CN109537060A - 一种dna编码分子库的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种DNA编码分子库的筛选方法，先采用设置有交联基团的第一DNA标记所述目标靶点蛋白，然后利用所述第一DNA和所述DNA编码分子库中的DNA分子的互补，实现化合物分子的筛选。本发明的DNA编码分子库的筛选方法，使活细胞上的靶点蛋白不需要被纯化分离及被专门过表达，能够进一步准确判断目标靶点的位置有效地排除非靶点蛋白和其他分子的影响，同时有利于后续分离其他非目标化合物，使目标化合物解码更准确。

Description

一种DNA编码分子库的筛选方法

技术领域

本发明涉及DNA编码分子库领域，尤其涉及一种新型DNA编码分子库的筛选方法。

背景技术

药物筛选是现代药物开发流程中检验和获取具有特定生理活性化合物的一个步骤，是指通过规范化的实验手段从大量化合物或中选择对某一特定作用靶点具有较高活性的化合物的过程。药物筛选的过程从本质上讲就是对化合物进行药理活性实验的过程，随着药物开发技术的发展，对新化合物的生理活性实验从早期的验证性实验，逐渐转变为筛选性实验，即所谓的药物筛选。

当代药物研发中，针对疾病的药物靶点，通过构建大型的候选药物分子库，进行高通量、大规模筛选是新药研发中不可或缺的手段。当今世界上主要的制药公司均拥有大型的分子库和大规模的筛选平台用于新药研发。然而，传统的分子库和筛选平台成本高昂、技术门槛高、管理运行复杂，成为高通量筛选发展和应用中的严重制约。近年来，DNA编码分子库技术逐渐发展起来，成为药物研发中的新兴筛选方法，使用DNA编码分子库进行药物筛选所使用的靶点大多为纯化后的蛋白质，而有些蛋白子纯化难度大则无法很好地使用DNA编码分子库进行筛选。为了解决这一问题，现有技术中通过引入一个带有光交联基团的短链DNA作为标签，目的是保护与蛋白质靶点结合的小分子的DNA标签；再利用DNA外切酶切除未与靶点结合的小分子DNA标签；最后利用PCR 扩增及DNA测序分析小分子的化学结构。此方法虽能够从一定程度将DNA编码分子库的筛选技术应用于未纯化未固载的蛋白靶点，但是在筛选过程中，目标靶点容易受到非靶点蛋白和其他分子影响，难以进行针对性的筛选，同时细胞表面与蛋白结合的分子和不结合的分子不容易分离，给分析目标化合物带来了影响。因此，DNA编码分子库的筛选方法仍然是制约其应用的重要因素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA编码分子库的筛选方法，旨在解决筛选过程中，目标靶点容易受到非靶点蛋白和其他分子影响以及细胞表面与蛋白结合的分子和不结合的分子不容易分离的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种DNA编码分子库的筛选方法，包括以下步骤：

(1)提供第一DNA标记的目标靶点蛋白；其中，所述第一DNA连接有交联基团，且所述第一DNA通过所述交联基团与目标靶点蛋白交联结合；

(2)筛选目标化合物；将所述第一DNA标记的目标靶点蛋白与DNA编码分子库孵育，得到目标靶点蛋白-编码分子库混合体系，其中，所述DNA编码分子库中至少含有一种能与所述目标靶点蛋白结合的目标编码化合物，且所述DNA编码分子库中的碱基与所述第一DNA靠近目标靶点蛋白一端的至少5 个碱基之间形成互补；

(3)分离并解码目标化合物；对所述目标靶点蛋白-编码分子库混合体系进行分离、筛选，将分离得到的目标靶点蛋白-编码分子库偶联体系进行变性解离，分析所述编码分子库中DNA分子类型，根据所述分析结果，确定与目标靶点蛋白结合的化合物类型。

本发明提供的一种DNA编码分子库的筛选方法，先采用设置有交联基团的第一DNA标记所述目标靶点蛋白，然后利用所述第一DNA和所述DNA编码分子库中的DNA分子的互补，实现化合物分子的筛选。该方法具有以下优点：

