JPWO2018168999A1 - Rna分子とペプチドとの複合体の製造方法、及びその利用 - Google Patents
Rna分子とペプチドとの複合体の製造方法、及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2018168999A1 JPWO2018168999A1 JP2019506263A JP2019506263A JPWO2018168999A1 JP WO2018168999 A1 JPWO2018168999 A1 JP WO2018168999A1 JP 2019506263 A JP2019506263 A JP 2019506263A JP 2019506263 A JP2019506263 A JP 2019506263A JP WO2018168999 A1 JPWO2018168999 A1 JP WO2018168999A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- molecule
- rna
- dna
- candidate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 141
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 100
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 51
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 134
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 46
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical group C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 43
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 40
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 39
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 34
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 22
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 22
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 22
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 22
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 22
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 21
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 19
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 18
- OVYNGSFVYRPRCG-KQYNXXCUSA-N 2'-O-methylguanosine Chemical group CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=C(N)NC2=O)=C2N=C1 OVYNGSFVYRPRCG-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 16
- 238000002824 mRNA display Methods 0.000 claims description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 12
- OVYNGSFVYRPRCG-UHFFFAOYSA-N 2'-O-Methylguanosine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(N)=NC2=O)=C2N=C1 OVYNGSFVYRPRCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 8
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 35
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 24
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 19
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 8
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 7
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 6
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 description 6
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 4
