化合物の1つである。
a)HuRタンパク質の可溶性形(ただし、全長HuR・グルタチオンSトランスフェラーゼ融合タンパク質は除外される)、
b)ARE含有mRNA、および
c)必要に応じて、該ARE含有mRNAと該HuRタンパク質間で形成された複合体の量、および/または非複合体形成mRNA/タンパク質種の量を検出する手段、
を含む。
医薬としての使用のため、薬物は、1以上の薬物、例えば、薬物の組合せを含む。
処置は、処置および予防を含む。
全長ヒトHuRの可溶性形(=sfl−HuR)
アミノ酸1〜326を包含する(=配列番号:1)か、または位置1のアミノ酸Mのない(=配列番号:2)、組換え全長ヒトHuR:
MSNGYEDHMAEDCRGDIGRTNLIVNYLPQNMTQDELRSLFSSIGEVESAKLIRDKVAGHSLGYGFVNYVTAKDAERAINTLNGLRLQSKTIKVSYARPSSEVIKDANLYISGLPRTMTQKDVEDMFSRFGRIINSRVLVDQTTGLSRGVAFIRFDKRSEAEEAITSFNGHKPPGSSEPIAVKFAANPNQNKNVALLSQLYHSPARRFGGPVHHQAQRFRFSPMGVDHMSGLSGVNVPGNASSGWCIFIYNLGQDADEGILWQMFGPFGAVTNVKVIRDFNTNKCKGFGFVTMTNYEEAAMAIASLNGYRLGDKILQVSFKTNKSHK326
の調製を、IMPACT[登録商標]−CNシステム(New England Biolabs)を用いて、次のように行った。
活性化ヒトTリンパ球、ならびにヒト単球由来樹状細胞から調製したcDNAライブラリーから、全長ヒトHuRをPCR増幅し、ベクターpTXB1およびpTYB1(New England Biolabs)のNdeIとSapI部位向きでクローン化し、これにより、さらにアミノ酸を挿入することなく、インテインCBDタグとのC末端融合が可能となる。
活性化ヒトTリンパ球由来のポリ(A)+RNA、およびLPS刺激性単球由来樹状細胞のポリ(A)+RNAのcDNAを、Thermoscript[登録商標]RT−PCRシステム(GIBCO/LIFE TECHNOLOGIES)を用いて、両RNA供給源から調製する。生じたcDNAを、ヒトHuRのPCR増幅のために用いる。
ベクターpTXB1およびpTYB1のNdeIとSapI制限酵素部位向きにクローン化するための適当な制限酵素部位を含有するオーバーハングを有する、完全コード配列(CDS)(アミノ酸1〜326を包含)フランキングプライマーを設計する。
フォワードプライマー:5’−GGAGGAGGAGGCATATGTCTAATGGTTATGAAGACCACAT−3’
リバースプライマー:5’−AAATAATGCTCTTCCGCATTTGTGGGACTTGTTGGTTTTG−3’
下線のヌクレオチドは、向き指定のクローニングのため、PCR産物に付加した制限酵素部位を示す。
アガロースゲルスライスから、NucleoSpin Extract 2in1 Kit(Machery&Nagel)を用いて、製造元のプロトコールに従い、試料を抽出する。
PCR後、増幅物の配列を自動DNAシークエンサーにより確認する。それぞれのcDNA供給源由来の、2つのPCR試料のDNA配列を分析する。ABI PRISM[登録商標]BigDye[登録商標]Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE APPLIED BIOSYSTEMS)を用いて、製造元のプロトコールに従い、配列決定反応を行う。キャピラリー電気泳動を、ABI[登録商標] PRISM 310 GENETIC ANALYZER(PE APPLIED BIOSYSTEMS)で、標準的プロトコールに従い行う。データをABI[登録商標]PRISM 310ソフトウエア(PE APPLIED BIOSYSTEMS)で処理する。
