CN111675744B - 一种可溶于有机溶剂的dna编码化合物及其中间体化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可溶于有机溶剂的DNA编码化合物及其中间体化合物，它具有式I所示的通式，其中，X为原子或分子骨架；A1为包含有连接基团和寡核苷酸的部分；A2为包含有连接基团和寡核苷酸的部分；M1为包含一个或多个结构单元的功能部分；M2为包含一个或多个可以增加在有机溶剂中溶解度的部分。本发明DNA编码化合物以支链形式引入聚乙二醇，既可以在前期化学反应增加DNA编码化合物在有机溶剂中的溶解度，又可以在后期进行生物筛选时将聚乙二醇断裂掉，提高DNA编码化合物在水中的溶解度，利于DNA编码化合物与生物靶标结合。本发明提高了DNA编码化合物及中间体在有机溶剂中的溶解度，扩展了可适用于DNA编码化合物库合成的反应类型。
。
Description
技术领域
本发明涉及一种可溶于有机溶剂的DNA编码化合物及其中间体化合物。
背景技术
在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库合成技术，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库。而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别，大幅度地增加了化合物库的大小和合成效率，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在国外制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(Accounts of Chemical Research,2014,47,1247-1255)。
传统的DNA编码化合物库目前已应用于先导化合物的筛选，但是也存在一些局限：一般用于编码的DNA适用于水相反应，DNA编码化合物及中间体在纯有机溶剂中溶解度差，无法用于对水敏感的纯有机相化学反应，限制了可用于DNA编码化合物库的合成反应类型，降低了DNA编码化合物库中的分子多样性。
因此，需要开发一种新的DNA编码化合物库，提高DNA编码化合物及中间体在有机溶剂中的溶解度，扩展可适用于DNA编码化合物库合成的反应类型。专利CN107916456A公开了一种提高DNA编码化合物在有机条件下溶解度的方法，该方法是在小分子化合物和核酸之间插入聚乙二醇，这种方法能够大幅提高DNA编码化合物在有机条件下的溶解度。
但是，DNA编码化合物主要应用最终还是在水溶液中与生物靶标结合，进行后续生物筛选，如果DNA编码化合物在有机条件下的溶解度太大会导致其在水中溶解度太小或不溶，影响DNA编码化合物后续生物筛选。如果能够有一种DNA编码化合物在前期化学反应时在有机溶剂中的溶解度高，在后期生物筛选时在水中溶解度高，就能更加满足实际需求。而专利CN107916456A引入聚乙二醇在构建DNA编码化合物前，是作为化合物和核酸的连接，如果断裂会导致化合物和DNA编码断掉，因此在后续生物筛选中无法通过将聚乙二醇断裂提高DNA编码化合物在水中的溶解度。
研究一种DNA编码化合物在前期化学反应时在有机溶剂中的溶解度高，在后期生物筛选时在水中溶解度高，可以扩展DNA编码化合物的使用，对于DNA编码化合物的发展具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种可溶于有机溶剂的DNA编码化合物及其中间体化合物。
本发明提供了一种DNA编码化合物或中间体化合物，它具有式I所示的通式：
其中，X为原子或分子骨架；
A1为包含有连接基团和寡核苷酸的部分；
A2为包含有连接基团和寡核苷酸的部分；
M1为包含一个或多个结构单元的功能部分；
M2为包含一个或多个可以增加在有机溶剂中溶解度的部分。
进一步地，所述X为碳原子或多原子的分子骨架。
进一步地，所述多原子骨架为环装或非环状骨架结构。
进一步地，非环状骨架结构为
其中X1、X2、X3、X4分别独立的选自碳、氧、氮、硫。
进一步地，非环状骨架结构为
其中R1、R2分别独立选自三价原子或基团，T为连接多原子连接链。
进一步地，R1选自
T选自双官能团的亚烷基或双官能团的低聚二醇链基团，R2选自
进一步地，所述官能团选自羧基、氨基或醛基。
进一步地，非环状骨架结构具体选自
进一步地，M2中可以增加在有机溶剂中溶解度的部分可以通过物理、化学或者生物的方法进行断裂。
进一步地，所述式I通式具有式II所示的结构：
其中，Z1为在其3'末端与L1连接的寡核苷酸，Z2为在其5'末端与L2连接的寡核苷酸或者Z1为在其5'末端与L1连接的寡核苷酸，Z2为在其3'末端与L2连接的寡核苷酸；
L1为包含有能与Z1的3'末端或5'末端形成键的官能团的连接基团；
L2为包含有能与Z2的5'末端或3'末端形成键的官能团的连接基团；
Y1为功能部分；
Y2为可以增加在有机溶剂中溶解度的部分；