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- SXUXMRMBWZCMEN-UHFFFAOYSA-N 2'-O-methyl uridine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 SXUXMRMBWZCMEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101100532034 Drosophila melanogaster RTase gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108091012456 T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- FPUGCISOLXNPPC-IOSLPCCCSA-N cordysinin B Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 FPUGCISOLXNPPC-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M potassium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FPUGCISOLXNPPC-UHFFFAOYSA-N 2'-O-Methyladenosine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 FPUGCISOLXNPPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFCQJGFZUQFYRF-UHFFFAOYSA-N 2'-O-Methylcytidine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 RFCQJGFZUQFYRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFCQJGFZUQFYRF-ZOQUXTDFSA-N 2'-O-methylcytidine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 RFCQJGFZUQFYRF-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- HPHXOIULGYVAKW-IOSLPCCCSA-N 2'-O-methylinosine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 HPHXOIULGYVAKW-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- HPHXOIULGYVAKW-UHFFFAOYSA-N 2'-O-methylinosine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 HPHXOIULGYVAKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXUXMRMBWZCMEN-ZOQUXTDFSA-N 2'-O-methyluridine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 SXUXMRMBWZCMEN-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 108091007999 druggable proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000038037 druggable proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
- C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(1) ペプチドをコードするRNA分子と、当該RNA分子にコードされているペプチドとの複合体を製造する方法であって、
工程(i): プロモーター領域及びその下流に位置するペプチドをコードする領域を含むDNA分子から転写反応によってRNA分子を作製する工程であって、当該DNA分子の最も下流のアンチセンス鎖の5’末端側に少なくとも1個の2’−修飾ヌクレオシド誘導体を含んでいる工程と、
工程(ii): 工程(i)で得られた上記RNA分子の3’末端に、スプリントポリヌクレオチドを足場として用いて、ペプチド受容分子を結合する工程と、
工程(iii): 工程(ii)で得られたペプチド受容分子が結合されている上記RNA分子を翻訳することによって、上記RNA分子と、当該RNA分子にコードされているペプチドとが、上記ペプチド受容分子を介して連結している、RNA分子とペプチドとの複合体を作製する工程と、
を含んでなる、方法。
(2) mRNAディスプレイ法に用いるDNAライブラリーであって、
プロモーター領域及びその下流に位置する候補ペプチドをコードする領域を含み、かつ最も下流のアンチセンス鎖の5’末端側に少なくとも1個の2’−修飾ヌクレオシド誘導体を含んでいる、複数の異なる候補DNA分子を含む、DNAライブラリー。
工程(i): プロモーター領域及びその下流に位置するペプチドをコードする領域を含むDNA分子から転写反応によってRNA分子を作製する工程であって、当該DNA分子の最も下流のアンチセンス鎖の5’末端側に少なくとも1個の2’−修飾ヌクレオシド誘導体を含んでいる工程と、
工程(ii): 工程(i)で得られた上記RNA分子の3’末端に、スプリントポリヌクレオチドを足場として用いて、ペプチド受容分子を結合する工程と、
工程(iii): 工程(ii)で得られたペプチド受容分子が結合されている上記RNA分子を翻訳することによって、上記RNA分子と、当該RNA分子にコードされているペプチドとが、上記ペプチド受容分子を介して連結している、RNA分子とペプチドとの複合体を作製する工程と、を含んでなる。
