JP2002513281A - Ｒｎａ−蛋白質の融合体を用いた蛋白質の選抜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本明細書において、RNA-蛋白質融合体を使用した蛋白質分子の選抜のための方法および試薬について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 RNA-蛋白質の融合体を用いた蛋白質の選抜 発明の背景 本発明は、蛋白質を選抜する方法に関する。 本発明は、助成金F32GM17776-01とF32GM17776-02による政府の支援を受けて行 われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。 RNA分子およびDNA分子を、その機能に基づいて単離するための方法が現在存在 する。例えば、エリントンとスゾスタック（Ellington and Szostak）（Nature 346:818(1990);およびNature 355:850(1992)）、およびツアークとゴールド（Tu erk and Gold）（Science 249:505(1990);およびJ．Mol．Biol．222:739(1991) ）の実験によって、選抜と増幅を何回も繰り返すことで、雑多な分子のプールか ら所期の性質をもつ非常に稀少な（10¹³個の中に1個よりも少ない）核酸分子を 単離することができることが示された。これらの方法は、（i）非常に大きな候 補プールをスクリーニングすることができ（>10¹⁵）、（ii）宿主の生存力とイ ンビボの条件とは無関係で、また、（iii）インビボでの遺伝学的なスクリーン がなくても選抜を行うことができるという点で、従来の遺伝学的選抜よりも優れ ている。インビボ選抜の威力は、新規のRNAおよびDNAの配列で、特異的な蛋白質 結合機能をもつもの（例えば、Tuerk and Gold，Science 249:505(1990);Irvine et al.，J．Mol．Biol．222:739(1991);Oliphant et al.，Mol．Cell．Biol．9 :2944(1989);Blackwell et al.，Science 250:1104(1990);Pollock and Treisma n，Nuc．Acids Res．18:6197(1990);Thiesen and Bach，Nuc．Acids Res．18:32 03(1990);Bartel et al.，Cell 57:529(1991);Storino and Yoshida，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 88:5699(1991);およびBock et al.，Nature 355:564(1992) ）、低分子結合機能をもつもの（Ellington and Szostak，Nature 346:818(1990 );Ellington and Szostak，Nature 355:850(1992)）、および触媒機能をもつも の（Green et al.，Nature 347:406(1990);Robertson and Joyce，Nature 344:4 67(1990);Beaudry and Joyce，Science 257:635(1992);Bartel and Szostak，Sc ience 261:1411(1993);Lorsch and Szostak，Nature 371:31-36(1994);Cuenoud and Szostak，Nature 375:611-614(1995);Chapman and Szostak，Chemistry and Biology 2:325-333(1995);およびLohse and Szostak， Nature 381:442-444(1996)）を定義するときに示されてきた。蛋白質の選抜と増 幅についても同様のやり方が示されている。 発明の概要 本発明の目的は、インビトロ選抜とインビトロ展開の原理を蛋白質に応用でき る様にすることである。本発明は、部分的に、または完全に無作為なアミノ酸配 列の大きなプールから所期の特質をもった蛋白質を単離することを容易にする。 さらに、本発明は、mRNAのコード配列を蛋白質分子に共有的に結合させることに よって、蛋白質の配列情報を回収し増幅するという問題を解決する。 一般的に、本発明の方法は、自身のmRNAの3'末端に共有的に結合された蛋白質 、すなわち、RNA-蛋白質融合体を作出する、インビトロまたはインサイチューの 転写/翻訳プロトコールからなる。これは、その3'末端にペプチド受容体を付着 させたmRNA分子を合成し、インビトロまたはインサイチューで翻訳することによ って行われる。一つの好ましいペプチド受容体は、伸長しているペプチド鎖のC 末に付加されると翻訳を終了させるヌクレオシド類似化合物のピューロマイシン である。好ましいデザインの一つにおいて、メッセージの末端とペプチド受容体 との間に、オープンリーディングフレームの末端でリボソームが停止するように 設計されたDNA配列を含ませ、これによって、ペプチド受容体（例えば、ピュー ロマイシン）が、ペプチジルtRNA結合が加水分解される前に、生成中のペプチド 鎖を受容するための時間を延ばす。 この蛋白質の配列情報は、逆転写と増幅（例えば、PCR増幅、および3SRもしく はTSAなどのRNAによる増幅技術など、その他の増幅技術）によって回収すること ができるので、望ましければ、この結果できたRNA-蛋白質融合体で、選抜と増幅 を繰り返し行うことができる。そして、増幅された核酸を転写、修飾させ、イン ビトロまたはインサイチューで翻訳させて、次回の選抜のためのmRNA-蛋白質融 合体を作出することができる。何回も選抜と増幅を行うことができるために、例 えば、10¹⁵個からなるプールの中の1個の所期の分子というように、非常に稀少 な分子を増やして単離することが可能になる。これによって、次に、実質的に何 らかの標的を特異的に認識するか、または所期の化学反応を触媒する新規または 改良 された蛋白質の単離が可能になる。 したがって、第一の局面において、本発明は、所期の蛋白質を選抜するための 方法で、（a）それぞれが、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳 開始配列と開始コドンとを含み、またそれぞれが、候補蛋白質のコード配列の3' 末端でペプチド受容体に機能的に結合されている、候補となるRNA分子の集団を 提供する段階、（b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、候 補となる蛋白質のコード配列を、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段 階、および（c）所期のRNA-蛋白質融合体を選抜し、それによって所期の蛋白質 を選抜する段階を含む方法を特徴とする。 関連する局面において、本発明は、所期の蛋白質をコードするDNA分子を選抜 するための方法で、（a）それぞれが、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合 された翻訳開始配列と開始コドンとを含み、またそれぞれが、候補蛋白質のコー ド配列の3'末端でペプチド受容体に機能的に結合されている、候補となるRNA分 子の集団を提供する段階、（b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生する ために、候補となる蛋白質のコード配列を、インビトロまたはインサイチューで 翻訳する段階、（c）所期のRNA-蛋白質融合体を選抜する段階、および（d）融合 体のRNA部分から、所期の蛋白質をコードするDNA分子を作製する段階を含む方法 を特徴とする。 別の関連する局面において、本発明は、参照となる蛋白質に較べて変容した機 能をもつ蛋白質を選択する方法で、（a）候補となるDNA鋳型が、それぞれ、参照 となる蛋白質のコード配列とは異なる候補蛋白質のコード配列をもち、RNA分子 は、それぞれ、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開始配列と開 始コドンとを含み、3'末端でペプチド受容体に機能的に結合されている、DNA鋳 型集団から候補となるRNA分子の集団を産生する段階、（b）候補となるRNA-蛋白 質融合体の集団を産生するために、候補となる蛋白質のコード配列を、インビト ロまたはインサイチューで翻訳する段階、および（c）変容した機能をもつRNA- 蛋白質融合体を選抜し、それによって変容した機能をもつ蛋白質を選抜する段階 を含む方法を特徴とする。 さらに別の関連する局面において、本発明は、参照となる蛋白質に較べて変容 した機能をもつ蛋白質をコードするDNA分子を選択する方法で、（a）候補となる DNA鋳型が、それぞれ、参照となる蛋白質のコード配列とは異なる、候補蛋白質 のコード配列をもち、RNA分子は、それぞれ、候補蛋白質のコード配列に機能的 に結合された翻訳開始配列と開始コドンとを含み、3'末端でペプチド受容体に機 能的に結合されている、候補となるDNA鋳型集団から候補となるRNA分子の集団を 産生する段階、（b）RNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、候補となる蛋 白質のコード配列を、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段階、（c） 変容した機能をもつRNA-蛋白質融合体を選抜する段階、および（d）融合体のRNA 部分から、変容した機能をもつ蛋白質をコードするDNA分子を作出する段階を含 む方法を特徴とする。 さらに別の関連する局面において、本発明は、所期のRNAを選抜するための方 法で、（a）それぞれが、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開 始配列と開始コドンとを含み、またそれぞれが、候補蛋白質のコード配列の3'末 端でペプチド受容体に機能的に結合されている、候補となるRNA分子の集団を提 供する段階、（b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、候補 となる蛋白質のコード配列を、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段階 、および（c）所期のRNA-蛋白質融合体を選抜し、それによって所期のRNAを選抜 する段階を含む方法を特徴とする。 上記の方法の好ましい態様において、ペプチド受容体はピューロマイシンであ り；各候補RNA分子は、停止配列をさらに含むか、またはRNAの3'末端に共有結合 されたDNA配列もしくはDNA類似配列をさらに含み；候補RNA分子集団は、少なく とも10⁹個、好ましくは少なくとも10¹⁰個、より好ましくは少なくとも10¹¹個、1 0¹²個、または10¹³個、また最も好ましくは少なくとも10¹⁴個の異なったRNA分子 を含み；インビトロの翻訳反応を、真核細胞またはその一部から調製されたライ セート（すなわち、例えば、網状赤血球またはコムギ胚芽のライセート）の中で 行い；インビトロの翻訳反応を、原核細胞（例えば、大腸菌（E．coli））また はその一部から調製された抽出物の中で行い；選抜段階が、所期の蛋白質を、固 定した結合パートナーに結合させることを含み；選抜段階は、所期の蛋白質の機 能的活性を測定することを含み；DNA分子を増幅し；本方法は、上記の選抜方法 の段階を繰り 返すことをさらに含み；本方法は、DNA分子からRNA分子を転写させ、段階（a） から（d）を繰り返すことをさらに含み；インビトロ翻訳段階の後に、本方法は 、50〜100mM Mg²⁺存在下で行われるインキュベーション段階をさらに含み；RNA- 蛋白質融合体は、ペプチド受容体の近傍にある、可塑性を高めるような核酸また は核酸類似体の配列をさらに含む。 別の関連する局面において、本発明は、本発明の方法のいずれかによって選抜 されたRNA-蛋白質融合体；アミド結合によって、このリボ核酸によってコードさ れているアミノ酸配列に共有結合されたリボ核酸；および、候補蛋白質のコード 配列に機能的に結合された翻訳開始配列と開始コドンとを含み、候補蛋白質のコ ード配列の3'末端でペプチド受容体（例えば、ピューロマイシン）に機能的に結 合されているリボ核酸を特徴とする。 第二の局面において、本発明は、配列プールを増幅して、所期の蛋白質または 所期のRNAを選抜するための方法を特徴とする。この方法は、（a）それぞれが、 候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開始配列と開始コドンとを含 み、またそれぞれが、候補蛋白質のコード配列の3'末端でペプチド受容体に機能 的に結合されている、候補となるRNA分子の集団を提供する段階、（b）候補とな るRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、候補となる蛋白質のコード配列を 、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段階、（c）結合している結合パ ートナー-RNA-蛋白質融合体複合体が集団の非結合構成分子から実質的に分離さ れる条件の下で、RNA-蛋白質融合体の集団を、RNA-蛋白質融合体のRNA部分また は蛋白質部分のどちらかに特異的な結合パートナーと接触させる段階、（d）結 合したRNA-蛋白質融合体を複合体から解離させる段階、および（e）結合してい る結合パートナー-RNA-蛋白質融合体複合体が集団の非結合構成分子から実質的 に分離される条件の下で、段階（d）のRNA-蛋白質融合体集団を、所期のRNA-蛋 白質融合体の蛋白質部分に特異的な結合パートナーと接触させ、それによって、 所期の蛋白質および所期のRNAを選抜する段階を含む。 好ましい態様において、本方法は、段階（a）から（e）を繰り返すことをさら に含む。さらに、これらの反復段階において、所期のRNA-蛋白質融合体を選択的 に増加させるために、何らかの順序で、同一の、または異なった結合パートナー を用いることができる。別の好ましい態様において、段階（d）は、所期の融合 体の蛋白質部分に特異的な結合パートナー（例えば、モノクローナル抗体）を使 用することを含む。この段階は、好ましくは、所期の蛋白質をコードするDNAを 作出するために、融合体のRNA部分を逆転写した後に行う。望ましければ、このD NAは、単離および/またはPCR増幅することができる。この増幅技術を用いて、所 期の蛋白質を選抜することができ、または、参照用蛋白質と較べて変容した機能 をもつ蛋白質を選抜することもできる。 増幅方法の別の好ましい態様において、ペプチド受容体はピューロマイシンで あり；各候補RNA分子は、停止配列をさらに含むか、またはRNAの3'末端に共有結 合されたDNA配列もしくはDNA類似配列をさらに含み；候補RNA分子集団は、少な くとも10⁹個、好ましくは少なくとも10¹⁰個、より好ましくは少なくとも10¹¹個 、10¹²個、または10¹³個、また最も好ましくは少なくとも10¹⁴個の異なったRNA 分子を含み；インビトロの翻訳反応を、真核細胞またはその一部から調製された ライセート（すなわち、例えば、網状赤血球またはコムギ胚芽のライセート）の 中で行い；インビトロの翻訳反応を、原核細胞（例えば、大腸菌（E．coli）） またはその一部から調製された抽出物の中で行い；DNA分子を増幅し；少なくと も一つの結合パートナーを固体支持体に固定し；インビトロ翻訳段階の後に、本 方法は、50〜100mM Mg²⁺存在下で行われるインキュベーション段階をさらに含み ；また、RNA-蛋白質融合体が、ペプチド受容体の近傍にある、可塑性を高めるよ うな核酸または核酸類似体の配列をさらに含む。 関連する局面において、本発明は、本明細書で説明されている選抜方法のいず れかを行うためのキットを特徴とする。 最後の第三の局面において、本発明は、RNA-蛋白質融合体にハイブリダイズす る一本鎖核酸を固定した配列を含むマイクロチップを特徴とする。好ましくは、 RNA-蛋白質融合体の蛋白質成分は、そのRNAによってコードされている。 本明細書で用いられるΓ集団」とは、一つよりも多い分子（例えば、複数のRN A分子、DNA分子、またはRNA-蛋白質融合体分子）を意味する。本発明の方法によ り、必要に応じて、多数の候補分子から出発する選抜が容易となるため、本発明 に係る「集団」は、好ましくは10⁹分子よりも多く、より好ましくは10¹¹、10¹² 、ま たは10¹³分子よりも多く、また最も好ましくは10¹³分子よりも多いことを意味す る。 「選抜する」とは、集団の中のその他の分子から、ある分子を実質的に区分け することを意味する。本明細書で用いられる場合、「選抜」段階により、所期の 分子が、選抜段階の後に集団中の所期の分子でないものに較べて、少なくとも2 倍、好ましくは30倍、より好ましくは100倍、そして最も好ましくは1000倍に増 幅される。本明細書において示されているように、選抜段階は、所定の方法にお いて、何回でも反復することができ、また、異なったタイプの選抜段階を組み合 わせることもできる。 「蛋白質」とは、一つ以上のペプチド結合によって結合された、天然の、また は修飾された2個以上の任意のアミノ酸を意味する。「蛋白質」および「ペプチ ド」は、本明細書では、互換できるように使用されている。 「RNA」とは、共有結合された2つ以上の、天然または修飾されたリボ核酸の配 列を意味する。この用語に含まれる、修飾されたRNAの一つの例は、ホスホロチ オエートRNAである。 「翻訳開始配列」とは、機能的なリボソーム進入部位を提供できる任意の配列 を意味する。バクテリアのシステムにおいては、この領域は、シャイン-ダルガ ルノ（Shine-Dalgarno）配列ともいわれる。 「開始コドン」とは、蛋白質をコードする配列の開始のシグナルである3塩基 を意味する。一般的に、これらの塩基はAUG（またはATG）であるが、この態様に おいて使用されうる別の塩基トリプレットで代用することもできる。 ペプチド受容体に「共有結合された」とは、ペプチド受容体が、共有結合によ って直接、または、別の共有結合された配列（例えば、停止配列に相当するDNA ）によって間接的に、「蛋白質のコード配列」に結合していることを意味する。 「ペプチド受容体」とは、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ機能の 触媒活性によって、伸長している蛋白質鎖のC末に付加されうる任意の分子を意 味する。典型的には、このような分子は、（i）ヌクレオチドまたはヌクレオチ ド様部分（例えば、アデノシンまたはアデノシン類似体（N-6アミノ部位のジメ チル化は許容される））、（ii）アミノ酸またはアミノ酸様部分（例えば、20個 の任意のD-もしくはL-アミノ酸、またはそれの任意の類似体（例えば、O-メチル チロシ ン、または、Ellmanら、Meth．Enzymol．202:301，1991で説明されている類似体 のいずれか））、および（ii）これら二つの間の結合（例えば、3'位置、または あまり好ましくはないが、2'位置でのエステル、アミド、またはケトン結合）； 好ましくはこの結合は、天然のリボヌクレオチドの立体構造でできる環のしわを 有意に乱すことのないものである。また、ペプチド受容体は、求核基をもつこと ができる。この求核基に制限はないが、アミノ酸基、ヒドロキシル基、またはス ルフヒドリル基などである。さらに、ペプチド受容体は、ヌクレオチド擬似体、 アミノ酸擬似体、または、ヌクレオチド-アミノ酸結合構造物の擬似体からなっ ていてもよい。 蛋白質コード配列の「3'末端」に位置するペプチド受容体とは、ペプチド受容 体分子が、蛋白質コード配列の終止コドンの後に位置していることを意味する。 この用語には、蛋白質コード配列のまさに3'末端に位置するペプチド受容体分子 と、介在するコード配列、もしくは非コード配列（例えば、停止部位に相当する 配列）によって終止コドンから離されているペプチド受容体分子が含まれるが、 これに制限されない。また、この用語には、コード配列または非コード配列が、 ペプチド受容体分子の後ろに続いている（すなわち、3'末端側にある）構築物も 含まれる。さらに、この用語には、制限なしに、蛋白質のコード配列に（直接的 、または介在する核酸配列によって間接的に）共有結合されたペプチド受容体、 また、例えば、蛋白質コード配列の3'末端またはその近くに結合する別の核酸配 列で、それ自体がペプチド受容体分子に結合している別の核酸配列を用いたハイ ブリダイゼーションのような、何らかの非共有的な方法によって蛋白質コード配 列に結合されているペプチド受容体が含まれる。 「変容した機能」とは、ある分子の機能における、質的または量的な任意の変 化を意味する。 「停止配列」とは、リボソームの翻訳の速さを遅くするか停止させる核酸配列 を意味する。 本明細書で用いられる「結合パートナー」とは、所期のRNA-蛋白質融合体の一 部に、特異的で、共有結合的、または非共有結合的な親和性をもつ任意の分子を 意味する。結合パートナーには制限はないが、その例には、抗原/抗体対、蛋白 質 /インヒビター対、レセプター/リガンド対（例えば、ホルモンレセプター/ペプ チドホルモン対などの細胞表面レセプター/リガンド対）、酵素/基質対（例えば 、キナーゼ/基質対）、レクチン/炭水化物対、オリゴマー、もしくはヘテロオリ ゴマーの蛋白質集合体、DNA結合蛋白質/DNA結合部位対、RNA/蛋白質対、および 核酸の二本鎖、ヘテロ二本鎖、もしくは連結させた鎖のいずれか、および、RNA- 蛋白質融合体のいずれかの部分と一つ以上の共有結合もしくは非共有結合（例え ば、ジスルフィド結合）を形成することができる任意の分子が含まれる。結合パ ートナーには、非制限的に、図2に示されている「選抜モチーフ」のいずれかが 含まれる。 