S1、S2各自独立地为连接基团。
进一步地，Z1与Z2互补形成双链。
进一步地，Z1与Z2长度相同或不同。
进一步地，Z1、Z2的长度分别为10个以上的碱基，且具有10个以上的碱基对互补区。
进一步地，Z1、Z2均包含PCR引物序列。
进一步地，L1、L2分别独立地选自双官能团的亚烷基或双官能团的低聚二醇链基团。
进一步地，L1、L2中的官能团选自磷酸基、氨基、羟基、羧基。
进一步地，L1、L2分别独立地选自
其中，n为1～10的整数。
进一步地，S1、S2分别独立地选自双官能团的亚烷基或双官能团的低聚二醇链基团。
进一步地，S1、S2中的官能团选自羧基、氨基、卤素或醛基。
进一步地，S1、S2选自
其中，m为1～10的整数。
进一步地，Y2包含可以增加在有机溶剂中溶解度的基团。
进一步地，Y2包含聚乙二醇基团。
进一步地，Y2中聚乙二醇基团的聚合度范围为10～2000。
进一步地，S2可以通过物理、化学或者生物的方法发生断裂。
进一步地，所述式I通式具有式III所示的结构：
其中，
L1、L2分别独立为连接基团；
R1为连接基团；
n为10～2000；
R为功能部分。
进一步地，所述式I通式具有式IV所示的结构：
其中，
L1、L2分别独立为连接基团；
M为可以通过物理、化学或者生物方法发生断裂的基团；
R1为连接基团；
n为10～2000；
R为功能部分。
进一步地，M通过物理、化学或者生物方法发生断裂时，不影响化合物中的其它部分。
本发明还提供了一种DNA编码化合物库，它是由前述的DNA编码化合物组成。
进一步地，DNA编码化合物库包含至少106种不同的DNA编码化合物。
进一步地，DNA编码化合物库包含至少108种不同的DNA编码化合物。
进一步地，DNA编码化合物库包含至少1010种不同的DNA编码化合物。
本发明式I所示或者其他的化合物中，寡核苷酸可以是任何适用于DNA编码化合物的寡核苷酸。
本发明用聚合物(如聚乙二醇、聚氨酯等)修饰的DNA化合物能够在非水溶剂中溶解，且在其有机溶剂中能够进行DNA上的反应。
本发明DNA编码化合物在合成DNA编码化合物时引入聚乙二醇链，该聚乙二醇链是作为支链引入的，这样聚乙二醇链在化合物中更加灵活，既可以在前期化学反应增加DNA编码化合物在有机溶剂中的溶解度，又可以在后期进行生物筛选时将聚乙二醇断裂掉，在不影响化合物其余部分的同时提高DNA编码化合物在水中的溶解度，利于DNA编码化合物与生物靶标结合。
本发明提高了DNA编码化合物及中间体在有机溶剂中的溶解度，扩展了可适用于DNA编码化合物库合成的反应类型。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为化合物1的LC-Ms谱图。
图2为化合物1的Ms谱图。
图3为化合物1的HPLC谱图。
图4为化合物2-1的LC-Ms谱图。
图5为化合物2-1的Ms谱图。
图6为化合物2-1的HPLC谱图。
图7为化合物2-2的LC-Ms谱图。
图8为化合物2-2的Ms谱图。
图9为化合物2-2的HPLC谱图。
图10为化合物3的LC-Ms谱图。
图11为化合物3的Ms谱图。
图12为化合物4-1的LC-Ms谱图。
图13为化合物4-1的Ms谱图。
图14为化合物4-1的HPLC谱图。
图15为化合物4-2的LC-Ms谱图。
图16为化合物4-2的Ms谱图。
图17为化合物4-2的HPLC谱图。
图18为化合物6的LC-Ms谱图。
图19为化合物6的Ms谱图。
图20为化合物6的HPLC谱图。
图21为化合物8的LC-Ms谱图。
图22为化合物8的Ms谱图。
图23为化合物8的HPLC谱图。
图24为化合物9的LC-Ms谱图。
图25为化合物9的Ms谱图。
图26为化合物9的HPLC谱图。
图27为化合物11的LC-Ms谱图。
图28为化合物11的Ms谱图。
图29为化合物11的HPLC谱图。
图30为化合物12的LC-Ms谱图。
图31为化合物12的Ms谱图。
图32为化合物12的HPLC谱图。
图33为化合物1在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱。
图34为化合物2-1在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱。
图35为化合物2-2在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱。
图36为化合物3在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱。
图37为化合物4-1在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱。
图38为化合物4-2在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱。
图39为光切断反应0min的LC-Ms谱图。
图40为光切断反应40min的LC-Ms谱图。
