CN113636931B - 基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上的应用，普适性好、条件较温和、操作方便、收率高，适用于多孔板进行的基因编码化合物库的合成，增加了基因编码化合物库中寡聚核酸与含有游离氨基类小分子化合物反应的底物类型，扩大了基因编码化合物库的多样性。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上的应用。
背景技术
任何一种药物的开发都是一个漫长且耗资巨大的过程。据药物研发的统计资料报道，一种新药从开始研发到最终批准投放市场，平均需10年的时间，研究费用更是高达～26亿美元。药物的研制历程之所以这样漫长，费用高昂，其中很重要的一个原因是先导化合物的发现与优化过程缓慢[1]。基于化学结构的药物设计(Structure-based drug design，简称 SBDD)：根据目标蛋白质的3D结构特征，依赖于计算机算法指导小分子化合物结构设计与筛选，是发现先导化合物的一个重要途经[2]。基于有机化合物分子片段的筛选方法(Fragment screen)以及其筛选出先导化合物的方法(Fragment based lead generation，简称FBLG)：通常对几千个小分子量(<200Da)的化合物组，在高浓度下进行筛选。这些基于小分子片段进行的筛选方法是早期发现活性化合物的有效途经[3]。在新型药物的研发过程中，科学家们不断地寻求更多有效的筛选方法，以便在许多化合物中通过对生物学靶标的结合亲和力和/或药理学效力以无差异性的筛选方式找到优异的活性化合物。高度自动化以及深度优化后的多种高通量筛选法在活性化合物的筛选与发现中的重要作用是无可争议的。经过许多年的应用、发展与完善，高通量筛选已经建立起了高度自动化、完善的筛选流程、以及与之相伴的提升的化学分子库质量和增长的化合物数量，是国际上主流的药物研发公司获得目标蛋白的先导化合物的重要途经。但是，高成本导致了化学结构及化合物总数上的局限性，以至于传统的药物研发方法越来越不能满足新药研发的需求。在很多疾病蛋白的筛选实践中用这种传统方法是徒劳无功的。为了能突破高通量筛选方法的瓶颈，使筛选的化合物在化学结构空间及数量上能呈现几何级数上的飞跃，及使用一种全新的生物筛选模式，基因编码库技术(DELT)应运而生。DELT正在改变药物发现研究领域里的游戏规则。Brenner和Lerner于1992年提出 DELT的原创理论并预见了它能够使用比传统方法更快捷的方式来合成和筛选数量庞大的基因编码化合物库[4]。
与传统高通量筛选相比，基因编码化合物库极大地增加了化合物的数量和多样性[5]。在很小的体积例如几十微升的反应管中，通过一系列反应，可以合成上千万甚至上亿种不同的化合物[6]。DELT的原理是用不同特定序列的基因片段来标记反应过程中的每一个小分子化合物，用组合化学的策略，通过使用拆分、合并(split and pool)的方法，利用有限的成本和时间，大量合成百万级至百亿级连接有特定基因序列的化合物文库[7]。然后将所得化合物的混合物与蛋白质靶标一起孵育，通过洗去没有与蛋白质靶标结合的化合物而达到物理分离并找到具有高结合亲和力的化合物[8]。孵育靶标蛋白质所需的基因编码化合物库只需极其小的剂量规模(微克) 而且可以在很短时间内(比如1天内)进行。可以轻松地在不同条件下[9](例如，溶液的酸碱度、样品蛋白混合方式、蛋白质浓度、存在或不存在竞争化合物、存在不同的缓冲液或辅助因子)进行多项筛选实验。由于基因序列与化合物结构一一对应，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)扩增和下一代测序(Next Generation Sequencing，简称NGS)读取后，就可以通过基因序列解码得到活性化合物的化学结构式。然后对具有高结合亲和力化合物进行“脱离基因”的单独合成，并测定没有附着基因的化合物与目标蛋白质的结合力以确认其生物活性。
先导化合物的发现是新药研发的重要步骤，高起点的先导化合物是新药研发成功的关键因素之一。基因编码化合物库是诸多先导化合物筛选方法中引人注目的方法之一[10]。它以传统方法无可比拟的化合物数量、化学结构多样性以及对生物目标蛋白独特的结合方式脱颖而出。最近二十年来在新药研发领域取得的进展已将DELT转变为大多数制药公司新药研发产品的强大工具[11-12]。它不仅能为传统的生物学靶标蛋白寻找新的配体，而且能为困扰药物学家的新颖靶标蛋白以及用传统方法无法找到亲和物的疾病蛋白筛选到配体。因此，DELT将有助于找到药物化学研究的重要起点-先导化合物。尽管如此，DELT面对的挑战仍然是如何拓展文库小分子的化学空间以及优化其物理化学性质[13-15]和卓越的生物筛选方法。
最近几年在这一领域里出现的在活细胞上的生物筛选方法，是一个引人注目的成就[16]。在活细胞上的筛选将不再需要纯化过的靶标蛋白，也无需对蛋白进行修饰，更好地保持了蛋白的原生态结构，而且可以直接找到有细胞活性的先导化合物。这样，药物学家能够在此平台上找到更好的先导化合物[17-18]。
在基因编码化合物库的合成中，将基因片段末端与目标化合物库相连是最开始也是关键的步骤之一。目前最常用的方法是通过基因末端的氨基与小分子羧酸缩合形成酰胺键来链接，此方法适用性较好，但不适用于与含有游离氨基类小分子化合物的链接[19]。
上式是DELT文献中常用的链接方式。
通过基因末端羧基与含有游离氨基类小分子化合物进行反向缩合形成酰胺键的方法也有报道(如上式所示)。但是这种方法普适性不好，因其能够导致在接下来的酰胺反应中发生分子内环化副反应、并使得产物稳定性不好。这种链接方式导致反应收率普遍偏低，因此只有有限的应用[20]。
上式展示了本发明中提出的基因编码化合物库起始头片段化合物与含有游离氨基类小分子化合物的链接方式。
