CN112143783A - 一种可识别混合物对复杂生物体系的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可识别混合物对复杂生物体系的鉴别方法，具体涉及一种DNA编码化合物库对复杂生物体系的鉴别方法。通过本发明的方法，可有效对不同复杂生物体系进行区分。
Description
技术领域
本发明涉及一种可识别混合物对复杂生物体系的鉴别方法。
背景技术
复杂生物体系是由多种物质、核酸、蛋白、细胞等按照特定构造、组分等形成的生物组合物，包括生物组织、生物器官、血液、体液、菌群等。由于此类生物体系组成的复杂性，通常需要多维度的分析检测才能鉴别不同的复杂生物体系。但是常规的多维度分析检测在某些情况下并不能鉴别出一些差异较小的复杂生物体系。例如，对于某些人体的前期病理组织和健康组织，可能组织样本间的差异仅在于部分蛋白的表达不同，从而导致常规的分析检测并不能鉴别出来。又例如，对于某些土壤菌群，菌群间的差异可能非常细微，但是产生的作用却相差较大。
可识别混合物主要应用于新药发现领域，其中近年来出现的DNA编码化合物库(DEL库)技术结合了组合化学和分子生物学技术，对化合物分子加上一段序列独特的DNA标签，从而在短时间内能得到大量的可通过DNA测序识别的混合物。DNA编码化合物库技术主要有双链DNA标记技术(WO2005058479、WO2018166532等)和单链DNA标记(CN103882532等)，在国外新药行业已得到广泛应用。现有DNA编码化合物库技术主要还是用于对生物靶点蛋白进行筛选，缺乏在其它领域上的应用。
本发明将可识别混合物应用于对复杂生物体系的鉴别，能有效的将差异较小的复杂生物体系区分。
发明内容
本发明提供了一种可识别混合物对复杂生物体系的鉴别方法，包含以下步骤：
a、取不同复杂生物体系样本；
b、将相同的可识别混合物分别和不同复杂生物体系样本于缓冲液中混合孵育；
c、分离除去未结合的混合物组分，得到与复杂生物体系样本结合的可识别混合物组分；
d、识别对比混合物组分的特征参数，作为各复杂生物体系样本的鉴别。
进一步地，所述可识别混合物是指混合物中的全部或部分可识别。即所述可识别混合可能包含可识别的化合物和不可识别的化合物，其中不可识别的化合物不会对可识别化合物的识别产生干扰。
更进一步地，所述可识别混合物中的不同的可识别组分大于10种。优选地，不同的可识别组分大于103种。更优选地，不同的可识别组分大于105种。进一步优选地，不同的可识别组分大于107种。
更进一步地，所述可识别混合物中可识别的部分通过标签来识别。即可识别混合物中可识别的部分为一个或多个标签，通过对标签的识别即可识别出可识别混合物中单一可识别组分整体。优选地，可识别混合物中的每种可识别组分的标签不重复。
进一步具体地，所述标签为核酸、肽链、肽核酸、荧光标记或同位素标记。优选地，所述核酸包含双链核酸和单链核酸。
更进一步地，所述可识别混合物中可识别的部分为DNA编码化合物。
进一步地，所述复杂生物体系为生物组织、生物器官、血液、体液、菌群。在本发明的一些实施方案中，所述复杂生物体系为人体正常生理组织和病理组织。
进一步地，步骤d中特征参数包含混合物可识别组分的组成和含量。
进一步地，所述方法为一种DNA编码化合物库对复杂生物体系的鉴别方法，包含以下步骤：
a、取不同复杂生物体系样本；
b、将相同的DNA编码化合物库和不同复杂生物体系样本置于缓冲液中混合孵育；
c、分离除去未结合的DNA编码化合物，得到与复杂生物体系样本结合的DNA编码化合物；
d、识别对比DNA编码化合物的组成和含量，作为各复杂生物体系样本的鉴别。
更进一步地，步骤a中复杂生物体系样本需进行冰冻切片。
更进一步地，步骤a～c的操作在0～4℃下进行。
更进一步地，步骤b中的缓冲液含有ssDNA(鲑鱼精DNA)。
更进一步地，步骤c中通过离心分离除去未结合的DNA编码化合物。
进一步具体地，步骤c中还包括多次加入洗脱缓冲液离心。
更具体地，所述洗脱缓冲液不含有ssDNA(鲑鱼精DNA)。
更进一步地，步骤c中通过加热后离心，以得到与复杂生物体系样本结合的DNA编码化合物。
进一步具体地，加热温度为65～100℃，并维持10～30分钟。
更进一步地，步骤d中通过对DNA编码化合物的DNA标签进行PCR扩增和DNA测序从而识别DNA编码化合物的组成和含量。
进一步具体地，测序前通过qPCR定量DNA编码化合物分子数，如果qPCR定量的DNA编码化合物分子数大于108，则用步骤c得到的DNA编码化合物替代步骤b中的DNA编码化合物库，并重复步骤b至步骤c的操作。
利用本发明的鉴别方法，可比较不同样本间的信号差异，包括单一信号差异以及信号组合差异。例如，通过比较肿瘤病理组织和正常生理组织的单一信号增强或降低，将其作为肿瘤病理组织的鉴别。又例如将特征信号的变化组合，作为肿瘤组织特异表达的指纹。