图41为光切断反应120min的LC-Ms谱图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
1、缩写：Fmoc表示芴甲氧羰基；DMF表示N,N-二甲基甲酰胺；DMSO表示二甲基亚砜；DMT-MM表示2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪；TEAA表示乙酸三乙胺；DIPEA表示N,N-二异丙基乙胺；Boc表示叔丁氧羰基；DMA表示N,N-二甲基乙酰胺；HATU表示2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
2、下述的DNA接头序列(HUB)：
其中，A为腺嘌呤，T为胸腺嘧啶，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤。
DNA上进行的化学反应或DNA酶连接反应的后处理操作：
操作方式一：在DNA上进行的化学反应或DNA酶连接反应的反应液中加入10％反应液体积的5M NaCl水溶液及2-3倍体积的乙醇。涡旋震荡后，将溶液置于-20℃冰箱冷冻1小时。冷冻后的溶液经高速离心沉淀后，去除上层清液，得到DNA样品。
操作方式二：将DNA上进行的化学反应或DNA酶连接反应的反应液进行浓缩后，再经HPLC纯化，得到DNA样品。
实施例1、本发明DNA编码化合物的合成
步骤1：化合物1的合成
将10μmol HUB溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的起始溶液；然后将AOP-Boc的DMA溶液(15μmol,浓度10mM)、HATU的DMA溶液(15μmol,浓度20mM)和DIPEA的DMA溶液(15μmol,浓度20mM)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后静置保存10分钟。将上述混合液加入到化合物HUB起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温震荡反应2-4小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，LCMS监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到化合物1(7.5μmol，产率75％，MS＝5354.9，纯度76.2％)。化合物1的LC-Ms谱图如图1所示，化合物1的Ms谱图如图2所示，化合物1的HPLC谱图如图3所示。
步骤2：化合物2的合成
将1μmol化合物1溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的溶液，再加入mPEG-SCM-5K(mPEG-SCM的分子量为5K)的DMA溶液(10μmol，浓度50mM)，涡旋振荡充分混匀后，在25-30℃下震荡反应2-6小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到mPEG-5K修饰的分子量约10K道尔顿的化合物2-1(HUB-1AOP-PEG-5K，0.60μmol，产率60％，Ms＝9966～10627，纯度＝97.3％)。化合物2-1的LC-Ms谱图如图4所示，化合物2-1的Ms谱图如图5所示，化合物2-1的HPLC谱图如图6所示。
将1μmol化合物1溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的溶液，再加入mPEG-SCM-10K(mPEG-SCM的分子量为10K)的DMA溶液(10μmol，浓度25mM)，涡旋振荡充分混匀后，在25-30℃下震荡反应2-6小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到mPEG-10K修饰的分子量约15K道尔顿的化合物2-2(HUB-1AOP-PEG-10K，0.54μmol，产率54％，Ms＝15211～15920，纯度＝97.4％)。化合物2-2的LC-Ms谱图如图7所示，化合物2-2的Ms谱图如图8所示，化合物2-2的HPLC谱图如图9所示。
步骤3：化合物3的合成
将5μmol化合物1溶于水中，配制成1mM浓度的溶液，然后分别加入核酸片段1(2014.7μL，2.72mM)和编码序列1(5130.2μL，1.175mM)，最后加入DNA连接酶(401.7μL，6.82mM)、缓冲溶液(4384.0μL，10mM)和水(5489.3μL)的混合物10275.0μL，涡旋震荡充分混匀后，在20℃下反应16小时后，取样做检测，反应完全后按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到化合物3(P1-C1-HUB-1AOP，3μmol,产率60％，Ms＝20869,纯度＝88.0％)。化合物3的LC-Ms谱图如图10所示，化合物3的Ms谱图如图11所示。
