JP2023153898A - 核酸の検知 - Google Patents

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Abstract

【課題】サンプル中の検体の検出方法を提供する。【解決手段】ａ）サンプル由来の単一の検体を固体担体の別々の領域に固定化すること、および、上記単一の検体と結合および解離する、検知可能に標識された問合せプローブを提供すること、ｂ）上記別々の領域内で検出される複数の時間分離されたシグナル強度変化を数えること、および、上記別々の領域内で検出されるシグナル強度変化の数が閾値よりも大きいときに、上記シグナル強度変化を、上記検知可能に標識された問合せプローブと上記固定化された単一の検体との繰り返される結合および解離によって生成される候補シグナルとして同定すること、および、ｃ）上記候補シグナルが検出されたときに、または、上記時間分離されたシグナル強度変化を特徴づけるパラメータの値が上記別々の領域内における上記検体の存在を示したときに、上記サンプル中の上記検体を検出すること、を含む、検出方法である。【選択図】図１ａ

Description

発明の詳細な説明
本願は、２０１６年２月１０日に出願された米国仮出願第６２／２９３５８９号に基づく優先権を主張する。該米国仮出願は参照によりその全文が本明細書に援用される。
（連邦政府支援下の研究または開発に関する宣言）
本発明は、米国国立衛生研究所から与えられた助成番号ＧＭ０６２３５７、および、米国海軍省の海軍研究局から与えられた助成番号Ｗ９１１ＮＦ－１２－１－０４２０の下、米国政府の支援を受けて成されたものである。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
（技術分野）
本願は、核酸の検知および同定に関する技術であり、特に、単一分子の分解能において高い信頼度で標的核酸を検出、同定、定量するための組成、方法、キットおよびシステム（但しこれらに限らない）に関する。
（背景技術）
多くの疾患、特に癌の効果的治療には早期発見が重要である。早期段階の疾患に関連する検知可能なバイオマーカーの同定に関する研究によると、核酸は、癌およびその他の病気に関する高度に特異的なバイオマーカーとなることが明らかになっている。例えば、近年では、ヒトの未処理の生物体液（血液、尿および唾液等）中の、癌およびその他の疾患に関する高感度の特異的バイオマーカーとして、癌細胞由来の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）および二次構造化長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）が共に取り上げられている。
しかし、上記バイオマーカーは、診断用バイオマーカーとして有望であるにもかかわらず、核酸バイオマーカーを高感度かつ特異的に検知するのは困難だと判明している。特に、核酸の検知に関する既存手法では、標的分子とともに熱力学的に安定した複合体を形成するプローブが利用されるため、バックグラウンド信号、偽標的、または、関連性が近い変異核酸に対して、弱く、しばしば信頼できない熱力学的識別能しか持たない。また、標的配列へのアクセス可能性は、サンプル中の相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の存在によって大きく制限される。
したがって、核酸バイオマーカーの迅速かつ確実な同定および／または定量化を実現するためには、最小限に処理された生物体液中の核酸を増幅することなしに検知する高感度、かつ特異的な分析が必要となる。
（概要）
したがって、本明細書で提供されるのは、短鎖標識プローブの標的核酸への一時的な結合に基づいて、単一の核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、メチル化ＤＮＡなど）の標的分子の特異的かつ超高感度な検知および計数を行う技術である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、プローブ‐標的相互作用によって生成される動的「フィンガープリント」によって検知される。この平衡ポアソンサンプリングによる一分子認識（ＳｉＭＲＥＰＳ）技術は、一本鎖核酸（例えば、米国特許出願第１４／５８９，４６７号を参照のこと。参照によりその全文が本明細書に援用される）および二本鎖核酸の両方を高感度で検知する。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸の検知は、ｄＣａｓ９誘導捕獲およびＤＮＡ融解の使用を含む。いくつかの実施形態では、本技術は、ガラスまたは溶融シリカ表面上の未標識の標的を、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を積んだ触媒不活性（「無効型」）ｄＣａｓ９酵素または標的核酸の１つ以上の部分に高い特異性をもって結合する酵素を用いて捕獲することを含む。いくつかの（例えば、ｌｎｃＲＮＡを検知する）実施形態では、本技術は、さらに、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）オリゴヌクレオチドを用いて、ｄＣａｓ９による核酸標的（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）の標的化を行うことを含む。
いくつかの実施形態では、本技術は、分子内ＳｉＭＲＥＰＳプロービング、例えば、結合して分子内プローブ機構（例えば、図５ａおよび５ｂを参照のこと。下記参照）を提供する捕獲プローブと問合せプローブを用いることを含む。
より広くは、いくつかの実施形態では、１つ以上の複合体（例えば、１つ以上のｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体）が標的核酸中の特定の部分（例えば、ヌクレオチド配列）を認識して、当該標的核酸を表面に固定化する。さらに、実施形態では、これらの同一のまたは他の複合体および／または相補的オリゴヌクレオチドは、標的核酸の二本鎖領域を融解して、標識化問合せプローブの結合のための（例えば、問合せプローブが第２の部分、例えば問合せ領域に結合するための）アクセスを提供する。表面での捕獲（および、いくつかの実施形態では、１つ以上の二本鎖領域の融解）に続いて、短鎖蛍光標識化ＤＮＡ問合せプローブが、標的核酸のうち、ｄＣａｓ９媒介融解によってアクセス可能にされた第２の部分（例えば、問合せ領域）に繰り返し一時的に結合するのが観察される。
さらに、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡを用いて標的配列（例えば、１つ以上の問合せ領域）を固定化および／または曝露するのに加えて、実施形態では、標識化（例えば、蛍光標識化）ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が標的核酸の検知を行う技術も提供される。特に、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体はＳｉＭＲＥＰＳ用の問合せプローブを提供する。ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡのＤＮＡ配列上での滞留時間は、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ配列とのあいだに形成される塩基対の数に影響されるからである。本技術の実施形態では、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとのあいだに形成される塩基対の数は、変異配列からの解離を迅速に、しかし野生型配列からの解離はゆっくりと行うように、あるいはその反対となるように、調整される。さらに、設計されたｄＣａｓ９タンパク質は、適切な反応速度および配列特異性を提供する（例えば、Kleinstiver et al. (2016) “High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects” Nature 529: 490-495; Slaymaker et al. (2015) “Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity” Science 351: 84-8を参照のこと）。設計されたＣａｓ９タンパク質は、ネイティブのＣａｓ９に比べてＤＮＡ骨格との相互作用が弱く、このためオフターゲット効果が減少する。
本明細書に記載された特定の実施形態では、ＳｉＭＲＥＰＳプローブは、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡが標的領域に隣接する１つ以上の核酸領域（例えば、「隣接領域」）に結合することで、特異的にアクセス可能となった標的配列（例えば、問合せ領域）に繰り返し結合する。問合せプローブが問合せ領域に繰り返し結合することで、唯一の連続的な動的「フィンガープリント」ができ、観察された標的分子毎に多数の独立した測定値が与えられる。この繰り返される動的サンプリングには、２つの主なメリットがある。（１）サンプリング時間が増すにつれてバックグラウンド信号に対する識別性が任意に高くなり、偽陽性信号を本質的に排除する。（２）分子標的の同一性のわずかな違いに対して鋭い感度を有し、それにより、わずかに異なるバイオマーカー同士（例えば、疾患関連の変異、メチル化パターン、または他の化学的指標のたった１つのＤＮＡ／ＲＮＡ塩基が異なるバイオマーカー同士）を、極めて高い信頼度で識別できる。さらに、単一分子技術として、この方法は、密接に関連しているが偽の（例えば、変異した）標的が大量に存在する中で、少量の標的分子（例えば、単一の細胞由来のもの）を検知する。ＰＣＲ増幅（少量の標的に対する現在の標準的手法）を必要とする技術とは対照的に、本技術は標的増幅を用いず、そのため、生体サンプルに対して必要な前処理は、例えば、標的検知前に周辺温度で行うｄＣａｓ９／ｇＲＮＡによる前処理だけでよく、これにより、サンプリングバイアスの導入を避けられる。さらに、直接的な検知手段として、本技術は、標的上のいかなる化学的指標も失うことがなく、これは、増幅に基づく検知方法がしばしば標的上の化学的指標を失うのと対照的である。本技術は、例えば、ヒトの血清中を循環する腫瘍ＤＮＡおよびｌｎｃＲＮＡから癌を診断するのに用いられる。本技術はまた、病原体およびヒト腫瘍細胞中で、薬物および抗生剤に対して耐性を有する遺伝子を検知するのにも用いられる。
したがって、本明細書で提供されるのは、二本鎖標的核酸の検知可能なフィンガープリントを提示するための複合体であって、第１領域およびそれに隣接する第２領域を有する二本鎖標的核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）と、前記第１領域と相互に作用して熱力学的に安定した複合体を形成し、前記第２領域を一本鎖形態とする融解要素（例えば、固定化された融解要素）と、前記第２領域と繰り返し結合して、前記二本鎖標的核酸と関連した検知可能なフィンガープリントを提供する問合せプローブと、を含む、複合体の実施形態である。いくつかの実施形態では、前記二本鎖核酸は、二本鎖二次構造を有する領域を含む一本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、前記融解要素はｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、前記融解要素は一本鎖結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記融解要素はタンパク質であり、いくつかの実施形態では、前記融解要素は核酸である。実施形態では、二本鎖核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）に結合するタンパク質および／または融解要素（例えば、タンパク質または核酸）を用いて、二本鎖核酸（例えば、核酸の領域）を解離して、一本鎖核酸を提供する。特定の実施形態では、前記融解要素は、前記第１領域にハイブリダイズしたｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を含む。いくつかの実施形態では、前記融解要素は、（例えば、標的核酸に対してトランスで配置された）ＰＡＭｍｅｒを含む。
いくつかの実施形態では、前記問合せプローブは、０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返しハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、前記問合せプローブは、１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返しハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、前記問合せプローブは、０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返しハイブリダイズする蛍光標識化核酸である。いくつかの実施形態では、前記問合せプローブは、１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返しハイブリダイズする蛍光標識化核酸である。
いくつかの実施形態では、前記融解要素は、基材に固定化されたｄＣａｓ９を含む。
いくつかの実施形態では、データが分析される。例えば、いくつかの実施形態では、前記フィンガープリントはパターン認識分析によって検知可能である。
さらなる実施形態は、前記標的核酸の前記第２領域に隣接する前記標的核酸の第３領域と相互に作用する第２融解要素を含む。いくつかの実施形態では、前記第２融解要素はｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、前記第２融解要素は一本鎖結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記第２融解要素はタンパク質であり、いくつかの実施形態では、前記第２融解要素は核酸である。特定の実施形態では、前記第２融解要素は、前記第３領域にハイブリダイズしたｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を含む。いくつかの実施形態では、前記融解要素は、（例えば、標的核酸に対してトランスで配置された）ＰＡＭｍｅｒを含む。いくつかの実施形態では、前記第１融解要素および前記第２融解要素は、約５から１５ヌクレオチド離れて、前記標的核酸に結合し、例えば、問合せプローブが前記問合せ領域にアクセスできるようにする。
本技術は、核酸の検知、同定、および／または定量に用いられる。例えば、いくつかの実施形態では、前記標的核酸は、変異、単一ヌクレオチド多型、または修飾塩基を有する。
さらなる実施形態は、サンプル中の二本鎖標的核酸の検知可能なフィンガープリントを提示する方法であって、二本鎖標的核酸を固体担体の別々の領域に固定化するステップであって、前記二本鎖標的核酸は、第１領域およびそれに隣接する第２領域を有し、前記固体担体の前記別々の領域は前記第１領域と相互に作用する固定化された融解要素を含む、ステップと、前記第２領域に繰り返し結合する問合せプローブを提示して、検知可能なフィンガープリントを提示するステップと、前記検知可能なフィンガープリントを前記二本鎖核酸と関連させて、前記二本鎖核酸を特定するステップと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、パターン認識または類似の分析（例えば、機械学習、ニューラルネットワーク、教師あり学習および／または教師なし学習など）を用いてデータを分析し、前記二本鎖核酸の前記検知可能なフィンガープリントを生成または同定する。
方法のいくつかの実施形態では、前記融解要素はｄＣａｓ９を含む。方法のいくつかの実施形態では、前記融解要素は一本鎖結合タンパク質を含む。方法のいくつかの実施形態では、前記融解要素はタンパク質であり、いくつかの実施形態では、前記融解要素は核酸である。方法の特定の実施形態では、前記融解要素は、前記第１領域にハイブリダイズしたｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を含む。方法のいくつかの実施形態では、前記融解要素は、（例えば、標的核酸に対してトランスで配置された）ＰＡＭｍｅｒを含む。
さらなる実施形態は、前記標的核酸の第３領域と相互に作用する第２融解要素を提示するステップであって、当該第３標的領域は前記第２領域と隣接している、ステップを含む。例えば、いくつかの実施形態は、前記標的核酸の前記第２領域と隣接する前記標的核酸の第３領域と相補的なｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を提示するステップを含む。関連する実施形態は、前記融解要素が前記第２領域を二本鎖形態にするのに十分な条件（例えば、バッファｐＨ条件、温度制御、溶液成分（例えば、塩、対イオン、補因子など））を提供するステップを含む 。
いくつかの実施形態は、前記問合せプローブが、０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返し結合するのを検知するステップを含む。いくつかの実施形態は、前記問合せプローブが、１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返し結合するのを検知するステップを含む。いくつかの実施形態は、蛍光標識化核酸が、０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返し結合するのを検知するステップを含む。いくつかの実施形態は、蛍光標識化核酸が、１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返し結合するのを検知するステップを含む。
いくつかの実施形態は、前記サンプル中の前記二本鎖標的核酸の量または濃度を、前記検知可能なフィンガープリントから計算するステップを含む。
本技術の実施形態は、二本鎖核酸を検知するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、前記システムは、固定化された融解要素を含む固体担体と、前記二本鎖核酸に繰り返し結合する検知可能に標識された問合せプローブと、蛍光検知器と、問合せプローブの結合データをパターン認識分析するよう構成されたソフトウェア要素と、を備える。システムの実施形態は、本明細書に記載した組成を有し、かつ／または要素（例えば、コンピュータ、プロセッサなど）を有して、本明細書に記載した方法を実行する。
本技術は、対象が癌にかかっている、あるいは癌にかかるリスクがあるという予測値を計算する方法の実施形態で用いられる。例えば、前記方法の実施形態は、マイクロＲＮＡバイオマーカーの存在を判定するステップ、変異の存在を判定するステップ、およびゲノムＤＮＡ中の修飾塩基の存在を判定するステップを含む。いくつかの実施形態では、前記予測値は、マイクロＲＮＡバイオマーカーの存在、変異の存在、およびゲノムＤＮＡ中の修飾塩基の存在と関連する変数から計算される値である。
関連する実施形態は、標的核酸を検知するための複合体であって、第１領域およびそれに隣接する第２領域を有する標的核酸と、前記第１領域とハイブリダイズした検知可能に標識された捕獲プローブと、前記捕獲プローブの標識と親和性の消光剤またはアクセプター蛍光物質で標識された問合せプローブと、を含み、前記問合せプローブは、０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返しハイブリダイズする、複合体を提供する。
さらなる実施形態は、本明細書に含まれる教示に基づけば当業者には明らかであろう。
（図面の簡単な説明）
本願技術の上記および他の特徴、態様および利点は、添付の図面を参照することでよりよく理解されるであろう。
図１ａは、本明細書に記載した核酸検知技術の一実施形態の模式図である。
図１ｂは、スライド表面に非特異的に一時連結する蛍光標識化問合せプローブに関する例示的なＳｉＭＲＥＰＳデータを示す。
図１ｃは、標的核酸と一時結合する蛍光標識化問合せプローブに関する例示的なＳｉＭＲＥＰＳデータを示す。図１ｃおよび図１ｂの動的フィンガープリントが異なるため、問合せプローブの特異的結合および非特異的結合に関する異なる動的サインの例が示されている。
図１ｄは、１ｐＭの標的核酸（例えばｍｉＲ－１４１というマイクロＲＮＡ）の非存在（灰色の太線）または存在（細線）下で問合せプローブの数をカウントして得られた一定数の強度変化（Ｎｂ＋ｄ）を示す一連のヒストグラムである。４つのヒストグラムのプロットデータの取得にはそれぞれ１、２、５、１０分間の取得時間を要した。
図１ｅは、５つのｍｉＲＮＡに関するＳｉＭＲＥＰＳ分析から得た、Ｒ２値＞０．９９の標準カーブのプロット図である。ＳｉＭＲＥＰＳ技術により、高い信頼度の核酸検知が実現されている。
図２ａは、ｌｅｔ－７ａ用の蛍光性問合せプローブが、ｌｅｔ－７ａとは長い存続時間（τｏｎ＝２３．３±８．３ｓ）の結合を示す一方、当該ｌｅｔ－７ｃ配列がｌｅｔ－７ａに対して一塩基ミスマッチ（下線付きの「Ｇ」）であることから、ｌｅｔ－７ｃとは結合がずっと一時的（τｏｎ＝４．７±３．０ｓ）であることを示すプロット図である。
図２ｂは、ｌｅｔ－７ａ（塗りつぶした丸点）とｌｅｔ－７ｃ（塗りつぶしていない丸点）とで、単複製レベルにおける高い信頼度の区別を示した滞留時間分析結果である。
図２ｃは、ｌｅｔ－７ａとｌｅｔ－７ｃとを区別するために、τｏｎ閾値を変更して作成した受信者動作特性（ＲＯＣ）のプロットである。
図２ｄは、ｍｉＲＣＵＲＹｌｅｔ－７阻害因子の存在または非存在下における、未処理のＨｅｌａ細胞抽出物中のｌｅｔ－７の検出結果に関するＮｂ＋ｄヒストグラムである。内因性ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａに関するＮｂ＋ｄヒストグラムは、明確な輪郭を有するピーク（細線）を示した。当該ピークは、ｌｅｔ－７ファミリーメンバーに結合し隔離するよう設計されたｌｅｔ－７阻害因子の存在下では消失した（太い灰色のバー）。
図２ｅは、ｌｅｔ－７ａ用の蛍光プローブおよび捕獲プローブを用いて未処理のＨｅｌａ抽出物から検出した分子に関する滞留時間を示す。塗りつぶした丸点および塗りつぶしていない丸点は、τｏｎ値のｋ－ｍｅａｎｓクラスタ分析によって分類された２つの標的分子クラスタを表し、単ヌクレオチド変異型ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａおよびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃについて予想されたτｏｎ分布に一致している。
図２ｆは、ヒト血清中に加えた人工ｍｉＲ－１４１の定量結果を示す。
図３は、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡを含む本願技術の実施形態を示す模式図である。ゲノム標的ＤＮＡをｄＣａｓ９／ｇＲＮＡで短時間、下処理する。このあいだ、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、問合せ領域（例えば問合せプローブに相補的な領域）に隣接する領域において標的核酸（例えばゲノムＤＮＡ）とハイブリダイズする。ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡは、標的核酸中の特定のＤＮＡ配列（例えば問合せ領域）を融解する。ビオチン化ｄＣａｓ９をスライド表面上に（例えばビオチンとアビジンとの相互作用によって）捕獲した後、ＳｉＭＲＥＰＳを用い、標的核酸中の現在アクセス可能な問合せ領域と問合せプローブとの結合を検知する。なお、該アクセス可能な問合せ領域は、標的核酸のうちｇＲＮＡにハイブリダイズした部位に隣接している。