本明細書において「ライブラリー」とは、複数(2つ以上)の異なる分子(例えば、複数の異なるDNA分子、複数の異なるRNA分子、又は複数の異なるRNA−ペプチド複合体)の集合を指し、例えば、同じカテゴリ(例えば、DNA分子のカテゴリ、RNA分子のカテゴリ、又はRNA−ペプチド複合体のカテゴリ)に分類される、複数の異なる分子の集合を指す。分子のカテゴリの名称を関して、DNAライブラリー(DNA分子のライブラリー)、RNAライブラリー(RNA分子のライブラリー)、RNA−ペプチド複合体ライブラリー(RNA−ペプチド複合体分子のライブラリー)などと称する場合もある。本実施形態に係る方法では、必要に応じて、多数の候補分子から出発する選抜が容易となるため、本実施形態における「ライブラリー」は、好ましくは109個以上、より好ましくは1010個以上、1011個以上、又は1012個以上、さらに好ましくは1013個以上の異なる分子を含み得る。
本実施形態に係る方法の説明に先立ち、スプリントポリヌクレオチド(DNA)を用いる、従来のmRNAディスプレイ法の一例を、図1の(A)を参照して簡単に説明する。
本実施形態に係る方法を用いたmRNAディスプレイ法の詳細を、図1の(B)を参照しての詳細を説明する。
工程1では、プロモーター領域及びその下流に位置する候補ペプチドをコードする領域を含み、かつ最も下流のアンチセンス鎖の5’末端側に少なくとも1個の2’−修飾ヌクレオシド誘導体を含んでいる、複数の異なる候補DNA分子を含む、候補DNA分子のライブラリーを用意する。
工程2では、上記候補DNA分子を鋳型として転写し、対応する候補RNA分子のライブラリーを作製する(「工程(i)」の一態様)。
RNAリガーゼを用いるライゲーションにより連結してヘアピン構造を形成させる方法
が開発された。また、分解能の高い電気泳動によってライブラリーの精製を行い、1〜数塩基が付加された候補RNA分子を除去することも考えられた。一方、本実施形態の方法では、精製を行わなくとも後述の工程3においてより簡便にかつ高い効率でペプチド受容分子を結合することができる。
工程3では、候補RNA分子の3’末端に、スプリントポリヌクレオチドを足場として用いて、ペプチド受容分子を結合する(「工程(ii)」の一態様)。
工程4では、工程3で得られたペプチド受容分子が結合されている候補RNA分子を翻訳することによって、候補RNA分子と、当該候補RNA分子にコードされている候補ペプチドとが、ペプチド受容分子を介して連結している、候補RNA分子と候補ペプチドとの複合体(候補RNA−ペプチド複合体)のライブラリーを作製する(「工程(iii)」の一態様)。
工程5では、候補RNA−ペプチド複合体のライブラリーを結合パートナーと接触させ、結合反応を行う。
工程6では、逆転写反応を行って、候補RNA−ペプチド複合体における候補RNA分子部分をDNA(cDNA)分子との二本鎖にする。本実施形態において、逆転写反応は、溶出等によって結合パートナーから解離させた後に行うこともできるし、結合パートナーに結合した状態で行うこともできる。結合パートナーに結合した状態で行うことにより、RNA(アプタマー)によって結合しているcDNAを抑制できるというメリットがある。逆転写反応は例えば通常の方法で行えばよい。本実施形態では、工程5よりも後に逆転写反応を行うため、工程5よりも前に逆転写反応のための精製を行う必要がないというメリットを有する。そのため、精製により候補RNA分子の多様性が減少するという従来の方法における問題が生じない。
工程7では、候補RNA−ペプチド複合体と結合パートナーとを解離させて、候補RNA−ペプチド複合体を回収する。解離させる方法は、結合パートナーとの結合の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、Ficin、パパイン、トリプシンなどのプロテアーゼ、または、IdeS、IdeZなどの抗体配列特異的なプロテアーゼが利用可能である。このように工程5〜7を行って、候補RNA−ペプチド複合体のライブラリーから所望するRNA−ペプチド複合体が選抜される(「工程(iv)」の一態様)。
選抜されたRNA−ペプチド複合体は、その後、RNA及び/又はペプチドの配列等が分析されてもよい。分析は、通常のアミノ酸配列シークエンサーで行うこともでき、このようなペプチドに結合しているRNAからDNAを逆転写し、得られたcDNAの塩基配列を解析することによって行うこともできる。また、適宜、精製や定量を行ってもよい。
別の実施形態に係る方法では、上述の実施形態の工程5と工程6との順序を入れ替えることも可能である。すなわち、従来のmRNAディスプレイ法の工程4において、工程3で得られたペプチド受容分子が結合されている候補RNA分子を翻訳した後、続いて工程6に相当する逆転写反応を行い、候補RNA−ペプチド複合体における候補RNA分子部分をDNA(cDNA)分子との二本鎖にする。その後、工程5に相当する、候補RNA−ペプチド複合体のライブラリーを結合パートナーと接触させる結合反応を行う。
創薬の標的分子に相互作用するタンパク質の同定、薬剤標的タンパク質の解析、抗体分子の取得やその改変、抗体が認識する抗原タンパク質及びその抗原部位の特定、種々の機能性タンパク質やペプチドの改変、ワクチンの活性確認等が挙げられる。
(1) ペプチドをコードするRNA分子と、当該RNA分子にコードされているペプチドとの複合体を製造する方法であって、
工程(i): プロモーター領域及びその下流に位置するペプチドをコードする領域を含むDNA分子から転写反応によってRNA分子を作製する工程であって、当該DNA分子の最も下流のアンチセンス鎖の5’末端側に少なくとも1個の2’−修飾ヌクレオシド誘導体を含んでいる工程と、
工程(ii): 工程(i)で得られた上記RNA分子の3’末端に、スプリントポリヌクレオチドを足場として用いて、ペプチド受容分子を結合する工程と、
工程(iii): 工程(ii)で得られたペプチド受容分子が結合されている上記RNA分子を翻訳することによって、上記RNA分子と、当該RNA分子にコードされているペプチドとが、上記ペプチド受容分子を介して連結している、RNA分子とペプチドとの複合体を作製する工程と、
を含んでなる、方法。
(2) 上記翻訳は、RNaseを実質的に含まないインビトロ翻訳系で行う、(1)に記載の方法。
(3) 上記翻訳は、上記DNA分子に対して活性のあるRNAポリメラーゼを実質的に含まないインビトロ翻訳系で行う、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 上記DNA分子は、連続する2個の2’−修飾ヌクレオシド誘導体を含んでいる、(1)〜(3)の何れかに記載の方法。
