WO2021182587A1 - 光架橋塩基を活用した、新規ペプチドアプタマー探索用標的モジュール、新規ペプチドアプタマー探索用リンカー及びそれらを用いる新規ペプチドアプタマーの探索方法 - Google Patents

光架橋塩基を活用した、新規ペプチドアプタマー探索用標的モジュール、新規ペプチドアプタマー探索用リンカー及びそれらを用いる新規ペプチドアプタマーの探索方法 Download PDF

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WO2021182587A1
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WO
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linker
peptide
searching
site
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根本　直人
琢也 寺井
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株式会社Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
国立大学法人埼玉大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a target module for searching for a novel peptide aptamer, a linker for searching for a novel peptide aptamer, and a method for searching for a novel peptide aptamer using them. More specifically, a target module for searching for novel peptide aptamers that functions not only in a simple buffer but also in a molecularly contaminated environment, that is, in an experimental environment in which various biomolecules coexist in a complex manner at high concentrations such as in cells. , A linker for searching for a novel peptide aptamer, and a method for searching for a novel peptide aptamer using them.
  • Evolutionary molecular engineering specifically, (a1) amplifies while introducing a mutation into a molecule to create an amplified molecular group containing various molecules (hereinafter, "amplified molecular group"), (a2) “desired”. By constructing a mechanism that "only molecules with functions remain” and selecting molecules (variants) with the desired properties from the above amplified molecule group, the process of (a3) and above is repeated to have new molecular functions. The purpose is to develop molecules.
  • evolutionary molecular engineering can be said to be one of the methods for obtaining a mutant having desired properties based on a certain biopolymer by the following procedure (b1) First, the biopolymer contained in a certain group. The mutation is introduced by randomly introducing the mutation into the biopolymer; (b2) Next, the biopolymer into which the above mutation has been introduced is selected, and the biopolymer having the desired characteristics is selected from them. (B3) Amplifies the selected biopolymer and further introduces the mutation to introduce the mutation.
  • the desired biopolymer can be screened by repeating the above operations (b1) to (b3).
  • the basic elements in evolutionary molecular engineering are the technology to generate mutations in biopolymers (introduce mutations), the technology to select molecules with the desired properties from many molecules into which mutations have been introduced, and selection. Examples thereof include a technique for associating the above-mentioned target molecule with its genetic information, and a method for efficiently repeating the above operations.
  • the technology for associating the target molecule with its genetic information can be classified into so-called ribozyme type, virus type, cell type, external intelligence type and the like.
  • virus type is a term indicating a form in which a genotype (DNA or RNA) and a phenotype (protein) are simply linked, and is a "type” of "virus” used in microbiology. It does not indicate.
  • a phage display in which a protein encoded by the genome for example, a coat protein
  • mapping technologies include phage display, cell surface display, ribosome display, mRNA display, cDNA display, etc. (see FIG. 1). Of these, since the phage display and the cell surface display use cells, the cells produce proteins. At present, the phage display method is most often used (see Non-Patent Documents 1 and 2, hereinafter referred to as "conventional example 1").
  • Non-Patent Document 3 hereinafter referred to as "conventional example 2"
  • the cells do not produce protein.
  • the cDNA display method can handle a huge library size (10 12 to 10 13 / mL).
  • the phage display method of Conventional Example 1 is an excellent method in that it has already been established as a simple and rapid method. For example, the entire process of selection and evolution using a phage display is usually completed in about 2 to 3 weeks (see Non-Patent Documents 1 and 2). However, there is a problem that can handle only up to the library with a library size of approximately 10 8 at the maximum.
  • a cDNA display molecule formed by covalently bonding a peptide (phenotype) and a cDNA (genotype) via a puromycin linker (Fig. 3) is used, and this display molecule is used. It is an excellent method in that it is possible to select candidates with more molecular diversity because of its high stability and the ability to handle libraries with a larger size of 10 12 or more as described above. be.
  • the interaction between the cDNA display molecule and the target molecule generally has a problem that originates from the non-covalent bond.
  • cDNA display molecules and other molecules containing proteins are non-specifically adsorbed on a solid phase, a carrier, or the like when performing an assay. This means that there are molecules to be adsorbed other than the target protein, and there is a problem that it is difficult to distinguish between these molecules and the molecule bound to the target protein.
  • the molecule having low specificity to the target molecule is not a molecule intended to be obtained, there is no problem even if it is lost during the washing operation. Further, it is considered that the cDNA display molecule having high specificity and high affinity for the target molecule has a low rate of being dissociated and lost during washing. On the other hand, the cDNA display molecule, which is specific to the target molecule but has a relatively weak affinity, is dissociated and lost during the above washing operation if it is the acquisition target. There was a problem that it could be stored (Fig. 4).
  • one aspect of the present invention is a target module for searching for a peptide aptamer (hereinafter, may be simply referred to as a “target module”).
  • the target module for searching for a peptide aptamer comprises at least one photocrosslinking base; a linker bound to a ligand that interacts with the target molecule, and a duplex formation site that forms a duplex of 5 to 8 mer. It comprises a tag DNA of 4 kDa or more and 15 kDa or less;
  • the double chain forming portion contains the photocrosslinked base.
  • the double chain forming site forms a double chain with the tag DNA binding sequence in the linker, and the photocrosslinked base irradiated with light forms an irreversible covalent bond.
  • the double chain forming site is preferably composed of the following nucleotide sequence, and in the following nucleotide sequence, K represents a photocrosslinking base.
  • the photocrosslinked base is preferably any compound selected from the group consisting of cyanovinylcarbazole and its derivatives, and more preferably 3-cyanovinylcarbazole.
  • a linker module for searching for a peptide aptamer containing a tag DNA binding sequence forming a double chain the main chain is (a1) a solid phase binding site for fixing the linker module to a solid phase and a solid phase. Containing a cleavage site for cleaving the linker module from; (a2) a photocrosslinking base for photocrosslinking the mRNA to the backbone; the side strand is (b1) bound to the backbone. It is provided with a peptide binding site for binding a peptide synthesized corresponding to the mRNA; (b2) a fluorescent molecule for detection;
  • the tag DNA binding sequence preferably has the following nucleotide sequence, and at least the cleavage site is preferably riboG or inosine.
  • the length of the duplex formed with the duplex forming site may be 5 to 8 mer, and the length of the tag DNA binding sequence is not particularly limited.
  • the photocrosslinked base is preferably any compound selected from the group consisting of cyanovinylcarbazole and its derivatives, and more preferably 3-cyanovinylcarbazole.
  • the peptide bond site is preferably any compound selected from the group consisting of puromycin and its derivatives.
  • a target module for searching for a peptide aptamer and a linker module for searching for a peptide aptamer having a main chain and a side chain in which a peptide is bound to the peptide binding site are allowed to interact with each other.
  • the target module forming the double chain and the linker module are irradiated with light and photocrosslinked.
  • the target module for searching for a peptide aptamer is a double bond of 5 to 8 mer with a target molecule; at least one photocrosslinking base and a main chain or side chain of a linker bound to a ligand that interacts with the target molecule. It comprises a single-stranded tag DNA of 4 kDa or more and 15 kDa or less, which comprises a double bond forming site that forms a bond.
  • the linker module for searching for a peptide aptamer has a main chain and a side chain, and at least one of the main chain or the side chain has at least a part of the double chain forming site of the target module and 5 to 5 to It contains a tag DNA binding sequence that forms an 8-mer duplex, the backbone of which is (a1) a solid phase binding site for immobilizing the linker module to the solid phase and for separating the linker module from the solid phase. Containing; (a2) a photobridging base for photocrosslinking an mRNA to the backbone; the side strand is synthesized corresponding to (b1) the mRNA bound to the backbone. It is provided with a peptide binding site for binding the peptide and (b2) a fluorescent molecule for detection.
  • the duplex formation site in the peptide aptamer search target module is preferably composed of the following nucleotide sequence 1, and in the following nucleotide sequence, K represents a photobridge base.
  • the photocrosslinked base is located in the double chain formation site of the peptide aptamer search target module and in the main chain of the peptide aptamer search linker module.
  • the photocrosslinked base is preferably any compound selected from the group consisting of cyanovinylcarbazole and its derivatives, and more preferably 3-cyanovinylcarbazole.
  • the tag DNA binding sequence in the linker module is preferably represented by the following nucleotide sequence 2 or 3.
  • the peptide bond site is preferably any compound selected from the group consisting of puromycin and its derivatives, and more preferably puromycin.
  • the double chain forming sequence in the target module for searching for a peptide aptamer and the tag DNA binding sequence in the linker module are complementarily bound and then irradiated with light. These can be irreversibly covalently bonded with photocrosslinked bases. Then, by forming such a bond, a molecule having a weak specific interaction can be detected.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a virus type mapping strategy.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the fabrication and selection method of a cDNA display.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a conventional cDNA display linker used in the selection method of FIG.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the problems of selection in the above-mentioned cDNA display method and the outline of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a linker module for searching for a peptide aptamer of the present invention.
  • FIG. 6 is a gel electrophoresis image showing the preparation result of the linker module of the present invention.
  • FIG. 7 is a gel electrophoresis image visualized by fluorescence of FAM in which a photocrosslinked sample is bound to a linker module.
  • FIG. 8 is a gel electrophoresis image showing the results of examining the binding between the target module and the linker module.
  • FAM is 6-aminofluorescein
  • TAMRA is 5 (6) -carboxytetramethylrhodamine
  • spc is spacer phosphoramidite 18
  • K is 3-cyanovinylcarbazole (hereinafter, "cnvK” or “cnv K ").
  • cnvK 3-cyanovinylcarbazole
  • FIG. 10 is a gel electrophoresis image showing the affinity between the cDNA display molecule and the target protein.
  • SA streptavidin labeled with tagged DNA
  • SBP streptavidin-binding peptide encoded by the cDNA display
  • BDA shows the results of studies on cross-linking between the cDNA display encoding the B domain of the A protein
  • IgG IgG
  • FIG. 11 is a gel electrophoresis image showing the results of a competitive assay in which bond formation between the target module and the linker module was examined.
  • FIG. 12 is a gel electrophoresis image showing that only the cDNA display (TBP) that binds to the target molecule is photocrosslinked to form a covalent bond.
  • TBP cDNA display
  • the target module of the present invention contains (a1) a target molecule and (a2) a single-stranded tag DNA of 4 kDa or more and 15 kDa or less.
  • the single-stranded tag DNA contains at least one photocrosslinking base and forms a double strand with the main chain or side chain of the linker bound to the ligand that interacts with the target molecule (see FIG. 5). ..
  • a fragment of 4 kDa or more and 15 kDa or less is preferable from the viewpoint of binding to the above-mentioned ligand.
  • the target molecule is not particularly limited as long as it can chemically bond the tag DNA, and any protein can be selected.
  • the target protein include IgG that binds to a desired antigen, single domain antibody and other antibodies, enzymes, receptors, signaling proteins, fragments thereof, artificial proteins including artificially recombined peptides, and the like. can do.
  • the ligand that interacts with the target molecule is not particularly limited as long as it can interact with the target molecule described above.
  • the antibodies, dimers or tetramers thereof, fragments thereof, aptamers containing artificially recombined peptides that interact with target proteins, and the like can be exemplified.
  • "interaction” means binding to the target molecule regardless of the strength of affinity. The above linker will be described later.
  • the "single-stranded tag DNA” is a single-stranded DNA bound to a target molecule, and its length is not particularly limited. However, it is preferable that it is 4 kDa or more because a stable double chain can be formed when the above-mentioned ligand and the target molecule interact with each other.
  • the "single-strand tag DNA” includes a "double-strand forming site” for forming the double-strand.
  • the length of the double chain forming site is not necessarily limited. However, if it is too short, a stable double chain cannot be formed, and if it is too long, a double chain is formed even if the ligand and the target molecule do not interact with each other. It is desirable that the size is approximately 5-8 mars.
  • the photocrosslinked base irradiated with light forms an irreversible covalent bond.
  • the above-mentioned target module and the above-mentioned linker module are not liberated, and a target molecule having a weak interaction can be captured, which is preferable.
  • the double chain forming site is more preferably one having the following nucleotide sequence from the viewpoint of the stability and selectivity of complementary binding. In the nucleotide sequence below, K represents a photocrosslinked base.
  • the photocrosslinking base is preferably a base that forms an irreversible covalent bond when irradiated with light.
  • it is preferably any compound selected from the group consisting of cyanovinylcarbazole and its derivatives, and more preferably 3-cyanovinylcarbazole for the following reasons (see FIG. 8 (b)).
  • Irreversible photocrosslinks with thymine can be formed by irradiating 3-cyanovinylcarbazole with ultraviolet rays, and the time required for this crosslink formation is as short as several seconds to several minutes, resulting in damage to DNA. This is because the amount of UV rays is small, the peptide as designed can be obtained, and the cross-linking can be formed in such a short time, so that the processing speed can be increased.
  • the single-stranded tag DNA has, for example, a poly A tail and a fluorescent label on the 3'side of the double-stranded binding sequence so that the thiol residue is on the 5'end side as shown in FIG. 8 (b). It is preferable to design the linker module so as to be bound in order from the viewpoint of the interaction between the linker module and the target molecule.
