KR101789216B1 - Ｄｎａ―코딩된 라이브러리의 생성 및 스크리닝 방법 - Google Patents

Ｄｎａ―코딩된 라이브러리의 생성 및 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 표적에 결합하는 하나 이상의 화합물을 확인하는 다수의 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 화합물 라이브러리의 합성 단계를 포함하며, 여기서, 화합물은 하나 이상의 다양성 위치를 갖는 관능성 모이어티를 포함한다. 화합물의 관능성 모이어티는 관능성 모이어티의 구조를 확인하는 개시 올리고뉴클레오티드에 작동적으로 연결된다.

Description

ＤＮＡ―코딩된 라이브러리의 생성 및 스크리닝 방법{METHODS OF CREATING AND SCREENING DNA-ENCODED LIBRARIES}
약물 발견 비용의 급증에 의해, 가능한 한 저렴하게 더욱 큰 화학 공간을 스크리닝하여 효력이 더욱 크고 독성이 거의 없거나 전혀 없는 분자를 발견하는 새로운 방법에 대한 연구가 계속 진행되었다. 1980년대의 조합 화학적 접근법은 원래 약물 발견 패러다임을 능가하는 방법인 것으로 알려졌지만, 불충분한 라이브러리 크기 및 부적당한 디콘볼루션 (deconvolution) 방법으로 인하여 대부분 실패하였다. 최근에, 소분자의 DNA-디스플레이 조합 라이브러리의 사용은 치료용 리드 화합물 (lead compound)의 스크리닝에 있어서 새로운 패러다임 변화를 생성하였다.
모건 (Morgan) 등 (본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2007/0224607호)은 약물 발견에서 DNA-디스플레이 조합 접근법의 사용에 있어서 하기 주요 도전 과제를 확인한다: (1)충분한 복잡성의 라이브러리의 합성 및 (2) 사용되는 스크린에서 활성을 갖는 분자의 확인. 게다가, 모건 등은 라이브러리의 복잡성 정도가 더욱 클수록, 즉, 라이브러리에 존재하는 독특한 구조의 수가 많을수록, 라이브러리가 관심있는 활성을 갖는 분자를 포함할 가능성이 더욱 커짐을 진술한다. 따라서, 라이브러리 합성에 이용되는 화학은 합리적인 시간틀 내에서 수많은 화합물을 생성할 수 있어야 한다. 이러한 접근법은 일반적으로 화학형이 다양하고 친화도가 높은 분자의 확인에 성공적이었다. 그러나, 막대한 복잡성의 라이브러리의 생성 및 기술된 규모의 서열결정 출력 데이터의 평가와 관련하여 다수의 쟁점이 표면화되었다. 예를 들어, 다수의 화학적 변환 (예를 들어, 일반적으로 3 또는 4개의 단계) 및 생물학적 변환 (예를 들어, DNA 태그의 효소적 라이게이션) 이후의 라이브러리의 정제는 번거로우며, 라이게이션 단계 동안의 미스태깅(mis-tagging) 또는 분자의 불완전한 합성으로 인하여 라이브러리 내에 상당한 양의 "노이즈"가 생성된다. 더욱이, 선택된 집단에서 정보를 얻기 위하여 필요한 서열결정의 양은 현저하여서, 일반적으로 "차세대" 서열결정 방법을 필요로 한다. 후자는 "차세대" 서열결정 출력 결과의 분석을 위한 생물정보 알고리즘과 함께, 라이브러리의 DNA 부분 내에 매립된 복잡한 유전자 태깅 방법이 노이즈를 면밀히 조사하고 라이브러리 중의 히트 (hit)를 확인하는 데 필요하다는 사실로 인한 것이다. 그 결과, 심지어 이들 방법을 이용해서도 여전히 서열결정은 주어진 스크린으로부터 (실제 히트 및 "노이즈" 둘 모두를 대표하는) 서열들의 다양성을 완전히 포획할만큼 충분히 진보되지 못하였다.
소분자의 조합 라이브러리의 DNA 디스플레이는 사용된 합성 단계 및 빌딩 블록 둘 모두를 코딩하는 DNA 태그의 효소적 부가와 커플링된, 라이브러리의 분할-풀링 (split-and-pool) 다단계 합성법에 의존한다. 몇몇 합성 단계 (예를 들어, 3 또는 4개의 단계)가 전형적으로 실시되고 코딩되며, 이들은 다양성 위치 (본원에서 A, B 및 C로 기술됨 (도 1)), 예컨대 빌딩 블록을 예를 들어 아민 또는 카르복실레이트 관능기를 화학적 스캐폴드에 커플링시킴으로써 형성되는 것을 포함하는데, 상기 화학적 스캐폴드는 부착된 빌딩 블록들을 규정된 배향으로 디스플레이한다. 조합 라이브러리에서 흔히 사용되는 스캐폴드 (S)의 일례로는 트리아진 모이어티가 있으며, 이는 그의 고리 구조 둘레의 3개의 위치에서 직교적으로 유도체화될 수 있다.
라이브러리 형성 과정은 시간이 걸릴 수 있으며, 생성물은 흔히 비효율적으로 정제되며, 그 결과는 DNA에 부착된 원하지 않는 및/또는 미공지된 분자를 생성하는 미공지 반응이 일어날 수도 있다는 것이다. 더욱이, 라이브러리의 불완전한 정제는 라이게이션 단계 동안 태그가 교차-오염될 수 있게 하며, 이는 미스-태깅으로 이어진다. 라이브러리로부터의 스크리닝 및 서열결정 히트에 있어서의 최종 결과는 의도되지 않은 분자 (예를 들어 미반응 생성물 또는 부산물) 또는 미스-태깅된 분자에 부착된 DNA의 내재적 "노이즈"로 인하여 대량 병렬 서열결정이 이용되어야 한다는 것이다. 따라서, 서열결정 효율이 손실된다.
일부 예에서, 소분자가 만들어지는 개시 올리고뉴클레오티드는 공유 결합에 의해 폐쇄된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 형태의, 폴리머라제 증폭 (예를 들어, PCR)을 위한 프라이머-결합 영역을 포함한다. 이러한 작제물은 이중가닥을 용융시키고 프라이머 올리고뉴클레오티드가 결합하여 중합을 개시하게 하는 것의 어려움 - 이는 반응이 비효율적이 되게 하여 수율을 10 내지 1000배만큼 또는 그보다 많이 감소시킴 - 에 기인하여 폴리머라제 반응을 수행함에 있어서 매우 문제시된다.
효력이 더욱 크고 독성이 거의 없거나 전혀 없는 소분자를 스크리닝 및 확인하는 더욱 계단식인 접근법에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 단순화된 DNA-코딩 라이브러리의 생성 및 스크리닝 방법을 특징으로 하며, 이는 더욱 적은 합성 단계 (예를 들어, 효소적 라이게이션이 없거나, 공유 결합에 의해 폐쇄된 이중 가닥 개시 올리고뉴클레오티드가 없음), 그리고 그에 따라 코딩 올리고머 (본원에서 "확인자 영역"으로 칭해짐)의 분석 동안의 실질적으로 덜한 "노이즈"에 기인한다. 따라서, 서열결정은 훨씬 더 효율적이게 되거나, 또는 대안적으로는 마이크로어레이 (microarray) 분석이 가능해지게 되어서, 코딩 영역의 증폭에 의해 도입될 수 있는 데이터의 해독이 틀렸음을 입증할 수 있는 내재적 바이어스 (bias)가 고려된다. 또한 본 발명자는 DNA-코딩된 라이브러리가 더욱 큰 소수성을 갖게 하고 라이브러리 합성의 후속 단계를 위한 유기 용매에 더욱 가용성으로 되게 하는 수성 조건에 단순히 한정되는 것이라기보다는 오히려 더욱 큰 다양성의 화학 반응을 생성하는 방법을 확인하였다. 이러한 방식으로, 화학 반응은 잠재적으로 더욱 높은 수율, 더욱 큰 다양성의 빌딩 블록, 및 개선된 충실도의 화학 반응에 의해 실시될 수 있다.
따라서, 본 발명은 개시 올리고뉴클레오티드 - 여기서, 개시 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 구조를 형성함 - 의 5' 말단에서 개시 올리고뉴클레오티드에 2관능성 링커의 제1 관능기를 결합시키고, 2관능성 링커의 제2 관능기를 화학 라이브러리의 구성요소에 결합시킴으로써 DNA-코딩 화학 라이브러리를 태깅하는 방법을 특징으로 한다. 개시 올리고뉴클레오티드는 제2 확인자 영역이 개시 올리고뉴클레오티드의 제1 확인자 영역에 혼성화되도록 제1 확인자 영역 및 제2 확인자 영역을 포함할 수 있다. 제2 확인자 영역은 형광 태그 (예를 들어, 형광단 또는 GFP) 또는 비오틴 표지체를 포함할 수 있다. 게다가, 제2 확인자 영역은 선별 단계 이후 분석 이전에는 증폭되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 제1 다양성 노드 (diversity node)를 생성하는 단계, (b) 별도의 베셀 (vessel)에서 제1 다양성 노드를 코딩하는 단계, (c) 제1 다양성 노드를 풀링하는 단계 및 (d) 풀링된 제1 다양성 노드를 별도의 베셀의 제2 세트로 분할하는 단계에 의해 DNA-코딩된 라이브러리를 생성하는 방법을 특징으로 하며, 여기서, 제1 다양성 노드는 제2 다양성 노드를 형성하도록 반응한다. 특정 실시양태에서, 제2 다양성 노드는 코딩 및 풀링되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 반-수성 또는 비-수성 (예를 들어, 유기) 화학 반응을 이용하여, 이전에 달성된 것보다 더 큰 수율, 빌딩 블록의 더 큰 다양성, 및 더 많은 DNA-태깅된 조합 라이브러리의 생성에 사용될 수 있는 더 많은 화학 반응으로 라이브러리를 생성하는 방법을 특징으로 한다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 고수율로 효율적으로 생성될 수 있고, 예를 들어 하나 또는 2개의 다양성 위치에 존재하는 바람직한 개개의 빌딩 블록 또는 빌딩 블록 조합을 확인하도록 스크리닝될 수 있고, 예를 들어 제2, 제3 및/또는 제4 다양성 위치에서 반복하여 다양화되어 개선된 특성을 갖는 분자를 생성할 수 있는, 예를 들어 화학적 스캐폴드 상의 하나 또는 2개의 다양성 위치를 포함하는 라이브러리 세트를 제공한다. 게다가, 본원에 개시된 방법은 요망되는 생물학적 특성을 갖는 선별된 화합물의 포괄적이고 광범위한 분석을 허용하며, 이는 다시 패밀리적인 구조적 관련성을 갖는 관련 화합물들의 확인을 허용한다 (예를 들어, 구조-활성 관련성).