(5) 上記2’−修飾ヌクレオシド誘導体は、2’−O−メチルグアノシンである、(1)〜(4)の何れかに記載の方法。
(6) 上記ペプチド受容分子は、ピューロマイシンである、(1)〜(5)の何れかに記載の方法。
(7) 複数の異なる上記DNA分子を用いて、複数の異なるRNA分子とペプチドとの上記複合体を作製する、(1)〜(6)の何れかに記載の方法。
(8) (1)〜(7)の何れかに記載の方法を含む、mRNAディスプレイ法であって、
工程(iii)で得られたRNA分子とペプチドとの複合体から、所望する複合体を選抜する工程(iv)を含む、方法。なお、工程(iv)が行われる事前に、上記RNA分子とペプチドとの複合体におけるRNA分子部分は、その少なくとも一部が、相補的なDNA(cDNA)分子との二本鎖構造を形成していてもよい。
(9) 工程(i)〜工程(iv)を1サイクルとして、複数サイクルを繰り返し行う、(8)に記載の方法。
(10) mRNAディスプレイ法に用いるDNAライブラリーであって、
プロモーター領域及びその下流に位置する候補ペプチドをコードする領域を含み、かつ最も下流のアンチセンス鎖の5’末端側に少なくとも1個の2’−修飾ヌクレオシド誘導体を含んでいる、複数の異なる候補DNA分子を含む、DNAライブラリー。
(11) 1013個以上の異なる候補DNA分子を含む、(10)に記載のDNAライブラリー。
[方法]
(1)実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウス抗体磁気ビーズの作製
C57B6マウス(10週齢)に、MOG35−55ペプチド(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)を完全フロイントアジュバントを用いて免疫した。免疫後20〜22日に全血を回収し、等量のPBSと混和し、フィコールを用いて血清成分を分離した。血清100μLを100μLのProteinG磁気ビーズ(dynabeads)に4℃で1時間結合させた。これを500μLの洗浄バッファー(50mM Tris−HCl pH7.5,300mM
NaCl,0.1% TritonX−100)で5回洗浄し、EAEマウス抗体が固定化された磁気ビーズを作製した。
ランダムORF領域を含む10nMのランダムライブラリーDNA:GCTGCCGCTGCCGCTGCC (MNN)n CATATGTATATCTCCTTCTTAAAG(n=8)又は下記(7)で回収したcDNA(2サイクル目以降)を、1μMのF-primer(CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG)及びR-primer(GmGmTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA(Gm:2’−O−メチルグアノシン))を用いてPCR(94℃:10秒,58℃:10秒,72℃:30秒,8サイクル)を行った。これによって、T7プロモーター配列、シャイン・ダルガノ配列(SD配列)及びランダムORF領域を含むテンプレートDNAライブラリー:CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG (NNK)n TGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCTACTTTGATCCGCCGACC (n=8)を作製した。これをFastGene Gel/PCR Extraction Kitを用いて精製した。
10nMのテンプレートDNAライブラリーから、50μLスケール(0.086ngT7 RNA polymeras,4.5mM NTP,40mM HEPES−KOH
(pH 7.6),20mM MgCl2,2mM spermidine,5mM DTT)で、37℃で1時間転写を行い、RNAライブラリーを作製した。
得られたRNAライブラリー3μLに10mM ATP 1μL,100μM Pu−DNA(CTCCCGCCCCCCGTCC[spacer18]5CC[Puromycin])2μL,100μM splint−DNA(GGGCGGGAGGGTCGGCGGATCAA)2μL、及びx1 T4 DNA ligase buffer 13μLを加え、95℃で3分間加熱した。室温で冷却した後0.5μLのT4 DNA Ligase(70U/μL)を加え、37℃で1.5時間反応させた。
2.4μLのピューロマイシン付加RNAライブラリーを20μLスケールのPURE system(14μLのSolution A,2μLのSolution B(RNAポリメラーゼ、RF1マイナス),2μLの50 mM Hepes-KOH(pH 7.6),100 mM KCl,10 mM MgCl2,30% glycerol)を用いて37℃で1時間反応させた。次いで、ここに30μLのbinding buffer(50 mM Tris-HCl(pH 8.0),61 mM EDTA)を加えた。
(5)で得られたmRNA−ペプチドライブラリーを、健康なマウス由来の抗体を固定化したProteinG磁気ビーズ(dynabeads)10μLに加え、4℃で30分反応させた。上清をEAEマウス由来の抗体を結合させた磁気ビーズ10μLに加え、4℃で30分反応させた。磁気ビーズを50μLの洗浄バッファー(50mM Tris-HCl pH7.5, 300mM NaCl, 0.1% Triton X-100)で8回洗浄した。
磁気ビーズに200μM dNTP, 1 mM DTT, 200nM Primer P2(GGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA) 0.5μL、ProtoScriptII RTase 200 U を含む 1x ProtoScript bufferを加え、37℃で30分間反応させた。上清を捨て、50μLの洗浄bufferで1回洗浄した。
50μLの溶出buffer(10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 75 mM KCl, 0.1 % Triton X-100, 10 mM DTT)を加えた。これを97℃で3分間加熱し上清を回収した。