  • Such single-stranded DNA can be synthesized according to a conventional method, and a company that outsources the synthesis of such nucleic acids may be requested to produce such DNA.
  • the double chain binding site is designed so that the photocrosslinked base forms an irreversible covalent bond by irradiating ultraviolet light at the double chain forming site where the double chain is formed as described above. It is preferable to do so for the following reasons. With such a sequence, a double strand can be efficiently formed with the tag DNA binding site of the ligand, and the linker module bound by irradiating with long-wavelength ultraviolet light for a short time can be reliably captured. Because it becomes like. Therefore, the double chain forming site preferably contains cnvK in its sequence, and examples thereof include the following sequences.
  • the linker module of the present invention has a main chain (b1) and a side chain (b2) as described above, and the main chain or at least one of the side chains is covered with the above. It contains a tag DNA binding sequence that forms a 5-8 mar double chain with at least a portion of the double chain formation site of the target module.
  • the tag DNA binding sequence has, for example, a sequence complementary to at least a part of the above-mentioned double strand binding sequence. The following sequences can be mentioned as an example of such a sequence.
  • the main chain (b1) contains (b11) a solid phase binding site, (b12) a cleavage site, and (b13) a photocrosslinked base.
  • the solid phase binding site is a site for fixing the linker module to the solid phase
  • the cleavage site is a site for separating the linker module from the solid phase.
  • the photocrosslinking base has a function of binding the main chain and uracil in the mRNA adjacent to the photocrosslinking base by photocrosslinking.
  • any compound selected from the group consisting of a cyanovinyl compound and a derivative thereof can be exemplified, and 3-cyanovinylcarbazole can be preferably used.
  • the solid phase binding site is not particularly limited as long as it is a protein capable of binding to a protein bound to the solid phase.
  • a combination called biotin can be mentioned.
  • the cleavage site is preferably composed of a base that can be site-specifically cleaved by a specific enzyme.
  • RNasT1 when used, ribo G is used, and when endonuclease V is used.
  • the main chain (b1) further includes a region for binding the side chain (b2), which will be described later, and a region for performing reverse transcription (see FIG. 5).
  • the side chain (b2) comprises a peptide bond site (b21), a detection fluorescent molecule (b22), and a tag DNA binding sequence (b23), which is bound to the main chain at the 5'end.
  • the tag DNA binding sequence (b23) forms a duplex with the duplex forming site, and then is irradiated with ultraviolet rays having a predetermined wavelength to obtain the above-mentioned photocrosslinked base contained in the target module. It is irreversibly covalently coupled with the target module.
  • the tag DNA binding sequence is not particularly limited as long as it has a sequence complementary to a part of the double strand binding site.
  • the nucleotide sequence constituting the double chain binding site is SEQ ID NO: A
  • the following nucleotide sequence can be given as an example.
  • the tag DNA sequence described above does not have to be completely complementary to the nucleotide sequence constituting the double chain binding site.
  • a double chain of 5 to 8 mer may be formed between the tag DNA binding sequence and the double chain binding site. preferable.
  • the number of double chains formed is 4 mer or less, the stability of the double chain is low and photocrosslinking does not occur efficiently, and when 9 mer or more, a non-specific photocrosslinking reaction that does not depend on the affinity of the ligand occurs. Is.
  • linker module for searching for a peptide aptamer of the present invention
  • linker module has the above-mentioned main chain (b1) and side chain (b2).
  • the tag DNA binding sequence is arranged in the side chain
  • the length of the tag DNA binding sequence is not particularly limited as long as it can form a duplex of 5 to 8 mer with the duplex forming site.
  • the formation of a double chain of 5 to 8 mer is preferable in that the number and specificity of the finally obtained aptamer can be appropriately controlled.
  • the linker module synthesizes the main chain (b1) and the side chain (b2) separately, and binds the side chain (b2) to the side chain binding site of the main chain (b1) by a conventional method. By doing so, it can be produced.
  • the biotin fragment shown in Table 1 below (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) was prepared as the main chain (b1), and the puromycin fragment (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) in the same table as the side chain (b2). Can be created and used.
  • the present invention is also a method for searching for a novel peptide aptamer including the following steps.
  • in vitro selection is performed using the cDNA display method using the linker module described above.
  • the structures of the target module and the linker module used in the following step 1 are as described above, respectively, and these are manufactured and used.
  • the desired DNA library is transcribed to prepare mRNA, and this mRNA is ligated with a linker to form an mRNA-linker linkage.
  • the linker is a peptide binding site composed of puromycin, a side chain having a fluorescent label, a solid phase binding site composed of biotin, an mRNA binding site, and a solid phase cleavage composed of riboG. It is composed of a site and a main chain having a reverse transcription initiation region.
  • a peptide is formed from this conjugate using a cell-free translation system.
  • the formed peptide is displayed on puromycin constituting the peptide binding site, and may be referred to as an mRNA-linker-peptide conjugate (hereinafter, "mRNA display molecule” or "in vitro virus”.
  • mRNA display molecule or "in vitro virus”.
  • in vitro virus is also referred to as “in vitro virus”. It may be abbreviated as "IVV”).
  • the above IVV is bound to the solid phase at the solid phase binding site.
  • the displayed peptide is then reverse transcribed to produce a cDNA complementary to the mRNA, which is then cleaved from the solid phase at the solid phase cleavage site to obtain a cDNA display molecule.
  • the obtained cDNA molecule is purified using a tag attached to the C-terminal, and affinity selection (selection by affinity) for the target molecule is performed. At this time, peptides that do not interact with the target molecule used for selection are removed.
  • a DNA library of the specifically bound peptide can be obtained by eluting the peptide specifically bound to the target molecule with a desired eluate and amplifying it by PCR.
  • DNase is added in the desired amount.
  • DNase eg, RQ1 Dnase, manufactured by Promega
  • the obtained mRNA can be purified using, for example, AfterTri-ReagentRNA Clean-Up Kit (manufactured by FavogenBiotech Corp.).
  • the mRNA obtained as described above and the above linker are ligated by irradiating with a long wavelength UV (for example, about 350 to about 370 nm) for 0.5 to 5 minutes.
  • the resulting linker-mRNA conjugate is cell-free translated at the desired scale as described above. For example, using a cell-free translation system such as erythrocyte lysate in rabbit reticulum, 10 to 20 pmol of the above mRNA-linker conjugate is translated on a scale of 100 to 150 ⁇ L at about 30 ° C. for about 15 minutes.
  • MgCl 2 and KCl are added to, for example, about 70 to 80 mM and about 850 to 950 mM, respectively, and incubated at about 37 ° C. for about 1 hour to obtain a translation reaction solution containing an mRNA-peptide conjugate.
  • This translation reaction contains IVV in which the peptide is further linked to the mRNA-linker.
  • the magnetic beads are then washed, for example, with about 200 ⁇ L of 1x binding buffer for SA 2-4 times, and for example, about 100 ⁇ L of reverse transcriptase reaction according to the protocol attached to ReverTraAse®.
  • the mixture is charged and stirred at about 42 ° C. for about 15 minutes to perform reverse transcription to prepare an mRNA / cDNA-peptide conjugate (hereinafter sometimes referred to as “cDNA display”).
  • anti-FLAG M2 affinity gel about 40 to 60% suspension
  • a suitable column such as MicroSpin Empty Columns (manufactured by GE Healthcare), and about 150 to 250 ⁇ L. Wash with selection buffer 2-4 times.
  • about 50 to 150 ⁇ L of the above supernatant is taken and loaded on a column, and the mixture is stirred at room temperature for about 1 hour using a rotator.
  • PCR The eluate in the column is collected by centrifugation, ethanol precipitation is performed, and then the solution is dissolved in a desired amount of nuclease-free water.
  • the above ethanol precipitation product is added to about 150 to 250 ⁇ L of PCR reaction solution, and PCR is performed.
  • the eluate in the column collected by centrifugation is precipitated with ethanol using Quick-Precip Plus Solution or the like, and dissolved in about 15 ⁇ L of Nuclease-free water.
  • 1xPrimeSTAR buffer containing about 150-250 ⁇ L of PCR reaction solution (about 0.2 mM dNTPs, about 0.4 ⁇ M T7 ⁇ new, about 4 ⁇ M New Ytag for cnvK, about 0.02 U / ⁇ L PrimeSTAR HS DNA polymerase)
  • PCR reaction solution about 0.2 mM dNTPs, about 0.4 ⁇ M T7 ⁇ new, about 4 ⁇ M New Ytag for cnvK, about 0.02 U / ⁇ L PrimeSTAR HS DNA polymerase
  • T7 ⁇ new and New Ytag for cnvK SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing
  • the sequences of these primers are shown.
  • PCR was performed, for example, at (a1) 98 ° C for 1 minute, (b1) 98 ° C for 15 seconds, (c1) 68 ° C for 30 seconds, (d1) 68 ° C for 1 minute, and (b1) and ( c1) can be 25 cycles.
  • the obtained PCR product is subjected to SDS gel electrophoresis to excise full construct DNA and purified according to a conventional method.
  • Double-stranded DNA can be obtained by adding the purified full construct DNA to a desired amount of PCR reaction solution, dispensing the desired amount, and performing PCR again.
  • the PCR product obtained by PCR as described above is run on, for example, 8M urea-denatured 6% PAGE to cut out full construct DNA (260 to 300 mer) and purified according to a conventional method. do.
  • the purified full construct DNA contains about 150-250 ⁇ L of PCR reaction solution (about 0.2 mM dNTPs, about 0.4 ⁇ M Newleft, about 0.4 ⁇ M NewYtag for cnvK, and about 0.02 U / ⁇ L PrimeSTAR HS DNA polymerase.
  • Double-stranded DNA can be obtained by dispensing about 25 to 75 ⁇ L each in addition to 1xPrimeSTAR buffer ( containing Mg 2+) and performing PCR for about 5 cycles.
  • the New Left sequence SEQ ID NO: 5 in the sequence listing
  • exemplified as the primer used here is shown below.
  • PCR is, for example, (a2) 98 ° C. for 1 minute, (b2) 98 ° C. for 10 seconds, (c2) 68 ° C. for 30 seconds, (d2) 68 ° C. for 1 minute, and steps (b2) and (c2). Can be performed for 5 cycles.
  • the PCR reaction solution is collectively purified by column and used in the next round.
  • display molecule the DNA sequence encoding the target-binding peptide (FLAG peptide in this case) and the peptide are integrated.
  • the above is the selection cycle using the cDNA display method used in the present invention.
  • the method for searching for peptide aptamer of the present invention is a modification of the above-mentioned cDNA display method.
  • the target module and the linker module prepared as described above are used, and the peptide aptamer is searched by the method having the following steps 1 to 3.
  • the above-mentioned target module for searching for a peptide aptamer and a linker module for searching for a peptide aptamer having a main chain (b1) and a side chain (b2) are mixed in an aqueous solvent.
  • the linker module used here the peptide (protein) is displayed on puromycin.
  • the mRNA or cDNA encoding the peptide is bound to the main chain of the linker module.
  • incubation is performed at a desired temperature for a desired time in order to allow the peptide displayed on puromycin to interact with the target module. For example, incubate overnight at about 4 ° C.
  • aqueous solvent used in this step examples include a phosphate buffer solution (hereinafter, may be abbreviated as “PB”) and a phosphate buffered saline solution (hereinafter, may be abbreviated as “PBS”).
  • PB phosphate buffer solution
  • PBS phosphate buffered saline solution
  • buffer solution such as, purified water and other aqueous solvents having no buffering action can be mentioned.
  • the peptide displayed on the linker module is a molecule that interacts with the target molecule in the target module when the target module and the linker module are mixed in the above-mentioned solution in an aqueous solvent.
  • the target module and the linker module form a duplex at the duplex forming site and the tag DNA binding site.
  • a double chain is formed between the target module and the linker module. Specifically, a double chain is formed between the double chain forming region in the tag DNA added to the target protein and the tag DNA binding region incorporated in the main chain or side chain of the linker module. It is formed. This is because, as described above, these two sequences are configured to contain sequences that are at least partially complementary to each other.
  • the target module and the linker module having the double chain formed as described above are irradiated with light and photocrosslinked to form a composite module.
  • the linker module and the target module are irreversibly covalently bonded by irradiating with ultraviolet rays having a desired long wavelength for a desired time.
  • the wavelength of the ultraviolet rays used is about 350 nm to about 400 nm, and the irradiation time is 10 to 300 seconds, so that the formation of thymine dimers by the DNA bound to the linker can be prevented.
  • the search throughput can be increased, which is preferable. It is more preferable that the wavelength of ultraviolet rays is about 360 nm and the irradiation time is about 100 to 140 seconds.
  • the composite module is purified.
  • the light-irradiated sample is run on a 4-8% PAGE (100-200V, 60-150 minutes), the band corresponding to the composite module is cut out, and the DNA is purified according to a conventional method. You can do it with.
  • the purified DNA can be PCR-amplified, for example, as described in (3-1-5) above, thereby obtaining a DNA library encoding a ligand that interacts with the target molecule.