步骤3在化合物1中引入核酸片段、编码序列1是为了研究DNA序列的长短对化合物是否有影响。
步骤4：化合物4的合成
将1μmol化合物3溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的溶液，再加入mPEG-SCM-5K(mPEG-SCM的分子量为5K)的DMA溶液(20μmol，浓度50mM)，涡旋振荡充分混匀后，在25-30℃下震荡反应2-6小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到mPEG-5K修饰的分子量约25K道尔顿的化合物4-1(P1-C1-HUB-1AOP-PEG-5K，0.57μmol，产率57％，Ms＝25610-26230，纯度＝98.8％)。化合物4-1的LC-Ms谱图如图12所示，化合物4-1的Ms谱图如图13所示，化合物4-1的HPLC谱图如图14所示。
将1μmol化合物3溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的溶液，再加入mPEG-SCM-10K(mPEG-SCM的分子量为10K)的DMA溶液(20μmol，浓度25mM)，涡旋振荡充分混匀后，在25-30℃下震荡反应2-6小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到mPEG-10K修饰的分子量约30K道尔顿的化合物4-2(P1-C1-HUB-1AOP-PEG-10K，0.62μmol，产率62％，Ms＝31020-31680，纯度＝95.9％)。化合物4-2的LC-Ms谱图如图15所示，化合物4-2的Ms谱图如图16所示，化合物4-2的HPLC谱图如图17所示。
步骤5：化合物5的合成
将0.5μmol化合物1溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的起始溶液；然后将photocleavable linker的DMA溶液(12.5μmol,浓度200mM)、HATU的DMA溶液(12.5μmol,浓度400mM)和DIPEA的DMA溶液(12.5μmol,浓度400mM)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后静置保存10分钟。将上述混合液加入到化合物1起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温震荡反应2-4小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，LCMS监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式一进行后处理，处理得到的化合物用500μL水溶解，再加入50μL的哌啶，所得混合物在室温下震荡反应2小时后按照前述后处理操作方式之一得到化合物5(0.4μmol，产率＝80％)。
步骤6：化合物6的合成
将1μmol化合物5溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的溶液，再加入mPEG-SCM-5K(mPEG-SCM的分子量为5K)的DMA溶液(20μmol，浓度50mM)，涡旋振荡充分混匀后，在25-30℃下震荡反应2-6小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到mPEG-5K修饰的分子量约10.6K道尔顿的化合物6(0.4μmol，产率45％，Ms＝10203-10952,纯度＝82.7％)。化合物6的LC-Ms谱图如图18所示，化合物6的Ms谱图如图19所示，化合物6的HPLC谱图如图20所示。
步骤7：化合物7的合成
将5μmol HUB溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的起始溶液；然后将3-乙酰基苯甲酸的DMA溶液(7.5μmol,浓度10mM)、HATU的DMA溶液(7.5μmol,浓度20mM)和DIPEA的DMA溶液(7.5μmol,浓度20mM)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后静置保存10分钟。将上述混合液加入到化合物HUB起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温震荡反应2-4小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，LCMS监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到化合物7(1.6μmol,产率32％)。
步骤8：化合物8的合成