「固体支持体」とは、制限ではないが、任意のカラム（または、カラム材料） 、ビーズ、試験官、微量滴定用プレート、固形粒子（例えば、アガロースまたは セファロース）、マイクロチップ（例えば、シリコン、シリコンガラス、または 金製チップ）、または、直接的もしくは間接的（例えば、別の抗体やプロテイン Aなどの、別の結合パートナー中間体）に親和的な複合体が結合できるか、もし くは親和的な複合体が（例えば、レセプターまたはチャンネルを通して）包埋さ れえる膜（例えば、リポソームまたは液胞の膜）を意味する。 本明細書で請求されている発明は、数多くの有意な利点を提供する。まず、こ れは、蛋白質を選抜、増幅するためのこの種の案の初めての例である。この技術 は、所期の単離された蛋白質に対応する塩基配列を回収する必要がある（なぜな ら、核酸のみが複製可能だから）ために生じた困難を克服している。特に、部分 的に、または完全に無作為化されたプールからの蛋白質の単離を可能にした多く の先行技術は、インビボの段階によって単離を行った。本方法には、モノクロー ナル抗体技術（Milstein，Sci．Amer．243:66(1980);およびSchultzら、J．Chem ．Engng．News 68:26(1990)）、ファージディスプレイ（Smith，Science 228:13 15(1985);Parmley and Smith，Gene 73:305(1988);およびMcCaffertyら、Nature 348:552(1990)）、ペプチド-lacリプレッサー融合体（Cullら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 89:1865(1992)）、および古典的な遺伝学的選抜法が含まれる。本 技術とは異なり、これらの各方法は、蛋白質と核酸とのトポロジー的な結合に依 存し、そのために、蛋白質の情報が保たれて、読み取り可能な核酸の形 で回収できる。 さらに、本発明は、まだ、リボソームおよびmRNAと複合体を形成している生成 中の蛋白質鎖の何らかの特性に対して選抜が行われるという、行き詰まった翻訳 技術（Tuerk and Gold，Science 249:505(1990);Irvineら、J.Mol.Biol.222:739 (1991);Kormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1844-1848(1982);Mattheakisら 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022-9026(1994);Mattheakisら、Meth.Enzymol.2 67:195(1996);およびHanes and Pluckthun，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937(1 997)）に対する利点を提供する。行き詰まった翻訳技術とは異なり、本方法は、 非常に壊れやすく、そのために、技術的に用いることのできる選抜のタイプ関す る制限がある複合体である、mRNA：リボソーム：生成鎖の3成分の複合体の完全 性を維持することに依存しない。 本方法は、また、ブレナートとラーナー（Brenner and Lerner）（Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 89:5381-5383(1992)）によって提案された、DNA-ペプチド融 合体を作り、選抜を一回行って遺伝情報を理論的に回収するという、枝分かれ合 成法に対する利点を提供する。枝分かれ合成法とは異なり、本方法では、（枝分 かれ合成法においては、一般的に、化学合成する毎に行われる）融合体のDNA部 分からのペプチド再生を行う必要がない。したがって、本方法は、候補分子の集 団を用いて、選抜を何度も繰り返すことが可能である。さらに、非常に短い配列 を選抜するため一般的に限定される枝分かれ合成技術とは異なり、本方法は、か なりの長さの蛋白質分子を選抜するのに用いることができる。 さらに別の利点として、この選抜、および方向性をもった展開技術は、非常に 大きく複雑な、候補配列のライブラリーを利用することができる。これとは対照 的に、インビボの段階に依存する現存の蛋白質選抜法は、典型的には、ある程度 複雑さが限定されている、比較的小さなライブラリーに限定される。機能的な蛋 白質の配列を選抜するとき、例えば、長さが10アミノ酸しかないペプチドに対し て、10¹³通りの配列が存在することを考えれば、この利点は特に重要である。古 典的な遺伝学的方法、lacリプレッサー融合法、およびファージディスプレイ法 では、最大の複雑さでも、一般的に、10¹³個という桁数よりは小さくなる。大き なライブラリーサイズは、どのような出発配列についても、配列空間をより深く 調べる ことができるという点で、方向性をもった展開に応用するにも有利である。 また、本技術は、選抜段階が、状況に依存しないという点で、先行する方法と は異なる。多くの別の選抜スキームでは、例えば、発現された蛋白質が存在する 情況が、作製されるライブラリーの性質に大きな影響を与えることがある。例え ば、特定のシステムでは、発現蛋白質が適正に発現されないか、または、（例え ば、ファージ粒子の表面上に）正しく提示されないかもしれない。または、蛋白 質の発現は、実際には、選抜サイクルの一つ以上の重要な段階、例えば、ファー ジの生存力もしくは感染力、またはlacリプレッサーの結合によって妨害される ことがある。これらの問題は、機能的な分子の消失をもたらすことがあり、用い ることのできる選抜方法の性質を制約することになる。 最後に、本方法は、調べることのできる蛋白質のレパートリーを調節すること ができるため、有益である。一定の技術（例えば、抗体選抜）においては、最初 のプールの性質を調節することがほとんどできないか全くできない。さらに別の 技術（例えば、lac融合およびファージディスプレイ）では、候補プールを、融 合蛋白質という状態で発現させなければならない。これに対し、RNA-蛋白質融合 体構築物は、スクリーニングに用いることのできる候補プールの性質に対する調 節を具えている。さらに、候補プールの大きさは、インビトロ翻訳反応を行う規 模によって制約されるだけで、RNAまたはDNAのプールと同じ大きさにすることが できる（〜10¹⁵個）。そして、候補プールの組み立ては、完全に実験のデザイン しだいである。すなわち、無作為領域は、単独にスクリーニングしてもよいし、 または、所期の融合蛋白質に関連させてスクリーニングしてもよい。また、RNA- 蛋白質融合体の候補プールにおいて、すべてではないにしても、ほとんどの配列 を発現させることができる。 本発明のこの他の特徴と長所は、次の詳細な説明および請求の範囲から明らか になると思われる。 詳細な説明 まず、図面について、簡単に説明する。 図面の簡単な説明 図1A〜1Cは、RNA-蛋白質融合体を作出するのに含まれる段階の概要を示したも のである。図1Aは、融合体のRNA部分を作製するためのDNA構築物の見本を図示し たものである。図1Bは、RNA/ピューロマイシン結合体の作出を図示したものであ る。そして、図1Cは、RNA-蛋白質融合体が作出されるのを図示している。 図2は、本発明による一般的な選抜プロトコールの概要を示したものである。 図3は、3'側にピューロマイシンをもつ最小翻訳鋳型の合成プロトコールの概 要を示したものである。段階（A）は、ピューロマイシンの反応官能基（5'-OHと NH₂）に保護基を付加するところを示している。すなわち、修飾されて、これら の基は、ホスホロアミダイトによるオリゴヌクレオチド合成で使用するのに適す るように保護される。その3'OHにDNAを付加するための標準的なプロトコールを 用いて、この保護されたピューロマイシンを、2'OH基によって、アミノヘキシル 調節多孔ガラス（CPG）に付着させた（ゲート（Gait）、オリゴヌクレオチド合 成、実際的方法（Oligonucletide Synthesis，A Practical Approach）、実用的 応用シリーズ（The Practical Approach Series）（IRLプレス、オクスフォード （IRL Press，Oxford）、1984））。段階（B）では、43ヌクレオチドを含む最小 翻訳鋳型（「43-P」と呼ぶ）を、標準的なRNAおよびDNA化学法（ミリポア社、マ サチューセッツ州、ベドフォード（Millipore，Bedford，MA））を用いて合成し 、NH₄OHとTBAFを用いて脱保護し、さらにゲル精製した。この鋳型は、5'末端に1 3塩基のRNAを含み、それに、その5'OHに3'ピューロマイシンが付着した、29塩基 のDNAが続いていた。RNA配列は、（i）16S rRNAの5塩基に相補的なシャイン-ダ ルガルノ保存配列（Stomoら、Nucleic Acids Research 10:2971-2996(1982);Shi ne and Dalgarno，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71:1342-1346(1974);およびSteitz and Jakes，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:4734-4738(1975)）、（ii）5塩基のス ペーサー、および（iii）1個のAUG開始コドンを含んでいた。「P」がピューロマ イシンの場合には、DNA配列はdA₂₇dCdCPであった。 図4は、保護されたCPG-結合ピューロマイシンを調製するための好ましい方法 の概要を示している。 図5は、本発明の鋳型にメチオニンを取り込むことが可能な方式を示した概要 図である。反応（A）で示されているように、鋳型はリボソームに結合し、70Sの 開始複合体を形成させる。f-met tRNAがＰサイトに結合し、鋳型と塩基対を形成 する 。鋳型の3'末端のピューロマイシンが、分子内で鋳型のAサイトに入り込み、ペ プチジルトランスフェラーゼの中心を介してN-ホルミルメチオニンとアミド結合 を形成し、それによって、tRNAを脱アシル化する。反応液をフェノール/クロロ ホルム抽出すると、メチオニンが共有的に付着した鋳型が得られる。反応（B） で示されているのは、鋳型とピューロマイシンを含むオリゴヌクレオチドとの望 ましくない分子間反応である。前と同じように、最小鋳型は、Pサイトに結合し たf-met tRNAを含む70Sリボソームの形成を刺激する。この後、もう一つの鋳型 がトランスの形に入ってきて、共有的に付着したメチオニンができる。 図6A〜6Hは、³⁵Sメチオニン（³⁵S met）の翻訳鋳型への取り込みを示した写真 である。図6Aは、この反応がマグネシウム（Mg²⁺）依存的であることを示してい る。図6Bは、産物が塩基安定的であることを示している。すなわち、この図に示 されている移動度の変化は、43-P（「Met鋳型」とも名づけられている）の5'RNA 配列が消失して、30-Pと名づけられたDNA-ピューロマイシン部位が産生されたこ とに対応している。塩基処理の後も標識を保持していることは、³⁵Sメチオニン と鋳型の3'ピューロマイシンとの間にペプチド結合が形成されたことと合致して いた。図6Cは、ペプチジルトランスフェラーゼのインヒビター存在下で、産物形 成が阻害されることを示している。図6Dは、³⁵Sメチオニンの取り込みが、鋳型 コード配列依存的であることを示している。図6Eは、³⁵Sメチオニンの取り込み が、DNA鋳型の長さに依存することを示している。図6Fは、鋳型43-Pと25-Pを用 いた、シス型対トランス型の産物形成を示している。図6Gは、鋳型43-Pと13-Pを 用いた、シス型対トランス型の産物形成を示している。図6Hは、網状赤血球ライ セートシステムにおいて鋳型43-Pと30-Pを用いた、シス型対トランス型の産物形 成を示している。 図7A〜7Cは、ペプチド融合形成と選抜を調べるための構築物の概要を図示した ものである。図7Aは、LP77（「連結した産物」「77」ヌクレオチド長）（「短い myc鋳型」とも名づけられている）を示している（配列番号：1）。この配列は、 5'側の開始コドンと3'側のリンカーに隣接したc-mycモノクローナル抗体エピト ープタグEQKLISEEDL（配列番号：2）を含む（Evansら、Mol．Cell Biol．5:3610 -3616(1985)）。5'側領域は、43-Pと同一の細菌シャイン-ダルガルノ配列を含ん でいる。コード配列は、細菌の系で翻訳されるよう最適化した。特に、43-PとLP 77 の5'UTRは、16S rRNAの5塩基に相補的なシャイン-ダルガルノ保存配列（Steitz and Jakes，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 72:4734-4738(1975)）、およびリボソ ーム蛋白質の配列と同じスペース（Stormoら、Nucleic Acids Res．10:2971-299 6(1982)）をもっていた。図7Bは、LP154（154ヌクレオチド長の連結産物）（「 長いmyc鋳型」とも名づけられている）を示している（配列番号：3）。この配列 は、c-myc抗体を単離するのに用いたペプチドを生成するためのコードを含んで いる。5'末端には、一部欠失したTMVの上流配列（「TE」と命名した）を含んで いる。この5'UTRは、TMVの5'UTRに由来する、2個のACAAAUUAC直列反復配列（Gal lieら、Nucl．Acids Res．16:883(1988)）を含む22ヌクレオチドの配列を含んで いた。図7Cは、ペプチド選抜に用いられる例示的な配列である1号プール（配列 番号：4）を示している。鋳型のPCR増幅に必要とされる3'側定常領域として利用 する鋳型には、最初のmycペプチドから最終的には７つのアミノ酸が含まれてい た。この配列は、抗体結合エピトープの部分ではないことが分かっている。 図8は、鋳型43-P、LP77、およびLP154、ならびに網状赤血球（「Retic」）お よびコムギ胚芽（「Wheat」）の翻訳システムを用いた、RNA-蛋白質融合体の合 成を示す写真である。図の左側半分は、3つの鋳型それぞれにおける、³⁵Sメチオ ニンの取り込みを示している。図の右側半分は、その結果できた産物を、RNAの コード領域を除去するために、3つの鋳型それぞれについてRNase Aで処理したも のを示している：³⁵Sメチオニン標識したDNA-蛋白質融合体が示されている。そ れぞれのDNA部分は、オリゴP-30と一致していた。このように、移動度の違いは 、コード領域の長さに比例していて、それぞれの場合に異なった長さの蛋白質が 存在することと合致していた。 図9は、LP154から合成したRNA-蛋白質融合体の、変性ポリアクリルアミドゲル 電気泳動によって解析したプロテアーゼ感受性を示す写真である。レーン1は、^{3 2} Pで標識された30-Pを含んでいる。レーン2〜4、5〜7、および8〜10は、網状赤 血球ライセート反応から回収された、それぞれ、無処理、RNase A処理、または 、RNase AおよびプロテイナーゼK処理のいずれかの、³⁵S標識された翻訳鋳型を 含んでいる。 図10は、インビトロで翻訳させた33アミノ酸のmyc-エピトープ蛋白質を用いた 免疫沈降反応の結果を示す写真である。レーン1と2は、それぞれmyc-エピトープ 蛋白質とβ-グロビンの鋳型の翻訳産物を示している。レーン3〜5は、c-mycモノ クローナル抗体、ならびに、それぞれ、PBS、DB、およびPBSTDS洗浄用緩衝液を 用いた、myc-エピトープペプチドの免疫沈降の結果を示している。レーン6〜8は 、同じ免疫沈降反応であるが、β-グロビン翻訳産物を用いた結果を示している 。 図11は、インビトロで翻訳反応させたRNA-蛋白質融合体の免疫沈降反応の結果 を示す写真である。反応において用いられた鋳型のピコモル数が示されている。 レーン1〜4はRNA124（LP154融合体のRNA部分）を、レーン5〜7はRNA-蛋白質融合 体LP154を示している。c-mycモノクローナル抗体とプロテインGセファロースを 用いた免疫沈降後、サンプルをRNase AとT4ポリヌクレオチドキナーゼで処理し てから、融合体を可視化するために、尿素ポリアクリルアミド変性ゲルで泳動し た。レーン1〜4では、鋳型なしか、長いmyc鋳型（RNA124）のRNA部分だけを含む サンプルでは、融合は見られなかった。レーン5〜7では、融合体に相当するバン ドが明らかに見られた。³²P標識された30-Pの位置を示し、図の上部には、投入 した鋳型の量を示す。 図12は、インビトロで翻訳反応で得られた融合物質の定量結果を示すグラフで ある。図11のレーン5〜7における融合体のバンドと30-Pのバンド（dT₂₅で平行方 式で単離された；図示されていない）の強度をホスホールイメージャープレート で定量して、LP154の投入濃度の関数としてグラフにした。回収された被修飾30- P（左側のy軸）は、投入された鋳型（X軸）に直線的に比例したが、リンカーペ プチド融合体（右側のy軸）は一定であった。この解析から、翻訳反応サンプル1 mlについて、〜10¹²個の融合体が形成されると計算された。 図13は、チオプロピルセファロースとdT₂₅アガロース、および、これらの基質 が、本発明のRNA-蛋白質融合体と反応できることを図示したものである。 図14は、本発明の融合体を連続して単離した結果を示す写真である。レーン1 は、³²P標識した30-Pである。レーン2と3は、翻訳反応液から単離して、RNase A で処理したLP154を示している。レーン2では、チオプロピルセファロースの後dT₂₅ アガロースを用いて、LP154を連続的に単離した。レーン3は、dT₂₅アガロース だけを用いて単離したものを示している。この結果から、この産物が、mycエピ トープのコ ード配列の最後から2番目のシステインと思われる遊離のチオール基を含んでい ることが示された。 図15Aと15Bは、SDS-トリシン-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によ って解析されたβ-グロビンを鋳型として用いたときの融合産物の形成を示す写 真である。図15Aは、鋳型なし（レーン1）、合成-β-グロビン鋳型（レーン2〜4 ）、またはLP-β-グロビン鋳型（レーン5〜7）のいずれかを用いたときの、³⁵S の取り込みを示している。図15Bは（図15Aと同じにレーン標識されている）、オ リゴヌクレオチドアフィニティークロマトグラフィーによって単離された³⁵S標 識物質を示している。30-Pテールがないと、何も単離されなかった（レーン2〜4 ）。 図16A〜16Cは、インビトロ選抜による、myc dsDNAとプールdsDNAの増幅を示す 表と写真である。図16Aは、選抜プロトコールの概要である。myc鋳型とプール鋳 型の4つの混合液をインビトロで翻訳し、dT₂₅アガロースで分離した後、TPセフ ァロースで、修飾されなかった鋳型から鋳型融合物を精製した。次に、mRNA-ペ プチド融合体を逆転写して、鋳型に存在する二次構造または三次構造を抑制した 。各混合液の等量液を、親和性選抜を行う前（図16B）と後（図16C）に取り出し 、標識プライマー存在下でPCRで増幅して、myc DNAのみを切断する制限酵素で制 限酵素消化した。投入した鋳型混合液は、純粋なmyc（レーン1）、またはmyc： プールが1：20、1：200、もしくは1：2000であった（レーン2〜4）。mycの鋳型 の選択的な翻訳と逆転写が起きたために、非選択的な物質が、投入割合から逸脱 した。選抜の前後におけるプール：mycの比率の変化から、選抜段階の間におけ るmyc鋳型の増幅を計算した。 図17は、myc RNA鋳型の翻訳を示した写真である。次のリンカーを用いた：レ ーン1〜4、dA₂₇dCdCP；レーン5〜8、dA₂₇rCrCP；およびレーン9〜12、dA₂₁C₉C₉C₉ dAdCdCP。各レーンにおいて、RNA鋳型の濃度は600nMで、³⁵S-Metを標識に用い た。反応条件は、以下の通りであった：レーン1、5および9、30℃で1時間；レー ン2、6および10、30℃で2時間；レーン3、7および11、30℃で1時間、-20℃で16 時間；およびレーン4、8および12、30℃で1時間、50mM Mg²⁺とともに-20℃で16 時間。この図において、「A」は、遊離のペプチドを示し、「B」は、mRNA-ペプ チド融合体を示す。 図18は、³²P標識されたmyc RNA鋳型の翻訳を示す写真である。用いたリンカー は、dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCPであった。翻訳は、30℃で90分間行い、インキュベーシ ョンは、Mg²⁺を添加せずに-20℃で2日間行った。mRNA鋳型の濃度は、400nM（レ ーン3）、200nM（レーン4）、100nM（レーン5）、および100nM（レーン6）であ った。レーン1は、³⁵S-Metで標識したmRNA-ペプチド融合体を示す。レーン2は、³² P標識されたmRNAを示す。レーン6では、0.5mMのキャップ類似体の存在下で反 応を行った。 図19は、アンビオン社（Ambion）（レーン1）、ノバジェン社（Novagen）（レ ーン2）、およびアマシャム社（Amersham）（レーン3）から購入したライセート を用いた、myc RNA鋳型の翻訳を示す写真である。用いたリンカーは、dA₂₇dCdCP であった。鋳型の濃度は600nMで、³⁵S-Metを標識に用いた。翻訳は、30℃で1時 間行い、インキュベーションは、50mM Mg²⁺存在下、-20℃で一晩行った。 蛋白質が、それら自身のメッセンジャーRNAに共有的に連結している融合体を 用いた、所期の機能をもつ蛋白質を選抜するための一般的な方法を本明細書にお いて説明する。これらのRNA-蛋白質融合体は、3'末端に付着したペプチド受容体 を含むmRNAプールをインビトロ、またはインサイチューで翻訳して合成される（ 図1B）。