  • the conditions for PCR amplification can be set as appropriate.
  • the obtained DNA library is transcribed to obtain mRNA.
  • Selection can be performed by repeating the above-mentioned general cDNA display method or the search method of the present invention utilizing photocrosslinking using this mRNA for a desired number of cycles, and a desired ligand can be obtained. can.
  • it is possible to search for and obtain aptamers having weak interactions in the selection using the cDNA display method.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples, but these are merely examples of the present invention and do not limit the scope of the present invention at all.
  • Example 1 Synthesis of tag DNA, etc.
  • Reagents, devices, etc. As general reagents, the highest grade reagents commercially available by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. were used. Reagents for molecular biology experiments were purchased from SIGMA and Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and used without further purification. We commissioned Eurofins Genomics and Hokkaido System Science to synthesize oligo DNA. The water used was MilliQ (Millipore).
  • PCR uses a Biometra TRIO48 thermal cycler, and unless otherwise noted, (a3) 98 ° C for 1 minute, (b3) 98 ° C for 10 seconds, (c3) 55 ° C for 5 seconds, (d3) 72 ° C. 1 minute / kb, (e3) 1 minute at 72 ° C, and steps (b3) to (d3) were performed for 25 cycles. Unless otherwise specified, PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara) was used for PCR under the conditions recommended by the manufacturer, and the amplified DNA was purified by FavorPrep PCR Clean-Up Mini Kit (Favogen). The primers and synthetic oligos shown in Table 1 below were used.
  • F indicates fluorescein-dT (denoted as M in the sequence listing), and P indicates puromycin CPG.
  • Spacer 18 indicates spacer phosphoramidite 18 (denoted as N in the sequence listing), N indicates 5'-biotin-TEG, and rG indicates guanine ribonucleotide (in the sequence listing). Notated as N).
  • K indicates 3-cyanovinylcarbazole, SH indicates a thiol terminal, and T-NH 2 indicates an amino modifier C6 dT (amino-modifier C6 dT, indicated as NN in the sequence listing).
  • EMCS final concentration 2 mM, manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.
  • EMCS final concentration 2 mM, manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.
  • the modified DNA was purified using a FavorPrep column according to the instructions provided by the manufacturer and eluted with water.
  • the target protein streptavidin or IgG, both having a concentration of about 1 mg / mL
  • the above-mentioned modified tag DNA are mixed in PBS so as to be stoichiometrically equimolar, and overnight at 4 ° C. Incubated.
  • the complex formed was purified using Amicon Ultra (0.5 mL, MWCO: 50 kDa, Merck) and fluorescently labeled with TAMRA (5 (6) -carboxytetramethylrhodamine). Then, it was confirmed by SDS-PAGE.
  • the linker module includes a linker module having a tag DNA binding sequence length of 5 bp (hereinafter, may be referred to as "linker A”), a 7 bp linker module (hereinafter, may be referred to as "linker B”), and the like.
  • linker C A 9bp linker module (hereinafter sometimes referred to as "linker C”) (see Fig. 8 (b)) is incorporated.
  • the mixture was purified with a mixed solution of 20 mM NaH 2 PO 4 and 30 mM NaCl, and the yellow fluorescent portion was separated.
  • 5 ⁇ L of 1 mM biotin fragment, 10 ⁇ L of 100 mM EMCS, and 85 ⁇ L of 0.2 M sodium phosphate buffer were mixed, incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and purified by ethanol precipitation using Precip plus. Subsequently, the two purified fragments were all mixed and incubated overnight at 4 ° C. Then, 10 ⁇ L of 1 M DTT was added, and the mixture was shaken at room temperature for 30 minutes, confirmed by PAGE, and then cut out and purified.
  • the formed PC linker cut out the gel in the squared part of the rightmost lane in Fig. 7.
  • This cut-out gel was mashed with BioMasher II (manufactured by Nippi), a TE buffer was added thereto, and DNA was extracted from the gel overnight.
  • the polyacrylamide remaining after extraction was removed with Spin-X microcentrifuge column (manufactured by Costar). Then, DNA was precipitated with ethanol using Quick-PrecipPlus Solution (manufactured by Edge Bio) and dissolved in water to obtain a PC linker to be used as a linker module.
  • modified tag DNA The tag DNA modified with EMCS (hereinafter sometimes referred to as "modified tag DNA”) is diluted with a 4-fold amount of saturated guanidine hydrochloride aqueous solution and a 6-fold amount of isopropanol with respect to the sample, and then added to the FavorPrep column. It was centrifuged at 10,000 xg for 1 minute. The column was then washed with 70% ethanol and eluted with water.
  • DNA 100 ng was placed in a microtube using a T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System (Promega) and incubated at 37 ° C. for 3 hours to obtain mRNA. Then 1 ⁇ L of DNase was added and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. mRNA was purified with RNeasy MiniElute Cleanup Kit (Qiagen) and its concentration was measured with Nanodrop. Next, NaCl (final concentration 0.2 M), Tris-HCl (pH 7.5, final concentration 0.05 M), PC-linker (20 pmol), and mRNA (20 pmol) were added and annealed on a 20 ⁇ L scale.
  • This annealing was carried out by a process of lowering the temperature from 90 ° C. to 70 ° C. at 0.1 ° C./sec, lowering the temperature to 25 ° C. at 0.02 ° C./sec, and then lowering the temperature to 10 ° C. at 2 ° C./sec.
  • a CL-1000 Ultraviolet Crosslinker was used to irradiate 405 mJ of UV with a wavelength of 365 nm to photocrosslink the linker and mRNA (the product obtained here is called an mRNA-linker).
  • Dynabeads MyOne C1 Streptavidin was washed with 1 ⁇ binding buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20). 60 ⁇ L of Dynabeads MyOne C1 Streptavidin washed as described above was taken, the entire amount of the above mRNA display sample was added thereto, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 60 minutes using a rotator. Washed 3 times with 100 ⁇ L of 1 ⁇ binding buffer and washed with 1 ⁇ ReverTraAce buffer used for 100 ⁇ L reverse transcription.
  • ReverTraAce buffer 5 ⁇ ReverTraAce buffer, 2.5 mM dNTPs mixture (final concentration 1 mM), and ReverTraAce (final concentration 2 U / ⁇ L) are mixed to prepare a reverse transcription solution, and reverse transcription is performed by rotating at 42 ° C for 30 minutes. The reaction was carried out.
  • RnaseT1 (final concentration 5U) was washed with 100 ⁇ L of His tag-binding buffer (20 mM sodium phosphate buffer containing 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, pH 7.4), and then increased to 40 ⁇ L with the above His tag-binding buffer. / ⁇ L) was added, and the mixture was stirred at 37 ° C. for 15 minutes with a rotator to obtain a sample containing a cDNA display.
  • biotin was added at a saturated concentration to the buffer during the RNase T1 treatment. This is to prevent SBP from recombination with streptavidin beads.
  • the template DNA was PCRed using Newleft and cnvK-NewYtag (see Table 1) as primers as needed.
  • the amount used in this electrophoresis corresponds to 0.5 pmol of molecules assuming that the yield of all samples in each step of preparation is 100%.
  • the gel after electrophoresis was visualized by fluorescence using a FITC filter set, and the cDNA display formation efficiency was determined from the fluorescence intensity of the band.
  • For the last three samples add RNase H (Takara, 10U) and 10 ⁇ NE buffer 2 (1/10 volume, NEB) to make a mixture, and bring this mixture to 37 ° C before loading it into the gel. Incubated for 30 minutes to digest RNA / cDNA duplexes.
  • biotin (post-treatment) samples 500 ⁇ M (final concentration) of biotin was added to the light-irradiated samples and then incubated at 25 ° C. for 30 minutes. All samples were analyzed on a non-denaturing PAGE (8% gel, 200 V, 150 minutes) at 4 ° C.
  • FIG. 10 shows the results of gel electrophoresis in which the affinity between the cDNA display molecule and the target protein was examined.
  • FIG. 10 (a) shows the results of photocrosslinking of a tagged DNA-labeled cDNA display encoding a streptavidin-binding peptide (SBP).
  • Figure 10 (b) shows the results of examining the cross-linking between the cDNA display encoding the B domain of the A protein and IgG.
  • Lanes 3 and 4 are the migration results of the sample in which free IgG was excessively added after irradiation. Similar to FIG. 10 (a), the band was upshifted by UV irradiation, and no dissociation of photocrosslinking was observed even when free IgG was added later. From the above, it was shown that the photocrosslinking between the linker module and the target module of the present invention has sufficient practicality.
  • Example 2 Model selection in a contaminated environment The practicality in a contaminated environment was confirmed in the following experimental system. In this system, it was decided to confirm whether or not the peptide that binds to the target protein is correctly bound by photocrosslinking with the following proteins and peptides in the presence of an excessive amount of contaminating protein.
  • SA streptavidin
  • SBP streptavidin-binding peptide
  • SBP model selection SA final concentration 4 ⁇ M modified with DNA tag
  • cDNA display encoding SBP about 0.23 pmol
  • BDA about 0.25 pmol
  • contaminant molecules BSA (final concentration 1%, w / v) was incubated in 10 ⁇ L PBS for 30 minutes at 25 ° C.
  • UV irradiation CL-1000 UV Crosslinker
  • Sample analysis was performed by PAGE (4% gel, 200 V, 60 minutes) at 4 ° C.
  • samples free of one or more compounds were prepared and analyzed.
  • FIG. 11 shows the gel electrophoresis results of the following samples.
  • SBP-cDNA represents an SBP-presented cDNA display molecule
  • BDA-cDNA represents a BDA-presented cDNA display.
  • SBP-cDNA and BDA-cDNA bands were detected at different positions in the samples containing no contaminants and SA with tagged DNA (lanes 1 and 2 in FIG. 11).
  • SA with tagged DNA is added to these samples, the band of SBP-cDNA is upshifted as shown in lane 3 of FIG. 11, and SBP-cDNA binds to SA with tagged DNA (Fig. 11). Lane 3) was confirmed.
  • the position of the band of BDA-cDNA was the same as in the absence of SA with tagged DNA, and it was confirmed that BDA-cDNA did not bind to SA with tagged DNA (lane 4 in Fig. 11).
  • lane 5 of FIG. 11 when the two display molecules were mixed, only the SBP band was upshifted, but the BDA band remained.
  • the upshifted band of SBP-cDNA shows a covalent bond between SBP-cDNA and SA with tagged DNA, confirming that the presence of contaminants does not affect the binding of SBP-cDNA to SA with tagged DNA.
  • SBP streptavidin-binding peptide
  • the target molecule and the linker part of the cDNA display that 1) it is solution-based, 2) it is compatible with molecular contaminants, and 3) it has a large degree of freedom to technically change the washing conditions.
  • the present invention we have established a novel linker for searching for a peptide aptamer, which can obtain the merit of forming a photocrosslink (covalent bond), and a method for searching for the peptide aptamer using the linker.
  • the present invention further has the great advantage that the experimenter can accurately and uniformly control the concentration of the target molecule when using the selection system.