为解决以上问题，得到一种普适性较好的能够使基因末端与含有游离氨基类小分子化合物结合的合成新方法，我们研究并开发了基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上与含有游离氨基类小分子化合物合成的应用。该基因编码化合物库起始头片段化合物相比于传统的羧酸起始头片段有着明显的优势[19]：1)新颖的链接方式而引导出新的产物的化学空间；2)增加了底物分子的多样性；3)化学文库的分子量更小；4)更高的化学文库稳定性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供基因编码化合物库起始头片段化合物及其在基因编码化合物库合成上的应用。其特征在于，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接得到寡聚核酸链接化合物，然后在硼酸钠无机盐缓冲液存在下与含有游离氨基类小分子化合物反应得到基因编码化合物。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
在第一方面，本申请提供基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的制备方法，具体反应方程式如下：
其中，所述基因编码化合物库起始头片段化合物的结构通式如下：
其中，在基因编码化合物库起始头片段化合物的结构通式中，Y包括羧酸类，2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类；X包括对甲苯磺酰基(OTs)、溴；n＝3、4；m＝1、2、3、4；在一个优选的实施方案中，Y为2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类，X是对甲苯磺酰基(OTs)，n＝3；m＝1。
其中，羧酸类基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸的链接是通过酰胺偶联反应实现的，包括：将寡聚核酸溶于硼酸钠缓冲溶液，并依次将羧酸类基因编码化合物库起始头片段化合物溶液、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯溶液、N,N-二异丙基乙胺溶液，加入到寡聚核酸溶液中，在室温下反应至反应结束；
优选地，将10纳摩尔寡聚核酸溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.5， 250毫摩尔/升)，将80摩尔当量的羧酸类基因编码化合物库起始头片段化合物溶液(80毫摩尔/升，寡聚核酸的80摩尔当量)在室温下加入到寡聚核酸溶液中，并加入50摩尔当量2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(50毫摩尔/升，寡聚核酸的50摩尔当量)及200摩尔当量 N,N-二异丙基乙胺(200毫摩尔/升，寡聚核酸的200摩尔当量)，在室温下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入4微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，100微升无水乙醇，震荡混匀。放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟后，高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到羧酸类基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物。
羧酸类基因编码化合物库起始头片段化合物结构如下：
和/或，2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸的链接是通过亲核取代反应实现的，包括：将寡聚核酸溶于硼酸钠缓冲溶液，并将2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物溶液加入到寡聚核酸溶液中，在室温下反应至反应结束；
优选地，将10纳摩尔寡聚核酸溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.5， 250毫摩尔/升)，将10摩尔当量的2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物溶液(10毫摩尔/升，寡聚核酸的10摩尔当量)加入到寡聚核酸溶液中，在室温下，反应1～2小时。反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀。放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟，高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物。
2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物结构如下：
其中，所述寡聚核酸是由经人工修饰的和/或未修饰的寡核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡聚核酸链，其中一种寡聚核酸结构如下：
在第二方面，本申请提供一种基因编码化合物的制备方法，其特征在于，与寡聚核酸链接的基因编码化合物库起始头片段化合物与含有游离氨基类小分子化合物反应得到基因编码化合物。
优选地，将摩尔浓度为0.1～2毫摩尔/升的寡聚核酸链接化合物、5～ 500摩尔当量的含有游离氨基类小分子化合物及反应溶剂混合，在0～90℃下反应1～24小时直至反应结束，具体反应方程式如下：
其中，所述含有游离氨基类小分子化合物的结构式为R1-NH-R2，可以是一级或二级胺类化合物，包括芳香类、脂肪类、碳环类化合物以及含有杂原子的环类化合物、氨基酸类化合物以及带有其他保护基团的游离氨基类化合物，R1、R2可任选地为羧酸、氢、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1-C12烷基、C1-C6烯烃基、C1-C6炔烃基、C3-C8环烷基、C1-C6烷基氧、芳基、杂环芳基中的任意一种至多种或它们的任意组合。