一つの好ましい態様において、メッセージのオープンリーディングフレ ームをリードスルーした後、設計された停止部位に到達すると、リボソームが停 止し、リボソームのAサイトに受容体部分が入り、Pサイトにいるペプチジル-tRN Aから生成中のペプチド鎖を受け取って、RNA-蛋白質融合体を生成させる（図1C ）。蛋白質とRNAとの間の共有結合（mRNAの3'末端と、それのコードする蛋白質 のC末との間のアミド結合の形になる）によって、蛋白質中の遺伝学的情報を回 収し、RNAの逆転写による選抜の後に（例えば、PCRによって）増幅することが可 能になる。融合体が生成されれば、mRNA-蛋白質融合体の特性に基づいた選抜も しくは増幅を行うか、または、一本鎖RNAが選抜に及ぼす何らかの影響を防ぐた めに蛋白質に付着している間に、mRNA鋳型を用いて逆転写を行うことができる。 mRNA-蛋白質構築物を用いるときには、選抜した融合体を調べて、どちらの部分 （蛋白質、RNA、またはその両方）が、所期の機能を具備しているのかを判定す ることができる。 好ましい態様の一つにおいて、（チロシルアデノシンに類似している）ピュー ロマイシンが、伸長しているペプチドがそのmRNAに付着するための受容体として 機能する。ピューロマイシンは、ペプチド伸長を終結させることにより作用する 抗生物質である。これは、アミノシルtRNAの擬似体として、Aサイトに結合し、 伸長中のペプチド鎖を受容し、リボソームを離脱させる（Kd＝10^-4M）（Traut a nd Monro，J．Mol．Biol．10:63(1964);Smithら、J．Mol．Biol．13:617（1965 ）)ことによって、蛋白質合成の普遍的なインヒビターとして作用する。ピュー ロマイシンの最も魅力的な特徴の一つは、伸長中のペプチド鎖と安定したアミド 結合を形成するために、不安定なエステル結合を形成する可能性のある受容体と 較べて、より安定した融合体が可能になるという事実である。特に、ペプチジル -ピューロマイシン分子は、ペプチドとピューロマイシンのO-メチルチロシン部 位との間に安定したアミド結合を含む。そして、O-メチルチロシンは、安定した アミド結合によってピューロマイシンの修飾されたアデノシン部分の3'-アミノ 基連結している。 この他に、受容体として選択可能なものには、mRNAの3'末端のtRNA様構造、お よびピューロマイシンと同じように作用する他の化合物が含まれる。このような 化合物には、制限ではないが、アデノシン、またはアミノ酸ヌクレオチド、フェ ニルアラニル-アデノシン（A-Phe）、チロシルアデノシン（A-Tyr）、およびア ラニル-アデノシン（A-Ala)などのアデニン様化合物、ならびに、フェニルアラ ニル3'デオキシ3'アミノアデノシン、アラニル3'デオキシ3'アミノアデノシン、 およびチロシル3'デオキシ3'アミノアデノシンなどのアミド結合構造物などがあ り、これらの化合物のいずれにおいても、天然のL-アミノ酸またはそれらの類似 体を利用することができる。さらに、tRNA様3'構造物-ピューロマイシンを結合 させた結合体も、本発明において用いることができる。 図2に示されているのは、本発明にしたがった好ましい選抜スキームである。 この選抜に含まれる段階は、一般的に、以下のようにして行われる。 段階1．DNA鋳型の調製 本発明のRNA-蛋白質融合体を作出することを目的とす る段階として、融合体のRNA部分を合成する。これは、直接的なRNAの化学合成に より行い、または、より一般的には、適当な二本鎖のDNA鋳型を転写して行うこ と ができる。 このようなDNA鋳型は、常法（組換えDNA技術、化学合成、またはその両方を含 む技術など）によって作製することができる。原則として、既知の、無作為の、 無作為化した、または変異誘発した配列を含む鋳型を一つ以上産生させる方法が 、この目的のために用いられる。特定の方法の一つでは、オリゴヌクレオチド（ 例えば、無作為の塩基を含むもの）を合成して、転写の前に（例えば、PCRで） 増幅する。後で既知の蛋白質コード配列の中央に挿入される無作為なカセットを 作製するために化学合成を用いることもできる（例えば、アウスウベル（Ausube l）ら、分子生物学の最新プロトコール（Current Protocol in Molecular Biolo gy）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社およびグリーンパブリッシングカン パニー（John Wiley & Sons and Greene Publishing Company）、1994年の8.2章 を参照のこと）。後者の方法によって、目的とする蛋白質の特定の部位近くに高 密度の突然変異が誘発される。 DNA鋳型の配列を完全に無作為化する代わりに部分的に無作為化され、そうし て合成されたプールは、一般的に、「ドープド（dopede）」プールと呼ばれる。 この技術の例で、RNA配列について行われたものが、例えば、エクランド（Eklan d）ら（Nucl．Acids Research，23:3231(1995)）によって説明されている。部分 的な無作為化は、それぞれの塩基付加反応混合液が1つの塩基を過剰に含み、他 の塩基それぞれの量が少なくなるようにして合成反応にバイアスをかけることに よって、化学的に行うことができる。また、塩基の濃度を慎重に調節することに よって、この方法で、望ましい突然変異頻度を実現することができる。また、部 分的に無作為化したプールは、エラープローン（error prone）PCR技術を用いて 、例えば、ボードリーとジョイス（Beaudry and Joyce）（Science 257:635(199 2)）、およびバーテルとスゾスタック（Bartel and Szostak）（Science 261:14 11(1993)）で説明されているようにして作製することができる。 既知の配列から出発し、変異を起こしたDNAプールを作製してDNA構築物を作製 する数多くの方法を利用することもできる。このような技術の例は、アウスウベ ル（Ausubel）ら（前記、第8章）、およびサムブルック（Sambrook）ら、（分子 クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning．A Laboratory Manual）、 第15章、コールドスプリングハーバープレス（Cold Spring Harbor Press）,第 ２版、(1989)）で説明されている。ランダム配列は、ステマー（Stemmer）（Nat ure 370:389(1994)）において概説されている「シャッフリング」技術によって 作製することができる。 本発明の選抜スキームを最適化するために、鋳型の5'末端と3'末端の配列と構 造を変更することもできる。好ましくは、これは、無作為なドメインを鋳型の適 当な末端の近くに挿入することを含み、その後選抜を行うという、二つの別々の 選抜によって行うことができる。これらの選抜法は、（i）作製される融合体の 量を最大にする（そして、それによってライブラリーの複合性を最大にする）か 、または（ii）最適化された翻訳配列を提供するために利用することができる。 さらに、本方法は、一般的に、コード領域と非コード領域の両方において翻訳用 鋳型を最適化するために、変異原PCRと組み合わせて適用することができる。 段階2．RNAの生成 上記したように、オリゴヌクレオチド合成の標準的な技術 を用いて、RNA-蛋白質融合体のRNA部分を化学的に合成することができる。また は、および特に、長いRNA配列が用いられるときは、RNA部位は、DNA鋳型のイン ビトロ転写によって作製される。好ましい方法の一つにおいては、T7ポリメラー ゼを用いて、酵素的に、RNA鎖を生成させる。このように用いられる他の適当なR NAポリメラーゼには、制限ではないが、SP6、T3、および大腸菌のRNAポリメラー ゼなどがある（例えば、アウスウベル（Ausubel）ら（前記、第3章）で説明され ている）。さらに、合成RNAは、全体的または部分的に修飾されたRNAであっても よい。一つの特定の例において、修飾されたリボヌクレオチドと標準的な技術を 用いて、ホスホロチオエートRNAを作出することができる（例えば、T7転写によ って）。このように修飾されたRNAは、ヌクレアーゼ安定的であるという長所が ある。 段階3．鋳型へのピューロマイシンのライゲーション 次に、ピューロマイシ ン（または、別の適当なペプチド受容体）を、鋳型配列に共有結合させる。この 段階は、T4RNAリガーゼを用いて、ピューロマイシンをRNA配列に直接付着させて 行うことができるが、好ましくは、T4 DNAリガーゼ、または二つの塩基配列をつ なぎ合わせることができる別の酵素を用いて、ピューロマイシンをDNAの「スプ リント（splint）」を通して付着させることができる（図1B参照）（また、例え ば、 アウスウベル（Ausubel）ら、前記、第3章14節と15節も参照のこと）。tRNA合成 を用いて、ピューロマイシン様化合物をRNAに付着させることができる。例えば 、フェニルアラニルtRNA合成酵素は、フェニルアラニンを、3'アミノ基をもつフ ェニルアラニルtRNA分子に結合させて、ピューロマイシン様の3'末端をもつRNA 分子を生成させる（Fraser and Rich，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 70:2671（1 973））。用いることのできる別のペプチド受容体には、制限ではないが、アミ ノ酸ヌクレオチド、フェニルアラニル-アデノシン（A-Phe）、チロシルアデノシ ン（A-Tyr）、およびアラニル-アデノシン（A-Ala）などのアデニン様化合物、 ならびに、フェニルアラニル3'デオキシ3'アミノアデノシン、アラニル3'デオキ シ3'アミノアデノシン、およびチロシル3'デオキシ3'アミノアデノシンなどのア ミド結合構造物など、アデニンまたはアデニン様化合物に結合したアミノ酸をも つ化合物が含まれる。また、これらの化合物のいずれかにおいて、天然のL-アミ ノ酸、またはそれらの類似化合物を利用することができる。数多くのペプチド受 容体が、例えば、クラエフスキーとクカノバ（Krayevsky and Kukahnova）、Pro gress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology 23:1(1979)で説明さ れている。 段階4．RNA-蛋白質融合体の生成と回収 RNA-蛋白質融合体を生成させるため に、どのようなインビトロ、またはインサイチューの翻訳システムを利用しても よい。下に示すように、真核生物のシステムが好ましく、2つの特に好ましいシ ステムには、コムギ胚芽と網状赤血球のシステムがある。しかし、原則として、 RNA-蛋白質融合体を形成でき、融合体のRNA部分を有意に分解しない翻訳システ ムであれば、本発明において有用である。さらに、これらのシステムのいずれか において、RNA分解を低下させるために、翻訳反応混合液の中に、分解を遮断す るアンチセンスオリゴヌクレオチドを入れることができる。このようなオリゴヌ クレオチドは、分解が開始する、分子のRNA部位の中の配列に特異的にハイブリ ダイズして、それを覆う（例えば、Hanes and Plucthun，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 94:4937(1997)）。 上記したように、真核細胞の翻訳システムを本発明で使用することができる。 これらには、制限はないが、酵母、腹水、腫瘍細胞のライセート（Leibowitzら 、 Meth．Enzymol．194:536(1991)）、およびアフリカツメガエル（xenopus）の卵 母細胞が含まれる。バクテリアシステムで有用なインビトロ翻訳システムには、 制限はないが、ズベイ（Zubay）(Ann．Rev．Genet．7:267(1973))；チェンとズ ベイ（Chen and Zubay）（Meth．Enzymol．101:44(1983)）；およびエルマン（E llman）（Meth．Enzymol．202:301(1991)）で説明されているものが含まれる。 さらに、翻訳反応を、インサイチューで行うことができる。特異的な例の一つ において、標準的な技術を用いて、アフリカツメガエル（xenopus）の卵母細胞 にmRNAを注射することによって翻訳を行わせることができる。 生成されたところで、蛋白質またはRNAの標準的な精製技術を用いて、翻訳反 応混合液からRNA-蛋白質融合体を回収する。典型的には、蛋白質の精製技術を利 用する。下記に示すように、例えば、dT₂₅アガロースまたはチオプロピルセファ ロースなど、適当なクロマトグラフィー試薬を用いることによって、融合体の精 製を容易に行うことができるようになる。しかし、精製は、また、あるいはまた は、融合体のRNA部位に基づいた精製を含むことができる。このような精製技術 は、例えば、アウスウベル（Ausubel）ら（前記、第4章）において説明されてい る。 段階5．所期のRNA-蛋白質融合体の選抜 候補融合体の集団から、所期の融合 体を選択的に区別または単離するために利用可能な方法によって、所期のRNA-蛋 白質融合体の選抜を行うことができる。分離技術の例に制限ではないが、例えば 、カラム、ビーズ、膜、またはその他の固形支持体上に直接的または間接的に固 定された結合パートナーへの選択的な結合、および融合体の蛋白質部位に特異的 な抗体を用いた免疫沈降などがある。これらの技術のうち最初のものは、結合が 可能な、いずれかのタイプの分子からなる、固定された選択モチーフを利用する 。選択モチーフ分子の可能性のあるもののリストが、図2に示されている。選抜 はまた、候補分子と反応するアフィニティー標識（例えば、基質-ビオチン）に 付着した基質分子を用いることによって行うこともできるし、または、融合分子 との別のタイプの相互作用に基づいて行うこともできる。さらに、蛋白質は、RN A酵素の単離について、バーテルとスゾスタック（Bartel and Szostak）（前記 ）によって説明されている方法と同じようにして、それらの触媒活性に基づいて 選抜することができるが、この特殊な技術によれば、所期の分子は、標的分子を それら自 身に結合させることのできる能力に基づいて選抜され、次に、その標的が存在す ることによって、機能的な分子を単離することができる。これと同じ方法を用い た新規の、または改良された触媒蛋白質を単離するための選抜法、または、別の 機能的な選抜法が、本発明によって可能になる。 さらに、本明細書において説明されているように、所期のRNA-蛋白質融合体（ または、そのDNAコピー）の選抜は、候補分子のプールの中で、この融合体を増 幅することによって容易にすることができる。このような選択的な増幅を行うた めに、サンプル中の非結合構成分子から結合パートナー-融合体複合体が実質的 に分離される条件の下で、候補であるRNA-蛋白質融合体の集団を、この融合体の RNA部位または蛋白質部位のどちらかに特異的な結合パートナー（例えば、結合 パートナーの一つが上記されている）と接触させる。この段階は反復することが でき、この技術は、好ましくは、RNA部位に特異的な結合パートナーを用いて融 合体を選択するという一つの段階と、蛋白質部位に特異的な結合パートナーを用 いて融合体を選択するというもう一つの段階という、少なくとも2つの連続的な 増幅段階を含む。さらに、融合体の同じ部位（例えば、蛋白質部位）を標的とし た増幅段階を繰り返すときは、好ましくは、異なった結合パートナーを利用する 。本明細書で説明されている特定の実施例においては、所期の融合体について、 まず、融合体のRNA部位に特異的な結合パートナーを用いて、次に、2段階の連続 段階において、どちらも融合体の蛋白質部位に特異的な、2つの異なる結合パー トナーを用いて分子集団を増幅する。再び、制限ではないが、カラムアフィニテ ィークロマトグラフィー、遠心分離、または免疫沈降などの標準的な分離技術に よって、サンプル成分からこれらの複合体を分離することができる。 なお、増幅（または選抜）混合液からのRNA-蛋白質融合体の溶出は、多くの方 法で行うことができる。例えば、本明細書において説明されているように、所期 のRNA-蛋白質融合体を単離するために、変性または非特異的な化学的溶出段階を 利用することができる。このような段階は、複合体の成分の間の、および/また は複合体の成分と固形支持体との間の非共有結合を切断することによって、比較 的非特異的な方法で、複合体の成分を、互いから、または結合している固形支持 体から解離するのを容易にする。本明細書において説明されているように、変性 、 または非特異的な化学的溶出試薬の一例は、4% HOAc/H₂Oである。この他の変性 または非特異的な化学的溶出試薬の例には、グアニジン、尿素、高塩、界面活性 剤、または非共有結合的な付加物が一般的に除去できるような他の方法が含まれ る。または、融合体分子の特異的な解離をもたらすような試薬を活用する、特異 的な化学的溶出法を利用することもできる。一つの特異的な例において、所期の 融合蛋白質のリンカーアームが、一つ以上のジスルフィド結合を含んでいたなら ば、結合している融合アプタマーを、例えば、DTTを添加することによって溶出 することができ、その結果、ジスルフィド結合が低下して結合標的が解離する。 または、親和複合体を特異的に崩壊させることによって溶出を行うことができ るが、このような技術は、複合体のメンバーを過剰に加えることによって、複合 体の成分を選択的に解離させる。例えば、ATP結合選抜法においては、過剰量のA TPをインキュベーション混合液に加えて溶出を行う。最後に、酵素的溶出を行う こともできる。この方法によって、結合している分子自体、または外から加えた プロテアーゼ（または、他の適当な加水分解酵素）が、標的または酵素のいずれ かを切断して解離させる。特異的な実施例の一つにおいて、プロテアーゼの標的 部位は、複合体の成分のいずれかに含まれていて、プロテアーゼを付加すること によって、結合している分子を溶出するかもしれない。または、触媒的な選抜に おいて、固形支持体から自身を解離する（例えば、切断する）ことができる分子 を分離するための選抜段階として溶出を利用することができる。 段階6．逆転写酵素を用いたRNA配列のDNAコピーの作出 望ましければ、選抜 されたRNA融合配列のDNAコピーは、標準的な技術のいずれか（例えば、スーパー スクリプト（Superscript）逆転写酵素）を用いて、RNA配列を逆転写して簡単に 手に入れることができる。この段階は、選抜または増幅段階の前に行うことがで きる（例えば、図16で検討されている）が、この段階の後に行うこともできる。 または、逆転写処理は、インビトロまたはインサイチューの翻訳混合液から融合 体を単離する前に行うことができる。 次に、部分的な、または全長の二本鎖配列としてDNA鋳型を増幅する。好まし くは、この段階で、適当なオリゴヌクレオチドとPCR増幅を用いて、全長のDNA鋳 型が生成される。 これらの段階、ならびにこれらの段階を行うための試薬および技術は、特異的 な実施例を用いて、これから詳しく説明される。これらの実施例は、本発明を例 示する目的で提供されている。したがって、これらを制限的なものと考えてはな らない。 RNA- 蛋白質融合体のための鋳型の作製 図1Aと2に示されているように、本発明の選抜法は、好ましくは、設計された 要素をいくつか含む二本鎖DNA鋳型を利用する。これらの要素のうち第一のもの は、mRNA合成のための所期のRNAポリメラーゼとともに用いられるプロモーター である。図1Aと本明細書で説明されているように、T7プロモーターが好ましいが 、直鎖上の二本鎖DNAからの合成を促すことのできるプロモーターを用いること もできる。 図1に示されている鋳型の第二の要素は、5'非翻訳領域（または5'UTR）と名 づけられていて、翻訳開始部位の上流にあるRNAに相当する。図1Aに示されてい るのは、タバコモザイクウイルスの5'非翻訳領域の欠失変異体で、好ましい5'UT R（「TE」と名づけられている）であるが、特に、TMVの翻訳開始位置のすぐ5'側 にある塩基に相当する。なお、このUTRの配列は、以下の通りである。すなわち 、rGrGrGrArCrArArUrUrArCrUrArUrUrUrArCrArArUrUrArCrA（最初の3つのGヌクレ オチドは、転写を増加させるために挿入されている）（配列番号：5）。この他 の適当な5'UTRを使用することもできる（例えば、Kozak，Microbiol．Rev．47:1 (9183)を参照のこと）。 図1Aに示されている第三の要素は、翻訳開始部位である。一般的に、これは、 AUG開始コドンである。しかし、天然のコード配列において、AUG以外のコドンが 使用される例があるため、これらのコドンも本発明の選抜法において用いること ができる。 図1Aに示されている第四の要素は、蛋白質の配列をコードするオープンリーデ ィングフレーム（ORFと呼ばれる）である。このオープンリーディングフレーム は、天然の、無作為の、無作為化された、変異誘発された、または全部合成され た蛋白質の配列である。 図1Aに示されている第五の要素は、3'定常領域である。この配列は、プールさ れた配列のPCR増幅と、ピューロマイシンを含むオリゴヌクレオチドのmRNAへの ライゲーションを容易にする。望ましければ、この領域は、リボソームを停止さ せ、それによって受容体部分（例えば、ピューロマイシン）がペプチジル-tRNA から生成中のペプチド鎖を受け取るための時間を増加させることのできる配列で ある停止配列を含むこともある。この停止部位については、後にもっと詳しく考 察する。 本方法を開発するために、まず、1〜2個のコドンを含む、非常に単純化された mRNA鋳型を用いて、RNA-蛋白質融合体を作製した。2つの理由で、この方法を選 んだ。