首先，本发明利用已知抗体进行定位的方法，能够进一步准确判断目标靶点蛋白的位置，有效地排除非靶点蛋白和其他分子的影响；其次，利用引入的第一DNA进行标记及筛选，使目标编码化合物不仅与目标靶点蛋白特异性结合，而且与第一DNA结合形成目标靶点蛋白-编码分子库交联体系，有利于后续对其他非目标编码化合物进行分离，使目标编码化合物提取、解码更准确。综上，本发明提供的一种DNA编码分子库的筛选方法和传统方法相比，活细胞上的靶点蛋白不需要被纯化分离，也不需要被专门过表达，而完全处于其天然的细胞环境中，因此能够更好地反映蛋白的天然结构和功能，所筛选出得到的目标化合物，有更优良的生物相关性，更有可能成为真正的分子探针或药物候选化合物。

附图说明

图1是本发明实现DNA编码分子库对活细胞表面膜蛋白靶点筛选方法的流程示意图。

图2a是使用本发明方法对细胞表面FR蛋白进行标记特异性验证的流程示意图；图2b是使用本发明方法对细胞表面FR蛋白进行标记特异性验证的荧光标记分析图；图2c是使用本发明方法对细胞表面FR蛋白进行标记特异性验证的质谱分析的数据结果图。

图3a是对采用D-3，将D-1从D-2上取代下来的流程示意图；图3b是靶点蛋白标记物的荧光分析数据结果。

图4a是D-1/D-3双链离开之后，FR蛋白表面的配体结合位点与FAc小分子化合物结合的验证结果；图4b是D-1/D-3双链离开之后，FR蛋白表面的配体结合位点与没有FAc配体连接的阴性对照D-4DNA的小分子结合的验证结果；图4c是D-1/D-3双链离开之后，FR蛋白表面的配体结合位点与有FAc配体，但是6个碱基的DNA序列与D-1DNA不匹配的小分子结合的验证结果；图4d是D-1/D-3双链离开之后，结合位点已经饱和时，FR蛋白表面的配体结合位点与A的另一端连有一个荧光基团FAM的D-4DN小分子结合的验证结果。

图5是利用DNA编码分子库对细胞表面靶点蛋白进行筛选流程示意图。

图6a是靶点FR有较好结合能力的阳性对照物；图6b是与FR蛋白表面的配体结合的小分子化合物筛选后的结果。

图7a是具体实施例中所涉及的具有生物素标记的D-1DNA小分子的结构式示意图；图7b是具体实施例中所涉及的D-4DNA小分子的结构式示意图；图7c是具体实施例中所涉及的化合物A小分子的结构式示意图；图7d是具体实施例中所涉及的化合物B小分子的结构式示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明实施例提供了一种DNA编码分子库的筛选方法。该方法包括以下步骤：

S01.提供第一DNA标记的目标靶点蛋白；其中，所述第一DNA连接有交联基团，且所述第一DNA通过所述交联基团与目标靶点蛋白交联结合；

S02.筛选目标化合物；将所述第一DNA标记的目标靶点蛋白与DNA编码分子库孵育，得到目标靶点蛋白-编码分子库混合体系，其中，所述DNA编码分子库中至少含有一种能与所述目标靶点蛋白结合的目标编码化合物，且所述DNA编码分子库中的碱基与所述第一DNA靠近目标靶点蛋白一端的至少5 个碱基之间形成互补；

S03.分离并解码目标化合物；对所述目标靶点蛋白-编码分子库混合体系进行分离、筛选，将分离得到的目标靶点蛋白-编码分子库偶联体系进行变性解离，分析所述编码分子库中DNA分子类型，根据所述分析结果，确定与目标靶点蛋白结合的化合物类型。