并非所有DEL富集信号都是在病理组富集上升而在对照组富集下降，也可能出现在病理组富集下降而对照组富集上升的信号，其本质反映在机体病理状态下也存在可能下调表达的蛋白标志物。病理组与对照组间的DEL富集信号差异(包括上调与下调)统一都可以认为是DEL作为印记工具指征病理组织的变化。进一步地，其中变化水平较大的富集信号反映出对应结合物质在病理状态的较大程度改变，该物质可能通过进一步的靶点垂钓等方法研究其性质，明确为特定疾病的病理标志物。
本发明中“可识别混合物”可以通过物理、化学或生物的手段，将混合物中的特定组分识别出来。在本发明的一些实施方案中，识别特定组分的手段包括荧光、同位素、核酸测序等。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步地详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1得到的特征分子富集信号强度分布结果图。
图2为实施例1中DEL04和DEL08中两组样品的特征分子富集信号强度对比图。
图3为实施例1中DEL04分子富集信号的三维展示图。
具体实施方式
本发明中具体实施方式所使用的试剂材料均来自商业购买。
实施例1：病理组织的鉴别
取液氮保存的小鼠银屑病病灶皮肤组织样本1例，健康小鼠对照组织样本1例，PBS缓冲液冲洗后冰上用手术刀或冰冻切片机切片得到组织压积约为50μL的组织量，切片厚度在20～500μm左右，切成小块(非组织匀浆)，转移组织切片至离心管中，将离心管置于冰上。
将组织样本在离心管中500g x 2min于4℃下冰冻离心，去上清，用500μL的1x DEL缓冲溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM磷酸盐缓冲液，1mg/mL鲑鱼精DNA，0.01％(m/v)胰蛋白酶抑制剂，pH 7.4)重悬于4℃预冷的1.5mL的Eppendorf离心管中，将离心管置于旋转混合器上，20rpm于25℃混合1分钟。将离心管500g x 2min于4℃下低温离心，去上清。重复此步骤2次。
加入预先用1x DEL缓冲溶液混合溶解后的DNA编码化合物库溶液(500μL)。密封离心管盖，将离心管置于旋转混合器上，20rpm于25℃混合60分钟。将离心管500g x 2min于4℃下低温离心，将上清收集到一个新的1.5ml离心管中存放。
加入1mL的4℃预冷洗涤缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM磷酸盐缓冲液，1mg/mL ssDNA，0.01％(m/v)胰蛋白酶抑制剂，pH 7.4)，将离心管置于旋转混合器上，20rpm于25℃混合1分钟，500g x 2min于4℃下低温离心，上清转移至新的1.5ml离心管中。重复此步骤4次。
加入200～400μL洗脱缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)，彻底振荡混匀，加热至95℃并维持10分钟。16000g离心5分钟，上清转移至新的1.5ml离心管中。
通过qPCR仪器对洗脱上清液中的DNA分子数进行定量。qPCR的试剂如下：
| 成分 | 体积(μL) |
| 反应混合液 | 10 |
| 引物F/R(10μM) | 0.5 |
| 双蒸水 | 5 |
| 模板 | 4 |
| 总体积 | 20 |
qPCR程序如下：
根据qPCR定量结果，用洗脱的上清液替代DNA编码化合物库溶液，并重复上述操作2轮，直到洗脱上清液中的DNA分子数定量小于108。
| 样本 | 投入分子数 | 第1轮洗脱后分子数 | 第2轮洗脱后分子数 | 第3轮洗脱后分子数 |
| 对照小鼠健康组织 | 2.58E+15 | 4.13E+12 | 1.85E+10 | 8.00E+07 |
| 银屑病小鼠病理组织 | 2.58E+15 | 2.86E+12 | 1.02E+10 | 4.05E+07 |
然后使用Illumina NovoSeq6000仪器对上清中的DNA分子进行测序，并对测序结果进行数据分析。通过比较病理组织样本和健康对照组织样本的信号差异，作为病理组织的鉴别特征。
根据特征分子富集信号强度(反映在同一DEL富集立方分析图中，特定富集集群分子相对于周围分子的相对富集程度)分析结果如图1所示，两组样品(下：银屑病病理组织S2，上：健康对照组织S1)的DEL分子富集主要集中于DEL01～DEL08中。其中，DEL04和DEL08中两组样品的特征分子富集信号强度差异较大。
图2进一步展示DEL04和DEL08中两组样品的特征分子富集信号强度结果，横轴为银屑病病理组织S2样品的特征分子富集信号强度，纵轴为健康对照组织S1样品的特征分子富集信号强度。图中红圈处为具有显著意义的特征分子富集信号。
DEL04分子富集信号的三维展示结果如图3所示(S2右：银屑病病理组织，S1左：健康对照组织)，银屑病病理组织S2样品有明显区别于健康对照组织S1样品的信号，可作为该组织的鉴别特征。