結果を図2に示す。(A)はペプチドセレクションにおいて得られたペプチド配列とMOGタンパク質に対するスコアを示す。Rank2の7番目は終始コドンであり、1〜6番目の配列のみが翻訳されていると推定される。(B)はEAEマウス抗体のMOGタンパク質の認識部位を示す。(C)はEAEマウス抗体の抗原のモチーフ配列を示す。図2からわかるとおり、得られたアミノ酸配列からMOG35−55ペプチドの一部と相同性の高いモチーフ配列が得られた。また、MOGタンパク質の他の部位に対しての配列は検出されず、疾患原因となったペプチドを特異的に得ることに成功した。
(1)DNAの作製
10nMのFLAGペプチドテンプレート2重鎖DNA:GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGAAGTACTCCCCAACCGACTGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCTACTTTGATCCGCCGACCのアンチセンス鎖の5’末端の2塩基にグアノシン(WT)又は2’−O−メチルグアノシン(Gm)が導入されたテンプレートDNAを作製した。
それぞれのテンプレートDNA(10nM)を20μLスケール(0.086 ng T7 RNA polymerase,4.5 mM NTP, 40 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 20 mM MgCl2, 2 mM spermidine, 5 mMDTT)で37℃、1時間反応させ、転写されたmRNAをQubitを用いて定量した。
それぞれ1μMのmRNA、固相担体に抗FLAG(登録商標)M2抗体磁気ビーズ(シグマM8823)を用いて実施例1と同様にBiomek FXを用いたセレクションを行い、得られたcDNAをqPCRを用いて定量した。
結果を図3に示す。(A)はテンプレートDNAによるペプチド回収効率を示す。(B)はqPCRによるcDNAの検量線を示す。図3から算出されるとおり、2’−O−メチルグアノシン(Gm)が導入されたテンプレートDNAを用いることによって、ペプチドセレクションの効率が10倍程度向上することが確認された。
終始コドンの下流における、Pu−DNAとの連結に用いる配列(下線部)のみが異なる3種類のFLAGペプチドをコードする二本鎖DNAを作製し、それぞれを用いたペプチドセレクションの効率を検証した。
上記テンプレートDNAからT7 RNAポリメラーゼを用いてmRNAを作製した。Qubit(登録商標) RNA HS Assay Kitを用いてRNAを定量し、それぞれ7μMに調製した。Template DNA 1由来RNAは10μM Pu-DNA(CTCCCGCCCCCCGTCC[spacer18]5CC[Puromycin]), 1 mM ATPを含むx0.6 T4 RNA Ligase buffer(添付)15 μLと混和し95℃で2分間加熱を行い、室温で冷却した。その後、1μL(10U)のT4 RNA Ligase1(NEB社製)を加え、37℃で1.5時間反応させた。Template DNA 2,3由来RNA(3μL)は5μM Pu-DNA、5μM splint-DNA(GGGCGGGAGGGTCGGCGGATCAA)を含むx0.6 T4 DNA Ligase buffer(添付・1mM ATP含有)15μLと混和し、95℃で2分間加熱し、室温で冷却した。その後、1μL(400U)のT4 DNA Ligase(NEB社製)を加え、37℃で1.5
時間又は16℃で一晩(16時間)反応させた。それぞれ、0.5μLを7Mウレア10%PAGEで電気泳動(180V 45min)した。mRNA/Pu−DNA連結部位の構造は、図4の(A)に示すとおりである。
実験1で用いたそれぞれのmRNA(7μM)、固相担体に10μLの抗FLAG(登録商標)M2抗体磁気ビーズ(シグマM8823)を用いて実施例2と同様にBiomek FXを用いたセレクションを行い、得られたcDNAをqPCRを用いて定量した。なお、Template DNA 1を用いたペプチドセレクションには、T4 RNA ligase 1(NEB社製)を用いた。
[方法]
実施例2と同じ条件で、FLAGペプチド−cDNAを作製し、抗FLAG(登録商標)M2抗体磁気ビーズ(シグマM8823)からのcDNAの回収方法を検討した。
[方法]
実施例2と同じテンプレートDNAを用い、20μLスケールでFLAGペプチド−mRNA複合体を作製した。これを1/4量ずつ分割し、3サンプルに0.23μL EDTA(0.5 M)を加え、25℃で10分または50℃で10分、または95℃で1分静置した。これに、0.33μL MgCl2 (0.5 M)を加え、20μLのReverse transcription mix(1 mM dNTP, 10 mM DTT 0.2μM Primer P2 (GGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA) 0.125μL、ProtoScriptII RTase 100μ を含む 1x ProtoScript buffer)を加え、37℃で40分反応させた。これを、1μLの抗FLAG M2抗体磁気ビーズ (SIGMA:M8823)に室温で30分結合反応を行い、50μLの洗浄バッファーで10回洗浄を行った。これに30μLの溶出buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 75 mM KCl, 0.1 % Triton X-100, 10 mM DTT)を加え、97℃で3分加熱し速やかに上清を回収し、qPCRで定量を行った。残り1サンプルは、20μL のbinding buffer(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 61 mM EDTA)を加え、1μLの抗FLAG M2抗体磁気ビーズ (SIGMA:M8823)と室温で30分結合反応を行い、50μLの洗浄バッファーで10回洗浄を行った。これに30μLの溶出buffer (10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 75 mM KCl, 0.1 % Triton X-100, 10 mM DTT)を加え、97℃で3分加熱し速やかに上清を回収し、qPCRで定量を行った(control)。