両cDNA供給源由来のPCR産物、およびベクターpTXB1およびpTYB1をNdeIおよびSapIで2重切断後、ベクターDNAおよびPCR産物を、製造的アガロースSGE(スラブゲル電気泳動)により、分離する。適当なサイズ(pTXB1/NdeI−SapIについては6458bp;pTYB1/NdeI−SapIについては7426bp;PCR産物については985bp)のバンドを、トランスイルミネーション下、Dark Reader(480nm)上で滅菌済みのメスで切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて、製造元のプロトコールに従い抽出する。LKB Biochrom II分光光度計にて、50μlのUV石英セル(LKB Biochrom Ultrospec UV石英セル、P/N 4001-088)を用いて、260nmでのUV吸収を測定することにより、溶出したDNAを定量する。
1:1および3:1(インサート:ベクター)モル比で、両cDNA供給源由来のNdeI/SapI切断PCR産物を、T4DNAリガーゼにより、ベクターpTXB1およびpTYB1にライゲーションし、プラスミドpTXB1/HuRおよびpTYB1/HuRをそれぞれ得る。
化学的なコンピテント細胞のヒートショック形質転換のための標準的プロトコールから若干変更した条件を用いて、ライゲーション反応液由来のプラスミドpTXB1/HuRおよびpTYB1/HuR(両cDNA供給源由来のHuRインサート)で、自家製CaCl2コンピテント細胞(E.coliER2566)を形質転換する。形質転換細菌をLB−Ampプレートにまき、コロニーを37℃で一晩成長させる。シングルコロニーをピックアップし、対数増殖期後期まで液体培地中で成長させる。回収した細菌細胞から、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を用いて、製造元のプロトコールに従い、組換えプラスミドDNAを単離し、NdeIでの制限酵素切断、対それぞれ、NdeIかつPstI(pTXB1/HuRに対して)またはNdeIかつKpnI(pTYB1/HuRに対して)での2重切断により、正しいインサートサイズの存在についてチェックする。
LBブロス培地中で対数増殖期後期まで成長した、細菌培養液への1mM IPTGの添加により、クローン化HuR−インテイン−CBD融合タンパク質の発現を誘導し、28℃で6時間おく。20mM Tris/Cl(pH8.0)、800mM NaCl、1mM EDTA、および0.2% Pluronic F-127(Molecular Probes)緩衝液中での連続凍結/解凍サイクルにより、該細菌細胞を溶解する。DNA切断後、細菌ライセートを超遠心分離法により透明にし、該融合タンパク質を、CBDによるキチンアガロースビーズ(New England Biolabs)上で捕獲する。溶解緩衝液でビーズを広範囲に洗浄した後、Na−2−MESNAを添加し(最終濃度50mM)、そして4℃で12時間インキュベーションすることで、チオール誘導性カラム上でのインテインのセルフスプライスにより、該組換えタンパク質を回収する。任意の同時に溶出した、インテインタグおよび非切断融合タンパク質を、第2の親和性減少段階での溶出物から取り出す。最後に、該タンパク質を、標的緩衝液(25mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH7.2)、800mM NaCl、0.2%(w/v)Pluronic F-127)で事前に平衡化した、ゲル濾過カラム(DG-10、Bio-Rad)により溶出し、適当な貯蔵緩衝液に移し、液体窒素中で少量ずつ瞬時に凍結し、−80℃で保存する。
変性SDS−PAGE、UV分光法、分析的サイズ排除クロマトグラフィー、RP−HPLC分析法、LC/ESI−MS分析法、およびCD分光法により、実施例2に記載の標準的プロトコールに従い精製タンパク質の質をコントロールする。記載の条件で、全長HuRは、例えば、グルタチオンSトランスフェラーゼの様な親水性融合タグを必要とすることなく、溶解する。UV分光法の結果は、330nmより上での吸収は示さず、かつ分析的サイズ排除クロマトグラフィー(HuRは、24.2kDを最大とするシグナルピークとして溶出する)は、該タンパク質の高凝集状態は所定の緩衝液濃度で存在しないという証拠を提供する。
配列番号:1の最初の2つのRRMのみ(配列番号:1のアミノ酸1〜189=配列番号:3)または配列番号:1のアミノ酸2〜189(=配列番号:4)を包含するHuR変異体(HuR12)