在一个实施方案中，所述基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的摩尔浓度是0.1～2毫摩尔/升；在一个优选的实施方案中，所述基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的摩尔浓度为0.5～1.5毫摩尔/升；在一个更优选的实施方案中，所述基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的摩尔浓度为1.0毫摩尔/升。
在一个实施方案中，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的结构式中，X包括对甲苯磺酰基(OTs)、溴，n＝3、4，m＝ 1、2、3、4；在一个优选的实施方案中，X为对甲苯磺酰基(OTs)，n＝3， m＝1、3；在一个更优选的实施方案中，X为对甲苯磺酰基(OTs)，n＝3， m＝1。
在一个实施方案中，所述含有游离氨基类小分子化合物摩尔当量为寡聚核酸的5～500摩尔当量；在一个优选的实施方案中，所述含有游离氨基类小分子化合物的摩尔当量为寡聚核酸的100～300摩尔当量；在一个更优选的实施方案中，所述含有游离氨基类小分子化合物的摩尔当量为寡聚核酸的200摩尔当量。
在一个实施方案中，所述反应溶剂是含水、乙腈、甲醇、乙醇、叔丁醇、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、无机盐缓冲液(硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐)、有机碱缓冲液(三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、三羟甲基氨基甲烷)中的任意一种或几种的混合溶剂；在一个优选的实施方案中，所述反应溶剂是无机盐缓冲液及乙腈的混合溶液；在一个更优选的实施方案中，所述反应溶剂是pH＝12.5的硼酸钠缓冲溶液及乙腈的混合溶液，且缓冲液总含量不低于20％。
在一个实施方案中，所述反应温度为0～90℃；在一个优选的实施方案中，所述反应温度为50～80℃；在一个更优选的实施方案中，所述反应温度为70℃。
在一个实施方案中，所述反应时间为0～24小时；在一个优选的实施方案中，所述反应时间为1～8小时；在一个更优选的实施方案中，所述反应时间为4小时。
本发明提供了基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的制备方法及进一步与含有游离氨基类小分子化合物反应的方法，扩大了基因编码化合物库中直接与含有游离氨基类小分子化合物反应的范畴，增加了基因编码化合物库的多样性并提高了其稳定性。本发明的方法与含有游离氨基类小分子化合物反应普适性好、条件较温和、操作方便、收率高，适用于多孔板进行的基因编码化合物库的合成。
附图说明
图1为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物2-1相应的液相色谱质谱检测结果。
图2为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物1-8相应的液相色谱质谱检测结果。
图3为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物2-8相应的液相色谱质谱检测结果。
图4为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物2-1与寡聚核酸在 pH＝9.5的硼酸钠缓冲溶液下链接得到的链接化合物b的液相色谱质谱检测结果。
图5为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物2-8与寡聚核酸在 pH＝9.5的硼酸钠缓冲溶液下链接得到的链接化合物c的液相色谱质谱检测结果。
图6为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物a在pH＝12.5的硼酸钠缓冲溶液存在下与DL-高丝氨酸合成基因编码化合物1液相色谱质谱检测结果。
图7为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物a在pH＝12.5的硼酸钠缓冲溶液存在下与N-苄基甘氨酸合成基因编码化合物2液相色谱质谱检测结果。
图8为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b在pH＝12.5的硼酸钠缓冲溶液存在下与S-甲基-L-半胱氨酸合成基因编码化合物4液相色谱质谱检测结果。
图9为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b在pH＝12.5的硼酸钠缓冲溶液存在下与L-乙烯基甘氨酸盐酸盐合成基因编码化合物5液相色谱质谱检测结果。
图10为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b在pH＝12.5的硼酸钠缓冲溶液存在下与5-氨乙基四氮唑合成基因编码化合物10液相色谱质谱检测结果。
图11为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b在pH＝12.5的硼酸钠缓冲溶液存在下与对氰基苄胺合成基因编码化合物12液相色谱质谱检测结果。
图12为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物c在pH＝12.5的硼酸钠缓冲溶液存在下与N,N-二甲基乙二胺合成基因编码化合物14液相色谱质谱检测结果。
图13为本发明基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物与(9H-芴-9-基)甲基(2-(甲胺基)环己基)氨基甲酸酯的反应产物，进一步与苯丙醛反应得到的产物液相色谱质谱检测结果。