"스캐폴드"는 특정하고 특수한 기하학적 형상의 다양성 노드(들)를 디스플레이하는 화학적 모이어티를 의미한다. 다양성 노드(들)는 전형적으로는 라이브러리 합성 동안 스캐폴드에 부착되지만, 몇몇 경우 하나의 다양성 노드는 라이브러리 합성 이전에 스캐폴드에 부착될 수 있다 (예를 들어, 확인자 영역의 부가). 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 이것이 라이브러리 합성 동안 직교적으로 탈보호되고 후속적으로 상이한 다양성 노드 (예를 들어 각각의 단계에서 확인자 태깅을 사용하여)와 반응할 수 있도록 유도체화된다.
"확인자 영역"은 라이브러리에 빌딩 블록이 부가되는 것을 코딩하는 라이브러리의 DNA 태그 부분을 의미한다.
"개시 올리고뉴클레오티드"는 라이브러리 합성을 위한 출발 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 이는 다양성 노드 또는 스캐폴드의 부가를 위한 공유 부착된 링커 및 관능성 모이어티를 또한 포함한다. 개시 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 개시 올리고뉴클레오티드는 천연 또는 개질 염기로 이루어질 수 있다.
"관능성 모이어티"는 임의의 소분자로부터 선택되거나 또는 예를 들어 수소 결합 공여체 및 수용체의 이용가능성, 용해도, 결합의 회전 자유도, 양전하, 음전하 등의 요망되는 특성을 기반으로 하여 디자인 및 생성될 수 있는 하나 이상의 빌딩 블록을 포함하는 화학적 모이어티를 의미한다. 관능성 모이어티는 이것이 헤드피스 (headpiece)와 반응하도록 화학적 개질과 양립가능하여야 한다. 특정 실시양태에서, 관능성 모이어티는 2관능성 또는 3관능성 (또는 그보다 큰 관능성) 실체 (entity)로서 추가로 반응할 수 있다. 관능성 모이어티는 임의의 다양성 노드 또는 위치에서 사용되는 빌딩 블록을 또한 포함할 수 있다. 빌딩 블록 및 코딩 DNA 태그의 예가 표 1 및 표 2에서 발견된다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2007/0224607호를 참조하라.
"빌딩 블록"은 다른 화학적 구조 단위에 연결되거나, 다른 그러한 단위에 연결될 수 있는 화학적 구조 단위를 의미한다. 관능성 모이어티가 중합체 또는 올리고머일 때, 빌딩 블록은 그 중합체 또는 올리고머의 단량체 단위이다. 빌딩 블록은 하나 이상의 추가의 구조체 (예를 들어, 주변 빌딩 블록)가 부착되거나 부착될 수 있는 스캐폴드 구조체 (예를 들어, 스캐폴드 빌딩 블록)를 또한 포함할 수 있다. 빌딩 블록은 상보적인 임의의 화학적 화합물일 수 있다 (즉, 빌딩 블록들은 함께 반응하여 2개 이상의 빌딩 블록을 포함하는 구조체를 형성할 수 있어야 한다). 전형적으로, 사용되는 빌딩 블록들 중 일부는 단지 하나의 반응기 각각을 갖지만, 사용되는 빌딩 블록 모두는 2개 이상의 반응기를 갖는다. 2개의 상이한 빌딩 블록 상의 반응기는 상보적이어야 하며, 즉, 함께 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있어야 한다.
"링커"는 라이브러리의 핵산 부분을 관능성의 디스플레이되는 화학종에 연결시키는 분자를 의미한다. 그러한 링커는 당업계에 공지되어 있으며, 라이브러리 합성 동안 사용될 수 있는 것은 5'-O-디메톡시트리틸-1',2'-디데옥시리보스-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미디트; 9-O-디메톡시트리틸-트리에틸렌 글리콜,1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미디트; 3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필-1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미디트; 및 18-O-디메톡시트리틸헥사에틸렌글리콜,1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미디트를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러한 링커는 상이한 조합으로 서로에 대하여 직렬식으로 부가되어 상이한 요망되는 길이의 링커를 생성할 수 있다. "분지형 링커"는 라이브러리의 2가지 이상의 동일한 관능성 화학종에 라이브러리의 핵산 위치를 연결시키는 분자를 의미한다. 분지형 링커는 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 예는 대칭 또는 비대칭 더블러 (doubler) (1) 및 (2) 또는 대칭 트레블러 (trebler) (3)로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Newcome et al., Dendritic Molecules: Concepts, Synthesis, Perspectives, VCH Publishers (1996)]; [Boussif et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92: 7297-7301 (1995)]; 및 [Jansen et al., Science 266: 1226 (1994)]을 참조하라.
본원에서 사용될 때, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 뉴클레오티드의 중합체를 나타낸다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 당업계에 공지된 그의 임의의 유도체 - 이는 합성되어 염기쌍 인식에 사용될 수 있음 - 를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 인접한 염기들을 가질 필요는 없으며, 올리고뉴클레오티드 사이사이에 링커 모이어티가 산재할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 중합체는 천연 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시시티딘), 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, C5-프로피닐시티딘, C5-프로피닐우리딘, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-메틸시티딘, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌 및 2-티오시티딘), 화학적 개질 염기, 생물학적 개질 염기 (예를 들어, 메틸화 염기), 층간삽입 (intercalated) 염기, 개질된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스), 및/또는 개질된 포스페이트기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포라미드 연결체)를 포함할 수 있다.
"작동적으로 연결된"은 2개의 화학적 구조체가 그들이 겪을 것으로 기대되는 다양한 조작을 통하여 연결된 채 남아있도록 하는 그러한 방식으로 함께 연결됨을 의미한다. 전형적으로, 관능성 모이어티 및 코딩 올리고뉴클레오티드는 적절한 연결기를 통하여 공유 결합에 의해 연결된다. 예를 들어, 연결기는 코딩 올리고뉴클레오티드의 부착 부위 및 관능성 모이어티의 부착 부위를 갖는 2관능성 모이어티일 수 있다.
"소분자"는 분자량이 약 1000 달톤 미만인 분자를 의미한다. 소분자는 유기 또는 무기 분자일 수 있으며, 예를 들어 화합물 라이브러리 또는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 공지된 화합물의 유도체화에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점이 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면, 실시예 및 특허청구범위로부터 자명해진다.
도 1은 다양성 위치 A, B 및 C를 도시하는 개략도이다.
도 2는 A 및 B 다양성 노드와 반응한, 확인자 영역에서 상보적인 헤어핀 (hairpin) 구조를 포함하는 개시 올리고뉴클레오티드를 부분적으로 예시하는, 모드 1의 DNA-코딩 화학 라이브러리 구성원의 개략도이다. B를 위한 확인자 영역이 부가되어 있다. 이 도면에서, "C" 다양성 노드는 B 확인자 영역의 부가 이후 부가될 추가의 다양성 위치의 잠재적인 위치이다.
도 3은 개시 올리고뉴클레오티드를 부분적으로 예시하는, 모드 1의 DNA-코딩 화학 라이브러리 구성원의 개략도이며, 이는 증폭을 위한 프라이머 결합 영역으로서의 역할을 할 수 있는 헤어핀 구조의 루프 영역의 서열을 포함한다.
도 4는 개시 올리고뉴클레오티드를 부분적으로 예시하는, 모드 1의 DNA-코딩 화학 라이브러리 구성원의 개략도이며, 이는 중합 또는 효소적 라이게이션을 위한 제2 확인자 영역에 결합하는 역할을 할 수 있는 분자의 3' 말단 상의 비-상보적 서열을 포함한다.
도 5는 개시 올리고뉴클레오티드를 부분적으로 예시하는, 모드 1의 DNA-코딩 화학 라이브러리 구성원의 개략도이며, 여기서, 개시 올리고뉴클레오티드의 루프 영역 및 루프 영역의 3'측 상의 적어도 확인자 영역은 제2 확인자 영역을 또한 포함하는 상보적 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 역할을 할 수 있다.
도 6은 도 5에 제시된 바와 같이 헤어핀 모델의 PCR 증폭의 개략도이다.
도 7은 링커에 대하여 원위의 말단 상의, 공유 결합에 의해 (예를 들어, 헤어핀을 통하여 또는 화학적으로) 폐쇄된 헤어핀 올리고뉴클레오티드를 예시하는, 모드 2의 DNA-코딩 화학 라이브러리 구성원의 개략도이다.
도 8은 추가의 다양성 노드의 포함을 예시하는, 모드 2의 DNA-코딩 화학 라이브러리 구성원의 개략도이다.
도 9는 확인자 영역을 디콘볼루션하는 방법 및 라이브러리의 스크리닝 단계들을 예시하는, 모드 2의 DNA-코딩 화학 라이브러리 구성원의 개략도이다.
도 10은 라이브러리 합성에서 사용되는 올리고뉴클레오티드를 예시하는 개략도이다. 헤드피스 (HP)는 아이디티 디엔에이 (IDT DNA)에 의해 합성되며, HPLC에 의해 정제된다. 화살표는 BbvCI 제한효소 부위 (밑줄) 또는 Nb.BbvCI 또는 Nt.BbvCI 니킹 (nicking) 절단 부위를 나타낸다. DNA 태그 A1, B1, 및 C1 (상부 및 하부 가닥)의 서열, 5' 및 3' PCR 프라이머 서열, 및 HP의 3' 말단의 서열이 또한 예시되어 있다.