上述结果表明银屑病小鼠病理组织组(S2)与对照小鼠健康组织样品(S1)通过DEL库筛选后富集的DEL分子有关联性，较多富集的特征分子在银屑病小鼠病理组织样品中呈现更高水平的富集，表明这些分子可能在病理组织样本上结合了某些尚未阐明性质的上调表达病理标志物。
通过分子特征信号富集在银屑病小鼠病理组织样品与对照小鼠健康组织样品之间的差异，对总量为约50μL压积的组织样品，利用DEL孵育就可获得足够的富集信号，表明该方法具备相当的灵敏度，可以对银屑病小鼠病理组织与小鼠健康组织进行鉴别。
Claims (19)
1.一种可识别混合物对复杂生物体系的鉴别方法，包含以下步骤：
a、取不同复杂生物体系样本；
b、将相同的可识别混合物分别和不同复杂生物体系样本在缓冲液中混合孵育；
c、分离除去未结合的混合物组分，得到与复杂生物体系样本结合的可识别混合物组分；
d、识别对比混合物组分的特征参数，作为各复杂生物体系样本的鉴别。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述可识别混合物是指混合物中的全部或部分可识别。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述可识别混合物中的不同的可识别组分大于10种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述可识别混合物中可识别的部分通过标签来识别。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述标签为核酸、肽链、肽核酸、荧光标记或同位素标记。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述可识别混合物中可识别的部分为DNA编码化合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述复杂生物体系为生物组织、生物器官、血液、体液、菌群。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤d中特征参数包含混合物可识别组分的组成和含量。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法为一种DNA编码化合物库对复杂生物体系的鉴别方法，包含以下步骤：
a、取不同复杂生物体系样本；
b、将相同的DNA编码化合物库和不同复杂生物体系样本置于缓冲液中混合孵育；
c、分离除去未结合的DNA编码化合物，得到与复杂生物体系样本结合的DNA编码化合物；
d、识别对比DNA编码化合物的组成和含量，作为各复杂生物体系样本的鉴别。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤a中复杂生物体系样本需进行冰冻切片。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤a～c的操作在0～4℃下进行。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤b中的缓冲液含有ssDNA(鲑鱼精DNA)。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤c中通过离心分离除去未结合的DNA编码化合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：步骤c中还包括多次加入洗脱缓冲液离心。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述洗脱缓冲液不含有ssDNA(鲑鱼精DNA)。
16.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤c中通过加热后离心，以得到与复杂生物体系样本结合的DNA编码化合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：加热温度为65～100℃，并维持10～30分钟。
18.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤d中通过对DNA编码化合物的DNA标签进行PCR扩增和DNA测序，从而识别DNA编码化合物的组成和含量。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：测序前通过qPCR定量DNA编码化合物的分子数，如果qPCR定量的DNA编码化合物的分子数大于108，则用步骤c得到的DNA编码化合物替代步骤b中的DNA编码化合物库，并重复步骤b至步骤c的操作。
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