图14为本发明含有游离氨基氨基酸化合物的代表结构。
图15为本发明含有游离氨基二级胺化合物的代表结构。
图16为本发明含有游离氨基一级胺化合物的代表结构。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例中的所有寡聚核酸原料均为寡聚核酸双链或者单链的底物。本发明中，“基因编码化合物库起始头片段化合物”是指用于连接寡聚核酸与含有游离氨基类小分子化合物的一段经化学修饰的长链化合物。
实施例1，基因编码化合物库起始头片段化合物1-1及2-1的合成
将1纳摩尔的乙酸叔丁酯-聚乙二醇溶于二氯甲烷中，并加入3纳摩尔三乙胺、0.1纳摩尔4-二甲胺基吡啶、1.5纳摩尔对甲苯磺酰氯，室温反应 4小时。经高效液相色谱柱制备得到中间体化合物；将中间体化合物溶于二氯甲烷中，加入适量三氟乙酸，室温反应1小时。经处理后得到基因编码化合物库起始头片段化合物1-1。将基因编码化合物库起始头片段化合物1-1溶于二氯甲烷溶液中，并在室温下加入3纳摩尔三乙胺、2纳摩尔 N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯。反应结束后，萃取浓缩得到基因编码化合物库起始头片段化合物2-1。液相色谱质谱检测结果如图1所示，具体反应方程式如下：
实施例2，基因编码化合物库起始头片段化合物1-8及2-8的合成
将1纳摩尔的四乙二醇溶于二氯甲烷中，并加入1.2纳摩尔三乙胺、0.1纳摩尔4-二甲胺基吡啶、1.5纳摩尔对甲苯磺酰氯(TsCl)，室温反应4 小时。然后再加入1.5纳摩尔对甲苯磺酰氯、0.1纳摩尔氢化钠，室温反应直至反应结束。经高效液相色谱柱制备得到中间体化合物。将中间体化合物溶于二氯甲烷中，加入适量三氟乙酸，室温反应1小时。经处理后得到基因编码化合物库起始头片段化合物1-8。液相色谱质谱检测结果如图2 所示。将基因编码化合物库起始头片段化合物1-8溶于二氯甲烷溶液中，并在室温下加入3纳摩尔三乙胺、2纳摩尔N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯 (DSC)。反应结束后，萃取浓缩得到基因编码化合物库起始头片段化合物2-8，液相色谱质谱检测结果如图3所示，具体反应方程式如下：
实施例3，基因编码化合物库起始头片段化合物1-16及2-16的合成
将1纳摩尔的四乙二醇溶于二氯甲烷中，并加入3纳摩尔三乙胺、0.1 纳摩尔4-二甲胺基吡啶、1.5纳摩尔1,5-二溴戊烷，室温反应4小时。经高效液相色谱柱制备得到中间体化合物。将中间体化合物溶于二氯甲烷中，加入适量三氟乙酸，室温反应1小时。经处理后得基因编码化合物库起始头片段化合物1-16。将基因编码化合物库起始头片段化合物1-16溶于二氯甲烷溶液中，并在室温下加入3纳摩尔三乙胺、2纳摩尔N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)。反应结束后，萃取浓缩得到基因编码化合物库起始头片段化合物2-16。通液相色谱质谱进行检测，具体反应方程式如下：
实施例4，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物 a的合成
将10纳摩尔的寡聚核酸(长度为41个碱基，碱基序列为： TCTAGACCCCTCCACAGTAGGGA/GAGATCTGGGGAGGTGTCATC CCTCAGC，相对分子质量为15940)溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝ 9.5，250毫摩尔/升)，将80摩尔当量基因编码化合物库起始头片段化合物 1-1溶液(200毫摩尔/升，寡聚核酸的80摩尔当量)，在室温下加入到寡聚核酸溶液中，并加入50摩尔当量2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(200毫摩尔/升，寡聚核酸的50摩尔当量)及200摩尔当量N,N-二异丙基乙胺(200毫摩尔/升，寡聚核酸的200摩尔当量)。反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃， 12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物a，分子量为16329。通过液相色谱质谱进行检测，检测到相应产物分子量，说明基因编码化合物库起始头片段化合物1-1可以用于与寡聚核酸的链接。
实施例5，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b的合成
将10纳摩尔的寡聚核酸(长度为41个碱基，碱基序列为： TCTAGACCCCTCCACAGTAGGGA/GAGATCTGGGGAGGTGTCATC CCTCAGC，相对分子质量为15940)溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝ 9.5，250毫摩尔/升)，将10摩尔当量的基因编码化合物库起始头片段化合物2-1溶液(200毫摩尔/升，寡聚核酸的10摩尔当量)，在室温下加入到寡聚核酸溶液中。反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b，分子量为16329。液相色谱质谱检测到相应产物分子量，结果见图4，说明基因编码化合物库起始头片段化合物2-1可用于与寡聚核酸链接。与实例4相比，实例5中2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物2-1与寡聚核酸的反应更简洁快速，反应条件更加温和。于是选择2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物作为优选。
实施例6，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物c的合成