도 11은 상이한 합성 단계의 헤드피스의 전기영동 겔 (TBE-우레아 (15%) 겔 전기영동; TLC 플레이트 상에서의 UV 쉐도우잉 (shadowing))이다. 헤드피스 HP (아이디티 디엔에이)를 Fmoc-아미노-PEG2000-NHS (젠켐 테크놀로지 유에스에이 (JenKem Technology USA))에 의해 아실화하였다. 레인 1은 HP (아이디티 디엔에이) 올리고뉴클레오티드 (42개 nt)이다. 레인 2는 Fmoc-아미노-PEG2000-NHS에 의해 아실화된 HP이다. 트리스-HCl 첨가 이후, Fmoc의 약간의 탈보호가 관찰된다. 레인 3은 피페리딘과의 조 반응물이며, 이는 Fmoc의 완전한 탈보호를 보여준다. 레인 4는 NAP-5 컬럼 상에서의 탈염 및 동결건조 후의 레인 3과 동일하다. (XC: 자일렌 시아놀 (60개 nt DNA와 같이 이동); BPB: 브로모페놀 블루 (15개 nt DNA와 같이 이동).
도 12는 모델 라이브러리 합성에서의 단계를 예시하는 개략도이다. DTAF는 제1 단계에서 아미노-PEG 개질된 헤드피스 (HP-1)에 콘쥬게이션되었다. 이 단계 이후, HP-1-DTAF의 일부분은 펜틸아미노-비오틴으로 추가로 아실화되었다.
도 13a는 DNA 태그의 라이게이션의 개략도이다. 도 13b는 DNA 태그 라이게이션의 상이한 단계에서의 HP-1-DTAF-비오틴 라이브러리의 4% 아가로스 겔을 예시한다. M: 마커; 레인 1: HP-1-DTAF-비오틴; 레인 2: 1+ 단지 태그 A; 레인 3: 1 + 태그 A, B, 및 C, 이외에도 3' 말단 올리고 라이게이션됨. 화살표는 밝은 녹색 형광을 나타낸다 (DTAF). 상당한 분리는 겔 상에서 관찰되지 않는다. 도 13c는 라이게이션 반응물의 PCR 증폭 (24 사이클)을 예시한다. M: 마커 (가장 낮은 곳의 밴드는 100임); 레인 1: 도 14b의 레인 1로부터의 녹색 형광 밴드의 PCR 증폭물 (HP-1-DTAF-비오틴 + 태그 A); 레인 2: 도 13b의 레인 2로부터의 녹색 형광 밴드의 PCR 증폭물 (HP-1-DTAF-비오틴 + 모든 3가지 태그 및 3' 말단 올리고); 레인 3: 조 라이게이션 반응물 HP-1-DTAF-비오틴의 PCR 증폭물 + 모든 3가지 태그; 레인 4: 주형 대조 없음.
도 14는 엑스켐 (XChem) 모델 화합물의 정제 및 모델 선별 (엑스켐 모델 화합물의 비오틴 모이어티와 스트렙타비딘 사이의 결합 상호작용을 통하여)을 예시하는 전기영동 겔의 세트이다. 겔은 MES 러닝 (running) 완충액을 포함하는 4-12% SDS 누페이지 (NuPage) 겔이다. 겔은 450-nm 레이저를 이용하여 녹색 형광에 대하여 스캐닝하였다. 도 14a는 합성 및 정제 단계를 보여주는 겔이다. 샘플을 로딩 완충액과 혼합하고, 비등시켰다. M: 마커; 레인 1: HP-1 + DTAF; 레인 2 및 2a: HP-1-DTAF + 비오틴 (2개의 독립적인 반응물); 레인 3-6 (스트렙타비딘 다이날 (Dynal) 비드를 이용한 정제/모델 선별 단계): 레인 3: 통과물; 레인 4: 최종 세척물 (10분 동안 80℃의 물로 세척); 레인 5 및 5': 90℃의 25 mM EDTA로 용출 (1차 및 2차); 레인 6 및 6': 90℃의 5 mM NaOH 및 25 mM EDTA로 용출 (1차 및 2차). 도 14b는 스트렙타비딘에의 HP-1-DTAF-비오틴 ("1의 라이브러리")의 결합을 보여주는 겔이다. 샘플을 겔 로딩 완충액과 혼합하고 비등 없이 겔 상에 직접적으로 로딩하였다. 도 14a의 겔에서와 같이, 샘플은 50 mM NaCl/10 mM 트리스 (Tris) HCl - pH 7.0 - 중의 과량의 스트렙타비딘과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. "S"는 스트렙타비딘의 첨가를 나타낸다. 샘플 5 및 6은 함께 풀링되었다. 레인 1: HP-1-DTAF; 레인 1S: HP-1-DTAF + 스트렙타비딘; 레인 2: HP-1-DTAF-비오틴 (탈염됨); 레인 2S: HP-1-DTAF-비오틴 + 스트렙타비딘; 레인 4: 최종 세척물 (80℃의 물로 10분 동안 세척됨); 레인 4S: 최종 세척 셈플 + 스트렙타비딘; 레인 5+6: 풀링된 샘플 5, 5', 6 및 6' (스트렙타비딘 비드로부터의 용출 분획물, 정제되고 선별된 HP-1-DTAF-비오틴; 레인 5+6S': 정제되고 선별된 HP-1-DTAF-비오틴 + 스트렙타비딘. "1의 라이브러리"의 상이한 합성 단계들 사이에서의 이동에서의 두드러진 차이는 없음을 주목하라. 도 14c는 DTAF와 반응시킨 헤드피스 (트리링크 (Trilink)) HP-T의 4% 아가로스 겔이다. 레인 1: 마커; 레인 2: DTAF; 레인 3: HP-T-DTAF. 좌측 패널: 겔의 UV 가시화 (브롬화에티듐 염색); 우측 패널: 450 nm의 여기 파장에서 형광에 대하여 스캐닝된 동일 겔 (녹색, 플루오레세인). 도 14d는 MES 러닝 완충액을 포함하는 4-12% SDS 누페이지 겔이며, 이는 스트렙타비딘에의 HP-T-DTAF-비오틴의 결합을 보여준다. 샘플을 겔 로딩 완충액과 혼합하고, 비등 없이 겔 상에 직접적으로 로딩하였다. 도 14a의 겔에서와 같이, 샘플은 50 mM NaCl/10 mM 트리스 HCl - pH 7.0 - 중의 과량의 스트렙타비딘과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 레인 1: DTAF; 레인 2: HP-T-DTAF; 레인 3: HP-T-DTAF + 스트렙타비딘; 레인 4: HP-T-DTAF-비오틴 (탈염됨); 레인 5: HP-T-DTAF-비오틴 + 스트렙타비딘; 레인 6: 풀링된 샘플 5, 5', 6 및 6' (스트렙타비딘 비드로부터의 용출 분획물, 정제되고 선별된 HP-1-DTAF-비오틴; 레인 7: 정제되고 선별된 HP-1-DTAF-비오틴 + 스트렙타비딘.
도 15a는 T7 RNAP 세포내 전달 실험을 위한 작제물의 합성의 개략도이다. VH dsDNA 클론을 PCR 증폭시켜 T7 프로모터의 5' 말단 상류에 BsmI 부위를 부가하였다. 제한효소에 의한 절단 및 정제 이후, 작제물을 HP-1-DTAF-R7 (DTAF 및 (-Arg-εAhx)6-Arg 펩티드로 개질된 헤드피스)에 라이게이션시켰다. 도 15b는 라이게이션 반응물의 전기영동 겔이다. 레인 1 및 2는 VH에 라이게이션된 상이한 HP-1 샘플을 보여주며; 레인 3은 라이게이션되지 않은 VH PCR 생성물을 보여주며; M은 마커이다. 도 15c는 T7 프로모터 활성에 대한 검증을 보여주는 전기영동 겔이다. 이 겔은 도 15b의 레인 1-3으로부터의 샘플을 사용한 T7 메가스크립트 (Megascript) (앰비온, 인크. (Ambion, Inc.)) 반응물을 보여준다.
도 16은 라이브러리 10x 10 합성에서의 단계들의 아가로스 겔 전기영동이다. 도 16a는 태그 A가 라이게이션된 헤드피스 (트리링크) HP-T의 4% 아가로스 겔이다. 레인 1: 마커; 레인 2: HP-T; 레인 3: 태그 A 어닐링됨; 레인 4: 태그 A가 라이게이션된 HP-T; 레인 5: 태그 A가 라이게이션되고 제바 (Zeba) 컬럼에서 탈염된 HP-T. 도 16b는 12가지의 상이한 태그 B가 라이게이션된 HP-T-A의 2% 아가로스 겔이다. 레인 M: 마커, 레인 1 및 9: HP-T-A; 레인 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15 및 16: 태그 B1-B12가 라이게이션된 HP-T-A. 도 16c는 시아노우릭 클로라이드 및 아민 B1-B12와의 반응 후 태그 A 및 B1-B12가 라이게이션된 풀링된 라이브러리 (라이브러리 B)의 4% 아가로스 겔이다. 레인 1: 마커; 레인 2: HP-T-A; 레인 3: 풀링되고 제바 컬럼에서 탈염된 라이브러리-B.
본 발명은 생물학적 표적에 결합하는 하나 이상의 화합물을 확인하는 다수의 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 화합물 라이브러리의 합성 단계를 포함하며, 여기서, 화합물은 하나 이상의 다양성 위치를 갖는 관능성 모이어티를 포함한다. 화합물의 관능성 모이어티는 관능성 모이어티의 구조를 확인하는 개시 올리고뉴클레오티드에 작동적으로 연결된다. 요약하면, 모드 1은 라이브러리 합성 동안 dsDNA의 이중 가닥 특징을 보존하는 다수의 방법을 제공하는데, 이는 화학 반응 단계 동안 중요하며, 최대 2개의 다양성 노드를 생성하는 데 사용될 수 있다 (도 2 내지 도 6에 예시된 바와 같음). 모드 2 (도 7 내지 도 9)는 링커에 대하여 원위인 말단 상에서 (예를 들어, 헤어핀을 통하여 또는 화학적으로) 공유 결합에 의해 폐쇄된 헤어핀 올리고뉴클레오티드를 이용하며 하나의 다양성 노드를 예상한다. 모드 3은 하나, 2개, 3개 또는 그보다 많은 다양성 노드를 갖는 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 모드 1, 2 및 3은 하기에 상세하게 기술된다.