結果を図8に示す。図8からわかるとおり、翻訳直後にcDNA合成を行い、その後抗体への結合反応を行う手順でのDECODE法も可能であり、EDTAを加えた後に高温で処理することで若干の効率化が期待できる。
Claims (11)
- ペプチドをコードするRNA分子と、当該RNA分子にコードされているペプチドとの複合体を製造する方法であって、
工程(i): プロモーター領域及びその下流に位置するペプチドをコードする領域を含むDNA分子から転写反応によってRNA分子を作製する工程であって、当該DNA分子の最も下流のアンチセンス鎖の5’末端側に少なくとも1個の2’−修飾ヌクレオシド誘導体を含んでいる工程と、
工程(ii): 工程(i)で得られた上記RNA分子の3’末端に、スプリントポリヌクレオチドを足場として用いて、ペプチド受容分子を結合する工程と、
工程(iii): 工程(ii)で得られたペプチド受容分子が結合されている上記RNA分子を翻訳することによって、上記RNA分子と、当該RNA分子にコードされているペプチドとが、上記ペプチド受容分子を介して連結している、RNA分子とペプチドとの複合体を作製する工程と、
を含んでなる、方法。 - 上記翻訳は、RNaseを実質的に含まないインビトロ翻訳系で行う、請求項1に記載の方法。
- 上記翻訳は、上記DNA分子に対して活性のあるRNAポリメラーゼを実質的に含まないインビトロ翻訳系で行う、請求項1又は2に記載の方法。
- 上記DNA分子は、連続する2個の2’−修飾ヌクレオシド誘導体を含んでいる、請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 上記2’−修飾ヌクレオシド誘導体は、2’−O−メチルグアノシンである、請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 上記ペプチド受容分子は、ピューロマイシンである、請求項1〜5の何れか1項に記載の方法。
- 複数の異なる上記DNA分子を用いて、複数の異なるRNA分子とペプチドとの上記複合体を作製する、請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
- 請求項1〜7の何れか1項に記載の方法を含む、mRNAディスプレイ法であって、
工程(iii)で得られたRNA分子とペプチドとの複合体から、所望する複合体を選抜する工程(iv)を含む、方法。 - 工程(i)〜工程(iv)を1サイクルとして、複数サイクルを繰り返し行う、請求項8に記載の方法。
- mRNAディスプレイ法に用いるDNAライブラリーであって、
プロモーター領域及びその下流に位置する候補ペプチドをコードする領域を含み、かつ最も下流のアンチセンス鎖の5’末端側に少なくとも1個の2’−修飾ヌクレオシド誘導体を含んでいる、複数の異なる候補DNA分子を含む、DNAライブラリー。 - 1013個以上の異なる候補DNA分子を含む、請求項10に記載のDNAライブラリー。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017053621 | 2017-03-17 | ||
JP2017053621 | 2017-03-17 | ||
PCT/JP2018/010223 WO2018168999A1 (ja) | 2017-03-17 | 2018-03-15 | Rna分子とペプチドとの複合体の製造方法、及びその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018168999A1 true JPWO2018168999A1 (ja) | 2020-02-27 |
JP6852917B2 JP6852917B2 (ja) | 2021-03-31 |
Family
ID=63523803
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019506263A Active JP6852917B2 (ja) | 2017-03-17 | 2018-03-15 | RNA分子とペプチドとの複合体の製造方法、mRNAディスプレイ法、及びDNAライブラリー |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11286481B2 (ja) |
EP (1) | EP3597746B1 (ja) |
JP (1) | JP6852917B2 (ja) |
CN (1) | CN110637086B (ja) |
AU (1) | AU2018236568B2 (ja) |
CA (1) | CA3056756C (ja) |
SG (1) | SG11201908579PA (ja) |
WO (1) | WO2018168999A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7416715B2 (ja) | 2018-11-07 | 2024-01-17 | 公益財団法人川崎市産業振興財団 | ペプチド-核酸複合体 |
CN111041025B (zh) | 2019-12-17 | 2021-06-18 | 深圳市瑞吉生物科技有限公司 | 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法 |
CN112111524B (zh) * | 2020-01-10 | 2024-02-27 | 深圳瑞吉生物科技有限公司 | mRNA-GalNAc靶向分子的制备方法及其体内递送系统和应用 |
CN111235198B (zh) * | 2020-01-20 | 2021-06-15 | 深圳市瑞吉生物科技有限公司 | 规模化合成长链rna的方法及其定点修饰的方法 |