将10纳摩尔的寡聚核酸(长度为41个碱基，碱基序列为：TCTAGACCCCTCCACAGTAGGGA/GAGATCTGGGGAGGTGTCATC CCTCAGC，相对分子质量为15940)溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝ 9.5，250毫摩尔/升)，将10摩尔当量的基因编码化合物库起始头片段化合物2-8溶液(200毫摩尔/升，寡聚核酸的10摩尔当量)，在室温下加入到寡聚核酸溶液中。反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物c，分子量为16419，液相色谱质谱检测到相应产物分子量，结果见图5，说明基因编码化合物库起始头片段化合物2-8可用于与寡聚核酸链接。与实例5相比，实例6得到的产物分子量更大，我们优先选择实例5产物分子量较小的基因编码化合物库起始头片段化合物2-1。
实施例7，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物 d的合成
将10纳摩尔的寡聚核酸(长度为41个碱基，碱基序列为： TCTAGACCCCTCCACAGTAGGGA/GAGATCTGGGGAGGTGTCATC CCTCAGC，相对分子质量为15940)溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝ 9.5，250毫摩尔/升)，将10摩尔当量的基因编码化合物库起始头片段化合物2-16溶液(200毫摩尔/升，寡聚核酸的10摩尔当量)，在室温下加入到寡聚核酸溶液中。反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物d。由于使用含有溴的起始头片段化合物所得到产物的产率低于对甲苯磺酰基(OTs)的，于是优选实例5 中基因编码化合物库起始头片段化合物2-1。
实施例8，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物 a与DL-高丝氨酸合成基因编码化合物1
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物a溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入200 摩尔当量的DL-高丝氨酸(200毫摩尔/升的水溶液，寡聚核酸的200摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2 微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物1，分子量为16275，液相色谱质谱检测到基因编码化合物1分子量，结果见图6。
实施例9，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物 a与N-苄基甘氨酸合成基因编码化合物2
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物a溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入200 摩尔当量的N-苄基甘氨酸(200毫摩尔/升的水溶液，寡聚核酸的200摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2 微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物2，分子量为16320，液相色谱质谱检测到基因编码化合物2分子量，结果见图7。
实施例10，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与DL-蛋氨酸砜合成基因编码化合物3
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入 200当量的DL-蛋氨酸砜(200毫摩尔/升的水溶液，寡聚核酸的200摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物3，液相色谱质谱检测到基因编码化合物3分子量。
实施例11，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与S-甲基-L-半胱氨酸合成基因编码化合物4
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入 200摩尔当量的S-甲基-L-半胱氨酸(200毫摩尔/升的水溶液，寡聚核酸的 200摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟， 5分钟)，得到基因编码化合物4，分子量为16290，液相色谱质谱检测到基因编码化合物4分子量，结果见图8。
实施例12，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与L-乙烯基甘氨酸盐酸盐合成基因编码化合物5
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入 200摩尔当量的L-乙烯基甘氨酸盐酸盐(200毫摩尔/升的水溶液，寡聚核酸的200摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，然后放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物5，分子量为16256，液相色谱质谱检测到基因编码化合物5分子量，结果见图9。
实施例13，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与叔丁基八氢吡咯并[3.4-B]吡啶-1-羧酸反应合成基因编码化合物6