具体的，上述步骤S01中，提供第一DNA标记的目标靶点蛋白，为下述步骤S02中DNA编码分子库中的编码化合物识别目标靶点蛋白提供了定位基础。

具体的，所述第一DNA连接有交联基团，且所述第一DNA通过所述交联基团与目标靶点蛋白交联结合。优选的，交联基团包括光交联基团、亲电交联基团的任一种。光交联基团被广泛用于非特异性生物耦合，一般是通过紫外光照射，将其与靶点蛋白的胺或巯基反应，使二者相结合，采用光交联基团对靶点蛋白进行标记。在优选实施例中，光交联基团包括苯基叠氮、二苯甲酮、丙基吖啶中的任一种。苯基叠氮，是一种无色或淡黄色油状物，易溶于有机溶剂，不溶于水、酸或碱的水溶液。在紫外光的作用下，叠氮苯基容易被取代，通常被取代的叠氮苯基可用作荧光标记。二苯甲酮，是一种白色片状结晶，有微玫瑰香味，是常用的自由基光引发剂，主要用于自由基紫外光固化体系，在紫外光的作用下，可作为荧光标记物使用。亲电交联基团，亲电基团指在有机化学反应中对含有可成键电子对的原子或分子有亲和作用的原子或分子，一般都是带正电荷的试剂或具有空的p轨道或者d轨道，能够接受电子对的中性分子。亲电基团能够直接与靶点目的蛋白表面的胺基或巯基进行反应，生成共价的酰胺键。在优选实施例中，亲电交联基团包括N-羟基琥珀酰亚胺、丙烯酰胺、溴代乙酰胺的任一种。具体的，所述交联基团与所述目标靶点蛋白交联结合。交联反应是指2个或者更多的分子相互键合交联成网络结构的较稳定分子的反应。这种反应使线型或轻度支链型的大分子转变成三维网状结构，以此在蛋白质分子上增加一个标记物。

优选的，所述目标靶点蛋白选自膜蛋白、蛋白质复合体、活细胞、病理组织的任一种。这些蛋白由于其性质特殊，较难或无法纯化和固载，但通常此类蛋白与疾病体系更加接近，更加具有生物相关度，是更有价值的药物筛选靶点。该DNA编码分子库的筛选方法适用于纯化、固载的蛋白靶点，同时也适用于非纯化、非固载的蛋白靶点。因此，本发明的筛选方法更适用于此类蛋白进行药物靶点范围筛选。

优选的，提供第一DNA标记的目标靶点蛋白的方法为：

S011.提供目标靶点蛋白，采用第二DNA标记的特异性抗体标记所述目标靶点蛋白，得到第二DNA标记的目标靶点蛋白，其中，特异性抗体为目标靶点蛋白的已知抗体；

S012.提供所述第一DNA，将所述第一DNA加入所述第二DNA标记的目标靶点蛋白中，反应得到第一DNA/第二DNA标记的目标靶点蛋白，其中，所述第二DNA与所述第一DNA靠近所述交联基团的一端的至少10个碱基互补，所述第一DNA连接的交联基团与目标靶点蛋白进行交联反应；

S013.提供与所述第二DNA具有互补碱基区域的第三DNA，且所述第三 DNA与所述第二DNA的互补程度高于所述第一DNA与所述第二DNA的互补程度，将所述第三DNA加入所述第一DNA/第二DNA标记的目标靶点蛋白中，将所述第二DNA从所述第一DNA/第二DNA标记的目标靶点蛋白解离，得到第一DNA标记的目标靶点蛋白。

具体的，上述步骤S011中，采用第二DNA标记的特异性抗体标记所述目标靶点蛋白，得到第二DNA标记的目标靶点蛋白。具体的，所述特异性抗体为目标靶点蛋白的已知抗体，利用目标靶点蛋白的已知抗体特异性识别目标靶点蛋白，为后续引入的进行定位的交联基团准确提供目标靶点蛋白的具体位置，保证筛选对象的准确性及专一性。