CN111117978B (zh) * | 2020-01-27 | 2022-07-15 | 黄种山 | 一种单链DNA肽连接酶sDPlaseI及其使用方法 |
CN111088235B (zh) * | 2020-01-27 | 2022-07-12 | 黄种山 | 一种双链DNA肽连接酶dDPlaseI及其使用方法 |
CN111088236B (zh) * | 2020-01-27 | 2022-07-22 | 黄种山 | 一种单链RNA肽连接酶sRPlaseI及其使用方法 |
CN111088234B (zh) * | 2020-01-27 | 2022-07-15 | 黄种山 | 一种双链DNA肽连接酶dDPlaseII及使用方法 |
CN111744019B (zh) | 2020-07-01 | 2023-08-04 | 深圳瑞吉生物科技有限公司 | 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用 |
CN115010794A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-06 | 武汉瑞佶生物科技有限公司 | 蛋白质介导的mRNA靶向分子及其制备方法和应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002513281A (ja) * | 1997-01-21 | 2002-05-08 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | Rna−蛋白質の融合体を用いた蛋白質の選抜 |
WO2009099073A1 (ja) * | 2008-02-07 | 2009-08-13 | The University Of Tokyo | 非天然塩基を含む改変tRNA及びその用途 |
WO2012074029A1 (ja) * | 2010-12-01 | 2012-06-07 | 田辺三菱製薬株式会社 | 無細胞翻訳系でFabを提示しうるポリヌクレオチド構築物ならびにそれを用いたFabの製造方法およびスクリーニング方法 |
JP2013226138A (ja) * | 2012-04-26 | 2013-11-07 | Genefrontier Corp | タンパク質多量体の効率的な提示法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6261804B1 (en) | 1997-01-21 | 2001-07-17 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
US8207093B2 (en) | 1997-01-21 | 2012-06-26 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
AU2003225085A1 (en) * | 2002-04-19 | 2003-11-03 | California Institute Of Technology | Unnatural amino acid containing display libraries |
EP2492344B1 (en) | 2009-10-22 | 2016-04-06 | PeptiDream Inc. | Rapid display method in translational synthesis of peptide |
JP5818237B2 (ja) * | 2010-09-09 | 2015-11-18 | 国立大学法人 東京大学 | N−メチルアミノ酸およびその他の特殊アミノ酸を含む特殊ペプチド化合物ライブラリーの翻訳構築と活性種探索法 |
WO2012074129A1 (ja) * | 2010-12-03 | 2012-06-07 | 国立大学法人東京大学 | 安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法 |
WO2014119600A1 (ja) * | 2013-01-30 | 2014-08-07 | ペプチドリーム株式会社 | Flexible Display法 |
CN103382579B (zh) * | 2013-07-06 | 2015-10-21 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种体外筛选多肽的方法 |
JP6325632B2 (ja) | 2016-11-02 | 2018-05-16 | 東芝ライフスタイル株式会社 | 冷蔵庫 |
-
2018
- 2018-03-15 SG SG11201908579P patent/SG11201908579PA/en unknown
- 2018-03-15 CN CN201880018535.8A patent/CN110637086B/zh active Active
- 2018-03-15 WO PCT/JP2018/010223 patent/WO2018168999A1/ja active Application Filing
- 2018-03-15 EP EP18768096.2A patent/EP3597746B1/en active Active
- 2018-03-15 CA CA3056756A patent/CA3056756C/en active Active
- 2018-03-15 AU AU2018236568A patent/AU2018236568B2/en active Active
- 2018-03-15 US US16/494,996 patent/US11286481B2/en active Active
- 2018-03-15 JP JP2019506263A patent/JP6852917B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002513281A (ja) * | 1997-01-21 | 2002-05-08 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | Rna−蛋白質の融合体を用いた蛋白質の選抜 |