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入 200摩尔当量的叔丁基八氢吡咯并[3.4-B]吡啶-1-羧酸(200毫摩尔/升的乙腈溶液，寡聚核酸的200摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃， 12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物6，液相色谱质谱检测到基因编码化合物6分子量。
实施例14，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与(9H-芴-9-基)甲基(2-(甲胺基)环己基)氨基甲酸酯合成基因编码化合物7
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入 200摩尔当量的(9H-芴-9-基)甲基(2-(甲胺基)环己基)氨基甲酸酯(200 毫摩尔/升的乙腈/水溶液＝1:1，寡聚核酸的200摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物7，液相色谱质谱检测到基因编码化合物7分子量。
实施例15，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与1-叔丁氧羰基哌嗪合成基因编码化合物8
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入 200摩尔当量的1-叔丁氧羰基哌嗪(200毫摩尔/升的乙腈溶液，寡聚核酸的200摩尔当量)。反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物8，液相色谱质谱检测到基因编码化合物8 分子量。
实施例16，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与(R)-1-N-Boc-2-甲基哌嗪合成基因编码化合物9
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入 200摩尔当量的(R)-1-N-Boc-2-甲基哌嗪(200毫摩尔/升的乙腈溶液，寡聚核酸的200摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数 /分钟，5分钟)，得到基因编码化合物9，液相色谱质谱检测到基因编码化合物9分子量。
实施例17，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与5-氨乙基四氮唑合成基因编码化合物10
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入 200摩尔当量的5-氨乙基四氮唑(200毫摩尔/升的乙腈溶液，寡聚核酸的 200摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物10，分子量为16255，液相色谱质谱检测到基因编码化合物10分子量，结果见图10。
实施例18，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与邻羟基苄胺合成基因编码化合物11
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入 200摩尔当量的邻羟基苄胺(200毫摩尔/升的乙腈溶液，寡聚核酸的200 摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物11，液相色谱质谱检测到基因编码化合物11分子量。
实施例19，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与对氰基苄胺合成基因编码化合物12
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入 200摩尔当量的对氰基苄胺(200毫摩尔/升的乙腈溶液，寡聚核酸的200 摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物12，分子量为16289，液相色谱质谱检测到基因编码化合物12分子量，结果见图11。
实施例20，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b与1-甲氨基-1-环己醇盐酸盐合成基因编码化合物13
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物b溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入200摩尔当量的1-甲氨基-1-环己醇盐酸盐(200毫摩尔/升的乙腈/水溶液，所述乙腈/水溶液，其乙腈和水体积比为1:1，寡聚核酸的200摩尔当量)，反应液在70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物13，液相色谱质谱检测到基因编码化合物13分子量。
实施例21，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物c与N,N-二甲基乙二胺合成基因编码化合物14
将10纳摩尔的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物c溶于10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝12.5，250毫摩尔/升)，加入200 摩尔当量的N,N-二甲基乙二胺(200毫摩尔/升的乙腈/水溶液，所述乙腈/ 水溶液，其乙腈和水体积比为1:1，寡聚核酸的200摩尔当量)，反应液在 70℃下反应4小时。待反应结束后，向反应液中加入2微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，50微升无水乙醇，震荡混匀。放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟，高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到基因编码化合物14，分子量为16327，液相色谱质谱检测到基因编码化合物14分子量，结果见图12。实例4～21相应产物的成功合成，充分证明本发明制备的基因起始头片段化合物能够与寡聚核酸链接，且能够进一步与含有游离氨基类小分子化合物以新的链接方式链接的可实施性。相较寡聚核酸末端羧基与含有游离氨基类小分子化合物进行反向缩合形成酰胺键的方法的链接方式，本发明基因编码化合物库起始头片段化合物引导出了新的产物的化学空间，增加了底物分子的多样性，同时此方法合成的化学文库的分子量更小。
