CN110093408B - 一种dna编码化合物库及化合物筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DNA编码化合物、化合物库及化合物筛选方法。使用本发明的DNA编码化合物库进行筛选,不需要对靶点蛋白质进行纯化或固定,因此可适用于非固载蛋白、细胞跨膜蛋白、细胞裂解液等复杂体系的筛选。此外,本发明的DNA编码化合物在与蛋白共价交联后,蛋白与DNA标签部分全部通过共价连接,可耐受各种分离条件,如电泳分离、强洗脱条件等,蛋白与DNA标签部分不会因为分离条件苛刻而发生分离。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA编码化合物库及化合物筛选方法。
背景技术
在药物研发,尤其是新药研发中,针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而,基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万),且化合物库的建成需要数十年的积累,限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库合成技术,结合了组合化学和分子生物学技术,在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签,能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库。而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别,大幅度地增加了化合物库的大小和合成效率,成为下一代化合物库筛选技术的趋势,并开始在国外制药行业广泛应用,产生了诸多积极的效果(Accounts of Chemical Research,2014,47,1247-1255)。
传统的DNA编码化合物库的合成及编码技术能很好的应用于筛选,但是其也存在一些应用上的局限:其一,采用传统的DNA编码化合物库进行筛选时,需要将靶标蛋白(蛋白质靶点)进行固定,然而某些靶标蛋白在进行固定化操作后,其空间结构发生变化,导致筛选出的化合物并不能与未固定的靶标蛋白结合,从而限制了DNA编码化合物库的应用范围;其二,采用传统的DNA编码化合物库只能对纯度较高的靶标蛋白进行筛选。然而由于技术、蛋白性质等因素影响,某些蛋白并不能被纯化到可以进行筛选的纯度,从而也限制了DNA编码化合物库的应用范围。
为了解决上述技术问题,CN107130299A公开了一种可以共价交联的DNA编码化合物库,它在常规单链DNA编码化合物库的基础上,引入一段具有8~12个碱基的短链DNA,其中短链DNA一端具有光交联基团。该DNA编码化合物库通过光交联基团与靶标蛋白的结合,DNA编码化合物与靶标蛋白共价结合,因此靶标蛋白可以不需要纯化和固定,扩大了DNA编码化合物库的应用范围。CN107130299A还公开了一种基于上述DNA编码化合物库的筛选方法,其中在共价交联后,需加入DNA外切酶对DNA进行降解。
然而由于不同蛋白质靶点的性质不同,在加入DNA外切酶时,可能会出现外切酶将共价交联后的DNA编码化合物的DNA标签降解,从而限制了其应用范围。而如果直接对上述共价交联后的DNA编码化合物采取电泳等强分离、强洗脱条件,则可能因为蛋白质靶点部分和DNA标签部分间仅以少量碱基间的氢键连接而不足以耐受,导致蛋白质靶点与DNA标签部分分离,从而使DNA标签失去作用。
因此,现在需要一种更稳定的可共价交联的DNA编码化合物库,使靶标蛋白与DNA编码化合物结合更稳定,在强分离、强洗脱条件下也不会发生分离。
发明内容
为了解决上述问题,进一步扩大DNA编码化合物库的应用范围,本发明提供了一种新的DNA编码化合物库及化合物筛选方法。
本发明首先提供了一种DNA编码化合物,它具有式Ⅰ所示的通式:
其中,X为原子或分子骨架;
A1为包含有连接链和寡核苷酸的部分;
A2为包含有连接链和寡核苷酸的部分;
M1为包含一个或多个结构单元的功能部分;
M2为包含一个或多个可操作进行共价交联的部分。