将0.15μmol化合物7溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的起始溶液；然后将苯甲酸的DMA溶液(7.5μmol,浓度200mM)、HATU的DMA溶液(7.5μmol,浓度400mM)和DIPEA的DMA溶液(7.5μmol,浓度400mM)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后静置保存10分钟。将上述混合液加入到化合物7起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温震荡反应2-4小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，LCMS监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到化合物8(0.12μmol,产率80％，Ms＝5257.8,纯度＝80.6％)。化合物8的LC-Ms谱图如图21所示，化合物8的Ms谱图如图22所示，化合物8的HPLC谱图如图23所示。
步骤9：化合物9的合成
将0.5μmol化合物7溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的溶液，再加入mPEG-SCM-5K(mPEG-SCM的分子量为5K)的DMA溶液(10μmol，浓度50mM)，涡旋振荡充分混匀后，在25-30℃下震荡反应2-6小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，监测反应。反应完全后，按照前述后操作方式之一进行后处理，得到mPEG-5K修饰的分子量约10K道尔顿的化合物9(0.20μmol，产率40％，Ms＝9719-10734,纯度＝98.5％)。化合物9的LC-Ms谱图如图24所示，化合物9的Ms谱图如图25所示，化合物9的HPLC谱图如图26所示。
步骤10：化合物10的合成
将5μmol HUB溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的起始溶液；然后将对醛基苯甲酸的DMA溶液(7.5μmol,浓度10mM)、HATU的DMA溶液(7.5μmol,浓度20mM)和DIPEA的DMA溶液(7.5μmol,浓度20mM)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后静置保存10分钟。将上述混合液加入到化合物HUB起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温震荡反应2-4小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，LCMS监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到化合物10(2.0μmol，产率＝40％)。
步骤11：化合物11的合成
将0.15μmol化合物10溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，配制成1mM浓度的起始溶液；然后将苯甲酸的DMA溶液(7.5μmol,浓度200mM)、HATU的DMA溶液(7.5μmol,浓度400mM)和DIPEA的DMA溶液(7.5μmol,浓度400mM)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合，将该混合液涡旋振荡充分混匀，然后静置保存10分钟。将上述混合液加入到化合物10起始溶液中，涡旋振荡充分混匀后，室温震荡反应2-4小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，LCMS监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到化合物11(0.10μmol，产率66％，Ms＝5243.9,纯度＝76.6％)。化合物11的LC-Ms谱图如图27所示，化合物11的Ms谱图如图28所示，化合物11的HPLC谱图如图29所示。
步骤12：化合物12的合成
将0.5μmol化合物10溶于0.25M的硼酸钠缓冲液(pH＝9.4)中，，配制成1mM浓度的溶液，再加入mPEG-SCM-5K(mPEG-SCM的分子量为5K)的DMA溶液(10μmol，浓度50mM)，涡旋振荡充分混匀后，在25-30℃下震荡反应2-6小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释，监测反应。反应完全后，按照前述后处理操作方式之一进行后处理，得到mPEG-5K修饰的分子量约10K道尔顿的化合物12(0.20μmol,产率40％，Ms＝9706-10631,纯度＝98.2％)。化合物12的LC-Ms谱图如图30所示，化合物12的Ms谱图如图31所示，化合物12的HPLC谱图如图32所示。