모드 1
본 발명은 생물학적 표적에 결합하는 하나 이상의 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 화합물 라이브러리의 합성 단계를 포함하며, 여기서, 화합물은 2개 이하의 다양성 위치를 갖는 관능성 모이어티를 포함한다. 화합물의 관능성 모이어티는 A 개시 화합물을 함유하는 용액을 제공함으로써 관능성 모이어티의 구조를 확인하는 개시 올리고뉴클레오티드에 작동적으로 연결된다.
개시 올리고뉴클레오티드는 1 이상의 정수를 갖는 링커 L (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)을 포함하며, 여기서, 개시 올리고뉴클레오티드는 2 이상의 정수인 A의 반응 베셀로 분리되고 L에 부착된 A 빌딩 블록을 포함하는 관능성 모이어티를 포함하고, 상기 모이어티는 A 빌딩 블록을 확인하는 개시 올리고뉴클레오티드에 작동적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, A 빌딩 블록은 공통 노드 S를 통하여 추가로 유도체화될 수 있다. 다른 실시양태에서, A는 S에 의해 후속적으로 변환되며, S는 다양성 도입의 추가의 노드를 허용하는 스캐폴드 분자이다. 일부 실시양태에서, A-S는 직접적으로 스크리닝될 수 있으며, 이는 단일한 다양성 노드를 나타낸다. 다른 실시양태에서, A-S 반응 베셀 (예를 들어, 이는 첫 번째로 출발 재료로부터의 A-S의 정제를 포함할 수 있음)은 함께 혼합되며, B 반응 베셀 내로 분취되며, 여기서, B는 1 이상의 정수이고, B 빌딩 블록들 중 하나와 반응한다. 여전히 B 반응 베셀 중에 있는 A-S-B는 일부의 경우에 C가 1의 정수인 C 빌딩 블록과 반응하며, 정제되며, B 프라이머를 사용한 중합 또는 라이게이션 반응에 처해지고, 여기서, B 프라이머는 서열이 상이하고 B 빌딩 블록을 확인한다.
특정 실시양태에서, A-S는 1의 정수일 수 있다. 일 실시양태에서, A-S는 B 개시 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 연결될 수 있으며, B 빌딩 블록의 반응 이후에 B 반응물들은 혼합된다. 특정 실시양태에서, B가 유일한 다양성 노드를 나타내는 A-S-B 혼합물은 직접적으로 스크리닝되며, 이는 단일한 다양성 노드를 나타낸다. 다른 실시양태에서, B가 유일한 다양성 노드를 나타내는 A-S-B 혼합물은 후속적으로 C 반응 베셀 내로 분취되며, C 빌딩 블록과 반응하며, C 프라이머를 이용한 제2 가닥 중합 또는 라이게이션 반응에 처해지고, 여기서, C 프라이머는 서열 이 상이하고 C 빌딩 블록을 확인한다.
특정 실시양태에서, B는 1의 정수일 수 있으며, A-S는 1 초과이고, 이 경우 A-S는 현재 B로 유도체화된 것으로서, C 반응 베셀 내로 분취되며, C 빌딩 블록과 반응하고, C 프라이머를 이용한 제2 가닥 중합 반응에 처해지고, 여기서, C 프라이머는 서열 면에서 상이하고 C 빌딩 블록을 확인한다. 이러한 일반적인 전략은 확장되어 추가의 다양성 노드 (예를 들어, D, E, F 등)를 포함할 수 있어서, 제1 다양성 노드는 빌딩 블록들 및/또는 S와 반응하고 초기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되며, 혼합되며, 베셀 내로 재분취되며, 그 후 후속 다양성 노드는 빌딩 블록들에 의해 유도체화되는데, 이는 중합 또는 라이게이션 반응에 사용되는 프라이머에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, A는 1의 정수일 수 있으며, B는 1의 정수일 수 있으며, C 개시 올리고뉴클레오티드가 사용된다. C 개시 올리고뉴클레오티드에 부착된 A-S-B는 C 반응 베셀에서 형성되며, C 빌딩 블록과 반응하며, 직접적으로 스크리닝된다.
특정 실시양태에서, S를 먼저 개시 올리고뉴클레오티드와 반응시키며, A, B 및/또는 C (예를 들어, 또는 D, E, F 등)는 후속적으로 반응시킨다.
특정 실시양태에서, A, B 또는 C (예를 들어, 또는 D, E, F 등)는 추가의 다양성 노드를 위한 부위를 포함할 수 있다. 만일 이것이 맞다면, S는 추가의 다양성 노드의 도입에 사용 또는 요구될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
일 실시양태에서, 개시 올리고뉴클레오티드는 확인자 영역에서 상보적인 헤어핀 구조를 포함한다 (도 2). 확인자 영역은 길이가 예를 들어 2 내지 100 염기쌍, 바람직하게는 길이가 5 내지 20 염기쌍, 그리고 가장 바람직하게는 길이가 6 내지 12 염기쌍일 수 있다. 개시 올리고뉴클레오티드는 증폭에 있어서 프라이머 결합 영역으로서의 역할을 할 수 있는 헤어핀 구조의 루프 영역 내의 서열을 추가로 포함하여서 (도 3) 프라이머 결합 영역은 확인자 영역 단독보다 더 높은, 그의 상보적 프라이머 (예를 들어, 이는 측면에 위치하는 확인자 영역을 포함할 수 있음)의 용융 온도를 갖게 된다.
일 실시양태에서, 루프 영역은 비개질 염기보다 더 높은 친화도의 이중가닥 형성물을 형성할 수 있는 개질된 염기를 포함할 수 있으며, 그러한 개질 염기는 당업계에 공지되어 있다 (도 3). 개시 올리고뉴클레오티드는 중합을 위한 또는 효소적 라이게이션을 위한 제2 확인자 영역에 결합하는 역할을 할 수 있는 분자의 3' 말단 상의 비-상보적 서열을 추가로 포함할 수 있다 (도 4). 일 실시양태에서, 가닥들은 후속적으로 예를 들어 프소랄렌을 사용하여 가교결합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 루프 영역 및 루프 영역의 3'측의 적어도 확인자 영역은 제2 확인자 영역을 또한 포함하는 상보적 올리고뉴클레오티드에 혼성화되는 역할을 할 수 있다 (도 5). 많은 빌딩 블록 및 상응하는 태그가 사용되는 경우 (예를 들어, 100개의 태그), 혼합-분할 전략을 올리고뉴클레오티드 합성 단계 동안 이용하여 필요한 수의 태그를 생성할 수 있다. DNA 합성에 있어서의 그러한 혼합-분할 전략은 당업계에 공지되어 있다. 일 실시양태에서, 가닥들은 후속적으로 예를 들어 프소랄렌을 사용하여 가교결합될 수 있다. 생성된 라이브러리 구성원은 관심있는 표적(들)에 대한 결합 실체에 대하여 선별한 후 PCR 증폭될 수 있다 (도 6).
예를 들어, 개시 올리고뉴클레오티드를 포함하는 헤드피스를 예를 들어 1000가지의 상이한 변이체를 포함하는 A 및 링커와 반응시킬 수 있다. 각각의 A 빌딩 블록에 있어서, DNA 태그 A는 헤드피스에 라이게이션되거나 헤드피스가 되도록 프라이머 연장될 수 있다. 이들 반응은 예를 들어 1000웰 플레이트 또는 10 x 100웰 플레이트에서 수행될 수 있다. 모든 반응물은 풀링되며, 임의로 정제되며, 제2 플레이트 세트로 분할될 수 있다. 다음, B 빌딩 블록을 이용하여 동일 절차를 수행할 수 있으며, 상기 B 빌딩 블록은 예를 들어 1000가지의 상이한 변이체를 또한 포함한다. DNA 태그 B는 헤드피스에 라이게이션될 수 있으며, 모든 반응물은 풀링될 수 있다. B에 대한 A의 1000 x 1000의 조합의 라이브러리 (즉, 1,000,000가지의 화합물)는 태그의 1,000,000가지의 상이한 조합에 의해 태깅된다. 동일한 접근법을 확장시켜 변이체 C, D, E 등을 부가할 수 있다. 그 후, 생성된 라이브러리는 표적에 결합하는 화합물의 확인에 사용될 수 있다. 라이브러리에 결합하는 화합물의 조성물은 풍부해진 화합물의 확인을 위하여 DNA 태그의 서열결정 및 PCR에 의해 평가될 수 있다.