図４は、互いに側面に位置する２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の標的核酸へのハイブリダイゼーションを含む、本願技術の実施形態を示す模式図である。いくつかの実施形態において、２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を問合せ領域の側面に位置するようにハイブリダイズさせることで、標的核酸（例えば問合せ領域）から、ＳｉＭＲＥＰＳに基づく検知用の問合せプローブへのアクセス可能性がさらに向上し、一部の実施形態では特異性がさらに増強される。図示される実施形態では、一方のｄＣａｓ９は、表面上への捕獲のためにビオチン化されており、他方のｄＣａｓ９はビオチン化されていない。但し、いくつかの実施形態では、当該他方のｄＣａｓ９は修飾、例えばビオチン化される。
図５ａは、問合せプローブおよび捕獲プローブが連続的なオリゴヌクレオチドと連結してなる分子内ＳｉＭＲＥＰＳのプロービングの実施形態を示す模式図である。
図５ｂは、非連続的な問合せプローブおよび捕獲プローブがアドレスオリゴヌクレオチドによって共局在化してなる分子内ＳｉＭＲＥＰＳのプロービングの実施形態を示す模式図である。
本願の図面は必ずしも縮尺通りに描かれておらず、図中の各部材は必ずしも縮尺通りの関係で描かれていない。図面は、本明細書に開示の装置、システム、方法に関する各実施形態を明確にし理解することを意図したものである。可能な場合には、各図面に亘って同じ参照番号を同じまたは類似の部材に付す。また、図面は、本発明の教示範囲をいかなるかたちでも限定するものではないと認識されるべきである。
（詳細な説明）
本願は、核酸の検知および同定に関する技術であり、特に、単分子の分解能において高い信頼度で標的核酸を検知、同定、定量するための組成、方法、キットおよびシステム（但しこれらに限らない）に関する。
様々な実施形態の詳細な説明において、説明の目的で、多数の特定細部を示して、開示される実施形態が完全に理解されるようにしている。但し、当業者であれば、こうした様々な実施形態は、これらの特定細部とともに実施してもよいし、これらの特定細部なしに実施してもよいことがわかるであろう。別の例において、構造および装置はブロック図の形式で示される。さらに、当業者ならば容易にわかるように、各方法が提示され実行される特定の順序は例示的なものに過ぎず、そのような順序は変えることができ、その場合でも依然として、本明細書に開示した様々な実施形態の精神および範囲内に含まれる。
本願で引用された全ての文献および同様の資料（特許、特許出願、記事、書籍、論文、インターネット上のウェブページが挙げられるが、これらに限らない）は、いかなる目的であれ、参照によりその全文が本明細書に明確に援用されるものとする。断りのない限り、本明細書中の全ての技術用語および科学用語は、本明細書に記載の様々な実施形態が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を持つ。援用された文献における用語の定義が本教示での定義と異なっていると思われる場合は、本教示での定義に従うものとする。本明細書中の見出しは系統立てるためのものに過ぎず、記載された構成をいかなるかたちでも限定するものと解釈されるべきではない。
＜定義＞
本発明の技術に対する理解を容易にするために、多くの用語およびフレーズを以下に定義する。さらなる定義は「詳細な説明」全体を通して示す。
本明細書および請求項全体を通して、下記の用語は、文脈から明らかにそうではないと示される場合を除き、本欄に明示的に対応付けられた意味を持つ。明細書中の「一実施形態において」のようなフレーズは、同じ実施形態を指しうるが、必ずしもそうではない。また、明細書中の「別の実施形態において」というフレーズは、異なる実施形態を指しうるが、必ずしもそうではない。したがって、以下に示すように、本発明の様々な実施形態を、本発明の範囲または精神から逸脱しない範囲で組み合わせることは容易である。
加えて、文脈から明らかにそうではないと示される場合を除き、明細書中の用語「または」は、包含的な選択性機能語であり、用語「および／または」と同等である。また、文脈から明らかにそうではないと示される場合を除き、用語「～に基づく」は、排他的な表現ではなく、未記載のそれ以外の要素に基づくという意味も許容される。さらに、本明細書を通して、単数形の表現（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は複数形の意味を含む。また、「～において（ｉｎ）」は、「～において（ｉｎ）」および「～の上において（ｏｎ）」の意味を含む。
本明細書中の「核酸」または「核酸配列」は、ピリミジン塩基および／またはプリン塩基のポリマーもしくはオリゴマーを指し、好ましくはそれぞれシトシン、チミンおよびウラシルおよびアデニンおよびグアニンを指す（Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, 793-800 (Worth Pub. 1982)を参照のこと）。本願技術は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはペプチド核酸成分、および、その化学的変異体（例えば、これら塩基をメチル化、ヒドロキシメチル化、またはグリコシル化させた形態など）を考慮に入れる。ポリマーまたはオリゴマーは、組成として異種でも同種でもよく、天然発生源から単離されたものであってもよく、または人為的もしくは人工的に作られたものであってもよい。また、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合体であってもよく、一本鎖または二本鎖形態（ホモ二重鎖、ヘテロ二本鎖およびハイブリッドを含む）として不変にもしくは一時的に存在してもよい。いくつかの実施形態において、核酸または核酸配列は、例えばＤＮＡ－ＲＮＡへリックス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、および／または、リボザイムのような他種類の核酸構造を含む。ゆえに、用語「核酸」または「核酸配列」は、非天然型ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、および／または、天然型ヌクレオチドと同じ機能を示しうる非ヌクレオチド構成ブロック（例えば「ヌクレオチド類縁体」）を含む鎖も、包含し得る。また、本明細書中の用語「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、それらの断片や部分、ならびに、ゲノム由来または人工由来のＤＮＡもしくはＲＮＡを指し、一本鎖でも二本鎖でもよく、センス鎖を表わしてもよくアンチセンス鎖を表わしてもよい。
本明細書中の用語「ヌクレオチド類縁体」は、修飾ヌクレオチドまたは非天然発生型ヌクレオチドを指す。当該類縁体としては、改変スタッキング相互作用を有する類縁体、例えば７－ｄｅａｚａプリン（すなわち、７－ｄｅａｚａ－ｄＡＴＰ、および７－ｄｅａｚａ－ｄＧＴＰ）や、代替の水素結合構造を有する塩基類縁体（例えば、S. Bennerによる米国特許第６００１９８３号（参照により本明細書に援用される）に開示のＩｓｏ－Ｃ塩基対、Ｉｓｏ－Ｇ塩基対、およびその他の非標準塩基対）や、非水素結合型類縁体（例えば、B. A. Schweitzer and E. T. Kool、J. Org. Chem., 1994、59、7238-7242およびB. A. Schweitzer and E. T. Kool, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 1863-1872（何れの文献も参照により本明細書に援用される）に開示の２，４－ジフルオロトルエンのような非極性芳香族ヌクレオシド類縁体）や、５－ニトロ基インドール、３－ニトロ基ピロールのような「汎用」塩基や、汎用プリンとピリミジン（例えば、それぞれ、「Ｋ」ヌクレオチドと「Ｐ」ヌクレオチド。P. Kong et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 10373-10383と、P. Kong et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5149-5152）が挙げられる。ヌクレオチド類縁体は、ジデオキシヌクレオチドや２’－Ｏ－メチルヌクレオチドのような糖残基修飾ヌクレオチドを含む。また、ヌクレオチド類縁体は、デオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドの修飾形態を含む。
「ペプチド核酸」は、ペプチド様ポリアミド骨格を組み込んでなるＤＮＡ疑似物を意味する。
本明細書中の用語「％配列同一性」とは、核酸配列と基準配列とを整列させ、必要ならばギャップを導入して最大パーセントの同一性を達成するようにした後における、核酸配列中のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体と、基準配列中の対応するヌクレオチドとの同一性を示す百分率である。ゆえに、本願技術に係る核酸が基準配列よりも長い場合には、当該核酸のうち、基準配列と整列しない余分のヌクレオチドは、配列同一性を決定する際に考慮しない。なお、整列の方法およびコンピュータプログラムは、本技術分野において公知であり、ｂｌａｓｔｎ、Ａｌｉｇｎ２およびＦＡＳＴＡが挙げられる。
用語「相同」または「相同的」は同一性の程度を指し、部分的相同であってもよく、完全相同であってもよい。また、部分的相同配列とは、他方の配列との同一性が１００％未満の配列である。
本明細書中の用語「配列変化」とは、２つの核酸同士間での核酸配列の違いを指す。例えば、野生型構造遺伝子と該野生型構造遺伝子の変異形態とで、その配列は、一塩基置換、および／または、１以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入によって異なりうる。つまり、構造遺伝子のこの２つの形態は、一方の配列が他方と異なると考えられる。また、構造遺伝子には第２の変異形態も存在し得る。この第２の変異形態は、その配列が、野生型遺伝子および該遺伝子の上記第１の突然変異形態の両方と異なる。
本明細書中の用語「相補的」または「相補性」は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド同士（例えば、オリゴヌクレオチドのようなヌクレオチド配列、または標的核酸）について使用する用語である。例えば、「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’」配列は、「３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’」配列に相補的である。相補性は「部分的」な相補性であってもよく、すなわち、一部の核酸塩基のみが塩基対合則に従ってマッチしてもよい。あるいは、相補性は、核酸同士間での「完全な」または「全体的な」相補性であってもよい。核酸鎖同士間の相補性の程度は、核酸鎖同士間のハイブリダイゼーションの効率および強さに大きく影響する。これは、増幅反応、および、核酸同士間の結合に依存する検知法においては、特に重要なことである。また、どちらの用語も、個別のヌクレオチドに対して使用してよく、特にポリヌクレオチドに係る文脈に使用してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド中の特定のヌクレオチドの、他の核酸鎖中のヌクレオチドに対する相補性または相補性の欠如に、当該オリゴヌクレオチドの残りおよび当該核酸鎖の残りのあいだの相補性と対比または比較するかたちで注目してもよい。
一部の文脈では、用語「相補性」およびその関連用語（例えば「相補的」、「相補体」）は、核酸配列のうち水素結合を介して他の核酸配列に結合できるヌクレオチド、例えば、ワトソン－クリック塩基対合またはその他の塩基対合によって塩基対合可能なヌクレオチドを指す。塩基対を構成可能なヌクレオチド（例えば、互いに相補的であるヌクレオチド）としては、シトシン－グアニン塩基対、チミン－アデニン塩基対、アデニン－ウラシル塩基対、およびグアニン－ウラシル塩基対が挙げられる。相補性の百分率は必ずしも核酸配列の全長について計算する必要はない。また、相補性の百分率は、塩基対合された核酸配列中の特定領域（例えば、最初の塩基対合ヌクレオチドから開始し、最後の塩基対合ヌクレオチドで終了する）の当該百分率に限定されてもよい。本明細書中の核酸配列の相補体とは、一方の配列の５’末端が他方の配列の３’末端と対合するように該核酸配列へ整列されるとき、「アンチパラレル結合」状態となるオリゴヌクレオチドを指す。本発明における核酸は、天然の核酸に通常では存在しない何らかの塩基を含んでもよく、当該塩基としては、例えばイノシンや７－ｄｅａｚａグアニンが挙げられる。相補性は、必ずしも完璧である必要はない。安定した二重鎖は、ミスマッチ塩基対、または非マッチ塩基を含有してもよい。核酸の技術分野の当業者ならば、その経験から、多数の変化要因、例えばオリゴヌクレオチド長、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン化強度、ミスマッチ塩基対の発生率などを考慮し、二重鎖の安定性を決定することができる。
したがって、いくつかの実施形態において、「相補的」とは、第１の核酸塩基配列が、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個またはそれ以上の数の核酸塩基からなる領域において、第２の核酸塩基配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であること、または、当該２つの配列が厳格なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。また、「完全相補的」とは、第１核酸中の各核酸塩基が、第２核酸中の対応する位置の各核酸塩基にそれぞれ対合可能であることを意味する。例えば、ある実施形態では、全ての核酸塩基が核酸との相補性を有するオリゴヌクレオチドは、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個またはそれ以上の数の核酸塩基からなる領域において前記核酸の相補体と同一である核酸塩基配列を有する。
「ミスマッチ」とは、第１核酸中の核酸塩基が、第２核酸中の対応する位置の核酸塩基に対合できないことを意味する。
本明細書中の用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸同士の対合について使用する用語である。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強さ（すなわち、核酸間の結合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関係する条件の厳格度、形成されるハイブリッドのＴｍなどの要因に左右される。また、「ハイブリダイゼーション」の方法には、一方の核酸と、他方の相補的核酸（すなわち、相補的ヌクレオチド配列を有する核酸）とのアニーリングが伴う。相補的配列を含む核酸の２つのポリマーが互いを探し出し塩基対合の相互作用を介してアニールできることは周知の現象である。Marmur and Lane, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:453 (1960)およびDoty et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:461 (1960)による「ハイブリダイゼーション」処理に関する最初の所見に続いて、当該処理は改良され、現代の生物学に必要不可欠な手段となっている。
本明細書中の用語「Ｔｍ」は、「融解温度」について使用する。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団が二分されて一本鎖になる温度である。本分野では、核酸のＴｍを計算するいくつかの公知の計算式が存在する。標準的な参考文献に示されているように、１ＭのＮａＣｌ水溶液中に核酸が存在する場合には、等式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１＊（％Ｇ＋Ｃ）を用いてＴｍの簡単な推定値を計算することができる（例えば、Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)を参照のこと）。他の参考文献（例えばAllawi and SantaLucia、Biochemistry 36: 10581-94 (1997)）には、構造的特性、環境学的特性および配列特性を考慮してＴｍを計算するより高度な演算が挙げられている。例えば、いくつかの実施形態では、上記演算により、短鎖核酸型プローブおよび標的（例えば、実施例で用いられたもの）のＴｍのよりよい推定値が計算される。
本明細書中の用語「融解」は、核酸に対して使用する場合には、二本鎖核酸または核酸領域を解離して一本鎖核酸または核酸領域にすることを指す。
本明細書中の用語「融解要素」とは、核酸と相互作用して該核酸を融解して（例えば二本鎖領域（一本鎖核酸の二次構造、ＤＮＡの二重構造、または、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの二重構造など）を解離して）一本鎖領域にする（例えば、問合せプローブが結合する問合せ領域にアクセスできるようにする）物質、分子（例えば生体分子）、または、複数の分子からなる複合体（例えば、複数の生体分子からなる複合体）を指す。例示的な実施形態において、融解要素は、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体（例えば、ある実施形態では、ビオチン化されたｄＣａｓ９を含み、ある実施形態ではビオチン化されていないｄＣａｓ９を含む）である。但し、本願技術において、ｄＣａｓ９を含む融解要素に限らない。また、本願技術は、問合せプローブによる問合せ領域へのアクセスを提供し、標的核酸のＳｉＭＲＥＰＳ分析を実現する任意の実体の使用を含む。
本明細書中の「二本鎖核酸」は、核酸の一部、長鎖核酸における領域、または、核酸全体であってもよい。また、「二本鎖核酸」は、例えば二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド等であってもよく、これらに限定されない。なお、二次構造（例えば、塩基対合した二次構造）および／またはさらなる高次的構造を有する一本鎖核酸は「二本鎖核酸」を含む。例えば、三重構造は「二本鎖」と見做す。いくつかの実施形態では、塩基対合したいかなる核酸も「二本鎖核酸」である。
本明細書中の「非コードＲＮＡ」または「ｎｃＲＮＡ」とは、タンパク質へ翻訳されない機能性ＲＮＡ分子である。それほど頻繁に使用されない同義語としては、非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｐｃＲＮＡ）、非伝令ＲＮＡ（ｎｍＲＮＡ）、低分子非伝令ＲＮＡ（ｓｎｍＲＮＡ）、および機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）がある。また、「低分子ＲＮＡ」（ｓＲＮＡ）とは、細菌のｎｃＲＮＡに対してよく使われる用語である。非コードＲＮＡが最終産物として転写されるＤＮＡ配列は、しばしばＲＮＡ遺伝子または非コードＲＮＡ遺伝子と呼ばれる。非コードＲＮＡ遺伝子には、非常に豊富かつ機能的に重要なＲＮＡ（例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ））や、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡのようなＲＮＡが含まれる。ヒトゲノム内にコードされるｎｃＲＮＡの数はまだ解明されていないが、最近の転写学および生物情報学の研究によれば、数千のｎｃＲＮＡが存在することが示唆されている。新たに同定されたｎｃＲＮＡの大半は、その機能がまだ確認されていないため、その多くは非機能的なものであるかもしれない。
本明細書中の用語「長鎖非コードＲＮＡ」、「ｌｎｃＲＮＡ」または「長鎖ｎｃＲＮＡ」とは、約２００ヌクレオチドよりも長い非タンパク質コードＲＮＡを指す。なお、本明細書中のこれらの用語は、ｌｎｃＲＮＡを、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）および低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）などのような低分子調節ＲＮＡ、および、その他の短鎖ＲＮＡから区別するために使用される。
本明細書中の用語「ｍｉＲＮＡ」はマイクロＲＮＡを指す。また、本明細書中の用語「ｍｉＲＮＡ標的配列」は、（例えば、他の核酸の存在下での）検知対象のｍｉＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ変異体である。
用語「ｓｉＲＮＡ」は短鎖干渉ＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは二重鎖領域または二本鎖領域を含み、当該二本鎖領域のそれぞれの鎖は約１８～２５ヌクレオチド長である。前記二本鎖領域は、最短で１６塩基対、最長で２９塩基対であってもよく、その長さはアンチセンス鎖により決まる。ｓｉＲＮＡは、その各鎖の３’末端において、しばしば約２個乃至４個の非対合ヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物体および脊椎動物体内のＲＮＡ干渉を誘発したり、植物中の転写後の遺伝子抑制のあいだに配列特異的ＲＮＡの分解を誘発したりする際、中心的媒介として機能すると思われる。ｓｉＲＮＡの二重鎖領域または二本鎖領域における少なくとも一本の鎖が、標的ＲＮＡ分子と実質相同または実質相補的である。なお、標的ＲＮＡ分子に相補的な鎖は「アンチセンス」鎖であり、標的ＲＮＡ分子に相同的な鎖は「センス」鎖であって、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的でもある。また、前記二本鎖領域における一方の鎖は、その対向鎖と厳密に同じ長さである必要はない。したがって、一方の鎖は、対向する相補的鎖に比べて少なくとも１ヌクレオチド少ないことで「バブル」が形成されてもよく、マッチしない少なくとも１つの塩基を対向鎖に有してもよい。また、二本鎖領域における一方の鎖は、必ずしも対向鎖と厳密に相補的である必要はない。したがって、当該鎖（好ましくはセンス鎖）は、少なくとも１つのミスマッチ塩基対を有してもよい。
ｓｉＲＮＡは付加配列を含んでもよい。このような付加配列は、例えば、前記二重鎖領域の２つの鎖を連結するリンキング配列またはループが挙げられるが、これに限らない。ｓｉＲＮＡのこのような形態は「ｓｉ様ＲＮＡ」、「短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡ」または「ヘアピンｓｉＲＮＡ」と呼んでもよい。なお、ここで言う短鎖とは、ｓｉＲＮＡの二重鎖領域を指す。ｓｉＲＮＡ中に存在する付加配列の非限定的な例として、ステム構造または他の折り曲げ構造が挙げられる。上記付加配列は、既知の機能を有してもよく、有さなくてもよい。当該既知の機能の例としては、ｓｉＲＮＡ分子の安定性を向上させる機能、または、細胞へのシグナル（cellular destination signal）を形成する機能が挙げられるが、これらに限らない。
「ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ」または「ｐｒｅ－ｍｉＲ」とは、ヘアピン構造を有する非コードＲＮＡを指し、Ｄｒｏｓｈａとして知られている二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼを用いてｐｒｉ－ｍｉＲを切断して得た産物である。
「ステムループ型配列」は、ヘアピン構造を持ち、成熟ｍｉＲＮＡ配列を有するＲＮＡを意味する。Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列およびステムループ型配列は重複してもよい。ステムループ型配列の例は、ｍｉＲ Ｂａｓｅとして知られているｍｉＲＮＡデータベースにある（ウェブサイトmicroma.sanger.ac.ukで参照可能）。
「ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ」または「ｐｒｉ－ｍｉＲ」とは、ヘアピン構造を有する非コードＲＮＡを指し、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＤｒｏｓｈａの基質である。
「ｍｉＲＮＡ前駆体」は、１つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含む非コード構造化ＲＮＡを含むゲノムＤＮＡ由来転写物を意味する。例えば、ある実施形態では、ｍｉＲＮＡ前駆体はｐｒｅ－ｍｉＲＮＡである。また、ある実施形態では、ｍｉＲＮＡ前駆体はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡである。
用語「遺伝子」は、非コード機能を有するＲＮＡ（例えばリボソームまたは転移ＲＮＡ）、ポリペプチドまたは前駆体を産出するのに必要なコントロール配列もしくはコード配列を含むＤＮＡ配列を指す。当該ＲＮＡまたはポリペプチドは、所望の活性や機能が維持されるのであれば、コーディング配列の全長、または当該コーディング配列の任意の部分によってコードされてもよい。
用語「野生型」とは、天然発生源から単離された際の遺伝子または遺伝子産物の特性を持つ遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型の遺伝子は、個体群の中で最も頻繁に観察されるため、当該遺伝子の「正常型」または「野生型」と恣意的に指定される。それと対照的に、用語「修飾型」、「変異型」または「多型性」とは、野生型の遺伝子もしくは遺伝子産物に比べ、配列および／または機能的特徴に変化（すなわち、改変特性）が現れている遺伝子もしくは遺伝子産物を意味する。なお、天然発生の変異型は単離され得る。その存在は、野生型の遺伝子もしくは遺伝子産物に比べて改変特性を有するという事実により確認することができる。
本明細書中の用語「オリゴヌクレオチド」は、２以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは少なくとも５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０～１５ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５～３０ヌクレオチドを含む分子であると定義される。なお、その実際のサイズは多くの要因に依存し、そうした多くの要因が今度は、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存する。オリゴヌクレオチドは任意の方法で生成されてよく、その例として、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
モノヌクレオチドは、１つのモノヌクレオチド五炭糖環の５’リン酸塩がリン酸ジエステル結合を介して隣の五炭糖環の３’酸素と一方向に連結するという方式により反応し、オリゴヌクレオチドが作られる。そのため、オリゴヌクレオチドの末端は、該オリコヌクレオチドの５’リン酸塩がモノヌクレオチド五炭糖環の３’酸素と結合していない場合には「５’末端」と称し、前記３’酸素が以降のモノヌクレオチド五炭糖環の５’リン酸塩と結合していない場合には「３’末端」と称する。本明細書中の核酸配列は、たとえより大きなオリゴヌクレオチドの内部にあっても、５’末端および３’末端を有すると称し得る。核酸鎖上の第１領域は、該核酸の鎖の５’末端から３’末端へ向かって見て該第１領域の３’末端が第２領域の５’末端の手前に存在する場合には、他領域の上流に位置すると言う。
互いに異なり重複していない２つのオリゴヌクレオチドを同じ直鎖状の相補的な核酸配列上の異なる領域にアニールし、一方のオリゴヌクレオチドの３’末端が他方のオリゴヌクレオチドの５’末端の方を向いている場合、前記一方のオリゴヌクレオチドを「上流側」オリゴヌクレオチドと呼び、前記他方のオリゴヌクレオチドを「下流側」オリゴヌクレオチドと呼んでよい。同様に、互いに重複している２つのオリゴヌクレオチドを同じ直鎖状の相補的な核酸配列にハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドが、その５’末端が第２のオリゴヌクレオチドの５’末端の上流にあり、且つ第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が第２のオリゴヌクレオチドの３’末端の上流にあるように位置している場合、当該第１のオリゴヌクレオチドを「上流側」オリゴヌクレオチドと呼び、当該第２のオリゴヌクレオチドを「下流側」オリゴヌクレオチドと呼んでよい。
本明細書中の用語「対象」および「患者」は、植物、微生物、動物（例えば、イヌ、ネコ、家畜およびヒトなどの哺乳類動物）を含む任意の有機体を指す。
本願の明細書および請求項中の用語「サンプル」は、その最も広い意味において用いられる。当該用語は、試料または培養物（例えば微生物学上の培養物）の意味を包含する一方、生体サンプルおよび環境サンプルの意味も包含する。サンプルは合成由来の試料を含んでもよい。
本明細書中の「生体サンプル」とは、生体組織または体液のサンプルを指す。例えば、生体サンプルは、動物（ヒトを含む）から採取したサンプルや、体液サンプル、固体サンプルまたは組織サンプルや、流動食、固形食、飼料や、乳製品、野菜、食肉、食肉副産物のような材料や、排泄物であってもよい。また、生体サンプルは、様々な家畜物全般、および野生または自然界の動物から採取してもよい。当該野生または自然界の動物として、有蹄類、クマ、魚類、ウサギ目、齧歯類などの動物が挙げられるが、これらに限らない。生体サンプルの例としては、組織切片、血液、血液画分、血漿、血清、尿、または、その他の末梢源または細胞培養物、細胞コロニー、単一細胞、単一細胞集合から得られるサンプルを含む。さらに、生体サンプルは、上述したサンプルのプールまたは混合物を含む。また、生体サンプルは、対象から細胞サンプルを切除して調達してもよいが、予め単離されたサンプルを用いて調達してもよい。一例として、疾患にかかっていると疑われる対象から、従来の生検手法を用いて、組織サンプルを切除してもよい。いくつかの実施形態では、対象から血液サンプルを採取する。患者からの生体サンプルは、疾患に侵されていると疑われる対象からのサンプルを意味する。
また、環境サンプルは、環境学上の材料、例えば地表物質、土壌、水、産業上のサンプル、ならびに、食品加工および酪農加工における器具、装置、設備、用具、使い捨て品や非使い捨て品から採取されるサンプルを含む。なお、上記の例は、本発明に適用可能なサンプル種類への限定と解釈されるべきではない。
本明細書中の用語「標識」とは、検知可能（好ましくは定量化可能）という効果を実現するために利用可能かつ核酸またはタンパク質と連結可能な、任意の原子または分子を指す。標識として、色素（例えば、蛍光性色素または蛍光性部分）、放射性標識（例えば、３２Ｐ）、結合部分（例えば、ビオチン）、ハプテン（例えば、ジゴキシゲニン）、発光性部分、燐光性部分または蛍光性部分、マスタグ（mass tag）、および、蛍光性色素単独、または該蛍光性色素と、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって発光スペクトルを抑制またはシフトできる部分との結合体が挙げられるが、これらに限定されない。標識は、蛍光、放射能、比色分析、重力測定、Ｘ線の回折や吸収、磁性、酵素活性、質量特性や質量に影響される性質（例えばＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析法、蛍光偏光法）等によって検知可能な信号を発してもよい。また、標識は、帯電部分（正電荷または負電荷）であってもよく、代わりに電荷中性であってもよい。標識は、当該標識を含む配列が検知可能である限り、核酸またはタンパク質配列を含むか、核酸またはタンパク質配列から成ってよい。
本明細書中の「担体」または「固体担体」とは、その上またはその中に核酸分子、微粒子等が固定化されうる基材を指す。例えば、当該核酸分子、微粒子等は、該基材に共有結合的または非共有結合的に付着してもよく、あるいは、当該核酸分子、微粒子等は、該基材内または該基材上に部分的もしくは完全に埋入され、それによって、自由に拡散したり互いに動いたりするのをほとんどまたは完全に防いでもよい。
本明細書中の「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」とは、解離しうる物体中の２以上の部分要素のうちの１つ、例えばオリゴヌクレオチド、分子、化学基、ドメイン、プローブ等の様々な部分要素を指す。
本明細書中の「問合せプローブ」または「読取プローブ」とは、核酸を認識する（例えば、核酸と結合する、例えば、核酸と特異的に結合する）任意の実体（例えば、分子、生体分子など）を指す。例示的な実施形態において、問合せプローブは、核酸を認識するタンパク質（例えば、核酸結合型タンパク質、抗体、抗体断片、転写因子、または、核酸内の特定配列と結合するその他の任意のタンパク質）である。他のいくつかの例示的な実施形態において、問合せプローブは、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸、修飾塩基および／または塩基同士間の修飾された連結を有する核酸。例としては、前述した核酸、核酸アプタマー、または、核酸内の特定配列と結合する他の任意の核酸が挙げられる）である。いくつかの実施形態において、問合せプローブは、例えば、検知可能な標識（例えば、上述した蛍光性部分）で標識されている。いくつかの実施形態において、問合せプローブは、２種類以上の分子（例えば、タンパク質、核酸、化学的リンカーおよび化学的部分のうち、２つ以上）を含む。
本明細書中の「捕獲プローブ」とは、核酸を認識する（例えば、核酸と結合する、例えば、核酸と特異的に結合する）任意の実体（例えば、分子、生体分子など）を指す。例示的な実施形態において、捕獲プローブは核酸を認識するタンパク質（例えば、核酸結合型タンパク質、抗体、抗体断片、転写因子、または、核酸内の特定配列と結合するその他の任意のタンパク質）である。他のいくつかの例示的な実施形態において、捕獲プローブは核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸、修飾塩基および／または塩基同士間の修飾された連結を有する核酸。例としては、前述した核酸が挙げられる）である。いくつかの実施形態において、捕獲プローブは、例えば、検知可能な標識（例えば、上述した蛍光性部分）で標識されている。いくつかの実施形態において、捕獲プローブは、２種類以上の分子（例えば、タンパク質、核酸、化学的リンカーおよび化学的部分のうち、２つ以上）を含む。
＜説明＞
単一の核酸の特異的超高感度検知に関する技法の実施形態を説明する。前述したように（例えば、米国特許出願第１４／５８９４６７号を参照のこと。参照によりその全文が本明細書に援用される）、ＳｉＭＲＥＰＳでは、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡、単分子可視化、および、蛍光標識プローブの標的分子への結合および当該標的分子からの放出の動的分析（例えば、図１ａを参照のこと）が用いられている。なお、標的分子は、簡単かつ増幅のない、直接カウントによる動的フィンガープリント同定により定量化される。この同定は、過去にマイクロＲＮＡの検知で実証されたように、単一のヌクレオチド変異体同士を鋭敏に識別する（例えば、米国特許出願第１４／５８９４６７号を参照のこと。参照によりその全文が本明細書に援用される）。本明細書に記載の技術によれば、核酸のその他の形態の検知、例えば、多量の野生型を背景として、例えば、ＤＮＡ、変異ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡの検知が実現される。
核酸の検知に関する既存手法は、標的分子とともに熱力学的に安定した複合体を形成するプローブを用いるため、バックグラウンド信号または偽標的に対して、弱く、しばしば信頼できない熱力学的識別能しか持たない。これに対して、本明細書に記載の技術は、問合せ領域において標的分子と繰り返し結合するプローブと、観測される各標的分子に発生する独立した結合事象を大量に記録する関連方法と、を用いている。このような動的なサンプリングを繰り返すことにより、標的に関する唯一の動的「フィンガープリント」が提供され、高度に特異的かつ高感度の核酸の検知が行われる。いくつかの実施形態において、本願技術によれば、最少１つのヌクレオチドが異なる２つの核酸分子の識別が行われる。また、いくつかの実施形態において、本願技術によれば、２つの核酸分子のうち一方の核酸分子が過剰（例えば１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、１００００００倍またはそれ以上）である場合に、当該２つの核酸分子の識別が行われる。例えば、米国特許出願第１４／５８９４６７号を参照のこと（参照によりその全文が本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態において、標識化された核酸を、例えば当該標識から発生する信号を検知するための計器で検知する。例えば、いくつかの実施形態は、検知可能に標識化された（例えば蛍光標識化された）問合せプローブの使用と、蛍光顕微鏡法のような蛍光発光の検出器の使用とを含む。いくつかの実施形態において、本願技術は、生体サンプル中の、変異または異型発現核酸標的を同定するための診断用ツールとして用いられる。例えば、米国特許出願第１４／５８９４６７号を参照のこと（参照によりその全文が本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態において、本アプローチでは、固体担体（例えば、ガラスまたは溶融シリカ）に連結したｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体で未標識の核酸を捕獲し、問合せ領域を融解した後に、検知可能に標識化された（例えば、蛍光標識化された）短鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）問合せプローブが当該問合せ領域に対して繰り返し一時的に結合するのを観察する。
いくつかの実施形態において、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、固体担体に付着または固定化される。いくつかの実施形態において、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、該ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を固体担体に固定化するための部分を含み、当該固定化は、該部分と、該固体担体上に付着した第２の部分との相互作用によって実現される。ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、固体担体に直接的または間接的に固定化されてもよい。
ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の担体として、様々な材料の任意の一つを用いてよく、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、磁性吸着可能な材料から作られた基材または粒子を用いてよい。本明細書に記載の顕微鏡法で画像化するためには、担体は二次元の平面であることが好ましい。ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、例えば、様々な共有結合型連結、キレート化、またはイオン相互作用によって固体担体に直接結合することで固定化されてもよく、当該担体に接合された１つ以上のリンカーを介して当該担体に間接結合することで固定化されてもよい。いくつかの実施形態において、前記リンカーは核酸である。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、標的核酸の捕獲領域とのハイブリダイズが意図されていない（例えば、ハイブリダイズしない）ものの、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体とその固体担体との間のスペーサとして機能するように意図された１つ以上のヌクレオチドを含む、核酸である。
いくつかの実施形態において、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体はビオチン基を備え（例えば、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体がビオチン化されている）、固体担体はストレプトアビジン基（例えば、リンカー部分（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー等）を介して固体担体に付着している）を含む。したがって、ビオチンとストレプトアビジンとの特異的相互作用により、捕獲プローブが固体担体上に固定化される（図１ａ、図３および図４）。
様々な他の化学的方法を用いて、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を固体担体に固定化させてもよい。このような方法の一例としては、マレイミド基とチオール（－ＳＨ）基との組合せを用いる方法が挙げられる。当該方法では、チオール（－ＳＨ）基はｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体と結合しており、固体担体はマレイミド基を含んでいる。そのため、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のチオール基が固体担体上のマレイミド基と反応して共有結合を形成し、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体はこの共有結合によって固定化される。マレイミド基の導入は、ガラス基材とアミノシランカップリング剤とを反応させた後、アミノ基とＥＭＣＳ試薬（Ｎ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド；同仁化学研究所から入手可能）との反応によってマレイミド基をガラス基材上に導入する工程を用いてもよい。また、ＤＮＡへのチオール基の導入は、当該ＤＮＡがＤＮＡ合成装置によって自動的に合成される場合には、５’－チオール修飾因子Ｃ６（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から入手可能）を用いて行ってもよい。
いくつかの実施形態では、固定化を行うための官能基同士の組み合わせとして、上述のチオール基とマレイミド基との組み合わせの代わりに、例えばエポキシ基（固体担体上に存在する）とアミノ基（ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体）との組み合わせを用いる。なお、様々な種類のシランカップリング剤を用いる表面処理も有効である。また、タンパク質を固体担体および固体表面上に付着させるその他の技法は本分野では公知である。
＜ポアソン過程＞
本願技術の実施形態は、プローブ（例えば問合せプローブ）が標的（例えば問合せ領域）と結合する際の特徴的な運動を記録することによる単分子認識に関する。特定の実施形態では、このプロセスはポアソン過程である。ポアソン過程とは、所定の時間間隔内に事象（例えば、検知可能に標識化された（例えば、蛍光性）問合せプローブと固定化された標的との一時的結合）が発生する回数および時間をカウントする連続時間確率過程である。連続する事象各ペア間の時間間隔は指数分布を持ち、それぞれの間隔は他の間隔から独立していると見なされる。ポアソン分布とは、所定の数の事象が、既知の平均割合で、前回の事象からの時間と独立して生じる場合に、所定の時間間隔内に発生する確率を示す離散確率分布である。ポアソン分布は、他の特定の間隔、例えば距離、面積、体積等における事象の回数にも適用できる。
ポアソン分布は、通常の二項分布に関する特別なケースであり、試行数ｎが大きく、当たり確率ｐが低く、かつ、積ｎｐ＝λが中程度である。ポアソン過程では、任意の時間ｔにおいて事象数Ｎがｊになる確率は下式のポアソン確率分布Ｐｊ（ｔ）に従う。
Figure 2023153898000002
すなわち、時間ｔまでに発生する事象の数Ｎは、パラメータλｔを伴うポアソン分布を有する。ポアソン過程およびポアソン分布に関連する統計学および数学的方法は当該分野において公知である。例えば、“Stochastic Processes (i): Poisson Processes and Markov Chains” in Statistics for Biology and Health - Stastistical Methods in Bioinformatics (Ewans and Grant, eds.), Springer (New York, 2001)；page 129 et seq.を参照のこと（参照によりその全文が本明細書に援用される）。また、例えばＭａｔｌａｂおよびＲのようなソフトウェアパッケージを使用し、ポアソン過程、ポアソン確率およびポアソン分布と関連する数学的および統計学的方法を実行してもよい。
＜検出の動力学＞
本願技術の特定の実施形態は、問合せプローブと、検知される標的核酸の問合せ領域との相互作用の動力学を分析することで核酸を検知する構成に関する。（例えば平衡濃度[Ｑ]の）問合せプローブＱと（例えば平衡濃度[Ｔ]の）標的核酸Ｔとの相互作用に関しては、標的核酸Ｔの問合せ領域にハイブリダイズした問合せプローブＱを含む複合体ＱＴの、時間に依存したフォーメーションは、運動速度定数ｋｏｎで記述される。特定の実施形態では、ＱＴ複合体のフォーメーションは、問合せプローブの濃度に依存する二次速度定数（単位：Ｍ－１ｍｉｎ－１；または同様な単位）と関連付けられるものであるが、当該ＱＴ複合体のフォーメーションを、ＱＴ複合体のフォーメーションと関連付けられた疑似的な一次速度定数ｋｏｎで記述する。したがって、本明細書中のｋｏｎは見かけ（「疑似」）の一次速度定数である。
同様に、複合体ＱＴから問合せプローブＱおよび標的核酸Ｔへの時間に依存した解離は、運動速度定数ｋｏｆｆで記述される。本明細書中の運動速度の典型的な単位はｍｉｎ－１またはｓ－１である。結合状態の問合せプローブＱの「滞留時間（τｏｎ）」とは、問合せプローブＱが標的核酸Ｔの問合せ領域に結合してＱＴ複合体を形成する各場合において、プローブＱが標的核酸Ｔの問合せ領域にハイブリダイズされる時間間隔（例えば、期間）を指す。また、非結合状態の問合せプローブＱの「滞留時間（τｏｆｆ）」とは、問合せプローブＱが標的核酸Ｔの問合せ領域に結合してＱＴ複合体を形成する各場合同士の間において、プローブＱが標的核酸Ｔの問合せ領域にハイブリダイズされていない時間間隔（例えば、期間）を指す（例えば、問合せプローブＱと標的核酸Ｔとの連続的な結合事象同士の間に、問合せプローブＱが標的核酸Ｔから解離している時間）。なお、滞留時間は、多数の結合事象および不結合事象を統合した平均値もしくは加重平均値であってもよい。
また、いくつかの実施形態において、問合せプローブ（例えば、検知可能に標識化された問合せプローブ（例えば、蛍光プローブ）、例えば、ＤＮＡプローブもしくはＲＮＡプローブのような核酸プローブ）と固定化された標的との、反復された確率論的結合は、単位時間あたり一定の確率で発生するポアソン過程であって単位時間あたりの結合事象および解離事象の数量の標準偏差（Ｎｂ＋ｄ）が「（Ｎｂ＋ｄ）１／２」として増加するポアソン過程として、モデル化される。ゆえに、観測時間が増加すれば、統計的なノイズは、Ｎｂ＋ｄのより小さな一部となる。したがって、いくつかの実施形態では、標的結合とオフターゲット結合との識別を達成するために、必要に応じて観測時間を延ばす。そして、取得時間が増えるため、Ｎｂ＋ｄヒストグラム中の信号ピークおよびバックグラウンドピークがますます分離され、信号分布の幅が倍率「Ｎｂ＋ｄの平方根」で増加する。これは動的モンテカルロシミュレーションに一致している。取得時間が約１０分間（例えば約１～１００分間。例えば１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１１分間、１２分間、１３分間、１４分間、１５分間、１６分間、１７分間、１８分間、１９分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、８０分間、９０分間または１００分間）であれば、信号をＮｂ＋ｄの背景分布から十分に（例えば完全に）分離することができ、標的を実質的に背景無しで定量化できる。例えば、米国特許出願第１４／５８９４６７号を参照のこと（参照によりその全文が本明細書に援用される）。
また、いくつかの実施形態では、好都合な実験タイムスケールにおいて信号ピークとバックグラウンドピークとを十分に分離することが可能なプローブ長を選択する。特に、問合せプローブの置換の動力学は、問合せプローブと標的核酸との相補的塩基の数量に関係する。例えば、いくつかの実施形態では、短鎖ＤＮＡ問合せプローブとその相補体との相互作用は、形成される塩基対の数量のほぼ指数関数として増加するが、一方、結合速度定数は、少なくとも６～７塩基を有する相互作用に対して弱く影響されるだけである。このように、問合せプローブの長さを変化させることで動力学上の挙動を調節することにより、問合せプローブと標的との結合事象を背景結合から識別する効果が向上する。特に、長さ９ｎｔ～１０ｎｔ（１７．５℃～２５℃の理論Ｔｍ値を実現する）の問合せ（例えば蛍光性の）プローブを用いれば、標的の存在および非存在下での候補分子ごとの強度変化ヒストグラムに示されるように、バックグラウンド信号から区別される迅速な標的結合が実現可能である。例えば、米国特許出願第１４／５８９４６７号を参照のこと（参照によりその全文が本明細書に援用される）。さらに、いくつかの実施形態において、結合および解離の動力学は、二重鎖の融解温度よりも、プローブ長の方とより密接に相関している。いくつかの実施形態では長さ９ｎｔ～１０ｎｔのプローブの使用が含まれるが、本願技術は上記長さに限定されない。実際、例えば、本明細書を通して論じるように、本願技術では９ｎｔ～１０ｎｔよりも長い、または短いプローブの使用も考えられる。
本開示は特定の例示的な実施形態を説明しているが、これらの実施形態は例として提示されたのであり限定として提示されたのではないと理解されるべきである。
＜二本鎖核酸の検知＞
本技術の実施形態は二本鎖核酸の検知を提供する。いくつかの実施形態は、１つ以上の核酸を検知するための複数の分子を含む組成、反応混合物および複合体を提供する。当該組成、反応混合物および複合体のいくつかの実施形態は、検知、同定、定量化および／または特徴付けされる核酸（例えば標的核酸）と、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を有する固体基材であって、当該ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は固体表面に連結されて高特異性によって標的の１つ以上の領域と結合する、固体基材と、検知可能に標識化された（例えば蛍光性の）問合せプローブと、を備える。いくつかの実施形態は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）型ＤＮＡオリゴヌクレオチドをさらに含む。
ＳｉＭＲＥＰＳ技術は、短鎖（６～１２ヌクレオチド）蛍光標識化ＤＮＡプローブと、ガラス表面上に固定化された未標識の核酸標的（例えばｍｉＲＮＡ）との直接結合を活用する（図１ａ）（例えば、米国特許出願第１４／５８９４６７号を参照のこと。参照によりその全文が本明細書に援用される）。ＴＩＲＦ顕微鏡法（Walter et al (2008) “Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit” Nat Methods 5: 475-89）を用いて、固定化された標的との非特異的な表面結合（図１ｂ）および特異的結合（図１ｃ）の両方を検知した。但し、プローブと標的との平衡結合は、特有の動的サインもしくはフィンガープリントをもたらすため、バックグラウンド結合に対して極めてはっきりと識別することが達成可能である（図１ｂと図１ｃを比較せよ）。プローブと固定化された標的との一時的結合はポアソン過程に似ているため、結合事象数および解離事象数の標準偏差（Ｎｂ＋ｄ）は、
Figure 2023153898000003
という倍率で増加する。実験上の取得時間が増加するため、Ｎｂ＋ｄヒストグラム中の信号ピークおよびバックグラウンドピークが次第に好適に分離していき（図１ｄ）（例えば、Johnson-Buck al. (2015) “Kinetic fingerprinting to identify and count single nucleic acids” Nat Biotechnol 33: 730-2を参照のこと）、標的結合とオフターゲット結合との任意に高い識別が可能となる。
ＳｉＭＲＥＰＳをＲＮＡの定量に用いる（例えば、米国特許出願第１４／５８９４６７号を参照のこと。参照によりその全文が本明細書に援用される）。特に、過去の実験で、癌および他の疾患では調節不良となる４つのヒトｍｉＲＮＡの定量化がなされた。標的とプローブとからなる全てのペアについての識別（例えば特異性＝１）が達成され、標準カーブは標的の濃度に対して一次従属を示した（図１ｅ）。１ヌクレオチドのみ異なる２つのマイクロＲＮＡを、最も高い特異性をもって、１つの蛍光性プローブで識別する（図２ａ～ｃ）。ＳｉＭＲＥＰＳでは、複雑な生体マトリックス中の標的が検知される（図２ｄ、２ｅ）。また、種々の標的濃度をスパイクインしたあとの血清サンプルから、前立腺癌バイオマーカーｈｓａ－ｍｉＲ－１４１８も検知された。測定された濃度は、見かけのスパイクイン濃度と強い相関性を持っていた（図２ｆ。Ｒ＞０．９９９、傾き＝１．０７）。
二本鎖核酸の検知にＳｉＭＲＥＰＳ技術を適用する際に困難な点の一つは、問合せプローブと標的核酸との（例えば問合せ領域における）一時的結合が、相補鎖と問合せ領域（例えばｄｓＤＮＡ）との標的部位における結合と競合することである。したがって、本願技術は二本鎖ＤＮＡの検知にＳｉＭＲＥＰＳを用いる。この困難を克服するために、本技術に係るいくつかの実施形態は、特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を積んだ触媒作用不活性（「無効型」）ｄＣａｓ９酵素を使用することでｄｓＤＮＡの構造を局所的に配列特異的に融解し、ＳｉＭＲＥＰＳプローブのためのアクセスを実現する（図３）。関連する実施形態では、二本鎖核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）と結合するタンパク質、および／または、二本鎖核酸（例えば核酸の領域）を解離して一本鎖核酸にする融解要素（例えばタンパク質または核酸）を使用する。
＜ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体＞
本技術は、配列特異的な核酸結合成分（例えば分子、生体分子、あるいは１つ以上の分子および／または生体分子の複合体）を使用することにより、核酸を固定化、および／または、二本鎖核酸（例えば二本鎖核酸の領域）を変換して一本鎖領域にする。例示的な実施形態において、配列特異的な核酸結合成分は、酵素不活性の、または「無効型」のＣａｓ９タンパク質（「ｄＣａｓ９」）と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。様々な類型および種類の細胞に対するゲノム編集のために、ＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムのような核酸結合分子が幅広く採用されているが、本願技術では、遺伝子組換および遺伝子操作された核酸結合タンパク質を用い、二本鎖核酸を融解してプローブ結合用の一本鎖核酸にする。
Ｃａｓ９タンパク質は、細菌順応性免疫システムの一成分として発見された（例えばBarrangou et al., (2007) “ＣＲＩＳＰＲ provides acquired resistance against viruses in prokaryotes” Science 315: 1709-1712を参照のこと）。Ｃａｓ９は、ＲＮＡに誘導されるエンドヌクレアーゼであり、ｇＲＮＡと外来ＤＮＡとの間で配列特異性を実現するＲＮＡ：ＤＮＡ塩基対合を利用して細菌内で外来ＤＮＡを標的として破壊する。最近では、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体をゲノム編集に用いる事例が報告されている（例えばDoudna et al., (2014) “The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9” Science 346: 6213を参照のこと）。
したがって、一部のＣａｓ９／ＲＮＡ複合体は、（１）標的ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を持つＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および（２）トランス－活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、という２つのＲＮＡ分子を備える。この場合、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を利用して標的配列を認識し切断するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとして機能する。近年、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡよりも、アニールされるｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡの構造を模倣するシングルキメラ型ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の利用が広がりつつある。理由は、そのｇＲＮＡアプローチにより、２つの成分（例えばＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ）のみを有する簡略なシステムが実現されるためである。このように、核酸への配列特異的結合は、天然のデュアルＲＮＡ複合体（例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９とを含む）またはキメラ型シングルガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９）による誘導が可能である（例えばJinek et al., (2012) “A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity” Science 337:816-821を参照のこと）。
本明細書では、ｃｒＲＮＡ（２－ＲＮＡシステム）またはｓｇＲＮＡ（シングルガイドシステム）の標的領域を「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）と称する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、１０～５０塩基、例えば１５～４０塩基、例えば１５～３０塩基、例えば１５～２５塩基（例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個または５０個の塩基）を含む、または、それらから成る、または実質的にそれらから成る。なお、Ｃａｓ９に関する最も効率的な標的認識を実現するｇＲＮＡ長を決定する方法は、本分野において公知である。例えばLeeet al. (2016) “The Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 System Enables Specific Genome Edithing in Mammalian Cells” Molecular Therapy, 19 January 2016; doi:10.1038/mtを参照のこと。
したがって、いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９と結合するための「足場」配列と、核酸標的に相補的である、ユーザに定義された約２０ヌクレオチドの「標的」配列と、を含む短鎖人工ＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的特異性は、２つの要因、すなわち、１）ｇＲＮＡ標的配列にマッチするＤＮＡ配列と、当該標的配列の直接下流に位置するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）と、によって決定される。一部のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列と、それに隣接し、ｇＲＮＡに相補的な約２０塩基とを含むＤＮＡ配列を認識する。標準的なＰＡＭ配列としては、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９に対するＮＧＧもしくはＮＡＧ、および、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）由来のＣａｓ９に対するＮＮＮＮＧＡＴＴがある。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的配列へのハイブリダイゼーションによるＤＮＡ認識の後、Ｃａｓ９は、固有のヌクレアーゼ活性を利用してＤＮＡ配列を切断する。なお、ゲノム編集やその他の目的で最も利用されているのは、化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。このシステムを利用すれば、５’にてＰＡＭに隣接する約２０塩基のＤＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を有するｇＲＮＡを設計して、特定の標的核酸を（例えば編集またはその他の操作目的で）標的にすることができる。Ｃａｓ９に関する最も効率的な標的認識を実現するＰＡＭ配列を決定する方法は、本分野において公知である。例えばZhang et al. (2013) “Processing-independent CRISPR RNAs limit natural transformation in Neisseria meningitidis” Molecular Cell 50: 488-503、および、Lee et al.による前記の文献を参照のこと。
本技術は、Ｃａｓ９の触媒作用不活性形態（「無効型Ｃａｓ９」または「ｄＣａｓ９」）、すなわち、点変異を導入してヌクレアーゼ活性を無くした形態を利用する。いくつかの実施形態において、ｄＣａｓ９タンパク質は化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）に由来する。また、いくつかの実施形態において、ｄＣａｓ９タンパク質は、例えば、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３および／またはＤ９８６、ならびに、Ｈ８４０および／またはＮ８６３における変異（例えば、Ｄ１０およびＨ８４０における変異、例えばＤ１０ＡもしくはＤ１０Ｎ、および、Ｈ８４０ＡもしくはＨ８４０ＮもしくはＨ８４０Ｙにおける変異）を含む。いくつかの実施形態において、ｄＣａｓ９は、ｄＣａｓ９を固体表面に付着させるための機能的ドメイン（例えばエピトープ標識、リンカーペプチドなど）を有する融合タンパク質である。
ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、ｇＲＮＡが持つ配列特異性を利用して標的核酸と結合するが、該核酸を切断しない。この構成では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡは、配列特異的に標的配列を「融解」することで、該標的核酸の一本鎖領域を作る（例えばQi et al. (2013) “Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression” Cell 152(5): 1173-83)を参照のこと）。
さらに、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡシステムおよびｄＣａｓ９／ｇＲＮＡシステムは、もともとはＰＡＭに隣接する配列を標的にしたが、本発明におけるｄＣａｓ９／ｇＲＮＡシステムは、結合用に任意のヌクレオチド配列を標的化するよう設計されている。また、コンパクト遺伝子によってコードされたＣａｓ９オルソログおよびｄＣａｓ９オルソログ（例えば黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９）が知られている（例えばRan et al. (2015) “In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9” Nature 520: 186-191を参照のこと）。これらは、インビトロにおけるＣａｓ９成分のクローニングおよび操作を向上させる。
Ｃａｓ９タンパク質変異体を発現する細菌は数多く存在する。現在、化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）由来のＣａｓ９が最も一般的に用いられているが、他にも、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９と高度な配列同一性を有し同じガイドＲＮＡを用いたＣａｓ９タンパク質がある。また、他のＣａｓ９タンパク質はさらに多様で、別のｇＲＮＡを用いて別のＰＡＭ配列（ＲＮＡで特定される配列に隣接するタンパク質で特定される２～５ヌクレオチド配列）を同様に認識する。Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉらは、多数の細菌群のＣａｓ９タンパク質を分類し（RNA Biology 10:5, 1-12; 2013）、多数のＣａｓ９タンパク質をその補足図１および補足表１に例示している。これらは参照により本明細書に援用される。なお、上記以外のＣａｓ９タンパク質としては、Esvelt et al., Nat Methods. 2013 November; 10(11):1116-21およびFonfara et al., “Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems.” Nucleic Acids Res. 2013 Nov. 22；[出版前の電子公開] doi:10.1093/nar/gkt1074に記載されている。
本明細書に記載の技術は、様々な種のＣａｓ９分子、したがってｄＣａｓ９分子を用いている。化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）Ｃａｓ９分子およびサーモフィルス菌（S.thermophilus）Ｃａｓ９分子が幅広く使用されているが、本技術の実施形態は、本明細書に挙げる他の種類のＣａｓ９タンパク質のＣａｓ９分子、該Ｃａｓ９タンパク質由来のＣａｓ９分子、または、該Ｃａｓ９タンパク質に基づくＣａｓ９分子を用いている。したがって、本技術によれば、化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）およびサーモフィルス菌（S.thermophilus）由来のＣａｓ９分子およびｄＣａｓ９分子を、別種の菌由来の置換可能なＣａｓ９分子およびｄＣａｓ９分子（例えば以下に挙げているもの）で置換することが実現される。
Figure 2023153898000004
Figure 2023153898000005

Figure 2023153898000006
本明細書に記載の技術は、任意のＣａｓ９タンパク質（例えば上記挙げたもの）に由来するｄＣａｓ９、および、該ｄＣａｓ９に対応するガイドＲＮＡまたは互換性のある他のガイドＲＮＡの使用を含む。なお、サーモフィルス菌ＬＭＤ－９のＣＲＩＳＰＲ１システムから得られるＣａｓ９がヒト細胞内で機能することが開示されている（例えばCong et al. (2013) Science 339: 819を参照のこと）。また、Ｊｉｎｅｋによれば、サーモフィルス菌（S.thermophilus）およびリステリアイノキュア（L.innocua）由来のＣａｓ９オルソログが、インビトロで、化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）二重ｇＲＮＡに誘導されて標的プラスミドＤＮＡを切断しうることが開示されている。
いくつかの実施形態において、本願技術は、化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）由来のＣａｓ９タンパク質を含む。当該Ｃａｓ９タンパク質は、細菌内でコードされているか、または哺乳類動物細胞内での発現のためにコドン最適化されており、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３、または、Ｄ９８６およびＨ８４０もしくはＮ８６３での変異（例えばＤ１０Ａ／Ｄ１０Ｎ、および、Ｈ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙ）を有し、タンパク質のヌクレアーゼ部分の触媒作用を不活性化する。これらの位置における置換部は、いくつかの実施形態ではアラニンであり（Nishimasu (2014) Cell 156: 935-949）、いくつかの実施形態では例えばグルタミン、アスパラギン、チロシン、セリンまたはアスパルテートのような他の残基（例えばＥ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３ＳまたはＮ８６３Ｈ）である。特許文献ＵＳ２０１６００１００７６には、本明細書に記載の技術で用いられる１つの化膿性連鎖球菌ｄＣａｓ９タンパク質の配列が記載されている。当該文献は参照により、その全文が本明細書に援用される。
例えば、いくつかの実施形態において、本明細書で用いられるｄＣａｓ９は、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９の配列と少なくとも約５０％同一であり、例えば、Ｄ１０Ａ置換部およびＨ８４０Ａ置換部を含む下記のｄＣａｓ９配列(配列番号１)と少なくとも５０％同一である。
Figure 2023153898000007
Figure 2023153898000008

Figure 2023153898000009

Figure 2023153898000010
いくつかの実施形態において、本願技術は、配列番号１で記述されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列の使用を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で用いられるｄＣａｓ９は、触媒作用不活性の化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９の配列と少なくとも約５０％同一、すなわち、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であり、Ｄ１０およびＨ８４０における変異、例えばＤ１０Ａ／Ｄ１０Ｎ、および、Ｈ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙが保持されている。
いくつかの実施形態では、配列番号１とのいかなる差分も非保存領域に含まれる。当該差分は、Chylinski et al., RNA Biology 10:5, 1-12; 2013 （例えばその補足図１および補足表１）、Esvelt et al., Nat Methods. 2013 November; 10(11):1116-21、およびFonfara et al., Nucl. Acids Res. (2014) 42 (4): 2577-2590. [出版前の電子公開；2013 Nov. 22] doi:10.1093/nar/gkt1074に規定された配列との配列整列により、確認される。但し、Ｄ１０およびＨ８４０における変異、例えばＤ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙは保持される。
２つの配列のパーセント同一性を特定するために、最適比較目的で当該配列を整列する（最適な整列が要求されるため、第１および第２のアミノ酸配列もしくは核酸配列の一方または両方にギャップを導入する。非相同配列は、比較目的のため無視することができる）。なお、比較目的で整列される基準配列は、その長さの少なくとも５０％（いくつかの実施形態では、基準配列長の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％または１００％）が整列される。続いて、対応する位置のヌクレオチドまたは残基を比較する。第１配列中の或る位置に、第２配列中の対応位置と同じヌクレオチドまたは残基が存在していれば、当該分子は前記位置にて同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列間に共通する同一位置の数に関する関数であって、２つの配列の最適な整列のために導入すべきギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた関数である。
配列同士の比較、および、２つの配列間のパーセント同一性の特定は、数学的アルゴリズムを用いて実行することができる。本願の目的のため、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453）アルゴリズムを使用し、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を特定する。なお、該アルゴリズムには、ギャップペナルティが１２、ギャップ伸長ペナルティが４、フレームシフトギャップペナルティが５であるＢｌｏｓｕｍ６２スコア行列が用いられている。
したがって、本明細書で提供されているのは、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡに基づき、ＳｉＭＲＥＰＳプローブを用いて二本鎖核酸（例えば二本鎖ゲノムＤＮＡ）を検知するアプローチである。本願技術の実施形態は、ｇＲＮＡを積んだ酵素無効型ｄＣａｓ９酵素、または、標的の１つ以上のセグメントと高度に特異的に安定結合する（例えば、ｇＲＮＡに相補的である部位において約２０塩基対を構成する；図３）酵素を用いて、未標識のゲノムＤＮＡ標的をガラスまたは溶融シリカの表面上に捕獲する構成を含む。ビオチン化ｄＣａｓ９によって核酸標的を表面上に捕獲した後、ＳｉＭＲＥＰＳプローブが標的の第２セグメントに反復的かつ一時的に結合するのが観測される。なお、第２セグメントは、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡによって融解され、既にアクセス可能状態となっている。
このように、いくつかの実施形態において、標的核酸は、適切な配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を有するビオチン化ｄＣａｓ９によって捕獲される。また、ｄＣａｓ９は、ｇＲＮＡの協力の下でＤＮＡを融解することにより、問合せプローブがアクセス可能な一本鎖である相補的な非鋳型ＤＮＡ鎖を作り出す。いくつかの実施形態において、本願技術は、標的核酸と結合する第２のｇＲＮＡを含む第２の非ビオチン化ｄＣａｓ９の使用（図４）を含む。第２のｄＣａｓ９／ｇＲＮＡは、第１のｄＣａｓ９／ｇＲＮＡから距離を取って標的核酸と結合する。当該距離は、問合せプローブのサイズにほぼ相当し、例えば５～３０ヌクレオチド分である。つまり、ビオチン化ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ（捕獲型ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ）および第２のｄＣａｓ９／ｇＲＮＡは、標的核酸のうち、問合せプローブが結合する領域に隣接する領域と結合する。この２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、それらの間における核酸領域を融解することにより、問合せプローブが結合するアクセス可能な一本鎖問合せ領域を提供する。ゆえに、２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の間の間隔は、問合せプローブが該２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の間で結合するのに適している。
＜方法＞
いくつかの実施形態では、本技術は、二本鎖核酸を検知する方法である。例えば、いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）標的ＤＮＡは、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡにより（例えば、周辺温度（「室温」）でまたはその近くで）簡単に前処理される。次に、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、問合せ領域（例えば、標的核酸のうち、問合せプローブに相補的な領域）に隣接する領域において、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）にハイブリダイズする。ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡは、標的核酸中の特定のＤＮＡ配列（例えば、問合せ領域）を融解する。該方法は、スライド表面上に、ｄＣａｓ９（例えば、ビオチン化ｄＣａｓ９）を（例えば、ビオチンーアビジン相互作用によって）捕獲することを含む。ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ‐標的核酸を該表面上に捕獲し固定化した後、標的核酸のうちｇＲＮＡにハイブリダイズした位置に隣接する、標的核酸中の問合せ領域に、問合せプローブが結合することを、ＳｉＭＲＥＰＳにより検知する。例えば、図３を参照のこと。
いくつかの実施形態では、２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を用いることにより、問合せプローブが標的核酸の問合せ領域に近づきやすくなる。いくつかの実施形態では、問合せ領域の両側に位置するように、２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体をハイブリダイズすることにより、ＳｉＭＲＥＰＳに基づく検知のための問合せプローブが標的核酸（例えば、問合せ領域）により近づきやすくなる。表面上に捕獲するために、１つのｄＣａｓ９はビオチン化されるが、もう１つの（例えば、第２）ｄＣａｓ９は任意にビオチン化される（好適な実施形態では、第２のｄＣａｓ９はビオチン化されない）。例えば、図４を参照のこと。標的核酸に結合した２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が結合する領域間の空間は、問合せプローブが標的核酸の問合せ領域に結合するのに適当な空間である。
いくつかの実施形態では、検知可能な（例えば、蛍光）問合せプローブが固体担体の表面に近づく（例えば、固体担体の表面から約１００ｎｍ以内にある）と、該問合せプローブは蛍光発光信号を生成する。未結合の場合、問合せプローブは素早く拡散し、個別に検出されない。よって、未結合の状態である場合、問合せプローブは、低レベルの拡散バックグラウンド蛍光を発する。したがって、いくつかの実施形態では、結合した問合せプローブの検出は、全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）、ＨｉＬｏ顕微鏡（例えば、ＵＳ２００９００８４９８０、ＥＰ２３００９８３Ｂ１、ＷＯ２０１４０１８５８４Ａ１、ＷＯ２０１４０１８５８４Ａ１を参照のこと。これらは参照により本明細書に援用される）、共焦点走査顕微鏡、または、固体担体の表面近くまたは表面上の問合せプローブ分子のみを照明する（例えば、励起する）照明スキームを含む他の技術を用いる。このように、いくつかの実施形態では、表面近くまたは表面上に固定化された標的に結合した問合せプローブのみが、単一分子に由来することを確認できる点状の発光信号（例えば、「スポット」）を発する。
おおまかに言えば、観測は、標的核酸が（例えば、表面に付着したｄＣａｓ９／ｇＲＮＡに特異的に結合することにより）固定化された、固体担体上の多数の離散位置において、例えば、明滅する（例えば、「オン」および「オフ」状態となりうる）複数の蛍光「スポット」において、蛍光発光を観測することを含む。それぞれの離散位置（例えば、固体担体上のそれぞれの「スポット」）において蛍光発光があること（スポットが「オン」である）および蛍光発光がないこと（スポットが「オフ」である）が記録される。各スポットは、問合せプローブがそのスポットにおいて固定化された標的核酸に結合するとき、および、問合せプローブがそのスポットにおいて固定化された標的核酸から解離するとき、「明滅」する、例えば、スポットが「オン」状態および「オフ」状態間で交替する。
集められたデータにより、問合せプローブがそれぞれの固定化された標的に結合する回数（例えば、それぞれのスポットが「明るくなる」回数）が測定され、また、問合せプローブが結合している合計時間（例えば、「消える」まで、スポットが「明るい」ままでいる時間の長さ）が測定される。
いくつかの実施形態では、問合せプローブは、発光波長を有する蛍光標識を含む。蛍光標識の発光波長での蛍光発光を検出したことは、問合せプローブが固定化された標的核酸に結合したことを示す。問合せプローブが標的核酸に結合することは、「結合事象」である。本技術のいくつかの実施形態では、結合事象は、蛍光発光の測定強度が規定閾値よりも高い。例えば、いくつかの実施形態では、結合事象は、蛍光強度がバックグラウンド蛍光強度（例えば、標的核酸の非存在下で観察された蛍光強度）よりも高い。いくつかの実施形態では、結合事象は、蛍光強度がバックグラウンド蛍光強度（例えば、標的核酸の非存在下で観察された蛍光強度）よりも、少なくとも１、２、３、４、またはそれ以上、標準偏差が高い。いくつかの実施形態では、結合事象は、蛍光強度がバックグラウンド蛍光強度（例えば、標的核酸の非存在下で観察された蛍光強度）よりも、少なくとも２標準偏差が高い。いくつかの実施形態では、結合事象は、蛍光強度が背景蛍光強度（例えば、標的核酸の非存在下で観察された平均蛍光強度）の少なくとも１．５、２、３、４、または５倍である。
よって、いくつかの実施形態では、規定閾値よりも強度が高い（例えば、バックグラウンド強度よりも少なくとも２標準偏差が高い）蛍光プローブの発光波長での蛍光を検出したことは、（例えば、標的核酸が固定化された、固体担体上の離散位置において）結合事象が発生したことを示す。また、いくつかの実施形態では、規定閾値よりも強度が高い（例えば、背景強度よりも少なくとも２標準偏差が高い）蛍光プローブの発光波長での蛍光を検出したことは、結合事象が開始したことを示す。よって、いくつかの実施形態では、規定閾値よりも強度が高い（例えば、背景強度よりも少なくとも２標準偏差が高い）蛍光プローブの発光波長での蛍光の不存在を検出したことは、結合事象が終了したこと（例えば、問合せプローブは標的核酸から解離したこと）を示す。結合事象の開始から結合事象の終了までの時間の長さ（例えば、規定閾値よりも強度が高い（例えば、背景強度よりも少なくとも２標準偏差が高い）蛍光プローブの発光波長である蛍光が検出される時間の長さ）が、結合事象の滞留時間である。「遷移」は、問合せプローブが標的核酸に結合し標的核酸から解離すること（例えば、オン／オフ事象）を指す。
本技術の方法は、規定の時間間隔内で固体担体上のそれぞれの離散位置において発生する問合せプローブ結合事象の回数を数えることを含む。規定の時間間隔は「取得時間」（例えば、数十～数百～数千秒の時間間隔、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または、６０秒、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または、０分間、例えば、１、１.５、２、２.５、または、３時間）である。いくつかの実施形態では、取得時間は、約１～１０秒から１～１０分間（例えば、約１～１００秒、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００秒、例えば、１～１００分間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００分間）である。
さらに、結合事象中に問合せプローブが標的核酸に結合している時間の長さは、結合事象の「滞留時間」である。取得時間中に検出された結合事象の回数、および／または、記録された結合事象の滞留時間の長さは、標的核酸への問合せプローブの結合の特徴である。これにより、標的核酸が上記の離散位置に固定化されたこと、したがって、標的核酸がサンプル中に存在することが示される。
問合せプローブが固定化された標的核酸に結合すること、および／または、問合せプローブが固定化された標的核酸から解離することは、規定時間間隔中（例えば、取得時間中）に、（例えば、光源を用いて蛍光プローブを励起し、例えば、蛍光顕微鏡を用いて、結合された問合せプローブからの蛍光発光を検出することによって）観測および／または記録される。取得時間中に問合せプローブが核酸に結合する回数、および／または、それぞれの結合事象中に問合せプローブが核酸に結合している時間の長さと、それぞれの結合事象の間に問合せプローブが核酸に結合していない時間の長さ（例えば、それぞれ、結合状態での「滞留時間」と未結合状態での「滞留時間」）は、例えば、コンピュータおよびソフトウェアを用いて（例えば、隠れマルコフモデルおよびポアソン統計を用いてデータを分析して）判定される。
いくつかの実施形態では、コントロール用のサンプルが（例えば、標的の非存在下で）計測される。コントロール用のサンプルで検出される蛍光は、「バックグラウンド蛍光」、または、「バックグラウンド（蛍光）強度」または「基準値」である。
いくつかの実施形態では、問合せプローブの発光波長での蛍光強度の測定値を含むデータが、時間の関数として記録される。いくつかの実施形態では、（例えば、固定化された核酸毎の）結合事象の回数および結合事象の滞留時間が、（例えば、蛍光強度が閾値背景蛍光の強度以上である回数および時間の長さを測定することによって）データから判定される。いくつかの実施形態では、標的核酸が固定化された固体担体上の離散位置毎の遷移（例えば、問合せプローブの結合および解離）が数えられる。いくつかの実施形態では、遷移回数の閾値を用いて、固体担体上の離散位置に標的核酸が存在することを、バックグラウンド信号、非標的核酸、および／または、問合せプローブの疑似結合から識別する。いくつかの実施形態では、取得時間中に、１０を超える複数の遷移が記録されたことは、固体担体上の離散位置に標的核酸が存在することを示す。
いくつかの実施形態では、固定化された標的毎の遷移回数の分布が判定される。例えば、観察された固定化された核酸標的毎の遷移回数が数えられる。いくつかの実施形態では、ヒストグラムを作成する。いくつかの実施形態では、分布の特性パラメータが判定され、例えば、分布の平均値、中央値、ピーク、形状などが判定される。いくつかの実施形態では、例えば、人工知能、パターン認識、機械学習、統計推論、ニューラルネットなどを用いて、データのパターンおよび規則性を認識するアルゴリズムにより、データおよび／またはパラメータ（例えば、蛍光データ（例えば、時間領域にある蛍光データ）、運動データ、分布の特性パラメータなど）を分析する。いくつかの実施形態では、上記の分析には頻度論的分析を用いるが、いくつかの実施形態では、ベイズ分析を用いる。いくつかの実施形態では、既知の「トレーニング」データを用いて（例えば、教師あり学習を用いて）、パターン認識システムがトレーニングされるが、いくつかの実施形態では、アルゴリズムを用いて、これまで知られていないパターンを発見する（例えば、教師なし学習）。例えば、Duda, et al. (2001) Pattern classification (2nd edition), Wiley, New York; Bishop (2006) Pattern Recognition and Machine Learning, Springerを参照のこと。
パターン認識は（例えば、トレーニングセット、教師あり学習、教師なし学習、および未知のサンプルの分析を用いて）、識別されたパターンを核酸と関連させて、特定のパターンが特定の核酸の「フィンガープリント」となるようにする。当該「フィンガープリント」は、核酸の検出、定量化、および識別に役立つ。
いくつかの実施形態では、標的核酸から生成した分布は、非標的核酸から生成した分布、または、標的核酸の非存在下で生成した分布とは大きく異なる。いくつかの実施形態では、複数の固定化された標的核酸の平均遷移回数が判定される。いくつかの実施形態では、標的核酸を含むサンプルについて観察された平均遷移回数は、時間の関数として、ほぼ直線状に関連し、正の傾斜を有する（例えば、平均遷移回数は、時間の関数として、ほぼ直線状に増加する）。
いくつかの実施形態では、データは、統計（例えば、ポアソン統計）処理され、固体担体上のそれぞれの離散位置において、時間の関数として、遷移が発生する確率を判定する。いくつかの特定の実施形態では、固体担体上の離散位置において時間の関数として遷移事象が比較的一定の確率で発生することは、上記固体担体上の離散位置において標的核酸が存在することを示す。いくつかの実施形態では、事象回数および経過時間に関する相関係数は、固体担体上の離散位置において時間の関数として遷移事象が発生する確率から算出される。いくつかの実施形態では、固体担体上の離散位置において時間の関数として遷移事象が発生する確率から算出されたとき、事象回数および経過時間に関する相関係数が０.９５より大きいことは、上記固体担体上の離散位置において標的核酸が存在することを示す。
いくつかの実施形態では、結合問合せプローブの滞留時間（τｏｎ）および未結合問合せプローブの滞留時間（τｏｆｆ）を用いて、サンプル中に標的核酸が存在することを識別し、かつ／または、標的核酸を含むサンプルを、非標的核酸を含み、かつ／または、当該標的核酸を含まないサンプルから区別する。例えば、標的核酸のτｏｎは、非標的核酸のτｏｎよりも大きく、標的核酸のτｏｆｆは、非標的核酸のτｏｆｆよりも小さい。いくつかの実施形態では、ネガティブコントロールのτｏｎおよびτｏｆｆと、サンプルのτｏｎおよびτｏｆｆとを計測することで、サンプル中に標的核酸が存在するかしないかが示される。いくつかの実施形態では、例えば、コントロール（例えば、ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール）、および、標的核酸を含む疑いのあるサンプルについて、固体担体上に結像された複数のスポットのそれぞれの、複数のτｏｎおよびτｏｆｆ値が判定される。いくつかの実施形態では、例えば、コントロール（例えば、ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール）、および、標的核酸を含む疑いのあるサンプルについて、固体担体上に結像された複数の点のそれぞれの、平均τｏｎおよび／または平均τｏｆｆが判定される。いくつかの実施形態では、結像されたすべてのスポットのτｏｎ対τｏｆｆ（例えば、平均τｏｎおよびτｏｆｆ、時間平均τｏｎおよびτｏｆｆなど）のプロットは、サンプル中に標的核酸が存在するかしないかを示す。
＜応用＞
本技術は、核酸、例えば、一本鎖および二本鎖核酸の検出に用いられる。よって、本技術は、ＤＮＡの様々な形態（例えば、修飾塩基を含むＤＮＡ、例えば、メチル化ＤＮＡ、非メチル化ＤＮＡ）、および、ＲＮＡ（例えば、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）を検出し、例えば、共通プラットホーム上でマルチ核酸検出を行う。よって、本技術の例示的な応用として、例えば、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡ、変異型ＤＮＡ対立遺伝子、野生型ＤＮＡ対立遺伝子、および、遺伝子座特異的メチル化ＤＮＡの１つ以上を、すべてＳｉＭＲＥＰＳプラットホーム上で検知することが挙げられる。いくつかの実施形態では、これらの種類の核酸検出は、同じサンプルで行われる。
例えば、本技術は、メチル化ＤＮＡの検知に用いられる。メチル化ＤＮＡは、健康および疾患の多数の状態の標識である。そうした標識の例として、特定のメチル化遺伝子座の存在に基づいて、大腸癌のリスクが高い患者を識別することが挙げられる。メチル化ＤＮＡは、大腸癌の早期検出、前癌性腺腫および異形成病変の診断テストの基礎を提供する。現在、特定の遺伝子座でのメチル化ＤＮＡの検出は、ＤＮＡの重亜硫酸ナトリウム処理によって行われる。該処理は、非メチル化シトシンを脱アミノ化してＤＮＡ中にウラシルを生成し、その後、メチル化ＤＮＡ断片（例えば、重亜硫酸ナトリウムによる変換から保護される５－ｍＣまたは５－ｈｍＣ）、または、（シトシンのかわりにウラシルを含む、予想される変換配列にプライマーが結合するよう設計されている）非メチル化断片を選択的に増幅する別個のプライマーセットを用いるＰＣＲを行う。別の方法は、重亜硫酸塩処理され、および／または、重亜硫酸塩処理されていないＤＮＡの次世代シーケンシングをし、メチル化塩基を推測することである。
重亜硫酸塩変換後にＰＣＲまたは次世代シーケンシングをする方法は一般的に用いられるが、これらの方法には深刻な限界がある。驚くべきことに、重亜硫酸塩に基づく技術のいくつかのこうした限界のため、ＳｉＭＲＥＰＳ技術を用いてメチル化ＤＮＡを検出する本発明は好都合である。まず、重亜硫酸塩処理は、シトシンを脱アミノ化するのみならず、ＤＮＡを短い断片にランダムに断片化するため、特に配列長がとても短くなった場合にＰＣＲプライマーを設計することは難しくなる。さらに、重亜硫酸塩変換後、シトシンの脱アミノ化を受けたＤＮＡの領域が相補的でなくなり、したがって二本鎖でもなくなるため、ＰＣＲがいくぶんかより難しくなる。任意のＰＣＲプライマーセットにより、一本鎖のみを増幅できるからである。一方、ＳｉＭＲＥＰＳ方法は、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変換すること、および、核酸を短い断片に断片化することから、根本的な利点を得ている。
いくつかの実施形態では、核酸修飾の存在または不存在（例えば、修飾塩基、ヌクレオチド類縁体など）を検出する。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子発現に影響する核酸のエピジェネティック修飾が検出される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡのメチル化が検出される。いくつかの実施形態では、本技術は、ヌクレオチド類縁体、ヌクレオチド塩基、または、アデニン、チミン、グアノシン、シトシンおよびウラシル以外の塩基を含むヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの検知（例えば、その存在または不存在を識別する）に用いられる。例えば、いくつかの実施形態では、本技術は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、および／または、塩基（例えば、５－メチルシトシン（５ｍＣ）、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）、Ｎ（６）－メチルアデノシン（ｍ（６）Ａ）、プソイドウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、ヒポキサンチン、キサンチン、２,６－ジアミノプリンおよび６,８－ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない）の検知、同定、および／または定量に用いられる。
例示的な実施形態では、本技術は、重亜硫酸塩で処理されたサンプル、および、重亜硫酸塩で処理されていないサンプルを分析することを含むＳｉＭＲＥＰＳにより、メチル化ＤＮＡを検知することを含む。実施形態は、非メチル化シトシンからウラシルへの変換から予期される配列と、特定の遺伝子座におけるシトシンが（メチル化の結果）ウラシルに変換されない場合に予期される配列とを区別するＳｉＭＲＥＰＳ問合せプローブを用いることを提供する。いくつかの実施形態では、サンプルチャンバで同時に両方の問合せプローブを提供するが、それぞれのプローブは異なる蛍光物質を含む。いくつかの実施形態では、両方の問合せプローブ（例えば、メチル化配列に結合する１つのプローブと、ウラシル変換された配列に結合する第２のプローブで、それぞれ異なる蛍光物質を有する）が存在するＳｉＭＲＥＰＳ実験の画像化をしながら、重亜硫酸塩試薬をリアルタイムで提供する。このとき、変換に基づいて、ある色で明滅するＤＮＡ断片が別の色で明滅するように変化する。このような分析は、（現在のＰＣＲまたは次世代シーケンシングに基づく方法で必要とされる）重亜硫酸塩処理された一定分量のサンプルと処理されていない一定分量のサンプルとを比べることよりも、測定上の高度な正確さおよび精度を有する。いくつかの実施形態では、本技術は、例えば、マイクロ流体力学および／またはマルチスペクトル画像化を用いる多重分析である。重硫酸塩修飾（bislfate modification）に加えて、本技術は、ＤＮＡまたはＲＮＡ上の追加の化学マーカーを、ＳｉＭＲＥＰＳにより簡単に検出できる修飾に変換させる他の試薬を用いることを含む。
いくつかの実施形態では、本技術は、同一のプラットホーム上において、変異型ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡおよびマイクロＲＮＡバイオマーカーの組み合わせを検出するのに用いられる。例えば、このような技術は、例えば便サンプルの分析によって、大腸癌および進行性腺腫を検出するのに用いられる。本技術は、変異型ＤＮＡを検出する（例えば、１,０００,０００個の野生型分子の背景の中で、１個の変異型分子を検出したり、例えば、野生型ＤＮＡの背景の中で、ＫＲＡＳ変異型ＤＮＡを検知したりする）。さらに、本技術は、３種類のマーカー（メチル化ＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または、変異型ＤＮＡ）すべてを計測する技術も提供する。本技術は、緩衝液中の核酸を分析するのに用いられ、本技術は、便から抽出されたマトリックス中の核酸を分析するのに用いられる。平均的な便は、重量が２００ｇで、ヒトＤＮＡに相当する２倍体ゲノムを約１千万個含む。１:１,０００,０００の感度により、典型的な便全体から抽出されたＤＮＡの中のわずか１０個の変異型分子を検出することができる。これは、現在臨床で用いられているＫＲＡＳ分析よりも１０,０００倍感度が高く、最も優れた研究レベルの方法よりも１００倍感度が高い。例えば、Domagala et al. (2012) “KRAS mutation testing in colorectal cancer as an example of the pathologist's role in personalized targeted therapy: a practical approach” Pol J Pathol 63(3): 145-64; Gerecke et al. (2013) “Ultrasensitive detection of unknown colon cancer-initiating mutations using the example of the Adenomatous polyposis coli gene” Cancer Prev Res (Phila). 6(9): 898-907を参照のこと。この劇的な性能の進歩は、ＳｉＭＲＥＰＳ技術の動的フィンガープリント固有の、対立遺伝子識別の任意の特異性によりもたらされたものである。
＜癌のバイオマーカーの検出＞
米国では、大腸内視鏡検査は大腸癌（ＣＲＣ）の最も主要なスクリーニング方法であるが、該方法は、侵襲性があり、コストが高く、患者コンプライアンスが低く、さらに、合併症のリスクがある。例えば、便に基づく大腸癌スクリーニングなどの新しい診断は、進行性腺腫（ＡＡ）（これを取り除くことでＣＲＣが防げる）の検知が低感度であるなどの限界がある。現在最も性能のよい、便に基づくテストは、便ＤＮＡ（変異型ＤＮＡおよびメチル化）および潜血を分析するが、技術的に複雑で高価（５００ドル/検査１回）であり、野生型ＤＮＡの高背景の中で数少ない変異型ＤＮＡ対立遺伝子を検出する能力に限界があるという課題がある。
本明細書に記載の検出技術は、低コストで迅速に便の中の数少ない変異型ＤＮＡ対立遺伝子を測定する新技術である。当該技術は、すぐれた分析特異性を有し、１つのプラットホーム上で、潜血（例えば、潜血のマイクロＲＮＡマーカーを用いる）およびメチル化ＤＮＡを同時に測定する。本技術は、現在の最先端技術と比べて１０倍を上回るほど低いコストで、進行性腺腫の検知の感度を向上させる。
本技術は、数少ない変異型ＤＮＡ対立遺伝子の定量化を、現在の方法よりはるかに高い特異性で行い、ＡＡ検出の感度を著しく高める。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ遺伝子にあるような、腺腫で定義されている変異が検出される。
本技術は、多種類の便バイオマーカーを、すべて１つのプラットホーム上で測定する。いくつかの実施形態では、変異型ＤＮＡに加えて、プラットホーム上で検出されるマーカーは、マイクロＲＮＡ（例えば、米国特許出願第１４／５８９，４６７号を参照のこと。参照によりその全文が本明細書に援用される）、便潜血マーカー（例えば、便潜血のマイクロＲＮＡマーカー）、およびメチル化ＤＮＡを含む。
＜ＲＮＡの検出＞
いくつかの実施形態では、検出、特徴づけ、定量、および／または、同定される核酸（例えば、標的核酸）は、ＲＮＡ（例えば、ｌｎｃＲＮＡ、例えば、約２００ヌクレオチドより長い非タンパク質コードＲＮＡ）である。実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｌｎｃＲＮＡ）の二次構造が融解され、ＳｉＭＲＥＰＳ検出の問合せプローブが問合せ領域にアクセスすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、本技術は、補助的なＰＡＭオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＡＭｍｅｒ）を用いることにより、ＲＮＡの中の二次構造標的を認識し融解させるｄＣａｓ９／ｇＲＮＡを用いる。いくつかの実施形態では、本技術は、補助的なＰＡＭオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＡＭｍｅｒ）を用いることにより、ＲＮＡの中の二次構造標的を認識し融解させる２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を用いる。
いくつかの実施形態では、ＰＡＭが別のＤＮＡオリゴヌクレオチド（「ＰＡＭ提示オリゴヌクレオチド」または「ＰＡＭｍｅｒ」）としてトランスに存在する場合、ｄＣａｓ９は、ｇＲＮＡ配列にマッチする一本鎖ＲＮＡ標的に結合する。よって、いくつかの実施形態では、ＰＡＭｍｅｒにより、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡが一本鎖ＲＮＡ標的（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）に部位特異的に結合する。さらに、本技術では、ＰＡＭｍｅｒを用いて、ｄＣａｓ９を誘導して特定のＲＮＡ標的に結合させ、二次構造を融解させて、ＳｉＭＲＥＰＳ分析において、問合せプローブの結合に問合せ領域が使用可能となるようにする。例えば、O’Connell et al. 2014 “Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9” Nature 516: 263-6を参照のこと。このように、実施形態では、ｄＣａｓ９、ｇＲＮＡ（例えば、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体）、およびＰＡＭｍｅｒを含む組成を提供する。
＜マイクロＲＮＡの検出＞
いくつかの実施形態では、検出、特徴づけ、定量、および／または、同定される核酸（例えば、標的核酸）は、マイクロＲＮＡである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはμＲＮＡ）は、遺伝子発現を調節する、長さ約２１～２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは遺伝子でコードされる。該遺伝子のＤＮＡからｍｉＲＮＡが転写される。しかし、ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されない（例えば、Carrington et al, 2003を参照のこと。当該文献は参照により本明細書に援用される）。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、処理された成熟ｍｉＲＮＡ分子よりもかなり長い。例えば、米国特許出願第１４／５８９，４６７号を参照のこと。当該文献は参照によりその全文が本明細書に援用される。
＜ゲノム異常の検出＞
いくつかの実施形態では、ＳｉＭＲＥＰＳ技術は、比較ゲノムのハイブリダイゼーション後に、無対領域の検知に基づき、ＤＮＡサンプルの中のゲノム異常（例えば、単純な点変異以外のゲノム異常）を同定および／または計測する。いくつかの実施形態では、ＳｉＭＲＥＰＳは、サンプルの中のゲノム不安定性の全体的な程度を判定するのに用いられる。例えば、参照用の通常のＤＮＡサンプルと比較して、欠失および挿入が存在することにより、ゲノムの不安定性が証明される。例示的な実施形態は、通常のＤＮＡ（例えば、肺癌などの固形腫瘍を有する患者の通常の血液細胞由来の野生型ＤＮＡ）を提供し、この通常のＤＮＡを、マッチした腫瘍ＤＮＡ（または循環無細胞ＤＮＡ）と混合し、当該ＤＮＡを断片化させ、それによって当該ＤＮＡを断片として存在させ、表面上に、おそらくは末端修飾（例えば、ビオチン化）または他の方法によって固定化する。大部分のＤＮＡは、ハイブリダイズＤＮＡ断片を構成するが、欠失または挿入が存在する領域は、一本鎖が膨出する二本鎖として存在する。いくつかの実施形態では、効率的な検出のために、通常のＤＮＡおよび腫瘍ＤＮＡを適切な比率で提供する。実施形態では、ＳｉＭＲＥＰＳに基づく親和性試薬を提供し、該試薬はこれらのマッチしていない領域を検知するのに用いられ、当該マッチしていない領域を数えることで、ゲノム不安定性の尺度が提供される。当該尺度は、例えば、いくつかの実施形態では、癌のリスクのバイオマーカーとして用いられる。いくつかの実施形態では、本技術は、染色体異常の出生前スクリーニングに用いられる。いくつかの実施形態では、例えば、バランスのとれた染色体転写の識別などのために、親和性試薬は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であり、（例えば、バランスの取れた染色体転座などの同定のために）核酸を切断しないように修飾されたホリディ構造リコンビナーゼである。
いくつかの実施形態では、本技術は、例えば、マイクロサテライトが不安定な大腸癌患者のマイクロサテライト反復異常を検出するのに用いられる。よって、実施形態は、サンプルの中でマイクロサテライト反復が拡大したかどうかに応じて区別される動的結合特性を示す異なるマイクロサテライト遺伝子座に対応する、ＳｉＭＲＥＰＳプローブの一団を提供する。いくつかの実施形態では、本技術は、拡大したマイクロサテライト反復配列が拡大していないマイクロサテライト反復配列にハイブリダイゼーションすることにより、無対断片が生成され、当該無対断片が、ＳｉＭＲＥＰＳに基づく方法を用いて、ＤＮＡプローブまたは他の有効な親和性ＳｉＭＲＥＰＳリーダー試薬を用いて、検出される、比較ＤＮＡハイブリダイゼーション方法を含む。
＜二機能性親和性試薬＞
いくつかの実施形態では、本技術は、標的検体に結合し、ＳｉＭＲＥＰＳリーダープローブを用いて数えることができる核酸を含む二機能性親和性試薬を組み込むことにより、ＳｉＭＲＥＰＳでタンパク質および他の検体を検出することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、短いＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合した抗体を用いて、標的タンパク質検体がスライドの表面上に（例えば、単純に表面上で乾燥させ、あるいは、他の非特異的または特異的な捕獲方法で）固定化された場合に、当該抗体の当該標的タンパク質検体への結合を、共役ＤＮＡのＳｉＭＲＥＰＳに基づく読み取りで計測することを含む。これにより、多数の抗体が多重化され、様々な抗体に結合した異なるＤＮＡ配列「バーコード」により区別される。実施形態では、サンプルには、均等な細胞または細胞溶解液を含む様々な種類がある。親和性試薬は、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質、アプタマー、ＤＮＡバーコードに結合した抗体および抗体断片を含む。
＜非核酸ＳｉＭＲＥＰＳプローブ＞
実施形態は、核酸でないプローブを提供する。例えば、実施形態は、ＳｉＭＲＥＰＳが安定的に処理できる標的検体に、結合的相互作用する抗体または他の親和性試薬を提供する。例えば、関連した一時的変動により、「明滅する」信号が提供され、いくつかの実施形態では、動的結合フィンガープリントが提供される。いくつかの実施形態では、非核酸問合せプローブを操作して、その結合を非操作プローブに比べて弱くし、例えば、結合および／または連結の熱力学的安定性を低くする。抗体に加えて、実施形態は、標的検体、および、タンパク質である問合せプローブを含み、例えば、結合する一方は親和性試薬であり、もう一方は計測される標的検体である。実施形態は、任意のリガンドに結合するアプタマー、糖化タンパク質に結合するレクチン、脂質に結合するタンパク質または他の分子などを用いる。本技術は、ＳｉＭＲＥＰＳプラットホーム上の検出に適した一時的結合作用を有する任意の結合対（例えば、動的フィンガープリントを生成する結合対）を用いる。
＜分子内ＳｉＭＲＥＰＳプロービング＞
いくつかの実施形態では、本技術は、結合して分子内のプロービングメカニズムを提供する捕獲プローブおよび問合せプローブを提供する（例えば、図５ａおよびｂを参照のこと）。プローブは非対称であり、標的核酸が（例えば、熱力学安定性を有し、例えば、不可逆的に）捕獲配列に結合するときに、当該標的核酸は問合せプローブと一時的に結合する。問合せプローブの一時的な結合および解離により、ドナー蛍光物質の強度またはＦＲＥＴ（その反応速度は標的核酸の配列の影響を受ける）に時間依存性の変化が生じる。いくつかの実施形態では、アドレス鎖により、問合せ/捕獲複合体が表面に結合され、一時的結合運動を制御する剛性が生じ、多数の異なる問合せ/捕獲配列を、結像面の異なる領域（例えば、ＤＮＡマイクロアレイにおけるように）に固定化する手段が提供される。
いくつかの実施形態では、分子内ＳｉＭＲＥＰＳプロービングにより、取得がより速くなる。特に、結合が、標的核酸が捕獲プローブに結合した後の分子内のハイブリダイゼーション反応であるため、問合せプローブの結合が迅速である。さらに、いくつかの実施形態では、ＳｉＭＲＥＰＳ技術の他の実施形態に比べ、画像化する時間が短縮される。例えば、ＳｉＭＲＥＰＳ技術の他の実施形態で１０分間に発生する結合および解離事象と同じ回数の結合および解離事象が、分子内ＳｉＭＲＥＰＳ実験のいくつかの実施形態では１～１０秒に発生する。分子内ＳｉＭＲＥＰＳ技術により、空間的分離による実験の並列化ができるようになる。いくつかの実施形態では、分子内ＳｉＭＲＥＰＳ技術により、問合せプローブの濃度が低減され、効率的に検出することができる。分子内ＳｉＭＲＥＰＳ技術が提供するプラットホームは、いくつかの実施形態では、アドレス鎖によって指定された方法で結像面の異なる領域内に固定化された、多数の異なる捕獲/問合せプローブを含む。例えば、何千もの異なる配列を含む標準マイクロアレイチップを用いることができる。これらの配列は、ＳｉＭＲＥＰＳ捕獲/問合せプローブを固定化するアドレス鎖として機能することができ、１つのチップ上で、何千もの標的配列（マイクロＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、一本鎖形態に変換されたＤＮＡ）のＳｉＭＲＥＰＳ分析を可能にする。
特に、いくつかの実施形態では、アドレス鎖はどの標的とも配列の点で関連がない。相互作用は、問合せおよび捕獲プローブを介して間接的に生じるからである。実際、アドレス鎖は、標的に関連する必要がない。さらに、実施形態では、問合せおよび捕獲プローブは、ＤＮＡ配列以外の親和性試薬、例えば、本出願の他の部分で説明されたｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を含む。
実施形態では、蛍光物質の励起源への露出を制御して、例えば分析前の光退色を減少または最小化させることを提供する。いくつかの実施形態では、動的サインは、例えば、結像面の間違った部分（結像面のアドレス領域の外側）に捕獲/問合せプローブを置くことによる偽陽性検出を同定し補正する補正メカニズムを提供する。実施形態では、問合せおよび捕獲プローブを、アドレス配列に結合する際に同一場所に存在する２つの非接触のプローブに分割する（例えば、図５ｂを参照）ことにより、偽陽性を最小化するまたは減少させる技術も提供する。
＜蛍光部分＞
いくつかの実施形態では、核酸は、蛍光部分（例えば、蛍光原色素、あるいは、「蛍光物質」または「蛍石」とも呼ばれる）を含む。多種多様な蛍光部分が当技術分野で知られ、オリゴヌクレオチドにヌクレオチドを組み込む前に、蛍光部分を当該ヌクレオチドに結合させる方法、オリゴヌクレオチドの合成後に、当該オリゴヌクレオチドに蛍光部分を添加する方法も知られている。
蛍光部分として用いられる化合物の例として、キサンテン、アントラセン、シアニン、ポルフィリンおよびクマリン色素が挙げられるが、これらに限定されない。本技術で用いられるキサンテン色素の例として、フルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、５－または６－カルボキシ－４，７，２’，７’－テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５－または６－カルボキシ－４’５’２’４’５’７’ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５’または６’－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、５－カルボキシ－２’，４’，５’，７’－テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）、ロドール、ローダミン、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、４，７－ジクロロテトラメチルローダミン（ＤＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）およびテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で用いられるシアニン色素の例として、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３.５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、Ｃｙ７およびＣｙ７.５が挙げられるが、これらに限定されない。本技術で用いられる他の蛍光部分および／または色素として、エネルギー移動色素、合成色素、および蛍光信号を発する他の芳香族化合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、蛍光部分は量子ドットを含む。
いくつかの実施形態では、蛍光部分は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、ＧＦＰの修飾された誘導体（例えば、Ｓ６５Ｔを含むＧＦＰ、（例えば、Ｆ６４Ｌを含む）高感度ＧＦＰ）、または、当技術分野で知られている他の蛍光部分、例えば、青色蛍光タンパク質（例えば、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ECFP、Cerulean、CyＰet、mTurquoise2）および黄色蛍光タンパク質誘導体（例えば、YFP、Citrine、Venus、YPet）を含む。実施形態では、蛍光タンパク質は、１つ以上の問合せおよび／または捕獲プローブに共有結合または非共有結合されてよい。
蛍光色素として、Ｃｙ５、ジクロロ「Ｒ１１０」、ジクロロ「Ｒ６Ｇ」、ジクロロ「ＴＡＭＲＡ」、ジクロロ「ＲＯＸ」等を含むｄ－ローダミンアクセプタ色素や、フルオレセイン、６－ＦＡＭ、５－ＦＡＭ等を含むフルオレセインドナー色素や、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、プロフラビン、ｐＨ７等を含むアクリジンや、２－メチルベンゾオキサゾール、エチルｐ－ジメチルアミノベンゾアート、フェノール、ピロール、ベンゼン、トルエン等を含む芳香族炭化水素や、オーラミンＯ、クリスタルバイオレット、クリスタルバイオレット、グリセロール、マラカイドグリーン等を含むアリールメチン色素や、７－メトキシクマリン－４－酢酸、クマリン１、クマリン３０、クマリン３１４、クマリン３４３、クマリン６等を含むクマリン色素や、１，１’－ジエチル－２，２’－シアニンヨウ化物、クリプトシアニン、インドカルボシアニン（Ｃ３）色素、インドジカルボシアニン（Ｃ５）色素、インドトリカルボシアニン（Ｃ７）色素、オキサカルボシアニン（Ｃ３）色素、オキサジカルボシアニン（Ｃ５）色素、オキサトリカルボシアニン（Ｃ７）色素、ピナシアノールヨウ化物、すべての染色液（Stains all）、チアカルボシアニン（Ｃ３）色素、エタノール、チアカルボシアニン（Ｃ３）色素、ｎ－プロパノール、チアジカルボシアニン（Ｃ５）色素、チアトリカルボシアニン（Ｃ７）色素等を含むシアニン色素や、Ｎ，Ｎ’－ジフルオロボリル－１，９－ジメチル－５－（４－ヨードフェニル）－ジピリン、Ｎ，Ｎ’－ジフルオロボリル－１，９－ジメチル－５－[（４－（２－トリメチルシリルエチニル）、Ｎ，Ｎ’－ジフルオロボリル－１，９－ジメチル－５－フェニルジピリン等を含むジピリン色素や、４－（ジシアノメチレン）－２－メチル－６－（ｐ－ジメチルアミノスチリル）－４Ｈ－ピラン（ＤＣＭ）、アセトニトリル、４－（ジシアノメチレン）－２－メチル－６－（ｐ－ジメチルアミノスチリル）－４Ｈ－ピラン（ＤＣＭ）、メタノール、４－ジメチルアミノ－４’－ニトロスチルベン、メロシアニン５４０等を含むメロシアニンや、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ジメチルスルホキシド、７－ベンジルアミノ－４－ニトロベンズ－２－オキサ－１,３－ジアゾ－ル、ダンシルグリジン、ダンシルグリジン、ジオキサン、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＤＭＦ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ルシファーイエローＣＨ、ピロキシカム、キニーネ硫酸塩、キニーネ硫酸塩、スクアリリウム色素ＩＩＩ等を含むその他の色素や、２,５－ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）、ビフェニル、ＰＯＰＯＰ、ｐ－クアテルフェニル、ｐ－テルフェニル等を含むオリゴフェニレンや、クレシルバイオレット過塩素酸塩、ナイルブルー、メタノール、ナイルレッド、エタノール、オキサジン１、オキサジン１７０等を含むオキサジンや、９，１０－ビス（フェニルエチニル）アントラセン、９，１０－ジフェニルアントラセン、アントラセン、ナフタリン、ペリレン、ピレン等を含む多環芳香族炭化水素や、１，２－ジフェニルアセチレン、１，４－ジフェニルブタジエン、１，４－ジフェニルブタジイン、１，６－ジフェニルヘキサトリエン、β－カロチン、スチルベン等を含むポリエン／ポリインや、アントラキノン、アゾベンゼン、ベンゾキノン、フェロセン、リボフラビン、トリス（２，２’－ビピリジルルテニウム（ＩＩ）、テトラピロール、ビリルビン、クロロフィルａ、ジエチルエーテル、クロロフィルａ、メタノール、クロロフィルｂ、ジプロトン化テトラフェニルポルフィリン、ヘマチン、マグネシウムオクタエチルポルフィリン、マグネシウムオクタエチルポルフィリン（ＭｇＯＥＰ）、マグネシウムフタロシアニン（ＭｇＰｃ）、ＰｒＯＨ、マグネシウムフタロシアニン（ＭｇＰｃ）、ピリジン、マグネシウムテトラメシチルポルフィリン（ＭｇＴＭＰ）、マグネシウムテトラフェニルポルフィリン（ＭｇＴＰＰ）、オクタルエチルポルフィリン、フタロシアニン（Ｐｃ）、ポルフィン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、テトラ－ｔ－ブチルアザポルフィン、テトラ－ｔ－ブチルナフタロシアニン、テトラキス（２，６－ジクロロフェニル）ポルフィリン、テトラキス（ｏ－アミノフェニル）ポルフィリン、テトラメシチルポルフィリン（ＴＭＰ）、テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）、ビタミンＢ１２、亜鉛オクタエチルポルフィリン（ＺｎＯＥＰ）、亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰｃ）、ピリジン、亜鉛テトラメシチルポルフィリン（ＺｎＴＭＰ）、亜鉛テトラメシチルポルフィリンラジカルカチオン、亜鉛テトラフェニルポルフィリン（ＺｎＴＰＰ）等を含む酸化還元活性発色団や、エオシンＹ、フルオレセイン、基本エタノール、フルオレセイン、エタノール、ローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローズベンガル、スルホローダミン１０１等を含むキサンテンや、これらの混合物、またはこれらの組み合わせ、またはこれらの合成誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本技術の特定の実施形態に適切ないくつかの種類の蛍光原色素および特定の化合物が知られている。フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシンおよびテキサスレッドなどのキサンテン誘導体や、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニンおよびメロシアニンなどのシアニン誘導体や、ナフタリン誘導体（ダンシルおよびプロダン誘導体）や、クマリン誘導体や、ピリジルオキサゾール、ニトロベンズオキサジアゾールおよびベンズオキサジアゾールなどのオキサジアゾール誘導体や、カスケードブルーなどのピレン誘導体や、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレットおよびオキサジン１７０などのオキサジン誘導体や、プロフラビン、アクリジンオレンジおよびアクリジンイエローなどのアクリジン誘導体や、オーラミン、クリスタルバイオレットおよびマラカイドグリーンなどのアリールメチン誘導体や、ポルフィン、フタロシアニン（phtalocyanine）、ビリルビンなどのテトラピロール誘導体である。いくつかの実施形態では、蛍光部分色素は、キサンテン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、ALEXA FLUOR（登録商標）350、ALEXA FLUOR（登録商標）405、ALEXA FLUOR（登録商標）430、ALEXA FLUOR（登録商標）488、ALEXA FLUOR（登録商標）514、ALEXA FLUOR（登録商標）532、ALEXA FLUOR（登録商標）546、ALEXA FLUOR（登録商標）555、ALEXA FLUOR（登録商標）568、ALEXA FLUOR（登録商標）568、ALEXA FLUOR（登録商標）594、ALEXA FLUOR（登録商標）610、ALEXA FLUOR（登録商標）633、ALEXA FLUOR（登録商標）647、ALEXA FLUOR（登録商標）660、ALEXA FLUOR（登録商標）680、ALEXA FLUOR（登録商標）700、ALEXA FLUOR（登録商標）750、または、スクアライン色素である。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光検知可能な部分であり、例えば、Haugland (September 2005) MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (10th ed.)に記載されている。当該文献は、参照によりその全文が本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、標識（例えば、蛍光検知可能な標識）は、ATTO-TEC GmbH (Am Eichenhang 50, 57076 Siegen, Germany)から入手可能であり、例えば、米国特許出願公報第２０１１０２２３６７７号、第２０１１０１９０４８６号、第２０１１０１７２４２０号、第２００６０１７９５８５号、および第２００３０００３４８６号、および米国特許第７，９３５，８２２号に記載されている。これらの文献はすべて、参照により本明細書に援用される（例えば、ATTO 390、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO 532、ATTO Rho6G、ATTO 542、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho3B、ATTO Rho11、ATTO Rho12、ATTO Thio12、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 594、ATTO Rho13、ATTO 610、ATTO 620、ATTO Rho14、ATTO 633、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO Oxa12、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740）。
発光最大値がこれらの範囲外である色素も使用できることは、当業者ならわかるであろう。場合によっては、５００ｎｍ～７００ｎｍ範囲の色素は、可視スペクトル内であり、既存の光電子増倍管により検出できるという利点がある。いくつかの実施形態では、使用可能な色素の範囲が広いため、検出範囲全域にわたる発光波長を有する色素セットを選択することができる。多数の色素を区別することのできる検出システムが当技術分野で知られている。
＜サンプル＞
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、様々な他の成分（例えば、タンパク質、脂質、非テンプレート核酸など）を含む生体サンプルから単離される。核酸テンプレート分子は、任意の物質（例えば、（生または死）細胞物質、細胞外物質、ウイルス物質、環境サンプル（例えば、メタゲノムサンプル）、合成物質（例えば、ＰＣＲまたはその他の増幅技術により提供されるアンプリコン））から得られ、動物、植物、細菌、古細菌、真菌または任意の他の生物から得られる。本技術で使用される生体サンプルは、ウイルス粒子またはその調製物を含む。核酸分子は、生物、または、生物から得られた生体サンプル、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、便、髪、汗、涙、皮膚、および組織から直接に得られる。例示的なサンプルとして、全血、リンパ液、血清、血漿、口腔細胞、汗、涙、唾液、痰、髪、皮膚、生検、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、精液、膣分泌物、漿液、滑液、心膜液、胸膜液、濾出液、滲出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、便サンプルおよび綿棒、（例えば、骨髄、細針などの）吸引物、（例えば、口腔の、鼻咽腔の、気管支の、気管支肺胞の、目の、直腸の、腸の、膣の、表皮などの）洗浄液、および／または他の標本が挙げられるが、これらに限定されない。
本技術では、核酸の出所として任意の組織または体液標本を用いてよく、法医学標本、アーカイブされた標本、保存標本、および／または、長時間保存された標本が挙げられ、例えば、新鮮凍結、メタノール/酢酸固定またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本およびサンプルが挙げられる。核酸テンプレート分子は、初代細胞培養または細胞株などの培養細胞から単離されてもよい。テンプレート核酸が得られる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染してもよい。サンプルは、生体標本、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスまたはゲノムＤＮＡから抽出されたトータルＲＮＡであってもよい。サンプルは、非細胞源から単離されたＤＮＡ、例えば、冷凍庫で保存された増幅/単離ＤＮＡであってもよい。
核酸分子は、例えば、Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載された様々な手法（例えば、pp. 280-281を参照のこと）により、例えば生体サンプルから抽出して得ることができる。
いくつかの実施形態では、本技術は、核酸のサイズを選択して、例えば、非常に短い断片または非常に長い断片を取り除く。
いくつかの実施形態では、本技術は、その場で（in situで）核酸を同定するために用いられる。特に、本技術の実施形態は、組織、細胞などから核酸を抽出せずに、（例えば、組織、細胞などの透過処理後に）組織、細胞などの中で直接に核酸を同定する。in situでの検出に関連する本技術のいくつかの実施形態では、本技術は、インビトロ、エクスビボ、および／または、インビトロで適用される。いくつかの実施形態では、サンプルは、未精製のサンプルであり、最小限に処理された細胞溶解液または生体液溶解液である。いくつかの実施形態では、核酸は、核酸精製せずに、未精製の溶解液の中で検出される。
＜キット＞
いくつかの実施形態は、核酸を検出するためのキットに関する。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、固体担体（例えば、顕微鏡スライド、ビーズ、カバースリップ、アビジン（例えば、ストレプトアビジン）‐共役型顕微鏡スライドまたはカバースリップ、ゼロモード導波路アレイ等を含む固体担体）、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ（例えば、ビオチン化ｄＣａｓ９を含む）、および、本明細書に記載の問合せプローブを含む。いくつかの実施形態は、さらに非ビオチン化ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡを提供する。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の問合せプローブ結合事象および滞留時間を収集し分析するための、コンピュータで読み取り可能な様式である、または、インターネットからダウンロードできるソフトウェアをさらに提供する。いくつかの実施形態では、多重検出のキットは２つ以上の問合せプローブを有し、各問合せプローブは、１つ以上の標的核酸の異なる問合せ領域に相補的な配列を含み、かつ、各問合せプローブは、異なる蛍光部分を含む。いくつかの実施形態では、問合せプローブは、１つ以上の核酸標的の問合せ領域に相補的である。キットのいくつかの実施形態は、１つ以上のポジティブコントロールおよび／または１つ以上のネガティブコントロールを含む。いくつかの実施形態は、既知の濃度を有する一連のコントロールを含み、例えば、それによって、標準濃度曲線を作る。
＜システム＞
本技術のいくつかの実施形態は、標的核酸を検出し定量化するためのシステムを提供する。本技術に係るシステムは、例えば、固体担体（例えば、顕微鏡スライド、カバースリップ、アビジン（例えば、ストレプトアビジン）－共役型顕微鏡スライドまたはカバースリップ、ゼロモード導波路アレイ等を含む固体担体）、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ（例えば、ビオチン化ｄＣａｓ９を含む）、および、本明細書に記載の問合せプローブを含む。いくつかの実施形態では、さらに非ビオチン化ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡを提供する。
いくつかの実施形態は、結合した問合せプローブを励起する照明構成（例えば、プリズム型全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡、対物型ＴＩＲＦ顕微鏡、近ＴＩＲＦまたはＨｉＬｏ顕微鏡、共焦点レーザー走査顕微鏡、ゼロモード導波路、および／または、照明を表面付近の空間の小さな領域に制限しつつ、スライドまたはカバースリップの広い領域（＞１００μｍ２）を並列に監視することができる照明構成）を含む蛍光顕微鏡をさらに含む。いくつかの実施形態は、蛍光検出器、例えば、インテンシファイア電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、電子倍増電荷結合素子（ＥＭ－ＣＣＤ）、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を含む検出器、および／または、１つの発色団から蛍光発光を検知することができる他の検出器を含む。いくつかの実施形態は、コンピュータ、および、コンピュータが実行する命令を符号化するソフトウェアを含む。
いくつかの実施形態は、レンズ、ミラー、ダイクロイックミラー、光学フィルタなどの光学系を含み、例えば、それによって、特定の範囲の波長または複数の範囲の波長内で選択的に蛍光を検知する。
例えば、いくつかの実施形態では、コンピュータに基づく分析ソフトウェアを用いて、検出分析により生成された生データ（例えば、１つ以上の核酸（例えば、１つ以上のバイオマーカー）の存在、不存在、または、量）を、臨床医のための予測値データに翻訳する。臨床医は、任意の適切な手段で予測データにアクセスできる。
例えば、いくつかの実施形態は、本技術の実施形態を実施できるコンピュータシステムを含む。様々な実施形態において、コンピュータシステムは、バスまたは他の情報伝達用通信メカニズム、および、バスに結合された情報処理用プロセッサを含む。様々な実施形態において、コンピュータシステムは、バスに結合されたメモリ（ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）または他の動的記憶装置であってもよい）と、プロセッサにより実行される命令とを含む。プロセッサにより実行される命令が実行されている間に、メモリも用いられ、一時変数または他の中間情報を記憶する。様々な実施形態において、コンピュータシステムは、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、または、バスに結合されて静的情報およびプロセッサへの命令を記憶する他の静的記憶装置をさらに含むことができる。磁気ディスクまたは光ディスクなどの記憶装置は、バスに結合され、情報および命令を記憶する。
様々な実施形態において、コンピュータユーザへ情報を表示するために、コンピュータシステムは、バスを介して、ブラウン管（ＣＲＴ）または液晶表示装置（ＬＣＤ）などのディスプレイに結合される。英数字および他のキーを含む入力素子は、バスに結合され、プロセッサへ情報およびコマンドの選択を伝達することができる。別の種類のユーザ入力素子は、方向情報およびコマンドの選択をプロセッサに伝達し、ディスプレイ上のカーソルの動作を制御する、マウス、トラックボール、またはカーソル方向キーなどのカーソル制御である。この入力素子は、典型的には、第１軸（例えば、ｘ）および第２軸（例えば、ｙ）の２つの軸に２つの自由度を有し、これにより、素子が平面上の位置を指定することができる。
コンピュータシステムは、本技術の実施形態を実行することができる。本技術のある実施と一致するように、プロセッサがメモリに含まれる１つ以上の命令の１つ以上の配列を実行することに応答して、コンピュータシステムは、結果を提供することができる。このような命令は、コンピュータで読み取り可能な記憶装置などの別の媒体から、メモリに読み込まれることができる。メモリに含まれている命令の配列が実行されたことにより、プロセッサは、本明細書に記載の方法を実行する。あるいは、本発明の教示を実施するために、プログラムがハードウェアに組み込まれている回路を、ソフトウェア命令の代わりに用いる、または、ソフトウェア命令と併用することができる。このように、本技術の実施は、ハードウェア回路およびソフトウェアの任意の特定の組み合わせに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「コンピュータで読み取り可能な媒体」は、プロセッサに命令を提供して実行させることに参加する任意の媒体を指す。このような媒体は様々な形態を取ることができ、不揮発性媒体、揮発性媒体および伝送媒体が挙げられるが、これらに限定されない。不揮発性媒体の例として、記憶装置のような光または磁気ディスクが挙げられるが、これらに限定されない。揮発性媒体の例として、動的メモリが挙げられるが、これらに限定されない。伝送媒体の例として、同軸ケーブル、銅線、および、光ファイバー（バスを含むワイヤを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
コンピュータで読み取り可能な媒体の一般の形態は、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープまたは任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、任意の他の光媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップまたはカートリッジ、または、コンピュータが読み取り可能な任意の他の有形媒体を含む。
様々な形態のコンピュータで読み取り可能な媒体が、１つ以上の命令の１つ以上の配列をプロセッサへ運んで実行させることに関与できる。例えば、命令は最初に遠隔コンピュータの磁気ディスクへ運ばれる。遠隔コンピュータは、命令をその動的メモリにロードし、ネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネット、電話線）を介して命令を送る。ローカルコンピュータシステムは、データを受け入れ、それをバスに伝えることができる。バスは、データをメモリへ運び、プロセッサはメモリから命令を取得し実行することができる。メモリに受け入れられた命令は、プロセッサにより実行される前に、または、実行された後に、任意で記憶装置に記憶してよい。
様々な実施形態によれば、プロセッサにより実行されて方法を実施する命令は、コンピュータで読み取り可能な媒体に記憶される。コンピュータで読み取り可能な媒体は、デジタル情報を記憶する装置であってもよい。例えば、コンピュータで読み取り可能な媒体は、当技術分野で知られている、ソフトウェアを記憶するための、ＣＤによる読み出し専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）を含む。コンピュータで読み取り可能な媒体は、実行されるよう構成された命令を実行するのに適したプロセッサによってアクセスされる。
このようなコンピュータシステムによれば、本明細書で提供される本技術のいくつかの実施形態は、データ（例えば、核酸の存在、不存在、濃度）を収集、記憶、および／または、分析する機能をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態は、例えば、命令を記憶して実行し、蛍光、画像データを分析し、データを用いる計算を実行し、データを変換し、データを記憶するために、プロセッサ、メモリ、および／または、データベースを含むシステムを意図する。いくつかの実施形態では、アルゴリズムにより、データに統計モデル（例えば、ポアソンモデルまたは隠れマルコフモデル）が適用される。
多くの診断は、１つ以上の核酸（例えば、核酸バイオマーカー）の存在またはヌクレオチド配列を判定することを含む。このように、いくつかの実施形態では、多数の核酸の存在、不存在、濃度、量または配列特性を表す変数を含む方程式は、核酸の存在または特性を診断または評価するために用いられる値を生成する。したがって、いくつかの実施形態では、該値は、デバイスによって、例えば、結果に関連する表示器（例えば、ＬＥＤ、ディスプレイ上のアイコン、音等）などによって、提示される。いくつかの実施形態では、デバイスは、前記値を記憶して伝え、または、追加の計算のために前記値を使用する。いくつかの実施形態では、方程式は、ゲノムＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、変異型遺伝子バイオマーカー、または、染色体変異の中の１つ以上のメチル化遺伝子座の存在、不存在、濃度、量または配列特性を表す変数を含む。
このように、いくつかの実施形態では、本技術のさらなる利点は、遺伝学または分子生物学の訓練を受けた可能性が少ない臨床医が、生のデータを理解する必要がないということである。データは、その最も有用な形態で臨床医に直接に提示される。臨床医は、その後、該情報を利用して、対象の治療を最適化することができる。本発明は、分析を行う実験室、情報提供者、医療関係者、および／または、対象へ／から情報を受け取り、処理し、伝えることができる任意の方法を意図する。例えば、本技術のいくつかの実施形態では、サンプルが対象から得られると、世界の任意の地域（例えば、対象がいる国または情報が最終的に使用される国と異なる国）に位置する、プロファイリングサービス（例えば、医療施設の臨床検査室、ゲノムプロファイリング会社など）に送信され、生のデータを生成する。サンプルが組織または他の生体サンプルを含む場合、対象は、医療センターを訪問し、そこでサンプルを採取してもらいプロファイリングセンターに送ってもらってもよく、あるいは、対象自らがサンプルを収集し直接プロファイリングセンターに送ってもよい。サンプルが以前に判定された生体情報を含む場合、該情報は、対象により直接にプロファイリングサービスに送られてもよい（例えば、該情報を含む情報カードが、コンピュータによりスキャンされ、電子通信システムによりデータがプロファイリングセンターのコンピュータに伝えられてもよい）。プロファイリングサービスは、サンプルを受け取った後、サンプルを処理し、対象に望まれる診断情報また予後の情報に特有のプロファイルを作成する。プロファイルデータは、その後、担当臨床医の解釈に適切な様式で用意される。例えば、用意された様式は、生の発現データを提供するのではなく、対象に対する診断またはリスク評価を、特定の治療の選択肢の推奨とともに示してよい。該データは、任意の適切な方法により、臨床医に表示されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、プロファイリングサービスは、臨床医のために（例えば、治療の地点で）印刷可能な、または、コンピュータモニタ上で臨床医に表示可能な報告を生成する。いくつかの実施形態では、該情報はまず治療の地点または地域施設で分析される。生のデータは、その後、中央処理施設に送られ、さらに分析され、および／または、生のデータが臨床医または対象に有用な情報に変換される。中央処理施設は、プライバシー（すべてのデータは、統一されたセキュリティプロトコルで中央施設に保存される）、速さ、および、データ分析の均一性の面でメリットがある。中央処理施設は、その後、対象の治療後のデータの処理を制御することができる。例えば、中央施設は、電子通信システムを使用して、データを臨床医、対象、または、研究者に提供できる。いくつかの実施形態では、対象は、電子通信システムを用いて、データにアクセスできる。対象は、結果に基づいて、さらなる介入またはカウンセリングを選択することができる。いくつかの実施形態では、データは研究目的に使用される。例えば、データを用いて、病気に関連した特定の条件の有用な指標としてのマーカーの包含または除外をさらに最適化してよい。
上記の明細書で言及されたすべての刊行物および特許は、参照によりその全文が本明細書であらゆる目的のために援用される。本技術の記載された組成、方法および用途の様々な変更および変化は、本技術の上記技術範囲および精神から逸脱することなく、当業者にとって明らかであろう。本技術は、特定の例示的な実施形態に関連して記載されたが、本発明はこれらの特定の実施形態に不当に限定されないことを理解されたい。実際、本発明を実施するための上記方法に対する様々な変更が以下の特許請求の範囲の範囲内にあることを意図しているのは、当業者にとって明らかである。
本発明は、以下のように構成することも可能である。
［１］二本鎖標的核酸の検知可能なフィンガープリントを提示するための複合体であって、
ａ）第１領域およびそれに隣接する第２領域を有する二本鎖標的核酸と、
ｂ）前記第１領域と相互に作用して熱力学的に安定した複合体を形成し、前記第２領域を一本鎖形態とする固定化された融解要素と、
ｃ）前記第２領域と繰り返し結合して、前記二本鎖標的核酸と関連した検知可能なフィンガープリントを提供する問合せプローブと、を含む、複合体。
［２］前記融解要素はｄＣａｓ９を含む、［１］に記載の複合体。
［３］前記融解要素は、前記第１領域にハイブリダイズしたｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を含む、［１］に記載の複合体。
［４］前記融解要素はＰＡＭｍｅｒを含む、［１］に記載の複合体。
［５］前記問合せプローブは、０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返しハイブリダイズする蛍光標識化核酸である、［１］に記載の複合体。
［６］前記ｄＣａｓ９は基材に固定化されている、［２］に記載の複合体。
［７］前記フィンガープリントはパターン認識分析によって検知可能である、［１］に記載の複合体。
［８］前記標的核酸の前記第２領域に隣接する前記標的核酸の第３領域と相互に作用する第２融解要素をさらに含む、［１］に記載の複合体。
［９］前記標的核酸は、変異、単一ヌクレオチド多型、または修飾塩基を有する、［１］に記載の複合体。
［１０］前記第１融解要素および前記第２融解要素は、約５から１５ヌクレオチド離れて、前記標的核酸に結合している、［８］に記載の複合体。
［１１］サンプル中の二本鎖標的核酸の検知可能なフィンガープリントを提示する方法であって、
ａ）二本鎖標的核酸を固体担体の別々の領域に固定化するステップであって、前記二本鎖標的核酸は、第１領域およびそれに隣接する第２領域を有し、前記固体担体の前記別々の領域は前記第１領域と相互に作用する固定化された融解要素を含む、ステップと、
ｂ）前記第２領域に繰り返し結合する問合せプローブを提示して、検知可能なフィンガープリントを提示するステップと、
ｃ）前記検知可能なフィンガープリントを前記二本鎖核酸と関連させて、前記二本鎖核酸を特定するステップと、を含む、方法。
［１２］パターン認識を用いてデータを分析し、前記二本鎖核酸の前記検知可能なフィンガープリントを生成または同定する、［１１］に記載の方法。
［１３］前記融解要素はｄＣａｓ９を含む、［１１］に記載の方法。
［１４］第２ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を提供するステップをさらに含み、当該第２ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、前記標的核酸の前記第２領域に隣接する前記標的核酸の第３領域に相補的なｇＲＮＡを含む、［１１］に記載の方法。
［１５］前記融解要素が前記第２領域を一本鎖形態にするのに十分な条件を提供するステップを含む、［１１］に記載の方法。
［１６］前記検知可能に標識された問合せプローブが前記標的核酸の前記第２領域に繰り返し結合するのを検知するステップを含み、運動速度定数ｋｏｆｆは１ｍｉｎ－１より大きく、かつ／または運動速度定数ｋｏｎは１ｍｉｎ－１より大きい、［１１］に記載の方法。
［１７］前記サンプル中の前記二本鎖標的核酸の量または濃度を、前記検知可能なフィンガープリントから計算するステップをさらに含む、［１６］に記載の方法。
［１８］二本鎖核酸を検知するためのシステムであって、
固定化された融解要素を含む固体担体と、
前記二本鎖核酸に繰り返し結合する検知可能に標識された問合せプローブと、
蛍光検知器と、
問合せプローブの結合データをパターン認識分析するよう構成されたソフトウェア要素と、を備える、システム。
［１９］対象が癌にかかっている、あるいは癌にかかるリスクがあるという予測値を計算する方法であって、
マイクロＲＮＡバイオマーカーの存在を判定するステップ、変異の存在を判定するステップ、および／またはゲノムＤＮＡ中の修飾塩基の存在を判定するステップのうち一つまたは複数を含む、方法。
［２０］前記予測値は、前記マイクロＲＮＡバイオマーカーの存在、前記変異の存在、および／または前記ゲノムＤＮＡ中の修飾塩基の存在のうち１つ又は複数と関連する変数から計算される値である、［１９］の方法。
［２１］標的核酸を検知するための複合体であって、
１）第１領域およびそれに隣接する第２領域を有する標的核酸と、
２）前記第１領域とハイブリダイズした検知可能に標識された捕獲プローブと、
３）前記捕獲プローブの標識と親和性の消光剤または蛍光受容体で標識された問合せプローブと、を含み、
前記問合せプローブは、０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返しハイブリダイズする、複合体。
［２２］二本鎖標的核酸の検知可能なフィンガープリントを提示するためのシステムであって、
ａ）前記二本鎖標的核酸の第１領域と相互に作用して、熱力学的に安定した複合体を形成し、前記二本鎖標的核酸の第２領域を一本鎖形態にすることができる、固定化された融解要素と、
ｂ）前記第２領域と繰り返し結合して、前記二本鎖標的核酸と関連する検知可能なフィンガープリントを提示する問合せプローブと、を備える、システム。
［２３］前記融解要素はｄＣａｓ９を含む、［２２］に記載のシステム。
［２４］前記融解要素は、前記第１領域に相補的なｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を含む、［２２］に記載のシステム。
［２５］前記融解要素はＰＡＭｍｅｒを含む、［２２］に記載のシステム。
［２６］前記問合せプローブは、０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｆｆおよび／または０．１ｍｉｎ－１より大きな運動速度定数ｋｏｎで前記第２領域に繰り返しハイブリダイズする蛍光標識化核酸である、［２２］に記載のシステム。
［２７］前記ｄＣａｓ９は基材に固定化されている、［２３］に記載のシステム。
［２８］前記フィンガープリントはパターン認識分析によって検知可能である、［２２］に記載のシステム。
［２９］前記標的核酸の前記第２領域に隣接する前記標的核酸の第３領域と相互に作用する第２融解要素をさらに含む、［２２］に記載のシステム。
［３０］前記標的核酸は、変異、単一ヌクレオチド多型、または修飾塩基を有する、［２２］に記載のシステム。
［３１］前記第１融解要素および前記第２融解要素は、約５から１５ヌクレオチド離れて、前記標的核酸に結合している、［２９］に記載のシステム。
［３２］蛍光検知器をさらに備える、［２２］に記載のシステム。
［３３］問合せプローブの結合データをパターン認識分析するよう構成されたソフトウェア要素をさらに備える、［２２］に記載のシステム。
［３４］前記サンプル中の前記二本鎖標的核酸の量または濃度を、前記検知可能なフィンガープリントから計算するよう構成されたソフトウェア要素をさらに備える、［２２］に記載のシステム。
［３５］前記標的核酸の存在、不存在、濃度、量、または配列特性に関する結果を提示するための指示器またはディスプレイをさらに備える、［２２］に記載のシステム。
［３６］標的核酸の存在、不存在、濃度、量、または配列特性に関する結果を提示するためのキットであって、固体担体、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ、および問合せプローブを備える、キット。
［３７］問合せプローブの結合事象および／または滞留時間を収集し分析する、コンピュータで読み取り可能なフォーマットのソフトウェアをさらに備える、［３６］に記載のキット。
［３８］１つまたは複数のポジティブコントロール、および／または、一つまたは複数のネガティブコントロールをさらに備える、［３６］に記載のキット。
［３９］前記固体担体は、顕微鏡スライド、ビーズ、またはカバースリップを含む、［３６］に記載のキット。
［４０］前記固体担体は、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、［３６］に記載のキット。
［４１］前記固体担体は、ゼロモード導波路アレイを含む、［３６］に記載のキット。
［４２］二本鎖標的核酸の検知可能なフィンガープリントを提示するためのシステムの使用であって、前記システムは、
ａ）前記二本鎖標的核酸の第１領域と相互に作用して、熱力学的に安定した複合体を形成し、前記二本鎖標的核酸の第２領域を一本鎖形態にすることができる、固定化された融解要素と、
ｂ）前記第２領域と繰り返し結合して、前記二本鎖標的核酸と関連する検知可能なフィンガープリントを提示する問合せプローブと、を備える、使用。
［４３］サンプル中の二本鎖標的核酸の検知可能なフィンガープリントを提示する方法の使用であって、前記方法は、
ａ）二本鎖標的核酸を固体担体の別々の領域に固定化するステップであって、前記二本鎖標的核酸は、第１領域およびそれに隣接する第２領域を有し、前記固体担体の前記別々の領域は前記第１領域と相互に作用する固定化された融解要素を含む、ステップと、
ｂ）前記第２領域に繰り返し結合する問合せプローブを提示して、検知可能なフィンガープリントを提示するステップと、
ｃ）前記検知可能なフィンガープリントを前記二本鎖核酸と関連させて、前記二本鎖核酸を特定するステップと、を含む、使用。
［４４］サンプル中の二本鎖標的核酸の検知可能なフィンガープリントを提示するための複合体の使用であって、前記複合体は、
ａ）第１領域およびそれに隣接する第２領域を有する二本鎖標的核酸と、
ｂ）前記第１領域と相互に作用して熱力学的に安定した複合体を形成し、前記第２領域を一本鎖形態とする固定化された融解要素と、
ｃ）前記第２領域と繰り返し結合して、前記二本鎖標的核酸と関連した検知可能なフィンガープリントを提供する問合せプローブと、を含む、使用。
［４５］標的核酸の存在、不存在、濃度、量、または配列特性に関する結果を提示するためのキットの使用であって、前記キットは、固体担体、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ、および問合せプローブを備える、使用。
［４６］以下の方法に従って作られたサンプル中の二本鎖標的核酸のフィンガープリントを含むデータ構造であって、当該方法は、
ａ）二本鎖標的核酸を固体担体の別々の領域に固定化するステップであって、前記二本鎖標的核酸は、第１領域およびそれに隣接する第２領域を有し、前記固体担体の前記別々の領域は前記第１領域と相互に作用する固定化された融解要素を含む、ステップと、
ｂ）前記第２領域に繰り返し結合する問合せプローブを提示して、検知可能なフィンガープリントを提示するステップと、
ｃ）前記検知可能なフィンガープリントを前記二本鎖核酸と関連させて、前記二本鎖核酸を特定するステップと、を含む、データ構造。
［４７］以下のシステムを用いて作られたサンプル中の二本鎖標的核酸のフィンガープリントを含むデータ構造であって、当該システムは、
ａ）前記二本鎖標的核酸の第１領域と相互に作用して、熱力学的に安定した複合体を形成し、前記二本鎖標的核酸の第２領域を一本鎖形態にすることができる、固定化された融解要素と、
ｂ）前記第２領域と繰り返し結合して、前記二本鎖標的核酸と関連する検知可能なフィンガープリントを提示する問合せプローブと、を備える、データ構造。
［４８］以下の複合体を用いて作られたサンプル中の二本鎖標的核酸のフィンガープリントを含むデータ構造であって、当該複合体は、
ａ）第１領域およびそれに隣接する第２領域を有する二本鎖標的核酸と、
ｂ）前記第１領域と相互に作用して熱力学的に安定した複合体を形成し、前記第２領域を一本鎖形態とする固定化された融解要素と、を含む、データ構造。
図１ａは、本明細書に記載した核酸検知技術の一実施形態の模式図である。 図１ｂは、スライド表面に非特異的に一時連結する蛍光標識化問合せプローブに関する例示的なＳｉＭＲＥＰＳデータを示す。 図１ｃは、標的核酸と一時結合する蛍光標識化問合せプローブに関する例示的なＳｉＭＲＥＰＳデータを示す。図１ｃおよび図１ｂの動的フィンガープリントが異なるため、問合せプローブの特異的結合および非特異的結合に関する異なる動的サインの例が示されている。 図１ｄは、１ｐＭの標的核酸（例えばｍｉＲ－１４１というマイクロＲＮＡ）の非存在（灰色の太線）または存在（細線）下で問合せプローブの数をカウントして得られた一定数の強度変化（Ｎｂ＋ｄ）を示す一連のヒストグラムである。４つのヒストグラムのプロットデータの取得にはそれぞれ１、２、５、１０分間の取得時間を要した。 図１ｅは、５つのｍｉＲＮＡに関するＳｉＭＲＥＰＳ分析から得た、Ｒ２値＞０．９９の標準カーブのプロット図である。ＳｉＭＲＥＰＳ技術により、高い信頼度の核酸検知が実現されている。 図２ａは、ｌｅｔ－７ａ用の蛍光性問合せプローブが、ｌｅｔ－７ａとは長い存続時間（τｏｎ＝２３．３±８．３ｓ）の結合を示す一方、当該ｌｅｔ－７ｃ配列がｌｅｔ－７ａに対して一塩基ミスマッチ（下線付きの「Ｇ」）であることから、ｌｅｔ－７ｃとは結合がずっと一時的（τｏｎ＝４．７±３．０ｓ）であることを示すプロット図である。 図２ｂは、ｌｅｔ－７ａ（塗りつぶした丸点）とｌｅｔ－７ｃ（塗りつぶしていない丸点）とで、単複製レベルにおける高い信頼度の区別を示した滞留時間分析結果である。 図２ｃは、ｌｅｔ－７ａとｌｅｔ－７ｃとを区別するために、τｏｎ閾値を変更して作成した受信者動作特性（ＲＯＣ）のプロットである。 図２ｄは、ｍｉＲＣＵＲＹｌｅｔ－７阻害因子の存在または非存在下における、未処理のＨｅｌａ細胞抽出物中のｌｅｔ－７の検出結果に関するＮｂ＋ｄヒストグラムである。内因性ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａに関するＮｂ＋ｄヒストグラムは、明確な輪郭を有するピーク（細線）を示した。当該ピークは、ｌｅｔ－７ファミリーメンバーに結合し隔離するよう設計されたｌｅｔ－７阻害因子の存在下では消失した（太い灰色のバー）。 図２ｅは、ｌｅｔ－７ａ用の蛍光プローブおよび捕獲プローブを用いて未処理のＨｅｌａ抽出物から検出した分子に関する滞留時間を示す。塗りつぶした丸点および塗りつぶしていない丸点は、τｏｎ値のｋ－ｍｅａｎｓクラスタ分析によって分類された２つの標的分子クラスタを表し、単ヌクレオチド変異型ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａおよびｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃについて予想されたτｏｎ分布に一致している。 図２ｆは、ヒト血清中に加えた人工ｍｉＲ－１４１の定量結果を示す。 図３は、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡを含む本願技術の実施形態を示す模式図である。ゲノム標的ＤＮＡをｄＣａｓ９／ｇＲＮＡで短時間、下処理する。このあいだ、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、問合せ領域（例えば問合せプローブに相補的な領域）に隣接する領域において標的核酸（例えばゲノムＤＮＡ）とハイブリダイズする。ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡは、標的核酸中の特定のＤＮＡ配列（例えば問合せ領域）を融解する。ビオチン化ｄＣａｓ９をスライド表面上に（例えばビオチンとアビジンとの相互作用によって）捕獲した後、ＳｉＭＲＥＰＳを用い、標的核酸中の現在アクセス可能な問合せ領域と問合せプローブとの結合を検知する。なお、該アクセス可能な問合せ領域は、標的核酸のうちｇＲＮＡにハイブリダイズした部位に隣接している。 図４は、互いに側面に位置する２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の標的核酸へのハイブリダイゼーションを含む、本願技術の実施形態を示す模式図である。いくつかの実施形態において、２つのｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を問合せ領域の側面に位置するようにハイブリダイズさせることで、標的核酸（例えば問合せ領域）から、ＳｉＭＲＥＰＳに基づく検知用の問合せプローブへのアクセス可能性がさらに向上し、一部の実施形態では特異性がさらに増強される。図示される実施形態では、一方のｄＣａｓ９は、表面上への捕獲のためにビオチン化されており、他方のｄＣａｓ９はビオチン化されていない。但し、いくつかの実施形態では、当該他方のｄＣａｓ９は修飾、例えばビオチン化される。 図５ａは、問合せプローブおよび捕獲プローブが連続的なオリゴヌクレオチドと連結してなる分子内ＳｉＭＲＥＰＳのプロービングの実施形態を示す模式図である。 図５ｂは、非連続的な問合せプローブおよび捕獲プローブがアドレスオリゴヌクレオチドによって共局在化してなる分子内ＳｉＭＲＥＰＳのプロービングの実施形態を示す模式図である。

Claims (15)

  1. 以下のａ）～ｃ）を含む、サンプル中の検体の検出方法：
    ａ）上記サンプル由来の単一の検体を固体担体の別々の領域に固定化すること、および、上記単一の検体と結合および解離する、検知可能に標識された問合せプローブを提供すること、
    ｂ）上記別々の領域内で検出される複数の時間分離されたシグナル強度変化を数えること、および、上記別々の領域内で検出されるシグナル強度変化の数が閾値よりも大きいときに、上記シグナル強度変化を、上記検知可能に標識された問合せプローブと上記固定化された単一の検体との繰り返される結合および解離によって生成される候補シグナルとして同定すること、および、
    ｃ）上記候補シグナルが検出されたときに、または、上記時間分離されたシグナル強度変化を特徴づけるパラメータの値が上記別々の領域内における上記検体の存在を示したときに、上記サンプル中の上記検体を検出すること。
  2. 上記検体は、タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 上記検体は、糖化タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 上記検体は、脂質を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 上記検知可能に標識された問合せプローブは、アプタマーを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 上記検知可能に標識された問合せプローブは、レクチンを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 上記検知可能に標識された問合せプローブは、タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 上記検知可能に標識された問合せプローブは、抗体、または、抗体断片を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 上記検知可能に標識された問合せプローブは、転写因子を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 上記検知可能に標識された問合せプローブは、上記検体への結合を弱くしたものである、請求項１に記載の方法。
  11. 上記固体担体の別々の領域は、捕獲プローブを含む、請求項１に記載の方法。
  12. 上記捕獲プローブは、以下の１つを含む、請求項１１に記載の方法：
    ｉ）抗体、または、抗体断片、
    ｉｉ）転写因子、
    ｉｉｉ）アプタマー、
    ｉｖ）レクチン、
    ｖ）タンパク質。
  13. 複数の時間分離されたシグナル強度変化を数えることが、単一分子の分解能技術を用いて上記別々の領域を観察することを含む、請求項１に記載の方法。
  14. 上記検知可能に標識された問合せプローブは、蛍光標識を含む、請求項１に記載の方法。
  15. 上記別々の領域内で複数の時間分離されたシグナル強度変化を数えることが、上記タンパク質に対する上記検知可能に標識された問合せプローブの結合および放出の動的解析を含む、請求項１に記載の方法。

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