  • the present invention is useful in fields such as medicine, diagnostic agents, and biological analysis.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of biotin fragment
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence of puromycin fragment
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence of T7 ⁇ new
  • SEQ ID NO: 4 Nucleotide sequence of primer (cnvK-NewYtag)
  • Nucleotide sequence No. 5 Nucleotide sequence of primer (Newleft)
  • Nucleotide sequence SEQ ID NO: 6 SBP DNA construct base sequence
  • SEQ ID NO: 7 T7 base sequence
  • SEQ ID NO: 8 ⁇ sequence base sequence
  • SEQ ID NO: 9 SBP base sequence
  • SEQ ID NO: 10 GGGS base sequence
  • SEQ ID NO: 11 His 6 Tag base sequence
  • SEQ ID NO: 12 BDA DNA construct base sequence

Abstract

本発明は、標的タンパク質以外に吸着する分子と、標的タンパク質と結合した分子との区別を可能にする手段を提供することを目的とする。本発明は、標的分子と；少なくとも１つの光架橋塩基と、標的分子と相互作用するリガンドと結合したリンカーの主鎖又は側鎖と５～８マーの二重鎖を形成する二重鎖形成部位とを含む、4 kDa以上15kDa以下の１本鎖のタグＤＮＡと；を備えるペプチドアプタマー探索用標的モジュールを提供する。また、主鎖と側鎖とを有し、前記主鎖又は前記側鎖の少なくとも一方に、前記標的モジュールの前記二重鎖形成部位の少なくとも一部と５～８マーの二重鎖を形成するタグＤＮＡ結合配列を含む、ペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールを提供する。

Description

光架橋塩基を活用した、新規ペプチドアプタマー探索用標的モジュール、新規ペプチドアプタマー探索用リンカー及びそれらを用いる新規ペプチドアプタマーの探索方法
　本発明は、新規ペプチドアプタマー探索用標的モジュール、新規ペプチドアプタマー探索用リンカー及びそれらを用いる新規ペプチドアプタマーの探索方法に関する。より詳細には、単純緩衝液中のみならず分子夾雑環境下、すなわち、細胞内のように様々な生体分子が高濃度で複雑に共存する実験環境下でも機能する、新規ペプチドアプタマー探索用標的モジュール、新規ペプチドアプタマー探索用リンカー、及びそれらを用いる新規ペプチドアプタマーの探索方法に関する。
　生物の突然変異と淘汰との繰り返しによって進化するという地球上で行われてきたサイクルを、試験管内にて実験的に時間を短縮して再現し、核酸、タンパク質その他の分子の生物機能に改良を加えていくものとして、進化分子工学が知られている。
　進化分子工学は、具体的には、(a1)分子に変異を導入しながら増幅させ、多様な分子含む増幅された分子集団（以下、「増幅分子集団」）を創る、(a2)「所望の機能を持つ分子だけが残る」という仕組みを構築して、上記の増幅分子集団から目的の性質を有する分子（変異体）を選択する、(a3)以上のプロセスを繰り返し行い、新しい分子機能を有する分子を開発することを目的としている。
　すなわち、進化分子工学は、ある生体高分子を基にして、以下の手順で所望の特性をもつ変異体を得る方法の一つということができる
　(b1)まず、ある集団に含まれる生体高分子にランダムに変異を導入する操作を行なって変異を導入する；(b2)次に、上記の変異が導入された生体高分子を選択し、それらの中から目的とする特性を有するものを選択する；(b3)上記選択された生体高分子を増幅するとともに、さらに変異を導入する操作を行なって変異を導入する。
　上記(b1)～(b3)のような操作を繰り返すことによって、所望の生体高分子をスクリーニングすることができる。進化分子工学における基本的要素としては、生体高分子に変異を発生させる（変異を導入する）技術、変異が導入された多くの分子の中から目的とする性質を有する分子を選択する技術、選択された上記目的分子とその遺伝情報とを対応付ける技術、及び以上のような操作を効率的に繰り返す方法が挙げられる。
　上記目的分子とその遺伝情報とを対応付ける技術としては、いわゆるリボザイム型、ウイルス型、細胞型、外部知性型等に分類することができる。ここで、上記「ウイルス型」とは、遺伝子型（DNA又はRNA）と表現型（タンパク質）とが単純に結合している形態を示す用語であり、微生物学で用いられる「ウイルス」の「型」を示すものではない。例えば、ゲノムに当該ゲノムがコードしているタンパク質（例えば、コートプロテイン）が単純に結合しているファージディスプレイを挙げることができる。
　現在知られている対応付け技術としては、ファージディスプレイ、細胞表層ディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、cDNAディスプレイ等がある（図１参照）。これらのうち、ファージディスプレイと細胞表層ディスプレイとは細胞を用いることになるため、細胞がタンパク質を産生する。現在のところ、ファージディスプレイ法が最も多く利用されている（非特許文献１、２参照、以下、「従来例１」という。）。
　一方、mRNAディスプレイとcDNAディスプレイ(非特許文献３参照、以下「従来例２」という。)では、無細胞翻訳系を用いるため、細胞がタンパク質を産生することはない。そして、cDNAディスプレイ法では、膨大(1012～1013/mL)なライブラリのサイズを扱うことができることが知られている。
Smith, G.P., et al, Chem. Rev. 1997, 97, 391. Cheng,F.;Zhu,L.;Schwaneberg,U. Chem.Commun.2015,51,9760-9772.DOI:10.1039/C5CC01594D Yamaguchi, J., et al. Nucleic Acids Res. 2009, 37, e108
　従来例１のファージディスプレイ法は、簡便で迅速な手法としてすでに確立されているという点では優れた方法である。例えば、ファージディスプレイを用いるセレクション及び進化の全過程は、通常、約２～３週間で完了する（非特許文献１、２参照）。しかし、最大でも108程度のライブラリサイズを有するライブラリまでしか扱えないという問題があった。
　従来例２のcDNAディスプレイ法では、ペプチド（表現型）とcDNA（遺伝子型）とを、ピューロマイシンリンカー（図３）を介して共有結合して形成されたcDNAディスプレイ分子を用いるが、このディスプレイ分子の安定性が高いこと、及び、上述したように1012以上という、より大きなサイズを有するライブラリを扱うことができるため、より多くの分子多様性を有する候補をセレクションできるという点では優れた方法である。
　しかし、cDNA display 分子と標的分子との相互作用は、上述したように、一般に非共有結合であることに端を発する問題がある。具体的に説明すると、cDNAディスプレイ分子その他のタンパク質を含む分子は、アッセイを行なう際に、固相、担体等に非特異的に吸着することは当業者には周知である。このことは、標的タンパク質以外に吸着する分子が存在していることを意味し、こうした分子と標的タンパク質と結合した分子との区別が難しいという問題があった。
　また、アッセイの感度を保つためには、このような非特異的に吸着したタンパク質を含む分子を、洗浄によって除去することも当業者には周知である。すなわち、担体等に非特異的に吸着したcDNA display分子は、洗浄によって取り除くが、ここで標的分子に対する特異性及び親和性の強さが問題となる。
　上記標的分子に対して特異性の低い分子は、取得することを目的とする分子ではないため、洗浄操作のときに失われても問題はない。また、上記標的分子に対して特異性が高く、親和性も高い上記cDNAディスプレイ分子は洗浄の際に、解離して失われる割合は低いと考えられる。これに対し、標的的分子に対して特異的ではあるが比較的弱い親和性を持つcDNAディスプレイ分子は、仮にこれを取得対象としていた場合、上記の洗浄操作の際に、解離して失われてしまう可能性があるという問題点があった（図４）。
　したがって、標的タンパク質以外に吸着する分子と、標的タンパク質と結合した分子との区別を可能にする手段に対する強い社会的要請があった。また、標的的分子に対して特異的ではあるが比較的弱い親和性を持つcDNAディスプレイ分子を取得できる手段についての強い社会的要請もあった。
　本願の発明者等は、上記のような状況の下で鋭意研究を進め、本願発明を完成したものである。
　すなわち、本願発明のある態様は、ペプチドアプタマー探索用標的モジュール（以下、単に「標的モジュール」ということがある。）である。ここで、前記ペプチドアプタマー探索用標的モジュールは、少なくとも１つの光架橋塩基と；標的分子と相互作用するリガンドと結合したリンカーと５～８マーの二重鎖を形成する二重鎖形成部位とを含む、4 kDa以上15kDa以下のタグＤＮＡと；を備えるものである。
　ここで、前記二重鎖形成部は前記光架橋塩基を含むことが好ましい。また、前記二重鎖形成部位は前記リンカー内のタグＤＮＡ結合配列と二重鎖を形成し、光を照射された前記光架橋塩基が不可逆的な共有結合を形成することが好ましい。さらに、前記二重鎖形成部位は、下記のヌクレオチド配列で構成されることが好ましく、下記のヌクレオチド配列中、Kは光架橋塩基を表す。
［配列番号A］
　TGCAKGCGT
　そして、前記光架橋塩基は、シアノビニルカルバゾール及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることが好ましく、３－シアノビニルカルバゾールであることがさらに好ましい。
　本願発明の別の態様は、主鎖と側鎖とを有し、前記主鎖又は前記側鎖の少なくとも一方に、前記標的モジュールの前記二重鎖形成部位の少なくとも一部と５～８マーの二重鎖を形成するタグＤＮＡ結合配列を含む、ペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールであって：前記主鎖は、(a1)前記リンカーモジュールを固相へ固定するための固相結合部位と、固相から前記リンカーモジュールを切り離すための切断部位と；(a2)前記主鎖にmRNAを光架橋によって結合させるための光架橋塩基と；を含み、前記側鎖は、(b1)前記主鎖に結合されたmRNAに対応して合成されたペプチドを結合するためのペプチド結合部位と；(b2)検出用蛍光分子と；を備えるものである。
　ここで、前記タグＤＮＡ結合配列は、下記のヌクレオチド配列を有することが好ましく、少なくとも前記切断部位は、リボＧ又はイノシンであることが好ましい。ここで、前記二重鎖形成部位との間で形成される二重鎖の長さは５～８マーであればよく、タグＤＮＡ結合配列の長さは特に限定されない。
［配列番号B］
　CGCGTGC
［配列番号C］
　ACGCGTGCA
　さらにまた、前記光架橋塩基は、シアノビニルカルバゾール及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることが好ましく、３－シアノビニルカルバゾールであることがさらに好ましい。
　また、前記ペプチド結合部位は、ピューロマイシン及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることが好ましい。
　本発明のさらに別の態様は、（１）ペプチドアプタマー探索用標的モジュールと、前記ペプチド結合部位にペプチドが結合した状態の主鎖及び側鎖を有するペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールとを相互作用させ、上記標的モジュールの二重鎖形成部位に二重鎖を形成させる相互作用工程と；（２）前記二重鎖を形成している前記標的モジュールと前記リンカーモジュールとに光を照射して光架橋させ、複合モジュールを形成する複合モジュール形成工程と；（３）前記複合モジュールを精製する精製工程と、を備える新規ペプチドアプタマーの探索方法である。ここで、前記ペプチドアプタマー探索用標的モジュールは、標的分子と；少なくとも１つの光架橋塩基と、前記標的分子と相互作用するリガンドと結合したリンカーの主鎖又は側鎖と５～８マーの二重結合を形成する二重鎖形成部位とを含む、4kDa以上15kDa以下の１本鎖のタグＤＮＡと；を備えている。
　そして、前記ペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールは、主鎖と側鎖とを有し、前記主鎖又は前記側鎖の少なくとも一方に、前記標的モジュールの前記二重鎖形成部位の少なくとも一部と５～８マーの二重鎖を形成するタグＤＮＡ結合配列を含み、前記主鎖は、(a1)前記リンカーモジュールを固相へ固定するための固相結合部位と、固相から前記リンカーモジュールを切り離すための切断部位と；(a2)前記主鎖にmRNAを光架橋によって結合させるための光架橋塩基と；を含み、前記側鎖は、(b1)前記主鎖に結合されたmRNAに対応して合成されたペプチドを結合するためのペプチド結合部位と；(b2)検出用蛍光分子と；を備えている。
　前記ペプチドアプタマー探索用標的モジュール中の二重鎖形成部位は、下記のヌクレオチド配列１で構成されることが好ましく、下記のヌクレオチド配列中、Kは光架橋塩基を表す。
［配列番号A］
　TGCAKGCGT
　また、前記光架橋塩基は、前記ペプチドアプタマー探索用標的モジュールの前記二重鎖形成部位内、及び前記ペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールの前記主鎖中にそれぞれ位置することが好ましい。そして、前記光架橋塩基は、シアノビニルカルバゾール及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることが好ましく、３－シアノビニルカルバゾールであることがさらに好ましい。
　さらに、前記リンカーモジュール中のタグＤＮＡ結合配列は、下記のヌクレオチド配列２又は３で表されることが好ましい。