实施例2、本发明DNA编码化合物的溶解度实验
步骤1：用实施例1制备的化合物1、化合物2-1、化合物2-2、化合物3、化合物4-1和化合物4-2进行如下溶解度测试：
1)称取50nmol的化合物1、化合物2-1，化合物2-2，化合物3、化合物4-1和化合物4-2于离心管中，完全冻干后，分别加入50μl的不同溶剂(正庚烷、二氯乙烷、四氢呋喃、二氧六环、叔丁醇、乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、水)振荡10min使充分溶解；
2)将上述离心管进行9000转高速离心后取2μl上清液；溶解至98μl去离子水溶液中，再使用Nanophotometer定量仪进行浓度定量；
3)根据定量结果得到化合物1、化合物2-1，化合物2-2，化合物3、化合物4-1和化合物4-2在不同溶剂中的紫外可见光吸收光谱，根据谱图(图33～图38)得到在不同溶剂中的溶解度数值，结果如表1所示。
表1.本发明化合物在不同溶剂中的溶解度
上述结果表明，PEG修饰的DNA能够显著改善DNA编码化合物在有机溶剂中的溶解度情况，增加DNA编码化合物在有机溶剂中的溶解，且溶解度改善情况与PEG链长和DNA链长有直接关系，更长链长的DNA应该使用更长链长的PEG以改善其在有机溶剂中的溶解度。
实施例3、光切断反应
将35nmol的化合物6溶于70μl PBS缓冲溶液中(pH＝5.3)中，置于365nm波长，能量1000焦的光照下，0℃条件下反应40-120min，分别于0min，40min，80min和120min取样送Ms观察反应，得各组分所占结果如下表2。图39、40和41分别为光切断反应0min、40min和120min的LC-Ms谱图。
表2.光切断反应实验结果
上述结果表明，在DNA和PEG之间引入的linker是可切断linker，可以使用适当的方法将PEG切割下来。且不会破坏DNA编码化合物的结构。本发明DNA编码化合物既可以在前期化学反应中溶于有机溶液，参与纯有机相化学反应，又可以在后期断掉PEG，增加DNA编码化合物在水中的溶解度，利于其与生物靶标结合，扩展DNA编码化合物的使用。
实施例4、本发明DNA编码化合物的化学反应(有机相中酮的还原胺化)
步骤一：醛的还原胺化实验：
总反应路线：
(1)将10nmol化合物11溶解至10μl的MES缓冲溶液中(0.5M,pH＝5.0)，配制成1mM浓度的溶液，然后加入100eq的胺试剂溶液(3.3μl，溶剂为乙腈/H2O＝1/1,浓度为0.3M)，振荡3min后静置活化30min，然后加入100eq的氰基硼氢化钠溶液(3.3μl，溶剂为乙腈/H2O＝1/1,浓度为0.3M)，振荡5min后置于60℃下反应20小时。取2μl溶液送LCMS检测得到反应结果。所得产物的收率根据胺试剂不同而不同，具体见表3中entry1(表3中反应溶剂组成为最终溶剂，乙腈/H2O的最终浓度比为1/4)。
(2)将10nmol化合物12溶解至10μl的1,2-二氯乙烷溶液中，然后加入100eq的胺试剂溶液(3.3μl，溶剂为1,2-二氯乙烷，浓度为0.3M)振荡3min后静置活化30min，然后加入100eq的氰基硼氢化钠溶液(3.3μl，溶剂为二甲基亚砜,浓度为0.3M)，振荡5min后置于60℃下反应20小时。取2μl溶液送LCMS检测得到反应结果。所得产物的收率根据胺试剂不同而不同，具体见表3中entry2(表3中反应溶剂组成为最终溶剂，二氯乙烷/二甲基亚砜的最终浓度比为4/1)。
(3)将10nmol化合物12溶解至10μl的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，然后加入100eq的胺试剂溶液(3.3μl，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，浓度为0.3M)振荡3min后静置活化30min，然后加入100eq的氰基硼氢化钠溶液(3.3μl，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺,浓度为0.3M)，振荡5min后置于60℃下反应20小时。取2μl溶液送LCMS检测得到反应结果。所得产物的收率根据胺试剂不同而不同，具体见表3中entry3。
(4)将10nmol化合物12溶解至10μl的MES缓冲溶液中(0.5M,pH＝5.0)，然后加入100eq的胺试剂溶液(3.3μl，溶剂为乙腈/H2O＝1/1,浓度为0.3M)，振荡3min后静置活化30min，然后加入100eq的氰基硼氢化钠溶液(3.3μl，溶剂为乙腈/H2O＝1/1,浓度为0.3M)，振荡5min后置于60℃下反应20小时。取2μl溶液送LCMS检测得到反应结果。所得产物的收率根据胺试剂不同而不同，具体见表3中entry4(表3中反应溶剂组成为最终溶剂，乙腈/H2O的最终浓度比为1/4)。
表3.醛的还原胺化反应实验结果