上記のアミノ酸を包含するヒトHuRの短い可溶性変異体を、IMPACT−TWINシステム(New England Biolabs)を用いて、制限酵素部位NdeIおよびSapIの向きにクローニングすることにより調製する。最近の研究において、該最初の2つのフラグメントを、効率的RNA結合に重要かつ十分であると同定し、そして関係タンパク質(HuD、Sxl)に関する匹敵する発見は、ほぼ、該短い構造物がリガンド結合での十分な特異性を保つという結論を導く。可溶性組換えタンパク質を、細菌培養液から調製する。
クローニングを実施例1に記載のように行うが、アミノ酸1〜189由来のヒトHuR(以下、HuR12として言及する)の完全コード配列フランキングプライマーを適宜設計する。
E.coliER2566−pTWIN1/HuR12を、組換えヒトHuR12の大スケール精製のための発現システムとして用いる。培養を実施例1に記載のように行う。IPTGによる発現の誘導の際の粗細菌細胞ライセートのSDS−PAGE分析は、クローン化HuR12−Mxe−インテイン−CBD融合タンパク質の予測サイズに対応する、〜48kDの新生タンパク質を現す。
c)精製
アフィニティークロマトグラフィーを、実施例1に記載のように行う。
HuR12の製造的HPLC−精製
第2のキチンカラムから溶出した溶液を、製造的RP−HPLCによりさらに精製する。概略、溶液中の全タンパク質濃度を、Bradfordタンパク質アッセイ(Bio-Rad)を用いて、製造元のプロトコールに従い評価する。それぞれの製造的実施において、タンパク質1から5mgに対応する量を、DeltaPak[登録商標]C4、15μm、300Å、250×10mm RP−HPLCカラム(WATERS)に注入する。溶出を、100% A(5%(v/v) CH3CN/H2O、0.1% TFA)から100% B(95%(v/v) CH3CN/H2O、0.1% TFA)の直線的勾配、50分間、一定流速10ml/分で行う。230nmでのUV吸収、およびλex=280nm/λem=340nmでの蛍光を測定することにより、検出を行う。HuR12は、典型的には、〜60% B(〜59%(v/v) CH3CNに対応)により溶出する。分画3mlを集め、変性非還元SDS−PAGEにより分析し、HuR12含有分画を集める。溶液を最終的に液体N2中で容器凍結し、タンパク質を−59℃、0.005mbarで36時間凍結乾燥する。凍結乾燥HuR12含有フラスコをアルゴンで洗い流し、連続する精製段階のため−20℃で貯蔵する。
凍結乾燥HuR12(理論的pI=7.84)を、イオン交換カラム上でリホールディングする。概略、それぞれのクロマトグラフィーの実施に対して、凍結乾燥HuR12 1〜1.5mgをアルゴン下で計量し、8M 尿素含有50mM NaH2PO3/Na2HPO3緩衝液(pH5.50)に溶解し、そして、SセファロースFF(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH)でパックした10mm(内径)×90mmカラムのベッドに直接添加する。LKB−LCC 500装置にカラムを装着後、タンパク質を、増加NaCl濃度の勾配で溶出する。勾配中、分画1mlを集める。等量を変性非還元SDS−PAGEにかけ、タンパク質バンドを銀染色で可視化する。HuR12は典型的には、濃度250mMおよび350mM NaCl(最大値は、285mM NaClのとき)で溶出する。HuR12含有分画を集め、因子5によるAMICON CENTRIPREPS(YM−3、MWCO=3000Da)での遠心により濃縮し、貯蔵緩衝液(25mM NaH2PO3/Na2HPO3、300mM NaCl、1mM EDTA、pH6.00)で透析し、液体窒素中、小滴で瞬時に凍結し、−80℃で貯蔵する。
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
精製HuR12 30μgを、Zorbax DuPont GF-250、9.4mm(内径)×25cmカラム(HP、P/N 884973901)に注入し、貯蔵緩衝液(25mM NaH2PO3/Na2HPO3、300mM NaCl、1mM EDTA、pH6.00)で、一定流速1ml/分、一定組成で溶出する。280nmでのUV吸収、および連続的に配置した2つの検出器でのλex=280nmおよびλem=340nm(ゲイン=10、、減衰=8)での蛍光を測定することにより、検出を行う。試料の保持時間を、同一条件のサイズ検量線から得たクロマトグラムと比較する。HuR12は、最大ピーク20.41kD(ベース範囲=8.33kD〜36.14kD)のシグナルピークとして溶出し、これは、該タンパク質の高い凝集状態がないことが、所定の緩衝液濃度で推定され得るという証拠を提供する。