모드 2
또 다른 실시양태 (도 7)에서, 본 방법은 화합물의 라이브러리의 합성 단계를 포함하며, 여기서, 화합물은 2개 이하의 다양성 위치를 갖는 관능성 모이어티를 포함한다. 화합물의 관능성 모이어티는 A 개시 화합물을 포함하는 용액을 제공함으로써 관능성 모이어티의 구조를 확인하는 유일무이한 유전자 서열을 포함하는 개시 올리고뉴클레오티드에 작동적으로 연결되며, 여기서, 개시 화합물이 A 반응 베셀로 갈라지는 A 빌딩 블록을 갖는 관능성 모이어티를 포함할 경우 L은 1 이상의 정수이고, 예를 들어 A가 2 이상의 정수일 경우 이는 A 빌딩 블록을 확인하는 초기 올리고뉴클레오티드에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, A 빌딩 블록은 공통적인 S에 의해 사전 유도체화된다. 다른 실시양태에서, A는 후속적으로 S에 의해 변환되며, S는 다양성 도입의 추가의 노드를 허용하는 스캐폴드 분자이다. 다음, A-S 반응 베셀들 (이는 첫 번째로 출발 재료로부터의 A-S의 정제물을 포함할 수 있음)을 함께 혼합하고, B 반응 베셀들 - 여기서, B는 1 이상의 정수임 - 내로 분취하고, B 빌딩 블록들 중 하나와 반응시킨다. 일부 실시양태에서, 여전히 B 반응 베셀 내에 있는 A-S-B는 1의 정수인 C의 빌딩 블록과 반응시키며, 이는 정제되며, 스크리닝을 위하여 B 베셀 내에 분리된 채 유지된다. 일부 실시양태에서, A-S는 1의 정수이다. 일 실시양태에서, A-S는 B 개시 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 연결될 수 있으며, B 빌딩 블록의 반응 이후, B 반응물들은 혼합되며, C 반응 베셀 내로 분취되며, C 빌딩 블록과 반응시키며, 스크리닝을 위하여 C 베셀 내에 분리된 채 유지된다. 다른 실시양태에서, B는 1의 정수일 수 있으며, A-S는 1 초과이고, 이 경우, 현재 B에 의해 유도체화된 A-S는 C 빌딩 블록과 반응하는 C 반응 베셀로 분취되며 스크리닝을 위하여 C 베셀 내에 분리되어 유지된다. 이러한 일반적인 전략은 확장되어 추가의 다양성 노드 (예를 들어, D, E, F 등)를 포함하여서, 제1 다양성 노드가 빌딩 블록 및/또는 S와 반응하고 개시 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되며, 혼합되고, 베셀로 재분취되고, 그 후 후속적인 다양성 노드는 빌딩 블록에 의해 유도체화되고 스크리닝을 위하여 그의 각각의 베셀 내에 유지된다 (도 8).
예를 들어, 모드 1에 기술된 바와 같이, 개시 올리고뉴클레오티드를 포함하는 헤드피스는 예를 들어 1000가지의 상이한 변이체를 포함하는 A 빌딩 블록 및 링커와 반응시킬 수 있다. 각각의 A 빌딩 블록에 있어서, DNA 태그 A는 헤드피스에 라이게이션되거나 헤드피스가 되도록 프라이머 연장될 수 있다. 반응물들은 풀링될 수 있다. 다음, B 빌딩 블록을 이용하여 동일 절차를 수행할 수 있지만, DNA 태그는 B에 있어서는 부가되지 않는다. B는 코딩되지 않기 때문에, 모든 "B" 반응물들은 풀링될 수 있으며 (예를 들어, 1000가지의 반응물), 미공지 B 빌딩 블록에 의한 요망되는 결합 효과를 생성하는 모든 A 빌딩 블록을 확인하기 위하여 선별 단계를 수행할 수 있다. 그 후, 선별 단계에서 확인된 A 빌딩 블록의 라이브러리 (예를 들어, 10가지의 A 빌딩 블록)는 동일한 1000가지의 B 빌딩 블록과 반응하여 10,000가지 이하의 화합물의 스크린을 생성할 수 있다. 이 라운드에서, B에 대한 DNA 태그가 부가될 수 있으며, 예를 들어 10개의 A 빌딩 블록과 조합되어 요망되는 결합 효과를 생성하는 B 빌딩 블록이 확인되어 예를 들어 1,000,000가지의 화합물의 초기 라이브러리의 단계식 컨볼루션을 생성할 수 있다. 이들 최종 화합물의 세트를 개별적으로 시험하여 예를 들어 최상의 결합자, 활성자 또는 저해자를 확인할 수 있다.
B 합성 후의 반응물 모두의 풀링을 회피하기 위하여, 예를 들어, BIND 판독기 (에스알유 바이오시스템즈 (SRU Biosystems))를 사용하여 고처리량 포맷 (예를 들어, 384웰 플레이트 및 1536웰 플레이트)의 센서 표면에서 결합을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, A 빌딩 블록은 DNA 태그에 의해 코딩될 수 있으며 B 빌딩 블록은 위치 코딩될 수 있다. 그 후, A 태그의 제한 효소 절단 분석, 또는 마이크로어레이 분석, 서열결정 및 BIND 센서를 이용하여 결합자를 확인할 수 있다. 이러한 분석에 의해, 요망되는 분자를 생성하는 A 및 B 빌딩 블록의 조합을 확인한다. 당업계의 숙련자에게 공지된, 결합을 모니터링하는 다른 방법이 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 ELISA를 포함한다.
모드 1 및 2
모드 1 및 2의 개시 올리고뉴클레오티드는 확인자 영역에서 상보적인 헤어핀 구조를 포함할 수 있다. 개시 올리고뉴클레오티드는 증폭을 위한 프라이머-결합 영역으로서의 역할을 할 수 있는 헤어핀 구조의 루프 영역 내의 서열을 추가로 포함하여서, 프라이머 결합 영역은 확인자 영역 단독보다 더 높은 용융 온도를 그의 상보적 프라이머 (측면에 위치하는 확인자 영역을 포함할 수 있음)에 대하여 갖는다.
일 실시양태에서, 개시 올리고뉴클레오티드는 빌딩 블록과 작용적으로 반응할 수 있는 링커 분자를 포함한다. 링커 분자는 당업계에 공지된 방법을 통하여 개시 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 직접적으로 부착될 수 있거나, 예를 들어 유도체화된 염기로부터 떨어져서 (예를 들어, 우리딘의 C5 위치) 당해 분자 내에 매립될 수 있거나, 링커는 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 개시 올리고뉴클레오티드의 중앙에 두어질 수 있다.
개시 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 형성은 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 형성을 통하여 또는 예를 들어 프소랄렌 모이어티를 사용하여 가교결합을 통하여 달성될 수 있으며, 이는 당업계에 공지된 바와 같다.
개시 올리고뉴클레오티드는 빌딩 블록을 코딩하는 확인자 영역의 어느 하나의 측면에 2개의 프라이머-결합 영역 (예를 들어, PCR 반응을 가능하게 하기 위한 것임)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 개시 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에 하나의 프라이머-결합 부위를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 개시 올리고뉴클레오티드는 헤어핀이며, 루프 영역은 프라이머-결합 부위를 형성하거나, 프라이머-결합 부위는 루프의 3' 측의 확인자 영역에의 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 통하여 도입된다. 개시 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상동성인 영역을 포함하고 그의 5' 말단에 프라이머 결합 영역 (예를 들어, PCR 반응을 가능하게 하기 위한 것임)을 지니는 프라이머 올리고뉴클레오티드는 개시 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 수 있으며, 다양성 위치들 중 하나에서 사용되는 빌딩 블록을 코딩하는 확인자 영역을 포함할 수 있다. 프라이머 올리고뉴클레오티드는 추가의 정보, 예컨대 랜덤화된 뉴클레오티드, 예를 들어 길이가 2 내지 16개 뉴클레오티드인 것의 영역을 포함할 수 있으며, 이는 생물정보 분석을 위하여 포함된다.
일 실시양태에서, 개시 올리고뉴클레오티드는 PCR 프라이머-결합 부위를 포함하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 화합물의 라이브러리 또는 그의 일부분은 화합물 라이브러리의 적어도 하나의 구성원을 표적에 결합시키기에 적합한 조건 하에 생물학적 표적과 접촉시키고, 이어서 표적에 결합하지 않은 라이브러리 구성원을 제거하고, 확인자 영역 또는 영역들을 분석한다. 예시적인 생물학적 표적은 예를 들어 효소 (예를 들어, 키나제, 포스파타제, 메틸라제, 데메틸라제, 프로테아제 및 DNA 복구 효소), 단백질:단백질 상호작용에 연루된 단백질 (예를 들어, 수용체에 대한 리간드), 수용체 표적 (예를 들어, GPCR 및 RTK), 이온 채널, 박테리아, 바이러스, 기생충, DNA, RNA, 프리온, 또는 탄수화물)을 포함한다.
일 실시양태에서, 화합물의 라이브러리, 또는 그의 일부분은 화합물 라이브러리의 적어도 하나의 구성원을 표적에 결합시키기에 적합한 조건 하에 생물학적 표적과 접촉시키고, 이어서 표적에 결합하지 않는 라이브러리 구성원을 제거하고, 이어서 당업계에 공지된 방법에 의해 확인자 영역을 증폭시키고, 후속적으로 당업계에 공지된 방법에 의해 확인자 영역 또는 영역들을 분석한다.
일 실시양태에서, 확인자 영역의 증폭 방법은 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 선형 사슬 증폭 (LCR), 롤링 서클 증폭 (RCA), 또는 핵산 서열을 증폭시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 다른 방법을 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 화합물의 라이브러리는 빌딩 블록 부가의 최종 단계 이후에 풀링되는 것은 아니며, 풀을 개별적으로 스크리닝하여 표적에 결합하는 화합물(들)을 확인한다.
또 다른 실시양태에서, 표적에 결합하는 분자는 증폭시키지 않고, 직접적으로 분석한다. 분석 방법은 확인자 영역을 디콘볼루션하기 위한 마이크로어레이 분석 또는 비드-기반 방법을 포함한다 (도 9). 스크리닝 단계 동안 결합하는 분자는 무표지체 (label-free) 광결정 바이오센서에 의해 또한 검출될 수 있다.
일 실시양태에서, 개시 올리고뉴클레오티드 및/또는 프라이머 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 형광 태그, Q 도트 또는 비오틴에 의해 그가 검출되게 하는 관능성 모이어티를 포함한다.
일 실시양태에서, 마이크로어레이 분석은 예를 들어 순간적 공명 광결정과 같이 진보된 검출 능력을 이용한다.