进一步地,X为碳原子或多原子的分子骨架。
进一步地,多原子骨架为环状或非环状骨架结构。
进一步地,所述式Ⅰ通式具有式Ⅱ所示的结构:
其中,Z1为在其3'末端与L1连接的寡核苷酸,Z2为在其5'末端与L2连接的寡核苷酸或者Z1为在其5'末端与L1连接的寡核苷酸,Z2为在其3'末端与L2连接的寡核苷酸;
L1为包含有能与Z1的3'末端或5'末端形成键的官能团的连接链;
L2为包含有能与Z2的5'末端或3'末端形成键的官能团的连接链;
Y1为功能部分;
Y2为可操作进行共价交联的部分;
S1、S2各自独立地为连接链。
进一步地,Z1与Z2互补形成双链。
进一步地,Z1与Z2长度相同或不同。
进一步地,Z1、Z2的长度分别为10个以上的碱基,且具有10个以上的碱基对互补区。
进一步地,Z1、Z2均包含PCR引物序列。
进一步地,L1、L2分别独立地选自双官能团的亚烷基链或双官能团的低聚二醇链。
进一步地,L1、L2中的官能团选自磷酸基、氨基、羟基、羧基。
进一步地,S1、S2分别独立地选自双官能团的亚烷基链或双官能团的低聚二醇链。
进一步地,S1、S2中的官能团选自羧基、氨基或醛基。
进一步地,Y2包含光敏性基团、电敏性基团或可与蛋白质共价交联的基团。
进一步地,Y2包含叠氮基团、双吖丙啶基团、磺酰氟基团、重氮基团、肉桂酰基、丙烯酸酯基。
本发明还提供了一种DNA编码化合物库,它是由前述的DNA编码化合物组成。
进一步地,所述DNA编码化合物库包含至少106种不同的DNA编码化合物。
进一步地,所述DNA编码化合物库包含至少108种不同的DNA编码化合物。
进一步地,所述DNA编码化合物库包含至少1010种不同的DNA编码化合物。
本发明还提供了前述的DNA编码化合物库的筛选方法,它包括以下步骤:
a、将化合物库与蛋白质靶点进行孵育,然后操作进行共价交联;
b、将蛋白-DNA编码化合物共价交联复合物与未交联的DNA编码化合物分离;
c、将回收的蛋白-DNA编码化合物共价交联复合物进行PCR扩增和DNA测序,读取DNA序列信息,获得化合物结构信息。
进一步地,所述步骤a中共价交联通过光照、通电或者直接孵育进行。
进一步地,所述步骤b中采用电泳法进行分离。
进一步地,所述步骤b中采用SDS-PAGE进行分离。
进一步地,所述步骤b中的分离方法为:将蛋白固定化,用洗脱剂将未固定物质洗掉即可。
进一步地,所述将蛋白固定化是使用磁珠将蛋白固定。
本发明还提供了前述的DNA编码化合物库对细胞裂解液筛选的方法,它包括以下步骤:
ⅰ、用物理方法将细胞打碎;
ⅱ、进行离心,分离出可溶性物质;
ⅲ、使用上述DNA编码化合物库对分离出的可溶性物质进行筛选。
本发明还提供了前述的DNA编码化合物库对跨膜蛋白进行筛选的方法,它包括以下步骤:
1)、用物理方法将细胞打碎;
2)、进行第一轮离心,分离出可溶性物质和细胞膜,沉淀除去不可溶物质;
3)、进行第二轮离心,沉淀分离出细胞膜;
4)、使用上述DNA编码化合物库对分离出的跨膜蛋白进行筛选。
使用本发明的DNA编码化合物库进行筛选,不需要对靶点蛋白质进行纯化或固定,因此可适用于非固载蛋白、细胞跨膜蛋白、细胞裂解液等复杂体系的筛选。
本发明的DNA编码化合物在与蛋白共价交联后,蛋白与DNA标签部分全部通过共价连接,可耐受各种分离条件,如电泳分离、强洗脱条件等,蛋白与DNA标签部分不会因为分离条件苛刻而发生分离。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为化合物4、5和6与靶点蛋白进行共价交联后电泳分离结果。
图2为化合物6、7和8与靶点蛋白进行共价交联后电泳分离结果。
具体实施方式
缩写:Fmoc表示芴甲氧羰基;DMF表示N,N-二甲基甲酰胺;DMSO表示二甲基亚砜;DMT-MM表示2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪;TEAA表示乙酸三乙胺,DIEA表示N,N-二异丙基乙胺;Boc表示叔丁氧羰基;DMA表示N,N-二甲基乙酰胺;HATU表示2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
下述的DNA的序列:
下述的DNA的序列:
其中,A为腺嘌呤,T为胸腺嘧啶,C为胞嘧啶,G为鸟嘌呤;
DNA上进行的化学反应或DNA酶连接反应的后处理操作:在DNA上进行的化学反应或DNA酶连接反应的反应液中加入10%反应液体积的5M NaCl水溶液及2-3倍体积的乙醇。涡旋震荡后,将溶液置于-20℃冰箱冷冻1小时。冷冻后的溶液经高速离心沉淀后,去除上层清液,得到DNA样品。
实施例1、DNA编码化合物库的起始DNA原料的合成
合成方法一:
步骤1、化合物1的合成
将化合物HUB1(82nmol)溶于硼酸钠缓冲液(82μL,pH=9.4,浓度250mM/L)中,配成浓度1mM/L的起始溶液;然后将4-叠氮-苯甲酸的DMA溶液(8.2μmol,浓度200mM/L)、HATU的DMA溶液(8.2μmol,浓度400mM/L)和DIPEA的DMA溶液(8.2μmol,浓度400mM/L)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合,将该混合液涡旋振荡充分混匀,然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物HUB1起始溶液中,涡旋振荡充分混匀后,室温反应12小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释,LCMS监测反应。反应完全后,按照前述后处理操作进行后处理,得化合物1(77nmol)。
步骤2、化合物4的合成
将化合物1(77nmol)溶于硼酸钠缓冲液(308μL,pH=9.4,浓度250mM/L)中,配成浓度0.25mM/L的溶液,涡旋振荡充分混匀后,在90℃下反应16小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释,LCMS监测反应。反应完全后,按照前述后处理操作进行后处理,得到化合物4(73nmol)。
合成方法二:
步骤1、化合物3的合成
将化合物HUB(10μmol)溶于硼酸钠缓冲液(10ml,pH=9.4,浓度250mM/L)中,配成浓度1mM/L的起始溶液;然后将化合物2(AOP-Fmoc)的DMA溶液(1000μmol,浓度200mM/L)、HATU的DMA溶液(1000μmol,浓度400mM/L)和DIPEA的DMA溶液(1000μmol,浓度400mM/L)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合,将该混合液涡旋振荡充分混匀,然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物HUB起始溶液中,涡旋振荡充分混匀后,室温反应12小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释,LCMS监测反应。反应完全后,加入2mL氯化钠水溶液(5M/L)和60mL乙醇振荡5分钟,置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟。沉淀加入10mLdd-H2O溶解,再加入1ml哌啶后,室温反应1-3小时,LCMS监测反应。反应完全后,加入1mL氯化钠水溶液(5M/L)和60mL乙醇振荡5分钟,置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟,分出上清液得到白色沉淀,即为化合物3(9μmol,纯度>95%)。
步骤2、化合物4的合成
将化合物3(1μmol)溶于硼酸钠缓冲液(1mL,pH=9.4,浓度250mM/L)中,配成浓度1mM/L的起始溶液;然后将对叠氮苯甲酸的DMA溶液(2μmol,浓度20mM/L),HATU的DMA溶液(2μmol,浓度20mM/L)和DIPEA的DMA溶液(2μmol,浓度20mM/L)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合,将该混合液涡旋振荡充分混匀,然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物3起始溶液中,涡旋振荡充分混匀后,室温反应2-4小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释,LCMS监测反应。反应完全后,加入0.2mL氯化钠水溶液(5M/L)和10mL乙醇振荡5分钟,置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟得到沉淀。沉淀加入1mL dd-H2O溶解,HPLC制备得到化合物4(300nmol,纯度>95%)。