凍結乾燥HuR12 500pmolを、N末端のEdman配列分析(タンパク質配列決定機HP−G1000A)にかける。試料は、予測アミノ酸配列(SNGYEDHMAEDCRGDIGRTN)を生じる同種N末端を示すが、N末端Metを量的に欠く。配列分析から測定した試料の純度は97%より高い。
凍結乾燥HuR12 500ngを、LC−ESI/TOF(液体クロマトグラフィーイオン化/フライト時間)質量分析にかける。MS−スペクトルは、4つの主なピークを生じる。
A...20849.5Da (<5%)
B...20974.3Da,=A+124.9Da (>95%)
S位置2NGYEDHMAEDCRGDIGRTNLIVNYLPQNMTQDELRSLFSSIGEVESAKLIRDKVAGHSLGYGFVNYVTAKDAERAINTLNGLRLQSKTIKVSYARPSSEVIKDANLYISGLPRTMTQKDVEDMFSRFGRIINSRVLVDQTTGLSRGVAFIRFDKRSEAEEAITSFNGHKPPGSSEPITVKFAANPNQ189の予想質量に正確に対応する。Bの質量は、同一アミノ酸配列に対応するが、C末端2−MESNA−チオエステルを有する。
精製タンパク質500ngを、変性還元SDS−PAGEにかけ、次に、標準的半乾燥条件を用いて、PVDF膜にタンパク質バンドを移す。1次抗体としてマウスモノクローナル抗HuR 19F12(N末端ペプチドに対して生じたもの、MOLECULAR PROBES)、2次抗体としてHRP結合ヤギ抗マウスIgG(H+L)(PIERCE)を用いて、タンパク質バンドを検出し、HRP基質(ECL[登録商標]ウエスタンブロッティング検出キット、AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH)とインキュベーション後、X線フィルムにブロットを曝露して、可視化する。展開フィルムは、HuR12(21kD)のバンドに対応するサイズの抗HuR抗体の強力シグナル、およびHuR2量体の存在を示す、約42kDに対応するバンドの弱シグナルを現す。試料中の少量のHuR12 3量体を示す、より弱いシグナルを〜70kDのサイズで検出する。
精製方法後のタンパク質ホールディング、ならびに蛍光標識をCD−分光法によりモニターする。集めたデータは、上記のように精製したHuRをホールディングし、βシートおよびαらせん体含有量(〜30%)を有する第2の構造を示す。さらに連続する実験は、RNA結合の際の該タンパク質の第2の構造は、任意の相当な変化を鎮めないが、RNAの第2の構造での顕著な変化は、HuR12結合の際生じるという証拠を提供する。生じたタンパク質は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーおよび/またはUV分光法によりコントロールするように、例えば、分光法適合条件の生理的pHの水性緩衝液中での凝集および沈殿を示さず、かつ濃度>100μMを示す。
HuR12の蛍光標識
調製タンパク質HuR12の部位特異的蛍光標識については、既に先に記載したいくつかの方法に従い得る。1つの例として、マレイミド活性化蛍光ダイの2重結合とのチオール基の結合により、HuRのより短い変異体中の1システイン残基のみの存在(位置13)を部位特異的標識に理論的に適合させる。最も安定かつ上手く特徴付けるダイの1つとして、5−カルボキシ−TMR−マレイミドを選択し、HuR12と結合させる。
mRNAフラグメントの調製
HuR−mRNA結合と関係するRNA安定化の特異的過程を、分解の標的であるメッセンジャーの3’UTR中のシス作用配列エレメントによりコントロールする。該責任のあるエレメントは、5つの部分からなるAUUUAのいくつかの繰り返しの存在を本質的に特徴とする、AおよびUのリッチな配列(AUリッチエレメント、AREと命名)である。特徴として、これらを、大抵、オーバーラップする9つからなるUUAUUUAUUの形のUのリッチな領域内でクラスター形成する。該エレメントは、サイズ9から約100ntの範囲にあり、典型的には、化学合成に理論的に適した〜30ntの長さである。しかしながら、ARE単独の可能性のある生体内不安定化は、全3’UTRの環境内に取り込まれた同一AREのものより、顕著に弱いという証拠が存在する。従って、ARE自体だけでなく、興味あるメッセンジャーのARE周囲の増加するサイズのフラグメント、ならびに、可能な限り、全長3’UTRは本発明のアッセイコンセプトで適用可能であろう。