［配列番号B］
　CGCGTGC
［配列番号C］
　ACGCGTGCA
　また、前記ペプチド結合部位は、ピューロマイシン及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることが好ましく、ピューロマイシンであることが更に好ましい。
　本発明によれば、前記ペプチドアプタマー探索用標的モジュール中の二重鎖形成配列と、前記リンカーモジュール（cDNAディスプレイ分子）中のタグＤＮＡ結合配列とを相補的に結合させた後に、光を照射して光架橋塩基でこれらを不可逆的に共有結合させることができる。そして、こうした結合を形成させることにより、特異的相互作用が弱い分子を検出することができる。
図１は、ウイルス型対応付け戦略を示す模式図である。 図２は、cDNAディスプレイの作製とセレクション法とを示す模式図である。 図３は、図２のセレクション法で使用する従来のcDNAディスプレイ用リンカーを示す模式図である。 図４は、上述したcDNAディスプレイ法におけるセレクションの問題点と本発明の概要とを示す模式図である。
図５は、本発明のペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールを示す模式図である。
図６は、本発明のリンカーモジュールの調製結果を示す、ゲル電気泳動像である。 図７は、光架橋した試料をリンカーモジュールに結合させたFAMの蛍光で可視化したゲル電気泳動像である。
図８は、前記標的モジュールと前記リンカーモジュールとの結合の検討結果を示すゲル電気泳動像である。図中FAMは6－アミノフルオレセインを、TAMRAは5(6)-カルボキシテトラメチルローダミンを、spcはスペーサー・ホスホロアミダイト18を、Kは3-シアノビニルカルバゾール（以下、「cnvK」又は「cnvK」ということがある。）を表す。 図９は、本発明のリンカーモジュールを使用したときのcDNAディスプレイ分子の形成を確認した結果を示すゲル電気泳動像である。
図１０は、cDNAディスプレイ分子と標的タンパク質との間の親和性を示すゲル電気泳動像である。(a)は、タグDNAで標識したストレプトアビジン（以下、「SA」と略すことがある。）とcDNAディスプレイがコードするストレプトアビジン結合ペプチド(以下、「SBP」と略すことがある。)の光架橋の検討結果を示す。(b)は、Aタンパク質のBドメイン（以下、「BDA」と略すことがある。）をコードしているcDNAディスプレイとIgGとの架橋の検討結果を示す。 図１１は、前記標的モジュールと前記リンカーモジュールとの結合形成を検討した競合アッセイの結果を示すゲル電気泳動像である。 図１２は、標的分子に結合するcDNAディスプレイ（TBP）のみが光架橋されて共有結合体を形成することを示すゲル電気泳動像である。
　以下に、本発明を、図２、３及び５を参照しつつ、さらに詳細に説明する。
（１）本発明の標的モジュール
　上述したように、本発明の標的モジュールは、(a1)標的分子と、(a2) 4 kDa以上15kDa以下の１本鎖のタグDNAとを含んでいる。ここで、上記１本鎖タグDNAは、少なくとも１つの光架橋塩基を含み、前記標的分子と相互作用するリガンドと結合したリンカーの主鎖又は側鎖と二重鎖を形成する（図５参照）。そして、4 kDa以上15kDa以下の断片であることが、上記リガンドとの結合性の面から好ましい。
　ここで、前記標的分子は、上記タグDNAを化学結合させることができるものである限り特に限定されず、任意のタンパク質を選択することができる。例えば、所望の抗原に結合するIgG、シングルドメイン抗体その他の抗体、酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質、それらのフラグメント、人工的に組換えられたペプチドを含む人工タンパク質等を、前記標的タンパク質として例示することができる。
　前記標的分子と相互作用するリガンドは、上述した標的分子と相互作用することができるものであれば特に限定されない。例えば、前記抗体、それらの二量体又は四量体、それらのフラグメント、標的タンパク質と相互作用する人工的に組換えられたペプチドを含むアプタマー等を例示することができる。本明細書中、「相互作用」とは、前記標的分子と親和性の強弱によらず結合することをいう。また、上記リンカーについては後述する。
　　前記「１本鎖タグDNA」は標的分子に結合されている１本鎖のDNAであり、長さは特に限定されない。しかし、4 kDa以上であることが、上記リガンドと標的分子とが相互作用したときに、安定した二重鎖を形成することができることから好ましい。そして、上記「１本鎖タグDNA」は、上記二重鎖を形成するための「二重鎖形成部位」を含んでいる。上記二重鎖形成部位の長さは必ずしも限定されない。しかし、短すぎると安定した二重鎖が形成できず、逆に長すぎるとリガンドと標的分子が相互作用していなくても二重鎖を形成してしまうため、形成される二重鎖の長さはおよそ５－８マーであることが望ましい。
　また、上記二重鎖形成部位中に後述する光架橋塩基を含むことが、光を照射された前記光架橋塩基が不可逆的な共有結合を形成することから好ましい。このような共有結合を形成することにより、上述した標的モジュールと上記リンカーモジュールとは遊離することがなくなり、相互作用の弱い標的分子を捕捉することができるようになるために好ましい。上記二重鎖形成部位は、相補結合の安定性と選択性の観点とから、下記のヌクレオチド配列を有するものであることがさらに好ましい。下記のヌクレオチド配列中、Kは光架橋塩基を表す。
［配列番号A］
　TGCAKGCGT
　また、光架橋塩基としては、光を照射したときに不可逆的な共有結合を形成する塩基であることが好ましい。具体的には、シアノビニルカルバゾール及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることが好ましく、３－シアノビニルカルバゾールであることが以下の理由からさらに好ましい（図8(b)参照）。３－シアノビニルカルバゾールに紫外線を照射することによってチミンとの間に不可逆的な光架橋を形成できること、また、この架橋形成に要する時間が数秒～数分以内と短時間であるため、DNAに対する損傷が少ないこと、それによって設計通りのペプチドが得られること、及び、こうした短時間で架橋を形成させられるために処理速度を上げることができるからである。
　上記１本鎖タグDNAは、例えば、図8(b)に示すように5’末端側にチオール残基が来るように、また、二重鎖結合配列の3’側にポリＡテイル及び蛍光標識を順に結合させたものとなるように設計することが上記リンカーモジュールと標的分子との相互作用の観点から好ましい。こうした１本鎖DNAは、常法に従って合成することもでき、こうした核酸の合成を受託する企業に作製を依頼してもよい。
　例えば、上記二重鎖結合部位は、上記のように二重鎖を形成した二重鎖形成部位において、紫外光を照射することによって前記光架橋塩基が不可逆的な共有結合を形成するように設計することが以下の理由から好ましい。このような配列とすることによって、上記リガンドのタグDNA結合部位と効率よく二重鎖を形成できること、及びその後に長波長の紫外線を短時間照射することによって結合されたリンカーモジュールを確実に捕捉できるようになるからである。このため、上記二重鎖形成部位は、その配列中にcnvKを含むことが好ましく、例えば、下記の配列を挙げることができる。
［配列番号A］
　TGCAKGCGT
（２）本発明のリンカーモジュール
　本発明のリンカーモジュールは、上述したように主鎖(b1)と側鎖(b2)とを有しており、前記主鎖又は前記側鎖の少なくとも一方に、前記標的モジュールの前記二重鎖形成部位の少なくとも一部と５～８マーの二重鎖を形成するタグDNA結合配列を含んでいる。ここで、前記タグDNA結合配列は、例えば、上述した二重鎖結合配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するものであることが好ましい。こうした配列の一例として、下記の配列を挙げることができる。
［配列番号B］
　CGCGTGC
［配列番号C］
　ACGCGTGCA
　そして、前記主鎖(b1)は、(b11)固相結合部位と、(b12)切断部位と、(b13)光架橋塩基とを含んでいる。ここで、(b11)前記固相結合部位は、前記リンカーモジュールを固相へ固定するための部位であり、(b12)前記切断部位は、前記固相から前記リンカーモジュールを切り離すための部位である。また、(b13)前記光架橋塩基は、前記主鎖と前記光架橋塩基と近接しているmRNA中のウラシルとを、光架橋によって結合させるという機能を有している。具体的には、シアノビニル化合物及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物を例示することができ、3-シアノビニルカルバゾールを好適に使用することができる。
　また、(b11)前記固相結合部位は、固相に結合されているタンパク質と結合し得るタンパク質であればよく、特に限定されない。例えば、固相にストレプトアビジンが結合されている場合にはビオチンという組み合わせを挙げることができる。また、(b12)前記切断部位は、特定の酵素で部位特異的に切断できる塩基で構成されていることが好ましく、例えば、RNasT1を用いる場合にはリボＧが、また、エンドヌクレアーゼVを用いる場合にはイノシンといった組み合わせを例示することができる。前記主鎖(b1)は、後述する側鎖(b2)を結合する領域及び逆転写を行うための領域をさらに含んでいる（図5参照）。
　前記側鎖(b2)は、ペプチド結合部位(b21)と、検出用蛍光分子(b22)と、タグDNA結合配列(b23)とを備えており、その５’末端で前記主鎖に結合している。前記タグDNA結合配列(b23)は、前記二重鎖形成部位と二重鎖を形成し、その後、所定の波長を有する紫外線を照射することにより、上記標的モジュールに含まれる上記光架橋塩基で上記標的モジュールと不可逆的に共有結合される。前記タグDNA結合配列としては、上記二重鎖結合部位の一部と相補的な配列を有していればよく、特に限定されない。
　しかしながら、上記二重鎖結合部位を構成するヌクレオチド配列が上記配列番号Aである場合には、下記のようなヌクレオチド配列を例として挙げることができる。上述したタグDNA配列は、上記二重鎖結合部位を構成するヌクレオチド配列と、完全に相補的でなくてもよい。最終的に得られるアプタマーの数および特異性を適切に制御するために、上記タグDNA結合配列と上記二重鎖結合部位との間では、５～８マーの二重鎖が形成されることが好ましい。形成される二重鎖が４マー以下では二重鎖の安定性が低いため光架橋が効率的に起こらず、９マー以上ではリガンドの親和性に依存しない非特異的な光架橋反応が起こるからである。
［配列番号B］
　CGCGTGC
［配列番号C］
　ACGCGTGCA
　本発明のペプチドアプタマー探索用リンカーモジュール（以下、「リンカーモジュール」ということがある。）は、上述した主鎖(b1)と側鎖(b2)とを有している。なお、上記の説明では、側鎖にタグDNA結合配列が配置された場合を例示挙げて説明したが、上記タグDNA結合配列は前記主鎖中に配置されていてもよい。上記タグDNA結合配列の長さは、上記二重鎖形成部位との間で５～８マーの二重鎖を形成することができるものであればよく、特に限定されない。５～８マーの二重鎖が形成されると、最終的に得られるアプタマーの数および特異性を適切に制御することができる点で好ましい。
　上記のリンカーモジュールは、上記主鎖(b1)と上記側鎖(b2)とを別個に合成し、上記側鎖(b2)を上記主鎖(b1)の側鎖結合部位に常法で結合させることによって、作製することができる。例えば、上記主鎖(b1)として下記表１に示すビオチンフラグメント（配列表の配列番号1）を作製し、上記側鎖(b2)として同表中のピューロマイシンフラグメント（配列表の配列番号2）を作成して使用することができる。
（３）ペプチドアプタマーの探索方法
　本発明はまた、下記の工程を備える新規ペプチドアプタマーの探索方法である。この探索方法では、上述したリンカーモジュールを用いたcDNAディスプレイ法を用いて試験管内淘汰を行う。ここで、下記の工程１で使用する前記標的モジュール及び前記リンカーモジュールの構造は、それぞれ上述した通りであり、これらを作製して使用する。
（３－１）cDNAディスプレイ法を用いた試験管内淘汰法
　まず、一般的なcDNAディスプレイ法について図２を参照しつつ説明する。この試験管内淘汰法では、所望のDNAライブラリを転写してmRNAを調製し、このmRNAをリンカーと連結させて、mRNA-リンカー連結体を形成させる。ここで、上記リンカーは、ピューロマイシンで構成されたペプチド結合部位および蛍光標識を備える側鎖と、ビオチンで構成された固相結合部位と、mRNA連結部位と、リボＧで構成された固相切断部位と、逆転写開始領域とを備える主鎖とで構成されている。
　次いで、無細胞翻訳系を用いてこの連結体からペプチドを形成させる。形成されたペプチドはペプチド結合部位を構成するピューロマイシン上にディスプレイされ、mRNA-リンカー-ペプチド連結体（以下、「mRNAディスプレイ分子」又は「インビトロウイルス」ということがある。また、上記インビトロウイルスは、「IVV」と省略することがある。）を生成させる。
　次いで、上記IVVを固相結合部位で固相と結合させる。その後、displayされているペプチドを逆転写してmRNAと相補的なcDNAを生成させ、次いで固相切断部位で固相から切り離し、cDNAディスプレイ分子を得る。得られたcDNA分子をC末端につけたタグを用いて精製し、標的分子に対するアフィニティセレクション（親和性による淘汰）を行う。このときに、淘汰に使用された標的分子と相互作用しないペプチドが除去される。標的分子と特異的に結合したペプチドを所望の溶出液を用いて溶出させ、PCRで増幅させることにより、上記特異的に結合したペプチドのDNAライブラリを得ることができる。
　以下に、cDNAディスプレイ法を用いた一般的なセレクションサイクルについて詳細に説明する。ここでは例として、抗FLAG抗体に結合するペプチドの取得方法について述べる。
（３－１－１）mRNAの調製
　所望の配列を有するライブラリDNAとFLAG配列とをコードするDNAとを使用する場合を例に挙げて説明する。例えば、25,000～100,000：１のモル比で上記のDNAを混合してDNA混合物を調製し、ここから250～1,000ngを取り、RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7等のキットを使用して、10～20μLのスケールで転写を行う。