步骤二：酮的还原胺化实验：
总反应路线：
(1)将10nmol化合物8溶解至10μl的MES缓冲溶液中(0.5M,pH＝5.0)，配制成1mM浓度的溶液，然后加入100eq的胺试剂溶液(3.3μl，溶剂为乙腈/H2O＝1/1,浓度为0.3M)，振荡3min后静置活化30min，然后加入100eq的氰基硼氢化钠溶液(3.3μl，溶剂为乙腈/H2O＝1/1,浓度为0.3M)，振荡5min后置于60℃下反应20小时。取2μl溶液送LCMS检测得到反应结果。所得产物的收率根据胺试剂不同而不同，具体见表4中entry1(表4中反应溶剂组成为最终溶剂，乙腈/H2O的最终浓度比为1/4)。
(2)将10nmol化合物9溶解至10μl的1,2-二氯乙烷溶液中，然后加入100eq的胺试剂溶液(3.3μl，溶剂为1,2-二氯乙烷，浓度为0.3M)振荡3min后静置活化30min，然后加入100eq的氰基硼氢化钠溶液(3.3μl，溶剂为二甲基亚砜,浓度为0.3M)，振荡5min后置于60℃下反应20小时。取2μl溶液送LCMS检测得到反应结果。所得产物的收率根据胺试剂不同而不同，具体见表4中entry2(表4中反应溶剂组成为最终溶剂，二氯乙烷/二甲基亚砜的最终浓度比为4/1)。
(3)将10nmol化合物9溶解至10μl的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，然后加入100eq的胺试剂溶液(3.3μl，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，浓度为0.3M)振荡3min后静置活化30min，然后加入100eq的氰基硼氢化钠溶液(3.3μl，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺,浓度为0.3M)，振荡5min后置于60℃下反应20小时。取2ul溶液送LCMS检测得到反应结果。所得产物的收率根据胺试剂不同而不同，具体见表4中entry3。
(4)将10nmol化合物9溶解至10μl的MES缓冲溶液中(0.5M,pH＝5.0)，然后加入100eq的胺试剂溶液(3.3μl，溶剂为乙腈/H2O＝1/1,浓度为0.3M)，振荡3min后静置活化30min，然后加入100eq的氰基硼氢化钠溶液(3.3μl，溶剂为乙腈/H2O＝1/1,溶剂为0.3M)，振荡5min后置于60℃下反应20小时。取2μl溶液送LCMS检测得到反应结果。所得产物的收率根据胺试剂不同而不同，具体见表4中entry4。(表4中反应溶剂组成为最终溶剂，乙腈/H2O的最终浓度比为1/4)。
表4.DNA上酮的还原胺化反应实验结果
通过化合物8、化合物9、化合物11以及化合物12在不同溶剂下的还原胺化反应收率对比可知：
(1)PEG修饰的DNA编码化合物可以在有机溶剂中正常进行反应。
(2)醛的还原胺化实验中PEG修饰的DNA编码化合物在有机溶剂中的反应收率与正常DNA编码化合物在水相中反应结果相当，而酮的还原胺化实验中PEG修饰的DNA编码化合物在有机溶剂中的反应收率比正常DNA编码化合物在水相中反应结果明显更好。
(3)醛的还原胺化实验中PEG修饰的DNA编码化合物在水相中的反应收率与正常DNA编码化合物在水相中反应结果相当，而酮的还原胺化实验中PEG修饰的DNA编码化合物在水相中的反应收率比正常DNA编码化合物在水相中反应结果更好。这可能与PEG的胶束或表面活性性质相关。
上述实验表明，具有式I所示结构的DNA编码化合物或中间体化合物(式I中X为原子或分子骨架；A1为包含有连接基团和寡核苷酸的部分；A2为包含有连接基团和寡核苷酸的部分；M1为包含一个或多个结构单元的功能部分；M2为包含一个或多个可以增加在有机溶剂中溶解度的部分，如聚乙二醇等)能够使用传统有机溶剂作为反应溶剂正常反应。特别是PEG修饰的DNA编码化合物不仅能够在传统有机溶剂中反应，在水相中也能反应。这对于DNA上对水敏感的有机反应的开发具有重要的意义。
综上，本发明用聚合物(如聚乙二醇、聚氨酯等)修饰的DNA化合物，能够在非水溶剂中溶解，且在其有机溶剂中能够进行DNA上的反应。本发明DNA编码化合物在合成DNA编码化合物时引入聚乙二醇链，该聚乙二醇链是作为支链引入的，这样聚乙二醇链在化合物中更加灵活，既可以在前期化学反应增加DNA编码化合物在有机溶剂中的溶解度，又可以在后期进行生物筛选时将聚乙二醇断裂掉，在不影响化合物其余部分的同时提高DNA编码化合物在水中的溶解度，利于DNA编码化合物与生物靶标结合。本发明提高了DNA编码化合物及中间体在有机溶剂中的溶解度，扩展了可适用于DNA编码化合物库合成的反应类型。
Claims (23)
1.一种DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：具有式II所示的结构：
其中，X为原子或分子骨架；
Z1为在其3'末端与L1连接的寡核苷酸，Z2为在其5'末端与L2连接的寡核苷酸或者Z1为在其5'末端与L1连接的寡核苷酸，Z2为在其3'末端与L2连接的寡核苷酸；