上述步骤S012中，提供所述第一DNA，将所述第一DNA加入所述第二 DNA标记的目标靶点蛋白中，反应得到第一DNA/第二DNA标记的目标靶点蛋白。优选的，第一DNA的长度为12～20个碱基，且在靠近目标靶点蛋白一端连接一个交联基团；第二DNA的碱基长度为10～14个，第二DNA与已知抗体相连接。在本发明优选实施例中，反应为在水相条件下，添加0.1～0.3mol氯化钠，1mol磷酸盐缓冲液，调整反应体系为中性，反应时间为30～40分钟，反应温度为36～38℃。

具体的，所述第二DNA与所述第一DNA靠近所述交联基团的一端的至少 10个碱基互补配对，发生聚合反应使其结合，优选的，所述第一DNA与所述第二DNA碱基互补配对长度小于所述第二DNA与所述第三DNA碱基互补配对长度。进一步将所述第一DNA连接的交联基团与目标靶点蛋白进行交联反应，对目标靶点蛋白进行定位，保证后续筛选过程中靶点蛋白的准确性，确保能够进行针对性的筛选，避免细胞表面非靶点蛋白和其他分子影响筛选结果。在本发明优选实施例中，选用光交联基团与目标靶点蛋白进行光交联反应，反应的条件为紫外光照，所述紫外光波长为360nm～370nm，反应时间为9～11秒。

上述步骤S013中，提供一个第三DNA，优选的，所述第三DNA的碱基长度为12～20个。具体的，第三DNA与所述第二DNA具有互补碱基区域，且第三DNA与第二DNA的互补程度高于第一DNA与第二DNA的互补程度。因此，将所述第三DNA加入所述第一DNA/第二DNA标记的目标靶点蛋白中，使第二DNA与第三DNA能够形成一个长度较长的双链，将第二DNA从第一DNA上取代下来，得到第一DNA标记的目标靶点蛋白。优选地，反应为在水相条件下，添加0.1～0.3mol氯化钠，1mol磷酸盐缓冲液，调整反应体系为中性，反应时间为30～40分钟，反应温度为36～38℃。本发明优选实施例中，第二DNA与第三DNA碱基可为完全互补。

上述步骤S02中，将第一DNA标记的目标靶点蛋白与DNA编码分子库孵育。其中，所述DNA编码分子库中至少含有一种能与所述目标靶点蛋白结合的目标编码化合物，且所述DNA编码分子库中的碱基与所述第一DNA靠近目标靶点蛋白一端的至少5个碱基之间形成互补，由此，不仅使得所述DNA编码分子库能够通过与所述第一DNA结合的方式有效识别所述目标靶点蛋白，而且，编码分子库中目标化合物与目标靶点蛋白特异性结合，因此识别过程中形成目标靶点蛋白-编码分子库交联体系非常稳定，有利于后续对其他非目标编码化合物进行分离，使目标编码化合物提取、解码更准确。

具体的，DNA编码分子库是在传统组合化学的基础上，将一种具体的化合物与一段独特序列的DNA在分子水平连接，即对小分子化合物进行DNA编码，使小分子化合物的结构单元与DNA序列存在一一对应关系。一般，在与相应靶点蛋白进行亲和筛选后，就可以通过对DNA序列的识别从而分析化合物的结构信息，然后将“被翻译”的化合物进行合成，从而得到所需的目标化合物。与传统的化合物库比较，DNA编码分子库库容量大，包括几十亿甚至更多的化合物；合成时间较短，筛选更加方便。因此，DNA编码分子库已广泛运用于药物筛选试验中。具体的，本发明所使用的DNA编码分子库是前期构建得到，该分子库所有化合物两端的DNA链都具有引物结合区域，且相同种类的化合物具有相同DNA的序列。