일 실시양태에서, 증폭 방법은 복수의 수성 마이크로반응기를 생성하기 위하여 유중수 에멀젼을 형성하는 단계 - 여기서, 마이크로반응기들 중 적어도 하나는 표적에 결합하는 화합물 라이브러리의 적어도 하나의 구성원, 표적에 결합하는 화합물 라이브러리의 적어도 하나의 구성원의 코딩 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있는 단일 비드, 및 핵산 증폭 수행에 필요한 시약들을 함유하는 증폭 반응 용액을 가짐 - , 마이크로반응기 내의 코딩 올리고뉴클레오티드를 증폭시켜 코딩 올리고뉴클레오티드의 증폭된 카피 (copy)를 형성하는 단계, 및 마이크로반응기에서 코딩 올리고뉴클레오티드의 증폭된 카피를 비드에 결합시키는 단계를 포함한다.
일단 관심있는 표적에 결합하는 제1 라이브러리로부터의 빌딩 블록이 확인되었으며, 하나 또는 2개의 추가의 다양성 노드를 부가하는 반복적인 방식으로 제2 라이브러리를 제조할 수 있으며, 라이브러리를 생성하고, 다양성을 샘플링하며, 이는 본원에 기술된 바와 같다. 이러한 과정은 필요한 만큼 많이 반복하여서 요망되는 분자 특성 및 약제학적 특성을 갖는 분자를 생성할 수 있다.
예시적인 A 빌딩 블록은 예를 들어 아미노산 (알파-아미노산에 한정되는 것은 아님), 아민을 포함하는 클릭-화학 반응물 (예를 들어, 아지드 또는 알킨 사슬), 또는 티올 반응물을 포함한다. A 빌딩 블록의 선택은 예를 들어 링커에서 사용되는 반응기의 성질, 스캐폴드 모이어티의 성질, 및 화학 합성에 사용되는 용매에 따라 달라진다. 예를 들어, 표 1을 참조한다.
Figure 112011070703980-pct00001
Figure 112011070703980-pct00002
예시적인 B 및 C 빌딩 블록이 각각 표 2 및 표 3에 기술되어 있다. 제한효소 부위는 PCR 및 상응하는 제한 효소들 중 하나를 이용한 제한효소 절단을 수행함으로써 최종 생성물을 분석 및 선별하기 위하여 예를 들어 B 또는 C 위치 내에 도입될 수 있다.
Figure 112011070703980-pct00003
Figure 112011070703980-pct00004
Figure 112011070703980-pct00005
Figure 112011070703980-pct00006
Figure 112011070703980-pct00007
모드 3
본원에 기술된 모드들 (예를 들어, 모드 1 및 2) 중 어느 하나에서, 헤드피스 올리고뉴클레오티드는 반-수성 또는 비-수성 (예를 들어, 유기) 조건에서의 용해성을 지지하도록 개질될 수 있다. 특정 실시양태에서, 헤드피스는 확인자 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커를 포함하는 헤드피스는 먼저 빌딩 블록 (예를 들어, 관능성 모이어티) 또는 스캐폴드에 의해 유도체화될 수 있으며, 확인자 서열은 그 후 부가된다.
헤드피스의 뉴클레오티드 염기는 예를 들어 T 또는 C 염기의 C5 위치를, 그가 그의 상보적 염기에 수소 결합하는 능력을 유의하게 파괴하지 않고서 지방족 사슬을 이용하여 개질함으로써 더욱 소수성으로 되게 할 수 있다. 예를 들어, 개질된 염기의 예에 대해서는 표 4를 참조하라. 게다가, 헤드피스 올리고뉴클레오티드는 유기 용매에서의 용해성을 촉진하는 개질체가 산재할 수 있다. 예를 들어, 아조벤젠 포스포르아미다이트는 소수성 모이어티를 헤드피스 디자인 내로 도입할 수 있다. 헤드피스 내로의 소수성 아미다이트의 그러한 삽입은 당해 분자 내의 어느 곳에서든지 일어날 수 있다. 그러나, 상기 삽입은 라이브러리 합성 또는 뒤따르는 PCR 반응 - 일단 선별이 완료된 경우 - 또는 마이크로어레이 분석 - 태그 디콘볼루션에 사용되는 경우 - 동안 추가의 DNA 태그를 이용한 후속적인 태깅을 방해할 수는 없다. 본원에 기술된 헤드피스 디자인에의 그러한 부가는 예를 들어 15%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90 %, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 유기 용매에서 헤드피스가 가용성이 되게 한다. 따라서, 헤드피스 디자인 내로의 소수성 잔기의 부가는 헤드피스가 핵산 태깅에 대하여 적경성이 되도록 하면서 반-수성 또는 비-수성 (예를 들어, 유기) 조건에서 용해도를 향상시킨다. 더욱이, 후속적으로 라이브러리 내로 도입되는 DNA 태그는 T 또는 C 염기의 C5 위치에서 또한 개질될 수 있어서, 이들은 또한 라이브러리가 더욱 소수성으로 되게 하고 라이브러리 합성의 후속 단계에 있어서 유기 용매 중에 더욱 큰 가용성을 갖게 된다.
Figure 112011070703980-pct00008
헤드피스와 소분자 라이브러리 사이의 링커 분자를 변화시켜 유기 용매 중 헤드피스의 용해도를 증가시킬 수 있다. 매우 다양한 링커가 시판되며, 이는 헤드피스를 소분자 라이브러리와 커플링시킬 수 있다. 링커는 주어진 소분자 라이브러리 디자인 (스캐폴드 및 빌딩 블록)에 대하여 실험에 의해 선별되어서 라이브러리는 유기 용매, 예를 들어 15%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90 %, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 유기 용매에서 합성될 있게 된다. 링커는 유기 용매 중에 헤드피스를 가용화하는 적절한 사슬 길이를 선별하기 위하여 라이브러리 합성 이전에 모델 반응을 이용하여 변화시킬 수 있다. 그러한 링커는, 예를 들어 알킬 사슬 길이가 증가되거나, 폴리에틸렌 글리콜 단위가 증가되거나, (헤드피스 상의 포스페이트 음전하를 중화시키기 위하여) 양전하를 갖는 분지형 화학종을 갖거나, 소수성 양이 증가된 (예를 들어, 벤젠 고리 구조의 부가) 링커를 포함할 수 있다.
링커 분자는 헤드피스 DNA와 화학 라이브러리의 구성원 사이에 적절한 스페이서 (spacer)를 제공할 수 있다. 예를 들어, 2관능성 링커가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 2관능성 링커는 예를 들어 3개의 부분을 포함할 수 있다. 부분 1은 예를 들어 바람직하게는 N-히드록시 숙신이미드 (NHS)에 의해 활성화되는 카르복실산, DNA (예를 들어, 아미노-개질된 dT) 상의 아미노기와 반응하는 에스테르, 단일 가닥 DNA 헤드피스의 5' 또는 3' 말단을 개질하는 아미다이트 (표준 올리고뉴클레오티드 화학에 의해 달성됨), 클릭 화학 쌍 (Cu(I) 촉매의 존재 하에서의 아지드 알킨 환화 부가), 또는 티올 반응기와 같이 DNA와 공유 결합을 형성하는 반응기일 수 있다. 또한 부분 2는 화학 라이브러리, 위치 A 내의 빌딩 블록 또는 스캐폴드 모이어티와 공유 결합을 형성하는 반응기일 수 있다. 그러한 반응기는, 예를 들어 수성 반응을 위한 아민, 티올, 아지드 또는 알킨 또는 유기-기반 반응을 위한 다수의 기타 반응기일 수 있다. 부분 3은 부분 1과 부분 2 사이에 도입된, 다양한 길이의 화학적 불활성 스페이서일 수 있다. 그러한 스페이서는 에틸렌 글리콜 단위 사슬 (예를 들어, 상이한 길이의 PEG), 알칸, 알켄, 폴리엔 사슬 또는 펩티드 사슬일 수 있다. 링커는 라이브러리 검출 목적에 사용되는 형광 모이어티 (예를 들어, 플루오레세인 또는 Cy-3)뿐만 아니라 (예를 들어, 벤젠 고리와 같이) 유기 용매 중 헤드피스의 용해도를 향상시키기 위한 소수성 모이어티도 갖는 분지체 또는 삽입체를 포함할 수 있다.
시판 링커의 예는 예를 들어 아미노-카르복실릭 링커 (예를 들어, 펩티드 (예를 들어, Z-Gly-Gly-Gly-Osu 또는 Z-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Osu), PEG (예를 들어, Fmoc-아미노PEG2000-NHS 또는 아미노-PEG (12-24)-NHS), 또는 알칸산 사슬 (예를 들어, Boc-ε-아미노카프로산-Osu)), 클릭 화학 링커 (예를 들어, 펩티드 (예를 들어, 아지도호모알라닌-Gly-Gly-Gly-OSu 또는 프로파르길글리신-Gly-Gly-Gly-OSu), PEG (예를 들어, 아지도-PEG-NHS), 또는 알칸산 사슬 (예를 들어, 5-아지도펜탄산, (S)-2-(아지도메틸)-1-Boc-피롤리딘, 또는 4-아지도-부탄-1-오익산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)), 티올-반응성 링커 (예를 들어, PEG (예를 들어, SM(PEG)n NHS-PEG-말레이미드), 알칸 사슬 (예를 들어, 3-(피리딘-2-일디술파닐)-프로피온산-Osu 또는 술포숙신이미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트))), 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 아미다이트 (예를 들어, 아미노 개질제 (예를 들어, 6-(트리플루오로아세틸아미노)-헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포라미디트), 티올 개질제 (예를 들어, S-트리틸-6-메르캅토헥실-1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미디트, 또는 클릭 화학 개질제 (예를 들어, 6-헥신-1-일-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포라미디트, 3-디메톡시트리틸옥시-2-(3-(3-프로파르길옥시프로판아미도)프로판아미도)프로필-1-O-숙시노일, 장쇄 알킬아미노 CPG, 또는 4-아지도-부탄-1-오익산 N-히드록시숙신이미드 에스테르))를 포함한다.