　上記のDNA混合物を、例えば、約37℃で３～５時間インキュベートした後、DNaseを所望の量で加える。例えば、上記のDNA混合物を約37℃で約４時間インキュベートし、上記のキット付属のDNase (例えば、RQ1 Dnase、プロメガ社製)を約0.5μL加え、さらに約37℃で約10分間インキュベートしてmRNAを得る。得られたmRNAは、例えば、After Tri-Reagent RNA Clean-Up Kit（Favogen Biotech Corp.製）を使用して精製することができる。
（３－１－２）光架橋
　次いで、上記のようにして得られたmRNAと上記リンカーとを、長波長のUV（例えば、約350～約370nm）を0.5～５分間照射して連結させる。得られたリンカー-mRNA連結体を、上記と同様に所望のスケールで、無細胞翻訳する。例えば、ウサギ網内赤血球ライセート等の無細胞翻訳系を使用して、10～20 pmolの上記mRNA－リンカー連結体を100～150μLのスケールで、約30℃で約15分間翻訳する。その後、MgCl2及びKClを、例えば、それぞれ約70～80mM及び約850～950mMとなるように加えて、約37℃で約１時間インキュベートし、mRNA-ペプチド連結体を含む翻訳反応液を得る。この翻訳反応液は、mRNA-リンカーにペプチドがさらに連結したIVVを含んでいる。
（３－１－３）cDNAディスプレイの調製
　上記のようにして得られた翻訳反応液に、約0.25～約0.75MのEDTA(pH 約7.8～約8.2)を、終濃度が約80～85mMとなるように加えて、室温で約3～7分間インキュベートする。引き続き、上ここに、例えば、SA用２x結合バッファー(約20mMのTris-HCl(pH 約7.5), 約2MのNaCl、約2mMのEDTA、約0.2％のTween-20を含む)を等量加え、SA用の１x結合バッファーで洗浄済みの磁性ビーズ、例えば、Dynabeads MyOne C1 ストレプトアビジン100～200μLと混合し、約20～30℃で約20～40分撹拌する。
　次いで、上記の磁性ビーズを、例えば、約200μLのSA用の１x結合バッファーで２～４回洗浄し、例えば、ReverTra Ase（登録商標）に付属のプロトコルに従って、約100μLの逆転写用反応液を投入し、約42℃で約15分間撹拌して逆転写を行い、mRNA/cDNA-ペプチド連結体（以下、「cDNAディスプレイ」ということがある。）を調製する。
（３－１－４）mRNA/cDNA-ペプチド連結体の精製
　次いで、例えば、約150μLの1xNEバッファー4で、Dynabeads MyOne C1 ストレプトアビジンを洗浄し、その後、約200ＵのRNaseT1を含む、約75μＬの１xNEバッファー4を加えて、約37℃で約１時間撹拌する。次いで、約75μＬの２ｘHis-tag洗浄バッファー(約１MのNaCl、約0.1％のTween-20を含む約40mMのリン酸ナトリウム(pH 約7.4))を加え、その後上清を回収する。
　次いで、例えば、回収した上清約150μLと、約20μLのHis Mag Sepharose Ni (GEヘルスケア社製、1xHis-tag洗浄バッファーにより洗浄済み)とを混合し、インテリミキサーRM-2M（（株）トーホー製）等のミキサーを用いて、室温で約１時間撹拌する。
　その後、約100μLの１xHis-tag洗浄バッファーで１～３回洗浄し、ここにEDTA濃度を高めた約30μＬのセレクションバッファー(約１MのNaCl、約10mMのイミダゾール、約5mMのEDTA及び約0.1％のTween-20を含む約50mMのTris-HClバッファー(pH 約7.4))を加え、上記のミキサーを用いて、室温で約10分間撹拌した後に上清を回収する。
　引き続き、例えば、約25～100μLの抗FLAG M2アフィニティゲル(約40～60％懸濁液)を、MicroSpin Empty Columns(GEヘルスケア社製)等の適当なカラムに充填し、約150～250μLのセレクションバッファーで２～４回洗浄する。その後、上記の上清から、約50～150μLをとってカラムにロードし、ローテーターを用いて室温で約１時間撹拌する。約150～250μLのセレクションバッファーで３～５回カラムを洗浄し、次いで約50～150ng/μLの3xFLAGペプチド(シグマアルドリッチジャパン合同会社製)を約50～150μL加え、上記のローテーターを用いて室温で約15分間撹拌することにより、抗FLAG M2アフィニティゲルに結合しているmRNA/cDNA-ペプチド連結体を競合溶出させることができる。
（３－１－５）PCR
　遠心操作によってカラム内の溶出液を回収し、エタノール沈殿を行なった後に、所望量のヌクレアーゼフリー水(Nuclease-free water)に溶解する。上記のエタノール沈殿産物を、約150～250μLのPCR反応液に加え、PCRを行なう。例えば、遠心操作によって回収したカラム内の溶出液を、Quick-Precip Plus Solution等を使用してエタノール沈殿させ、約15μLのNuclease-free waterに溶解する。上記のエタノール沈殿産物を、約150～250μLのPCR反応液（約0.2mMのdNTPs、約0.4μMのT7Ωnew、約４μMのcnvK用NewYtag、約0.02Ｕ/μLのPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼを含む1xPrimeSTARバッファー(Mg2+含有)に加え、以下のようにPCRを行なう。ここで使用するプライマーとしては、例えば、T7Ωnew及びcnvK用NewYtag（配列表の配列番号3及び4）を使用することができる。以下に、これらのプライマーの配列を示す。
[配列番号３]
5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA-3'
[配列番号４]
5'‐TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT‐3'
　次に、PCRは、例えば、(a1)98℃で１分、(b1)98℃で15秒、(c1)68℃で30秒、(d1)68℃で１分、上記(b1)及び(c1)を25サイクルとすることができる。得られたPCR産物を、SDSゲル電気泳動にかけ、フルコンストラクトDNAを切出し、常法に従って精製する。精製した上記フルコンストラクトDNAを、所望量のPCR反応液に加えて、所望量で分注し、PCRを再度行なうと、二本鎖DNAを得ることができる。
　より具体的には、上記のようにPCRを行なって得られたPCR産物を、例えば、8M尿素変性6％PAGEにて泳動し、フルコンストラクトDNA（260～300mer）を切出して、常法に従って精製する。精製した上記フルコンストラクトDNAを、約150～250μＬのPCR反応液（約0.2mMのdNTPs、約0.4μMのNewleft、約0.4μMのcnvK用NewYtag、及び約0.02Ｕ/μLのPrimeSTAR HS DNA polymeraseを含む1xPrimeSTARバッファー(Mg2+含有)）に加え、約25～75μLずつ分注して、約５サイクルのPCRを行うことにより、二本鎖DNAを得ることができる。ここで使用するプライマーとして例示した、Newleftの配列（配列表の配列番号５）を以下に示す。
[配列番号５]
　GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
　PCRは、例えば、(a2)98℃で１分、(b2)98℃で10秒、(c2)68℃で30秒、(d2)68℃で1分とし、ステップ(b2)及び(c2)を５サイクル行うようにすることができる。上記のようにPCRを行なった後のPCR反応液をまとめてカラム精製し、次のラウンドに使用する。
　上記の手順を、ライブラリDNAの転写からアフィニティセレクションまでを、所望のラウンド行い、標的結合ペプチド（この場合はFLAGペプチド）をコードするDNA配列とペプチドが一体となった複合体分子（ディスプレイ分子）を得ることができる。以上が本願発明で使用するcDNAディスプレイ法を用いたセレクションサイクルである。
（３－２）本発明の標的モジュールとリンカーモジュールとを用いたペプチドアプタマーの探索方法
　以上のようなcDNAディスプレイ法を改変したものが本発明のペプチドアプタマーの探索方法である。この探索方法では、上述のように作製した標的モジュール及びリンカーモジュールを使用し、下記の工程１～３の工程を有する方法によってペプチドアプタマーを探索する。
　上記工程１では、まず、上述したペプチドアプタマー探索用標的モジュールと、主鎖(b1)及び側鎖(b2)を有するペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールとを水性溶媒中で混合する。ここで使用するリンカーモジュールでは、ペプチド（タンパク質）がピューロマイシン上にディスプレイされた状態となっている。また、当該ペプチドをコードするmRNAまたはcDNAがリンカーモジュールの主鎖に結合した状態となっている。そして、ピューロマイシン上にディスプレイされたペプチドと上記標的モジュールとを相互作用させるために、所望の温度で所望の時間、インキュベーションを行う。例えば、約４℃で終夜インキュベートする。
　この工程で使用する上記水性溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液（以下、「PB」と略すことがある。）、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「PBS」と略すことがある。）等の緩衝液の他、精製水その他の緩衝作用のない水性溶媒を挙げることができる。酵素を用いてタンパク質（ペプチド）同士を結合させる場合には酵素の機能を発揮させるために緩衝液の使用が必須であるが、この探索方法では酵素を使用しない。このため、緩衝作用のない水性溶媒を使用することができ、これによって上記リンカーモジュールに結合しているmRNAの分解を防止することができるという利点がある。
　水性溶媒中で前記標的モジュールと前記リンカーモジュールとを上述した溶液中で混合したときに、前記リンカーモジュールにディスプレイされているペプチドが、前記標的モジュール中の標的分子と相互作用をする分子であれば、前記標的モジュールと前記リンカーモジュールとが、上記二重鎖形成部位と上記タグDNA結合部位とで二重鎖を形成する。
　上記標的モジュールのタンパク質と、上記ディスプレイされたペプチドとが相互作用する場合には、上記標的モジュールと上記リンカーモジュールとの間で二重鎖が形成される。具体的には、上記標的タンパク質に付加されているタグDNA中の二重鎖形成領域と、上記リンカーモジュールの主鎖又は側鎖に組み込まれているタグDNA結合領域との間で二重鎖が形成される。上述したように、これら2つの配列は、少なくとも互いに一部は相補的な配列を含むように構成されているからである。
　上記工程２では、以上のようにして二重鎖を形成した前記標的モジュールと前記リンカーモジュールとに光を照射して光架橋させ、複合モジュールを形成させる。具体的には、所望の長波長の紫外線を所望の時間照射して、上記リンカーモジュールと上記標的モジュールとを、不可逆的に共有結合させる。この光架橋に際しては、使用する紫外線の波長を約350nm～約400nmとし、照射時間を10～300秒間とすることが、上記リンカーに結合しているDNAによるチミンダイマーの形成を防止することができること、及び探索のスループットを上げることができるために好ましい。紫外線の波長を約360nmとし、照射時間を約100～140秒とすることが、さらに好ましい。
　次に、工程３で、前記複合モジュールを精製する。この精製は、例えば、4-8％のPAGE（100-200V、60-150分）にて光照射サンプルを泳動し、複合モジュールに相当する位置のバンドを切出して、常法に従ってDNA精製することで行える。精製したDNAは、例えば、上記（3-1-5）に記載したようにしてPCR増幅することができ、これによって、上記標的分子と相互作用するリガンドをコードするDNAライブラリを得ることができる。なお、PCR増幅の条件は、適宜設定することができる。
　次いで、得られたDNAライブラリを転写してmRNAを得る。このmRNAを用いて上述した一般的なcDNAディスプレイ法又は光架橋を活用した本発明の探索手法を所望のサイクル数繰り返すことにより、セレクション（淘汰）を行うことができ、所望のリガンドを得ることができる。以上のようにして、cDNAディスプレイ法を用いたセレクションにおいて、弱い相互作用を有するアプタマーを探索し、入手することが可能となる。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらはあくまでも本発明の一例を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
（実施例１）タグDNAの合成等
（１）試薬及び装置等
　一般的な試薬類は、和光純薬（株）が市販している最高級グレードのものを使用した。分子生物学実験用の試薬は、SIGMA社及び和光純薬（株）から購入して、さらに精製することなく使用した。オリゴDNAは、ユーロフィンゲノミクス社及び北海道システムサイエンス社に合成を依頼した。水は、MilliQ (ミリポア社)を使用した。
　PCRは、Biometra TRIO48 サーマルサイクラ―を使用し、特に断りがない限り、(a3)98℃で１分、(b3)98℃で10秒、(c3)55℃で5秒、(d3)72℃で1分/kb、(e3)72℃で1分、とし、ステップ(b3)から(d3)を25サイクル行う条件で行った。また、特に断りのない限り、PrimeSTAR HS DNA ポリメラーゼ (Takara社)を、製造元が推奨する条件でPCRに使用し、増幅されたDNAをFavorPrep PCR Clean-Up Mini Kit (Favogen)で精製した。プライマー及び合成オリゴは、下記表１に示したものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

注: 本明細書中、Fはフルオレセイン-dTを示し（配列表中ではMと表記）、PはピューロマイシンCPGを示す。スペーサー18はスペーサー・ホスホロアミダイト18（spacer phosphoramidite 18）を示し（配列表中ではNと表記）、Nは5’-ビオチン-TEGを、また、rGはグアニンリボヌクレオチドを示す（配列表中ではNと表記）。Kは3-シアノビニルカルバゾールを示し、SHはチオール末端を、また、T-NH2はアミノモディファイヤーC6 dT(amino-modifier C6 dT、配列表中ではNNと表記)をそれぞれ示す。