まず、このサイズの鋳型は、化学合成によって簡単に作製することができ る。そしてもう一つは、小さなオープンリーディングフレームは、結合効率、末 端の不均一性、鋳型依存性、および翻訳の正確性などを含む反応の重要な特徴を 簡単に測定することを可能にした。 構築物の設計 試験用のRNA-蛋白質融合体を作製するために、基本的な構築物 を用いた。この分子は、リボソーム蛋白質L1のSD配列を3塩基欠失させたもので 、16S rRNA（すなわち、rGrGrA rGrGrA rCrGrArA）（配列番号：6）（Stomoら、 Nucleic Acids Research 10:2971-2996(1982);Shine and Dalgarno，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 71:1342-1346(1974);およびSteitz and Jakes，Proc.Natl.Acad.S ci.USA 72:4734-4738(1975)）の５塩基に相補的な、翻訳開始のためのシャイン- ダルガルノ（SD）配列、（ii）AUG開始コドン、（iii）停止配列として働くDNA リンカー（すなわち、5'-(dA)₂₇）、（iv）dCdC-3'、および（v）3'ピューロマ イシン（P）を含むmRNAからできていた。ポリdA配列を選んだのは、それが、Aサ イトでtRNAを鋳型とすることが少なく（Morganら、J．Mol．Biol．26:477-497(1 967);Ricker and Kaji，Nucleic Acids Research 19:6573-6578(1991)）、また 、十分に停止配列として作用するように設計されていたからである。オリゴdAリ ンカーの長さは、翻訳部位とペプチド転移中心との間の距離が約60〜70オングス トローム続いていることから決定した。dCdCPはtRNAのCCA末端を模倣するので、 ピューロマイシンがリボソームのAサイトに結合するのが促進されるよう設計し た。 最小鋳型43-Pの化学合成 構築物43-P（図3に示されている）を合成するため に、まず、標準的なホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成化学法と親和的 な 方法で、ピューロマイシンを固形支持体に付着させた。このオリゴの合成プロト コールは、図3に概略が図解されており、より詳しくは後述される。ピューロマ イシンを、調節された多孔ガラス（CPG）に付着するために、アプライドバイオ システムズ社（Applied Biosystems）のDNA合成機モデル380用のユーザー会報49 号（1988）で説明されているところにしたがって、トリフルオロアセチル基でア ミノ基を保護した。次に、標準的なDMT-Cl法（ゲート（Gait）、オリゴヌクレオ チド合成、実際的方法（Oligonucletide Synthesis，A Practical Approach）、 実用的応用シリーズ（The Practical Approach Series）（IRLプレス、オクスフ ォード（IRL Press，Oxford）、1984））を用いて、5'OHの保護を行い、また、3 'OHを用いてデオキシヌクレオチドの付着を行ったのと全く同じ方法で、2'OHに よるアミノヘキシルCPGへの付着を行った（図3と、ゲート（Gait）、前記参照） 。こうして、5'DMT-CPG結合して保護されたピューロマイシンが、ホスホロアミ ダイトモノマーによる鎖伸長に適したものとなった。オリゴ合成は、3'→5'の方 向に進み、（i）3'ピューロマイシン、（ii）pdCpdC、（iii）リンカーとしての 約27ユニットのdA、（iv）AUG、および（v）シャイン-ダルガルノ配列の順序で 進んだ。43-P構築物の配列を下に示す。 CPG ピューロマイシンの合成 保護されたCPGピューロマイシンの合成は、以前 概説されている（ゲート（Gait）、オリゴヌクレオチド合成、実際的方法（Olig onucletide Synthesis，A Practical Approach）、実用的応用シリーズ（The Pr actical Approach Series）（IRLプレス、オクスフォード（IRL Press，Oxford ）、1984））ように、デオキシヌクレオチドに用いた一般的な経路にしたがった 。主な出発点には、適当なＮ末阻害基を選択すること、固形支持体に2'OHのとこ で付着させること、および固形支持体への結合反応を行なうことなどである。後 者の場合には、この物質が、固形支持体よりもかなり高価であったため、活性化 されたヌクレオチドの濃度が非常に低いところで反応を行なった。この結果、希 釈した反応条件を考慮すれば、非常に満足のゆく収量（〜20μmol/g支持体）が 得られた。 N- トリフルオロアセチルピューロマイシンの合成 267mg（0.490mmol）のピュ ーロマイシン塩酸を、まず水に溶解し、pH11の炭酸緩衝液を加えてから、クロ ロホルムの中（3×）で抽出して、遊離塩基の形に変えた。有機層を蒸発させて 乾燥させ、重量を計量した（242mg，0.513mmol）。次に、遊離の塩基を11mlの無 水ピリジンと11mlの無水アセトニトリルに溶解してから、139μl（2.0mmol）の トリエチルアミノ（TFA）と139μl（1.0mmol）の無水トリフルオロ酢酸（TFAA） を加えて撹拌した。そして、薄層クロマトグラフィー（tlc）（93：7、クロロホ ルム/MeOH）によって測定して、出発物質が完全になくなるまで、この混濁液にT FAAの等量液を20μlずつ加えた（総量280μl）。この反応を1時間行なわせた。 この時点で、薄層クロマトグラフィーで二本のバンドが見えたが、どちらも、出 発物質よりは高い移動度をもっていた。NH₄OHと水で反応を進めたところ、単一 のバンドだけになった。シリカクロマトグラフィー（93：7、クロロホルム/MeOH ）によって、293mg（0.515mmol）の産物、N-TFA-Purが得られた。この反応産物 を、図4に概略的に示す。 N- トリフルオロアセチル5'-DMTピューロマイシンの合成 上記の反応からの産 物を等量液にして、水を除去するために、無水ピリジンととともに2回蒸発させ た。複数のチューブを用意して、いくつかの反応条件を調べた。少量の反応では 、27.4mg（48.2μモル）のN-TFA-Purを、0.05当量のDMAPと1.4当量のTEAを含む 、480μlのピリジンの中に溶解した。この混合液に、20.6mgのトリチルクロライ ド（60μmol）を加えて、撹拌しながら反応を完全になるよう進行させた。等量 の水（約500μl）を溶液に加えて、この反応を停止させた。この反応は成功した ように見えたので、大規模にして実験を行なった。特に、262mg（0.467mmol）の N-TFA-Purを、2.4mlのピリジンの中に溶解した後、と1.4当量のTEA、0.05当量の DMAP、および1.2当量のトリチルクロライドを加えた。約2時間後、さらに50mg（ 0.3当量）のジメトキシトリチル^*Cl（DMT^*Cl）を加えて、反応をさらに20分間進 ませた。3mlの水を加えて反応を停止させ、CH₃CNとともに3回蒸発させた。この 反応物を、100mlシリカ（乾燥）、直径2mmのカラム上で、95：5のクロロホルム/ MeOHによって精製した。精製が不完全だったため、別の同じカラム上で97.5：2. 5のクロロホルム/MeOHによって行なった。全収量は、325mgまたは0.373mmol（ま たは72%の収率）であった。この反応産物を図4に図解する。 N- トリフルオロアセチル、5'-DMT、2'スクシニルピューロマイシンの合成 少 量の反応スケールでは、32mg(37μmol)の上記合成産物を、1.2当量のDMAPと結合 させ、350μlのピリジンに溶解した。この溶液に、44μlの無水CH₃CNに入った1. 2当量の無水コハク酸を加えて一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィーによって 、出発物質が少し残っているのが分かった。大規模な反応においては、292mg(33 6μmol)の前記産物を、3mlのピリジンの中で、1.2当量のDMAPと結合させた。こ れに、無水CH₃CNに入った403μlの1M無水コハク酸を加え、混合液を一晩撹拌し た。薄層クロマトグラフィーによって、再び、出発物質が少し残っているのが分 かった。この2つの反応液を合わせて、さらに0.2当量のDMAPとコハク酸を加えた 。この産物をトルエンとともに1回蒸発させ、高い真空状態で、黄色い泡になる まで乾燥させた。CH₂Cl₂を加えて（20ml）、15mlの10%氷冷クエン酸で2回抽出し 、さらに2回、純水で抽出した。この産物を乾燥させて、2mlのCH₂Cl₂に再溶解し 、さらに、50mlのヘキサンを加えて撹拌しながら沈殿させた。そして、この産物 をボルテックスで撹拌してから、医療用の遠心分離器で600rpmで10分間遠心分離 した。溶出物のほとんどを除去してから、デシケータの中で、最初は低い真空状 態で、次に高い真空状態にして、残りの産物を乾燥させた。この反応物の収量は 約260μmolで、1工程についての収率は約70%であった。 N- トリフルオロアセチル5'-DMT、2'スクシニル、CPGピューロマイシンの合成 次に、前記工程からの産物を、1mlのジオキサンで溶解してから、0.2mlのジオキ サン/0.2mlのピリジンに溶解した。この溶液に、40mgのp-ニトロフェノールと、 140mgのジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を加えてから、反応を2時間進 行させた。この反応で産生された不溶性のシクロヘキシルウレアを遠心分離して 除去し、この産物溶液を、22mlの無水DMFに懸濁された5gのアミノヘキシル調節 多孔ガラス（CPG）に加えて、一晩撹拌した。そして、DMF、メタノール、および エーテルで樹脂を洗浄してから乾燥させた。この結果できた樹脂は、1g当り22.6 μmolのトリチルを含んでいると測定されたが、これは、このタイプの支持体に ついて十分に許容できる範囲に含まれる。そして、支持体に蓋をして、15mlのピ リジン、1mlの無水酢酸、および60mgのDMAPとともに30分間インキュベートした 。このカラム材料は、ブロッキングする前はこのカラム材料が濃青色反応を生じ たという結果とは対照的に、ニンヒドリン試験で陰性（発色なし）の結果を生 じた。この反応産物を、図４に示す。 mRNA- ピューロマイシン結合体の合成 上記で検討したように、ピューロマイ シンを繋げたオリゴを用いて、2つの方法のどちらかで、翻訳用の鋳型として働 くmRNA-ピューロマイシン結合体を作製することができる。非常に短いオープン リーディングフレームのために、ピューロマイシンオリゴは、典型的には、RNA またはDNAのモノマーとともに化学的に伸長して、全部が合成された鋳型を作出 する。より長いオープンリーディングフレームが望ましいときには、一般的には 、ムーアとシャープ（Moore and Sharp）（Science，256:992(1992)）によって 説明されているようにして、DNAスプリントとT4 DNAリガーゼを用いて、RNAまた はDNAオリゴをmRNAの3'末端に連結させる。 インビトロでの翻訳およびRNA-蛋白質融合物の試験 以下のように細菌細胞および真核細胞のインビトロ翻訳系を共に使用して、上 記のように作成した鋳型をインビトロで翻訳した。 最小鋳型のインビトロ翻訳 （i）エルマン（Ellman）ら（Methods Enzymol． 202:301（1991））が記載するように調製した大腸菌(E. coli）MRE600由来のS30 系（Zubay，Ann．Rev．Genet．7:267（1973）；Collins，Gene 6:29（1979）；C hen and Zubay，Methods Enzymol，101:44（1983）；Pratt，in Transcription and Translation:A Practical Approach，B．D．Hammes，S．J．Higgins，Eds． (IRL Press，Oxford，1984)pp.179-209;and Ellman et al.，Methods Enzymol． 202:301（1991））；（ii）クドリッキ（Kudlicki）ら（Anal．Chem．206:389（ 1992））が記載するように調製した同菌株由来のリボソーム分画；および（iii ）レスリー（Lesley）ら（J．Biol．Chem．266:2632（1991））が記載するよう に調製した大脳菌（E. coli）BL21由来のS30系を含むいくつかの異なるインビト ロ翻訳系に43-Pおよび関連するRNA-ピューロマイシン結合体を添加した。どの場 合も、使用したプレミックスはレスリー（Lesley）ら（J．Biol．Chem．266:263 2（1991））が使用したものであり、インキュベーション期間は30分とした。 融合物の性質の試験 大腸菌（E. coli）のS30翻訳抽出物を使用して43-P鋳型 をまず試験した。図5は（反応「A」）は、43-Pがリボソームに結合し、fMetの鋳 型であると同時にアクセプターとして作用する、望ましい分子内（シス）反応を 示す。鋳型への³⁵S-メチオニンの取り込みおよびその位置をまず試験し、結果を 図6Aおよび図6Bに示す。インビトロ翻訳反応混合物をフェノール/クロロホルム で抽出し、産物をSDS-PAGEにより分析すると、³⁵S標識バンドが43-P鋳型と同じ 移動度で出現した。このように合成した材料の量はMg²⁺濃度に依存した（図6A） 。至適Mg²⁺濃度は9〜18mMであると思われ、本発明の系での翻訳の最適値と類似 していた（Zubay，Ann．Rev．Genet．7:267（1973）；Collins，Gene 6:29（197 9）；Chen and Zubay，Methods Enzymol，101:44（1983）；Pratt，in Transcri ption and Translation:A Practical Approach，B．D．Haulmes，S．J．Higgins ，Eds．（IRL Press，Oxford，1984）pp.179-20；Ellman et al.，Methods Enzy mol．202:301（1991）；Kudlicki et al.，Anal．Chem．206:389（1992）；and Lesley et al.，J．Biol．Chem．266:2632（1991））。さらに、取り込まれた標 識はNH₄OHによる処理に安定であった（図6B）。これは、標識が分子の3'側の半 部に位置し（塩基安定DNA部分）、ピューロマイシンとfMetとの間のアミド結合 に期待されるように、塩基安定結合によって結合されてていることを示している 。 リボソームおよび鋳型依存性 上記に観察されたリボソーム上で生じた反応を 明らかにするために、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ機能の特異的 阻害剤の影響を試験し（図6C）、メチオニンをコードする配列を変更する影響を 調査した（図6D）。図6Cは、反応がペプチジルトランスフェラーゼ阻害剤である バージニアマイシン、ゴーゲロチンおよびクロラムフェニコール（virginiamyci n，gougerotin，and chloramphenicol）によって強力に阻害されたことをはっ きりと示している（Monro and Vazquez，J．Mol．Biol．28:161-165（1967）；a nd Vazquez and Monro，Biochemica et Biophysical Acta 142:155-173（1967） ）。図6Dは、鋳型の1つの塩基をAからCに変更することにより、9mMのMg²⁺では³⁵ Sメチオニンの取り込みを阻止し、18mMではかなり低下させることを示す（高濃 度のMg²⁺はメッセージを誤読するという事実と一致する）。これらの実験は、反 応が鋳型依存的にリボソーム上で生じることを示した。 リンカー長 リンカー長に対する反応の依存性についても試験した（図6E）。 リンカーが解読部位（鋳型のAUGが占める）からアクセプター部位（ピューロマ イシン部位が占める）までの距離にわたるように元の鋳型を設計した。距離はtR NA のアンチコドンループからアクセプターステムまでの距離、すなわち約60〜70Å とほぼ同じであった。試験した最初のリンカーは、塩基あたり最小3.4Åである ことに基づいて（≧102Å）、30ヌクレオチド長であった。30〜21ヌクレオチド の範囲では（n=27‐18；長さ≧102‐71Å）、反応効率にわずかな変化が観察さ れただけであった。従って、リンカー長は変更されてもよい。21〜30ヌクレオチ ドのリンカーが好ましい長さとなるが、80ヌクレオチドより短いリンカー、好ま しくは45ヌクレオチドより短いリンカーも本発明に使用することができる。 分子内反応と分子間反応 最後に、本発明者らは、反応が望ましく分子内に生 じたか（図5、反応「A」）または分子間で生じたか（図5、反応「B」）を試験し た。3'側のピューロマイシンを持つが、リボソーム結合配列を持たないオリゴヌ クレオチド（すなわち、鋳型25-P、13-Pおよび30-P）を43-P鋳型を含む翻訳反応 に添加することによってこれを試験した（図6F、6Gおよび6H）。反応が分子間機 序によって生じると、比較的短いオリゴも標識されるだろう。図6F〜Hに示すよ うに、比較的短い3つのオリゴは³⁵Sメチオニンの取り込みがほとんどなかった。 これは、反応が主に分子内的に生じたことを示している。25-P（配列番号：10） 、13-P（配列番号：9）および30-P（配列番号：8）の配列を以下に示す。 網状赤血球溶解産物 図6Hは、上記に使用した大腸菌（E．coli）以外にも、 インビトロ翻訳のためのウサギ網状赤血球溶解産物（以下を参照のこと）を使用 して、³⁵S-メチオニンが43-P鋳型に取り込まれることができることを示す。この 反応は、望ましくも、主に分子内機序で生じた。 c-myc エピトープタグを有する融合物の合成と試験 蛋白質部分にc-mycモノクローナル抗体9E10のエピトープタグを有する例示的 な融合物も作製した（Evan et al.，Mol．Cell Biol．5:3610（1985））。 鋳型の設計 3種類の最初のエピトープタグ鋳型（すなわち、LP77、LP154およ びプール#1）を設計し、図7A-Cに示す。最初の2つの鋳型はc-mycエピトープタグ 配列EQKLISEEDL（配列番号：2）を有し、3つめの鋳型はランダム選択プールの合 成に使用する設計であった。LP77は12アミノ酸配列をコードし、コドンは細菌翻 訳に最適化していた。LP154およびその誘導体は33アミノ酸mRNA配列を有し、コ ドンは真核細胞の翻訳に最適化していた。コードされたアミノ酸配列MAEEQKLISE ED LLRKRREQKLKHKLEQLRNSCA（配列番号：7）は、9E10抗体を単離するために使用し た元のペプチドに相当した。プール#1は、NNG/Cの27コドン（ランダムペプチド を作製する）と、その下流に、mycペプチドの最後の7アミノ酸に相当する配列（ mycエピトープ配列の一部ではない）を有した。これらの配列を以下に示す。 網状赤血球インビトロ翻訳系と小麦胚芽インビトロ翻訳系 43-P、LL77および LP154鋳型をウサギ網状赤血球翻訳系および小麦胚芽抽出物（プロメガ（Promega ）社、ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）社）翻訳系の双方で試 験した（図8）。翻訳は30℃で60分間実施した。4℃においてdT₂₅アガロースを使 用して鋳型を単離した。15mM NaOH、1mM EDTAを使用して鋳型をアガロースから 溶出し、NaOAc/HOAc緩衝液で中和し、速やかにエタノールで沈殿させ（2.5〜3容 量）、洗浄し（100%エタノール）、スピードバック（speedvac）濃縮器で乾燥し た。図8は、³⁵Sメチオニンが小麦胚芽系および網状赤血球系の双方において3種 類の全ての鋳型に取り込まれたことを示す。網状赤血球系の融合反応では鋳型の 分解はあまり観察されず、従って、この系はRNA-蛋白質融合物の作製に好ましい 。また、一般に、真核細胞系が細菌細胞系より好ましい。真核細胞はヌクレアー ゼの量がより少ない傾向にあるので、mRNAの寿命は細菌細胞より真核細胞の方が 概して10〜100倍長い。1つの特定の大腸菌（E．coli）翻訳系を使用した実験に おいて、c-mycエピトープをコードする鋳型を使用した融合物の作製は観察され なかった；鋳型の種々の位置での標識は、これが鋳型のRNAおよびDNA部分の分解 による可能性があることを示した。 これらの融合物のペプチド部分を調査するために、試料をRNaseで処理して、 コード配列を除去した。この処理により、43-P産物は³²P標識30-Pオリゴとほぼ 同じ移動度で移動した。これは30-Pに添加した非常に小さいペプチド（おそらく メチオニンのみ）に一致した。LP77は、コード配列を除去することにより、30-P オリゴより移動度の小さい産物を生成した。これは12アミノ酸ペプチドがピュー ロマイシンに添加されたという考えと一致する。最後に、LP154は、コード配列 を除去することにより、移動度がさらに小さい産物を生成した。これは30-Pオリ ゴに結合した33アミノ酸配列に一致する。RNase処理LP154網状赤血球レーンには ローディングエラーによるオリゴは観察されなかった。図9では、この産物の移 動度が小麦 胚芽抽出物中に作製された産物と同じであることを示した。要約すると、これら の結果はRNAase耐性産物が30-Pオリゴの末端に添加されたこと、産物のサイズは コード配列の長さに比例すること、および産物は大きさがほぼ同じであることを 示した。また、両方の系は類似した融合産物を産生したが、網状赤血球系は鋳型 の安定性が高いことによりより優れていると思われた。 