具体的，DNA编码分子库中的碱基与所述第一DNA靠近目标靶点蛋白一端的至少5个碱基之间形成互补，优选地，所形成互补的碱基为5～8个，因此第一DNA标记的目标靶点蛋白与DNA编码分子库中的化合物所形成的DNA 双链并不稳定，而是形成一个动态的，不断“形成-分离-再形成”的动态过程。通过孵育，能够和靶点蛋白相结合的小分子，由于目标化合物小分子和目标靶点蛋白的结合方式包括非共价结合和共价结合，非共价结合包括静电相互作用、π-π共轭效应、范德华相互作用以及疏水相互作用；共价结合形成包括离子键、共价键相关化学键进行作用，因此所形成的目标靶点蛋白-目标小分子化合物复合体系具有较高的稳定性。此外，DNA编码分子库的各个化合物两端的引物结合区域，都能够与标记目标靶点蛋白的第一DNA通过DNA聚合酶的作用发生聚合反应，形成双链。因此所形成的DNA双链具有较高的稳定性，目标化合物小分子能够稳定地以双链的形式结合在靶点蛋白上。在本发明优选实施例中，所添加的与第一DNA标记的目标靶点蛋白进行孵育的DNA编码分子库的浓度为1～3μmol，孵育条件为水相条件下，添加0.1～0.3mol氯化钠，1mol磷酸盐缓冲液，调整反应体系为中性，孵育时间为30～40分钟。

具体的，孵育得到目标靶点蛋白-编码分子库混合体系。该混合体系包括了与目标靶点蛋白特异性结合的小分子，同时还包括和目标靶点蛋白非特异性结合的分子库的其他物质。

上述步骤S03中，对所述目标靶点蛋白-编码分子库混合体系进行分离、筛选。具体的，通过分离的方法，将没有和目标靶点蛋白特异性结合的其他化合物从目标靶点蛋白-编码分子库的体系中除去。优选地，分离的方法包括清洗、超滤任一种。由于非目标化合物不能与目标靶点蛋白进行共价结合或非共价结合，因此该二者的结合是不稳定的，通过简单的分离方法即可除去非目标化合物，使未与目标靶点蛋白结合的分子被洗脱，避免影响筛选得到的目标小分子的解离和结构解析。

进一步，通过对目标靶点蛋白-编码分子库混合体系进行分离、筛选，得到目标靶点蛋白-编码分子库偶联体系。具体的，目标靶点蛋白-编码分子库偶联体系是指编码分子库中的目标化合物与目标靶点蛋白非共价结合以及通过目标化合物两端的DNA链与连接有交联基团进行定位的第一DNA结合的偶联体系。目标靶点蛋白-编码分子库偶联体系中，由于目标化合物与目标靶点蛋白形成非共价结合，因此采用变性的方法进行解离。优选地，变性解离的方法包括加热、破碎任一种。通过加热或是超声破碎的方法，将目标化合物从靶点蛋白上解离下来。再进一步通过常规的PCR扩增、高通量DNA测序的方式对连接于目标化合物两端的DNA链进行解码，根据分析得到的DNA分子的类型，确定与靶点蛋白结合的化合物类型。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

一种DNA编码分子库化合物的筛选方法，具体的，使用HeLa细胞为研究体系，以HeLa细胞表面的膜蛋白(folic receptor,FR)为靶点蛋白作为研究目标蛋白。如图1所示，所述筛选方法包括以下步骤：

第一步为提供目标靶点蛋白：所提供的目标靶点蛋白采用一个长为16个碱基的第二DNA(下文以“D-2DNA”表示)标记的特异性抗体标记，长为10 个碱基的第一DNA(下文以“D-1DNA”表示)在与D-2DNA具有6个互补碱基区域，且D-1DNA在靠近互补区域的一端连接有交联基团，采用末端连接有交联基团的D-1DNA标记目标靶点蛋白，其中，交联基团与目标靶点蛋白交联结合；提供与D-2DNA具有完全互补碱基区域的长为16个碱基的第三DNA (下文以“D-3DNA”表示)，利用D-3DNA将D-2DNA进行取代，得到由 D-1DNA标记的目标靶点蛋白。