RNA ORNを、それぞれ、5’−O−ジメトキシトリチル−2’O−tBdMS−保護β−シアノエチル−(N,N−ジイソプロピル−)ホスホラミダイト、または5’−O−ジメトキシトリチル−2’O−TOM−保護ntホスホラミダイト溶液[無水CH3CN中0.1M]、および2’−tBDMS、または2’−TOM−保護ntにより合成し、公開方法(例えば、Chaix C. et al., Nucleic Acids Symp Ser. 1989 (21) 45-6; Scaringe S.A. et al., Nucleic Acids Res. 1990 Sep.25; 18 (18):5433-41)、および製造元のプロトコールを適用し、1μmolのスケールでApplied Biosystem 394A合成機のCPG上に固定化する。15秒間おき、結合試薬を2カ所の連続する位置に添加する。結合段階のホスホラミダイトの活性化を、テトラゾール(無水CH3CN中0.5M)により行う。それぞれ、11分間(2’−tBdMS−保護nt−ホスホラミダイト用)または7分間(2’−TOM−保護nt−ホスホラミダイト用)の結合中、試薬溶液の0.1秒「アップおよびダウン」パルスにより、CPG支持体を定期的に攪拌する。無水酢酸/THFとの結合を20秒間、I2/THF/ピリジン/H2Oでの酸化を1分間、CH3CNでの洗浄段階を40秒間行う。ジメトキシトリチル脱保護を、3%(w/v) TCA/CH2Cl2により、40秒間4回、そして計反応時間5分間行う。6−(4−モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)ホスホラミダイトを、合成中のオリゴヌクレオチドの5’位置で、15分間、ルアー注射器送達により、アルゴン雰囲気下の活性化溶液200μlに直接溶解した試薬11μmolを用いて、手動で結合させる。溶解試薬を乾燥した注射器に引き入れ、針を除去後、カートリッジにより押し出し、別の注射器の第2のルアー濃度に近づける。15分間の結合時間中、2本の注射器の非同調的攪拌により、定期的に溶液を攪拌する。合成サイクルの残りの段階を、装置上で行う。アミノリンカー取り込みの効率を、収集脱トリエチル基溶液の色調強度に基づき、評価する。
支持体からの切断、塩基およびリン酸塩脱保護
1.0または0.5μmol スケール合成由来の粗RNA産物を、CPG支持体から切断し、飽和エタノール中のNH3により塩基およびリン酸塩脱保護する。40℃で17時間インキュベーション後、該支持体を集める。CPGをさらに、エタノールで3回洗浄し、次に、エタノール/H2O(1:1)およびH2Oで洗浄する。洗浄溶液を切断溶液と合併し、溶媒を蒸発させる。
粗ORNの2’脱保護のため、乾燥産物を、1.1M TBAF/THF溶液1.8mlに溶解し、ボルテックスミキサー上、RTで少なくとも15時間インキュベーションする。反応を、0.5M NH4Ac溶液400μlの添加により終結させ、氷上で10分間インキュベーションする。該溶液を、H2O1.4mlの添加により、最終濃度50%(v/v)まで希釈し、一部分、2.5ml以下まで蒸発させる。溶液を脱塩し、260nmでの吸収を測定することにより決定した、ORN含有分画を合併し、そして溶媒を蒸発させる。
RNA試料の乾燥分画をH2Oに溶解し、エタノールで沈殿させ、そして遠心によりペレット化する。該ペレットを乾燥させ、H2Oに溶解し、ゲルローディングバッファー(95%(v/v) 脱イオン化ホルムアミド、0.5mM EDTA、0.025%(v/v)キシレンシアノールブルー、0.025%(w/v) ブロモフェノールブルー、0.025%(w/v) SDS)と1:1希釈する。RNAを85℃で2分間変性し、氷上ですぐに冷却し、電気泳動する。試料を、変性12% ポリアクリルアミドゲル(6M 尿素、12%(w/v) アクリルアミド/ビスアクリルアミド(40:1)、Tris−ホウ酸−EDTAバッファー;400×200×1.5mm)の電気泳動により精製する。電気泳動を、45W(一定出力)で4時間、ブロムフェノールブルーが底方向の4/5まで移動するまで、行う。電気泳動後、ゲルをプレートから取り出し、サランラップで覆う。バンドを、254nm(携帯用UVランプ)で蛍光TLCプレートをUV照射することにより可視化し、Polaroid PoloPan 52 Iso400(Kodak UV Wrattenフィルター、f.3.5)により、20秒間撮影する。