RNase A およびプロテイナーゼK感受性 図9では、RNase Aおよびプロテイナー ゼKに対する感受性をLP154融合物を使用して試験した。レーン2〜4に示すように 、³⁵Sメチオニンの取り込みはLP154鋳型では明らかである。この産物をRNase A で処理すると、融合物の移動度は低下するが、³²P標識30-Pオリゴヌクレオチド よりはかなり大きかった。これは、3側末端に33アミノ酸ペプチドを添加したこ とに一致する。この材料をプロテイナーゼKでも処理すると、³⁵Sシグナルは完全 に消失した。これもまた、標識が30-P断片の3'側末端のペプチドに存在するとい う考えに一致した。同様の結果が、43-PとLP77の融合物を使用した同等の実験で 得られている。 ³⁵S Metによる鋳型の標識が翻訳の結果であること、さらに詳細にはリボソー ムのペプチジルトランスフェラーゼ活性によって生じたことを確認するために、 標識反応に対する種々の阻害剤の影響を調べた。真核細胞のペプチジルトランス フェラーゼの特異的な阻害剤である、アニソマイシン、ゴーゲロチンおよびスパ ルソマイシン（anisomycin，gougerotin，and sparsomycin）（Vazquez，Inhibi tors of Protein Biosynthesis（Springer-Verlag，New York）,pp．312（1979 ））、並びに転移阻害剤である、シクロヘキシミドおよびエメチン（cyclohexim ide and emetine）（Vazquez，Inhibitors of Protein Biosynthesis（Springer -Verlag，New York）,pp．312（1979））は全て、長いmyc鋳型および網状赤血球 溶解産物翻訳抽出物を使用したとき、RNA-ペプチド融合物形成を〜95%低下した 。 免疫沈降実験 mRNA-ペプチド融合物を免疫沈降させる効率を例示するために 設計した実験では、インビトロ翻訳によって作製された遊離のc-mycペプチドを 免疫沈降させる試みを実施した。図10は、SDS-PAGEペプチドゲルでアッセイした これらの実験の結果を示す。レーン1およびレーン2は、RNA124（LP154のRNA部分 ）またはβ-グロビンmRNAのどちらかを含む翻訳反応の標識材料を示す。レーン3 〜8は 、いくつかの異なる緩衝液条件下において（以下に記載）、c-mycモノクローナ ル抗体9E10を使用した、これらの反応試料の免疫沈降を示す。レーン3〜5は、RN A124由来のペプチドが効果的に免疫沈降され、最も良い例は、総TCA沈降可能計 数の〜83%が単離されたレーン4であった。レーン6〜8は、β-グロビン蛋白質を ほとんど示さない。これは精製が>100倍であることを示している。これらの結果 は、RNA124（およびLP154）によってコードされるペプチドはこの免疫沈降プロ トコールによって定量的に単離され得ることを示した。 融合物の免疫沈降反応 次に、本発明者らは、LP154翻訳反応およびc-mycモノ クローナル抗体9E10を使用して、キメラRNA-ペプチド産物を免疫沈降させる能力 について試験した（図11）。網状赤血球反応の翻訳産物は免疫沈降によって単離 し（本明細書に記載するように）、室温で30分間1μgのRNaseで処理してコード 配列を除去した。これによって5'側のOHを作製し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ で³²P標識し、変性PAGEでアッセイした。図11は、LP154融合物のRNase処理によ って作製された、c-mycエピトープと30-Pとの融合物に見られるものと同様の移 動度を有する産物（上記を参照のこと）が単離されたことを示すが、鋳型のRNA 部分（RNA124）だけを翻訳した場合には、対応する産物は作製されなかった。図 12では、単離された融合蛋白質の量を測定し、未修飾30-Pの量に対してプロット した（この図には示していない）。リンカー-mycペプチド融合物に対する未修飾 リンカーの比の値は、取り込まれたメッセージの0.2〜0.7%は融合産物に変換さ れたことを示す。より大きいリボソーム/鋳型比が存在する場合には、より大き い割合の取り込まれたRNAが融合蛋白質に変換された。試験した、取り込まれたm RNA濃度の範囲にわたって、翻訳抽出物1mlあたり約0.8〜1.0×10¹²の融合分子が 作製された。 また、本発明者らの結果は、RNA種に結合したペプチドはそのmRNAによってコ ードされたことを示した。すなわち、新生ペプチドはいくつかの他のmRNAのピュ ーロマイシンに転移しなかった。20：1もの高い比で翻訳抽出物中でリンカー（3 0-P）を長いmyc鋳型と共に同時インキュベーションした場合には、交差転移を示 すものは観察されず、遊離のリンカーの存在は、作製された長いmyc融合物の量 を有意には低下させなかった。同様に、短い鋳型と長い鋳型である、43-PとLP15 4の同時翻訳は、短い鋳型と長いmycペプチドとの融合に期待されるように、鋳型 が単 独で翻訳された場合に観察される融合産物のみを作製し、中間の移動度の産物は 観察されなかった。これらの結果は共に、融合物の形成が新生ペプチドと同じリ ボソームに結合したmRNAとの間で主に生じたことを示した。 連続的単離 インビトロ翻訳されたLP154鋳型産物の性質をさらに確認するも のとして、本発明者らは2つの異なる種類のクロマトグラフィー媒体でのこの産 物の挙動を調査した。チオプロピル（TP）セファロースにより、遊離のシステイ ンを有する産物を単離することができる（例えば、C末端に隣接したシステイン 残基を有するLP154産物）（図13）。同様に、dT₂₅アガロースにより、ポリdA配 列を有する鋳型を単離することができる（例えば、30-P）（図13）。図14は、TP セファロース次いでdT₂₅アガロースでの連続的な単離によりdT₂₅アガロース単独 で単離されるものと同じ産物を作製したことを示す。インビトロ翻訳産物がポリ Aトラクト（tract）と遊離チオールの両方を有したということは、翻訳産物が望 ましいRNA-ペプチド融合物であることを強く示した。 上記の結果はmRNA-ペプチド融合物を合成し、それらをインビトロ翻訳抽出物 から無傷で回収することをできることと一致する。このように合成された融合物 のペプチド部分は、免疫沈降および適当なクロマトグラフ技法を使用した単離に よって明らかにされるように、目的の配列を有すると思われる。上記の結果によ ると、反応は分子内的で、鋳型依存的に生じる。最後に、1%未満の鋳型修飾率の 場合でも、本発明の系は約10¹³分子の候補複合物に基づいた選択を容易にする。 c-myc エピトープ回収選択 追加のc-mycエピトープを選択するために、ランダ ム領域を有する翻訳鋳型の大きいライブラリー（例えば、10¹⁵分子）を作製した （図7Cおよび以下を参照のこと）。このライブラリーを使用して、〜10¹²〜10¹³ の融合物（本明細書に記載されているように）を作製し、抗c-myc抗体で処理し （例えば、免疫沈降によって、またはカラムもしくは他の固相支持体に固定した 抗体を使用して）、インビトロ選択を繰り返し実施してc-mycコード鋳型を濃縮 する。 融合物形成モデル 特定の理論に結びつけることなく、本発明者らは、翻訳が 正常に開始し、読み取り枠の末端まで伸長が進行する、融合物形成機序のモデル を提案する。リボソームが鋳型のDNA部分に達すると、翻訳は遅れる。この時点 で、複合体は2つの運命に分けられる：新生ペプチドの解離または新生ペプチド の鋳 型の3'側末端のピューロマイシンへの転移。転移反応の効率は、遅延した翻訳複 合体の安定性とペプチジルトランスフェラーゼ中心のAサイトへの3'-ピューロマ イシン残基の導入に影響を与える数多くの要因によって制御されやすい。転移反 応後では、mRNA-ペプチド融合物は、既知の放出因子がRNAとペプチドドメインの 安定なアミド結合を加水分解することができないので、リボソームとの結合体を 維持しているようであった。 典型的な伸長モデル（Watson，Bull．Soc．Chim．Biol．46:1399（1964））お よび中間状態モデル（Moazed and Noller，Nature 342：142（1989））は共に、 ピューロマイシンがペプチジルトランスフェラーゼ中心に導入されるためにAサ イトになにも占めていないことを必要とする。開いているAサイトに導入される ピューロマイシンにとっては、リンカーはリボソームの外側がループになってい るか、またはAサイトを通る解読部位からペプチジルトランスフェラーゼ中心ま で直接通過するかしなければならない。試験した最も短いリンカー（21nts）は リボソームの外側を通過するのにも長すぎるので、本明細書に記載するデータは これらの代替物をはっきりと区別していない。リボソーム構造のいくつかのモデ ルでは（Frank et al.，Nature 376:441（1995））、mRNAは解読部位の一方の側 に延在する溝を通過するが、この場合には、ピューロマイシンにAサイトを通過 させてペプチジルトランスフェラーゼ中心に到達させるためには、溝からリンカ ーを抜き取ることが必要であると思われる。 新生ペプチドのピューロマイシンへの転移は、リンカーに結合するペプチドの 均質性および長さによって明らかにされるように、伸長過程と比較してゆっくり であると思われる。ピューロマイシンが伸長中にアミノアシルtRNAと効果的に競 合した場合には、融合産物中に存在するリンカー-ペプチド融合物はサイズが異 なることが予測されると思われる。さらに、Met-鋳型融合物と未修飾リンカーと のゲル移動度が類似していることによって示されるように、リボソームはリンカ ー領域に読み込まれないと思われた。dA_3nは、リンカーの移動度を確かに低下さ せる（lysinc）_nをコードしなければならない。mRNAの速度の遅い抜き取りは転 移速度に比較して融合物形成速度が遅いことを説明している。予備試験による結 果は、形成された融合産物の量が、おそらく新生ペプチドがピューロマイシンま で移行 するのに利用する時間が長いために、低温での伸長された翻訳後インキュベーシ ョンにより顕著に増加することを示唆している。 詳細な材料および方法 インビトロ翻訳およびmycエピトープタグを有する融合物を含むRNA-蛋白質融 合物の試験に関する詳細な材料と方法を以下に記載する。 配列 上記のRNA-蛋白質融合物を作製するために数多くのオリゴヌクレオチド を使用した。これらのオリゴヌクレオチドは以下の配列を持つ。 オリゴヌクレオチドは全て5'側から3'側方向に掲載してある。リボヌクレオチド 塩基は、ヌクレオチドの名称の前に小文字「r」で示してある：Pはピューロマイ シンである：rNは等量のrA、rG、rCおよびrUを示す：rSは等量のrGとrCを示す； 全ての他の塩基の名称はDNAオリゴヌクレオチドを示す。 化学物質 ピューロマイシンHCl、長鎖アルキルアミン制御式細孔ガラス、ゴ ーゲロチン、クロラムフェニコール、バージニアマイシン、DMAP、塩化ジメチル トリチルおよび無水酢酸はシグマケミカル（Sigma Chemical）社（ミズーリ州セ ントルイス）から入手した。ピリジン、ジメチルホルムアミド、トルエン、無水 コハク酸およびパラ-ニトロフェノールはフルカケミカル（Fluka Chemical）（ ニューヨーク州ロンコンコマ）から入手した。β-グロビンmRNAはノバゲン（Nov agen）社（ウィスコンシン州マディソン）から入手した。TMV RNAはベーリンガ ーマンハイム（Boehringer Mannheim）社（インディアナ州インディアナポリス ）から入手した。 酵素 プロテインキナーゼKはプロメガ（Promega）社（ウィスコンシン州マデ ィソン）から入手した。DNaseを含まないRNAaseはサムブルック（Sambrook）ら （前記）により製造するか、またはベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannh eim）社から購入した。T7ポリメラーゼは報告されているグロッドベルグ（Grodb erg）およびダン（Dunn）のプロトコール（J．Bacteriol．170:1245（1988）） にザワヅキー（Zawadzki）およびグロス（Gross）（Nucl．Acids Res．19:1948 （1991））の改良を加えたものによって製造した。T4 DNAリガーゼはニューイン グランドバイオラブズ（New England Biolabs）（マサチューセッツ州ベバーリ ー）から入手した。 放射能標識導入の定量 放射活性ゲルバンドでは、各バンドに存在する放射標 識（³⁵Sまたは³²P）の量をベータゲン（Betagen）603ブロットアナライザー（ベ ータゲン（Betagen）、マサチューセッツ州ワルサム）で、またはホスホールイ メージャープレート（phosphorimager plates）（モレキュラーダイナミクス（M olecular Dynamics）、カリォオルニア州サニーベール）を使用して定量測定し た。液体試料および個体試料は、存在する放射能標識（³⁵Sまたは³²P）の量をシ ンチレーション計数（ベックマン（Beckman）、メリーランド州コロンビア）に よって測定した 。 ゲル画像 ゲル画像はオートラジオグラフィー（コダック（Kodak）XARフィル ムを使用）によって、または）ホスホールイメージャープレート（phosphorimag er plates）（モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics））を使用して 得た。 CPG ピューロマイシンの合成 CPG-ピューロマイシンの合成の詳細なプロトコ ールは上記に概略してある。 酵素反応 一般に、大腸菌（E. coli）抽出物を使用したキナーゼのための核 酸の調製、転写、PCRおよび翻訳反応は同じであった。各調製プロトコールは等 容量の1:1フェノール/クロロホルムを使用した抽出から開始し、次に遠心分離、 水相の単離であった。酢酸ナトリウム（pH5.2）およびスペルミジンを、それぞ れ最終濃度300mMおよび1mMまで添加し、3容量の100%エタノールを添加して、-70 ℃において20分間インキュベーションすることによって試料を沈殿させた。試料 を＞12,000gで遠心分離し、上清を除去し、ペレットを過剰量の95%エタノールで 0℃において洗浄した。得られたペレットを次いで真空下で乾燥し、再懸濁させ た。 オリゴヌクレオチド 全ての合成DNAおよびRNAは、製造業者が提供するように （Milligen，Bedford，MA）、各々のための標準的な化学物質を使用して、ミリ ポア エクスペダイト（Millipore Expedite）合成装置で合成した。3'ピューロ マイシンを有するオリゴヌクレオチドは、30〜50mgの固相支持体を充填したCPG ピューロマイシンカラムを使用して合成した（〜20μmoleピューロマイシン/グ ラム）。3'ビオチンを有するオリゴヌクレオチドはグレンリサーチ（Glen Resea rch）（バージニア州スターリング）製の1μmoleバイオテグ（bioteg）CPGカラ ムを使用して合成した。5'ビオチンを有するオリゴヌクレオチドは5'塩基として バイオテグホスホラミダイト（bioteg phosphoramidite）（グレンリサーチ（Gl en Research））を添加することによって合成した。RNA分子の3'側末端に結合さ れるオリゴヌクレオチドは5'側末端の化学的リン酸化（グレンリサーチ（Glen R esearch）製の化学的リン酸化試薬を使用）した後に脱保護するか、または脱保 護後にATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラブ ズ（New England Biolabs））を使用して酵素的にリン酸化した。DNAだけ（およ び3'ピューロ マイシンまたは3'ビオチン）を含む試料は、25%NH₄OHを添加し、次に55℃で12時 間インキュベーションすることによって脱保護した。RNAモノマー（例えば、43- P）を含む試料は、NH₄OH溶液にエタノール（25%(v/v)）を添加し、55℃で12時間 インキュベーションすることによって脱保護した。2'OHは、1M TBAFのTHF溶液（ シグマ（Sigma）社）を使用して室温で48時間脱保護した。TBAFはNAP-25セファ デックスカラム（ファルマシア（Pharmacia）、ニュージャージー州ピスカタウ ェイ）を使用して除去した。 脱保護後のDNAおよびRNA試料は、次いで変性PAGEを使用して精製し、次にソー キングまたは、エルトラップ（Elutrap）（シュレイチャー アンド シャクル （Schleicher and Schuell）、ニュハンプシャー州ケーン）を使用してゲルから 電気溶出（electro-eluting）し、上記のようにNAP-25セファデックスカラムま たはエタノール沈殿することによって脱塩した。 myc DNA 構築 c-mycエピトープタグを有する2つのDNA鋳型を構築した。最初の 鋳型は、オリゴヌクレオチド64.27（5'-GTT CAG GTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT TTC GTC CTC CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3'）（配列番号：18 ）および18.109（5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3'）（配列番号：19）の組み合 わせから製造した。この鋳型を使用した転写は、ペプチドMEQKLISEEDLN（配列番 号：20）をコードしたRNA47.1を作製した。RNA47.1と30-Pとの連結は図7Aに示す LP77を作製した。 第2の鋳型は、RWR99.6の名称を持ち、配列5'AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG TT C CAG TTT GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTC TTC AGA GA T CAG TTT CTG TTC AGC CAT-3'（配列番号：21）を有する、長さ99塩基の１つの オリゴヌクレオチドとしてまず作製した。この配列を有する2本鎖転写鋳型は、 報告されているプロトコール（Ausubel et al.，前記、15章）により、オリゴRW R 21.103（5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-3'）（配列番号：22）とRWR 63.26 （5'TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA GAA CAG AAA CTG-3'）（配列番号：23）を用いたPCRによって構築した。この鋳 型を使用した転写は、ペプチドをコードする、RNA124と呼ばれるRNAを作製した 。 MAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA（配列番号：24）、このペプチドは、担体 蛋 白質（オンコジーン サイエンス テクニカル ブルチン（Oncogene Science T echnical Bullutin））と結合したとき、モノクローナル抗体9E10を産生するた めに使用される配列を有した。RNA124は長さが124ヌクレオチドで、RNA124と30- Pとの連結は図7Bに示すLP154を作製した。RNA124の配列を以下に示す（配列番号 ：32）： ランダムプール構築 ランダムプールは、RWR130.1と命名される長さ130塩基 の1つのオリゴヌクレオチドとして構築した。3'側末端から開始して、配列は3'C CCTGTTAATGATAAATGTTAATGTTAC(NNS)₂₇GTC GAC GCA TTG AGA TAC CGA-5'（配列番 号：25）であった。Nはランダム位置を示し、この配列は合成機の標準的なプロ トコールにより作製した。SはdGとdC塩基の等量混合物を示す。PCRはオリゴヌク レオチド42.108（5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT A CA）（配列番号：26）と21.103（5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG）（配列番号 ：27）を用いて実施した。この鋳型の転写はプール130.1と命名されるRNAを作製 した。プール130.1を30-Pに連結すると、図7Cに示すプール#1（LP160とも呼ばれ る）を作製する。 （i）RVVR130.1の出発濃度は30ナノモルであった、（ii）各プライマーを1.5 μMの濃度で使用した、（iii）dNTP濃度が各塩基について400μMであった、およ び（iv）Taqポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）社 ）を100μlあたり5単位の濃度で使用したこと以外は、報告されているプロトコ ール（Ausubelら、前記）により7サイクルのPCRを実施した。2本鎖産物を非変性 PAGEで精製し、電気溶出によって単離した。DNAの量は260nmのUV吸光度と臭化エ チジウム蛍光発光の既知の標準品との比較によって測定した。 RNA の酵素的合成 2本鎖PCR DNAおよび合成オリゴヌクレオチドの転写反応は 、以前に記載したように（Milligan and Uhlenbeck，Meth．Enzymol．180:51（1 98 9））実施した。全長のRNAを、上記のように変性PAGE、電気溶出および脱塩によ り精製した。プールRNA濃度は、吸光係数1300 O.D./μmole;RNA 124、1250 O.D. /μmole;RNA 47.1、480 O.D./μmoleを使用して推定した。