具体的，如图2a所示：使用连接了D-2DNA且能够专一结合FR的抗体 (FA)对FR蛋白进行了标记。提供D-1DNA，且D-1DNA的靠近抗体一端连接了一个荧光基团(FAM)；在紫外光波长为365nm下光照10秒，使荧光基团与靶点蛋白进行反应共价结合。在细胞被D-1DNA/D-2DNA处理，紫外光照之后，如图2b(A)所示，在显微镜下细胞产生明显的绿色荧光，证明了细胞被D-1DNA所标记。通过一组对照试验为了验证标记的特异性，对照组一为使用表面不表达FR蛋白的阴性对照细胞(2b(B))，对照组二为D-1DNA与 D-2DNA序列不匹配(2b(C))，对照组三为D-2DNA上没有靶点蛋白的抗体，对照组四为没有提供光照的试验条件，可以看出显微镜下对照组一～四的细胞均仅显示很弱的背景荧光信号，充分证明了靶点蛋白被标记的特异性。更进一步，为了验证D-1DNA的确被标记在靶点蛋白上，采用具有生物素(biotin)标记的D-1DNA(bio-D-1；图7a)。在完成标记之后，采用磁珠固载的链霉素与标记在D-1DNA上的生物素相结合，以分离出D-1DNA所共价捕获的蛋白。分离出的蛋白，从磁珠上洗脱之后，通过质谱分析进行蛋白质鉴定。结果表明，被D-1DNA所捕获的蛋白质，的确为目标蛋白FR，从而验证了本标记方法的靶点特异性，证明了细胞表面的其它蛋白没有被显著地标记。因此，通过引入靶点蛋白的已知抗体实现D-1DNA光交联基团的特异性定位，确保在后续筛选过程中，目标靶点不受到非靶点蛋白和其他分子影响。

进一步，采用与D-2DNA碱基完全互补配对的D-3DNA将D-2DNA从 D-1DNA上取代下来，并验证靶点蛋白上是否只留下D-1DNA。具体地，使用没有荧光标记的D-1DNA，但是对连有抗体的D-2DNA进行了荧光标记。如图3a所示，将荧光标记的D-2DNA与抗体相连并标记靶点蛋白，再添加带有光交联基团的D-1DNA与D-2DNA结合，在365nm紫外光光照10秒，使D-1DNA的光交联基团共价交联到靶点蛋白上，再添加一个与D-2碱基完全互补配对的D-3DNA，与D-2DNA形成双链DNA，将D-2DNA从D-1DNA上取代下来，得到由D-1DNA标记靶点蛋白的细胞。由于连有抗体的D-2DNA进行了荧光标记，如图3b(A1)所示，在HeLa细胞表面的FR蛋白被抗体标记之后，能够观察到由D-2DNA所产生的荧光信号(图3b(A2))；在加入与D-2DNA 完全互补配对的D-3DNA之后，由于形成D-2DNA/D-3DNA双链，D-2DNA 从D-1DNA上被取代下来，如图3b(B1)所示，D-2DNA从细胞表面被洗脱，细胞表面的靶点蛋白只被D-1DNA所标记，导致了荧光信号的消失(图3b(B2))。因此，进一步充分证明了D-3DNA去除的是最初的连接抗体的D-2DNA，仅保留标记着细胞表面靶点蛋白上的D-1DNA，以保证FR蛋白表面的配体结合位点能够与小分子化合物结合进行后续目标化合物的筛选。

第二步筛选目标化合物：将由D-1DNA标记的目标靶点蛋白与DNA编码分子库孵育，得到目标靶点蛋白-编码分子库混合体系，其中，所述DNA编码分子库中至少含有一个能与所述目标靶点蛋白结合的目标编码化合物，且所述 DNA编码分子库中的碱基与所述D-1DNA靠近目标靶点蛋白一端的碱基之间形成互补；