实施例2、DNA编码化合物库及筛选
用实施例1制备的起始DNA原料构建了如下结构的DNA编码化合物库:
对上述DNA编码化合物库按以下步骤进行筛选:
1)将上述DNA编码化合物库与靶标蛋白ROCK2在100μL的缓冲液体系中与蛋白孵育60分钟,然后在365nm光照条件下反应60秒;
2)将反应液加热至90℃使蛋白变性,通过制备型SDS-PAGE(12-15%)进行分离,采用切胶的方法回收和提取相应的目标蛋白质-DNA编码化合物共价交联复合物的条带;
3)将回收的样本进行PCR扩增和DNA测序,读取被富集的小分子化合物对应的DNA序列,然后获得化合物的结构信息。
实施例3、DNA编码化合物合成
通过实施例2中DNA编码化合物库的筛选,对化合物结构进行解析后,重新合成无DNA标签的化合物,其对ROCK2的抑制活性IC50约为50nM。以其作为工具化合物合成DNA编码化合物,对共价交联进行进一步验证。
步骤1:化合物5的合成
将化合物3(5μmol)溶于硼酸钠缓冲液(5mL,pH=9.4,浓度250mM/L)中,配成浓度1mM/L的起始溶液;然后将SM01的DMA溶液(10μmol,浓度20mM/L),HATU的DMA溶液(10μmol,浓度20mM/L)和DIPEA的DMA溶液(10μmol,浓度20mM/L)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合,将该混合液涡旋振荡充分混匀,然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物3起始溶液中,涡旋振荡充分混匀后,室温反应2-4小时。取1μL反应液加100uL dd-H2O稀释,LCMS监测反应。反应完全后,加入1mL氯化钠水溶液(5M/L)和50mL乙醇振荡5分钟,置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟得到沉淀。沉淀加入5mL dd-H2O溶解,HPLC制备得到化合物5(2μmol,纯度>98%)。
步骤2:化合物6的合成
将化合物5(1μmol)溶于硼酸钠缓冲液(1mL,pH=9.4,浓度250mM/L)中,配成浓度1mM/L的起始溶液;然后将对叠氮苯甲酸的DMA溶液(100μmol,浓度200mM/L),HATU的DMA溶液(100μmol,浓度400mM/L)和DIPEA的DMA溶液(100μmol,浓度400mM/L)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合,将该混合液涡旋振荡充分混匀,然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物5起始溶液中,涡旋振荡充分混匀后,室温反应2-4小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释,LCMS监测反应。反应完全后,加入0.2mL氯化钠水溶液(5M/L)和10mL乙醇振荡5分钟,置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟得到沉淀。沉淀即为化合物6(270nmol,纯度>95%)。
步骤3:化合物7的合成