主要産物のゲルスライスを切り出し、RNAをポリアクリルアミドゲルスライス(それを小片に切り、50mM NH4Acと共に、室温で少なくとも9時間インキュベーションすることにより)から抽出し、電気泳動する。さらに、Schleicher and Schuell Elutraps 100、少なくとも3×1時間30分間、200V(一定電圧)、TAE緩衝液中での電気泳動により、ゲル中の任意の残りのRNAを回収する。溶液を脱塩し、260nmでのUV吸収を測定することにより決定した、ORN含有分画を合併し、溶媒を蒸発させる。
HPLC分析を、UV検出装置(Beckman System Gold Programable Detection Mode)、および蛍光検出器(Waters[登録商標]471 Scanning Fluorescence Detector)の装着したBeckman System Gold機械(Beckman System Gold Programable Solvent Module)で行う。データ分析を、Beckman System Gold MDQソフトウエアにより行う。タンパク質/ペプチド精製カラム(すなわち、VYDAC[登録商標]Protein & Peptide Column(4.6×250mm、300Å−C18−5μ))上、100% 溶媒A(0.1M TEAAc、pH6.5/CH3CN、95:5)の5分間の洗浄段階、および100% 溶媒Aから100% 溶媒B[A(0.1M TEAAc、pH6.5/CH3CN、50:50]の連続的勾配による室温での45分間の溶出により、クロマトグラフィーを行う。分析的実施のため、精製RNA1.5から30μgを、85℃での2分間の変性し、氷上で5分間インキュベーションした後、注入する。
アッセイの実行
増加濃度の組換え全長HuRまたはHuR12の可溶性形に対して、例えば、IL−2、IL−4、IL−8、Cox−2、IL−1β、またはTNF−αのAREに対応する蛍光標識RNAフラグメント(カルボキシ−TMRにより5’末端標識し、そしてそれぞれ、33、58、26、35、33、および34nt長である)のタイトレーションを行う。HuR(分子量〜360912)またはHuR12(分子量〜20974)との複合体の遊離ORN(分子量約6000〜12000Da)についてのサイズ、およびそれ故異方性の予測増加は、異方性シグナルの変化が、必要な正確さで検出されるのに十分であることを示す。
ORNの蛍光標識
標識反応
蛍光ダイを5’末端リンカーと共に導入したアミノ基と、安定カルボキサミドの形成を導く、第1のアミンのスクシンイミジルエステル活性化分子との標準的反応により、結合させ得る。該目的上、H2O最大20μl中の精製RNA5〜10nmolを、0.5M Na2CO3/NaHCO3バッファー(pH9.0)ストック溶液と混合し、最終緩衝液濃度150〜300mMとする。1つの例として、TMR−NHS(5−カルボキシ−TMR−N−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステルエステル)を、アルゴン雰囲気下、無水DMSOに溶解し、RNAに添加して25倍Mを超えるものとするが、標識反応物中の最終DMSO濃度は、30%(v/v)を超えない。インキュベーションを、室温で少なくとも2時間、ライトから保護したボルテックスミキサー上で行う。非反応ダイを、1.5M NH2OH−HClの添加(50倍Mを超える)、および室温で30分間、ライトから保護したボルテックスミキサー上でのインキュベーションにより加水分解する。