实施例22，基因编码化合物7与3-环丁基丙酸的反应
将10纳摩尔的产物7溶于10微升水溶液中，加入10微升硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.5，250毫摩尔/升)，后将100摩尔当量的3-环丁基丙酸(200 毫摩尔/升的二甲基亚砜溶液，寡聚核酸的100摩尔当量)、200摩尔当量的 N,N-二异丙基乙胺(DIEA，200毫摩尔/升的二甲基亚砜溶液，寡聚核酸的 200摩尔当量)及50摩尔当量的7-偶氮苯并三氮唑(HATU，200毫摩尔/ 升的二甲基亚砜溶液，寡聚核酸的50摩尔当量)混合，在室温下活化10 分钟，加入到产物7溶液中，反应液在室温下反应1小时。待反应结束后，向反应液中加入3.75微升5摩尔/升的氯化钠水溶液，193.75微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000 转数/分钟，5分钟)，得到产物14，液相色谱质谱检测到产物分子量。
实施例23，基因编码化合物7与苯丙醛的反应
将10纳摩尔的产物7溶于10微升水溶液中，加入10微升磷酸二氢钠缓冲溶液(pH＝5.5，250毫摩尔/升)，100摩尔当量的苯丙醛(200毫摩尔/升的乙腈溶液，寡聚核酸的100摩尔当量)、100摩尔当量的氰基硼氢化钠(200毫摩尔/升的乙腈溶液，寡聚核酸的100摩尔当量)混合，反应液在室温下反应1小时。待反应结束后，向反应液中加入3微升5摩尔/ 升的氯化钠水溶液，75微升无水乙醇，震荡混匀，放置-80℃冰箱冷冻10～ 30分钟。高速冷冻离心(4℃，12000转数/分钟，5分钟)，得到产物15，分子量为16383，液相色谱质谱检测到产物分子量，结果如图13。实施例 22-23说明，相较基因末端羧基与含有游离氨基类小分子化合物进行反向缩合形成酰胺键的方法的链接方式，本发明基因编码化合物库起始头片段化合物引导出的产物，具有更高的化学文库稳定性。
综上所述，上述各实施例及附图仅为说明本发明的广适性而已，可以适用于不同类型的含有游离氨基类小分子化合物，其后续反应的反应性及稳定性，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
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Claims (26)
1.基因编码化合物库起始头片段化合物，其结构通式如下：
其特征在于，所述的结构通式中，Y为2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯，X包括对甲苯磺酰基、溴，n＝3、4；m＝1、2、3、4。
2.根据权利要求1所述的基因编码化合物库起始头片段化合物，其特征在于，所述的结构通式中，Y为2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯，X是对甲苯磺酰基(OTs)，n＝3；m＝1。
3.基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物，结构通式如下：
其特征在于，所述的结构通式中，X包括对甲苯磺酰基、溴，n＝3、4，m＝1、2、3、4；
其中，寡聚核酸是由经人工修饰的和/或未修饰的寡核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡核苷酸链。
4.根据权利要求3所述的基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物，其特征在于，所述的结构通式中，X是对甲苯磺酰基，n＝3，m＝1。
5.基因编码化合物，其结构通式如下：
其特征在于，所述的结构通式中，n＝3、4，m＝1、2、3、4
其中，R1、R2可任选地为羧酸、氢、氨基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1-C12烷基、C1-C6烯烃基、C3-C8环烷基、C1-C6烷基氧、芳基、杂环芳基中的任意一种至多种或它们的任意组合；
其中，寡聚核酸是由经人工修饰的和/或未修饰的寡核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡核苷酸链。
6.根据权利要求5所述的基因编码化合物，其特征在于，所述的结构通式中，n＝3；m＝1。
7.一种基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的制备方法，其反应方程式如下：
其特征在于，基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接得到链接化合物；
对于羧酸类基因编码化合物库起始头片段化合物，与寡聚核酸链接是通过酰胺偶联反应实现的：将寡聚核酸溶于硼酸钠缓冲溶液，并依次将羧酸类基因编码化合物库起始头片段化合物溶液、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯溶液、N,N-二异丙基乙胺溶液，加入到寡聚核酸溶液中，在室温下反应至反应结束；和/或