为了验证D-2DNA/D-3DNA双链离开之后，FR蛋白表面的配体结合位点能够与小分子化合物结合，加入了一个新的D-4DNA。具体地，D-4DNA(图 7b)具有三个特征：①一端连有一个小分子叶酸(folic acid,FAc)；FAc为已知的能够与FR结合的小分子化合物；②D-4DNA仅仅具有6个碱基，因此与细胞表面D-2形成不稳定的DNA双链；③D-4DNA的另一端连有一个荧光基团FAM。在D-4DNA引入细胞表面之后，由于FAc与FR的结合，大大增加了DNA双链的稳定性，能够留在细胞表面上，再一次产生了较强的荧光信号 (图4a)。同时，设置三个对照组，对照组一添加的是没有FAc配体连接的阴性对照D-4DNA，则该DNA无法与靶点蛋白结合，细胞没有表现荧光信号(图 4b)；对照组二添加的是有FAc配体，但是6个碱基的DNA序列与D-1DNA 不匹配的阴性对照D-4DNA，则FAc配体即便与靶点蛋白可特异性结合，但是由于照D-4DNA与D-1DNA的碱基不互补，因此二者无法结合，没有荧光信号的产生(图4c)；对照组三则在加入D-4之前，先加入游离的FAc小分子对 FR蛋白的结合位点进行饱和，再加入D-4DNA，由于FR蛋白的结合位点已饱和，则小分子物质无法与靶点蛋白结合，不再产生荧光信号(图4d)。因此，对照组试验充分验证了DNA分子编码库中的化合物是与靶点蛋白结合的小分子配体，以及能够与D-1DNA互补配对形成双链的碱基对。

具体地，利用DNA编码分子库对细胞表面靶点蛋白进行筛选。优选地，使用了一个有2,500万的DNA编码多肽分子库，其中包含有靶点蛋白的一个已知配体FAc，作为阳性对照。如图5，将该分子库与被D-1标记的靶点蛋白的细胞充分孵育，当目标化合物与靶点蛋白结合，则该目标化合物与D-1DNA能够互补配对形成双链DNA，双链DNA具有较高的稳定性，能够稳定地将目标化合物与靶点蛋白结合，使目标化合物留在细胞之上。其他未与靶点蛋白结合或与细胞表面非靶点蛋白的结合的小分子，由于缺少D-1DNA的支持，无法形成任何DNA双链，只有不稳定的瞬时作用，与细胞结合不稳定，容易在下一步被分离。

第三步分离并解码目标化合物：对所述目标靶点蛋白-编码分子库混合体系进行筛选，分离得到目标靶点蛋白-目标编码化合物混合体系，并对目标编码化合物进行变性解离并分析所述目标编码化合物结构，根据所述目标编码化合物结构的分析结果，确定与目标靶点蛋白结合的化合物类型。

进一步，大部分分子库化合物与细胞表面非靶点蛋白结合，由于缺少D-1 DNA的支持，无法形成任何DNA双链，只有不稳定的瞬时作用，与细胞结合不稳定，因此一般可以通过清洗、超滤等方法进行洗脱。而留在细胞上的目标化合物在强变性的条件如加热、破碎后从细胞上分离，利用常规的乙醇沉淀方法进行纯化、浓缩，之后再进行定量、PCR扩增。进一步加入和高通量DNA 测序相兼容的DNA引物，生成最终的测序样品进行测序以解析目标化合物的结构。其中，DNA测序的结果，用本实验室前期开发的程序进行数据处理，对每一个化合物的DNA编码序列个数进行统计，计算出筛选后每个化合物的含量百分比；并与未有经过任何筛选的原始分子库中的化合物含量百分比进行比较，计算出筛选所获得的分子库化合物的富集度(enrichment fold)。再以富集度为纵坐标，筛选后序列个数为横坐标，最终获得筛选结果图。