L1为包含有能与Z1的3'末端或5'末端形成键的官能团的连接基团；
L2为包含有能与Z2的5'末端或3'末端形成键的官能团的连接基团；
Y1为功能部分；
Y2为可以增加在有机溶剂中溶解度的部分，包含聚乙二醇基团；
S1、S2各自独立地为连接基团。
2.根据权利要求1所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：所述X为碳原子或多原子的分子骨架。
3.根据权利要求2所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：所述多原子骨架为环状或非环状骨架结构。
4.根据权利要求3所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：非环状骨架结构为
其中X1、X2、X3、X4分别独立的选自碳、氧、氮、硫。
5.根据权利要求1所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：Z1与Z2互补形成双链。
6.根据权利要求1所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：Z1与Z2长度相同或不同。
7.根据权利要求5或6所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：Z1、Z2的长度分别为10个以上的碱基，且具有10个以上的碱基对互补区。
8.根据权利要求1所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：Z1、Z2均包含PCR引物序列。
9.根据权利要求1所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：L1、L2分别独立地选自双官能团的亚烷基或双官能团的低聚二醇链基团。
10.根据权利要求9所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：L1、L2中的官能团选自磷酸基、氨基、羟基、羧基。
11.根据权利要求10所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：L1、L2分别独立地选自
其中，n为1～10的整数。
12.根据权利要求1所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：S1、S2分别独立地选自双官能团的亚烷基或双官能团的低聚二醇链基团。
13.根据权利要求12所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：S1、S2中的官能团选自羧基、氨基、卤素或醛基。
14.根据权利要求13所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：S1、S2选自
其中，m为1～10的整数。
15.根据权利要求1所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：Y2中聚乙二醇基团的聚合度范围为10～2000。
16.根据权利要求1所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：S2可以通过物理、化学或者生物的方法发生断裂。
17.根据权利要求1所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：具有式III所示的结构：
其中，
L1、L2分别独立为连接基团；
R1为连接基团；
n为10～2000；
R为功能部分。
18.根据权利要求1所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：具有式IV所示的结构：
其中，
L1、L2分别独立为连接基团；
M为可以通过物理、化学或者生物方法发生断裂的基团；
R1为连接基团；
n为10～2000；
R为功能部分。
19.根据权利要求18所述的DNA编码化合物或中间体化合物，其特征在于：M通过物理、化学或者生物方法发生断裂时，不影响化合物中的其它部分。
20.一种DNA编码化合物库，其特征在于：它是由权利要求1～19任一项所述的DNA编码化合物组成。
21.根据权利要求20所述的DNA编码化合物库，其特征在于：DNA编码化合物库包含至少106种不同的DNA编码化合物。
22.根据权利要求20所述的DNA编码化合物库，其特征在于：DNA编码化合物库包含至少108种不同的DNA编码化合物。
23.根据权利要求20所述的DNA编码化合物库，其特征在于：DNA编码化合物库包含至少1010种不同的DNA编码化合物。
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