2本鎖プールDNAから の転写は〜90ナノモルのプールDNAを作製した。 RNA- ピューロマイシン複合物の酵素的合成 mycおよびブールメッセンジャーR NA配列の、オリゴヌクレオチドを有するピューロマイシンとの連結を、ムーア（ Moore）およびシャープ（Sharp）（Science250:992（1992））が記載する手順と 類似した手順を使用して、19.35（5'-TTT TTT TTT TAG CGC AAG A）（配列番号 ：28）と呼ばれるDNAスプリント（splint）を使用して実施した。反応はmRNA、 スプリントおよびピューロマイシンオリゴヌクレオチド（30-P、dA27dCdCP)がモ ル比0.8:0.9:1.0であり、プールmRNAIピコモルあたりDNAリガーゼは1〜2.5単位 であった。反応は室温において1時間実施した。プールRNA融合物の構築は、mRNA 濃度は〜6.6μMであった。連結後、RNA-ピューロマイシン結合体を酵素反応につ いて上記したように調製した。上記のように、沈殿を再懸濁し、全長の融合物を 変性PAGEで精製し、電気溶出により単離した。プールRNA濃度は吸光計数1650 O. D./μmoleおよびmyc鋳型1600 O.D./μmoleを使用して推定した。この方法では、 2.5ナノモルの結合体が作製された。 dT₂₅ ストレプトアビジンアガロースの調製 3'ビオチンを含む1〜10μM濃度の dT₂₅（バイオテグホスホルアミダイト（biotag phosphoramidite）カラム（グレ ンリサーチ（Glen Research）で合成）をストレプトアビジンアガロースのスラ リー（50容量%のアガロース、ピアース（Pierce）社、イリノイ州ロックフォー ド）と共にTE（10mM Tris Chloride pH8.2，1mM EDTA）中で室温において1時間 インキュベーションし、洗浄した。次いで、アガロースの結合能力を、溶液から のビオチン-dT₂₅の消失によって、および／または既知量の相補的なオリゴヌク レオチドを含む樹脂を滴下することによって、光学的に推定した。 大腸菌（E．coli）由来抽出物およびリボソームを使用した翻訳反応 一般に 、購入したキット（例えば、直鎖鋳型のためには大腸菌（E．coli）S30抽出物、 プロメガ（Promega）社、ウィスコンシン州マディソン）を使用して翻訳反応を 実施した。しかし、大脳菌（E．coli）MRE600（ATCCから入手、メリーランド州 ロック ビル）も使用して、報告されているプロトコール（例えば、Ellman et al.，Met h．Enzymol．202:301（1991））によって調製したS30抽出物を作製し、またクド リッキ（Kudlicki）ら（Anal．Biochem．206:389（1992））が記載するようにリ ボソーム分画を調製した。マーカーとして20〜40μCiの³⁵Sメチオニンを用いて5 0μlの容量で標準的な反応を実施した。反応混合物は、30v/v%抽出物、9〜18mM MgCl₂、メチオニンを除いた40v/v%プレミックス（プロメガ（Promega）社）およ び5μMの鋳型（例えば、43-P）からなった。同時インキュベーション実験では、 オリゴ13-Pおよび25-Pを5μMの濃度で添加した。リボソームを使用した実験では 、溶解物の代わりに反応につき3μlのリボソーム溶液を添加した。全ての反応は 37℃において30分間インキュベーションした。酵素反応下で上記のように鋳型を 精製した。 小麦胚芽翻訳反応 製造業者の勧告に従い、メチオニンを含まない購入キット （プロメガ（Promega）社を使用して図8の翻訳反応を実施した。鋳型の濃度は43 -Pでは4μMで、LP77およびLP154では0.8μMであった。反応は、30μCi³⁵Sメチオ ニンを用いて総容量25μlで25℃において実施した。 網状赤血球翻訳反応 購入キット（ノバゲン（Novagen）社、ウィスコンシン 州マディソン）または報告されているプロトコール（Jackson and Hunt，Mrth． Enzymol．96:50（1983））により調製した抽出物を使用して翻訳反応を実施した 。網状赤血球が豊富な血液はペル-フリーズバイオロジカルズ（Pel-Freez Biolo gicals）（アラスカ州ロジャーズ）から入手した。両者の場合、反応条件はレッ ドノバリセート（Red Nova Lysate）（ノバゲン（Novagen）社）と共に使用する ことが勧められるものであった。反応は、100mM KCl、0.5mM MgOAc、2mM DTT、2 0mM HEPES pH7.6、8mMリン酸クレアチン、各アミノ酸の25μM（³⁵Sを使用した場 合には、メチオニンを除く）および40v/v%の溶解物からなった。インキュベーシ ョンは30℃で1時間とした。鋳型の濃度は実験に依存したが、一般に、50nM〜1μ Mであり、43-Pは例外で4μMであった（図6H）。 ランダムプールの作製は、10mlの翻訳反応を鋳型濃度〜0.1μM（1.25ナノモル の鋳型）において実施した。また、³²Ｐ標識鋳型を反応物中でインキュベーショ ンし、精製および選択手順の各段階に存在する材料の量を測定した。30℃におい て 1時間の翻訳の後、反応物を氷上で30〜60分間冷却した。 dT₂₅ ストレプトアビジンアガロースを用いた融合物の単離 インキュベーショ ン後、翻訳反応物を、dT₂₅濃度が〜10μMである10倍モル量より過剰量のdT₂₅-ビ オチン-ストレプトアビジンアガロースを含有する単離緩衝液（1.0M NaCl、0.1M Tris Chloride pH8.2、10mM EDTA、1mM DTT）で約150倍に希釈し（溶解物の容 量に等しいかまたはそれ以上の容量のスラリー）、４℃において1時間攪拌しな がらインキュベーションした。次いで、ろ過（ミリポア（Millipore）ウルトラ フリーMCフィルター）または遠心分離のいずれかによってアガロースを混合物か ら除去し、冷却した単離緩衝液で2〜4回洗浄した。次いで、15mM NaOH、1mM EDT Aの50〜100μl分量で繰り返し洗浄することによって、dT₂₅ストレプトアビジン アガロースから鋳型を遊離させた。溶出液を速やかに3M NaOAc pH5.2、10mMスペ ルミジンで中和し、エタノールで沈殿させた。プール反応物では、回収した総放 射能が、導入された鋳型の約50〜70%は回収されたことを示した。 チオプロピルセファロースによる融合物の単離 システインを含有する融合物 は、図13のように、チオプロピルセファロース6Bを使用して精製することができ る（ファルマシア（Pharmacia））。本明細書に記載する実験では、単離は翻訳 反応物から直接実施したり、または融合物を最初に単離した後に実施した（例え ば、ストレプトアビジンアガロースを用いて）。例えば、直接精製する場合には 、溶解物に対するセファロースの比は1:10（v/v）を使用した。プールでは、0.5 mlのセファローススラリーを使用して、5mlの反応混合物から融合材料の全てを 単離した。DNaseを含まないRNase（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannh eim）社）を含有する1倍量のTE8.2（10mM Tris-Cl、1mM EDTA、pH8.2）で試料を チオプロピルセファロースの50:50（v/v）スラリーに希釈し、4℃において回転 させながら1〜2時間インキュベーションし、完全に反応させた。過剰の液体を除 去し、20mM DTTを含有する単離緩衝液でセファロースを繰り返し洗浄し、遠心分 離またはろ過により回収した。25〜30mMのジチオスレイトール（DTT）の10mM Tr is Chloride pH8.2、1mM EDTA溶液を使用して融合物をセファロースから溶出し た。次いで、上記のように、高真空下での留去およびエタノール沈殿を組み合わ せることによって、融合物を濃縮した。プール反応物では、回収した総放射能が 、鋳型の 約1%が融合物に変換したことを示した。 所与の用途のためには、dT₂₅をこの溶出液に添加して、4℃において1時間回転 させた。冷却した単離緩衝液でアガロースを3回すすぎ、ろ過によって単離し、 結合材料を上記のように溶出させた。担体tRNAを添加し、融合産物をエタノール 沈殿させた。DNaseを含まないRNase Aを含有するTE pH8.2に試料を再懸濁し、鋳 型のRNA部分を除去した。 免疫沈降反応 4μlの網状赤血球翻訳反応物、2μlの正常マウス血清および20 μlのプロテインG+Aアガロース（カルビオケム（Calbiochem）社、カリフォルニ ア州ラホヤ）とPBS（58mM Na₂HPO₄、17mM NaH₂PO₄、68mM NaCl）、希釈緩衝液（ 10mM Tris Chloride pH8.2、140mM NaCl、1v/v% Triton X-100）、またはPBSTDS （PBS+1% Triton X-100、0.5%デオキシコール酸塩、0.1%SDS）のいずれかの200 μlとを混合することによって、翻訳反応物のペプチドの免疫沈降（図10）を実 施した。次いで、試料を4℃において1時間回転させ、次に2500rpmで15分間遠心 分離した。溶出液を除去し、10μlのc-mycモノクローナル抗体9E10（カルビオケ ム（Calbiochem）社、カリフォルニア州ラホヤ）および15μlのプロテインG+Aア ガロースを添加し、4℃において2時間回転した。次いで、試料をPBS、希釈緩衝 液またはPBSTDSのいずれかの1mlで2回洗浄した。40μlのゲルローディング緩衝 液（カルビオケム（Calbiochem）社製品便覧）を混合物に添加し、シャガー（Sc hagger）およびファン ジャゴウ（von Jagow）（Anal．Biochem．166:368（198 7））が記載するように、20μlを変性PAGEにローディングした。 8μlの網状赤血球翻訳反応物と300μlの希釈緩衝液（10mM Tris chloride pH8 .2、140mM NaCl、1v/v%Triton X-100）、15μlプロテインGセファロース（シグ マ（Sigma）社）および10μl（1μg）のc-myc抗体9E10（カルビオケム（Calbioc hem）社）を混合することによって融合物の免疫沈降（図11に示す）を実施し、 次に4℃において数時間回転した。単離後、試料を洗浄し、DNaseを含まないRNas eAで処理し、ポリヌクレオチドキナーゼと³²PガンマATPで標識し、変性尿素PAGE によって分離した（図11）。 融合物プールの逆転写 鋳型、水およびプライマーを70℃においてわずか2分 間インキュベーションした以外は、スーパースクリプト（Superscript）IIに関 する 製造業者の推奨事項に準拠して逆転写反応を実施した（ギブコ（Gibco）BRL、ニ ューヨーク州グランドアイランド）。伸長をモニターするために、50μCiのα³² PdCTPをいくつかの反応物中でインキュベーションし、別の反応物中では、³²Pα ATP（ニューイングランドヌクレアー（New England Nuclear）社、マサチューセ ッツ州ボストン）とT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラ ブズ（New England Biolabs）、マサチューセッツ州ベバリー）を使用して調製 した5'³²P-標識プライマーを使用して逆転写をモニターした。 プロテインGおよび抗体セファロースの調製 50μlのプロテインGセファロー ススラリー（固形分50容量%）（Sigma）の２分量を希釈緩衝液（10mM Tris chlo ride pH8.2、140mM NaCl、0.025% NaN₃、1v/v% Triton X-100）で洗浄し、遠心 分離によって単離した。最初の分は、選択マトリックスに先立つプレカラムとし て使用するために保存した。2番目の分を希釈緩衝液に再懸濁した後、40μgのc- myc AB-1モノクローナル抗体（オンコジーンサイエンス（Oncogene Science）） を添加し、反応物を4℃において一晩回転させながらインキュベーションした。 次いで、1500〜2500rpmで15分間微小遠心管中で遠心分離することによって抗体 セファロースを精製し、希釈緩衝液で1〜2回洗浄した。 選択 融合物を単離し、相補鎖を合成後、逆転写反応物全てを選択過程におい て直接使用した。２つのプロトコールを本明細書において概略する。1回目は、 上記のように調製した抗体セファロースに逆転写反応物を直接添加し、2時間イ ンキュベーションした。次の回では、洗浄したプロテインGセファロースと共に 反応物を〜2時間インキュベーションし、その後抗体カラムを通過させ、固定さ れた抗体ではなくプロテインGと相互作用する結合物質の数を低下させた。 マトリックスからプールを溶出するために、いくつかの方法を採用することが できる。最初は、4%酢酸による選択マトリックスの洗浄である。この手順は、マ トリックスからペプチドを遊離させる。または、よりストリンジェントな洗浄（ 例えば、尿素または他の変性物質を使用）を酢酸方法の代わりに、または酢酸方 法に追加して使用することができる。 選択された融合物のPCR プールの構築に関して上記した標準的な方法を使用 して、選択された分子をPCRで増幅した。β-グロビン融合体の合成および試験 β-グロビン融合構築物を合成するため、製造元のプロトコルに従って、グロ ビンmRNA 2.5μgからプライマー18.155（5’GTG GTA TTT GTG AGC CAG）（配列 番号：29）およびスーパースクリプト逆転写酵素（Gibco BRL社）200ピコモルを 用いた逆転写によってβ-グロビンcDNAを作製した。プライマー配列は、停止コ ドンのβ-グロビン5'の18ヌクレオチドと相補的であった。T7プロモーターを加 えるために、逆転写反応液20μlを採取して、プライマー18.155および40.54（5 ’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C）（配列番号：30 ）を用いたPCR６サイクルを行った。次に、得られた「syn-β-グロビン」mRNAを 、ミリガン＆アーレンベック（Milligan and Uhlenbeck）（Methods Enzymol.18 0：51（1989））に従ってT7ランオフ転写によって生成し、RNAゲルを精製して、 電気溶出して本明細書に記述のように脱塩した。次に、ムーア＆シャープ（Moor e and Sharp）（Science 256：992（1992））の方法に従って、プライマー20.26 2（5’TTT TTT TTT T GTG GTA TTT G）（配列番号：31）をスプリントとして用 いて、「LP-β−グロビン」をsyn-β-グロビン構築物から、同構築物を30-Pとラ イゲーションすることによって生成した。次にライゲーション反応産物をケル精 製して、電気溶出し、上記のように脱塩した。最終産物の濃度は260nmでの吸光 度から決定した。 次に、これらのβ-グロビン鋳型を表１に記述のように総容量それぞれ25μlで インビトロで翻訳した。25mM原液からMg²⁺を加えた。反応は全て30℃で１時間行 い、-20℃で一晩放置した。次に、溶解物６μlを用いてdT₂₅沈殿可能なCPMを２ 回測定し、バックグラウンドを差し引いた値を平均した。表１ β-グロビン鋳型を用いた翻訳反応 ゲル分析用の試料を調製するため、各翻訳反応液６μlを単離用緩衝液（1M Na Cl、100mMトリスCl pH8.2、10mM EDTA、0.1mM DTT）1000μl、RNアーゼA（DNア ーゼ不含、Boehringer Mannheim社）１μl、および20μM dT₂₅ストレプトアビジ ンアガロース20μlと混合した。試料を回転させながら４℃で１時間インキュベ ートした。過剰量の単離用緩衝液を除去して、試料をミリポア（Millipore）MC フィルターに加えて、残留単離用緩衝液を除去した。次に試料をH₂O50μlで４回 洗浄して15mM NaOH、１mM EDTA 50μlで２回洗浄した。試料（300μl）をTE pH6 .8（10mMトリスCl、１mM EDTA）100μlで中和して１mg/ml RNアーゼA（上記）１ μlを加え、試料を37℃でインキュベートした。次に、２×SDSローディング用緩 衝液（125mMトリスCl、pH6.8、２％SDS、２％β-メルカプトエタノール20％グリ セロール、0.001％ブロモフェノールブルー）10μlを加え、試料を凍結乾燥させ てH₂Oおよび１％β-メルカプトエタノール20μlに再懸濁した。次に、シャガー ＆フォンヤゴウ（Schagger and von Jagow）（Analytical Biochemis try 166： 368（1987））が記述したように、ペプチド分解ゲル上に試料をローディングし てオートラジオグラフィーによって可視化した。 これらの実験の結果を図15Aおよび15Bに示す。図15Aに示すように、³⁵S-メチ オニンをsyn-β-グロビンおよびLP-β-グロビンの蛋白部分に取り込ませた。蛋 白は不均一であったが、１つの強いバンドがβ-グロビンmRNAについて予想され る移動度 を示した。同様に、図15Bに示すように、dT₂₅単離およびRNアーゼＡ消化の後、s yn-β-グロビンのレーンには³⁵S-標識材料は残っていなかった（図15B、レーン ２〜４）。対照的に、LP-β-グロビンのレーンでは、均一な大きさの³⁵S-標識産 物を認めた。 これらの結果から、上記のように、鋳型が3'ピューロマイシンを含む場合に限 って、融合産物がオリゴヌクレオチドアフィニティクロマトグラフィーによって 単離されることが示された。このことはシンチレーションカウントによって確認 した（表１参照）。得られた材料は、β-グロビンの何らかの部分と融合した30- Pリンカーを含むと予想される。融合産物はゲル分析から判断する限り、大きさ が全く均一であるように思われた。しかし、産物は天然のβ-グロビンと非常に 類似の移動度を示したため（図15Aおよび15B、対照レーン）、融合産物の蛋白部 分の正確な長さを測定することは困難であった。 RNA 蛋白融合体形成のさらなる最適化 特定の要因がRNAペプチド融合体の形成効率をさらに増加させることが判明し た。融合体形成、すなわちmRNAの3'末端でのそのtRNAからピューロマイシン部分 への未完成のペプチド鎖の移動は、未完成のペプチドを生成する初回の比較的迅 速なオープンリーディングフレームの翻訳の後に続く遅い反応である。融合体形 成の程度は、Mg²⁺濃度を上昇させた条件（好ましくは、50〜100mMの範囲）下で の翻訳後インキュベーションによって、および／またはmRNAとピューロマイシン 部分との間により柔軟なリンカーを用いることによって、実質的に増強される可 能性がある。さらに、低温（好ましくは-20℃）での長期間のインキュベーショ ン（12〜48時間）によっても、30℃でのインキュベーションの際に起こる場合よ りmRNA分解が少ない融合体の収率増加が得られる。これらの要因を組み合わせる ことによって、下記に示すように、加えたmRNAの40％までがmRNAペプチド融合産 物に変換される可能性がある。 mRNA- ピューロマイシン結合体の合成 これらの最適化実験において、ピュー ロマイシン含有リンカーオリゴヌクレオチドを、おおよそ上記のように相補的DN Aスプリントの存在下でバクテリオファージT4 DNAリガーゼを用いて、mRNAの3' 末端にライゲーションした。T4 DNAリガーゼは、ライゲーション結合部近傍で正 確な 塩基対形成を嗜好し、T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼによるランオフ転写産 物はしばしばその3'末端が不均一であるため（Nucleic Acids Research 15：878 3（1987））、正しい3'-末端ヌクレオチドを含むRNAのみが効率よくライゲーシ ョンされた。標準的なDNAスプリントを用いた場合、ランオフ転写産物の約40％ がピューロマイシンオリゴとライゲーションされた。RNA量が過剰であればライ ゲーション産物の量は増加したが、ピューロマイシンオリゴヌクレオチドが過剰 である場合は増加しなかった。特定の理論にとらわれることなく、ライゲーショ ンの制限要因はDNAスプリントの対応する領域と完全に相補的であるRNAの量であ るように思われた。 それらの転写物のライゲーションを3'末端で余分の非鋳型ヌクレオチドで終わ らせるために（「N+1産物」と命名する）、標準的なDNAスプリントと、ライゲー ション結合部でさらなるランダム塩基を含む新たなDNAスプリントとの混合物を 用いた。ライゲーション効率は、そのような混合DNAスプリントの存在下では典 型的なmycRNA鋳型（すなわちRNA 124）の場合70％以上増加した。 この改変DNAスプリントアプローチの他に、mRNA-ピューロマイシン結合体形成 の効率は、以下の３つの要因を考慮に入れることによってもさらに最適化された 。第一に、好ましくは、スプリントヌクレオチドとのアニーリングを妨害する何 らかの有意で安定な二次構造を有する3'-末端を欠損するmRNAを構築または利用 した。さらに、高濃度の塩は時にライゲーション反応の失敗を引き起こすため、 好ましくは、NAP-25カラムを用いたオリゴヌクレオチドの完全な脱塩を、技法の １段階として含めた。最後に、ライゲーション反応は比較的迅速で、室温では40 分以内におおむね完了したため、有意に長いインキュベート期間は一般に用いら れず、しばしばRNAの不必要な分解が起こった。 上記の条件を用いて、mRNA-ピューロマイシン結合体を以下のように合成した 。myc RNA配列（RNA 124）とピューロマイシン含有オリゴヌクレオチドとのライ ゲーションは、標準的なDNAスプリント（例えば、5'-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA）ま たはライゲーション結合部にランダム塩基（N）を含むスプリント（例えば、5'- TTTTTTTTTTNAGCGCAAGA）のいずれかを用いて行った。