将化合物5(1μmol)溶于硼酸钠缓冲液(1mL,pH=9.4,浓度250mM/L)中,配成浓度1mM/L的起始溶液;然后将3-甲基-3H-双吖丙啶-3-丙酸的DMA溶液(100μmol,浓度200mM/L),HATU的DMA溶液(100μmol,浓度400mM/L)和DIPEA的DMA溶液(100μmol,浓度400mM/L)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合,将该混合液涡旋振荡充分混匀,然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物5起始溶液中,涡旋振荡充分混匀后,室温反应2-4小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释,LCMS监测反应。反应完全后,加入0.2mL氯化钠水溶液(5M/L)和10mL乙醇振荡5分钟,置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟得到沉淀。沉淀即为化合物7(310nmol,纯度>96%)。
步骤4:化合物8的合成
将化合物5(1μmol)溶于硼酸钠缓冲液(1ml,pH=9.4,浓度250mM/L)中,配成浓度1mM/L的起始溶液;然后将4-(氟磺酰)苯甲酸的DMA溶液(100μmol,浓度200mM/L),HATU的DMA溶液(100μmol,浓度400mM/L)和DIPEA的DMA溶液(100μmol,浓度400mM/L)分别置于-20℃冰箱中冷却后混合,将该混合液涡旋振荡充分混匀,然后置于4℃冰箱中保存5分钟。将上述混合液加入到化合物5起始溶液中,涡旋振荡充分混匀后,室温反应2-4小时。取1μL反应液加100μL dd-H2O稀释,LCMS监测反应。反应完全后,加入0.2mL氯化钠水溶液(5M/L)和10mL乙醇振荡5分钟,置于-20℃冰箱中冷却2-3小时后离心40-60分钟得到沉淀。沉淀即为化合物8(250nmol,纯度>82%)。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1、化合物4、5和6与靶点蛋白进行共价交联
1、试验方法
(1)将化合物4、5和6在25μL的缓冲液体系(40mM PBS,50mM NaCl,pH 7.5)中分别与靶标蛋白孵育60分钟。
(2)在365nm的紫外条件下,光源直射反应液30分钟。
(3)在反应液中加入9μL 4x上样缓冲液,吹打混匀,置于100℃金属浴加热10分钟,使蛋白彻底变性。
(4)通过SDS-PAGE电泳(120V,120min)分离蛋白质-DNA编码化合物共价交联复合物和未交联的DNA编码化合物。
2、试验结果
试验结果如图1所示。
上述试验结果表明,本发明的DNA编码化合物能够特异性与靶标蛋白发生共价交联,靶标蛋白与DNA编码化合物形成的复合物在电泳条件下不会发生分离,但是复合物与单独靶标蛋白在电泳下可以分离。
试验例2、化合物6、7和8与靶点蛋白进行共价交联
1、试验方法
(1)将化合物6在25μL的缓冲液体系(40mM PBS,50mM NaCl,pH 7.5)中与靶标蛋白孵育60分钟。
(2)一组在365nm的紫外条件下,光源直射反应液1分钟和30分钟。另一组放置于冰上黑暗处保存1分钟和30分钟。
(3)在反应液中加入9μL 4x上样缓冲液,吹打混匀,置于100℃金属浴加热10分钟,使蛋白彻底变性。
(4)将化合物7在25μL的缓冲液体系(40mM PBS,50mM NaCl,pH 7.5)中与靶标蛋白孵育60分钟。
(5)一组在365nm的紫外条件下,光源直射反应液30分钟和120分钟。另一组放置于冰上黑暗处保存30分钟和120分钟。
(6)在反应液中加入9μL 4x上样缓冲液,吹打混匀,置于100℃金属浴加热10分钟,使蛋白彻底变性。
(7)将化合物8在25μL的缓冲液体系(40mM PBS,50mM NaCl,pH 7.5)中与靶标蛋白孵育60分钟。
(8)在4℃条件下保存120分钟。
(9)在反应液中加入9μL 4x上样缓冲液,吹打混匀,置于100℃金属浴加热10分钟,使蛋白彻底变性。
(10)通过SDS-PAGE电泳(120V,120min)分离蛋白质-DNA编码化合物共价交联复合物和未交联的DNA编码化合物。
2、试验结果
试验结果如图2所示。
上述试验结果表明,本发明的DNA编码化合物可采用多种可共价交联的基团(如叠氮基团、双吖丙啶基团和磺酰氟基团等),在适当的条件下,均可以与靶点蛋白质发生共价交联,靶标蛋白与DNA编码化合物形成的复合物在电泳条件下不会发生分离,但是复合物与单独靶标蛋白在电泳下可以分离。