　特に断らない限り、DNA及びRNAのPAGE分析は、8 M 尿素を含むゲルを用いて、ランニングバッファーとして0.5× TBEを用いて、60℃にて行った。cDNAディスプレイ分子のSDS-PAGE分析は、8 Mの尿素を含むTris-HClゲルを用いて室温で行った。また、ゲル電気泳動像は、Typhoon FLA9500 イメージャー(GEヘルスケア社)で撮像した。
（２）タグDNAとタンパク質との結合
　Tag DNAの合成は、北海道システムサイエンス社に委託した。5’末端にチオール基を有する上記の合成されたTag DNA（図8(b)、5 nmol、納品時はチオール基が保護されている）を、0.1 MのDTTを用いて、100μLの0.4 Mリン酸ナトリウムバッファー（pH 9.0）中にて、室温で1時間還元した。常法に従ってDTTを除去し、NAP5マイクロ遠心カラム(GEヘルスケア社製)を用いて、30mMのNaClを含む20mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.2）にバッファー交換を行った。
　EMCS (終濃度2 mM, 同仁化学社製)を上記のようにバッファー交換をして得られた溶液に加えて混合液とし、この混合液を室温で１時間インキュベートし、DNAを修飾した。上記修飾されたDNAを、FavorPrepカラムを用いて、製造元から提供された指示書に従って精製し、水で溶出した。その後、標的タンパク質（ストレプトアビジン又はIgG、いずれも濃度は約1 mg/mL)及び上記の修飾されたタグDNAを化学量論的に等モルとなるようにPBS中で混合し、4℃で終夜インキュベートした。
　4℃での終夜インキュベート後、形成された複合体をアミコンウルトラ(0.5 mL, MWCO: 50 kDa, Merck)を用いて精製し、TAMRA（5(6)-カルボキシテトラメチルローダミン）による蛍光標識を利用してSDS-PAGEで確認を行なった。
（３）モデルリンカーモジュールとモデル標的モジュールとの光架橋
（３－１）PCリンカーの合成
　（３－１）モデルリンカーの合成
　モデルリンカーモジュールの一例として、図8(b)に示す配列を有する、3種類のビオチニル化リンカーモジュールを調製し使用した。上記リンカーモジュールには、タグDNA結合配列の長さが5bpのリンカーモジュール（以下、「リンカーA」ということがある。）、7bpのリンカーモジュール（以下、「リンカーB」ということがある。）、9bpのリンカーモジュール（以下、「リンカーC」ということがある。）（図8(b)参照）が組み込まれている。これらの合成は北海道システムサイエンスに委託した。
（３－２）PCリンカーの合成
　セレクション用のリンカーモジュールとして、7bpの二重鎖形成領域を持つリンカーモジュールを合成した。表１に示す２種類の修飾オリゴヌクレオチド（ビオチンフラグメント（配列表の配列番号1）及びピューロマイシンフラグメント（配列表の配列番号2)）を、EMCSと結合させ、リンカーモジュール（以下、「PCリンカー」ということがある。）を作製した。まず、100μLの100μM ピューロマイシンフラグメントに15μLの1 M DTT及び85μLの1 M Na2HPO4（pH 9.0）を加えて1時間振とうし、チオール基の保護基を還元し脱保護した。
　その後、NAP5 columnを用いて、20 mM NaH2PO4と30 mM NaClとを混合した溶液で精製し、黄色蛍光部分を分取した。次に、5μLの1 mM ビオチンフラグメント、10μLの100 mM EMCS、及び85μLの0.2 M リン酸ナトリウムバッファーを混合し、37℃で30分間インキュベートし、Precip plusを用いてエタノール沈殿により精製した。引き続き、精製した2種類のフラグメントを全量混合し、4℃で一晩インキュベートした。その後、10μLの1 M DTTを加えて室温で30分振とうし、PAGEで確認後、切り出し精製した。具体的には、10%アクリルアミドゲルを用いて200 Vで30分間泳動した。対照として、各フラグメントも一緒に泳動した。泳動終了後、SYBR（登録商標）Goldで染色して分析した。結果を図6に示す。ビオチンフラグメントからのシグナルが非常に強く、この像からの定量はできなかった。
　形成されたPCリンカーは、図7の右端のレーンの四角で囲った部分のゲルを切り出した。この切り出したゲルをBioMasher II (Nippi社製)でマッシュし、ここにTEバッファーを加えて、終夜ゲルからのDNA抽出を行った。抽出後に残ったポリアクリルアミドはSpin-X microcentrifuge column (Costar社製)で除去した。その後、Quick-Precip Plus Solution (Edge Bio社製)を用いてDNAをエタノール沈殿させ、水に溶解させてリンカーモジュールとして使用するPCリンカーを得た。
（３－３）標的モジュールの作製
　図８(b)に示す配列のタグDNAの合成は、北海道システムサイエンスに依頼した。5’-チオール基を有する5nmolのタグDNA（納品時はチオール基が保護されている）を、0.1MのDTTを含む100μLの0.4Mリン酸ナトリウムバッファー（pH 9.0）中にて、室温で1時間還元した。その後、NAP5遠心カラム（GEヘルスケア社）を用いて、DTTを除くと同時にバッファーを30mMのNaClを含む20mMリン酸バッファー（pH 7.2）に交換した。バッファー交換して得られた溶液に、終濃度2mMのEMCS（同人化学）を加え、この混合液を室温にて1時間インキュベートした。
　EMCSで修飾されたタグDNA（以下、「修飾タグDNA」ということがある。）を、サンプルに対して4倍量の飽和グアニジン塩酸塩水溶液と6倍量のイソプロパノールで希釈後、FavorPrepカラムに加えて10,000ｘgで1分間遠心した。その後、70％エタノールを用いてカラムを洗浄し、水で溶出させた。
　その後、約1mg/mLのSA又はIgG（標的タンパク質）と上記の修飾タグDNAとを化学量論的に等モルになるようにPBS中で混合し、４℃にて終夜インキュベートした。インキュベート終了後、アミコンウルトラ（0.5 mL、NWCO：50kDa、メルク社）を用いて、形成された複合体を精製した。標的モジュールの形成は、6％スタッキングゲル及び15％分離ゲルを用いて、20mA、2時間のゲル電気泳動後、TAMRAの蛍光で確認した。以上のようにして、タグDNAで標識されたSA又はIgG（以下、「標識SA」のようにいうことがある。）が得られた。
（３－４）モデルリンカーモジュールと標的モジュールとの光架橋
　上記（３－１）及び（３－３）で作製したビオチニル化リンカーとタグDNA標識SAとの相互作用を、以下のようにして検討した。
　タグDNA標識SA（終濃度１μM）とビオチニル化リンカー（終濃度１μM）とを、PBS中にて、37℃で30分間インキュベートした。ビオチン（＋）試料については、上記ビオチニル化リンカーに加える前に、ストレプトアビジンを１mMのビオチンと30分間、37℃でプレインキュベートして調製した。
　以上のようにして調製した試料を10μL取り、CL-1000 UV Crosslinker (UVP, Upland, USA)を用いて、120秒間、365nmの紫外線を照射して光架橋させた。その後、光架橋させたサンプルを20 mAで120分間、6%スタッキングゲル/15%分離ゲルを用いたゲル電気泳動に供した。このゲル電気泳動終了後、FITCフィルターセットを用いて、ゲル泳動像を撮像した。上記リンカーと光架橋されなかったSA分子も、TAMRA蛍光の部分的な漏れ（the partial leakage）のために、このフィルター条件下では弱く可視化された。
　マーカーとして、Precision plus dual color standard protein marker (Bio-Rad) を使用した。7マーのタグ結合配列を含むリンカーBの架橋の結果を図８(c)に示す。標識SAとリンカーBの分子量の和に相当する約30kDaのバンドが形成されており、光架橋によって標的モジュールとリンカーモジュールとの複合体が形成されていることが示された。またタグ結合配列を５マーや９マーにした場合でも複合体形成が確認された（図８(d)）が、５マーの場合は効率が悪かった。
　次いで、遊離ビオチンによって光架橋が阻害されるか否かを検討した。照射条件及びゲル電気泳動の条件は上記と同様とした。5マー及び7マーのタグDNA結合配列を有するリンカーA及びBで形成された二重鎖では遊離ビオチンの存在によって架橋形成が阻害された（図8(d)）。リンカーAとリンカーBとの阻害の程度を比較すると、リンカーBの方が阻害の程度が低くなっていた。対照的に、リンカーC（9マーのタグ結合配列を有する）では遊離ビオチンの存在による架橋の阻害は見られなかった。このことから、標的モジュールとリンカーモジュールとの相互作用は、二重鎖の形成には依存せず、ハイブリダイゼーションの熱力学に影響されるのではないかと思われた。
（４）PCリンカーを用いたcDNAディスプレイの形成
　鋳型DNA(下記表２の配列6および12)を、Terai, T.; Anzai, H.; Nemoto, N. Selection of Peptides that Associate with Dye-Conjugated Solid Surfaces in a pH-Dependent Manner Using cDNA Display. ACS Omega 2019, 4, 7378-7384. DOI: 10.1021/acsomega.9b00631に従ってcDNAディスプレイに変換した。
　具体的には、まず、T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System (Promega)を用いてDNA（100 ng）をマイクロチューブに入れ、37℃で3時間インキュベートしmRNAを得た。その後、1μLのDNaseを加え、37℃で15分間インキュベートした。mRNAをRNeasy MiniElute Cleanup Kit (Qiagen)により精製し、Nanodropを用いて濃度を測定した。
　次に、NaCl（終濃度0.2 M）、Tris-HCl（pH7.5、終濃度0.05 M）、PC-リンカー（20 pmol）、mRNA（20 pmol）を加え、これを20μLスケールでアニーリングした。このアニーリングは、90℃から、0.1℃/secで70℃まで降温し、0.02℃/secで25℃まで降温し、その後2℃/secで10℃に降温するというプロセスで行った。このアニーリング後、CL-1000 Ultraviolet Crosslinkerを用いて、波長365 nmのUVを405 mJ照射し上記リンカーとmRNAとを光架橋させた（ここで得られた生成物をｍRNA-リンカーと呼ぶ）。 
　次に、35μLのウサギ網状赤血球ライセート、2μLのアミノ酸混合物（1 mM）、mRNA-リンカー（6 pmol）、1μLのRnase Inhibitorをマイクロチューブに加え、このチューブを50μLスケールに超純水（UPDW）でメスアップし、30℃で20分間インキュベートした。その後、KCl（終濃度900 mM）及びMgCl2（終濃度75 mM）を添加し、37℃で60分間インキュベートしてペプチドの翻訳を行った。その後、EDTA（pH 8.0、終濃度70 mM）を加えて37℃で5分間インキュベートし、98μLの2×結合バッファーを加え、mRNAディスプレイを含むサンプルを得た。
　Dynabeads MyOne C1 Streptavidinを1×結合バッファー(1 mM EDTA、1 M NaCl、0.1% Tween 20を含む、10 mM Tris-HCl（pH 8.0）)で洗浄した。上記のように洗浄したDynabeads MyOne C1 Streptavidinを60μL取り、ここに上記のmRNAディスプレイサンプルを全量加え、ローテーターを用いて25℃で60分間撹拌した。100μLの1×結合バッファーで3回洗浄し、100μLの逆転写で使用する1×ReverTra Aceバッファーで洗浄した。洗浄後、5×ReverTra Aceバッファー、2.5 mM dNTPs混合物（終濃度1mM）、ReverTra Ace（終濃度2U/μL）を混合して逆転写溶液を調製し、42℃で30分間ローテートすることで逆転写反応を行った。
　逆転写後、100μLのHis tag結合バッファー( 0.5 M NaCl, 5 mMイミダゾールを含む20 mM リン酸ナトリウムバッファー、pH 7.4)で洗浄し、上記His tag結合バッファーで40μLにメスアップしたRnaseT1（終濃度5U/μL）を加え、37℃にて15分間ローテーターで撹拌してcDNAディスプレイを含むサンプルを得た。なおSBPをディスプレイした分子を作製する場合には、RNase T1処理の際のバッファーに、ビオチンを飽和濃度で添加した。これは、SBPがストレプトアビジンビーズと再結合するのを防ぐためである。
　20μLのHis MagセファロースNiを、100μLのHis tag結合バッファーで洗浄し、上記のcDNAディスプレイサンプルを全量加え、25℃にて2時間ローテーターで撹拌した。反応後、100μLのHis tag洗浄バッファーで3回洗浄し、40μLのHis tag溶出バッファーを加えた。その後、このマイクロチューブを、マイクロチューブミキサーを用いて室温で20分間撹拌し、cDNAディスプレイを回収した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

　鋳型DNAは必要に応じて、プライマーとしてNewleft及びcnvK-NewYtag（表１参照）を使用してPCRを行なった。cDNA displayが正しく出来ていることを確認するために、mRNA-リンカーのアリコート、インプット(= mRNAディスプレイ)及びSA-ビーズ固定化後の上清、RNase T1処理後の溶出液(= 未精製のcDNAディスプレイ)、Niビーズ固定化後の上清、及び最終的に回収したHisタグ溶出液(= 精製cDNAディスプレイ)を取り、8M尿素を含むSDS-PAGE (4%スタッキングゲル-6%分離ゲル、20 mA、 120分)で分析した。結果を図９に示す。図９に示すように、mRNA、mRNAディスプレイ（mRNA-リンカー-ペプチドの連結体）、cDNAディスプレイが形成されていることが確認された。
　この泳動で使用した量は、作製の各工程における全てのサンプルの収率が100％と仮定したとき0.5 pmolの分子に相当する。FITCフィルターセットを用いて泳動後のゲルを蛍光で可視化し、バンドの蛍光強度からcDNAディスプレイ形成効率を求めた。最後の3つのサンプルについては、RNase H (Takara、 10 U)及び10× NE バッファー 2 (1/10量、NEB)を加えて混合液とし、この混合液をゲルにロードする前に37℃にて30分間インキュベートし、RNA/cDNA二重鎖を消化した。
（５）cDNAディスプレイ分子及び標的タンパク質の光架橋（図10）