反応はmRNA、DNAスプリン ト、およびピューロマイシンオリゴヌクレオチドをモル比1.0：1.5〜2.0：1.0で 含んだ 。これらの成分の混合物をまず、94℃で１分間加熱して、次に氷上で15分冷却し た。ライゲーション反応は、50mMトリス塩酸（pH7.5）、10mM MgCl₂、10mM DTT 、１mM ATP、25μg/ml BSA、15μMピューロマイシンオリゴ、15μM mRNA、22.5 〜30μM DNAスプリント、RNasin阻害剤（Promega社）1U/μl、およびT4 DNAリガ ーゼをピューロマイシンオリゴ１ピコモルあたり1.6単位を含む溶液中で室温で １時間行った。インキュベーションの後、EDTAを最終濃度30mMとなるように加え 、反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出した。PAGEを変性させて全長の 結合物を精製し、電気溶出によって単離した。 網状赤血球翻訳条件全般 mRNA-ピューロマイシン結合体の合成を改善するこ とに加えて、翻訳反応を以下のようにさらに最適化した。反応は、異なる販売元 （Novagen社、Madison、WI；Amersham社、Arlington Heights，IL；Boehringer Mannheim社、Indianapolis、IN；Ambion社、Austin、TX；およびPromega社、Mad ison、WI、のウサギ網状赤血球溶解物において実施した。典型的な反応混合物（ 最終容量25μl）は、20mM HEPES pH7.6、２mM DTT、８mM燐酸クレアチン、100mM KCl、0.75mM Mg(OAc)₂、１mM ATP、0.2mM GTP、25μM各アミノ酸（³⁵S-Metを用 いる場合には0.7μMメチオニン）、RNasin１U/ml、および60％（v/v）溶解物を 含んだ。鋳型の最終濃度は50nM〜800nMの範囲であった。各インキュベーション について、溶解物を除く全ての成分を氷上で注意深く混合して、凍結した溶解物 を使用直前に融解した。溶解物を加えた後、反応混合物を緩やかなピペッティン グによって十分に混合して、30℃でインキュベートして翻訳を開始させた。Mg²⁺ およびK⁺の至適濃度は異なるmRNAについてそれぞれ、0.25mM〜２mMおよび75mM〜 200mMの範囲内で、好ましくは予備実験において決定した。翻訳の不十分なmRNA に関しては特に、ヘミン、燐酸クレアチン、tRNA、およびアミノ酸の濃度もまた 時に最適化した。融合反応に関しては、酢酸カリウムより塩化カリウムが一般に 好ましかったが、KClとKOAcの混合物は時によりよい結果を生じた。 30℃で30〜90分間翻訳した後、反応を氷上で40分冷却し、Mg²⁺を加えた。この 段階で加えたMg²⁺の最終濃度もまた、異なるmRNA鋳型について最適化したが、一 般に50mM〜100mMの範囲であった（混合鋳型のプールには50mMを用いることが好 ましい）。得られた混合物を-20℃で16〜48時間インキュベートした。標識した 融合 産物を可視化するために、反応混合物２μlをローディング用緩衝液４μlと混合 して、混合物を75℃で３分間加熱した。得られた混合物を６％グリシンSDS-ポリ アクリルアミドゲル（³²P-標識鋳型用）または８％トリシンSDS-ポリアクリルア ミドゲル（³⁵S-Met標識鋳型用）にローディングした。このアプローチの代用と して、融合産物はまた、おおむね本明細書に記述のように、dT₂₅ストレプトアビ ジンアガロースまたはチオプロピルセファロース（またはその両者）を用いて単 離してもよい。 SDS-PAGEによって後に分析するため、RNA-リンカー-ピューロマイシン-ペプチ ド結合体のRNA結合部分を除去するために、適当量のEDTAを翻訳後インキュベー ションの後に加え、反応混合物をミクロコン-10（またはミクロコン-30）カラム を用いて脱塩した。得られた混合液２μl（全体で約25μl）を、RNアーゼH緩衝 液（30mMトリス塩酸、pH7.8、30mM(NH₄)₂SO₄、８mM MgCl₂、1.5mMβ-メルカプト エタノール、および適当量の相補的DNAスプリント）18μlと混合し、混合液を４ ℃で15分間インキュベートした。次にRNアーゼHを加え、37℃で20分消化させた 。 ピューロマイシンオリゴの質 ピューロマイシンオリゴヌクレオチドの質も、 融合産物の効率的な生成にとって重要であった。5'-DMT、2'-スクシニルN-トリ フルオロアセチルピューロマイシンとCPGとのカップリングは、標準的なヌクレ オチドのカップリングほど効率的ではなかった。そのため、カップリング反応を 注意深くモニターして、カップリングしたピューロマイシンの濃度をかなり低く してCPGが形成されないようにし、3'-末端ピューロマイシンを欠損するオリゴヌ クレオチドが続いて合成されないようにするため、CPG上の未反応のアミノ基を 十分に消滅させた。また、これらは続く自動化オリゴヌクレオチド合成段階の際 にバルブの目詰まり問題を引き起こしうるため、非常に細かいメッシュ粒子を含 むCPGを用いないようにすることも重要である。 さらに、合成されたピューロマイシンオリゴは、3'末端でピューロマイシンが 存在することを確認するために、大規模で使用する前に試験することが好ましい 。われわれの実験では、ピューロマイシンを3'末端で一級アミノ基を含むデオキ シアデノシンに置換すれば、融合体は検出されなかった。3'ヒドロキシル基の有 無を調べるために（すなわち、3'-末端ピューロマイシンを欠損するオリゴの望 ま しくない合成）、ピューロマイシンオリゴをまず放射標識し（例えば5'-燐酸化 ）、次にプライマーとして用いてターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ ェラーゼによって伸長させた。3'-末端ピューロマイシン部分の存在下では、伸 長産物を認めなかった。 翻訳および翻訳後インキュベーションの時間経過 翻訳反応は比較的迅速で、 30℃では概して25分以内に完了した。しかし、融合反応は遅かった。標準的なリ ンカー（dA₂₇dCdCP）を30℃で用いた場合、融合体の合成はさらに45分で最高レ ベルに達した。翻訳後インキュベーションはより低い温度、例えば室温、０℃、 または-20℃で実施することが可能であった。-20℃ではmRNA鋳型の分解はより少 なかったが、最善の融合結果は-20℃で２日間インキュベートした後に得られた 。 Mg²⁺ 濃度の効果 翻訳後インキュベーションの際にMg²⁺の濃度が高ければ、融 合体形成は大きく刺激された。例えば、上記のようなmyc RNA鋳型では、50mM Mg²⁺ の存在下で標準的なリンカー（dA₂₇dCdCP）を用いて-20℃で16時間インキュベ ートすると、融合体形成の３〜４倍刺激を認めた（図17、レーン３と４の比較） 。同様に、効率的な融合体形成はまた、反応を室温で30〜45分実施した場合、50 〜100mM Mg²⁺濃度の存在下で翻訳後インキュベーションを用いた場合に認めた。 リンカーの長さおよび配列 融合反応のリンカーの長さへの依存性を調べた。 21〜30ヌクレオチド（n＝18〜27）の範囲では、融合反応の効率にほとんど変化 を認めなかった（上記のように）。より短いリンカー（例えば長さが13ヌクレオ チド）では融合体はより少なかった。さらに、長さがより長い特定のリンカー（ すなわち、45ヌクレオチドおよび54ヌクレオチド）も同様に幾分低い融合効率で あったが、さらにより長いリンカーを用いても融合反応の効率が最適となる可能 性がある。 リンカー配列に関しては、3'末端近傍のデオキシヌクレオチド残基をリボヌク レオチド残基に置換しても、融合効率は有意に変化しなかった。しかし、リンカ ーの3'末端でのdCdCP（またはrCrCP）配列は融合体形成にとって重要であった。 dCdCPをdUdUPに置換すると、融合体の形成効率は有意に減少した。 リンカーの柔軟性 融合反応のリンカーの柔軟性に及ぼす依存性についても試 験した。これらの実験において、3'末端近傍での相補的オリゴヌクレオチドによ るアニーリングによってリンカーの強直性が増加すれば、融合効率は低くなるこ とが明らかになった。同様に、より柔軟なリンカー（例えば、dA₂₁C₉C₉C₉dAdCdC P、ここでC₉はHO(CH₂CH₂O)₃PO₂）を表す）を用いれば、融合効率は有意に改善し た。標準的なリンカー(dA2,dCdCP)と比較すると、より柔軟なリンカー（dA₂₁C₉C₉ C₉dAdCdCP）を用いれば、RNA 124の融合効率は４倍以上改善した（図17、レー ン１と９の比較）。さらに、Mg²⁺の高濃度が存在しなければ翻訳後融合があまり 進まない標準的なリンカーによる鋳型とは対照的に（図17、レーン３および４） 、柔軟なリンカーを用いた鋳型は、-20℃でのさらなる翻訳後インキュベーショ ンにおいて収率のよい融合産物を生じるためにMg²⁺の上昇を必要としなかった（ 図17、レーン11および12の比較）。したがって、このリンカーは、Mg²⁺の高濃度 を翻訳後に加えることが望ましくない場合に非常に有用であった。さらに、柔軟 なリンカーはまた、Mg²⁺の濃度が上昇すれば最適な融合収率を生じた。 融合効率の定量 融合効率は、融合産物に変換された翻訳されたペプチドの分 画、または融合産物に変換された添加した鋳型の分画のいずれかとして表しても よい。融合産物に変換された翻訳されたペプチドの分画を決定するために、翻訳 されたペプチドの³⁵S-Met標識を利用した。これらの実験では、dA₂₇dCdCPまたは dA₂₇rCrCPリンカーを用いた場合、30℃での１時間翻訳インキュベーション後に そのmRNAに融合されたのは翻訳されたペプチドの約3.5％であった。この値は-20 ℃で一晩インキュベートすると12％に増加した。翻訳後インキュベーションを高 濃度のMg²⁺の存在下で実施すると、翻訳されたペプチドの50％以上が鋳型に融合 した。 柔軟なリンカーを用いた鋳型については、30℃での１時間の翻訳後鋳型に融合 されたのは、翻訳されたペプチドの約25％であった。この値は-20℃で一晩イン キュベートすると50％以上に増加し、翻訳後インキュベーションを50mM Mg²⁺の 存在下で実施すれば75％以上となった。 融合産物に変換された添加した鋳型の百分率を決定するため、³²P-標識mRNAリ ンカー鋳型を用いて翻訳を実施した。柔軟なリンカーを用いて翻訳後インキュベ ーションをMg²⁺の非存在下で-20℃で実施した場合、添加したRNA鋳型の濃度がそ れぞれ800、400、200、100および50nMであった場合、添加した鋳型の約20％、40 ％、40％、35％、および20％がmRNA-ペプチド融合体に変換された（図18）。翻 訳後イ ンキュベーションを50mM Mg²⁺の存在下で実施した場合にも同様の結果が得られ た。最善の結果はNovagen社、Amersham社、またはAmbion社から得た溶解物を用 いて得られた（図19）。 SDS-PAGEによって測定したmRNAとmRNA-ペプチド融合体の間の移動度の差は、m RNA鋳型が長い場合非常に小さい可能性がある。そのような場合、リンカーの5' 末端で鋳型を³²Pで標識してもよい。次に、翻訳／インキュベーション後、相補 的DNAスプリントの存在下で長いRNA部分をRNアーゼHで消化してもよく、融合効 率はリンカーペプチド融合体に対する未修飾のリンカーの比の定量によって決定 してもよい。3'-Pおよび5'-OHを生じるRNアーゼA消化と比較すると、このアプロ ーチはリンカーの5'末端での³²Pが除去されないという長所を有する。 翻訳後インキュベーションの際の分子内対分子間融合 上記実験の他に、われ われは、Mg²⁺の存在下で-20℃で起こった融合反応が本質的に分子内または分子 間であるか否かを調べた。遊離リンカー（dA₂₇dCdCP、またはdA₂₁C₉C₉C₉dAdCdCP 、ここでC₉はO(CH₂CH₂O)₃PO_2-)を表す）を、上記のように翻訳および翻訳後イン キュベーション下において、DNAリンカーを含むが、3'末端でピューロマイシン は含まない鋳型と共にインキュベートした。これらの実験において、³⁵S-Metの 検出可能な量（すなわち正常レベルの２％未満）はリンカー-ペプチド産物に取 り込まれず、このことは翻訳後融合が、未完成のペプチドと、同じリボソームに 結合したmRNAの間で起こったことを示唆している。 最適化結果 上記のように、柔軟なリンカーを用いることによっておよび／ま たは高濃度のMg²⁺の存在下での翻訳後インキュベーションを実施することによっ て、融合効率は添加したmRNAの約40％に増加した。これらの結果は、mRNA-ペプ チド融合体の10¹⁴個もの分子がインビトロ翻訳反応混合物１mlあたり産生されう ること、そしてインビトロ選択実験において使用するために非常に高度に複雑な mRNA-ペプチド融合体のプールを生じることを示した。 RNA- 蛋白融合体の選択的濃縮 われわれは、コードされたペプチドに基づくランダム配列融合の複雑なプール から特定のRNA-ペプチド融合体を濃縮することによって、選択および発展実験に おいてRNA-ペプチド融合体を用いることが可能か否かを明らかにした。詳しく述 べると、既知の配列の少量（この場合、長いmyc鋳型LP154）を何らかの量のラン ダム配列プール（すなわちLP160）と組み合わせた一連の混合物を調製した。こ れらの混合物を翻訳し、RNA-ペプチド融合産物を本明細書に記述のように、オリ ゴヌクレオチドおよびジスルフィドアフィニティクロマトグラフィーによって選 択した。myc-鋳型融合はmycモノクローナル抗体によって選択的に免疫沈降した （図16A）。この選択段階において得られた濃縮を測定するために、免疫沈降の 前後のcDNA/mRNA-ペプチド融合体混合物のアリコットを放射標識プライマーの存 在下でPCRによって増幅した。増幅したDNAをmyc鋳型配列を切断するがプールを 切断しない制限エンドヌクレアーゼによって消化した（図16Bおよび16C）。切断 と非切断DNAの比の定量から、免疫沈降によってmyc配列がランダムライブラリと 比較して20〜40倍濃縮されたことが示された。 これらの実験は以下のように実施した。翻訳反応 翻訳反応はおおむね上記のように実施した。詳しく述べると、反応 は製造元（Novagen社）の説明書に従って30℃で１時間実施し、-20℃で一晩凍結 した。試料６本を２通り作製し、一方には³⁵Sメチオニンを含み、もう一方は非 放射標識メチオニンを最終濃度52μMとなるように加えた。反応１〜６には、表 ２に記述した鋳型の量が含まれた。表２の全ての数値は、反応混合液25μlあた りの鋳型のピコモルを表す。 表２ 濃厚選択において用いられる鋳型の比 dT₂₅ ストレプトアビジンアガロースの調製 ストレプトアビジンアガロース（ Piece社）をTE8.2（10mMトリスCl pH8.2、１mM EDTA）で３回洗浄し、TE8.2に１ ：１（v/v）スラリーとして再懸濁した。次に、バイオテグCPG（Glen Research 社）を用いて合成した3'ビオチン化T₂₅を、望ましい最終濃度になるように加え （ 一般に10または20μM）、攪拌しながらインキュベーションを１時間実施した。 次に、dT₂₅ストレプトアビジンアガロースをTE 8.2で３回洗浄して、使用するま で４℃で保存した。 翻訳反応からの鋳型の精製 翻訳反応からの鋳型を精製するために、各反応液 25μlを採取して単離用緩衝液（1M NaCl、100mMトリスCl pH8.2、10mM EDTA、0. 1mM DTT）7.5mlおよび20μM dT₂₅ストレプトアビジンアガロース125μlに加えた 。この溶液を回転させながら４℃で１時間インキュベートした。チューブを遠心 して溶出剤を除去した。単離用緩衝液１mlを加え、スラリーを再懸濁して、混合 物を1.5ml微量遠心管に移した。次に、氷冷単離用緩衝液１mlアリコットで試料 を４回洗浄した。同一反応からの温および冷試料をフィルターミリポアMCフィル ターユニット中で合わせて、100μl H₂O、0.1mM DTT2容量、および15mM NaOH、 １mM EDTA2容量で洗浄することによってdT₂₅アガロースから溶出した。 この溶出液に、洗浄したチオプロピルセファロース（Pharmacia社）の50％ス ラリー40μlを加えて、インキュベーションを回転させながら４℃で１時間実施 した。次に試料をTE8.2 １ml容量で３回洗浄して溶出剤を除去した。１M DTT１ μlを固体に加え（総量は約20〜30μl）、試料を数時間インキュベートして、除 去し、H₂O 20μl（総容量90μl）で４回洗浄した。UV吸収によって判断すると、 溶出剤には2.5mMチオピリドンが含まれた。３M NaOAc pH5.2、10mMスペルミン、 １μlグリコーゲン（10mg/ml、Boehringer Mannheim社）および100％EtOH 170μ lを加えて、-70℃で30分インキュベートし、微量遠心器で13,000rpmで30分遠心 することによって、この試料50μlをエタノール沈殿させた。 逆転写反応 沈殿したエタノールとチオピリドン溶出剤試料の双方に、以下の ように逆転写反応を実施した。エタノール沈殿試料については、再懸濁した鋳型 30μl、H₂O 48μl、およびプライマー21.103（配列番号：22）200ピコモルを70 ℃で５分間アニーリングして氷上で冷却した。この試料に第一の鎖緩衝液（250m MトリスCl pH8.3、375mM KCl、および15mM MgCl₂；Gibco BRL社、Grand Island 、NYから入手可能）16μl、100mM DTT ８μl、および10mM NTP４μlを加えて42 ℃で平衡にし、スーパースクリプトII逆転写酵素（Gibco BRL社、Grand Island 、NY）４μlを加えた。H₂O（13μl）をTPセファロース溶出剤（35μl）に 加え、上記のように反応を実施した。１時間インキュベートした後、番号をつけ た試料を合わせた（総容量160μl）。試料10μlを各非選択試料のPCR用に保存し ておき、試料150μlを免疫沈降用とした。 免疫沈降 免疫沈降を実施するため、逆転写反応液170μlを希釈用緩衝液（10 mMトリスCl pH8.2、140mM NaCl、１％ v/vトリトンX-100）１mlおよびプロテイ ンG/A結合物（Calbiochem社、La Jolla、CA）20μlに加え、回転させながら４℃ で１時間インキュベーションを行い、予めきれいにした。溶出剤を除去してG/A 結合物20μlおよびモノクローナル抗体（２μg、12ピコモル）20μlを加え、試 料を回転させながら４℃で２時間インキュベートした。結合物は2500rpmで５分 間微量遠心によって沈降させ、溶出剤を除去して結合物を氷冷希釈用緩衝液の１ mlアリコットを用いて３回洗浄した。試料を氷冷10mMトリスCl、pH8.2、100mM N aCl １mlで洗浄した。凍結した４％ HOAc３容量を用いて結合した断片を除去し 、試料を凍結乾燥させた。 選択および非選択試料のPCR PCR反応は、濃縮NH₄OH 20μlを非選択材料およ び選択材料全体10μlに加え、試料中のRNAを破壊するために55℃、70℃および90 ℃で各５分インキュベートすることによって実施した。次に試料をスピードバッ クによって蒸発堅固させた。PCR混合物（Mg²⁺を含むPCR緩衝液中に１μMプライ マー21.103および42.108、200μM dNTP）（Boehringer Mannheim社）200μlおよ びTaqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim社）２μlを各試料に加えた。非選択 試料の２番にPCRを16サイクルを実施し、その他の試料全てに19サイクルを実施 した。 次に試料を5'³²P-標識プライマー21.103の存在下で表３に従って増幅し、ウィ ザードダイレクトPCR精製キット（Promega社）を用いて個々に２回精製して、全 てのプライマーおよびより短い断片を除去した。表３ 選択および非選択PCR試料の増幅 制限酵素消化 上記PCR反応のそれそれから調製した³²P-標識DNAを、表４に従 って、制限酵素消化反応に等量（試料のcpmによって）加えた。各反応の総容量 は25μlであった。AlwnI（５単位、New England Biolabs社）0.5μlを各反応に 加えた。試料を37℃で１時間インキュベートし、65℃で20分インキュベートする ことによって酵素を熱不活化させた。次に試料を変性ローディング用緩衝液10μ l（高純度ホルムアミド（USB）１ml、0.5M EDTA 20μl、および１M NaOH 20μl ）と共に混合して90℃で１分加熱し、冷却して、８M尿素を含む12％変性ポリア クリルアミドゲル上にローディングした。電気泳動の後、ゲルを10％（v/v）HOA c、10％（v/v）MeOH、H₂Oで固定した。 表４ 制限酵素消化条件w/AlwnI 消化物の定量 試料中に存在するmyc対プールしたDNAの量は、燐画像化装置（ Molecular Dynamics社）を用いて定量した。各バンド中に存在する材料の量は、 ゲルのバンド周囲の同じ長方形の積分容量として測定した。各バンドに存在する 総cpmはバックグラウンドを差し引いた容積として計算した。バックグラウンド の３つの値を用いた：(1)ゲル上でカウントが起こった領域外の同じ正方形の平 均；(2)mycバンドが現れるはずの非選択プールレーンに存在するcpm（ゲル上の この位置ではバンドは現れない）；および(3)非選択レーン間の鋳型の10倍毎の 増加に最も近い値を再現する正常化値。図16Bおよび16Cのレーン２、３および４ は、標的対プール配列の濃縮を示す。レーン３での証明可能な濃縮（非選択／選 択）により、この試料のノイズ比に対するシグナルの最適化により最大値（方法 １〜３を用いてそれぞれ17、43、および27倍）が得られた。