对于2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物，与寡聚核酸链接是通过亲核取代反应实现的：将寡聚核酸溶于硼酸钠缓冲溶液，并将2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯类基因编码化合物库起始头片段化合物溶液加入到寡聚核酸溶液中，在室温下反应至反应结束；
其中，寡聚核酸是由经人工修饰的和/或未修饰的寡核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡核苷酸链；
其中，所述基因编码化合物库起始头片段化合物的结构中，Y包括羧酸、2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯，X包括对甲苯磺酰基、溴，n＝3、4，m＝1、2、3、4；
其中，所述基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物结构中，X包括对甲苯磺酰基、溴，n＝3、4，m＝1、2、3、4。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述基因编码化合物库起始头片段化合物的结构中，Y为2,5-二氧杂吡咯烷-1-基羧酸酯，X是对甲苯磺酰基，n＝3，m＝1；所述基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物结构中，X是对甲苯磺酰基，n＝3，m＝1。
9.一种用于制备基因编码化合物的方法，其特征在于，将基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物进一步与含有游离氨基类小分子化合物反应，具体反应方程式如下：
其中，所述基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的结构中，X包括对甲苯磺酰基、溴，n＝3、4，m＝1、2、3、4；
其中，所述含有游离氨基类小分子化合物的结构式为R1-NH-R2，是一级或二级胺类化合物，包括芳香类、脂肪类、碳环类化合物以及含有杂原子的环类化合物、氨基酸类化合物以及带有其他保护基团的游离氨基类化合物，R1、R2可任选地为羧酸、氢、氨基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1-C12烷基、C1-C6烯烃基、C3-C8环烷基、C1-C6烷基氧、芳基、杂环芳基中的任意一种至多种或它们的任意组合；
其中，寡聚核酸是由经人工修饰的和/或未修饰的寡核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡核苷酸链。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的结构中，X是对甲苯磺酰基，n＝3；m＝1。
11.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的摩尔浓度是0.1～2毫摩尔/升。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于，所述基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的摩尔浓度为0.5～1.5毫摩尔/升。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于，所述基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物的摩尔浓度为1.0毫摩尔/升。
14.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述反应溶剂是含水、乙腈、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、甲醇、叔丁醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的混合溶剂。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于，所述反应溶剂是无机盐缓冲液及乙腈混合溶液。
16.根据权利要求15的方法，其特征在于，所述无机盐缓冲液选自硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐。
17.根据权利要求14的方法，其特征在于，所述反应溶剂是pH＝12.5的硼酸钠缓冲溶液及乙腈混合溶液，且缓冲液总含量不低于20％。
18.根据权利要求14的方法，其特征在于，所述有机碱缓冲液选自三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、三羟甲基氨基甲烷。
19.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述含有游离氨基类小分子化合物摩尔当量为寡聚核酸的5～500当量。
20.根据权利要求19的方法，其特征在于，所述含有游离氨基类小分子化合物的摩尔当量为寡聚核酸的100～300当量。
21.根据权利要求20的方法，其特征在于，所述含有游离氨基类小分子化合物的摩尔当量为寡聚核酸的200当量。
22.根据权利要求9的方法，其特征在于，在将基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物进一步与含有游离氨基类小分子化合物反应中，反应温度为0～90℃。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于，所述反应温度为50～80℃。
24.根据权利要求23的方法，其特征在于，所述反应温度为70℃。
25.根据权利要求9的方法，其特征在于，在将基因编码化合物库起始头片段化合物与寡聚核酸链接化合物进一步与含有游离氨基类小分子化合物反应中，反应时间为1～8小时。
26.根据权利要求25的方法，其特征在于，所述反应时间为4小时。
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