进一步，对上述结果进行分析。如图6(a)，偏向于右上角的数据点代表的是与靶点FR有较好结合能力的化合物，并且越倾向于右上角，代表与FR的结合力越强。对图中的筛选结果进行分析之后，我们发现FR的已知小分子配体 FAc，明显地处于图的右上角，反映了FA对靶点蛋白FR较高的结合力(结合平衡常数Kd：<1nM)。而对于所筛选出来的分子库化合物，如图6(b)，选取了一个富集度较高点(图6(b)中箭头所示)。根据DNA编码所反映出的化合物结构，对该富集度较高的化合物A进行合成，合成得到的化合物A(图7c) 不再带有DNA标签。进一步，利用表面等离子共振(surface plasma resonance， SPR)对化合物A与靶点FR蛋白的结合进行了测量，获得了12.1uM的结合力。作为阴性对照，我们还随机选取了没有被FR筛选到的分子库化合物B进行了合成，相应的SPR结果显示化合物B(图7d)与靶点FR蛋白的结合力大约为500μM，显示出对SPR并没有活性，该数据验证了本方法筛选对靶点的特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提供第一DNA标记的目标靶点蛋白；其中，所述第一DNA连接有交联基团，且所述第一DNA通过所述交联基团与目标靶点蛋白交联结合；

(2)筛选目标化合物；将所述第一DNA标记的目标靶点蛋白与DNA编码分子库孵育，得到目标靶点蛋白-编码分子库混合体系，其中，所述DNA编码分子库中至少含有一种能与所述目标靶点蛋白结合的目标编码化合物，且所述DNA编码分子库中的碱基与所述第一DNA靠近目标靶点蛋白一端的至少5个碱基之间形成互补；

(3)分离并解码目标化合物；对所述目标靶点蛋白-编码分子库混合体系进行分离、筛选，将分离得到的目标靶点蛋白-编码分子库偶联体系进行变性解离，分析所述编码分子库中DNA分子类型，根据所述分析结果，确定与目标靶点蛋白结合的化合物类型。

2.如权利要求1所述的DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，提供第一DNA标记的目标靶点蛋白的方法为：

提供目标靶点蛋白，采用第二DNA标记的特异性抗体标记所述目标靶点蛋白，得到第二DNA标记的目标靶点蛋白，其中，所述特异性抗体为目标靶点蛋白的已知抗体；

提供所述第一DNA，将所述第一DNA加入所述第二DNA标记的目标靶点蛋白中，反应得到第一DNA/第二DNA标记的目标靶点蛋白，其中，所述第二DNA与所述第一DNA靠近所述交联基团的一端的至少10个碱基互补，所述第一DNA连接的交联基团与目标靶点蛋白进行交联反应；

提供与所述第二DNA具有互补碱基区域的第三DNA，且所述第三DNA与所述第二DNA的互补程度高于所述第一DNA与所述第二DNA的互补程度，将所述第三DNA加入所述第一DNA/第二DNA标记的目标靶点蛋白中，将所述第二DNA从所述第一DNA/第二DNA标记的目标靶点蛋白解离，得到第一DNA标记的目标靶点蛋白。

3.如权利要求1所述的DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，所述目标靶点蛋白选自膜蛋白、蛋白质复合体、活细胞、病理组织的任一种。

4.如权利要求1-3任一项所述的DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，所述第一DNA的长度为12～20个碱基；和/或，

第二DNA的长度为10～14个碱基；和/或，

第三DNA的长度为12～20个碱基。

5.如权利要求4所述的DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，

所述DNA编码分子库中的碱基与所述第一DNA靠近目标靶点蛋白一端形成互补的碱基为5～8个；和/或，

所述第一DNA与所述第二DNA碱基互补配对长度小于所述第二DNA与所述第三DNA碱基互补配对长度。

6.如权利要求1-3任一项所述的DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，所述交联基团包括光交联基团、亲电基团的任一种。

7.如权利要求6所述的DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，所述光交联基团包括苯基叠氮、二苯甲酮、丙基吖啶中的任一种。

8.如权利要求7所述的DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，所述光交联基团与目标靶点蛋白进行交联反应时，所述交联反应的条件为紫外光照，所述紫外光波长为360nm～370nm，反应时间为9～11秒。

9.如权利要求6所述的DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，所述亲电基团包括N-羟基琥珀酰亚胺、丙烯酰胺、溴代乙酰胺的任一种。

10.如权利要求1-3任一项所述的DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，所述分离的方法包括清洗、超滤任一种；和/或，

所述变性的方法包括加热、破碎任一种。