综上,使用本发明的DNA编码化合物库进行筛选,不需要对靶点蛋白质进行纯化或固定,因此可适用于非固载蛋白、细胞跨膜蛋白、细胞裂解液等复杂体系的筛选。此外,本发明的DNA编码化合物在与蛋白共价交联后,蛋白与DNA标签部分全部通过共价连接,可耐受各种分离条件,如电泳分离、强洗脱条件等,蛋白与DNA标签部分不会因为分离条件苛刻而发生分离。
Claims (28)
2.根据权利要求1所述的DNA编码化合物,其特征在于:X为碳原子或多原子的分子骨架。
3.根据权利要求2所述的DNA编码化合物,其特征在于:多原子骨架为环状或非环状骨架结构。
5.根据权利要求1所述的DNA编码化合物,其特征在于:Z1与Z2互补形成双链。
6.根据权利要求1所述的DNA编码化合物,其特征在于:Z1与Z2长度相同或不同。
7.根据权利要求5或6所述的DNA编码化合物,其特征在于:Z1、Z2的长度分别为10个以上的碱基,且具有10个以上的碱基对互补区。
8.根据权利要求1所述的DNA编码化合物,其特征在于:Z1、Z2均包含PCR引物序列。
9.根据权利要求1所述的DNA编码化合物,其特征在于:L1、L2中的官能团选自磷酸基、氨基、羟基、羧基。
11.根据权利要求1所述的DNA编码化合物,其特征在于:S1、S2分别独立地选自双官能团的亚烷基链或双官能团的低聚二醇链。
12.根据权利要求11所述的DNA编码化合物,其特征在于:S1、S2中的官能团选自羧基、氨基或醛基。
14.根据权利要求1所述的DNA编码化合物,其特征在于:Y2包含光敏性基团、电敏性基团或可与蛋白质共价交联的基团。
15.根据权利要求14所述的DNA编码化合物,其特征在于:Y2包含叠氮基团、双吖丙啶基团、磺酰氟基团、重氮基团、肉桂酰基、丙烯酸酯基。
17.一种DNA编码化合物库,其特征在于:它是由权利要求1~16任一项所述的DNA编码化合物组成。
18.根据权利要求17所述的DNA编码化合物库,其特征在于:所述DNA编码化合物库包含至少106种不同的DNA编码化合物。
19.根据权利要求17所述的DNA编码化合物库,其特征在于:所述DNA编码化合物库包含至少108种不同的DNA编码化合物。
20.根据权利要求17所述的DNA编码化合物库,其特征在于:所述DNA编码化合物库包含至少1010种不同的DNA编码化合物。
21.权利要求17~20任一项所述的DNA编码化合物库的筛选方法,其特征在于:它包括以下步骤:
a、将化合物库与蛋白质靶点进行孵育,然后操作进行共价交联;
b、将蛋白-DNA编码化合物共价交联复合物与未交联的DNA编码化合物分离;
c、将回收的蛋白-DNA编码化合物共价交联复合物进行PCR扩增和DNA测序,读取DNA序列信息,获得化合物结构信息。
22.根据权利要求21所述的筛选方法,其特征在于:所述步骤a中共价交联通过光照、通电或者直接孵育进行。
23.根据权利要求21所述的筛选方法,其特征在于:所述步骤b中采用电泳法进行分离。
24.根据权利要求23所述的筛选方法,其特征在于:所述步骤b中采用SDS-PAGE进行分离。
25.根据权利要求21所述的筛选方法,其特征在于:所述步骤b中的分离方法为:将蛋白固定化,用洗脱剂将未固定物质洗掉即可。
26.根据权利要求25所述的筛选方法,其特征在于:所述将蛋白固定化是使用磁珠将蛋白固定。
27.权利要求17~20任一项所述的DNA编码化合物库对细胞裂解液筛选的方法,其特征在于:它包括以下步骤:
ⅰ、用物理方法将细胞打碎;
ⅱ、进行离心,分离出可溶性物质;
ⅲ、使用上述DNA编码化合物库对分离出的可溶性物质进行筛选。
28.权利要求17~20任一项所述的DNA编码化合物库对跨膜蛋白进行筛选的方法,其特征在于:它包括以下步骤:
1)、用物理方法将细胞打碎;
2)、进行第一轮离心,分离出可溶性物质和细胞膜,沉淀除去不可溶物质;
3)、进行第二轮离心,沉淀分离出细胞膜;
4)、使用上述DNA编码化合物库对分离出的跨膜蛋白进行筛选。
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