これらの結果を表５ に要約する。 表５ Myc鋳型対プールの濃縮 第二の一連の実験では、これらの同じPCR産物をウィザードダイレクトPCR精製 キットを用いて一度精製し、消化物を上記の方法(2)によって定量した。これら の実験では同様の結果を得た；それぞれ10.7、38、および12倍の濃縮が上記のレ ーン２、３および４と同等の試料について測定された。 蛋白選択システムの利用 本発明の選択システムは蛋白技術を用いて治療的、診断的、または工業的問題 を解決する如何なる領域にも商業的に応用される。この選択技術は望みの機能を 有する新しい蛋白の単離と共に、既存の蛋白を改善または変化させるために有用 である。これらの蛋白は天然に起こる配列であってもよく、天然に起こる配列の 変化形であってもよく、または部分的もしくは完全に合成された配列であっても よい。 新規結合試薬の単離 １つの特定の応用において、本明細書において記述のRN A蛋白融合技術は、特異的結合（例えば、リガンド結合）特性を有する蛋白の単 離に有用である。非常に特異的な結合相互作用を示す蛋白は、非抗体認識試薬と して用いてもよく、これによってRNA-蛋白融合技術は従来のモノクローナル抗体 技術をしのぐことができるようになった。この方法によって単離した抗体タイプ の試薬は、診断および治療応用を含む従来の抗体を利用する如何なる領域にも用 いられる可能性がある。 ヒト抗体の改善 本発明はまた、多くの疾患の治療のためにヒトまたはヒトに 適合させた抗体を改善するために用いてもよい。この応用において、抗体ライブ ラリを作製し、インビトロでスクリーニングすれば、細胞融合またはファージデ ィスプレイのような技術の必要性がなくなる。１つの重要な応用において、発明 は１本鎖抗体ライブラリを改善するために有用である（ワードら（Ward）、Natu re 341：544（1989）；およびグーロら（Goulot）、J．Mol．Biol．213：617（1 990））。この応用に関しては、可変領域は、ヒト起源（レシピエントの考えら れる有害な免疫反応を最少にする）から構築してもよく、または完全にランダム なカセットを含んでもよい（ライブラリの複雑性を最大限にするため）。改善し た抗体分子をスクリーニングするため、標的分子に対する結合に関して候補分子 のプールを調べる（例えば、図２に示すように固定した抗原）。次に選択が１つ のラウンドから次へと進行するように、高レベルのストリンジェンシーを結合段 階に適用する。ストリンジェンシーを増加させるため、洗浄段階の回数、過度の 競合物質の濃縮、緩衝液条件、結合反応時間の長さ、および固定化マトリクスの 選択のような条件を変化させる。 １本鎖抗体は、治療のために直接または標準的な抗体の構築のために間接的に 用いてもよい。そのような抗体は、抗自己免疫抗体の単離、免疫抑制、およびAI DSのようなウイルス疾患に対するワクチンの開発を含む、考えられる多くの応用 がある。 新しい触媒の単離 本発明はまた、新しい触媒蛋白を選択するために用いても よい。インビトロ選択および展開は、これまで新規触媒RNAおよびDNAの単離に用 いられているが、本発明では、新規蛋白酵素の単離に用いられる。このアプロー チの１つの特定の例において、触媒は、触媒の遷移状態の化学類似体への結合を 選択することによって間接的に単離してもよい。もう一つの特定の例において、 直接の単離は、基質との共有結合形成について選択することによって（例えば、 アフィニティタグに結合した基質を用いて）、または開裂（例えば、特異的結合 を切断する能力について選択し、それによって固相支持体からのライブラリの触 媒メンバーを生じることによって）によって実施してもよい。 新しい触媒を単離するこのアプローチは、触媒的抗体技術に対して少なくとも ２つの重要な長所を有する（シュルツら（Schultz）、J．Chem．Engng．News 68 ：26（1990））。まず、触媒抗体技術において、初回プールは一般に免疫グロブ リンの範囲に限定され；対照的にRNA-蛋白融合体の開始ライブラリは、完全にラ ンダムであってもよく、または既知の酵素構造または蛋白骨格の変種を含んでも よいがこれらに限定しない。さらに、触媒的抗体の単離は一般に遷移状態反応類 似体との結合に関しての初回選択に依存し、その後活性抗体についての面倒なス クリーニングを行う；この場合も対照的に、RNAライブラリを用いて先に証明し たように、RNA-蛋白融合ライブラリアプローチを用いた触媒の直接選択は可能で ある。蛋白酵素を単離するもう一つのアプローチにおいて、遷移状態類似体およ び直接選択アプローチを合わせてもよい。 この方法によって得られた酵素は非常に貴重である。例えば、現在開発すべき 化学プロセスを改善する新規かつ有効な工業的触媒に対する逼迫した必要性が存 在する。本発明の主要な長所は、任意の条件において選択を行ってもよく、例え ば、インビボ条件に限定されないという点である。したがって、発明は、既定の 環境、例えば上昇した温度、圧力または溶媒濃度の環境において機能しながら、 非常に特異的な形質転換を行うことができる（およびそれによって望ましくない 副産物の形成を最小限にする）新規酵素または既存の酵素の改善変種の単離を容 易にする。 インビトロ相互作用トラップ RNA-蛋白融合技術はまた、cDNAライブラリをス クリーニングし、蛋白蛋白相互作用に基づく新しい遺伝子をクローニングする際 に有用である。この方法によって、cDNAライブラリは望ましい起源から作製する （例えば、アウスベルら（Ausubel）、前記、第５章）。候補cDNAのそれぞれに 対して、ペプチド受容体（例えば、ピューロマイシンの尾部のように）をライゲ ー ションする（例えば、LP77、LP154、およびLP160の産生について上記の技術を用 いて）。次に、RNA-蛋白融合体を本明細書で記述のように作製し、これらの融合 体（または融合体の改善版）が特定の分子と相互作用する能力を上記のように調 べる。望ましければ、停止コドンおよび3’UTR領域は、このプロセスにおいて(i )サプレッサーtRNAを加えて停止領域の読み過ごしを可能にする、(ii)免疫沈降 による翻訳反応からの放出因子を除去する、(iii)(i)と(ii)の組合せ、または(i v)DNA配列からの停止コドンおよび3’UTRの除去、のいずれかによって避けられ る可能性がある。 相互作用段階がインビトロで起こるという事実から、非特異的競合剤、温度、 およびイオン条件を用いて、反応のストリンジェンシーを注意深く調節すること ができるようになる。正常な小分子を加水分解できない類似体（例えば、ATP対A TPgS）に変化させることは、同じ分子の異なる配座異性体を識別する選択となる 。このアプローチは、選択した結合パートナーのRNA配列は共有結合し、したが って、容易に単離される可能性があるため、多くの蛋白のクローニングおよび機 能的同定の双方にとって有用である。さらに、この技術は、その配列が現在ヒト ゲノムプロジェクトによって決定されつつある〜50〜100,000個のヒト遺伝子の 機能および相互作用を特定するために有用である。 マイクロチップ形式でのRNA-蛋白融合体の利用 「DNAチップ」は、固定したオリゴヌクレオチドまたはcDNAもしくはゲノムDNA の空間的に定義された配置を含み、迅速なシークエンシングおよび転写プロフィ ーリングのような応用を有する。RNA-蛋白融合体の混合物（例えば、細胞DNAま たはRNAプールから生じたもの）をそのようなDNAチップにアニーリングすること によって、１つの固定化配列に対応する各スポットがRNA-蛋白融合体のプールに おいてその対応する蛋白にアニーリングすることができる「蛋白ディスプレイチ ップ」を作製することが可能である。このアプローチによって、対応する蛋白は 、その自身のmRNAとの結合のために、空間的に定義された様式で固定化され、一 連のDNA配列を含むチップが対応する一連の蛋白を表示する。または、これらの 蛋白のペプチド断片は、融合物のライブラリがcDNAまたはゲノムDNAのより小さ い断片から生成する場合に表示される可能性がある。 そのような蛋白およびペプチドを順序立てて表示することは、多くの用途を有 する。例えば、それらはこれまで未知の蛋白-蛋白相互作用の同定のための強力 なツールとなる。１つの明確な形式において、プローブ蛋白を検出可能に標識し て（例えば、蛍光色素によって）、標識蛋白を蛋白ディスプレイチップによって インキュベートする。このアプローチによって、プローブ蛋白と結合することが できる蛋白の実体は、プローブの結合により標識されるに至ったチップ上のスポ ットの位置から決定される。もう一つの応用は修飾酵素の作用を通じて化学修飾 された蛋白の迅速な定量である（例えば、蛋白キナーゼ、アシルトランスフェラ ーゼ、およびメチルトランスフェラーゼ）。蛋白ディスプレイチップを関係酵素 および放射活性標識基質とインキュベートし、その後洗浄してオートラジオグラ フィーを行うことによって、位置および、したがって酵素を修飾するための基質 であるそれらの蛋白の実体が容易に決定される可能性がある。さらに、小さいペ プチドの順序表示によってこのアプローチを用いることは、そのような修飾部位 の位置を知ることがさらに可能となる。 蛋白表示技術は、適当な固相支持体に固定化した核酸（RNAを含むが、好まし くはDNA）の配置を用いて実施してもよい。一例としての固相支持体はガラス（ 例えば、ガラス板）、シリコン、またはシリコンガラス（例えばマイクロチップ ）、または金（例えば、金板）のような材料で構成してもよい。核酸をそのよう な固相表面上の正確な領域に接着させる方法、例えば、写真平板法は当技術分野 で周知であり、発明において用いられる固相支持体（例えば、DNAチップ）の作 製に用いてもよい。この目的のための一例としての方法は、シェナら（Schena） 、Science 270:467〜470（1995）；コザールら（Kozal）、Nature Medicine 2： 753〜759（1996）；チェンら（Cheng）、Nucleic Acids Research 24：380〜385 （1996）；リップシュッツら（Lipshutz）、Bio Techniques 19：442〜447（199 5）；ピースら（Pease）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91：5022〜5026（1994 ）；フォドア（Fodor）、Nature 364：555〜556（1993）；ピールンら（Pirrung ）、米国特許第5,143,854号；およびフォドア（Fodor）ら、国際公開公報第92/1 0092号を含むが、これらに限定しない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 リュー リヘ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ケ ンブリッジ マサチューセッツ アベニュ ー 2456 アパートメント 102

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1．下記の段階を含む、所期の蛋白質を選抜するための方法： （a）それぞれが、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開始配列 と開始コドンとを含み、またそれぞれが、該候補蛋白質のコード配列の3'末端で ペプチド受容体に機能的に結合されている、候補となるRNA分子の集団を提供す る段階、 （b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、該候補蛋白質のコ ード配列を、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段階、および （c）所期のRNA-蛋白質融合体を選抜し、それによって所期の蛋白質を選抜する 段階。 2．下記の段階を含む、所期の蛋白質をコードするDNA分子を選抜するための方 法： （a）それぞれが、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開始配列 と開始コドンとを含み、またそれぞれが、該候補蛋白質のコード配列の3'末端で ペプチド受容体に機能的に結合されている、候補となるRNA分子の集団を提供す る段階、 （b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、該候補蛋白質のコ ード配列を、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段階、 （c）所期のRNA-蛋白質融合体を選抜する段階、および （d）該融合体の該RNA部分から、所期の蛋白質をコードするDNA分子を作製する 段階。 3．下記の段階を含む、参照となる蛋白質に較べて変容した機能をもつ蛋白質 を選択する方法： （a）候補となるDNA鋳型が、それぞれ、参照となる蛋白質のコード配列とは異な る、候補蛋白質のコード配列をもち、RNA分子が、それぞれ、該候補蛋白質のコ ード配列に機能的に結合された翻訳開始配列と開始コドンを含み、その3'末端で ペプチド受容体に機能的に結合されている、DNA鋳型集団から候補となるRNA分子 の集団を産生する段階、 （b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、候補となる蛋白質 の コード配列をインビトロまたはインサイチューで翻訳する段階、および （c）変容した機能をもつRNA-蛋白質融合体を選抜し、それによって該変容した 機能をもつ該蛋白質を選抜する段階。 4．下記の段階を含む、参照となる蛋白質に較べて変容した機能をもつ蛋白質 をコードするDNA分子を選択する方法： （a）候補となるDNA鋳型が、それぞれ、参照となる蛋白質のコード配列とは異な る、候補蛋白質のコード配列をもち、RNA分子が、それぞれ、候補蛋白質のコー ド配列に機能的に結合された翻訳開始配列と開始コドンとを含み、その3'末端で ペプチド受容体に機能的に結合されている、候補DNA鋳型集団から候補RNA分子の 集団を産生する段階、 （b）RNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、該候補となる蛋白質のコード 配列を、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段階、 （c）変容した機能をもつRNA-蛋白質融合体を選抜する段階、および （d）該融合体のRNA部分から、該変容機能をもつ該蛋白質をコードするDNA分子 を作製する段階。 5．下記の段階を含む、所期のRNAを選抜するための方法： （a）それそれが、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開始配列 と開始コドンとを含み、またそれぞれが、該候補蛋白質のコード配列の3'末端で ペプチド受容体に機能的に結合されている、候補となるRNA分子の集団を提供す る段階、 （b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、該候補となる蛋白 質のコード配列を、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段階、および （c）所期のRNA-蛋白質融合体を選抜し、それによって該所期のRNAを選抜する段 階。 6．ペプチド受容体がピューロマイシンである、請求項1〜5のいずれか一項記 載の方法。 7．候補RNA分子のそれぞれが、停止配列をさらに含むか、または該RNA分子の3 '末端に共有結合されたDNAもしくはDNA類似体の配列をさらに含む、請求項1〜5 のいずれか一項記載の方法。 8．候補RNA分子の集団が、少なくとも10¹³個の異なるRNA分子を含む、請求項1 〜5のいずれか一項記載の方法。 9．インビトロ翻訳反応が、真核生物の細胞またはその一部から調製されたラ イセートの中で行われる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。 10．インビトロ翻訳反応が、網状赤血球のライセートの中で行われる、請求項 9記載の方法。 11．インビトロ翻訳反応が、コムギ胚芽のライセートの中で行われる、請求項 9記載の方法。 12．インビトロ翻訳反応が、細菌細胞またはその一部から調製されたライセー トの中で行われる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。 13．選抜段階が、所期の蛋白質を、固定された結合パートナーに結合させるこ とを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。 14．選抜段階が、所期の蛋白質の機能的な活性を測定することを含む、請求項 1〜5のいずれか一項記載の方法。 15．DNA分子を増幅する、請求項2または4記載の方法。 16．（a）から（c）までの段階を繰り返すことをさらに含む、請求項1、3、ま たは5記載の方法。 17．DNA分子からRNA分子を転写する段階、および（a）から（d）までの段階を 繰り返す段階をさらに含む、請求項2または4記載の方法。 18．RNAが、アミド結合によって、RNA-蛋白質融合体中の蛋白質と共有結合し ている、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。 19．RNAが、RNA-蛋白質融合体中の蛋白質と共有結合していて、該共有結合が 、リボソームによる切断に対して抵抗性である、請求項1〜5のいずれか一項記載 の方法。 20．インビトロ翻訳段階の後、50〜100mMのMg²⁺存在下でインキュベーション が行われる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。 21．RNA-蛋白質融合体が、ペプチド受容体の近傍にある、可塑性を高めるよう な核酸配列または核酸類似体の配列をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記 載の方法。 22．請求項1〜5のいずれか一項記載の方法によって選抜されるRNA-蛋白質融合 体。 23．アミド結合によって蛋白質に共有結合されたリボ核酸を含む分子。 24．蛋白質がリボ核酸によってコードされている、請求項23記載の分子。 25．リボ核酸がメッセンジャーRNAである、請求項23記載の分子。 26．蛋白質に共有結合されたリボ核酸を含む分子において、該蛋白質が該リボ 核酸によって完全にコードされている分子。 27．リボ核酸がメッセンジャーRNAである、請求項26記載の分子。 28．蛋白質に共有結合されたリボ核酸を含む分子において、該共有結合が、リ ボソームによる切断に対して抵抗性である分子。 29．リボ核酸がメッセンジャーRNAである、請求項28記載の分子。 30．候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開始配列と開始コドン とを含むリボ核酸において、該候補蛋白質のコード配列の3'末端でペプチド受容 体に共有結合されているリボ核酸。 31．下記の段階を含む、所期の蛋白質または所期のRNAを選抜するための方法 ： （a）それぞれが、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開始配列 と開始コドンとを含み、またそれぞれが、候補蛋白質のコード配列の3'末端でペ プチド受容体に機能的に結合されている、候補となるRNA分子の集団を提供する 段階、 （b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、候補となる蛋白質 のコード配列をインビトロまたはインサイチューで翻訳する段階、 （c）結合している結合パートナー-RNA-蛋白質融合体複合体が集団の非結合構成 分子から実質的に分離される条件の下で、該RNA-蛋白質融合体の集団を、RNA-蛋 白質融合体のRNA部分または蛋白質部分のどちらかに特異的な結合パートナーと 接触させる段階、 （d）該結合RNA-蛋白質融合体を該複合体から解離させる段階、および （e）結合している結合パートナー-RNA-蛋白質融合体複合体が集団の非結合構成 分子から実質的に分離される条件の下で、段階（d）からの該RNA-蛋白質融合体 集団を、所期のRNA-蛋白質融合体の蛋白質部分に特異的な結合パートナーと接触 さ せ、それによって、所期の蛋白質および所期のRNAを選抜する段階。 32．（a）から（e）までの段階を繰り返すことをさらに含む、請求項31記載の 方法。 33．ペプチド受容体がピューロマイシンである、請求項31記載の方法。 34．候補RNA分子の各々が、停止配列をさらに含むか、または該RNAの3'末端に 共有結合されたDNAもしくはDNA類似体の配列をさらに含む、請求項31記載の方法 。 35．候補RNA分子の集団が、少なくとも10¹³個の異なるRNA分子を含む、請求項 31記載の方法。 36．インビトロ翻訳反応が、真核細胞またはその一部から調製されたライセー トの中で行われる、請求項31記載の方法。 37．インビトロ翻訳反応が、網状赤血球またはコムギ胚芽のライセートの中で 行われる、請求項36記載の方法。 38．インビトロ翻訳反応が、原核細胞またはその一部から調製された抽出物の 中で行われる、請求項31記載の方法。 39．結合パートナーの少なくとも一つが、固体支持体上に固定されている、請 求項31記載の方法。 40．インビトロ翻訳段階の後に、50〜100mMのMg²⁺存在下でインキュベーショ ンを行う、請求項31記載の方法。 41．RNA-蛋白質融合体が、ペプチド受容体の近傍にある、可塑性を高めるよう な核酸または核酸類似体の配列をさらに含む、請求項31記載の方法。 42．固定された一本鎖の核酸を並べた配列を含むマイクロチップにおいて、該 核酸がRNA-蛋白質融合体にハイブリダイズするマイクロチップ。 43．蛋白質が、RNAによってコードされている、請求項42記載のマイクロチッ プ。