WO2009099073A1 (ja) * | 2008-02-07 | 2009-08-13 | The University Of Tokyo | 非天然塩基を含む改変tRNA及びその用途 |
WO2012074029A1 (ja) * | 2010-12-01 | 2012-06-07 | 田辺三菱製薬株式会社 | 無細胞翻訳系でFabを提示しうるポリヌクレオチド構築物ならびにそれを用いたFabの製造方法およびスクリーニング方法 |
JP2013226138A (ja) * | 2012-04-26 | 2013-11-07 | Genefrontier Corp | タンパク質多量体の効率的な提示法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
KAO, C., ET AL.: "A simple and efficient method to transcribe RNAs with reduced 3' heterogeneity", METHODS, vol. 23, no. 3, JPN6018021550, 2001, pages 201 - 205, XP055608886, ISSN: 0004334723, DOI: 10.1006/meth.2000.1131 * |
LIU, R., ET AL.: "Optimized synthesis of RNA-protein fusions for in vitro protein selection", METH. ENZYMOL., vol. 318, JPN6018021549, 2000, pages 268 - 293, XP002909305, ISSN: 0004334722, DOI: 10.1016/S0076-6879(00)18058-9 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20200283761A1 (en) | 2020-09-10 |
CA3056756A1 (en) | 2018-09-20 |
CA3056756C (en) | 2021-12-07 |
AU2018236568A1 (en) | 2019-11-07 |
WO2018168999A1 (ja) | 2018-09-20 |
EP3597746A4 (en) | 2020-12-23 |
AU2018236568B2 (en) | 2021-07-01 |
EP3597746B1 (en) | 2023-04-19 |
JP6852917B2 (ja) | 2021-03-31 |
US11286481B2 (en) | 2022-03-29 |
SG11201908579PA (en) | 2019-10-30 |
EP3597746A1 (en) | 2020-01-22 |
CN110637086B (zh) | 2024-02-06 |
CN110637086A (zh) | 2019-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6852917B2 (ja) | RNA分子とペプチドとの複合体の製造方法、mRNAディスプレイ法、及びDNAライブラリー | |
JP5837478B2 (ja) | ペプチド翻訳合成におけるrapidディスプレイ法 | |
US6716973B2 (en) | Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides | |
US20130116129A1 (en) | Method for detecting target molecules | |
JP6057185B2 (ja) | 核酸リンカー | |
WO2015175747A1 (en) | Barcoded peptides | |
JP2008253176A (ja) | 高親和性分子取得のためのリンカー | |
JP2004097213A (ja) | 核酸および/またはタンパク質の選択方法 | |
EP3262185B1 (en) | Dna display and methods thereof | |
JP6478392B2 (ja) | 核酸リンカー | |
JP7153996B2 (ja) | 架橋ペプチドの作製方法、及びその方法を用いて作製した架橋ペプチド | |
JP5712382B2 (ja) | 生体分子相互作用解析ツールの構成とそれを用いた解析方法 | |
WO2005024018A1 (ja) | 核酸構築物およびその製造方法 | |
JP5858415B2 (ja) | mRNA/cDNA−タンパク質連結体作製用リンカーとそれを用いたヌクレオチド−タンパク質連結体の精製方法 | |
WO2021182587A1 (ja) | 光架橋塩基を活用した、新規ペプチドアプタマー探索用標的モジュール、新規ペプチドアプタマー探索用リンカー及びそれらを用いる新規ペプチドアプタマーの探索方法 | |
JP6194894B2 (ja) | 核酸リンカー |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190913 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20200406 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200901 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201027 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210302 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210304 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6852917 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |