CN117305428A - Glra1基因在检测神经元神经递质释放中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种GLRA1基因在检测神经元神经递质释放中的用途和检测太赫兹波辐射后神经元神经递质释放的方法。GLRA1基因作为标志物在用于检测神经元神经递质释放水平中的用途，尤其是用于检测太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平；方法包括将神经元进行太赫兹波辐射处理，基于神经元中GLRA1基因的表达水平，确定太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平。GLRA1基因对神经元神经递质释放具有较高的敏感性，尤其是甘氨酸神经递质，通过检测待测GLRA1基因的表达量，可检测神经元神经递质的释放水平；该方法通过对神经元中的GLRA1基因的表达水平进行检测，可快速、准确地确定经太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种GLRA1基因在检测神经元神经递质释放中的用途，更具体地，本发明涉及一种GLRA1基因作为标志物的用途、试剂在制备试剂盒中的用途、检测太赫兹波辐射后神经元神经递质释放的方法。
背景技术
随着太赫兹科学技术的迅速发展，近年来，太赫兹生物医学研究已成为国际生命科学研究的热点。太赫兹技术在生物医学微观领域，可为揭示生物大分子之间、细胞之间的相互作用的规律，呈现生物大分子之间、细胞之间的相互作用和活动的生物特征，以及最终解释多种生命现象提供革命性科学方法；在生物医学宏观层面，将为疾病的诊断、治疗、评估、检测和预警，以及药物设计、研发、生产和评估带来革命性改变。
神经系统是太赫兹波生物医学研究的重要对象。神经元是电磁辐射的敏感靶细胞，神经元神经递质的释放在学习记忆等认知功能中发挥重要的作用。然迄今，关于太赫兹波促进神经元神经递质释放的标志物研究缺乏。因此，迫切需要开发出一种太赫兹波促神经元神经递质释放的标志物。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种GLRA1基因在检测太赫兹波促神经元神经递质释放中的用途，本发明将GLRA1基因可作为检测太赫兹波辐射后神经元神经递质释放水平的标志物，通过检测生物样本中GLRA1基因的表达量，检测太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
研究发现，一定剂量的太赫兹波辐射可增加神经元突触可塑性，并可通过调节神经递质的释放作用于信息传递。甘氨酸是中枢神经系统神经化学传递的氨基酸神经递质，介导突触囊泡中递质储存、甘氨酸能神经元的去极化引起其胞吐释放、结合到突触后氯离子选择透过性受体产生突触后电位。
有鉴于此，发明人通过大量试验，对生物样本中的多种基因进行检测，最终发现，甘氨酸受体(glycine receptor alpha 1，GLRA1)基因对经太赫兹波辐射后神经元神经递质(例如甘氨酸神经递质)释放具有较高的敏感性，将GLRA1基因作为一种太赫兹波辐射后神经元神经递质释放水平的标志物，通过检测神经元中GLRA1基因的表达量，可检测太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平，对神经元神经递质释放的研究具有重要意义。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种GLRA1基因作为标志物在用于检测神经元神经递质释放水平中的用途。发明人经过实验发现，GLRA1基因对神经元神经递质释放具有较高的敏感性，尤其是甘氨酸神经递质，可将GLRA1基因作为一种神经元神经递质释放水平的标志物，通过检测待测神经元中GLRA1基因的表达量，可检测神经元神经递质的释放水平。具体为，通过检测待测神经元中GLRA1基因的表达量，并与神经元神经递质释放正常的个体中GLRA1基因的表达量进行比较，若存在差异性，则神经元神经递质的释放水平异常，具有检测准确度高等有点。
根据本发明的实施例，所述神经递质包括甘氨酸神经递质。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种GLRA1基因作为标志物在用于检测神经元神经递质释放水平中的用途。发明人经过实验发现，GLRA1基因对神经元神经递质释放具有较高的敏感性，尤其是甘氨酸神经递质，可将GLRA1基因作为一种神经元神经递质释放水平的标志物，通过检测待测神经元中GLRA1基因的表达量，可检测神经元神经递质的释放水平。具体为，通过检测待测神经元中GLRA1基因的表达量，并与神经元神经递质释放正常的个体中GLRA1基因的表达量进行比较，若存在差异性，则神经元神经递质的释放水平异常，具有检测准确度高等有点。
根据本发明的实施例，待测样本中所述GLRA1基因的表达量和对照样本的GLRA1基因的表达量存在差异性，是待测样本的神经元神经递质释放量与对照样本中神经元神经递质释放量存在差异的指示。
示例性地，对照样品可以为神经元神经递质释放正常的样本，若待测样本中所述GLRA1基因的表达量和对照样本的GLRA1基因的表达量存在差异性，是待测样本的神经元神经递质释放异常的指示。
根据本发明的实施例，所述对照样品选自神经元神经递质释放正常的生物体。
根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平。发明人经过实验发现，GLRA1基因对经太赫兹波辐射后神经元神经递质(例如甘氨酸神经递质)释放具有较高的敏感性，可将GLRA1基因作为一种太赫兹波辐射后神经元神经递质释放水平的标志物，通过检测神经元中GLRA1基因的表达量，可检测太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平，具有检测准确度高等有点。
根据本发明的实施例，所述神经递质选自甘氨酸神经递质。
根据本发明的实施例，所述太赫兹波辐射的功率密度为25～35毫瓦，辐射时间为20～40分钟。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂用于检测GLRA1基因，所述试剂盒用于检测太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平。
发明人经过实验发现，GLRA1基因对经太赫兹波辐射后神经元神经递质(例如甘氨酸神经递质)释放具有敏感性高的特点，采用上述试剂盒对神经元(或含有神经元的组织等)中的GLRA1基因的表达水平进行检测，可快速、准确地确定经太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平。因此，通过检测GLRA1基因的表达水平，准确得知神经元神经递质的释放水平，可通过GLRA1基因的表达水平对太赫兹波辐射强度进行调整，以便控制神经元神经递质的释放；还可以用于特定神经递质释放水平的神经元或含有神经元的组织、个体等模型进行构建，通过检测GLRA1基因的表达水平，以便得到合格的模型，为太赫兹波辐射的生物医学研究和临床诊断分析奠定了基础。
根据本发明的实施例，太赫兹波辐射后所述GLRA1基因的表达量高于未经太赫兹波辐射所述GLRA1基因的表达量，是太赫兹波辐射促进神经元神经递质释放的指示。由此，能够对经太赫兹波辐射后神经元神经递质(例如甘氨酸神经递质)的释放水平进行准确判断，具有操作简单和准确度高等优点。
根据本发明的实施例，所述神经递质选自甘氨酸神经递质。
根据本发明的实施例，所述试剂包括第一引物组，所述第一引物组包含具有如SEQID NO.1和2所述的核苷酸序列。
其中，SEQ ID NO.1序列为：5’-GTGCTCACCATGACCACACAGA-3’；
SEQ ID NO.2序列为：5’-GACACAAAGTTGACAGCGGCATA-3’。
根据本发明的实施例，所述试剂进一步包括用于检测内参基因的第二引物组。
根据本发明的实施例，所述内参基因包括但不限于编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因，还可以包括本领域已知的其他内参基因。
根据本发明的实施例，所述第二引物组包含具有如SEQ ID NO.3和4所述的核苷酸序列。
其中，SEQ ID NO.3序列为：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’；
SEQ ID NO.4序列为：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。
根据本发明的实施例，所述太赫兹波辐射的功率密度为25～35毫瓦，辐射时间为20～40分钟。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测太赫兹波辐射后神经元神经递质释放的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将神经元进行太赫兹波辐射处理，基于所述神经元中GLRA1基因的表达水平，确定太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平。
发明人经过实验发现，GLRA1基因对经太赫兹波辐射后神经元神经递质(例如甘氨酸神经递质)释放具有敏感性高的特点，采用上述方法对神经元(或含有神经元的组织等)中的GLRA1基因的表达水平进行检测，可快速、准确地确定经太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平。此外，通过检测GLRA1基因的表达水平，准确得知神经元神经递质的释放水平，可通过GLRA1基因的表达水平对太赫兹波辐射强度进行调整，以便控制神经元神经递质的释放；还可以用于特定神经递质释放水平的神经元或含有神经元的组织等模型进行构建，通过检测GLRA1基因的表达水平，以便得到构建合格的模型，为太赫兹波辐射的生物医学研究和临床诊断分析奠定了基础。因此，该方法具有操作简单和准确度高等优点。
根据本发明的实施例，太赫兹波辐射后所述GLRA1基因的表达量高于未经太赫兹波辐射所述GLRA1基因的表达量，是太赫兹波辐射促进神经元神经递质释放的指示。由此，能够对经太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平进行准确判断，该方法具有操作简单和准确度高等优点。
根据本发明的实施例，所述试剂包括第一引物组，所述第一引物组包含具有如SEQID NO.1和2所述的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述试剂进一步包括用于检测内参基因的第二引物组。
根据本发明的实施例，所述内参基因包括但不限于编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因，还可以包括本领域已知的其他内参基因。
根据本发明的实施例，所述第二引物组包含具有如SEQ ID NO.3和4所述的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述太赫兹波辐射的功率密度为25～35毫瓦，辐射时间为20～40分钟。
根据本发明的实施例，所述神经递质选自甘氨酸神经递质。
根据本发明的实施例，所述神经元为海马神经元。
根据本发明的实施例，所述神经元是以神经组织的形式提供的。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种调控神经元中GLRA1基因表达的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使太赫兹波辐射所述神经元。由此，可以通过使太赫兹波辐射神经元，以调控神经元中GLRA1基因表达。
根据本发明的实施例，所述太赫兹波辐射的功率密度为25～35毫瓦，辐射时间为20～40分钟。
根据本发明的实施例，所述GLRA1基因的表达上调。
根据本发明的实施例，所述神经元为海马神经元。
根据本发明的实施例，所述神经元是以神经组织的形式提供的。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例3中假辐射组和太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元甘氨酸神经递质含量检测结果图；
图2是本发明实施例4中假辐射组和太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元差异表达的基因聚类分析图；
图3是本发明实施例4中假辐射组和太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元差异表达的基因火山图；
图4是本发明实施例4假辐射组和太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元转录组表达谱中GLRA1基因的表达结果；
图5是本发明实施例5假辐射组和太赫兹波辐射组大鼠原代海马神经元GLRA1基因表达验证结果。
具体实施方式
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：大鼠原代海马神经元分离培养
选取新生24小时以内的雄性Wistar大鼠(斯贝福生物技术有限公司)，用75％酒精浸泡大鼠消毒后，剥离脑组织并分离海马，消化与分散组织块，吹打制备成细胞悬液，然后接种在多聚赖氨酸包被的35毫米塑料培养皿中。隔天半量更换饲养液，培养7天。
实施例2：对大鼠原代海马神经元进行太赫兹波辐射
将上述实施例1培养的大鼠原代海马神经元随机分为假辐射组和太赫兹波辐射组。采用军事医学研究院太赫兹波生物暴露系统(具体参见专利号：ZL 201822177471.6的专利申请)对上述含有神经元的细胞培养液进行均匀辐射，太赫兹波辐射源的功率密度为30毫瓦，辐射时间为30分钟。假辐射组进行同等条件下放置30分钟，区别在于不进行太赫兹波辐射。
实施例3：大鼠原代海马神经元甘氨酸神经递质含量检测
将实施例2的太赫兹波辐射组和假辐射组于辐射(或假辐射)后，立即将培养液摇匀，快速取出800微升加入1.5毫升新的塑料离心管中，1000离心力/分钟、4摄氏度条件下离心10分钟；取500微升上清加入到新的塑料离心管中，迅速放入液氮中淬灭30秒，淬灭后放入负80摄氏度中保存。以上操作过程均在4摄氏度条件下完成。采用超高效液相色谱-质谱靶向代谢学检测大鼠原代海马神经元甘氨酸神经递质，采用内标法计算神经递质含量。结果见图1。
由图1可见，与假辐射组相比，太赫兹波辐射组甘氨酸含量于辐射后即刻明显增加(P<0.05)。表明太赫兹波可提升神经元甘氨酸神经递质的释放，并可能影响突触传递的调控。
实施例4：大鼠原代海马神经元转录组测序
1、大鼠原代海马神经元样品制备和测序
将上述实施例2处理后的太赫兹波辐射组和假辐射组大鼠原代海马神经元于辐射(或假辐射)后，立即弃细胞培养液上清，加磷酸缓冲盐溶液和无酶水在室温条件下冲洗，然后加入1毫升总核糖核酸抽提试剂，反复吸打数次后，加入至1.5毫升离心管中，再加300微升无酶水，进行总核糖核酸的提取和总核糖核酸质量检测。依次进行文库构建、文库质检和Novaseq 6000 PE150平台上机测序。
1.1文库构建：使用NEB下一代核糖核酸超快速定向文库制备试剂盒构建转录组文库。
①去除核糖体核糖核酸并片段化：总核糖核酸中含有多种核糖核酸，去除核糖体核糖核酸，然后将其打断。
②第一链互补脱氧核糖核酸合成：以片段化后的核糖核酸为模板，使用随机引物在反转录酶的作用下合成第一链互补脱氧核糖核酸。
③第二链互补脱氧核糖核酸合成：以第一链互补脱氧核糖核酸为模板合成第二链互补脱氧核糖核酸。第二链以T替换成U。
④纯化双链互补脱氧核糖核酸：使用AMPure XP磁珠对双链互补脱氧核糖核酸进行纯化。
⑤末端修复：对纯化后的双链互补脱氧核糖核酸进行末端修复，生成磷酸化平齐末端，随后在3’末端加dA形成粘性末端，以与接头上的T突出端连接。
⑥连接接头：在脱氧核糖核酸连接酶的作用下，在双链互补脱氧核糖核酸两端连接上环形接头，随后用USER酶将环打开并断开互补脱氧核糖核酸第二链。
⑦片段筛选：用AMPure XP磁珠对片段长度进行筛选，使目的片段长度范围在300-400碱基。
⑧文库富集：使用高保真的脱氧核糖核酸聚合酶进行聚合酶链式反应扩增，生成稳定易用的文库用于测序。最终的文库分子两端含有测序必需的接头序列，以及用于区分不同样本的指数序列。
⑨文库纯化：用AMPure XP磁珠对测序文库进行纯化。
1.2文库质检：
①使用Qubit荧光酶标仪检测文库DNA质量浓度，大于1.0纳克/微升为合格。
②使用Qseq100脱氧核糖核酸分析仪检测文库脱氧核糖核酸长度分布，长度集中在400碱基左右、单一峰、无接头峰和大片段峰则认为合格。
③使用KAPA图库定量试剂盒对文库脱氧核糖核酸的摩尔浓度进行定量，以此作为文库混合的标准。
2、生物信息分析
①数据质控与转录组文库质量评估：将高通量测序的下机数据(Raw Data)进行过滤得到高质量数据(Clean Data)。参考基因组对比。把高质量数据(Clean Data)与指定的参考基因组比对，计算测序数据与参考基因组的比对效率，评估测序数据的饱和度和基因的覆盖度。
②基因表达谱构建：根据比对结果，进行转录本组装，计算基因在不同样本中的表达量，构建基因表达谱。用箱线图、密度曲线图等图片展示各样本中基因表达值的分布情况。
③差异基因筛选与功能富集：在不同样本分组中筛选差异基因，并对差异基因进行聚类分析以及火山图可视化展示，对差异基因进行基因本体论/京都基因与基因组百科全书功能注释以及功能富集分析、差异基因互作网络分析，发掘差异基因差异化表达的功能和调控关系。
由图2可见，假辐射组和太赫兹波辐射组的组内差别小，表明所制备样品的一致性较好；假辐射组和太赫兹波辐射组的组间有一定差异，提示两组间存在差异基因。
由图3可见，定量值在进行中值归一化后得到的结果，进一步进行perseuse归一化。由于样品的重复次数为3次，因此直接采用t检验进行差异分析，卡P值0.05，变化倍数1.5倍，得到差异基因的分析结果。结果发现，太赫兹波辐射后，显著上调的基因有139个，显著下调的基因有164个。
转录组测序结果中GLRA1基因表达差异及显著性见图4。图4显示GLRA1基因明显上调(P<0.01)。
实施例5：大鼠原代海马神经元GLRA1基因表达检测
太赫兹波辐射组和假辐射组辐射(或假辐射)后，分别即刻提取大鼠原代海马神经元总核糖核酸，逆转录反应制备互补脱氧核糖核酸，以甘油-3-磷酸脱氢酶作为内参照进行实时定量聚合酶链扩增反应。序列和扩增片断长度见表1，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。聚合酶连扩增反应体系包括双链嵌合荧光染料9微升、互补脱氧核糖核酸1微升、上下游引物1微升、去离子水加至20微升。聚合酶连扩增反应扩增条件包括起始模板变性(95摄氏度，10分钟)、聚合酶链式反应循环中模板变性(95摄氏度，15秒)、退火/延伸(60摄氏度，1分钟)、循环数40个。结果见图5。
表1：实时荧光定量聚合酶链反应引物序列
由图5中结果可见，与假辐射组相比，太赫兹波辐射后大鼠原代海马神经元GLRA1基因表达显著升高(P<0.05)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.GLRA1基因作为标志物在用于检测神经元神经递质释放水平中的用途。
2.GLRA1基因作为标志物在用于检测太赫兹波辐射后神经元神经递质释放水平中的用途。
3.试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂用于检测GLRA1基因，所述试剂盒用于检测神经元神经递质的释放水平。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，待测样本中所述GLRA1基因的表达量和对照样本的GLRA1基因的表达量存在差异性，是待测样本的神经元神经递质释放量与对照样本中神经元神经递质释放量存在差异的指示；
任选地，所述试剂盒用于检测太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平；
任选地，太赫兹波辐射后所述GLRA1基因的表达量高于未经太赫兹波辐射所述GLRA1基因的表达量，是太赫兹波辐射促进神经元神经递质释放的指示；
任选地，所述试剂包括第一引物组，所述第一引物组包含具有如SEQ ID NO.1和2所述的核苷酸序列；
任选地，所述试剂进一步包括用于检测内参基因的第二引物组；
任选地，所述内参基因选自编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因；
任选地，所述第二引物组包含具有如SEQ ID NO.3和4所述的核苷酸序列。
5.一种检测太赫兹波辐射后神经元神经递质释放的方法，其特征在于，包括：
将神经元进行太赫兹波辐射处理；
基于所述神经元中GLRA1基因的表达水平，确定太赫兹波辐射后神经元神经递质的释放水平。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，太赫兹波辐射后所述GLRA1基因的表达量高于未经太赫兹波辐射所述GLRA1基因的表达量，是太赫兹波辐射促进神经元神经递质释放的指示。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：
采用试剂检测所述GLRA1基因的表达水平，所述试剂包括第一引物组，所述第一引物组包含具有如SEQ ID NO.1和2所述的核苷酸序列；
任选地，所述试剂进一步包括用于检测内参基因的第二引物组；
任选地，所述内参基因选自编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因；
任选地，所述第二引物组包含具有如SEQ ID NO.3和4所述的核苷酸序列。
8.根据权利要求1～4任一项所述的用途或5～7任一项所述的方法，其特征在于，所述神经递质选自甘氨酸神经递质；
任选地，所述太赫兹波辐射的功率密度为25～35毫瓦，辐射时间为20～40分钟。
9.一种调控神经元中GLRA1基因表达的方法，其特征在于，包括：使太赫兹波辐射所述神经元。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述太赫兹波辐射的功率密度为25～35毫瓦，辐射时间为20～40分钟；
任选地，所述GLRA1基因的表达上调。
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