　タグDNAで修飾したSA (終濃度 4 μM)及びSBPをコードしているcDNAディスプレイ分子（約0.23 pmol)を、10μLのPBS中にて25℃で30分間インキュベートした。ビオチン(前処理)サンプルについては、500μM (終濃度)のビオチンをSAと25℃で30分間、cDNAディスプレイ分子に加える前にインキュベートした。その後、UV照射(CL-1000 UV Crosslinker、波長360nm)を120秒間行った。ビオチン(後処理)サンプルについては、500μM(終濃度)のビオチンを光照射後の試料に加え、その後、25℃で30分間インキュベートした。すべてのサンプルを4℃の非変性PAGE (8%ゲル、200 V、150分間)で分析した。
　次いで、上記と同様の条件下でIgG-BDA 相互作用について検討した。この場合、ビオチンの代わりに、遊離IgG (40 μM)を競合タンパク質として加えた。ゲル電気泳動の条件は、4℃の非変性PAGE （4%ゲル、200 V、60分間）とした。図10に、cDNAディスプレイ分子と標的タンパク質との間の親和性を検討したゲル電気泳動の結果を示す。図10(a)は、ストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)をコードする、タグDNA標識cDNAディスプレイの光架橋の結果である。サンプルは、遊離ビオチンを加えずにUV照射を行った場合と（レーン２）、遊離ビオチンを加えてインキュベートした後にUV照射を行った場合（レーン４）、UV照射後にビオチンを加えてインキュベートした場合（レーン６）について、それぞれUV照射を行わない対照を置いて行った結果である。
　泳動後、ゲルをcDNA分子に含まれているFAMで可視化した。*は、キャラクタライズされていないサブバンドを示す。レーン１及び２の比較から、UV照射後、cDNAディスプレイと修飾SAとの複合体（共有結合体）ができてバンドがアップシフトしている様子が観察された。また、レーン2とレーン４との比較から、遊離ビオチンは標的モジュールとリンカーモジュールとの光架橋を大きく阻害する、すなわち光架橋による共有結合形成が標的タンパク質とディスプレイされたペプチドとの相互作用に依存することが示された（図10(a)）。さらにレーン６ではcDNA displayのみのバンドがあまり見られないことから、一旦共有結合が形成されると標的モジュールとリンカーモジュールとの相互作用はほぼ不可逆的となることが分かった。
　図10(b)に、Aタンパク質のBドメインをコードしているcDNAディスプレイとIgGとの架橋を検討した結果を示す。レーン3及び4は、遊離IgGを照射後に過剰に加えた試料の泳動結果である。図10(a)と同様にUV照射によってバンドがアップシフトしており、遊離IgGを後に加えても、光架橋の解離は見られなかった。
　以上から、本発明のリンカーモジュールと標的モジュールとの光架橋は、十分な実用性のあることが示された。
（実施例２）夾雑環境下におけるモデルセレクション
　夾雑環境下における実用性を、以下の実験系で確認した。この系では、標的タンパクと結合するペプチドが、正しく光架橋で結合されているかどうかを、以下のタンパク及びペプチドを、過剰量の夾雑タンパクの存在下で確認することとした。
　図８(b)に示すタグ配列を修飾したストレプトアビジン（以下、「SA」と略すことがある。）、ストレプトアビジン結合ペプチド（以下、「SBP」と略すことがある。）をディスプレイしたcDNAディスプレイ分子、BDAをディスプレイしたcDNAディスプレイ分子を用いた、また、夾雑タンパクとして牛血清アルブミン（BSA）を用いた。
（１）SBPのモデルセレクション
　DNAタグで修飾したSA（終濃度4μM)、SBPをコードしているcDNAディスプレイ(約0.23 pmol)、BDAをコードしているcDNAディスプレイ(約0.25 pmol)及び夾雑分子のモデルとしてBSA(終濃度1%, w/v)を、10μLのPBS中にて25℃で30分間インキュベートした。その後、UV照射(CL-1000 UV Crosslinker)を120秒間行った。サンプルの分析は、4℃にてPAGE(4%ゲル、200 V、60分)で行った。対照として、1以上の化合物を含まないサンプルを調製し、分析した。図11に、下記の試料のゲル電気泳動結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

　上記表３中、「SBP-cDNA」は、SBP提示cDNAディスプレイ分子を表し、「BDA-cDNA」はBDA提示cDNAディスプレイを表す。
　図11及び上記表３に示すように、夾雑物及びタグDNA付SAを含まない試料では、SBP-cDNA及びBDA-cDNAのバンドが、それぞれ異なる位置に検出された（図11のレーン1及び2）。これらの試料にタグDNA付SAを試料に加えると、図11のレーン3に示されるようにSBP-cDNAのバンドがアップシフトし、SBP-cDNAはタグDNA付SAと結合すること（図11のレーン3）が確認された。
　これに対し、BDA-cDNAのバンドの位置はタグDNA付SA非存在下のときと変わらず、BDA-cDNAはタグDNA付SAと結合ないことが確認された（図11のレーン4）。図11のレーン5に示されるように、2つのディスプレイ分子が混在しているときは、SBPのバンドのみがアップシフトしたが、BDAのバンドはそのまま残っていた。アップシフトしたSBP-cDNAのバンドは、SBP-cDNAとタグDNA付SAとの共有結合体を示すため、夾雑物の存在は、SBP-cDNAとタグDNA付SAとの結合に影響しないことが確認された。
（２）上記結合体の分析
　その後、光架橋産物に対応するバンド、及び光架橋していないcDNAディスプレイ分子（レーン5）のバンドを切り出し、Biomasher IIでマッシュし、それらに含まれるDNAをTEバッファーと終夜インキュベートして抽出した。Spin-X microcentrifuge column (Costar)でポリアクリルアミドを除き、その後、quick Precip-plus solution (Edge Bio)を用いてDNAをエタノール沈殿させ、水に溶解させた。次いで、得られたDNAをT7Ωnew及びcnvK-NewYtagをプライマー（表１参照）として使用して PCRで増幅させ、増幅産物をPAGE (4%ゲル、200 V、20分)で分析した。
　ゲルはSYBR Goldで染色した。結果を図12に示す。図12に示すように、DNAがコードするストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)が選択的に回収され、その量は非結合タンパク質（BDA）よりも遥かに多いことが確認された。すなわち、標的分子と正しく結合するペプチドアプタマーを、本発明技術により選択的に回収することができることが実証された。
　以上より、1)溶液ベースで、2)分子夾雑系と適合性のある、そして3)洗浄条件を技術的に変更する自由度が大きい、という、標的分子とcDNAディスプレイのリンカー部との間で光架橋（共有結合）が形成されていることによるメリットが得られる新規なペプチドアプタマー探索用リンカー、そのリンカーを用いた前記ペプチドアプタマーの探索方法を本発明として確立した。
　本発明には、さらに、実験者がセレクションシステムを使用する際に、精確かつ均一に標的分子の濃度を制御することができるという大きなメリットがある、
　本発明は、医学、診断薬、生物分析等の分野において有用である。
配列番号１：ビオチンフラグメントの塩基配列
配列番号２：ピューロマイシンフラグメントの塩基配列
配列番号３：T7Ω newの塩基配列
配列番号４：プライマー（cnvK-NewYtag）の塩基配列
配列番号５：プライマー（Newleft）の塩基配列
配列番号６：SBP DNAコンストラクトの塩基配列
配列番号７：T7の塩基配列
配列番号８：Ω配列の塩基配列
配列番号９：SBPの塩基配列
配列番号１０：GGGSの塩基配列
配列番号１１：His6 Tagの塩基配列
配列番号１２：BDAのDNAコンストラクトの塩基配列

Claims (16)

  1. 　標的分子と、
    　少なくとも１つの光架橋塩基と、標的分子と相互作用するリガンドと結合したリンカーと５～８マーの二重鎖を形成する二重鎖形成部位とを含む、4 kDa以上15kDa以下のタグＤＮＡと、
    を備える、ペプチドアプタマー探索用標的モジュール。
  2. 　前記二重鎖形成部位は前記光架橋塩基を含むことを特徴とする、請求項１に記載のペプチドアプタマー探索用標的モジュール。
  3. 　前記二重鎖形成部位は前記リンカー内のタグＤＮＡ結合配列と二重鎖を形成し、光を照射された前記光架橋塩基が不可逆的な共有結合を形成することを特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチドアプタマー探索用標的モジュール。
  4. 　前記二重鎖形成部位は、下記のヌクレオチド配列で構成されることを特徴とする、請求項１に記載のペプチドアプタマー探索用標的モジュール。
    ［配列番号A］
    　TGCAKGCGT
    　上記ヌクレオチド配列中、Kは光架橋塩基を表す。
  5. 　前記光架橋塩基は、シアノビニルカルバゾール及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることを特徴とする、請求項４に記載のペプチドアプタマー探索用標的モジュール。
  6. 　主鎖と側鎖とを有し、前記主鎖又は前記側鎖の少なくとも一方に、前記標的モジュールの前記二重鎖形成部位の少なくとも一部と５～８マーの二重鎖を形成するタグＤＮＡ結合配列を含む、ペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールであって：
    　前記主鎖は、
    　　(a1)前記リンカーモジュールを固相へ固定するための固相結合部位と、固相から前記リンカーモジュールを切り離すための切断部位と；
    　　(a2)前記主鎖にmRNAを光架橋によって結合させるための光架橋塩基と；を含み、
    　前記側鎖は、
    　　(b1)前記主鎖に結合されたmRNAに対応して合成されたペプチドを結合するためのペプチド結合部位と；
    　　(b2)検出用蛍光分子と；
    を備える、ペプチドアプタマー探索用リンカーモジュール。
  7. 　前記タグＤＮＡ結合配列は、下記のヌクレオチド配列を有するものである、ことを特徴とする請求項６に記載のペプチドアプタマー探索用リンカーモジュール。
    ［配列番号B］
    　CGCGTGC 
    ［配列番号C］
    　ACGCGTGCA
  8. 　前記切断部位は、リボＧ又はイノシンであることを特徴とする、請求項６に記載のペプチドアプタマー探索用リンカーモジュール。
  9. 　前記光架橋塩基は、シアノビニルカルバゾール及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることを特徴とする、請求項６に記載のペプチドアプタマー探索用リンカーモジュール。
  10. 　前記ペプチド結合部位は、ピューロマイシン及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることを特徴とする、請求項６に記載のペプチドアプタマー探索用リンカーモジュール。
  11. （１）ペプチドアプタマー探索用標的モジュールと、前記ペプチド結合部位にペプチドが結合した状態の主鎖及び側鎖を有するペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールとを相互作用させ、上記標的モジュールの二重鎖形成部位に二重鎖を形成させる相互作用工程と；
    （２）前記二重鎖を形成している前記標的モジュールと前記リンカーモジュールとに光を照射して光架橋させ、複合モジュールを形成する複合モジュール形成工程と；
    （３）前記複合モジュールを精製する精製工程と、を備え；
    　前記ペプチドアプタマー探索用標的モジュールは、
    　　標的分子と；
    　　少なくとも１つの光架橋塩基と、前記標的分子と相互作用するリガンドと結合したリンカーの主鎖又は側鎖と５～８マーの二重結合を形成する二重鎖形成部位とを含む、4kDa以上15kDa以下の１本鎖のタグＤＮＡと；を備え、
    　前記ペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールは、主鎖と側鎖とを有し、前記主鎖又は前記側鎖の少なくとも一方に、前記標的モジュールの前記二重鎖形成部位の少なくとも一部と５～８マーの二重鎖を形成するタグＤＮＡ結合配列を含み、
    　前記主鎖は、
    　　(a1)前記リンカーモジュールを固相へ固定するための固相結合部位と、固相から前記リンカーモジュールを切り離すための切断部位と；
    　　(a2)前記主鎖にmRNAを光架橋によって結合させるための光架橋塩基と；を含み、
    　前記側鎖は、
    　　(b1)前記主鎖に結合されたmRNAに対応して合成されたペプチドを結合するためのペプチド結合部位と；
    　　(b2)検出用蛍光分子と；
    を備える、新規ペプチドアプタマーの探索方法。
  12. 　前記二重鎖形成部位は、下記のヌクレオチド配列１で構成される、ことを特徴とする、請求項１１に記載の新規ペプチドアプタマーの探索方法。
    ［配列番号A］
    　TGCAKGCGT
    　前記ヌクレオチド配列中、Kは光架橋塩基を表す。
  13. 　前記光架橋塩基は、前記ペプチドアプタマー探索用標的モジュールの前記二重鎖形成部位内、及び前記ペプチドアプタマー探索用リンカーモジュールの前記主鎖中にそれぞれ位置することを特徴とする、請求項１２に記載の新規ペプチドアプタマーの探索方法。
  14. 　前記光架橋塩基は、シアノビニルカルバゾール及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることを特徴とする、請求項１３に記載の新規ペプチドアプタマーの探索方法。
  15. 　前記リンカーモジュール中のタグＤＮＡ結合配列は、下記のヌクレオチド配列２又は３で表される、ことを特徴とする請求項１０に記載の新規ペプチドアプタマーの探索方法。
    ［配列番号B］
    　CGCGTGC
    ［配列番号C］
    　ACGCGTGCA
  16. 　前記ペプチド結合部位は、ピューロマイシン及びその誘導体からなる群から選ばれるいずれかの化合物であることを特徴とする、請求項１１に記載の新規ペプチドアプタマーの探索方法。
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