헤드피스 디자인 중 소수성 잔기를 링커 디자인에 의해 변화시켜 유기 용매 중에서의 라이브러리 합성을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 헤드피스 및 링커 조합은 옥탄올:물 계수 (Poct)가 예를 들어 1.0 내지 2.5인 적절한 잔기를 갖도록 디자인된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 어떠한 방식으로든 한정하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1. 헤드피스 (변이체 1)의 제조
하기 서열을 갖는 포스포릴화 올리고뉴클레오티드 헤드피스 (올리고 HP)를 합성하고, 아이디티 디엔에이에 의해 HPLC 정제하였다.
Figure 112011070703980-pct00009
올리고뉴클레오티드는 오버행 (overhang)을 갖는 헤어핀으로 폴딩되며 (도 10), 제한 효소 BbvCI 또는 이 효소의 니킹 버전인 Nb.BbvCI 또는 Nt.BbvCI - 이는 상부 또는 하부 가닥 중 어느 하나를 절단할 수 있음 - (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England BioLabs))의 절단 부위 (CCTCAGC)를 포함하였다. 헤어핀 루프의 중앙에, 측쇄 C5-아미노-개질 dT가 삽입되어 있으며 (dT-C6-NH; "C6"은 탄소수 6의 링커를 나타냄), 이는 아미노-PEG 링커 (PEG2000, 대략 45개의 에틸렌 글리콜 단위)의 커플링에 사용하였다. DNA 태그 A, B 및 C의 상부 및 하부 가닥을 아이디티 디엔에이에 의해 합성 및 정제하고, 표준 탈염에 의해 정제하였다. 더욱 긴 올리고뉴클레오티드, 예컨대 3' 말단 및 PCR 프라이머를 아이디티 디엔에이에 의해 합성하고, HPLC로 정제하였다.
10 나노몰의 올리고 HP를 50 ㎕의 물에 용해시켰다. 20배 몰과량의 Fmoc-아미노-PEG2000-카르복실-NHS 에스테르 (젠켐 테크놀로지 유에스에이)를 50 ㎕의 디메틸포름아미드 (DMF)에 용해시키고, 실온에서 2시간의 코스에 걸쳐 두 부분으로 상기 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였다 (50% DMF/50% 물의 최종 용매 조성). 후속적으로, 60 ㎕의 1 M 트리스 HCl - pH 7.0 - (200 mM의 최종 농도)을 첨가하여 상기 과량의 NHS 에스테르를 켄칭하고, 그 용액을 실온에서 추가의 30분 동안 인큐베이션하였다. 생성된 반응 혼합물을 물을 이용하여 500 ㎕로 희석시키고, NAP-5 컬럼 (세파덱스 (Sephadex)-25, 지이 헬스케어 (GE Healthcare))에 통과시킴으로써 탈염시켰다.
생성된 물질을 동결건조시키고, 100 ㎕의 물에 용해시켰다. 20 ㎕의 피페리딘 (20%의 최종 농도가 되도록)을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 아민의 탈보호 및 수불용성 Fmoc 기의 방출로 인하여 흐린 침전물이 형성되었다. 그 후 반응물을 0.2-㎛ 스핀-필터 (밀리포어 (Millipore))를 통하여 여과시키고, 3배 부피의 에탄올의 첨가에 의해 300 mM 아세트산나트륨을 사용하여 침전시켰다. 개질된 올리고뉴클레오티드의 Fmoc-보호 형태는 에탄올 및 이소프로판올에 가용성인 것으로 밝혀졌다. 높은 커플링 효율로 인하여, 생성된 헤드피스 (HP-1)는 추가의 정제 없이 사용하였다 (도 11).
실시예 2. 헤드피스 (변이체 2)의 제조
하기 서열을 갖는 전 헤드피스 (HP-1)는 상기에 기술된 것과 유사한 절차에 따라 트리링크, 인크.가 제조하였으며, 이를 RP-HPLC로 정제하였다.
Figure 112011070703980-pct00010
여기서, X는 아미노-PEG2000을 나타낸다.
실시예 3. 모델 라이브러리 구성원의 합성
단계 1: DTAF 의 커플링
"1의 라이브러리"를 제조하기 위하여, 모델 화합물, 5-(4,6-디클로로트리아지닐-아미노플루오레세인) (DTAF; 아나스펙 (Anaspec)) (도 12)을 HP-1의 아미노기에 커플링시켰다. 구조적으로 DTAF는 하나의 아미노 화합물이 커플링된 트리클로로트리아진 스캐폴드를 나타내었다. 라이브러리의 형성을 위하여, 트리클로로트리아진 스캐폴드는 3개의 염소 위치 각각에서 다양한 빌딩 블록으로 유도체화할 수 있었다. 또한 DTAF는 형광 표지체를 모델 라이브러리에 제공하였다. 반응물 (10 ㎕)은 하기와 같이 셋업하였다. 물에 용해시킨 5 ㎕의 400 μM HP-1에 pH 9.5의 2 ㎕의 750 mM 붕산염 완충액 및 1 ㎕의 DMF를 첨가하였다. DTAF를 DMF 중에 50 mM이 되도록 용해시키고, 2 ㎕를 상기 반응물에 첨가하였다. HP-1 및 DTAF의 최종 농도는 각각 200 μM 및 10 mM이었으며, 그에 따라 50배 과량의 DTAF를 생성하였다. 최종 DMF 농도는 30%였다. HP-1은 최대 90%의 DMF 중에 계속 가용성이었으며, 이는 이것이 유기 용매, 예를 들어 DMF 중에 가용성임을 입증하는 것임이 주목되었다. 반응을 4℃에서 16-20시간 동안 진행시켰다. 그 후 반응 혼합물을 물로 30-50 ㎕로 희석시키고, 제바 스핀 컬럼 (피어스 (Pierce))에서 탈염시켰다. 이 시점에서 추가의 정제는 완료되지 못하였다.
단계 2: 아미노-비오틴 의 커플링
DTAF를 HP-1에 커플링시킨 후, 스캐폴드 분자 상의 추가의 하나의 반응기가 여전히 개질에 이용가능하였다. 본 발명자는 아미노-비오틴 유사체, EZ-링크 펜틸아민-비오틴 (EZ-Link 펜틸아민-Biotin; 피어스)을 선택하여 이 위치에서 커플링하여 모델 결합 화합물을 생성하였다 (도 12). 반응물을 하기와 같이 셋업하였다. 20 ㎕의 반응 혼합물은 pH 9.5의 150 mM 붕산염 완충액에 용해시킨 대략 200 pmol의 HP-1-DTAF (단계 1)와, 10 nmol의 펜틸아민-비오틴을 함유하였다. 반응을 4-12시간 동안 75℃에서 진행시켰다. 그 후, 반응물은 상기에 기술한 바와 같이 제바 스핀 컬럼에서의 탈염에 의해 정제하였다.
단계 3: HP -1- DTAF -비오틴 에의 DNA 태그의 라이게이션
포스포릴화 DNA 태그 (3' 말단 프라이머 영역과, 5' 및 3' PCR 프라이머)를 아이디티 디엔에이에 의해 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 서열 (도 13)은 하기와 같았다.
DNA Tag A1 (상부):
Figure 112011070703980-pct00011
DNA Tag A1 (하부):
Figure 112011070703980-pct00012
DNA Tag B1 (상부):
Figure 112011070703980-pct00013
DNA Tag B1 (하부):
Figure 112011070703980-pct00014
DNA Tag C1 (상부):
Figure 112011070703980-pct00015
DNA Tag C1 (하부):
Figure 112011070703980-pct00016
3' 말단 (상부):
Figure 112011070703980-pct00017
3' 말단 (하부):
Figure 112011070703980-pct00018
5' PCR 프라이머:
Figure 112011070703980-pct00019
3' PCR 프라이머:
Figure 112011070703980-pct00020
당량의 상부 및 하부 쌍의 태그 및 3' 말단 올리고뉴클레오티드를 물에 용해시키고, 200 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 7.0의 완충액 중에서 85℃로 가열하고 4℃로 감소시킴으로써 어닐링하였다.
첫째, 이중 가닥 A1 태그를 헤드피스에 라이게이션시켰다. 라이게이션 반응물 (20 ㎕)은 2.5 μM의 HP-1-DTAF-비오틴 및 2.5 μM의 이중 가닥 A1 태그를 1x T4 DNA 리가제 완충액 및 60 바이스 단위 (Weiss unit)의 T4 DNA 리가제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스) 중에 함유하였다. 반응물을 16℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 생성물은 상이한 백분율의 TBE-우레아, 네이티브페이지 (NativePage), SDS-PAGE, 또는 2% 및 4% 아가로스 E-겔 (인비트로겐, 인크. (Invitrogen, Inc.))을 포함하는 시험 겔들 중 어떠한 것에서도 분리되지 않았다. PEG 링커 및 DTAF-비오틴으로 개질된 올리고뉴클레오티드의 이동성은 DNA 그 자신에 의해서라기보다는 오히려 이들 기의 존재에 의해 대부분 결정되었다 (데이터는 예시되어 있지 않음). 라이게이션의 효율을 시험하기 위하여, 본 발명자는 모든 태그 및 3' 말단 올리고뉴클레오티드를 라이게이션하고, 생성된 작제물의 PCR 분석을 수행하여 라이게이션 효율을 확인하였다. 라이게이션 반응물 (70 ㎕)은 하기를 함유하였다: 2.5 μM의 HP-1-DTAF-비오틴; 2.5 μM의 각각의 어닐링된 이중 가닥 DNA 태그 (A1, B1 및 C1)과, 3' 말단 태그; 1x T4 DNA 리가제 완충액; 및 210 바이스 단위의 T4 DNA 리가제. 반응물을 16℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다.
반응 혼합물을 4% 아가로스 겔 상에 로딩하고, 형광 밴드를 겔로부터 추출하였다. 이 물질은 상기에 기술한 프라이머 5' 및 3'을 이용한 시험 24 사이클 PCR 증폭에 사용하였다. 그 결과가 도 13에 요약되어 있다.