標識後、RNAを遊離ダイから分離し、分画0.5mlを集め、上記のRP−HPLCにより分析する。260nmでのUV吸収、ならびに、TMRの励起/放出最大波長に対応する、λex=541nm、λex=567nmでの蛍光を測定することにより、標識および非標識RNAの検出、および遊離ダイの検出を行う。RNA含有分画を、類似の条件での製造的RP−HPLCによりさらに精製する。両標識および非標識RNAのピークを、先のとがったフラスコに別々に集め、該溶液量を、Rotavapor上で蒸発させて減少させりる。該溶液をエッペンドルフチューブに定量的に移し、H2O/エタノールと共に5〜7回、共蒸発させ、任意の残存TEAAcを除去する。乾燥RNAをH2Oに溶解し、濃度20〜50μMとし、さらなる使用のため−20℃で貯蔵する。
試験管内転写により調製したRNAフラグメント
a)DNA鋳型の調製
化学的に合成するには長すぎる、mRNAの3’UTRフラグメントの生化学的調製のため、第1の段階において、それぞれのmRNAの全長3’UTR(または対象領域)を含有する組換えプラスミドを入手する必要がある。該プラスミドは、次に、選択したサブフラグメントの試験管内転写の鋳型となる。ヒトIL−2、IL−1βの全長3’UTR、およびTNF−βの3’UTR由来の最初の600bpの鋳型を調製する。
完全コード配列、ならびにTNF−αの3’UTRの最初の600bpを含有する組換えプラスミドを、ATCC(American Type Culture Collection、#39918、構造物:pAW711)から購入する。
ヒトIL−2の全長3’UTRを含有する組換えプラスミドを、実施例1に記載の類似の方法に従い、調製する。概略、ヒトIL−2の全長3’UTRを、ヒトTリンパ球から調製したcDNAライブラリーから、ベクターLITMUS28(New England Biolabs)のKpnIおよびSpeI制限酵素部位の向きでクローン化するための適当な制限酵素部位を含有するオーバーハングを有するよう設計したプライマーで増幅する。PCR増幅およびベクターDNAを、制限酵素KpnIおよびSpeIで2重切断し、T4−DNAリガーゼでライゲーションし、標準的ヒートショックプロトコールを用いて、CaCl2コンピテントE.coli INVαF’に形質転換する。選択LB寒天プレートに播種後、組換えプラスミドDNA含有シングルコロニー(ブルー・ホワイトセレクションにより決定)をピックアップし、液体LB−Amp培地中で対数増殖期後期まで成長させる。3つのシングルコロニーから単離した組換えプラスミドの配列を、上記の自動DNA配列決定により確かめ、アラインメントし、ヒトIL−2の3’UTRに対して100%同一性とする(GenBank受託番号U25676)。
1つの例として、TNF−α 3’UTRの最初の697ntに対応する転写物を、次のように試験管内転写により調製する。5’末端のT7−RNAポリメラーゼに対するプロモーター配列を取り込んでいる、TNF−αの3’UTRのnt1〜697フランキングプライマーから、PCR産物を調製する。次に、流出転写物を、MEGASCRIPT T7試験管内転写キット(AMBION)を用いて、製造元のプロトコールに従い調製する。転写後、DNA鋳型を、RNAseフリーのDNAseIで切断し、そして混合物を、酸性フェノール・クロロホルムによる抽出段階を繰り返すことにより、さらに精製する。RNAをエタノールで沈殿させ、ヌクレアーゼフリーのH2Oに溶解し、−80℃で保存する。該産物を、可視化するためにエチジウムブロマイド染色したPAGEにより、さらに分析し、これは、1つのバンド移動を予測分子量にて現している。さらに、260nmでのUV吸収のRP−HPLC(実施例2参照)分析物は、従って、RNA転写物に対する単一ピークを示す。
HuR結合部位の推測
ポリUはHuRと高親和性で結合するという、我々の事前の知見に基づき、U8伸長の影響を試験した。個々のRNAフラグメントを合成し、全長HuRに対する親和性(Kd値として与える)を決定する(表2参照)。U8モチーフ(フラグメント番号1)の最も単純な変異体をHuRは認識しないが、1ヌクレオチド伸長U9(フラグメント番号2)は、十分に高い結合を示す。非標識RNAフラグメントとの競合的実験により、蛍光ダイの影響を排除する。9merのフラグメント(フラグメント番号3)は、HuDモチーフ、および3’末端にさらにヌクレオチドを含有するが、HuRと非結合である。しかしながら、フラグメント4の高親和性結合は、非Uヌクレオチドを、HuR結合モチーフ内ではなく、ある種の位置でのみ寛容することを示す。我々は、9ヌクレオチドが、HuRの結合にとって十分であることを見出し、そして(AUUU)3A内の4つの異なる9merのフレームを試験した(フラグメント番号4a)から4d)の太字を参照)。4つの対応するフラグメント内のHuRによる、フラグメント4bに限定した認識は、HuRが、(AUUU)3A内のフレーム2と結合することを示す。該フレームは、HuDモチーフと一致するが、1ウラシル残基が5’末端で伸長し、これが予備的結合モチーフNN(U/C)UNN(U/C)U(U/C)をしめす。フラグメント5、6、7a〜7d、および8a〜8cは、示した(太字および下線)位置で、それぞれ非ウラシル(A=アデニンにより証明する)およびCに対する寛容性試験となる。結果として、我々は、HuR配列結合モチーフがNNUUNNUUUであることを見出した。該相互作用は、絶対的な機序に従うようである。シングルミスマッチを有する配列を認識しないが、該モチーフを充足した配列と高親和性かつ不変Kd、Kd発見0.99nMで結合する。
Claims (10)
- ARE含有mRNAとHuRタンパク質との複合体形成に対する阻害作用を有する薬物を同定する方法であって、
(a)HuRタンパク質の可溶性形を用意すること(ただし、全長HuR・グルタチオンSトランスフェラーゼ融合タンパク質は除外される)、
(b)ARE含有mRNAを用意すること、
(c)候補化合物を用意すること、
(ここで、(a)、(b)、および(c)の少なくとも1つが標識されている)、
(d)(a)および(b)を、(c)の存在下および(c)の非存在下で、(a)および(b)が複合体を形成するのに十分な時間、混合すること、
(e)段階(f)で形成された複合体の量を検出すること、および/または非複合体形成mRNA/タンパク質種を検出すること、
(f)形成された複合体の量、および/または見出された非複合体形成mRNA/タンパク質種を、(c)の存在下と非存在下で比較すること、および
(g)段階(f)で検出された複合体形成に影響する薬物を選択すること、
を含む、方法。 - HuRタンパク質が同種供給源として用意されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- HuRが、組換え全長タンパク質または変異体の可溶性形、または全長タンパク質の可溶性形の変異型であることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- mRNAフラグメントが蛍光標識されていることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 検出方法が、1分子分光法、蛍光相関分光法、蛍光強度分布分析法、定常状態蛍光強度法、蛍光異方性測定、およびエネルギー転移法からなる群から選択される蛍光分光法であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- ARE含有mRNAとHuRタンパク質の複合体形成に対する阻害作用を有する薬物を同定するためのスクリーニングアッセイ(キット)であって、主な要素として
a)HuRタンパク質の可溶性形(ただし、全長HuR・グルタチオンSトランスフェラーゼ融合タンパク質は除外される)、
b)ARE含有mRNA、および
c)必要に応じて、該HuRタンパク質と該ARE含有mRNA間で形成された複合体の量の検出、および/または非複合体形成mRNA/タンパク質種の検出の手段、
を含む、アッセイ(キット)。 - 請求項1に記載の方法により同定される薬物を少なくとも1つの医薬賦形剤と共に含む、医薬組成物。
- 好ましくは、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−8、GM−CSF、TNF−α、VEGF、AT−R1、Cox−2、c−fos、およびc−mycからなる群から選択される、サイトカイン、成長因子、プロトオンコジーン、またはウイルスタンパク質からなる群から選択される物質の産生と関係する病因を有する疾患の処置のための、請求項7に記載の医薬組成物の使用。
- 位置326のC末端アミノ酸がエステル化されている、配列番号:1または配列番号:2の全長HuRタンパク質。
- HuRの結合部位である、単離RNA配列モチーフ。
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