단계 4: 스트렙타비딘 비드 상에서의 HP -1- DTAF -비오틴 의 정제 및 스트렙 타비딘과의 반응
스트렙타비딘 (SA) 다이날 자성 비드 M-280 (인비트로겐) 상에서의 HP-1-DTAF-비오틴의 정제는 화학적 DNA-태깅 라이브러리의 친화성 선별을 위한 모델로서의 역할을 하였다. SA 비드는 0.05% 트리톤 (Triton) X-100을 함유하는 2x PBS 완충액에서 사전 평형화하였다. 50 pmol의 HP-1-DTAF-비오틴을 텀블링하면서 실온에서 15분 동안 25 ㎕의 사전-세척 SA 비드 상에 로딩하였다. 통과물을 수집하고, 비드를 1 ml의 동일 완충액으로 30분 동안 3회 세척하였다. 최종 세척은 30 ㎕의 물을 이용하여 80℃에서 10분 동안 수행하였다 (수집함). 비드를 30 ㎕의 25 mM EDTA 및 5 mM NaOH를 이용하여 90℃에서 10분 동안 용출시키고, 용리액은 pH 7.0의 3 ㎕의 1 M 트리스 HCl의 첨가에 의해 즉각적으로 중화시켰다.
스트렙타비딘 결합 실험에 있어서, 5 ㎕의 용출 샘플을 pH 7.0의 50 mM NaCl/10 mM 트리스 HCl 중의 과량의 스트렙타비딘과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 비등 없이 겔-로딩 완충액과 혼합시키고, MES 러닝 완충액을 이용하여 4-12% SDS 누페이지 겔 (인비트로겐) 상에서 분리시켰다. 그 결과가 도 14에 요약되어 있다.
실시예 4. HP-1-DTAF에의 H(-Arg-εAhx)6-Arg-OH 펩티드의 커플링
본 발명자는 트리아진 스캐폴드 상의 마지막 반응기를 위한 또 다른 개질제로서 이용하기 위하여 아르기닌-풍부 펩티드 R7, H(-Arg-εAhx)6-Arg-OH (바켐 (Bachem))를 선택하였다. 이는 세포내 화합물 전달에 사용되는 아르기닌-아미노헥산산 세포막 투과성 펩티드였다. 반응물은 상기에 기술된 반응 조건과 유가하게 셋업하였다: 20 ㎕의 반응물은 pH 9.5의 150 mM 붕산염 완충액에 용해시킨 대략 200 pmol의 HP-1-DTAF (단계 1)와, 10 nmol의 R7 펩티드를 함유하였다. 이들 조건 하에서, 아르기닌의 측쇄는 반응하지 않으며, 펩티드 중의 유일한 반응성 아민은 N-말단이었다. 반응을 75℃에서 12시간 동안 진행시키고, 그 후 제바 스핀 컬럼 상에서의 탈염에 의해 정제하였다.
실시예 5. 세포내 T7 RNAP 전달 탐지 실험을 위한 DNA 작제물
화학적인 "1의 라이브러리"의 세포내 전달 실험에 사용한 DNA 작제물은 대략 400 bp의 VH DNA 단일 클론의 PCR 생성물로부터 제조하였는데, 상기 클론은 이 분자의 5' 말단의 T7 프로모터 영역 및 3' 말단에 가까운 짧은 항체 불변 Cmu 영역을 특징으로 하였다. 화학적 모델 라이브러리의 개질된 헤드피스에 상기 DNA 작제물을 연결시키기 위하여, BsmI 제한효소 부위를 상기 클론의 PCR 증폭에 의해 T7 프로모터 영역의 상류에 부가하였다. BsmI 제한효소 절단물은 3' GG 오버행을 생성하였으며, 이는 헤드피스 (3' CC 오버행)에의 라이게이션을 허용하였다. BsmI 부위를 갖는 5' 프라이머 (밑줄)는 아이디티 디엔에이, 인크.가 합성하였다.
Figure 112011070703980-pct00021
PCR 증폭 이후, DNA 작제물을 PCR 정제 키트 (인비트로겐)를 이용하여 정제하고, 생성된 DNA를 NEB 완충액 4에서 2시간 동안 65℃에서 250 U BsmI (뉴 잉글랜드 바이오랩스)을 이용하여 절단하였다. DNA를 2% 아가로스 겔 상에서 정제하였다. 라이게이션 반응물 (30 ㎕)은 BsmI로 절단한 2 pmol의 각각의 VH DNA 작제물을 함유하였으며, 이외에도 1x T4 DNA 리가제 완충액 및 60 바이스 단위의 T4 DNA 리가제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스) 중 HP-1-DTAF-R7 (아르기닌-아미노헥산산 펩티드)을 함유하였다. 반응물을 16℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 높은 라이게이션 효율로 인하여, 이 물질은 추가의 정제 없이 세포내 전달/T7 RNAP 실험에 또한 사용하였다. 그 결과가 도 15에 요약되어 있다.
실시예 6. 10x10 라이브러리의 합성
단계 1. 헤드피스 HP -T에의 태그 A의 라이게이션
이 예시적 라이브러리에서, 단지 위치 B 및 위치 C를 사용하였다. 하나의 태그 A를 HP-T에 라이게이션시켰다. 태그는 하기 서열을 가졌다:
DNA Tag A1 (상부):
Figure 112011070703980-pct00022
DNA Tag A1 (하부):
Figure 112011070703980-pct00023
30 nmol의 HP-T를 1x T4 DNA 리가제 완충액 중의 45 nmol의 각각의 태그 A1 상부 및 Tag A1 하부 올리고와 혼합하고, 95℃에서의 1분 동안의 가열, 이어서 0.2℃/초로 4℃로 냉각시킴에 의해 어닐링하였다. 그 후, 샘플을 16℃가 되게 하였다. 300 바이스 단위의 T4 DNA 리가제를 첨가하고, 샘플을 16℃에서 16-20시간 동안 인큐베이션하였다. 라이게이션 이후, HP-T-A를 제바 컬럼 (피어스)을 이용하여 탈염하였다. 예를 들어, 도 16a를 참조하라.
단계 2. 태그 B1-B12 및 C 태그의 라이게이션
12가지의 라이게이션 반응물을 상기에 기술한 라이게이션 반응물과 유사하게 셋업하였다. 12개의 튜브 각각에서, 5 nmol의 B1-B12 상부 및 하부 올리고의 쌍을 1x T4 DNA 리가제 완충액에 첨가하고, 상기에 기술한 바와 같이 어닐링하였다. HP-T-A를 1x T4 DNA 리가제 완충액 중에 용해시켰다. 2.5 nmol의 HP-T-A를 이들 12개의 튜브 내에 분취하였다. 30 바이스 단위의 T4 DNA 리가제를 각각의 튜브에 첨가하고, 반응을 16℃에서 20시간 동안 진행시켰다. 인큐베이션 이후, 각각의 반응 혼합물을 pH 9.0의 150 mM 붕산염 완충액으로 평형화한 0.5 ml 제바 스핀 컬럼 상에서 개별적으로 탈염하였다. 각각의 튜브에, 아세토니트릴 중에 용해시킨 20x 과량의 시아노우릭 클로라이드 (50 nmol)를 첨가하고, 4℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 이후, 아세토니트릴 또는 DMF 중에 용해시킨 100x 과량 (250 nmol, 즉, 시아노우릭 클로라이드에 대하여 5x 과량)의 아민 B1-B12를 라이게이션되는 B1-B12 태그에 상응하게 첨가하였다. 아민과의 반응을 4℃에서 20시간 동안 진행시켰다. 이 반응 이후, 라이브러리를 풀링하고, 2-ml 제바 컬럼 상에서 탈염하고, 동결건조시켰다. 도 16b 및 16c를 참조하라.
상기 반응과 같이, C 태그 및 아민을 상기에 기술한 것과 유사한 반응 조건을 이용하여 첨가하였다.
기타 실시양태
상기 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 개시된 방법 및 시스템의 다양한 변경 및 변화는 본 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않고서 당업계의 숙련자에게 자명할 것이다. 본 발명을 특정 실시양태와 관련하여 기술하였지만, 청구된 본 발명은 그러한 특정 실시양태에 부당하게 한정되어서는 안됨을 이해하여야 한다. 실제, 당업계의 숙련자에게 명백한, 본 발명을 실시하기 위한 기술된 모드의 다양한 변경은 본 발명의 범주 이내인 것으로 의도된다.
기타 실시양태가 특허청구범위에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> X-CHEM, INC. <120> METHODS OF CREATING AND SCREENING DNA-ENCODED LIBRARIES <130> 50719/002WO2 <140> PCT/US2010/024314 <141> 2010-02-16 <150> 61/152,508 <151> 2009-02-13 <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 cctccggaga 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 tccggaggac 10 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ccggcgccga 10 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 ggcgccggac 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 ccggtaccga 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA 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18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 gcactctacc tgcacagc 18

Claims (20)

  1. (a) 헤어핀 구조를 포함하는 개시 올리고뉴클레오티드를 포함하는 헤드피스(headpiece)의 5' 말단에서 상기 헤드피스에 2관능성 링커의 제1 관능기를 결합시키는 단계,
    (b) 상기 2관능성 링커의 제2 관능기를 제1 빌딩 블록에 결합시키는 단계,
    (c) 제2 빌딩 블록을 상기 제1 빌딩 블록과 반응시키는 단계, 및
    (d) 상기 헤드피스의 3' 말단에 상기 제2 빌딩 블록을 코딩하는 확인자 영역을 결합시키는 단계
    를 포함하며, 여기서 상기 (c) 단계는 유기 용매 중에서 수행되는 것인, DNA-코딩된 화학 라이브러리를 태깅(tagging)하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헤드피스가 확인자 영역을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, (b) 단계 후 (c) 단계 전에 상기 헤드피스의 3' 말단에 확인자 영역을 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 개질된 2관능성 링커가 알킬 사슬 또는 폴리에틸렌 글리콜 단위 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 헤드피스가 C5 위치에 지방족 사슬을 포함하는 T 또는 C 뉴클레오티드인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 헤드피스가 아조벤젠을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, (d) 단계의 상기 확인자 영역이 C5 위치에 지방족 사슬을 포함하는 T 또는 C 뉴클레오티드인 방법.
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